JPH11500619A - トロンビンの調製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 プロトロンビン、第Xa因子、第Va因子及びリン脂質を含む混合物を、７.０未満のｐＨでカルシウムイオンで処理することからなる、トロンビンの調製方法が提供される。特に、カルシウムイオンを添加するか、調製物をｐＨ７.０未満に緩衝化することにより７.０未満のｐＨが生成される。生成したトロンビン調製物は、更に精製してもよく、蛋白質、糖、ポリオール及びそれらの混合物等の外因性安定化剤を実質的に含まないでも特に安定であり、凍結乾燥及び加熱処理によりウイルスを不活性化してもよい。

Description

【発明の詳細な説明】 トロンビンの調製 発明の分野 本発明は、トロンビン、特にヒトトロンビンの新規な製造方法、及び存在する ウイルスを不活性化するために加熱処理してもよい、凍結乾燥形態で製造するこ とのできるトロンビン調製物に関する。 発明の背景 トロンビンは、血漿中でのプロトロンビンの第Xa因子による活性化生成物であ る。トロンビンは、フィブリノーゲンをフィブリンに変換し、第XIII因子を活性 化することによりフィブリンの架橋を促進する、潜在的に広範囲な特異的セリン プロテイナーゼである。また、他の観察された多くの生物学的活性の中で、トロ ンビンは、凝固カスケード内でいくつかのフィードバックループを制御し、血小 板放出反応を引き起こす（１，２）。 トロンビンは、局所止血剤として長年用いられてきた。しかし、トロンビンの 臨床使用が拡大すると思われるのは、フィブリン封止剤（フィブリン接着剤）の 構成成分としてである。トロンビンは、切り口又は移植片上でフィブリノーゲン をフィブリンに変換するためのフィブリン封止剤中で用いられ、多くの外科的応 用が外科的専門の広い範囲で記述される（３，４）。 典型的な、局所止血剤として又は市販のフィブリン封止剤生成物の構成成分と して、ウシトロンビンが、現在広く用いられている。このようなトロンビン生成 物は生物学的に活性であるけれども、通常は繰り返し使用した後、ウシトロンビ ン又はウシ第Ｖ因子等の不純物に対するアレルギー応答及び抗体の誘導の十分裏 付けのある危険性と関係する（５，６及び７）。Ortel ら（８）は、最近、この ような後天性凝固因子阻害剤は、おそらく現在理解されるより一般に起こりやす く、頻繁に臨床上良性であるとしても、これらの阻害剤は生命を脅かす(life-th reatening)出血に関係するかもしれないと結論した。この理由のため、局所止 血剤又はフィブリン封止剤生成物に包含するために用いるのに適したヒトトロン ビンを生成する方法の開発が求められている。 本来的に、トロンビンは、プロトロンビン（第II因子）が活性化第Ｘ因子、活 性化第Ｖ因子、リン脂質及びカルシウムイオンによってトロンビンに変換された ときに形成される。プロトロンビンのトロンビンへの変換は、一部の関係する成 分なしでも起こるが、変換の速度は望ましくないほど遅い。 in vitroにおけるプロトロンビンを変換する３つの主要な方法が当業界におい て知られている。第１の方法は、トロンボプラスチンの使用による。プロトロン ビンは、好ましくは塩化カルシウムの存在下でトロンボプラスチンの使用により トロンビンに変換する。このことは、EP0439156A及びEP0505604A等の多くの特許 明細書に記載されている。この方法の不利な点は、トロンボプラスチンが通常、 新鮮な均質化した脳、肺又は腸組織から得られた、粗調製物であることである。 これらの出所に依存して、ウイルス又は交差種汚染物質の危険を有し得るので、 この手法は試薬としてのヒトトロンビンの調製に適していない。 第２の方法はトロンビンを得るために蛇毒のいくつかの成分を利用する（９， １０，１１）。しかし、いくつかの蛇毒が、天然の活性化剤である第Xa因子のよ うにプロトロンビン内の同一の結合を切断しないことが報告されている（１２） 。