DE69632629T2

DE69632629T2 - Thrombin zusammensetzung

Info

Publication number: DE69632629T2
Application number: DE69632629T
Authority: DE
Inventors: Randle Ian MACGREGOR; Charles John HARDY; Olive Aberdour DRUMMOND
Original assignee: Common Services Agency
Current assignee: Common Services Agency
Priority date: 1995-02-24
Filing date: 1996-02-23
Publication date: 2005-06-09
Anticipated expiration: 2016-02-24
Also published as: JP3819935B2; JPH11500619A; ES2218583T3; CA2212832C; CA2212832A1; EP0813598B1; AU709673B2; US5907032A; DE69632629D1; EP0813598A1; AU4836496A; WO1996026269A1; ATE268380T1; GB9503750D0

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren zum Herstellen von Thrombin, insbesondere von humanem Thrombin, sowie Thrombinpräparate, die in gefriergetrockneter Form hergestellt werden können und zur Inaktivierung von etwaigen vorhandenen Viren einer Wärmebehandlung unterzogen werden können.
Hintergrund der Erfindung
Thrombin stellt das Produkt der Aktivierung von Prothrombin durch den Faktor Xa in Plasma dar. Es stellt eine wirksame Serin-proteinase mit breiter Spezifität dar, die Fibrinogen in Fibrin umwandelt und die Fibrinvernetzung durch Aktivierung von Faktor XIII fördert. Zu einer Anzahl von weiteren beobachteten biologischen Aktivitäten gehört auch, dass Thrombin mehrere Rückkopplungsschleifen in der Gerinnungskaskade steuert und die Blutplättchen-Freisetzungsreaktion induziert (1, 2).
Thrombin wird seit vielen Jahren als topisches hämostatisches Mittel verwendet. Da es jedoch eine Komponente von Fibrin-Dichtungsmittel (Fibrinleim) darstellt, wird sich wahrscheinlich die klinische Anwendung von Thrombin noch ausweiten. Thrombin wird in Fibrin-Dichtungsmitteln dazu herangezogen, an einer Schnittfläche oder innerhalb eines Transplantats Fibrinogen in Fibrin umzuwandeln. Es wurden zahlreiche chirurgische Anwendungsmöglichkeiten in einem breiten Bereich von chirurgischen Spezialgebieten beschrieben (3, 4).
Rinderthrombin wird derzeit in breitem Umfang als topisches hämostatisches Mittel oder als eine Komponente von handelsüblichen Fibrin-Dichtungsmitteln verwendet. Obgleich der artige Thrombinprodukte biologisch wirksam sind, sind sie mit dem gut dokumentierten Risiko von allergischen Reaktionen und der Induktion von Antikörpern gegen Rinderthrombin oder gegen Verunreinigungen, wie Rinderfaktor V, verbunden, und zwar üblicherweise nach wiederholter Anwendung (5, 6 und 7). Ortel et al. (8) zogen kürzlich den Schluss, dass derartige erworbene Koagulationsfaktor-Inhibitoren vermutlich häufiger auftreten, als derzeit angenommen wird und dass diese Inhibitoren trotz ihres häufigen klinischen Nutzens mit einer lebensbedrohenden Hämorrhagie verbunden sein können. Aus diesem Grund wird die Entwicklung eines Verfahrens zum Herstellen von humanem Thrombin, das sich zur Verwendung als topisches Hämostatikum oder als Bestandteil eines Fibrin-Dichtungsmittels eignet, angestrebt.
Natürlicherweise entsteht Thrombin, wenn Prothrombin (Faktor II) durch aktivierten Faktor X, aktivierten Faktor V, Phospholipid und Calciumionen in Thrombin umgewandelt wird. Die Umwandlung von Prothrombin in Thrombin kann in Abwesenheit einiger der assoziierten Komponenten erfolgen, jedoch ist dann die Umwandlungsgeschwindigkeit in unerwünschter Weise gering.
Aus dem Stand der Technik sind drei hauptsächliche in vitro-Prothrombin-Umwandlungsverfahren bekannt. Das erste Verfahren stützt sich auf die Verwendung von Thromboplastin. Prothrombin wird unter Verwendung von Thromboplastin vorzugsweise in Gegenwart von Calciumchlorid zu Thrombin umgewandelt. Dieses Verfahren ist in einer Anzahl von Patentveröffentlichungen beschrieben, z. B. in EP-0439156A und EP 0505604A. Ein Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es sich beim Thromboplastin üblicherweise um ein rohes Präparat handelt, das aus frisch homogenisiertem Hirn-, Lungen- oder Darmgewebe hergestellt worden ist. Dieses Verfahren eignet sich nicht zur Herstellung von humanem Thrombin, da die Reagenzien je nach ihrer Herkunft die Gefahr einer Virus- oder Überkreuzspezies-Verunreinigung mit sich bringen können.
Ein zweites Verfahren verwendet einige Komponenten aus Rattengift zur Bildung von Thrombin (9, 10, 11). Jedoch wurde berichtet, dass einige der Gifte innerhalb von Thrombin nicht die gleichen Bindungen spalten wie der natürliche Aktivator Faktor Xa (12). Somit können gefährliche Folgeerscheinungen auftreten, sofern eine nicht-physiologische Form von Thrombin klinisch verwendet wird.
