ES2218583T3 - Preparacion de trombina. - Google Patents
Preparacion de trombina.Info
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Abstract
SE PROPORCIONA UN PROCESO PARA LA PREPARACION DE TROMBINA QUE COMPRENDE EL TRATAMIENTO DE UNA MEZCLA QUE INCLUYE PROTROMBINA, FACTOR XA, FACTOR VA Y FOSFOLIPIDOS CON IONES DE CALCIO, A UN PH INFERIOR A 7,0. EN PARTICULAR EL PH INFERIOR A 7,0 PUEDE OBTENERSE POR ADICION DE IONES DE CALCIO O POR TAMPONAMIENTO DE LA PREPARACION A UN PH INFERIOR A 7,0. LAS PREPARACIONES DE TROMBINA ASI OBTENIDAS PUEDEN SOMETERSE A PURIFICACION ULTERIOR Y SON PARTICULARMENTE ESTABLES INCLUSO AUN CUANDO ESTAN SUSTANCIALMENTE LIBRES DE AGENTES ESTABILIZADORES EXOGENOS TALES COMO PROTEINAS, AZUCARES, POLIOL Y MEZCLAS DE LOS MISMOS, Y PUEDEN SOMETERSE A LIOFILIZACION Y A INACTIVACION DE VIRUS MEDIANTE TRATAMIENTO POR CALOR.
Description
Preparación de trombina.
La presente invención se refiere a un nuevo
proceso para la producción de trombina humana en particular y a
preparaciones de trombina capaces de ser producidas en forma seca
por congelación, que se pueden tratar térmicamente con el fin de
inactivar cualquier virus presente.
Trombina es el producto de la activación de
protrombina por el Factor Xa en el plasma. Es una potente serina
proteinasa muy específica que transforma el fibrinógeno en fibrina y
favorece la reticulación de la fibrina activando el Factor XIII.
Entre otras numerosas actividades biológicas observadas, la trombina
controla también varios bucles de retroalimentación en cascada de la
coagulación e induce la reacción de liberación de plaquetas
(1,2).
La trombina se ha utilizado como agente
hemostático sólido durante muchos años. Sin embargo, es un
componente del sellador de fibrina (goma de fibrina) que es probable
que propague la utilización clínica de la trombina. La trombina se
utiliza en el sellador de fibrina para transformar el fibrinógeno en
fibrina en una superficie de corte o dentro de un injerto y se han
descrito numerosas aplicaciones quirúrgicas en una amplia gama de
especialidades quirúrgicas (3,4).
La trombina bovina se utiliza en la actualidad
como agente hemostático tópico o como componente de productos
comerciales selladores de fibrina. Mientras que dichos productos de
trombina sean biológicamente eficaces, se asocian a un riesgo bien
documentado de respuestas alérgicas y de inducción de anticuerpos
para la trombina bovina o de impurezas tal como el factor V bovino,
normalmente después de uso repetido (5,6 y 7). Ortel et al.
(8) llegó a la conclusión recientemente de que dichos inhibidores
del factor de coagulación adquiridos probablemente tienen lugar más
frecuentemente que lo que se aprecia actualmente y aunque con
frecuencia clínicamente benignos, estos inhibidores se pueden
asociar a la hemorragia con riesgo para la vida. Por esta razón se
ha buscado el desarrollo de un proceso para producir trombina humana
adecuada para su uso como homeostático tópico o para la inclusión en
un producto sellador de fibrina.
La trombina se forma intrínsecamente cuando la
protrombina (Factor II) se transforma mediante el Factor X, el
Factor V activado, el fosfolípido y los iones de calcio en
trombina. La transformación de protrombina en trombina puede tener
lugar sin alguno de los componentes asociados, sin embargo, la
velocidad de transformación es indeseablemente baja.
Existen tres métodos principales de
transformación in vitro de protrombina conocidos en la
técnica. El primer método se basa en la utilización de
tromboplastina. La protrombina se transforma en trombina utilizando
tromboplastina, preferentemente en presencia de cloruro de calcio.
Esto se describe en numerosas memorias de patentes tales como EP
0439156A y EP 0505604A. Un incoveniente de este método es que la
tromboplastina normalmente es una preparación en bruto que se ha
preparado a partir de cerebro, pulmón o tejido intestinal recién
homogeneizado. Este procedimiento no es apropiado para la
preparación de la trombina humana ya que los reactivos, dependiendo
de su origen, pueden implicar el riesgo de virus o la contaminación
por cruce de especies.
Un segundo método utiliza algunos componentes de
veneno de serpiente para dar trombina (9, 10, 11). Sin embargo, se
ha descrito que alguno de los venenos no escinden los mismos enlaces
dentro de la protrombina, que el Factor Xa (12), activador natural.
Por lo tanto, puede que peligrosas implicaciones hiciesen que una
forma no fisiológica de trombina se utilizase clínicamente.