従って、トロンビンの非生理学的形態を臨床的に用いる場合には、危険性を含 むかもしれない。 第３のin vitroの方法は、本質的にin vivo の方法と同じであり、この場合、 プロトロンビンは、ほぼ生理学的条件に近い条件下で活性化第Ｘ因子、第Ｖ因子 、リン脂質及びカルシウムイオンによってトロンビンに変換される。このことは 、例えば、EP0528701 、EP0378798 及び米国特許5,219,995 号明細書に記載され ている。しかし、得られたトロンビンは、トロンビンを安定化するための外因性 蛋白質、ポリオール及び／又は糖を添加しないと、しばしば不安定である。 ヒトトロンビンは献血から得られた血漿に由来するので、最初の献血中のウイ ルスの存在によるトロンビンの汚染の危険がある。従って、診療に使用するため に設計されたヒトトロンビンの調製物は、使用前にウイルスの不活性化工程に付 すべきである。 溶剤−洗浄剤処理によるウイルスの不活性化は既に開示されている（１３）。 しかし、トロンビンの調製物は、溶剤−洗浄剤を除去するために更なる精製工程 に付す必要があるかもしれない。他の研究者は、例えば、EP0378798 及びEP0543 178 に、ウイルス／不活性化プロトロンビン供給原料の使用を開示したが、それ らから調製したトロンビン生成物のウイルス／不活性化方法は開示していない。 生成物の終末（例えば、方法の最終工程）ウイルス／不活性化は、再汚染の機会 を最小限にするので、多分ウイルス不活性化の最も安全かつ最も効果的なウイル ス／不活性化方法であると見られる。 従って、当業界において、特に加熱処理により最終的にウイルス／不活性化さ れた、不活性化されたトロンビンが必要である。 一般的に言えば、本発明は、プロトロンビンが酸性条件下で高収率でトロンビ ンに変化し、酸性条件が生成したトロンビンの安定性を促進するという驚くべき 発見に基づく。 発明の要約 即ち、本発明の第１の特徴は、プロトロンビン、第Xa因子、第Va因子及びリン 脂質を含む混合物を、７.０未満のｐＨで、カルシウムイオンにより処理するこ とからなるトロンビンの調製方法を提供する。 一般に、プロトロンビン、第Xa因子、第Va因子及びリン脂質を含む混合物は、 ヒト血漿の低温沈殿の上清（血漿を凍結融解することによって作られる）から得 ることができる。混合物は、低温沈殿した血漿の上清のクロマトグラフィー精製 、一般には陰イオン交換クロマトグラフィーにより得ることができる。更に詳細 には、臨床の第IX因子濃縮物の製造のために用いられるかもしれない低温沈殿し た血漿の吸収された上清のＤＥＡＥ−セルロースの溶出物は、トロンビン生成物 の混合物として役立つ（１４）。上記混合物は、第Ｘ因子、第Ｖ因子、第IX因子 、第IXa 因子等の付加的な凝固因子、及び極微量のトロンビンを含むかもしれな い。 先行技術（例えば、EP0378789 及びEP0528701）は、既に生理的条件又はその 付近において（ｐＨ７.０〜７.３）プロトロンビンを含む混合物に低濃度のカル シウムイオン（５〜２５ｍＭ）を添加することを教示し、EP0528701 はCaCl₂の 高 濃度の添加がトロンビンの調製を阻害することを開示している。プロトロンビン のトロンビンへの変換が、生理的な条件に近い条件で最も良く進行することが予 想される。従って、トロンビンが７.０未満のｐＨで特に良い収率で得られるこ とは本発明の驚くべき特徴である。好ましくはｐＨは６.０〜７.０であり、更に 好ましくはｐＨ６.４〜６.６である。前提とする理論に制限されることを望むこ となしに、７.０未満のｐＨが、生成されたトロンビンの自動分解を制限するこ とが教示される。 一般に、７.０未満のｐＨは、５０ｍＭ〜９０ｍＭ、更に好ましくは６０ｍＭ 〜８０ｍＭ、最も好ましくは６５ｍＭ〜７５ｍＭの濃度でCa²⁺イオン（特にCaCl₂ ）を混合物に添加することによって形成される。 