Beim dritten in vitro-Verfahren handelt es sich im Wesentlichen um das gleiche Verfahren wie beim natürlichen in vivo-Vorgang, wobei Thrombin durch aktivierten Faktor X, Faktor V, Phospholipid und Calciumionen unter nahezu physiologischen Bedingungen in Thrombin umgewandelt wird. Dieses Verfahren wird beispielsweise in EP-0528701, EP-0378798 und US-5 219 995 beschrieben. Jedoch ist das gebildete Thrombin häufig instabil, sofern nicht exogene Proteine, Polyole und/oder Zucker dem Thrombin zugesetzt werden, um es zu stabilisieren.
Da humanes Thrombin aus Plasma stammt, das aus Blutspenden gewonnen wird, besteht die Gefahr einer Verunreinigung des Thrombins durch etwaige Viren, die in der ursprünglichen Blutspende vorhanden sein können. Deshalb sollten sämtliche humanen Thrombinpräparate, die für eine klinische Anwendung bestimmt sind, vor der Verwendung einer Stufe zur Virusinaktivierung unterzogen werden.
Es wurde eine Virusinaktivierung durch eine Behandlung mit Lösungsmittel/Detergens beschrieben (13). Jedoch kann es erforderlich sein, dass das Thrombinpräparat weiteren Reinigungsstufen zu unterziehen ist, um das Lösungsmittel/Detergens zu entfernen. Andere Autoren beschrieben die Verwendung von virusinaktivierten Prothrombin-Ausgangsmaterialien, wobei sie aber keine Verfahren zur Virusinaktivierung der daraus hergestellten Thrombinprodukte beschreiben; vergl. z. B. EP-0378798 und EP-0543178. Eine endgültige (z. B. als letzte Stufe eines Verfahrens) Virus inaktivierung des Produkts wird als das vermutlich sicherste und wirksamste Verfahren zur Virusinaktivierung angesehen, da dadurch die Möglichkeit einer Rekontamination auf ein Minimum beschränkt wird.
Somit besteht auf dem einschlägigen Gebiet das Bedürfnis zur Herstellung von Thrombin, das einer abschließenden Virusinaktivierung und insbesondere einer Wärmebehandlung unterzogen worden ist.
Allgemein ausgedrückt, beruht die Erfindung auf dem überraschenden Befund, dass Prothrombin in guter Ausbeute unter sauren Bedingungen in Thrombin umgewandelt werden kann und dass diese sauren Bedingungen die Stabilität des erzeugten Thrombins fördern.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Insbesondere wird gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von Thrombin bereitgestellt, wobei ein Gemisch, das Prothrombin, Faktor Xa, Faktor Va und Phospholipide enthält, bei einem pH-Wert zwischen 6,0 und 6,6 behandelt wird.
Im Allgemeinen lässt sich das Gemisch, das Prothrombin, Faktor Xa, Faktor Va und Phospholipide enthält, aus einem Überstand eines Kryopräzipitats (das durch Einfrieren und Auftauen von Plasma gebildet wird) von humanem Plasma erhalten. Das Gemisch lässt sich durch chromatographische Reinigung des Überstands von kryopräzipitiertem Plasma erhalten, im Allgemeinen durch Anionenaustauschchromatographie. Insbesondere kann ein DEAE-Cellulose-Eluat des absorbierten Überstands von kryopräzipitiertem Plasma, das zur Herstellung von klinischen Faktor IX-Konzentraten verwendet werden kann, als Gemisch für die Thrombinherstellung dienen (14). Das Gemisch kann zusätzliche Gerinnungsfaktoren enthalten, z. B. Faktor X, Faktor V, Faktor IX, Faktor IXa und Spurenmengen von Thrombin.
Aus dem Stand der Technik (z. B. EP-0378789 und EP-0528701) ergibt sich die Lehre, geringe Konzentrationen an Calciumionen (5 bis 25 mM) zu einem Prothrombin enthaltenden Gemisch bei oder in etwa bei physiologischen Bedingungen (pH-Wert 7,0 bis 7,3) zu versetzen. EP-0528701 führt aus, dass die Zugabe höherer Konzentrationen an CaCl₂ die Herstellung von Thrombin hemmt. Es ließe sich erwarten, dass die Umwandlung von Prothrombin zu Thrombin am besten unter Bedingungen abliefe, die den physiologischen Bedingungen nahekommen. Somit stellt es ein überraschendes Merkmal der vorliegenden Erfindung dar, dass Thrombin in einer besonders guten Ausbeute bei einem pH-Wert zwischen 6,0 und 6,6 hergestellt werden kann. Vorzugsweise liegt der pH-Wert zwischen 6,4 und 6,6. Ohne Festlegung auf theoretische Annahmen, wird die Auffassung vertreten, dass der pH-Wert von 6,0 bis 6,6 den Selbstabbau des gebildeten Thrombins beschränkt.
Im Allgemeinen lässt sich der pH-Wert zwischen 6,0 und 6,6 durch Zugabe von Ca²⁺-Ionen (insbesondere CaCl₂) in Konzentrationen von 50 mM bis 90 mM, vorzugsweise von 60 mM bis 80 mM und insbesondere von 65 mM bis 75 mM zum Gemisch erreichen.
Die Zugabe von CaCl₂ in den angegebenen Bereichen führt ferner im Allgemeinen zu einem Abfall des pH-Wertes des Gemisches, der zum Erzielen des erforderlichen pH-Werts ausreichen kann.
