DD250711A1 - Verfahren zur herstellung von antithrombin-iii-konzentraten - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Antithrombin-III-Konzentraten zur Therapie von Antithrombin-III-Mangelzustaenden. Das bekannte Verfahren der Anreicherung von Antithrombin III in einer Rohfraktion durch Adsorption an Aluminiumhydroxid wird als Einstufenverfahren mit den Verfahrensschritten Adsorption, Auswaschen von Begleitproteinen und Freisetzung des Antithrombin III so gestaltet und vereinfacht, dass ein Antithrombin-III-Konzentrat fuer den therapeutischen Einsatz erhalten wird. Das erfindungsgemaesse Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass die Ausgangsmaterialien vor der Antithrombin-III-Adsorption nicht defibriniert werden und dass das Antithrombin III vorzugsweise aus Plasmaueberstaenden nach Abtrennung der Humanplasmafraktionen Kryopraezipitat und/oder Cohn I und Prothrombinkomplexkonzentrat als therapeutisch einsetzbare Plasmafraktionen an Aluminiumoxidhydrat adsorbiert und von diesem mit Zitrat enthaltenden Elutionsfluessigkeiten freigesetzt wird. Das erfindungsgemaesse Verfahren schliesst die Verwendung von Heparin enthaltenden Plasmaueberstaenden, die Gegenwart von Heparin in allen Verfahrensschritten sowie den Einsatz solcher Ausgangsmaterialien ein, aus denen vor der AT-III-Adsorption Lipoproteine abgetrennt wurden.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Antithrombin-Ill-Konzentrates. Antithrombin III (ATIII) ist der wichtigste Inhibitor der Blutgerinnung. Die Therapie angeborener und erworbener Antithrombin-Ill-Mangelzustände erfordert den Einsatz von Antithrombin-Ill-Konzentraten, da der Gabe von Blutplasma zum Zwecke der Antithrombin-Ill-Substitution in der Regel volumenbedingte Grenzen gesetzt sind'.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß Antithrombin III aus Humanzitratplasma in einer Rohfraktion durch Adsorption an Aluminiumhydroxid angereichert werden kann (Monkhouse, F. C, France, E. S. and Seegers, W. H.: Studies on the antithrombin III and heparincofactor activities of a fraction adsorbed from plasma by aluminium hydroxide. Circulation research 3 [1955] 397). Von Rosenberg, R. D. und Damus, P.S. (The purification and mechanism of action of human antithrombin-heparin cofactor. Journal of Biological Chemistry 281 [1973] 6490-6505) werden die Anreicherung von ATIII und dessen weitere Reinigung ausführlich beschrieben: Vor der Adsorption des ATIII am Aluminiumhydroxid mußausdem Plasma (1 000 bis 1 500 ml) der Prothrombin komplex durch Adsorption an Bariumcarbonat abgetrennt und das Fibrinogen durch eine thermische Behandlung des Plasmas (3 Minuten bei 54°C) weitgehend entfernt werden. Nach schneller Abkühlung auf O⁰C, wobei zur Defibrinieru ng jeweils nur10bis15ml Plasma eingesetzt werden, wird das Fibrinogen durch Zentrifugation abgetrennt. Anschließend wird das Plasma 15 min mit Aluminiumhydroxid.behandelt, das Adsorptionsmittel wird durch Zentrifugation abgetrennt.

Das erhaltene Präzipitat wird anschließend mit Natriumchloridlösung (0,15mol/l) ausgewaschen und anschließend das Antithrombin III mit Ammoniumphosphat (0,36mol/l, pH 8,1) in der3stufigen Elution freigesetzt, bei der insgesamt 540 ml Elutionsflüssigkeit eingesetzt werden. Durch Diafiltration wird das Eluat innerhalb von 12 bis 24 Stunden auf 35ml konzentriert. Bei einer AT-Ill-Ausbeute von 55% wird bis zu diesem Verfahrensschritt eine auf die Proteinmenge im Ausgangsmaterial bezogene 5- bis 8fache Anreicherung des Antithrombin III erhalten.

Im USP 4301153 wird von Rosenberg, R. D. mitgeteilt, daß das Antithrombin-Ili-Präparat, isoliert auf dieser Verfahrensstufe, tiefgefroren bei -20⁰C oder -9O⁰C über 20 Stunden bis 7 Tage gelagert, bis zu 60% seiner Aktivität verliert. Das AT-Ill-Präparat dieser Verfahrensstufe wird durch Gelfiltration an Sephadex G 200, lonenaustauschchromatographie an DEAE-Zellulose oder DEAE-Sephadex A-50 und durch isolelektrische Fokussierung weiter gereinigt.

Der Verfahrensschritt der thermischen Defibrinierung bei 54⁰C ist technisch sehr aufwendig, da wegen der Temperaturempfindlichkeit der meisten Proteine das Plasma sehr schnell auf 54°C erwärmt werden muß, die angegebene Zeit von 3 Minuten genau einzuhalten ist und aus den gleichen Gründen eine schnelle Abkühlung erforderlich ist. Nur so ist eine Denaturierung oder Inaktivierung des Antithrombin III in einem wesentlichen Umfang zu vermeiden, jedoch nicht auszuschließen. Das Verfahren kann deshalb nur mit kleinen Plasmamengen mit der notwendigen Sicherheit durchgeführt werden. Ein weiterer Nachteil ist, daß das Fibrinogen und die Faktoren des Prothrombinkomplexes nicht als therapeutisch einsetzbare Plasmafraktionen isoliert werden. Auch wird das isolierte und gereinigte ATIII nicht für therapeutische Zwecke eingesetzt.