特定の範囲でのCaCl₂の添加により、一般に必要とされるｐＨに到達するに十 分であるかもしれない、混合物のｐＨが低下する。 また、プロトロンビンのトロンビンへの変換を開始するためのCa²⁺イオンの添 加の前に、要求される範囲で緩衝化する公知の適当なバッファーにより、混合物 はｐＨ６.０〜７.０、好ましくはｐＨ６.４〜６.６に緩衝化される。適当なバッ ファーとしては、例えばＭＥＳ（２−〔Ｎ−モルホリノ〕エタンスルホン酸）； ＡＣＥＳ（２−〔２−アミノ−２−オキソエチル）アミノ〕エタンスルホン酸） ；ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス〔２−ヒドロキシエチル〕−２−アミノエタンスルホン 酸）；ＭＯＰＳ（３−〔Ｎ−モルホリノ〕プロパンスルホン酸）；ＴＥＳ（Ｎ− トリス〔ヒドロキシメチル〕メチル−２−アミノエタンスルホン酸）及びＨＥＰ ＥＳ（Ｎ−〔２−ヒドロキシエチル〕ピペラジン−Ｎ−〔２−エタンスルホン酸 ）等が含まれる。 実質的に全てのプロトロンビンをトロンビンに変換するために、変換は、効果 的な変換のために適当な温度で一定の時間行われる。典型的には、変換は１２〜 ２４時間、更に好ましくは１６〜２０時間行なうべきである。変換は室温、典型 的には１８〜２５℃で行われ、より高い温度は必要でない。 この方法で調製されたトロンビンは、一般に４０００〜９０００単位／ｍｌの トロンビン凝固活性及び２５０〜７００単位／ｍｇの比活性を有する。これは、 EP0528701 に記載された方法により得られたトロンビンの活性（７００ 〜１０００単位／ｍｌの凝固活性及び２０〜４０単位／ｍｇの比活性）よりもか なり高い。 トロンビン調製物中には、最初のＤＥＡＥ−セルロース溶出物中の汚染物質と して存在するフィブリノーゲンに対する生成したトロンビンの作用により、及び 不溶性リン酸カルシウムの作用により、おそらく、フィブリンが生成することに よる、不要な不溶性物質が見出される。該不溶性物質は、遠心又はろ過工程によ り除去することができる。しかし、ある場合には調製物は大変粘稠であるので、 粘度を減少するために好ましくはトロンビン調製物を希釈する。トロンビン１容 量に対して３容量までのバッファーによる希釈が一般に行われ、例えば、ｐＨ６ .０〜７.０の範囲で用いられるのに適当な３容量バッファーが用いられる。典型 的なバッファーは、ｐＨ６.５において、４０ｍＭグルコン酸ナトリウム又は２ ０ｍＭＭＥＳを含む。次いで、不溶性物質を除去するために、希釈された調製物 を遠心又はろ過する。又は、希釈バッファーとしては、２０ｍＭクエン酸塩(cit rate)、ｐＨ６.５を用いてもよい。これにより、不溶性リン酸カルシウムの溶解 性による遠心又はろ過の必要がなくなる。 希釈されたトロンビン調製物は、直後の更なる工程を行なうのに適しており、 又は、実質的な凝固活性の損失なしに−４０℃で少なくとも６ヶ月間保存するこ とができる。また、希釈された材料は、中間精製調製物として配合し、凍結乾燥 してもよい。 ２５０単位／ｍｇ〜７００単位／ｍｇのトロンビン調製物の比活性は、４００ ０トロンビン単位／ｍｇの純粋なα−トロンビンの比活性と比較して約６％〜１ ７.５％の純度に相当する。これはほとんどの臨床例に十分であるが、トロンビ ン調製物を更に高純度のトロンビンを生産するための工程に付すことは可能であ る。 更なる工程は、トロンビンのクロマトグラフィー精製と、クロマトグラフィー 精製の前の任意の溶媒／洗浄剤ウイルス不活性化工程からなる。適当な溶媒／洗 浄剤ウイルス／不活性化工程はEdwards ら（１３）によって既に開示されている 。 クロマトグラフィー精製は、一般に陽イオン交換クロマトグラフィーにより行 われる。用いてもよい典型的な陽イオン交換樹脂は、Mono-s（登録商標）、Ｓ− セファロースＦＦ（登録商標）及びＳ−セファロースBig Beads（登録商標）で あるが、他のスルホネートゲル又は他の陽イオン交換樹脂を用いてもよい。