Alternativ kann das Gemisch auf einen pH-Wert zwischen 6,0 und 6,6 oder vorzugsweise zwischen 6,4 und 6,6 durch beliebige geeignete Puffer, deren Pufferungswirkung im erforderlichen Bereich bekannt ist, gepuffert werden, bevor man Ca²⁺-Ionen zur Einleitung der Umwandlung von Prothrombin zu Thrombin zusetzt. Zu Beispielen für geeignete Puffer gehören MES (2-[N-Morpholino]-ethansulfonsäure); ACES (2-[2-Amino-2-oxoethyl)-amino]-ethansulfonsäure); BES (N,N-Bis- [2-hydroxyethyl]-2-aminoethansulfonsäure); MOPS (3-[N-Morpholino]-propansulfonsäure); TES (N-Tris-[hydroxymethyl]-methyl-2-aminoethansulfonsäure); und HEPES (N-[2-Hydroxyethyl]-piperazin-N-[2-ethansulfonsäure]) und dergl. Um im Wesentlichen das gesamte Prothrombin in Thrombin umzuwandeln, soll die Umwandlung für eine zur Durchführung der Umwandlung ausreichende Zeitspanne und bei einer geeigneten Temperatur durchgeführt werden. Typischerweise lässt man die Umsetzung 12 bis 24 Stunden und vorzugsweise 16 bis 20 Stunden ablaufen. Die Umsetzung kann bei Raumtemperatur, typischerweise bei 18 bis 25°C, ablaufen und erfordert keine Inkubation bei höheren Temperaturen.
Im Allgemeinen weist auf diese Weise hergestelltes Thrombin eine Thrombin-Gerinnungsaktivität von 4 000 bis 9 000 U/ml und eine spezifische Aktivität von 250 bis 700 U/mg auf. Dies liegt erheblich über der Aktivität des nach dem in EP-0528701 beschriebenen Verfahren hergestellten Thrombins (Gerinnungsaktivität 700 bis 1 000 U/ml und spezifische Aktivität 20 bis 40 U/mg).
Ein gewisser Anteil an unerwünschtem unlöslichen Material kann im Thrombinpräparat auftreten, was vermutlich auf die Bildung von Fibrin unter der Einwirkung des erzeugten Thrombins auf etwaiges Fibrinogen, das im ursprünglichen DEAE-Cellulose-Eluat als Verunreinigung vorliegt, und auf die Bildung von unlöslichem Calciumphosphat zurückzuführen ist. Das unerwünschte unlösliche Material kann durch Zentrifugieren oder durch ein Filtrationsverfahren entfernt werden. In einigen Fällen ist das Präparat jedoch zu viskos, so dass das Thrombinpräparat vorzugsweise zur Verringerung der Viskosität verdünnt wird. Eine Verdünnung von 1 Volumenteil des Thrombinpräparats mit bis zu 4 Volumenteilen Puffer, beispielsweise mit 3 Volumenteilen, wobei es sich um einen beliebigen Puffer, der sich zur Verwendung im pH-Bereich von 6,0 bis 7,0 eignet, handeln kann, wird im Allgemeinen vorgenommen. Typische Puffer umfassen 40 mM Natriumgluconat oder 20 mM MES, beide mit einem pH-Wert von 6,5. Das verdünnte Präparat kann sodann zentrifugiert oder filtriert werden, um etwaiges unlösliches Material zu entfernen. Alternativ können 20 mM Citrat vom pH-Wert 6,5 als Verdünnungspuffer verwendet werden. Dadurch kann die Notwendigkeit zur Zentrifugation oder Filtration entfallen, möglicherweise aufgrund der Solubilisierung von unlöslichem Calciumphosphat.
Das verdünnte Thrombinpräparat eignet sich zur sofortigen Weiterverarbeitung oder kann mindestens 6 Monate bei –40°C gelagert werden, ohne dass ein wesentlicher Verlust an Gerinnungsaktivität eintritt. Alternativ kann das verdünnte Material als Präparat von mittlerer Reinheit zubereitet und gefriergetrocknet werden.
Eine spezifische Aktivität des Thrombinpräparats von 250 U/mg bis 700 U/mg entspricht einer Thrombinreinheit von etwa 6 bis 17,5%, verglichen mit einer spezifischen Aktivität von reinem α-Thrombin von 4 000 U/mg. Obgleich dies in den meisten klinischen Fällen ausreicht, ist es möglich, das Thrombinpräparat einer weiteren Verarbeitung zu unterziehen, um Thrombin von höherer Reinheit zu erhalten.
Eine weitere Verarbeitung kann eine chromatographische Reinigung von Thrombin mit einer fakultativen Lösungsmittel/Detergens-Virus-Inaktivierungsstufe vor der chromatographischen Reinigung umfassen. Eine geeignete Lösungsmittel/Detergens-Virus-Inaktivierungsstufe wurde von Edwards et al. (13) beschrieben.
Eine chromatographische Reinigung wird im Allgemeinen durch Kationenaustauschchromatographie durchgeführt. Zu typischen Kationenaustauscherharzen, die verwendet werden können, gehören MONO-S (Warenbezeichnung, S-SEPHAROSE FF (Warenbezeichnung) und S-SEPHAROSE BIG BEADS (Warenbezeichnung), obgleich auch andere Sulfonatgele oder andere Kationenaustauscher verwendet werden können. Die Chromatographiestufe dient zur Entfernung des Lösungsmittels und des Detergens, wenn eine Lösungsmittel/Detergens-Virus-Inaktivierungsstufe durchgeführt worden ist. Ferner dient sie zur Reinigung des Thrombinpräparats.