El tercer método in vitro es esencialmente
el mismo que el proceso intrínseco in vitro, en el que la
protrombina se transforma en trombina mediante el Factor X activado,
el Factor V, el fosfolípido y los iones de calcio en condiciones
casi fisiológicas. Esto se ha descrito, por ejemplo en los
documentos EP 0528701, EP 0378798 y US 5.219.995. Sin embargo, con
frecuencia la trombina producida es inestable a no ser que se añadan
proteínas, polioles y/o azúcares exógenos a la trombina para
estabilizarla.
Ya que la trombina humana procede del plasma
obtenido de las donaciones de sangre, existe riesgo de contaminación
de la trombina por cualquier virus presente en la donación de sangre
original. Por lo tanto, cualquier preparación de trombina humana
diseñada para uso clínico, estaría sometida a una etapa de
inactivación de virus, antes de su uso.
La inactivación de virus por tratamiento con
disolvente-detergente se ha descrito anteriormente
(13). Sin embargo, la preparación de trombina puede necesitar
someterse a etapas de purificación adicionales para eliminar el
disolvente-detergente. Otros especialistas han
descrito la utilización de materias primas con protrombina con virus
inactivados, pero no han descrito métodos para la inactivación de
virus de los productos de trombina preparados a partir de ellas, por
ejemplo los documentos EP 0378798 y EP 0543178. La inactivación
vírica terminal (p. ej., una etapa final de un proceso) del producto
es observada como el método probablemente más seguro y más eficaz de
inactivación de virus, ya que minimiza la posibilidad de
recontaminación.
Existe por lo tanto un requisito en la técnica
para producir trombina que está inactivada para el virus finalmente,
especialmente por tratamiento térmico.
Hablando en general la presente invención se basa
en el sorprendente descubrimiento de que la protrombina se puede
transformar en trombina con buen rendimiento, en condiciones ácidas
y que estas condiciones ácidas favorecen la estabilidad de la
trombina generada.
Un primer aspecto de la presente invención
proporciona, más específicamente, un procedimiento para preparar
trombina que comprende el tratamiento de una mezcla que comprende
protrombina, Factor Xa, Factor Va y fosfolípidos con iones de calcio
a un pH entre pH 6,0 y 6,6.
En general, la mezcla que comprende protrombina,
Factor Xa, Factor Va y fosfolípidos se pueden obtener a partir de un
sobrenadante de un crioprecipitado (que se forma congelando y
descongelando el plasma) de plasma humano. La mezcla se puede
obtener por purificación cromatográfica del sobrenadante del plasma
crioprecipitado, generalmente por cromatografía de intercambio
aniónico. Más particularmente un eluido de
DEA-celulosa de sobrenadante absorbido de plasma
crioprecipitado, que se puede utilizar para la producción de
concentrados clínicos del Factor IX, puede servir como mezcla para
la producción de trombina (14). La mezcla puede comprender factores
de coagulación adicionales, tales como, Factor X, Factor V, Factor
IX, Factor IXa y vestigios de trombina.
La técnica anterior (p. ej.: documentos EP
0378789 y EP 0528701) ha dado a conocer la adición de bajas
cantidades de iones de calcio (5 a 25 mM) para una mezcla que
comprende protrombina en o en torno a las condiciones fisiológicas
(pH 7,0 -7,03) y el documento EP 0528701 describe que la adición de
grandes cantidades de CaCl_{2} inhibe la preparación de trombina.
Se puede esperar que la transformación de protrombina en trombina
proceda mejor en condiciones que se aproximen a las condiciones
fisiológicas. Es, por lo tanto, una característica sorprendente de
la presente invención que la trombina se puede preparar con
rendimiento particularmente bueno a un pH entre 6,0 y 6,6.
Preferentemente el pH está comprendido entre 6,4 y 6,6. Sin querer
estar limitado por ninguna de las teorías propuestas, se da a
conocer que el pH entre 6,0 y 6,6 limita la autodegradación de la
trombina producida.
En general el pH entre 6,0 y 6,6 se puede
producir por adición a la mezcla de iones Ca^{2+}, (en particular
CaCl_{2}) en concentraciones de 50 mM a 90 mM, más preferentemente
de 60 mM a 80 mM y lo más preferentemente de 65 mM a 75 mM.
La adición de CaCl_{2} en los márgenes
especificados, da como resultado además en general que una gota en
el pH de la mezcla puede ser suficiente para alcanzar el pH
requerido.
Como alternativa, la mezcla se puede tamponar a
un pH entre 6,0 y 6,6 o más preferentemente entre pH 6,4 y 6,6
mediante cualquier tampón adecuado conocido para tamponar en el
intervalo requerido, antes de añadir iones Ca^{2+} para iniciar la
transformación de protrombina en trombina. Los ejemplos de tampones
adecuados incluyen MES (ácido
2-[N-morfolino]etansulfónico); ACES (ácido
2-[2-amino-2-oxietil)amino]etansulfónico);
BES (ácido
N,N-bis[2-hidroxietil]-2-aminoetansulfónico);
MOPS (3-[N-morfolino]propansulfónico); TES
(ácido
N-tris[hidroximeti]metil-2-aminoetansulfónico)
y HEPES (ácido
N-[2-hidroxietil]piperazina-N-[2-etansulfónico])
y similares.