クロ マトグラフィー工程により、溶媒及び洗浄剤が除去され、ウイルス不活性化工程 が実施されればトロンビン調製物が精製される。 典型的には、トロンビン調製物が陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合 し、精製トロンビンは塩濃度を増加させた適当なバッファーを用いて溶出される 。適当なバッファーとしては、例えば２０ｍＭクエン酸塩 ｐＨ６.５、２０ｍ Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６.５及び４０ｍＭグルコン酸 ｐＨ６.５が含まれる。精製ト ロンビンの活性を維持するためには、バッファーのｐＨは好ましくはｐＨ６.０ 〜７.０の範囲であり、更に好ましくはｐＨ６.４〜６.６の範囲である。通常、 いくつかの塩は与えられた陽イオン交換樹脂で溶出することに適しており、典型 的にはNaClを含む。 溶出した精製トロンビンの濃度は、樹脂に結合する量に直接依存するが、典型 的には４０００〜９０００単位／ｍｇの精製トロンビン濃度が得られる。これら の濃度の低い範囲も、次の凍結乾燥のための配合バッファーで適当に希釈するの に適している。 精製トロンビンは溶出バッファー中で直接凍結することができ、トロンビン活 性の実質的な損失なしに６ヶ月間保存できる。しかし、保存の容易さのためにト ロンビン精製中間体及び精製トロンビンは凍結乾燥することが望ましい。 凍結乾燥は、しばしばトロンビン（トロンビン精製中間体及び精製トロンビン ）活性の損失を起こすので、トロンビンを配合バッファーに配合させることが重 要である。この配合バッファーは凍結乾燥の間にトロンビンを安定化することを 補助する。トロンビンを配合する前に、不溶性物質を除去するためにトロンビン を遠心及び／又はろ過することが望ましい。 該技術は、既に例えばグリセロール、マンニトール及びソルビトール等のポリ オール；スクロース及びグルコース等の糖及び／又はアルブミン等の外因性蛋白 質等の安定化剤のトロンビン調製物への添加が、トロンビン調製物の安定化、特 に凍結乾燥の間の安定化に好ましいことを開示している。従って、ポリオール、 糖、蛋白質及びこれらの混合物等の安定化剤の添加なしで実質的に安定にトロン ビンが得られるという本発明の特徴は驚くべきことである。 従って、別の特徴において、本発明はトロンビン調製物を提供し、該調製物は ｐＨ７.０未満のｐＨで緩衝化され、外因性安定化剤（蛋白質、糖、ポリオール 及びこれらの混合物等）を実質的に含まないトロンビンからなる。 一般に、トロンビン調製物は凍結乾燥され任意に加熱処理される。従って、更 なる特徴によれば、本発明は、蛋白質、糖又はポリオール及びこれらの混合物等 の外因性安定化剤を実質的に含まない、凍結乾燥され、任意に加熱処理されたト ロンビン調製物を提供する。 好ましくはトロンビン調製物はｐＨ６.０〜７.０、更に好ましくはｐＨ６.４ 〜６.６に緩衝化される。これは、例えば適当なｐＨ範囲の４０ｍＭグルコン酸 又は２０ｍＭＭＥＳバッファーにより達成される。好ましくは、トロンビン調製 物は、更に１０ｍＭ〜３０ｍＭ濃度の範囲のクエン酸塩、典型的にはクエン酸ナ トリウムを含有する。更に好ましくは、調整物は、更に１００〜２５０ｍＭ、例 えば１００〜２００ｍＭ濃度の塩化ナトリウムを含有する。クエン酸塩及び塩化 ナトリウムを含有するトロンビン調製物は、凍結乾燥及び任意の加熱処理に対し て最も安定であることが分かった。即ち、トロンビン調製物は、凍結乾燥及び任 意の加熱処理後に凝固活性の最大の割合を維持している。 凍結乾燥は、好ましくは２段階凍結工程を用いて行われる。次いで、凍結生成 物は−２０℃〜−３０℃の棚温度で第１の乾燥がなされ、＋１５℃〜＋３０℃の 棚温度で第２の乾燥がなされる。 次いで、凍結乾燥トロンビン調製物はウイルス汚染を不活性化するために加熱 処理してもよい。