Typischerweise ist das Thrombinpräparat an das Kationenaustauscher-Chromatographieharz gebunden. Gereinigtes Thrombin wird unter Verwendung eines geeigneten Puffers mit einer erhöhten Salzkonzentration eluiert. Zu Beispielen für geeignete Puffer gehören 20 mM Citrat vom pH-Wert 6,5, 20 mM MES vom pH-Wert 6,5 und 40 mM Gluconsäure vom pH-Wert 6,5. Der pH-Wert des Puffers soll vorzugsweise im Bereich von 6,0 bis 7,0 und insbesondere von 6,4 bis 6,6 liegen, um die Aktivität des gereinigten Thrombins zu bewahren. Üblicherweise eignen sich verschiedene Salze zur Elution für bestimmte Kationenaustauscherharze, wozu typischerweise NaCl gehört.
Die Konzentration des eluierten gereinigten Thrombins hängt direkt von der am Harz gebundenen Menge ab, wobei aber typischerweise Konzentrationen von gereinigtem Thrombin von 4 000 bis 9 000 U/ml erhalten werden können. Auch der untere Bereich dieser Konzentrationen eignet sich dazu, eine geeignete Verdünnung mit einem Zubereitungspuffer für die anschließende Gefriertrocknung zu erreichen.
Gereinigtes Thrombin kann direkt im Elutionspuffer eingefroren und bis zu 6 Monate gelagert werden, ohne dass ein erheblicher Verlust an Thrombinaktivität eintritt. Zur Vereinfachung der Lagerung ist es jedoch erwünscht, dass Thrombin von mittlerer Reinheit und gereinigtes Thrombin gefriergetrocknet werden.
Die Gefriertrocknung führt häufig zu einem Verlust an Aktivität des Thrombins (Thrombin von mittlerer Reinheit und gereinigtes Thrombin), so dass es wichtig ist, das Thrombin mit einem Zubereitungspuffer zuzubereiten. Dieser Zubereitungspuffer unterstützt die Stabilisierung des Thrombins während der Gefriertrocknung. Vor der Zubereitung des Thrombins ist es häufig wünschenswert, das Thrombin zu zentrifugieren und/oder zu filtrieren, um unlösliches Material zu entfernen.
Im Stand der Technik wurde ausgeführt, dass die Zugabe von Stabilisierungsmitteln, z. B. Polyolen, wie Glycerin, Mannit und Sorbit, Zuckern, wie Saccharose und Glucose, und/oder exogenen Proteinen, wie Albumin, zu einem Thrombinpräparat erwünscht ist, um die Stabilität eines Thrombinpräparats insbesondere während der Gefriertrocknung zu verbessern. Es stellt somit ein überraschendes Merkmal der vorliegenden Erfindung dar, dass sich Thrombin herstellen lässt, das ohne zusätzliche Stabilisierungsmittel, wie Polyol, Zucker, Protein und Gemische davon, im Wesentlichen stabil ist.
Somit wird gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ein wärmebehandeltes, gefriergetrocknetes Thrombinpräparat, das sich für die klinische Anwendung eignet, bereitgestellt. Das Präparat enthält Thrombin, das frei von exogenen Stabilisierungsmitteln, wie Protein, Zucker oder Polyol oder Gemische davon, ist, wobei das Präparat einer Wärmebehandlung unterzogen worden ist, um etwaige Virus-Verunreinigungen zu inaktivieren. Das Thrombinpräparat ist aus einer flüssigen Zubereitung, die auf einen pH-wert zwischen 6,0 und 6,6 gepuffert worden ist, zubereitet worden.
Das Thrombinpräparat wird auf einen pH-Wert zwischen 6,0 und 6,6 und vorzugsweise zwischen 6,4 und 6,6 gepuffert. Dies kann beispielsweise mit 40 mM Gluconsäurepuffer oder 20 mM MES-Puffer im geeigneten pH-Bereich erfolgen. Vorzugsweise enthält das Thrombinpräparat ferner Citrat in einer Konzentration von 10 mM bis 30 mM, typischerweise Natriumcitrat. Insbesondere enthält das Präparat Natriumchlorid in einer Konzentration von 100 bis 250 mM, z. B. 100 bis 200 mM. Ein Thrombinpräparat, das Citrat und Natriumchlorid neben Gluconat oder MES enthält, hat sich als besonders stabil gegen das Gefriertrocknen und die fakulta tive Wärmebehandlung erwiesen. Dabei behält das Thrombinpräparat den größten prozentualen Anteil an Gerinnungsaktivität nach dem Gefriertrocknen und der fakultativen Wärmebehandlung.
Die Gefriertrocknung wird vorzugsweise unter Anwendung eines zweistufigen Einfrierverfahrens durchgeführt. Das eingefrorene Produkt wird sodann zunächst bei einer Abteiltemperatur vom –20 bis –30°C und anschließend bei einer Abteiltemperatur von +15 bis +30°C getrocknet.