Para transformar sustancialmente toda la
protrombina en trombina, la transformación debería continuar durante
un periodo de tiempo y a una temperatura adecuada para efectuar la
transformación. Típicamente la transformación debería permitir
continuar durante 12 a 24 horas y más preferentemente durante 16 a
20 horas. La transformación puede continuar a temperatura ambiente,
típicamente entre 18 y 25ºC y no requiere incubación a altas
temperaturas.
En general la trombina preparada de esta manera
presenta una actividad de coagulación de la trombina de entre 4.000
a 9.000 U/ml y una actividad específica de entre 250 a 700 U/mg.
Esta es considerablemente mayor que la actividad de la trombina
preparada por el procedimiento descrito en el documento EP 0528701
(actividad de coagulación de 700 a 1.000 U/ml y una actividad
específica de 20 a 40 U/mg).
Se puede hallar algún material soluble no deseado
en la preparación de la trombina, probablemente debido a la
producción de fibrina por la acción de la trombina producida por
cualquier fibrinógeno presente como contaminante en el eluido
original de DEAE-celulosa y del fosfato de calcio
insoluble. El material insoluble no deseado se puede eliminar por
centrifugación o por un proceso de filtración. Sin embargo, en
algunos casos, la preparación es demasiado viscosa y por eso la
preparación de trombina se diluye preferentemente para reducir la
viscosidad. En general se realiza una dilución de 1 volumen de
preparación de protrombina con hasta 3 volúmenes de tampón, por
ejemplo 3 volúmenes que pueden ser de cualquier tampón adecuado para
su utilización en el intervalo de pH de 6,0 a 7,0. Los tampones
típicos comprenden el gluconato de sodio 40 mM o MES 20 mM, ambos a
pH 6,5. La preparación diluida se puede centrifugar o filtrar a
continuación para eliminar cualquier material insoluble. Como
alternativa, se puede utilizar citrato 20 mM a pH 6,5 como tampón de
dilución. Esto puede eliminar la necesidad de centrifugación o de
filtración, debido posiblemente a la solubilización del fosfato de
calcio insoluble.
La preparación de la trombina diluida es adecuada
para el tratamiento inmediato posterior, o se puede almacenar a
-40ºC durante al menos seis meses sin pérdida sustancial de la
actividad de coagulación. Como alternativa, el material diluido se
puede formular y liofilizar como una preparación de pureza
intermedia.
Una actividad específica de la preparación de
trombina de entre 750 U/mg a 700 U/mg es equivalente a una pureza de
trombina de aproximadamente entre 6% y 17,5% basada en una
comparación con una actividad específica de
\alpha-trombina pura de 4.000 U/mg. Mientras que
ésta es suficiente en la mayoría de los casos clínicos, es posible
someter la preparación de trombina a un tratamiento adicional para
dar una trombina de mayor pureza.
El tratamiento adicional puede comprender la
purificación cromatográfica de la trombina en una etapa de
inactivación adicional del virus con disolvente/detergente antes de
la purificación cromatográfica. Una etapa adecuada de inactivación
del virus con disolvente/detergente ha sido descrita anteriormente
por Edwards et al. (13).
La purificación cromatográfica se realiza
generalmente por cromatografía de intercambio catiónico. Las resinas
de intercambio catiónico típicas que se pueden emplear incluyen
Mono-S (MARCA REGISTRADA),
S-Sepharose FF (MARCA REGISTRADA) y
S-Sepharose Bigs Beads (MARCA REGISTRADA) aunque se
pueden emplear otros geles de sulfonato u otros intercambiadores
catiónicos. La etapa de cromatografía sirve para eliminar el
disolvente y el detergente si se ha llevado a cabo la etapa de
inactivación del virus con disolvente/detergente y también sirve
para purificar la preparación de trombina.
Típicamente la preparación de la trombina está
unida a la resina de cromatografía por intercambio iónico y la
trombina se eluye utilizando un tampón adecuado con aumento de la
concentración salina. Los ejemplos de tampones adecuados incluyen el
citrato 20 mM a pH 6,5, MES 20 mM a pH 6,5 y ácido glucónico 40 mM a
pH 6,5. El pH del tampón debería estar preferentemente en el
intervalo de pH de 6,0 a 7,0 y más preferentemente de pH de 6,4 a
6,6 para impedir la actividad de la trombina purificada. Normalmente
varias sales son adecuadas para la elución con cualquier resina de
intercambio catiónico dada y éstas incluyen típicamente el NaCl.
La concentración de la trombina purificada eluida
depende de la cantidad unida a la resina, pero típicamente se pueden
obtener concentraciones de trombina purificada entre 4.000 y 9.000
ml. Incluso el intervalo inferior de estas concentraciones es
apropiado para permitir la dilución adecuada con un tampón de
formulación, para la liofilización posterior.
La trombina purificada se puede congelar
directamente en el tampón de elución y almacenar hasta seis meses
sin pérdida sustancial de actividad de trombina. Sin embargo, para
facilidad de almacenamiento es deseable que la trombina de pureza
intermedia y la trombina purificada, se sequen por congelación.