典型的には、乾燥加熱処理は、７０〜１００℃の間の温度で９ ６時間まで行われる。特に好ましい加熱処理は約８０℃で約７２時間である。 好ましい態様の詳細な説明 本発明の態様を、添付図面を参照しながら、実施例により詳述する。 実施例の項 実施例１−ＤＥＡＥ−セルロースによる、プロトロンビン、第Xa因子、第Va因 子及びリン脂質を含む混合物の調製 ４５０ｌの低温沈殿した血漿をｐＨ６.９±０.０５に調整し、発熱物質を含ま ない水１５０ｌで最終容量６００ｌに希釈した。次いで、６ｋｇのＤＥＡＥ−セ ルロースゲル(DE-52 Whatman)を血漿／水溶液に加え、得られた懸濁液を１時間 連続して混合し、凝固因子をゲルに結合させた。次いで、ゲルを遠心によって集 め、上清を捨てた。次いで、ゲルを３０ｍＭクエン酸塩、３０ｍＭリン酸塩 ｐ Ｈ６.９バッファーに再懸濁し、得られた懸濁液をクロマトグラフィーカラムに 注いだ。次いで、カラムを２１ｌの同じバッファーで洗浄することにより満たし た。次いで、凝固因子を３０ｍＭクエン酸塩、３０ｍＭリン酸塩、２００ｍＭ NaCl、ｐＨ６.９で溶出した。次いで、溶出プール（３.１ｌ）を無菌の瓶にろ別 （０.４５μｍポアサイズ）して凍結した。 溶出プールは多量のプロトロンビン（第II因子）を含有している（８０μＭで 全蛋白質の約２５％）。また、溶出プールは、第IX因子及び第Ｘ因子を活性及び 不活性型（約５μＭ）で、凝集活性リン脂質、本質的な凝固経路によりプロトロ ンビンをトロンビンに生理的に変換させるのに十分な第Ｖ因子及び第VIII因子を 微量含有している。 実施例２−トロンビン精製中間体の調製 凍結したＤＥＡＥ−セルロース溶出物（実施例１により調製したもの）を室温 で、又は３７℃の水浴中で融解した。（溶出物の典型的な値は以下の通りである ：導電率＝１７ｍＳ；ｐＨ＝７.０；３０ｍＭクエン酸塩；３０ｍＭリン酸塩； ２００ｍＭナトリウム；２００ｍＭ塩化物；１５ｍｇ／ｍｌ全蛋白質；及びプロ トロンビン６０単位／ｍｌ） 次いで、１Ｍ ＣａＣｌ₂溶液を、融解した溶出物に対して、溶出物１０００ ｍｌ当たり７５ｍｌＣａＣｌ₂の割合で、２０℃で攪拌しながら滴下して加えた 。この結果は、最終カルシウム濃度は７０ｍＭとなり、混合物のｐＨはｐＨ６. ４〜６.６に低下した。反応を２０℃で１８時間、一晩攪拌して進め、プロトロ ンビン をトロンビンに変換した。 １５の実験において、トロンビン凝固活性は6,333 ±1,146 単位／ｍｌ（平均 ±ＳＤ）及び比活性は508 ±110 単位／ｍｇ（図１参照）であった。ＳＤＳＰＡ ＧＥは、活性化の終わりに、全てのプロトロンビンのバンドがトロンビンと同じ 移動度のバンドに有効に変換したことを示した。 トロンビン凝固活性は、肉眼検出、及び二重試料を使用して室温におけるフィ ブリノーゲンの凝固時間により測定した。１００ｍＭ CaCl₂及び０.１w/v％ウ シ血清アルブミンを追加した５０ｍＭ Tris-HCl、１００ｍＭ NaCl ｐＨ７. ５で希釈した標準（１〜４単位／ｍｌ）又はトロンビンの試験溶液を、５０ｍＭ Tris-HCl、１００ｍＭ NaCl ｐＨ７.５中の５ｍｇ／ｍｌ濃度のヒトフィブ リノーゲン溶液２００μｌに加え、それに続く凝固形成時間を記録した。標準カ ーブは、ヒトα−トロンビン標準89/588に対して標準化したウシトロンビンを用 いた凝固時間（秒）のlog₁₀に対してトロンビン濃度（単位／ｍｌ）のlog₁₀をプ ロットすることにより作製した。試験試料のトロンビン凝固活性は、標準カーブ からの外挿法により求めた（１５）。 実施例３−活性化の際の反応溶液のｐＨの変化の影響 実施例１で記載した工程に従って、混合物のｐＨを７.０〜７.２にした。これ は、CaCl₂を７０ｍＭになるように添加することにより直ちに６.５に減少した。 次いで、変換の間（１８時間）にpＨを６.１〜６.３に一様に減少した。ｐＨを 低下させることは、高活性のトロンビンの成功裡の生成のために必要であった。 