Das gefriergetrocknete Thrombinpräparat kann anschließend einer Wärmebehandlung unterzogen werden, um etwaige Virusverunreinigungen zu inaktivieren. Typischerweise wird die trockene Wärmebehandlung bei Temperaturen von 70 bis 100°C bis zu einer Zeitspanne von 96 Stunden durchgeführt. Eine besonders bevorzugte Wärmebehandlung erfolgt etwa 72 Stunden bei etwa 80°C.
Ausführliche Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
Nachstehend werden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung in Form von Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren beschrieben.
Beispielteil
Beispiel 1 – Herstellung eines Gemisches mit einem Gehalt an Prothrombin, Faktor Xa, Faktor Va und Phospholipid mit DEAE-Cellulose
450 Liter Kryopräzipitatplasma wurden auf den pH-Wert 6,9 ± 0,05 eingestellt und mit 150 Liter pyrogenfreiem H₂O auf ein Endvolumen von 600 Liter verdünnt. 6 kg DEAE-Cellulosegel (DE-52 Whatman) wurden sodann zu der Plasma/Wasser-Lösung gegeben. Die erhaltene Suspension wurde kontinuierlich 1 Stunde vermischt, um die Gerinnungsfaktoren an das Gel zu binden. Anschließend wurde das Gel durch Zentrifugation ge wonnen. Der Überstand wurde verworfen. Sodann wurde das Gel in 30 mM Citrat und 30 mM Phosphat-Puffer vom pH-Wert 6,9 resuspendiert. Die erhaltene Suspension wurde auf eine Chromatographiesäule aufgesetzt. Die Säule wurde sodann durch Waschen mit 21 Liter des gleichen Puffers gepackt. Die Gerinnungsfaktoren wurden anschließend von der Säule mit einem Elutionspuffer aus 30 mM Citrat, 30 mM Phosphat, 200 mM NaCl, pH-Wert 6,9, eluiert. Das vereinigte Eluat (3,1 Liter) wurde sodann in sterile Flaschen filtriert (Porengröße 0,45 μm) und eingefroren.
Der Eluatpool enthält erhebliche Mengen an Prothrombin (Faktor II) (80 μM und etwa 25% des gesamten Proteins). Ferner enthält er die Faktoren IX und X in aktivierter und nicht-aktivierter Form (etwa 5 μM), koagulationsaktives Phospholipid und ausreichende Spurenmengen der Faktoren V und VIII, um die physiologische Umwandlung von Prothrombin zu Thrombin über den natürlichen Gerinnungsweg zu unterstützen.
Beispiel 2 – Herstellung von Thrombin mittlerer Reinheit
Eingefrorenes DEAE-Cellulose-Eluat (hergestellt gemäß Beispiel 1) wurde bei Raumtemperatur oder in einem Wasserbad von 37°C aufgetaut (typische Werte für das Eluat: Leitfähigkeit = 17 mS; pH-Wert = 7,0; 30 mM Citrat; 30 mM Phosphat; 200 mM Natrium; 200 mM Chlorid; 15 mg/ml Gesamtprotein und 60 U/ml Prothrombin).
Eine 1 M CaCl₂-Lösung wurde sodann unter Rühren tropfenweise zum aufgetauten Eluat in einem Verhältnis von 75 ml CaCl₂ zu 1 000 ml Eluat bei 20°C gegeben. Dies führte zu einer Endkonzentration an Calcium von 70 mM und zu einem Abfall des pH-Werts des Gemisches auf 6,4–6,6. Man ließ die Reaktion 18 Stunden bei 20°C unter Rühren über Nacht ablaufen, um das Prothrombin zu Thrombin umzuwandeln.
In 15 Versuchen betrug die Thrombin-Gerinnungsaktivität 6 333 ± 1 146 U/ml (Mittelwert ± Standardabweichung) und die spezifische Aktivität 508 ± 110 U/mg (vergl. 1). SDS-PAGE ergab, dass am Ende der Aktivierungsperiode praktisch die gesamte Prothrombin-Bande in gemeinsam mit Thrombin wandernde Banden umgewandelt worden war.
Die Thrombin-Gerinnungsaktivität wurde als Fibrinogen-Gerinnungszeit bei Raumtemperatur unter visuellem Nachweis in Doppelbestimmung gemessen. 200 μl einer Lösung von humanem Fibrinogen in einer Konzentration von 5 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH-Wert 7,5, wurden mit 100 μl Standardlösungen (1–4 U/ml) oder Testlösungen von Thrombin, das in 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH-Wert 7,5, unter Zusatz von 100 mM CaCl₂ und 0,1% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin verdünnt war, versetzt, wonach die Zeitspanne bis zur anschließenden Gerinnselbildung festgestellt wurde. Eine Eichkurve wurde durch Auftragen der log₁₀-Thrombin-Konzentration (U/ml) gegen die log₁₀-Gerinnungszeit (sec) unter Verwendung von standardisiertem Rinderthrombin im Vergleich zu humanem α-Thrombin-Standard 89/588 aufgestellt. Die Thrombin-Gerinnungsaktivität von Testproben wurde durch Extrapolation aus der Eichkurve abgeleitet (15).