La liofilización produce con frecuencia una
perdida de actividad de la trombina (trombina de pureza intermedia y
trombina purificada) y es importante por lo tanto formular la
trombina con un tampón de formulación. Este tampón de formulación
ayuda a estabilizar la trombina durante la liofilización. Antes de
formular la trombina, es a menudo deseable centrifugar y/o filtrar
la trombina para eliminar el material insoluble.
La técnica ha descrito anteriormente que la
adición de agentes estabilizantes, tales como los polioles, por
ejemplo, glicerol, manitol y sorbitol; azúcares, tales como sacarosa
y glucosa y/o proteínas exógenas, tales como albúmina, a una
preparación de trombina es deseable para mejorar la estabilidad de
una preparación de trombina, especialmente durante la liofilización.
Por lo tanto una característica sorprendente de la presente
invención es que se puede preparar la trombina, que es
sustancialmente estable sin agentes estabilizantes adicionales,
tales como poliol, azúcar, proteína y sus mezclas.
Por lo tanto, en un aspecto adicional de la
presente invención se proporciona una preparación de trombina
liofilizada y tratada térmicamente, adecuada para su utilización
clínica, comprendiendo la preparación trombina exenta de agentes
estabilizantes exógenos, tales como proteínas, azúcar o poliol y sus
mezclas, en la que la preparación se ha tratado térmicamente con el
fin de inactivar cualquier virus contaminante y en la que la
preparación de trombina se ha preparado a partir de una formulación
líquida tamponada a un pH entre 6,0 y 6,6.
La preparación de trombina está tamponada entre
pH 6,0 y 6,6, más preferentemente entre pH 6,4 y 6,6. Esto se puede
conseguir mediante, por ejemplo, ácido glucónico 40 mM o tampón MES
20 mM en el intervalo de pH adecuado. Preferentemente, la
preparación de trombina comprende además citrato a una concentración
de 10 mM a 30 mM, típicamente citrato sódico. Más preferentemente la
preparación comprende además cloruro sódico a una concentración
entre 100 y 250 mM, por ejemplo de 100 a 200 mM. Se ha observado que
una preparación de trombina que comprende citrato y cloruro sódico,
además de gluconato o MES, es la más estable para la liofilización y
el tratamiento térmico opcional. Esto es, la preparación de trombina
conserva un porcentaje máximo de actividad coagulante después de la
liofilización y del tratamiento térmico opcional.
La liofilización se realiza preferentemente
empleando un procedimiento de congelación en dos etapas. El producto
congelado se somete a continuación a un secado primario a una
temperatura de conservación de -20ºC a -30ºC y a continuación a un
secado secundario a una temperatura de conservación de +15ºC a
+30ºC.
La preparación de trombina liofilizada se puede
tratar térmicamente a continuación para inactivar cualquier
contaminante vírico. Típicamente el tratamiento térmico en seco se
realiza a temperaturas entre 70ºC a 100ºC durante 96 horas máximo.
Un tratamiento térmico particularmente preferido es aproximadamente
a 80ºC durante alrededor de 72 horas.
Las realizaciones de la presente invención se
describirán ahora a título de ejemplo, con referencia a las Figuras
adjuntas.
Se ajustaron 450 litros de plasma crioprecipitado
a pH 6,9 \pm 0,05 y se diluyeron con 150 litros de H_{2}O exenta
de pirógenos hasta un volumen final de 600 litros. Se añadieron a
continuación 6 kg de gel de DEAE-celulosa
(DE-52 Whatman) a la solución de plasma/agua y se
mezcló la suspensión resultante en contínuo durante una hora para
unir los factores de coagulación al gel. Se recogió a continuación
el gel por cetrifugación y se descartó el sobrenadante. A
continuación se volvió a poner en suspensión el gel en citrato 30
mM, fosfato 30 mM, tampón de pH 6,9 y la suspensión resultante se
vertió en una columna de cromatografía. Se rellenó a continuación la
columna lavando con 21 litros del mismo tampón. Se eluyeron de la
columna a continuación los Factores de coagulación con un tampón de
elución de citrato 30 mM, fosfato 30 mM, NaCl 200 mM, pH 6,9. El
grupo eluido (3,1 litros) se filtró a continuación (tamaño de poro
0,45 \mum) en botellas estériles y se congeló.
El grupo eluido contiene cantidades sustanciales
de protrombina (Factor II) (a 80 \muM y aproximadamente 25% de
proteína total). También incluye los factores IX y X, activados y no
activados (a aproximadamente 5 \muM), fosfolípido coagulante
activo y suficientes cantidades en vestigios de Factores V y VIII
para soportar la transformación fisiológica de protrombina a
trombina mediante la vía de coagulación intrínseca.
Se descongeló el eluido de
DEAE-celulosa congelado (preparado según el Ejemplo
1) a temperatura ambiente o en un baño de agua a 37ºC. (Valores
típicos del eluido fueron los siguientes: conductividad = 17 mS; pH
= 7,0; citrato 30mM; fosfato 30mM; sodio 200 mM, cloruro 200 mM; 15
mg/ml de proteína total y 60 U/ml de protrombina).