このことは、CaCl₂の添加後ただちに溶液のｐＨがｐＨ７.０〜ｐＨ７.５に調整 される比較実験により証明された。ここで、反応の終わりにおける最終ｐＨ値は 、それぞれｐＨ６.７及びpＨ７.１であり、トロンビン活性の非常に低い量が生 成された（表１参照）。 更なる実験においては、CaCl₂の添加直後に混合物をｐＨ６.５に緩衝化した（ ２０ｍＭ ＭＥＳ）。これの結果、トロンビンへの変化がわずかに増加したが、 凝固活性の増加は取るに足らないものであった。 実施例４−プロトロンビンのトロンビンへの変換に用いる時間の長さ又は温度 の変化の影響 プロトロンビンのトロンビンへの変換のための最適のタイムコース(time cour se)を決定するための研究を行った。１６時間及び２４時間で生成されたトロン ビンの量の比較は、１６時間で頭打ち（プラトー）になることを示した。 また、研究は、この工程がこのタイプの供給原料で有用な収量を得るために必 要であるという報告（欧州特許出願第92401889.8号）を考慮して、それに続く室 温でのインキュベーションの前の３７℃におけるインキュベーションの影響を決 定するための研究を行った。トロンビン生成の初速度は室温で得られるものを越 えるが、トロンビンの最終収量は、室温での変換に比して１６又は２４時間では 良くないことが分かった。 実施例５−トロンビン生成に対するカルシウムイオン濃度の変化の効果 添加したカルシウムイオン濃度（ＤＥＡＥ−セルロース溶出物の７つのバッチ ）の範囲での２４時間におけるトロンビン生成量を決定した（図２）。７０ｍＭ のカルシウムの添加がプロトロンビンのトロンビンへの有効な変換を一様に生ず ることが見出された。 実施例６−溶媒／洗浄剤によるウイルス不活性化 実施例２で得られたトロンビンを、０.３％トリ−（ｎ−ブチル）ホスフェー ト及び１％Tween 80溶液と２０〜３０℃の温度で６〜２４時間攪拌することによ り混合した。これは、汚染性の脂質で包まれたウイルスを不活性化するのに十分 であった。溶媒／洗浄剤はクロマトグラフィーにより除去した。 実施例７−トロンビン精製中間体のクロマトグラフィー精製 クロマトグラフィー工程は、溶媒及び洗浄剤を除去し、及びトロンビン精製中 間体を精製するために作用する。１.６ｃｍの直径のクロマトグラフィーカラム に、直線流速２.２ｃｍ／分（４.５ｍｌ／分と同等）において、Ｓ−セファロー スＦＦ（登録商標）１０ｍｌを、４０ｍＭグルコン酸及び２０ｍＭ ＭＥＳ、又 は２０ｍＭクエン酸塩（全てｐＨ６.５）を用いて詰めた。１００ｍｌの溶媒／ 洗浄剤で処理した、実施例６のトロンビン又は実施例２のトロンビン精製中間体 を、平衡化バッファーで１＋３に希釈して、０.４５μｍでろ過して同じ流速で カラムにのせた。次いで、カラムを２８０ｎｍの吸収がベースラインに戻り、カ ラム流出液中の溶媒又は洗浄剤が許容範囲内の低濃度より低く見つけられるよう になるまで、平衡化バッファーで洗浄した（典型的には約１５０ｍｌ）。次いで 、０.５Ｍ NaClを含む平衡化バッファーでカラムを洗浄することによりトロン ビンを溶出させた。精製トロンビンは、典型的には４０００単位／ｍｌ及び２ｍ ｇ／ｍｌ蛋白質の濃度で約２５ｍｌで得られた。 クロマトグラフィー工程後の精製トロンビンの典型的な収率は８８±１６％で あった。この収率は、実施例６に記載された、溶媒／洗浄剤不活性化工程にかけ ていないトロンビン調製物に対するものである。 実施例８−配合、凍結乾燥及び最後の乾燥加熱処理 実施例２又は６で得られたトロンビンを室温で3,000rpm、２０分間遠心し、次 いでミリポア(Millpore)プレフィルター（ＡＰ２５）、次いでWhatman ０.２μ ｍフィルター(Polydisc AS)でろ過した。次いで、ろ過した溶液を配合バッファ ー（４０ｍＭグルコン酸又は２０ｍＭ ＭＥＳ、２０ｍＭクエン酸三ナトリウム 、 １５０ｍＭ NaCl、ｐＨ６.