Βeispiel 3 – Einfluss einer Variation des pH-Werts der Reaktionslösung während der Aktivierung
Gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhielt man ein Gemisch mit einem pH-Wert von 7,0–7,2. Der pH-Wert dieses Gemisches fiel bei Zugabe von CaCl₂ in einer Konzentration von 70 mM sofort auf 6,5. Sodann erfolgte während der Umwandlungsperiode (18 Stunden) eine stetige Abnahme des pH-Werts auf 6,1–6,3. Das Absinken des pH-Werts war eine Voraussetzung für die erfolgreiche Bildung von Thrombin von hoher Aktivität. Dies wurde durch Vergleichsversuche gezeigt, bei denen der pH-Wert der Lösung unmittelbar nach Zugabe von Cl₂ auf 7,0 oder 7,5 eingestellt wurde. Die endgültigen pH-Werte am Ende der Reaktionsperiode betrugen 6,7 bzw. 7,1. Dabei wurde eine wesentlich geringere Thrombin-Aktivität erzeugt (vergl. Tabelle 1).
Tabelle 1
In einem weiteren Versuche wurde das Gemisch unmittelbar nach der Zugabe von CaCl₂ auf den pH-Wert 6,5 gepuffert (20 mM MES). Dies führte zu einer zusätzlichen geringfügigen Zunahme der Umwandlung zu Thrombin, wobei jedoch der Anstieg der Gerinnungsaktivität nicht signifikant war.
Beispiel 4 – Einflüsse der Variation der Zeitspanne oder der Temperatur für die Imwandlung von Prothrombin zu Thrombin
Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um den optimalen zeitlichen Verlauf für die Umwandlung von Prothrombin zu Thrombin zu bestimmen. Ein Vergleich der nach 16 und 24 Stunden gebildeten Menge an Thrombin ergab, dass nach 16 Stunden ein Plateau erreicht worden war.
Ferner wurde eine Untersuchung durchgeführt, um den Einfluss der Inkubation bei 37°C für eine Zeitspanne von 1 Stunde vor der anschließenden Inkubation bei Raumtemperatur zu bestimmen, und zwar im Hinblick auf einen Bericht, dass diese Stufe zur Erzielung geeigneter Ausbeuten bei diesem Typ von Ausgangsmaterial erforderlich ist (EP-Anmeldung 92401889.8). Es wurde festgestellt, dass zwar die anfängliche Geschwindigkeit der Erzeugung von Thrombin den bei Raumtemperatur erhaltenen Wert überstieg, dass aber die endgültige Ausbeute an Thrombin nach 16 oder 24 Stunden nicht besser als bei einer Umwandlung bei Raumtemperatur war.
Beispiel 5 – Einflüsse der Variation der Calciumionenkonzentration auf die Bildung von Thrombin
Die nach 24 Stunden erzeugte Menge an Thrombin wurde in einem Konzentrationsbereich von zugesetzten Calciumionen (7 Ansätze von DEAE-Cellulose-Eluaten) bestimmt (2). Es wurde festgestellt, dass die Zugabe von 70 mM Calcium übereinstimmend zu einer wirksamen Umwandlung von Prothrombin zu Thrombin führte.
Beispiel 6 – Virale Inaktivierung durch Lösungsmittel/Detergens
Gemäß Beispiel 2 hergestelltes Thrombin wurde durch Rühren mit 0,3% Tri-(n-butyl)-phosphat und einer 1%igen Lösung von Tween 80 bei einer Temperatur von 20 bis 30°C für eine Zeitspanne von 6 bis 24 Stunden vermischt. Dieses Vorgehen reichte aus, um etwaige verunreinigende Viren mit Lipidhülle zu inaktivieren. Lösungsmittel/Detergens wurden durch Chromatographie entfernt.
Beispiel 7 – Chromatographische Reinigung von Thrombin mittlerer Reinheit
Die Chromatographiestufe dient zur Entfernung von Lösungsmittel und Detergens und zur Reinigung des Thrombins von mittlerer Reinheit. Eine Chromatographiesäule mit einem Durchmesser von 1,6 cm wurde mit 10 ml S-SEPHAROSE FF (Warenbezeichnung) bei einer linearen Strömungsgeschwindigkeit von 2,2 cm/min (entsprechend 4,5 ml/min) unter Verwendung von 40 mM Gluconsäure, 20 mM MES oder 20 mM Citrat, alle beim pH-Wert 6,5, gepackt. 100 ml gemäß Beispiel 6 mit Lösungsmittel/Detergens behandeltes Thrombin oder gemäß Beispiel 2 erhaltenes Thrombin mittlerer Reinheit, unter anschließender 1 + 3-Verdünnung in Äquilibrierungspuffer, wurden mit 0,45 μm filtriert und auf die Säule mit der gleichen Strömungsgeschwindigkeit aufgesetzt. Anschließend wurde die Säule mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bis die Absorption bei 280 nm auf die Basislinie zurückkehrte und Lösungsmittel oder Detergens nur mehr unterhalb akzeptabler niedriger Konzentrationen im Säulenausfluss (typischerweise etwa 150 ml) nachweisbar waren. Sodann wurde Thrombin von der Säule durch Waschen mit Äquilibrierungspuffer mit einem Gehalt an 0,5 M NaCl eluiert. Man erhielt gereinigtes Thrombin in einem Volumen von etwa 25 ml mit einer typischen Konzentration von 4 000 U/ml und 2 mg/ml Protein.
Die typische Ausbeute an gereinigtem Thrombin nach der Chromatographiestufe betrug 88 ± 16%. Diese Ausbeute bezieht sich auf ein Thrombinpräparat, das keiner Lösungsmittel/Detergens-Virus-Inaktivierungsstufe gemäß Beispiel 6 unterzogen worden war.