A continuación se añadió gota a gota solución de
CaCl_{2} 1 M al eluido descongelado, en agitación, en una
proporción de 75 ml de CaCl_{2}a 1.000 ml de eluido, a 20ºC. Esto
produjo una concentración de calcio final de 70 mM y una gota a pH
en la mezcla a pH 6,4-6,6. Se dejó continuar la
reacción con agitación toda la noche durante 18 horas a 20ºC, para
transformar la protrombina en trombina.
En 15 experimentos, la actividad de coagulación
de la trombina fue 6.333 \pm 1.146 U/ml (media \pm SD) y una
actividad específica de 508 \pm 110 U/mg (véase Figura 1). SDS
PAGE indicó que efectivamente toda la banda de protrombina se
transformó en bandas que emigran conjuntamente con la trombina, al
final del periodo de activación.
Se midió la actividad de coagulación de la
trombina por el tiempo de coagulación del fibrinógeno a temperatura
ambiente con detección visual y muestras duplicadas. A 200 \mul de
solución de fibrinógeno humano a 5 mg/ml en Tris-HCl
50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,5 se añadió 100 \mul de soluciones patrón
( 1 a 4 U/ml) o soluciones de análisis de trombina diluida en
tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,5 complementado
con CaCl_{2}100 mM y albúmina de suero bovino al 0,1% p/v, tras lo
cual se registró el tiempo para la formación del coágulo posterior.
Se construyó una curva patrón representando la concentración
log_{10} de trombina (U/ml) frente al tiempo de coagulación
log_{10} (s) utilizando trombina bovina estandarizada frente a la
alfa-trombina humana patrón 89/588. La actividad de
la coagulación de la trombina de las muestras de la prueba procedía
de la extrapolación de la curva patrón (15).
Siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo
1, se produjo una mezcla con un pH de 7,0 a 7,2. Éste disminuyó
inmediatamente a pH 6,5 por adición de CaCl_{2} a 70 mM. Se
produjo a continuación una disminución regular en el pH de 6,1 a 6,3
durante el periodo de transformación (18 horas). El descenso del pH
fue un requisito para la producción con éxito de trombina de alta
actividad. Esto se demostró mediante experimentos comparativos, en
los que el pH de la solución se ajustó a pH 7,0 o pH 7,5
inmediatamente después de la adición de CaCl_{2}. Aquí los valores
de pH finales al final del periodo de reacción fueron pH 6,7 y pH
7,1 respectivamente y se produjo una cantidad mucho más baja de
actividad de trombina (véase Tabla 1).
Ejemplo | pH de la mezcla inmediatamente | pH de la mezcla al final del | Actividad de coagulación |
después de la adición de CaCl_{2} | periodo de transformación | (IU/ml) | |
(ajustado si es necesario) | (18 horas) | ||
1 | 6,5 | 6,1 | 5716 |
2 | 7,0 | 6,7 | 2012 |
3 | 7,5 | 7,1 | 1493 |
En otro experimento, se tamponó la mezcla (MES 20
mM) a pH 6,5 inmediatamente después de la adición de CaCl_{2}.Esto
produjo un pequeño aumento adicional en la transformación a
trombina, pero el aumento de actividad de coagulación fue
insignificante.
Se realizaron estudios para determinar el
transcurso del tiempo óptimo para la transformación de protrombina
en trombina. Una comparación de la cantidad de trombina generada a
las 16 y 24 horas indicó que se había conseguido una meseta en 16
horas.
Se realizó también una investigación para
determinar el efecto de la incubación a 37ºC durante una hora antes
de la incubación posterior a temperatura ambiente, en vista de un
informe en el que esta etapa era necesaria para obtener rendimientos
útiles con este tipo de materia prima (solicitud de patente europea
nº 92401889.8). Se observó que mientras que la velocidad inicial de
generación de trombina superaba la obtenida a temperatura ambiente,
el rendimiento final de trombina no era mejor a las 16 o 24 horas en
comparación con la transformación a temperatura ambiente.
Se determinó la cantidad de trombina generada a
las 24 horas en un intervalo de concentraciones de ión calcio
añadido (siete lotes de eluidos de DEAE-celulosa)
(Figura 2). Se observó que la adición de calcio 70 mM producía
consecuentemente la transformación eficaz de protrombina en
trombina.
Se mezcló trombina preparada según el Ejemplo 2
por agitación con tri-(n-butil)fosfato al
0,3% y una solución al 1% de Tween 80 a una temperatura de 20ºC a
30ºC durante 6 a 24 horas. Esto fue suficiente para inactivar
cualquier virus con membrana de lípido contaminante. Se eliminó el
disolvente/detergente por cromatografía.