５）でトロンビン活性が６００単位／ｍｌになるよ うに希釈し、凍結乾燥のためにガラス瓶に２ｍｌずつのロットに分配した。 凍結乾燥は、Super-Modulyo(Edwards，Crawley)凍結乾燥機で、−４５℃にセ ットした凍結温度で、次いで−２５℃にセットした第１の乾燥温度、及び＋２０ ℃にセットした第２の乾燥温度で行った。 次いで、汚染ウイルスを不活性化するために、瓶を８０℃で７２時間加熱処理 した。 実施例９−種々の配合バッファーのトロンビンに対する安定化効果の比較 凍結乾燥及びそれに続く加熱処理（ウイルスの不活性化）の際のトロンビンの 安定化のための最適な配合バッファーを決定するために、トロンビンを種々の配 合バッファーに配合した。 実施例２で得られたトロンビン精製中間体、及び実施例７で得られた精製トロ ンビンを、種々の配合バッファー（表２に記載した）でトロンビン濃度が６００ 単位／ｍｌとなるように希釈した。次いで、トロンビン調製物を実施例８と同様 に凍結乾燥し、凍結乾燥したトロンビンの量を８０℃で７２時間加熱処理した。 凍結乾燥及びそれに続く加熱処理後に保持している凝固活性の割合を調べるため に、前述したようにトロンビン凝固活性を決定した。結果を表２に示す。 表２から、２０ｍＭクエン酸三ナトリウム及び／又は１５０ｍＭ塩化ナトリウ ムを含むか含まない２０ｍＭ tris-HCLバッファーｐＨ７.２からなる配合バッ ファーは、凍結乾燥後７４％以上のトロンビン凝固活性の回復を生じることが示 された。しかし、後の加熱処理において、特にクエン酸三ナトリウムの不存在下 で大きな活性の損失が見られる。配合バッファー中に塩化ナトリウムを配合する と、物質の完全なプラグを生じ、一方、塩化ナトリウムなしでは、プラグは撤回 され崩壊する。 バルクとして機能し、かつプラグ構造及び外観を向上させるために、配合バッ ファーに蛋白質（例えば、ヒトアルブミン）を０.５ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度 で含有させることができる。 配合バッファーをｐＨ６.５に緩衝化されたグルコン酸又はＭＥＳを用いて酸 性 にすると、乾燥加熱処理後のトロンビン凝固活性は実質的に向上した。 グルコン酸バッファー配合を用いて長期安定性を調べた（表２参照）。これら の研究は、凍結乾燥及び加熱処理後、４℃及び３７℃でいくつかの瓶を保存する ことにより行った。３７℃で保存したトロンビンと４℃で保存したトロンビンを 比較したとき、６ヶ月間でトロンビン凝固活性の損失は見られなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ， ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ハーディー ジョン チャールズ イギリス エディンバラ イーエイチ10 ４ビーアール グリーンヒル プレイス 17 (72)発明者 ドラモンド オリーヴ イギリス ファイフ ケイワイ３ ０ユー イー アバダウアー メイン ストリート 15

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．プロトロンビン、第Xa因子、第Va因子及びリン脂質を含む混合物を、７.０ 未満のｐＨでカルシウムイオンにより処理することを特徴とする、トロンビンの 調製方法。 ２．上記混合物が血漿の低温沈殿の上清から得られる、請求の範囲第１項に記載 の方法。 ３．上記混合物が低温沈殿した血漿の上清のクロマトグラフィー精製により得ら れる、請求の範囲第２項に記載の方法。 ４．ｐＨが６.０〜７.０である、請求の範囲第１項〜第３項の何れか１項に記載 の方法。 ５．ｐＨが６.４〜６.６である、請求の範囲第１項〜第３項の何れか１項に記載 の方法。 ６．カルシウムイオン濃度が５０ｍＭ〜９０ｍＭである、請求の範囲第１項〜第 ５項の何れか１項に記載の方法。 ７．