Beispiel 8 – Zubereitung, Gefriertrocknung und abschließende trockene Wärmebehandlung
Gemäß den Beispielen 2 oder 6 hergestelltes Thrombin wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur mit 3 000 U/min zentrifugiert und sodann durch ein Millipore-Vorfilter (AP25) und anschließend durch ein Whatman 0,2 μm-Filter (Polydisc AS) filtriert. Die filtrierte Lösung wurde sodann in einem Zubereitungspuffer (40 mM Gluconsäure oder 20 mM MES, 20 mM Trinatriumcitrat, 150 mM NaCl, pH-Wert 6,5) auf eine Thrombinaktivität von 600 U/ml verdünnt und zur Gefriertrocknung in Portionen von 2 ml in Glasfläschchen gegeben.
Die Gefriertrocknung wurde in einem Super-Modulyo-Gefriertrocknungsgerät (Edwards, Crawley) bei einer auf –45°C eingestellten Einfriertemperatur, gefolgt von einer primä ren Trocknungstemperatur von –25°C und einer sekundären Trocknungstemperatur von +20°C, durchgeführt.
Die Fläschchen wurden sodann 72 Stunden bei 80°C einer Wärmebehandlung unterzogen, um etwaige verunreinigende Viren zu inaktivieren.
Beispiel 9 – Vergleich der Stabilisierungswirkung von verschiedenen Zubereitungspuffern auf Thrombin
Thrombin wurde in verschiedenen Zubereitungspuffern zubereitet, um den optimalen Zubereitungspuffer zur Stabilisierung von Thrombin während der Gefriertrocknung und der anschließenden Wärmebehandlung (Virus-Inaktivierung) festzustellen.
Gemäß Beispiel 2 hergestelltes Thrombin mittlerer Reinheit und gemäß Beispiel 7 hergestelltes gereinigtes Thrombin wurden mit verschiedenen Zubereitungspuffern (gemäß den Angaben in Tabelle 2) auf eine Thrombinkonzentration von 600 U/ml verdünnt. Das Thrombinpräparat wurde sodann gemäß Beispiel 8 gefriergetrocknet. Eine Menge des gefriergetrockneten Thrombins wurde 72 Stunden einer Wärmebehandlung bei 80°C unterworfen. Die Thrombin-Gerinnungsaktivität wurde gemäß den vorstehenden Angaben bestimmt, um die prozentuale Gerinnungsaktivität zu ermitteln, die nach Gefriertrocknung und anschließender Wärmebehandlung verblieben war. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, dass Zubereitungspuffer mit einem Gehalt an 20 mM Tris-HCl-Puffer beim pH-Wert 7,2 mit oder ohne 20 mM Trinatriumcitrat und/oder 150 mM Natriumchlorid nach der Gefriertrocknung zu einer Aufrechterhaltung der Thrombin-Gerinnungsaktivität von mehr als 74 führten. Jedoch waren große Aktivitätsverluste nach der Wärmebehandlung feststellbar, insbesondere in Abwesenheit von Trinatriumcitrat. Die Zugabe von Natriumchlorid zum Zubereitungspuffer führte zu einem intakten Materialpfropfen, während ohne Zugabe von Natriumchlorid der Pfropfen sich zusammenzog und kollabierte.
Ferner kann Protein (z. B. humanes Albumin) der Zubereitung in Konzentrationen von 0,5 bis 10 g/Liter als Mittel zur Erhaltung des Volumens und zur Verbesserung der Struktur und des Erscheinungsbilds des Pfropfens verwendet werden.
Bei Ansäuern des Zubereitungspuffers unter Verwendung von Gluconsäure oder MES, gepuffert auf den pH-Wert 6,5, wurde die Ausbeute an Thrombin-Gerinnungsaktivität nach trockener Wärmebehandlung erheblich verbessert.
Die Langzeitstabilität wurde unter Verwendung der Gluconsäurepuffer-Zubereitung bestimmt (Tabelle 2). Diese Untersuchungen wurden durch Lagerung von mehreren Fläschchen bei 4°C und 37°C nach Gefriertrocknung und Wärmebehandlung durchgeführt. Über einen Zeitraum von 6 Monaten wurde kein Verlust an Thrombinaktivität beobachtet, und zwar bei einem Vergleich von bei 37°C gelagertem Thrombin mit einem bei 4°C gelagerten Thrombin.
Tabelle 2 Ausbeute an Gerinnungsaktivität (%)

FD: Gefriertrocknung
HAT: 72-stündige Wärmebehandlung bei 80°C im Fläschchen
nd: nicht durchgeführt

Literatur

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Claims

Verfahren zum Herstellen von Thrombin, wobei ein Gemisch, das Prothrombin, Faktor Xa, Faktor Va und Phospholipide enthält, mit Calciumionen bei einem pH-Wert zwischen 6,0 und 6,6 behandelt wird.
Verfahren zum Herstellen von Thrombin nach Anspruch 1, worin das Gemisch aus einem Überstand eines Plasmakryopräzipitats erhalten wird.
Verfahren zum Herstellen von Thrombin nach Anspruch 2, worin das Gemisch durch chromatographische Reinigung des Überstands eines kryopräzipitierten Plasmas erhalten wird.