Fischer, A. M. et'al. (Respective roles of antithrombin III and alpha 2-macroglobulin in thrombin inactivation. Thrombos.

Haemostas. 45 [1981 ] 51-54) defibrinieren das Plasma vor der AT-Ill-Adsorption an Aluminiumhyroxid mit Bentonit. Sie erreichen ähnliche Ergebnisse hinsichtlich der Ausbeute und des Anreicherungsgrades des ATIII nach Adsorption, Auswaschen und Freisetzung des ATIII vom Aluminiumhydroxid wie Rosenberg und Damus.

Hensen, A. und Loeliger, E. A. (Antithromin III. Its metabolism and its function" in blood coagulation. Thrombos. Diathes.

Haemorrh. 9, Suppl. 1 [1963] 1—84) defibrinieren das Plasma zunächst ebenfalls durch thermische Behandlung bei 54°C über 2 min und entfernen vor der AT-Ill-Adsorption zusätzlich die Gerinnungsfaktoren Xl und XII durch Adsorption an Celit.

Von Wickerhauser, M. und Sgouris, J. T. (Development of large scale fractionation methods. II. Isolation of a factor IX concentrate for clinical use. Vox Sang. 22 [1972] 137-160) wird Antithrombin III aus der Cohn-IV-Fraktion, die kein Fibrinogen enthält, durch Adsorption an Aluminiumhydroxid ebenfalls nur als Rohfraktion gewonnen, die nach weiterer Reinigung durch Fällung mit Ammoniumsulfat zur Stabilisierung von Prothrombinkomplexkonzentraten eingesetzt wird.

Im USP 4087415 wird in einem Mehrstufenverfahren Antithrombin III durch Adsorption an Aluminiumhydroxid angereichert.

Hinsichtlich der Fibrinogenentfernung wird dort ausgeführt: „Wenn man die Kältefällung (Kryopräzipitation) in der anfänglichen Stufe zur Abtrennung des Fibrinogensund des Faktors VIII anwendet, wird der Überstand aus der 3. Stufe etwa 5 min auf etwa 56°C erhitzt, u meine vollständige Abtrennung des Fibrinogens zu gewährleisten." Die Anwendung des Verfahrens erfordert den Einsatz von Äthylenoxid-Propylenoxid-Blockpolymeren und Polyäthylenglykol in mehreren Verfahrensstufen, es läßt sich in ein vorhandenes System der Plasmafraktionierung deshalb nicht einordnen. Die Abtrennung des ATIII, adsorbiert am Aluminiumhydroxid, erfolgt in der 4. Verfahrensstufe und die Freisetzung des Antithrombin III wird durch Behandlung mit 0,37mol/l Natriumphosphat bei einem pH von 7,8 erreicht. Angaben zur Anreicherung des ATIII in dieser Verfahrensstufe werden nicht gemacht, es sind jedoch noch 2 weitere Verfahrensstufen zur Abrennung von Begleitproteinen des ATIII erforderlich.

Im USP 4340589 wird das Plasma ebenfalls durch eine Behandlung bei 56°C über 3min defibriniert. Die Freisetzung des Antithrombin III erfolgt nach Monkhouse ebenfalls mit einem Phosphatpuffer, es ist eine weitere Reinigung des ATIII durch Chromatographie, an DEAE-Zellulose erforderlich.

Es ist auch bekannt, die Faktoren II, VII, IX und X (Prothrombinkomplex) aus Humanzitratplasma durch Adsorption an Aluminiumhydroxid abzutrennen und das Konzentrat dieser Faktoren für therapeutische Zwecke einzusetzen (z. B. Barowcliffe,

T. W., Stableforth, P. and Dormandy, K. M.: Small scale preparation and clinical use of factor IX-prothrombincomplex. Vox Sang.

25 [1973)426-441; Bruning, P. F., Loeliger, E. A.: Prothrombal: A new concentrate of human prothrombin complex for clinical use. British Journal of Haematology 21 [1971] 377-378).

Das Verfahren war in dertechnischen Ausgestaltung schwierig, da bei der Adsorption des Prothrombinkomplexes kurze Kontaktzeiten von 5min genau eingehalten werden mußten. Eine Aktivierung der Faktoren des Prothrombinkomplexes war trotzdem nicht ganz zu vermeiden. Es ist bekannt, daß aktivierte Faktoren in Prothrombinkomplexkonzentraten zu thromboembolischen Komplikationen führen können.

Es ist bekannt, daß durch einen Zusatz von Heparin und Antithrombin III in allen Verfahrensstufen der Isolierung des Prothrombinkomplexes die Aktivierung der Prokoagulantien II, VII, IX und X verringert oder überhaupt vermieden werden kann.

Solche Präparate zeigen keine thromboembolischen Komplikationen beim Empfänger (z.B. DDRWP 148297, DDRWP 157998, USP 4465 523). Es wird in diesen und anderen Quellen zum Ausdruck gebracht, daß der Zusatz von Heparin zum Antithrombin III enthaltenden Ausgangsmaterial möglichst frühzeitig vor dem Tieffrieren des Frischplasmas erfolgen sollte, da dadurch auch die Ausbeute an Faktor VIII, hergestellt durch Kryopräzipitation oder andere Verfahren, erhöht werden kann. Daraus ergibt sich, daß Heparin enthaltende Ausgangsmaterialien für eine Gewinnung weiterer therapeutisch einzusetzender Plasmafraktionen zur Verfugung stehen.