La etapa de cromatografía sirve para eliminar el
disolvente y el detergente y para purificar la trombina de pureza
intermedia. Se rellenó una columna de cromatografía de diámetro 1,6
cm con 10 ml de S-Sepharose FF (MARCA REGISTRADA) a
un caudal lineal de 2,2 cm/min (equivalente a 4,5 ml/min) utilizando
ácido glucónico 40 mM, MES 20 mM o citrato 20 mM, todo a pH 6,5.
Trombina tratada con 100 ml de disolvente/detergente según el
Ejemplo 6 o trombina de pureza intermedia según el Ejemplo 2,
después de una dilución 1+3 en tampón de equilibrado se filtró en
0,45 \mum y se aplicó a la columna al mismo caudal. Se lavó a
continuación la columna con tampón de equilibrado hasta que la
absorbencia a 280 nm volvió a la línea de referencia y el disolvente
o el detergente fueron detectables sólo por debajo de bajos niveles
aceptables, en el efluente de la columna (de forma típica
aproximadamente 150 ml). Se eluyó a continuación la trombina de la
columna lavando con tampón de equilibrado que contenía NaCl 0,5 M.
Se obtuvo aproximadamente 25 ml de trombina purificada a una
concentración típica de 4.000 U/ml y 2 mg/ml de proteína.
El rendimiento típico de la trombina purificada
después de la etapa de cromatografía fue 88 \pm 16%. Este
rendimiento se refiere a una preparación de trombina que no se
sometió a una etapa de inactivación del virus con
solvente/detergente tal como se describe en el Ejemplo 6.
Se preparó trombina según los Ejemplos 2 ó 6, se
centrifugó a 3.000 rpm durante 20 minutos a temperatura ambiente y
se filtró a continuación a través de un prefiltro Millipore (AP25)
seguido de un filtro Whatman de 0,2 \mum (Polydisc AS). Se diluyó
a continuación la solución filtrada en un tampón de formulación
(ácido glucónico 40 mM o MES 20 mM, citrato trisódico 20 mM, NaCl
150 mM, pH 6,5) hasta una actividad de trombina de 600 U/ml y se
dosificó en lotes de 2 ml en viales de vidrio para
liofilización.
Se realizó la liofilización en un liofilizador
super-Modulyo (Edwards, Crawley) con un ajuste de la
temperatura de congelación a -45ºC, seguido de un ajuste de la
temperatura de secado primaria a -25ºC y un ajuste de la temperatura
de secado secundaria a +20ºC.
Se trataron térmicamente a continuación los
viales para inactivar cualquier virus contaminante, a 80ºC durante
72 horas.
Se formuló la trombina en varios tampones de
formulación, con el fin de determinar el tampón de formulación
óptimo para estabilizar la trombina durante la liofilización y el
posterior tratamiento térmico (inactivación de virus).
Trombina de pureza intermedia preparada según el
Ejemplo 2 y trombina purificada preparada según el Ejemplo 7, se
diluyeron con varios tampones de formulación (como se describe en la
Tabla 2) hasta una concentración de trombina de 600 U/ml. A
continuación se secó por congelación la preparación de trombina
según el Ejemplo 8 y una cantidad de trombina liofilizada se sometió
también a un tratamiento térmico a 80ºC durante 72 horas. Se
determinó la actividad de coagulación de la trombina tal como se
describió anteriormente, para determinar el porcentaje de actividad
de coagulación que se conserva después de la liofilización y el
posterior tratamiento térmico. Los resultados se presentan en la
Tabla 2.
En la Tabla 2 se puede apreciar que los tampones
de formulación que comprenden tampón Tris-HCl 20 mM
a pH 7,2 con o sin citrato trisódico 20 mM y/o cloruro sódico 150
mM, produjeron una recuperación de actividad de coagulación de
trombina, después de la liofilización, de más del 74%. Sin embargo,
se observaron pérdidas mayores de actividad después del tratamiento
térmico, particularmente en ausencia de citrato trisódico. La
inclusión de cloruro sódico en el tampón de formulación dio lugar a
un coágulo intacto de material, mientras que sin cloruro sódico, el
coágulo se redujo o se colapsó.
Se puede incluir también proteína (p. ej.
albúmina humana) en la formulación a concentraciones de 0,5 g/l a 10
g/l, para actuar como agente de relleno y mejorar la estructura y
aspecto del coágulo.
Cuando el tampón de formulación se volvió ácido
utilizando ácido glucónico o MES tamponado a pH 6,5, mejoró
sustancialmente la recuperación de la actividad de coagulación de la
trombina después del tratamiento térmico en seco.
Se determinó la estabilidad a largo plazo
utilizando la formulación con tampón de ácido glucónico (véase Tabla
2). Estos estudios se realizaron por almacenamiento de varios viales
a 4ºC y 37ºC, después de liofilización y tratamiento térmico. No se
observó pérdida de actividad de coagulación de la trombina durante
un periodo de seis meses, al comparar la trombina almacenada a 37ºC
con la trombina almacenada a 4ºC.
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\newpage
1. Fenton, J. W. (1981). Thrombin
specificity. Ann. N. Y Acad. Sci.
370:468-495.