Verfahren zum Herstellen von Thrombin nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der pH-Wert zwischen 6,4 und 6,6 liegt.
Verfahren zum Herstellen von Thrombin nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Konzentration der Calciumionen im Bereich von 50 bis 90 mmol liegt.
Verfahren zum Herstellen von Thrombin nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Konzentration der Calciumionen im Bereich von 60 bis 80 mmol liegt.
Verfahren zum Herstellen von Thrombin nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Konzentration der Calciumionen im Bereich von 65 bis 75 mmol liegt.
Verfahren zum Herstellen von Thrombin nach einem der Ansprüche 5 bis 7, worin die Konzentration der Calciumionen derart eingestellt ist, dass der genannte pH-Wert zwischen 6,0 und 6,6 liegt.
Verfahren zum Herstellen von Thrombin nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das Gemisch vor dem Zugeben der Calciumionen auf den genannten pH-Wert gepuffert wird.
Verfahren zum Herstellen von Thrombin nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Verfahren ferner das Herstellen eines verdünnten Thrombinpräparats durch Verdünnen von 1 Volumen eines Thrombinpräparats mit bis zum 3 Volumina eines Puffers beinhaltet, wobei der Puffer für eine Verwendung im Bereich von unter pH 7,0 und über pH 6,0 geeignet ist.
Verfahren zum Herstellen von Thrombin nach Anspruch 10, worin der Puffer im Wesentlichen 20 mmol Citrat enthält und einen pH-Wert von 6,5 aufweist.
Verfahren zum Herstellen von Thrombin nach Anspruch 10 oder 11, wobei das Verfahren ferner das Zentrifugieren und/oder Filtrieren des verdünnten Thrombinpräparats beinhaltet, um unerwünschte unlösliche Stoffe zu entfernen.
Verfahren zum Herstellen von Thrombin nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei das Verfahren ferner ein Weiterverarbeiten beinhaltet, um ein Thrombin mit höherer Reinheit zu erhalten, wobei das Weiterverarbeiten eine chromatographische Reinigung umfasst und das Thrombin mit höherer Reinheit unter Verwendung eines geeigneten Puffers mit einem pH-Wert von unter 7,0 und über 6,0 eluiert wird.
Verfahren zum Herstellen von Thrombin nach Anspruch 13, wobei das Verfahren ferner vor der ch.romatographischen Reinigung eine Stufe der viralen Inaktivierung mit einem Lösungsmittel/Detergens beinhaltet.
Verfahren zum Herstellen eines gefriergetrockneten Thrombins, wobei das Verfahren das Herstellen von Thrombin nach einem der vorstehenden Ansprüche und das Gefriertrocknen dieses Thrombins beinhaltet.
Verfahren zum Herstellen eines gefriergetrockneten Thrombins nach Anspruch 15, wobei das Verfahren ferner das Wärmebehandeln des gefriergetrockneten Thrombins beinhaltet, um alle viralen Verunreinigungen zu aktivieren.
Verfahren zum Herstellen von Thrombin nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Thrombin Humanthrombin ist.
Für klinische Zwecke geeignetes wärmebehandeltes gefriergetrocknetes Thrombinpräparat, das Thrombin enthält, welches frei von exogenen Stabilisierungsmitteln, wie Protein, Zucker, Polyol oder Gemischen hiervon, ist, wobei das Präparat wärmebehandelt worden ist, um alle Virusverunreinigungen zu inaktivieren, und das Thrombinpräparat aus einer flüssigen Formulie rung hergestellt worden ist, die auf einen pH-Wert zwischen 6,0 und 6,6 gepuffert worden war.
Wärmebehandeltes gefriergetrocknetes Thrombinpräparat nach Anspruch 18, das aus einer flüssigen Formulierung hergestellt worden ist, die 10 bis 30 mmol Citrat enthalten hat.
Wärmebehandeltes gefriergetrocknetes Thrombinpräparat nach Anspruch 18, worin die flüssige Formulierung ferner 100 bis 250 mmol Natriumchlorid enthalten hat.
Wärmebehandeltes gefriergetrocknetes Thrombinpräparat nach einem der Ansprüche 19 bis 20, worin die flüssige Formulierung mit 20 mmol MES oder 20 mmol oder 40 mmol Gluconsäure auf einen pH-Wert zwischen 6,4 und 6,6 gepuffert worden ist.
Wärmebehandeltes gefriergetrocknetes Thrombinpräparat nach einem der Ansprüche 18 bis 20, worin das wärmebehandelte Thrombinpräparat bei einer Temperatur zwischen 70 und 100°C während bis zu 96 Stunden mit trockener Wärme behandelt worden ist.
Wärmebehandeltes gefriergetrocknetes Thrombinpräparat nach Anspruch 22, wobei das wärmebehandelte Thrombinpräparat bei etwa 80°C während etwa 72 Stunden wärmebehandelt worden ist.
Wärmebehandeltes gefriergetrocknetes Thrombinpräparat nach einem der Ansprüche 19 bis 23, wobei das Präparat unter Anwendung eines zweistufigen Gefrierverfahrens gefriergetrocknet worden ist, das ein primäres Trocknen bei einer Fachbodentemperatur von –20 bis –30°C und ein sekundäres Trocknen bei einer Fachbodentemperatur von +15 bis +30°C beinhaltet hat.