Es ist bekannt, daß organische Adsorbentien wie Heparin-Sepharose zur Isolierung und Reinigung von Antithrombin III eingesetzt werden können (z.B. Miller-Andersson, M., Borg, H. and Andersson, L. O.iPurification of antithrombin III by affinity chromatography. Th rom b. Res. 5 [1974] 439—452). Das Verfahren wird zur Herstellung von Antithrombin III für therapeutische Zwecke genutzt (Wickerhauser, M., Williams, C. and Mercer, J.: Development of large scale fractionation methods. VII. Preparation of a antithrombin III concentrate. Vox Sang. 36 [1979] 294-299; Wickerhauser, M. and Williams, C: A single step method for isolation of antithrombin III. Vox Sang. 47[1984] 397-405).

Bei einer AT-Ill-Ausbeute von ca. 30% wird eine hohe Anreicherung des Antithrombin III in einem Einstufenverfahren erreicht.

Die AT-Ill-Präparate zeigen jedoch einen Aktivitätsabfall bei der Lagerung im tiefgefrorenen Zustand und bei der Lyophilisation, ein entsprechender Hinweis ist u.a. im USP 4340589 enthalten. Die Adsorbentien sind teuer. Während der Adsorption sind Aktivierungsreaktionen nicht auszuschließen und die Freisetzung des ATIII von der Heparin enthaltenden Matrix kann zu Strukturveränderungen im AT-Ill-Molekül führen. Außerdem ist die AT-Ill-Bindung an die Heparin-Sepharose auch nicht spezifisch. AT-Ill-Protease-Komplexe und andere Proteine wie z. B. Lipoproteine, Komplementfaktoren, andere Proteaseinhibitoren, Fibronectin und andere Proteine der Zelloberfläche werden ebenfalls an der Heparinsepharose gebunden.

Diese Proteine müssen durch eine entsprechende Verfahrensgestaltung abgetrennt werden, wenn das ATIII therapeutisch eingesetzt werden soll.

Es ist weiterhin bekannt, Antithrombin III durch Adsorption an tri-Calciumphosphat für therapeutische Zwecke zu isolieren (DDR WP 140981 und DEOS 2902158). Beide Verfahren sind jedoch auf den Einsatz zitratfreier Ausgangsmaterialien beschränkt, d.h., daß entweder Chelaplex III als Antikoagulans bei der Blutentnahme eingesetzt werden muß oder das Zitrat in einem technisch aufwendigen Verfahren vor der AT-Ill-Adsorption an tri-Calciumphosphat entfernt werden muß.

Es ist bekannt, daß der therapeutische Einsatz von Plasmaproteinen mit der Gefahr der Übertragung der Hepatitis B, der NONA, NON B Hepatitis und anderer Krankheiten verbunden ist. Eine Präparation jedoch, die mindestens 10 Stunden bei 6O⁰C in wäßriger Lösung gehalten wird, gilt heute als praktisch hepatitissicher, insbesondere dann, wenn man Blutplasma einsetzt, in dem mit Testmethoden der 3. Generation Hepatitisviren nicht nachgewiesen wurden.

Proteine können jedoch 10 Stunden bei 60⁰C in wäßriger Lösung nur durch den Zusatz von stabilisierend wirkenden Substanzen behandelt werden, ohne daß sie in einem wesentlichen Umfang denaturiert werden.

Für Antithrombin III wurde gefunden, daß dessen thermische Stabilität durch den Zusatz von 0,5 mol/l bis 2,0 mol/l Natriumzitrat erhöht werden kann und daß in solchen Lösungen Hepatitisviren inaktiviert werden (Tabor, E., Murano, G., Snoy, P. and Gerety,

R. J.: Inactivation of hepatitis B virus by heat in antithrombin III stabilised with citrate. Throrhb. Res. 22 [1981] 233-238; Wickerhauser, M. and Williams, C: Antithrombin III concentrates for clinical use. The effects of pasteurisation and freeze drying.

Abstracts of the Congress of International Society of Haematology and International Society of Blood transfusion, Montreal 1980,

Von McKay, E. J. (A simple two-step procedure for the isolation of antithrombin III from biological fluids. Throm. Res. 21 [1981] 375-382) wurde gefunden, daß es zweckmäßig ist, vor der AT-Ill-Isolierung durch Affinitätschromatographie an Heparin-Sepha.rose Lipoproteine und andere Proteine mit einer Affinität zum Heparin durch Behandlung mit hochmolekularem Dextransulfat und Calciumchlorid abzutrennen. Es ist bekannt, daß die Lipoproteine des Humanplasmas als wasserlösliche Transportform für Triglyceride, Cholesterinester und Phospholipide wegen ihrer Labilität die Stabilität von Plasma oder

Plasmafraktionen ungünstig beeinflussen. . ir^u-x

Lipoproteine können durch Flotation, Behandlung des Plasmas mit kolloidalem S1O2 (OS DE 3247150) adsorbiert, durch' Polyanionen wie Dextransulfat oder Heparin bei Gegenwart der Kationen Ca⁺⁺,Mg⁺⁺oderMn⁺⁺ präzipitiertoderan Derivate des Polyhydroxymethylens (OS DE 3330648) adsorbiert werden.