2. Sutttie, J. W. y C. M. Jackson.
(1977). Prothorombin structure activation and biosynthesis.
Physiol. Rev. 57:1-65.
3. Brennan, M. (1991). Fibrin Glue.
Blood Rev 5:240-244.
4. Gibble, J. W. y P. M. Ness.
(1990). Fibrin Glue – The Perfect Operative Sealant.
Transfusion 30:741-747.
5. Banninger, H. J. Hardegger, A.
Tobler, A. Barth, F. Schupbach, W.
Reinhart, B. Lammle y M. Furlan. (1993).
Fibrin Glue in the Surgary – Freequent Development of Inhibitors of
Bovine Thrombin and Human Factor- V. Br. J. Heematol.
85:528-532.
6. Berruyer, M. J. Amiral, P.
Ffrench, J. Belleville, O. Bastien, J.
Clerc, A. Kassir, S. Estanove y M.
Dechavanne. (1993). Immunization by Bovine Thrombin
Used with Fibrin Glue During Cardiovascular Operations – Development
of Thrombin and Factors – V Inhibitors. J. Thorac. Cardiovasc.
Surg. 105:692-697.
7. Rothenberg, D. M. y J. N. Moy.
(1993). Anaphylactic Reaction to Topical Bovine Thrombin.
Anesthesiology 78:779-782.
8. Ortel, T. L., L. A. Charles, F.
G. Keller, P. K. Marcom, H. N. Oldhan, W. H.
Kane y B. G. Macik. (1994). Topical Thrombin
and Acquired Coagulation Factor Inhibitors – Clinical Spectrum and
Laboratory Diagnosis. Am. J. Hematol.
45:128-135.
9. Denson, K. W. E. (1969).
Coagulant and anticoagulant action of snake venoms. Toxicon
7:5-11.
10. Ngai, P. K. y J. Y. Change.
(1991). A Novel One-Step Purification of
Human alpha-Thrombin After Direct Activation of
Crude Prothrombin Enriched from Plasma. Biochem. J.
280:805-808.
11. Feldman, P. y L. Winkelman.
(1991). Preparation of special plasma products. In Blood
Separation and Plasma Fractionation. Wiley-Liss,
Inc, 341-383.
12. Rosing, J. y G. Tans
(1991). Inventory of exogenous prothrombin activators.
Thromb. Haemostats. 65:627-630.
13. Edwars, C. A., M. P. Piet, S.
Chin y B. Horowitz. (1987).
Tri(n-butyl) phosphate/detergent treatment of
licensed therapeutic and experimental blood derivatives. Vox.
Sang. 52:53-59.
14. Middleton, S. M., I. H. Bennett
y J. K. Smith. (1973). A therapeutic concentrate of
coagulation factors II, IX and X from citrated, factor
VIII-depleted plasma. Vox. Sang.
24:441-456.
15. Gaffney, P. J., A. B. Heath y
J. W. Fenton. (1992). A collaborative study to
establish an international satandar for
alpha-thrombin. Thromb. Haemostats.
67:424-427.
Claims (24)
1. Un procedimiento para preparar trombina que
comprende tratar una mezcla que comprende protrombina, Factor Xa,
Factor Va y fosfolípidos con iones de calcio a un pH entre 6,0 y
6,6.
2. Un procedimiento para preparar trombina según
la reivindicación 1, en el que la mezcla se obtiene a partir de un
sobrenadante de un crioprecipitado de plasma.
3. Un procedimiento para preparar trombina según
la reivindicación 2, en el que la mezcla se obtiene por purificación
cromatográfica del sobrenadante de plasma crioprecipitado.
4. Un procedimiento para preparar trombina según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el pH está
entre 6,4 y 6,6.
5. Un procedimiento para preparar trombina según
cualquier reivindicación anterior, en el que la concentración de
iones de calcio está comprendida en el intervalo de 50 mM a 90
mM.
6. Un procedimiento para preparar trombina según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la
concentración de iones de calcio está comprendida en el intervalo de
60 mM a 80 mM.
7. Un procedimiento para preparar trombina según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la
concentración de iones de calcio está comprendida en el intervalo de
65 mM a 75 mM.
8. Un procedimiento para preparar trombina según
una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la
concentración de iones de calcio es tal como la que resulta de dicho
pH entre 6,0 y 6,6.
9. Un procedimiento para preparar trombina según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la mezcla
está tamponada a dicho pH, antes de añadir los iones de calcio.
10. Un procedimiento para preparar trombina según
cualquier reivindicación anterior, que comprende además generar una
preparación diluida de trombina diluyendo 1 volumen de preparación
de trombina con hasta 3 volúmenes de tampón, en el que el tampón es
adecuado para su utilización en el intervalo entre menos de pH de
7,0 y más de pH 6,0.
11. Un procedimiento para preparar trombina según
la reivindicación 10, en el que el tampón comprende sustancialmente
citrato 20 mM y tiene un pH 6,5.
12. Un procedimiento para preparar trombina según
una de las reivindicaciones 10 u 11, que comprende además la
centrifugación y/o filtración de la preparación de trombina diluida
para eliminar el material insoluble no deseado.