カルシウムイオン濃度が６０ｍＭ〜８０ｍＭである、請求の範囲第１項〜第 ５項の何れか１項に記載の方法。 ８．カルシウムイオン濃度が６５ｍＭ〜７５ｍＭである、請求の範囲第１項〜第 ５項の何れか１項に記載の方法。 ９．カルシウムイオン濃度が、７.０未満のｐＨとする濃度である、請求の範囲 第６項〜第８項の何れか１項に記載の方法。 10．カルシウムイオンを添加する前に前記ｐＨに上記混合物が緩衝化される、請 求の範囲第１項〜第８項の何れか１項に記載の方法。 11．１容量のトロンビン調製物を３容量までのバッファーで希釈することにより 希釈されたトロンビン調製物を形成する工程を更に含み、上記バッファーがｐＨ ６.０〜７.０の範囲での使用に適している、請求の範囲第１項〜第１０項の何れ か１項に記載の方法。 12．上記バッファーが実質的に２０ｍＭのクエン酸塩を含みかつｐＨが６.５で ある、請求の範囲第１１項に記載の方法。 13．望ましくない不溶性物質を除去するために、希釈されたトロンビン調製物を 遠心及び／又はろ過する工程を更に含む、請求の範囲第１１項又は第１２項に記 載の方法。 14．高純度のトロンビンを得るための更なる処理を含み、上記更なる処理がクロ マトグラフィー精製を含み、高純度のトロンビンがｐＨ６.０〜７.０の範囲にお いて適当なバッファーを用いて溶出される、請求の範囲第１１項〜第１３項の何 れか１項に記載の方法。 15．上記クロマトグラフィー精製の前に、更に、溶媒／洗浄剤ウイルス不活性工 程を含む、請求の範囲第１４項に記載の方法。 16．請求の範囲第１２項〜第１５項の何れか１項に記載のトロンビンを調製し、 該トロンビンを凍結乾燥することを特徴とする凍結乾燥トロンビンの調製方法。 17．ウイルス汚染を不活性化するために、上記凍結乾燥トロンビンを更に加熱す る工程を含む、請求の範囲第１５項に記載の方法。 18．トロンビンがヒトトロンビンである、請求の範囲第１項〜第１７項の何れか １項に記載の方法。 19．蛋白質、糖、ポリオール及びそれらの混合物等の外因性安定剤を実質的に含 まず、７.０未満のｐＨに緩衝化されているトロンビン調製物。 20．ｐＨ６.０〜７.０に緩衝化されている、請求の範囲第１９項に記載のトロン ビン調製物。 21．ｐＨ６.４〜６.６に緩衝化されている、請求の範囲第１９項に記載のトロン ビン調製物。 22．蛋白質、糖又はポリオール及びそれらの混合物等の外因性安定剤を実質的に 含まないトロンビンを含有する凍結乾燥トロンビン調製物。 23．更に１０ｍＭ〜３０ｍＭのクエン酸塩を含む、請求の範囲第２２項に記載の 凍結乾燥トロンビン調製物。 24．更に１００ｍＭ〜２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む、請求の範囲第２３項 に記載の凍結乾燥トロンビン調製物。 25．０.５ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度の外因性蛋白質、１０ｍＭ〜３０ｍＭクエ ン酸塩及び１００ｍＭ〜２５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する、凍結乾燥トロン ビン調整物。 26．ウイルス汚染を不活性化するために加熱処理がされている、請求の範囲第２ ２項〜第２５項の何れか１項に記載の凍結乾燥トロンビン調製物。 27．上記加熱処理されたトロンビン調製物が、７０℃〜１００℃の温度で９６時 間までの時間乾燥加熱処理されている、請求の範囲第２６項に記載の凍結乾燥ト ロンビン調製物。 28．上記加熱処理されたトロンビン調製物が、約８０℃で約７２時間加熱処理さ れている、請求の範囲第２６項に記載の凍結乾燥トロンビン調製物。 29．上記調製が、−２０℃〜−３０℃の棚温度での第１の乾燥と、＋１５℃〜＋ ３０℃の棚温度での第２の乾燥とを含む２段階凍結工程を使用して凍結乾燥され る、請求の範囲第２２項〜第２８項の何れか１項に記載の凍結乾燥トロンビン調 整物。