Es ist auch bekannt, daß durch Behandlung von Humanplasma mit nichttoxischen Detergentien wie Triton X100 undTween 80 gegebenenfalls bei Gegenwart von Äther im Plasma vorhandene Viren inaktiviert werden und daß bei dieser Behandlung verfahrensbedingt Lipoproteine und andere Eiweiße entfernt werden können (USP 4481189, USP 4314997).

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, das bekannte Verfahren der Anreicherung von Antithrombin III in einer Rohfraktion durch Adsorption an Aluminiumhydroxid als Einstufenverfahren mit den Verfahrensschritten Adsorption, Auswaschen von Begleitproteinen und Freisetzung des ATIII so zu gestalten, daß gegenüber dem Stand der Technik ein Antithrombin-Ill-Konzentrat für den therapeutischen Einsatz erhalten wird.

Gegenüber dem Stand der Technik sollen solche Bedingungen für die Adsorption und Elution (Freisetzung) des Antithrombin III gewählt werden, die die Gefahr irreversibler Strukturveränderungen des AT-Ill-Moleküls herabsetzen. Das Antithrombin III soll in der Zubereitung stabil sein und nach der Verfahrensstufe Elution soll eine solche spezifische Aktivität des Antithrombin III erreichtwerden, daß die El u ate ohne weitere Anreicherung (Reinigung) des Antith rombin III auf dieser Verfahrensstufe und ohne Umpufferung direkt zur Inaktivierung von möglicherweise im Präparat vorhandenen Krankheitserregern 10 Stunden bei 60"C pasteurisiert werden können, ohne daß die biologische Aktivität des Antithrombin III in einem wesentlichen Umfang durch diese Behandlung herabgesetzt wird, wobei in Abhängigkeit von der eingesetzten Menge Elutionsfiüssigkeit eine Konzentrierung der Eluate z. B. durch Diafiltration oder ein anderes Verfahren notwendig sein kann.

Wird ein Antithrombin-Ill-Konzentrat höherer spezifischer Aktivität als das erfindungsgemäß hergestellte gefordert, soll eine weitere Reinigung des Eluats ohne wesentlichen Aktivitätsverlust nach bekannten Verfahren möglich sein. Ausgehend vom Stand der Technik sollen vorzugsweise die Nachteile beseitigt werden, daß das Fibrinogen im Ausgangsmaterial in einem der Antithrombin-Ill-Adsorption vorgeschalteten Verfahrensschritt obligatorisch vorzugsweise durch thermische Behandlung möglichst vollständig abzutrennen ist und daß das Antithrombin III lediglich in einer Rohfraktion mit einem für den therapeutischen Einsatz ungenügenden Anreicherungsgrad und unzureichender Stabilität isoliert wird. In der Verfahrensgestaltung soll gewährleistet sein, daß das nur in beschränkter Menge zur Verfügung stehende Humanplasma möglichst ökonomisch auch dadurch genutzt wird, daß die vor der Isolierung des Antithrombin III notwendigerweise abzutrennenden Plasmafraktionen wie Faktor VIII, die Faktoren des Prothrombinkomplexes und gegebenenfalls auch Fibrinogen in Zubereitungen isoliert werden, die direkt oder nach weiterer Reinigung für therapeutische Zwecke eingesetzt werden. Es soll auch erreicht werden, daß das Verfahren ohne Schwierigkeiten in ein vorhandenes System der Plasmafraktionierung eingeordnet werden kann und daß auch keine Verfahrensänderungen bei der Isolierung von z.B. Albumin und Gämmaglobulin notwendig sind, die in der Regel nach dem ATIII abgetrennt'werden.

Bei der Verfahrensgestaltung ist gleichermaßen zu gewährleisten, daß verschiedene Ausgangsmaterialien, die bei dem Stand der Technik zur Verfügung stehen und bei denen Zitrat, Chelaplex III und/oder Heparin als Antikoagulantien verwendet werden, aber auch das ohne Zusatz von Antikoagulantien gewonnene lonenaustauschplasma, eingesetzt werden können.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Antithrombin III aus Humanplasma, das die Antikoagulantien Zitrat, Chelaplex III und/oder Heparin enthalten kann oder das im Falle des lonenaustauscherplasmas frei von Antikoagulantien ist, vorzugsweise aber nach Abtrennung der Humanplasmafunktionen Kryopräzipitat und/oder Cohn I sowie der Humanplasmafraktion Prothrombinkomplexkonzentrat, in einem einfachen Einstufenverfahren als stabile Zubereitung einer solchen Zusammensetzung zu isolieren, die nach Pasteurisierung und Lyophilisation als Antithrombin-Ill-Konzentrat zur Therapie von Antithrombin-Ill-Mangelzuständen verwendet werden kann. Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung und Anreicherung von Antithrombin III in einem AT-Ill-Konzentrat durch Adsorption an Aluminiumoxidhydrat. Anmerkung:

In den im Abschnitt Charakteristik der bekannten technischen Lösungen angegebenen Quellen wird das Adsorbens entweder als Aluminiumhydroxid oder als alumina gel bezeichnet.