13. Un procedimiento para preparar trombina según
cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, que comprende además el
tratamiento adicional para dar una proteína de mayor pureza, en el
que el tratamiento adicional comprende la purificación
cromatográfica y en el que la proteína de mayor pureza se eluye
utilizando un tampón adecuado de pH menor que 7,0 y mayor que
6,0.
14. Un procedimiento para preparar trombina según
la reivindicación 13, que comprende además una etapa de inactivación
vírica con disolvente/detergente, antes de la purificación
cromatográfica.
15. Un procedimiento para preparar una trombina
liofilizada que comprende preparar la trombina según cualquier
reivindicación anterior y liofilizar dicha trombina.
16. Un procedimiento para preparar una trombina
liofilizada según la reivindicación 15, que comprende además tratar
térmicamente la trombina liofilizada para inactivar cualquier
contaminante vírico.
17. Un procedimiento para preparar trombina según
cualquier reivindicación anterior, en el que la trombina es trombina
humana.
18. Una preparación de trombina liofilizada,
tratada térmicamente, adecuada para su utilización clínica,
comprendiendo la preparación trombina exenta de agentes
estabilizantes exógenos, tales como proteínas, azúcar o poliol y sus
mezclas, en la que la preparación se ha tratado térmicamente con el
fin de inactivar cualquier virus contaminante y en la que la
preparación de trombina se ha preparado a partir de una formulación
líquida tamponada a un pH entre 6,0 y 6,6.
19. Una preparación de trombina liofilizada,
tratada térmicamente, según la reivindicación 18, que se ha
preparado a partir de una formulación líquida que comprende citrato
10 mM a 30 mM.
20. Una preparación de trombina liofilizada,
tratada térmicamente, según la reivindicación 18, en la que la
formulación líquida se comprende además cloruro de sodio 100 mM a
250 mM.
21. Una preparación de trombina liofilizada,
tratada térmicamente, según una cualquiera de las reivindicaciones
19 a 20, en la que la formulación líquida está tamponada entre pH
6,4 y 6,6 con MES 20 mM o ácido glucónico 20 mM o 40 mM.
22. Una preparación de trombina liofilizada,
tratada térmicamente, según una cualquiera de las reivindicaciones
18 a 20, en la que la preparación de trombina tratada térmicamente
se ha tratado térmicamente en seco a una temperatura entre 70ºC y
100ºC durante 96 horas como máximo.
23. Una preparación de trombina liofilizada,
tratada térmicamente, según la reivindicación 22, en la que la
preparación de trombina tratada térmicamente se ha tratado
térmicamente a aproximadamente 80ºC durante alrededor de 72
horas.
24. Una preparación de trombina liofilizada,
tratada térmicamente, según cualquiera de las reivindicaciones 19 a
23, en la que la preparación se liofiliza empleando un procedimiento
de congelación en dos etapas; que comprende un secado primario a una
temperatura de conservación de -20ºC a -30ºC y un secado secundario
a una temperatura de conservación de +15ºC a +30ºC.
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EP1221479B1 (en) * | 1999-09-27 | 2006-11-22 | Sysmex Corporation | Method for stabilizing thrombin |
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AU2003280730B2 (en) | 2002-11-14 | 2010-04-29 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Thrombin-carrying bioabsorbable synthetic nonwoven fabric |
ES2226587B1 (es) * | 2004-10-22 | 2005-12-16 | Probitas Pharma, S.A. | Composicion de trombina estable. |
CN100383241C (zh) * | 2005-11-11 | 2008-04-23 | 东北农业大学 | 猪凝血酶的制备方法 |
US8945895B2 (en) * | 2009-07-31 | 2015-02-03 | Baxter International Inc. | Methods of purifying recombinant ADAMTS13 and other proteins and compositions thereof |
US9212357B2 (en) | 2012-12-03 | 2015-12-15 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Thrombin solution and methods of use thereof |
US9932388B2 (en) | 2014-11-13 | 2018-04-03 | Hemarus Therapeutics Limited | Chromatographic process for producing high purity fibrinogen and thrombin |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3843126C3 (de) * | 1988-12-22 | 1994-10-06 | Octapharma Ag | Verfahren zur Herstellung eines hochreinen Thrombinkonzentrates |
CA2007545A1 (en) * | 1989-01-13 | 1990-07-13 | Yahiro Uemura | Production method for protein-containing composition |
FR2679251B1 (fr) * | 1991-07-18 | 1993-11-12 | Nord Assoc Essor Transfusion San | Procede de preparation d'un concentre de thrombine humaine destine a un usage therapeutique. |
AT398079B (de) * | 1991-11-04 | 1994-09-26 | Immuno Ag | Präparation mit thrombinaktivität sowie verfahren zu ihrer herstellung |
US5219995A (en) * | 1992-07-14 | 1993-06-15 | Alpha Therapeutic Corporation | Plasma fraction purification |
-
1995
- 1995-02-24 GB GBGB9503750.3A patent/GB9503750D0/en active Pending
-
1996
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