Für das in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Adsorptionsmittel trifft die der Formel Ai(OH)₃ entsprechende Zusammensetzung nicht zu, so daß in den weiteren Ausführungen die Bezeichnung Aluminiumoxidhydrat verwendet wird. Das Verfahren zur Anreicherung von Antithrombin III in einer Rohfraktion durch Adsorption an Aluminiumoxidhydrat hat bei dem Stand derTechnikfolgende entscheidende Nachteile:

Vorder Adsorption des ATIII an Aluminiumhydroxid muß das Fibrinogen obligatorisch weitgehend abgetrennt werden. Die bereits erwähnten Verfahren zur Abtrennung des Fibrinogens vorzugsweise durch thermische Behandlung des Plasmas über 3 bis 5 Minuten bei 54 bis 56⁰C sind für Großpool verfahren mit einer Chargengröße von mehr als 1001 technisch nur schwer zu lösen, da Zeit und Temperatur genau einzuhalten sind, die Solltemperatur möglichst schnell erreicht und nach Defibrinierung des Plasmasso schnell wie möglich auf O⁰C abgekühlt werden muß. Auch unabhängig von der Chargengröße sind die Defibrinierung bei 54bis56°C, aberauchdieFibrinogenadsorption an Bentonit bzw. kollidalem SiO₂, mit der Gefahr verbunden, daß die biologische Aktivität des Antithrombin III im Ausgangsmaterial durch diese Behandlung herabgesetzt wird.

Bei dem Stand der Technik wird das Antithrombin III in der Rohfraktion um das 5- bis 8fache angereichert. In der Rohfraktion ist das Antithrombin III nicht stabil, bereits durch Tieffrieren kommt es zu einem beträchtlichen Aktivitätsverlust.

Die Rohfraktion des ATIII muß durch Verfahren wie Adsorptionschromatographie an DEAE-ZeIIulose oder DEAE-Sephadex A-50 oder durch eine mehrstufige Fällung mit Polyäthylenoxid bzw. Äthylenoxid-Propylenoxid-Blockpolymeren weiter gereinigt werden, bevor das Antithrombin III pasteurisiert werden kann.

Erfindungskennzeichnend ist, daß die eingesetzten Ausgangsmaterialien mit einem normalen oder erniedrigten Fibrinogengehalt ohne Defibrinierung direkt mit Aluminiumoxidhydrat zur Antithrombin-Ill-Adsorption behandelt werden und daß die Freisetzung des Antithrombin III vom Adsorptionsmittel nicht wie bisher üblich mit Natrium-oder Ammoniumphosphat, sondern mit Zitrat enthaltenden Elutionsflüssigkeiten erfolgt.

Es wurde gefunden, daß auch das zur Adsorption des Antithrombin III eingesetzte Aluminiumoxidhydrat bekanntermaßen die Faktoren des Prothrombinkomplexes, Fibrinogen, Plasminogen und andere Proteine adsorbiert, die mit den üblicherweise eingesetzten Phosphat enthaltenden Elutionsflüssigkeiten zumindest teilweise das Eluat verunreinigen, so daß nur eine ca.

8fache Anreicherung des Antithrombin III mit den Verfahrensschritten Adsorption, Auswaschen des Adsorbens und Elution erreicht werden kann.

Überraschend wurde nun gefunden, daß durch den Einsatz von Zitrat enthaltenden Pufferlösungen zur Elution des Antithrombin

III vom Aluminumoxidhydrat in Abhängigkeit von der Zitratkonzentration der auf Protein bezogene Anreicherungsgrad |

(spezifische Aktivität) des Antithrombin III gezielt erhöht werden kann, ohne daß Aktivierungsreaktionen über die noch im j

Ausgangsmaterial vorhandenen Prokoagulantien in einem wesentlichen Umfang ablaufen, die die Ausbeute an Antithrombin III I

verringern würden und daß unerwünschte Begleitproteine im Eluat nicht oder nur in geringer Konzentration vorhanden sind. ;

Ein Hinweis auf den geringen Umfang einer unerwünschten Aktivierung von Prokoagulantien durch deren Oberflächenkontakt i

mit dem Adsorptionsmittel ergibt sich auch aus derTatsache, daß die Bedingungen für die Adsorption des AT III in !

verhältnismäßig weiten Grenzen variiert werden können. Es wurde gefunden, daß die Temperatur bei der AT-Ill-Adsorption zwischen -2⁰C und 25°C betragen und die Dauer d er Adsorption zwischen 3 Minuten und 24 Stunden liegen kann, ohne daß Ausbeute und spezifische Aktivität bei verlängerten Kontaktzeiten in einem wesentlichen Umfang negativ beeinträchtigt werden.

Es wurde gefunden, daß auch der pH bei der Adsorption, bei der Entfernung von Begleitproteinen durch Auswaschen des ]

Adsorptionsmittelsund bei der Elution des Antithrombin III kein kritischer Parameter ist. Es kann bei einem pH zwischen 7,0 und 9,1 gearbeitet werden, vorzugsweise wird bei einem pH zwischen 7,0 und 8,0 gearbeitet.

Es wurde gefunden, daß die Freisetzung des Antithrombin III vom Aluminiumoxidhydrat mit Lösungen erfolgen kann, die zwischen 0,50 und 2,0mol/l Natriumzitrat, Kaliumzitrat oder Ammoniumzitrat enthalten.

Es ist vorteilhaft, den Elutionsflüssigkeiten, aber auch den Waschflüssigkeiten zur Bindung eventuell vorhandener Aluminiumionen geeignete Komplexbildner zuzusetzen, wiez. B. 0,001 bis 0,05 mol/l Chelaplexlll (Dinatriumäthylendiamintetraazetat-2-hydrat).

Es wurde gefunden, daß die Elutions- und Waschflüssigkeiten zweckmäßigerweise Glycin in einer Konzentration bis zu 0,25 mol/l enthalten.

Es wurde gefunden, daß es zweckmäßig ist, die Eluate, gegenbenenfalls nach Konzentrierung, beispielsweise durch Diafiltration, ohne weitere Reinigungsschritte auf dieser Verfahrensstufe zu pasteurisieren.

Es wurde gefunden, daß zur Herstellung von Antithrombin-Ill-Konzentraten Ausgangsmaterialien eingesetzt werden können, die als Antikoagulantien Zitrat, Chelaplex III und/oder Heparin in bei der Blutkonservierung üblichen Konzentrationen enthalten oder die wie das lonenaustauscherplasma frei von diesen Antikoagulantien sind und die Fibrinogen in normaier^Konzentration enthalten.

Es ist jedoch nicht zuletzt auch aus ökonomischen Gründen vorteilhaft, Ausgangsmaterialien einzusetzen, aus denen der Faktor VIII und auch Fibrinogen zumindest teilweise durch Kryopräzipitation, Äthanolfällung oder ein anderes Verfahren sowie die Faktoren des Prothrombinkomplexes als therapeutisch einsetzbare Präparate abgetrennt wurden. Es wurde gefunden, daß'es günstig ist, die Faktoren des Prothrombinkomplexes möglichst vollständig abzutrennen. Werden beispielsweise die Faktoren des Prothrombinkomplexes durch Adsorption an DEAE-Sephadex A-50 entfernt, dann kann es in Abhängigkeit von der Gestaltung dieses Verfahrens zweckmäßig sein, die nach der Adsorption an DEAE-Sephadex A-50 im Plasmaüberstand noch vorhandenen Prokoagulantien II, IX und X, besonders aber den Faktor VII, durch geeignete Verfahren zu entfernen.

Es wurde gefunden, daß es zweckmäßig ist, vor der At-Ill-Adsorption diese Prokoagulantien ebenfalls an Aluminiumoxidhydrat zu adsorbieren, wobei zwischen 5 und 15% der später für die AT-Ill-Adsorption eingesetzten Menge Aluminiumoxidhydrat Verwendung finden.

Überraschend wurde nun gefunden, daß nach einer solchen Behandlung des Ausgangsmaterials die spezifische Aktivität des Antithrombin III im Eluat erhöht werden kann, da die Menge einzusetzenden Aluminiumoxidhydrats reduziert werden kann. Wird der Prothrombinkomplex dagegen aus Chelaplex III enthaltendem Plasma oder dessen äthanolhaltigem Überstand nach Abtrennung des Fibrinogen in der Fraktion I durch Adsorption an tri-Calciumphosphat entfernt oder wird Aluminiumoxidhydrat zur Adsorption des Prothrombinkomplexes eingesetzt, ist erfahrungsgemäß ein zusätzlicher Adsorptionsschritt nicht notwendig, da in den Plasmaüberständen die Prokoagulantien II, VII, IX und X nur noch in geringer Konzentration vorliegen. Da das Alüminiumoxidhydrat kein für Antithrombin III spezifisches Adsorbens darstellt, kann in Abhängigkeit von der Menge des eingesetzten Adsorptionsmittels zwar die spezifische Aktivität des ATIIl im Eluat beeinflußt werden, jedoch verbleibt bei reduzierten Adsorptionsmittelmengen Antithrombin im Ausgangsmaterial, die Erhöhung der spezifischen Aktivität erfolgt zu Lasten der Ausbeute.

Es wurde jedoch gefunden, daß Lipoproteine aber auch andere Proteine des Ausgangsmaterials affine Stellen des Adsorptionsmittels für Antithrombin III zumindest teilweise blockieren und so zu einem Mehrbedarf an diesem führen, wenn die gleiche Menge Antithrombin III adsorbiert werden soll.

Erfindungsgemäß hat die Herstellung von Antithrombin-Ill-Konzentraten aus Ausgangsmaterialien mit einem verringerten Gehalt an Lipoproteinen den Vorteil, daß im Vergleich zum nicht vorbehandelten Plasma AT-Ill-Präparate mit einer höheren spezifischen Aktivität erhalten.werden. Es wurde gefunden, daß bei vergleichbaren Ausbeuten in der Regel die Menge eingesetzten Aluminiumoxidhydrats verringert werden kann.

Es wurde gefunden, daß Antithrombin III aus Plasmaüberständen, denen vor der Isolierung des Faktors VIII durch Kryopräzipitation bzw. vor der Abtrennung der Faktoren des Prothrombinkomplexes Heparin (0,1 bis 2IE/ml) zugesetzt wurde, mit Vorteilen hinsichtlich der Ausbeute und spezifischen Aktivitäten isoliert werden kann. In einer besonderen Ausführungsform wird das Heparin in einer Konzentration von 0,05 bis2IE/ml dem Ausgangsmaterial bzw. dem Adsorptionsmittel vorder Antithrombin-Ill-Adsorption zugesetzt.

Es wurde gefunden, daß es bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zweckmäßig ist, Heparin bis zu einer Konzentration von 11Ε/ml den Waschflüssigkeiten zuzusetzen und die Freisetzung des Antithrombin Ml mit Elutionsflüssigkeiten durchzuführen, die neben Natriumzitrat Heparin in einer Konzentration zwischen 0,05 und 2IE/ml enthalten.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

*M50ml Humanzitratplasma werden nach Abrennung des Faktors VIII durch Kryopräzipitation und Isolierung des Prothrombinkompiexes durch Adsorption an DEAE-Sephadex A-50 gemäß DDR-WP 141 262 bei 4°C mit 65ml Aluminiumoxidhydrat Typ 8025 (VEB Säureschutz Berlin) versetzt und bei Raumtemperatur 15 min geschüttelt. Danach wird das Adsorptionsmittel durch Zentrifugieren vom Überstandsplasma getrennt. Das Präzipitat wird zweimal mit jeweils 300ml Waschflüssigkeit (0,003mol/l Chelaplex III, pH7,4) ausgewaschen und wiederum zentrifugiert.

Das Präzipitat wird mit 90 ml Elutionsflüssigkeit (1,35 mol/l Natriumzitrat, 0,003 mol/l Chelaplex III, pH 7,6) behandelt und das Antithrombin M! unter Schütteln vom Aluminiumoxidhydrat freigesetzt, erneut zentrifugiert und eine 2.Elution mit 30 ml Elutionsflüssigkeit unter den gleichen Bedingungen durchgeführt. Im Eluat sind 196 Einheiten Antithrombin III enthalten (Ausbeute 63%), wobei eine Einheit Antithrombin III der AT-Ill-Aktivitätvon 1 ml Frischplasma entspricht. Die Antithrombin-Ill-Aktivität wurde amidolytisch mit Chromozym TH (Fa. Boehringer Mannheim) nach den Angaben des Herstellers bestimmt. Im Eluat ist Antithrombin III bezogen auf die eingesetzte Proteinmenge 40fach angereichert. Nach Pasteurisierung des Eluates 10h bei 60⁰C sowie nach Konzentrierung, Entsalzung und Gefriertrocknung werden 157 Einheiten Antithrombin IM erhalten. Das entspricht einer Ausbeute von 50%.

Beispiel 2

Die Durchführung erfolgte wie im Beispiel 1 angegeben. Die Freisetzung des Antithrombin III erfolgte jedoch mit 90 ml (LEIution) bzw. 30 ml (2.Elution) einer 0,37 mol/l Natriumphosphat (pH 8,10) enthaltenden Elutionsflüssigkeit. Bei einer Ausbeute von 60% wird nun eine 8fache Anreicherung des Antithrombin III erreicht.

Beispiel 3

Das Ausgangsmaterial wird nach den Angaben von McKay, E. J. (A simple two-step procedure for the isolation of antithrombin III from biological fluids. Thromb. Res. 21 [1981] 375-382) mit CaCI₂ und Dextransulfat behandelt.

Die AT-III-Adsorption wurde, wie im Beispiel 1 angegeben, durchgeführt, wobei jedoch nur 30ml Aluminiumoxidhydrat eingesetzt wurden. Das Auswaschen und die Elution wurden, wie im Beispiel 1 angegeben, durchgeführt.

Bei einer Ausbeute von 58% wird eine 60fache Anreicherung des Antithrombin III im Eluat erhalten.

Claims (23)

1. Verfahren zur Herstellung von Antithrombin-Ill-Konzentraten durch Adsorption an Aluminiumoxidhydrat, gekennzeichnet dadurch, daß die Ausgangsmaterialien vor der AT-III-Adsorption nicht defibriniert werden, daß Humanplasma oder Plasmafraktionen, vorzugsweise die Plasmaüberstände nach Abtrennung der Humanplasmafraktionen Kryopräzipitat und/oder Cohn I sowie nach Abtrennung der Faktoren des Prothrombinkomplexes mit einem Fibrinogengehalt zwischen 1,0 und 4,5g/l, einem Gehalt an Heparin zwischen 0,0 und 5IE/ml und einem normalen oder verringerten Gehalt an Lipoproteinen zur Adsorption des Antithrombin III eingesetzt werden und daß das Antithrombin III nach Auswaschen des Adsorptionsmittels mit einer Zitrat enthaltenden Elutionsflüssigkeit vom Aluminiumoxidhydrat freigesetzt wird.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Ausgangsmaterial Humanplasma eingesetzt wird, bei dem Zitrat oder Chelaplex III oder Heparin als Antikoagulantien in üblicherweise eingesetzten Konzentrationen verwendet werden oder daß als lonen-Austauscherplasma frei von jeglichen Antikoagulantien ist.

3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß das Ausgangsmaterial neben dem Antikoagulantien Zitrat oder Chelaplex III bis zu 2IE Heparin/ml enthält.

4. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß dem kein Heparin enthaltenden Ausgangsmaterial vor der Antithrombin-Ill-Adsorption Heparin in einer Konzentration von 0,05 bis 2 ΙΕ/ml zugesetzt wird.

5. Verfahren nach Punkt 1 und Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß dem Adsorptionsmittel Aluminiumoxidhydrat das Heparin in einersolchen Menge vorder Adsorption des Antithrombin III zugesetzt wird, daß in der Adsorptionsmittel-Plasma-Suspension ein Heparingehalt von 0,1 bis 2IE/ml erreicht wird.

6. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß aus dem Ausgangsmaterial Faktor VIII und/oder Fibrinogen durch Kryopräzipitation, durch Fällung mitÄthanol oder ein anderes Verfahren als Humanplasmafraktionen zur therapeutischen Verwendung abgetrennt werden.

7. Verfahren nach Punkt 1 bis 3 und Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß die Faktoren des Prothrombinkomplexes entweder durch Adsorption an DEAE-Sephadex A-50, DEAE-Zellulose, tri-Calciumphosphat, penta-Calciumhydroxidtriphosphat oder Aluminiumoxidhydrat möglichst weitgehend als Humanplasmafraktion zur therapeutischen Verwendung abgetrennt werden.

8. Verfahren nach Punkt 1 und Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, daß eine Adsorption mit 5 bis 15% derzur AT-Ill-Adsorption eingesetzten Menge Aluminiumoxidhydrat zurEntfemung von restlichen Prokoagulantien des Prothrombinkomplexes vor der Antithrombin-Ill-Adsorption durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß im Ausgangsmaterial vor der AT-Ill-Adsorption der Gehalt an Lipoproteinen nach bekannten Verfahren vor oder nach der Abtrennung der therapeutisch eingesetzten Plasmafraktionen Kryopräzipitat bzw. Cohn I und Prothrombinkomplexkonzentrat gesenkt wird.

10. Verfahren nach Punkt 1 bis 9, gekennzeichnet dadurch, daß die Antithrombin-Ill-Adsorption bei einem pH zwischen 7,0 und 9,1, vorzugsweise bei einem pH zwischen 7,0 und 8,0 durchgeführt wird.

11. Verfahren nach Punkt 1 und 10, gekennzeichnet dadurch, daß die Adsorptionsdauer 3 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 15 bis 30 Minuten, beträgt.

12. Verfahren nach Punkt 1 bis 11, gekennzeichnet dadurch, daß zur Entfernung von Begleitproteinen zitratfreie hypotone bis hypertone Waschflüssigkeiten mit einem pH zwischen 5,5 und 9,1, vorzugsweise mit einem pH zwischen 7,0 und 8,0 eingesetzt werden, die einen Komplexbildner, vorzugsweise Chelaplex III in einer Konzentration von 0,001 bis 0,05mol/l, enthalten.

13. Verfahren nach Punkt 1 und Punkt 12, gekennzeichnet dadurch, daß als Neutralelektrolyt vorzugsweise Natriumchlorid eingesetzt wird.

14. Verfahren nach Punkt 1 und Punkt 12 bis 13, gekennzeichnet dadurch, daß die Waschflüssigkeit Glycin enthält, vorzugsweise in einer Konzentration zwischen 0,05 und 0,25mol/l.

15. Verfahren nach Punkt 1 und Punkt 12 bis 14, gekennzeichnet dadurch, daß derWaschflüssigkeit bis zu 11E Heparin/ml zugesetzt werden.

16. Verfahren nach Punkt 1 bis 15, gekennzeichnet dadurch, daß zur Freisetzung des Antithrombin III vom Aluminiumoxidhydrat eine 0,50 bis 2,0mol/l Natriumzitrat enthaltende Pufferlösung eingesetzt wird.

17. Verfahren nach Punkt 1 und 16, gekennzeichnet dadurch, daß die Elution des Antithrombin 111 bei einem pH zwischen 7,0 und 9,1 vorzugsweise bei einem pH zwischen 7,0 und 8,0 erfolgt.

18. Verfahren nach Punkti und Punkt 16 bis 17, gekennzeichnet dadurch, daß die Elutionspuffer einen Komplexbildner enthalten, vorzugsweise Chelaplex 111 in einer Konzentration zwischen 0,001 und

• 0,05mol/l.

19. Verfahren nach Punkt 1 und Punkt 16 bis 18, gekennzeichnet dadurch, daß dem Elutionspuffer Glycin bis zu einer Konzentration von 0,25mol/l zugesetzt wird.

20. Verfahren nach Punkt 1 und Punkt 16 bis 19, gekennzeichnet dadurch, daß der Elutionspuffer Heparin in einer Konzentration bis zu 2 ΙΕ/ml enthält.

21. Verfahren nach Punkt 1 und Punkt 16 bis 20, gekennzeichnet dadurch, daß anstelle Natriumzitrat Kaliumzitrat in einer Konzentration von 0,50 bis 2,0mol/l zur Freisetzung des Antithrombin III verwendet wird.

22. Verfahren nach Punkt 1 und Punkt 16 bis 20, gekennzeichnet dadurch, daß anstelle Natriumzitrat Ammoniumzitratin einer Konzentration von 0,5 bis2,0mol/l zur Freisetzung des Antithrombin III verwendet wird.

23. Verfahren nach Punkt 1 und Punkt 10 bis 22, gekennzeichnet dadurch, daß die Verfahrensschritte Adsorption, Auswaschen von Begleitproteinen und Elution des Antithrombin III bei Temperaturen zwischen -2°C und 25°C, vorzugsweise bei Temperaturen zwischen 4°C und 15⁰C, durchgeführt werden.