ES2261866T3 - Factor viii hibrido humano/porcino. - Google Patents
Factor viii hibrido humano/porcino.Info
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Abstract
Una secuencia de ácido nucleico aislado que codifica el dominio A2 del factor VIII porcino que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 2.
Description
Factor VIII híbrido humano/porcino.
El gobierno tiene los derechos en esta invención
que provienen de los Institutos Nacionales de Salud de Salud Nº de
concesión HL 40921 que parcialmente respaldó la investigación que
conduce a esta invención.
Esta invención se refiere en general a un factor
VIII porcino.
La coagulación sanguínea empieza cuando las
plaquetas se adhieren a la pared de corte de un vaso sanguíneo
lesionado en un sitio de lesión. Posteriormente, en una cascada de
reacciones reguladas enzimáticamente, se convierten las moléculas de
fibrinógeno soluble mediante la enzima trombina en cadenas
insolubles de trombina que mantienen juntas las plaquetas en un
trombo. En cada etapa de la cascada, se convierte un precursor
proteico en una proteasa que escinde el siguiente precursor proteico
en la serie. Son necesarios cofactores en la mayoría de las etapas.
En su forma activa, la proteína factor VIII es un cofactor que es
necesario para la activación del factor X por la proteasa factor IX
activado.
El factor VIII o factor antihemofílico se
observó en plasma y se nombró en los años 30. En los años 40, se
asoció una deficiencia de factor VIII con el trastorno de
coagulación hemofilia A. Se encontró que el factor VIII estaba
ligado al cromosoma X y se planteó la hipótesis de que era una
proteína. Trabajos que implicaron plasma bovino, humano y porcino
identificaron en los años 80 el factor VIII como una proteína,
aunque su fuente celular definitiva permanece incierta.
Es desconocido cómo funciona exactamente el
factor VIII en la coagulación sanguínea. Es conocido que el factor
VIII se activa a factor VIIIa proteolíticamente mediante la trombina
o el factor Xa. En combinación con calcio y fosfolípido, el factor
VIIIa hace al factor IXa un activador más eficaz del factor X
mediante un mecanismo desconocido.
La gente deficiente en factor VIII o que tiene
anticuerpos contra el factor VIII que no se tratan con factor VIII
padecen hemorragias internas incontroladas que pueden causar una
serie de graves síntomas, desde reacciones inflamatorias en
articulaciones a la muerte temprana. Los hemofílicos graves, que
ascienden aproximadamente a 10.000 en los Estados Unidos, pueden
tratarse con infusión de factor VIII, que recuperará la capacidad de
coagulación normal de la sangre si se administra con suficiente
frecuencia y concentración. La definición clásica de factor VIII, de
hecho, es aquella sustancia presente en plasma sanguíneo normal que
corrige el defecto de coagulación en plasma derivado de individuos
con hemofilia A.
Están disponibles comercialmente varias
preparaciones de factor VIII derivado de plasma humano de grados
variables de pureza para el tratamiento de la hemofilia A. Estas
incluyen un factor VIII parcialmente purificado derivado de la
sangre combinada de muchos donantes que se trata con calor y
detergente por los virus, pero que contiene un nivel significativo
de proteínas antigénicas; un factor VIII purificado con anticuerpo
monoclonal que tiene niveles menores de impurezas antigénicas y
contaminación viral; y factor VIII recombinante humano, para el que
están en desarrollo ensayos clínicos. Adicionalmente, está
disponible una preparación de factor VIII porcino parcialmente
purificado para tratar pacientes con inhibidores del factor VIII
humano, concretamente aquellos que tienen moléculas de anticuerpo en
circulación que se unen a y neutralizan factor VIII humano.
Los hemofílicos requieren la sustitución diaria
de factor VIII para evitar la artropatía hemofílica deformante que
aparece después de muchos años de hemorragias recurrentes en las
articulaciones. Sin embargo, los suministros de concentrados de
factor VIII no han sido nunca suficientemente abundantes para tratar
adecuadamente a los hemofílicos debido a problemas en la producción
comercial y el uso terapéutico. Por ejemplo, el derivado de plasma
utilizado habitualmente es difícil de aislar y purificar, es
inmunogénico y requiere tratamiento para eliminar el riesgo de
infectividad por virus del SIDA y la hepatitis. El factor VIII
recombinante humano puede reducir los dos últimos problemas. El
factor VIII porcino puede presentar también una alternativa, puesto
que el factor VIII humano es inestable a concentraciones y pH
fisiológicos y está presente en la sangre a una concentración
extremadamente baja (0,2 \mug/ml de plasma), y su actividad
específica de coagulación es baja, comparada con el factor VIII
porcino.
Puesto que muchos inhibidores de factor VIII
humano reaccionan menos fuertemente con factor VIII porcino, el
factor VIII porcino se utiliza actualmente para corregir la
deficiencia de factor VIII en pacientes con afecciones en las que no
responden a infusiones de factor VIII humano. Es una limitación del
factor VIII porcino el desarrollo de anticuerpos inhibidores contra
él después de una o más infusiones.
Los problemas asociados al factor VIII derivado
de plasma comercialmente disponible utilizado habitualmente han
estimulado un significativo interés en el desarrollo de un mejor
producto factor VIII. Existe la necesidad de una molécula de factor
VIII más potente de modo que puedan suministrarse más unidades de
actividad de coagulación por molécula; una molécula de factor VIII
que sea estable a un pH seleccionado y a concentración fisiológica;
una molécula de factor VIII que sea menos apta para producir
anticuerpos inhibidores; y una molécula de factor VIII que evite la
detección inmune en pacientes que han adquirido ya anticuerpos
contra el factor VIII humano.
Es por lo tanto un objeto de la presente
invención proporcionar un factor VIII que corrija la hemofilia en un
paciente deficiente en factor VIII o que tenga inhibidores de factor
VIII humano.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar un factor VIII con una eficacia aumentada en ensayos de
coagulación de factor VIII.
Es aún otro objeto de la presente invención
proporcionar un factor VIII que sea estable a un pH seleccionado y a
concentración fisiológica.
Se describen procedimientos para preparar factor
VIII híbrido porcino altamente purificado que tienen las etapas de:
(b) construcción de dominios de factor VIII porcino mediante
tecnología de ADN recombinante.
La Figura 1 (técnica anterior) es una
representación en diagrama de una molécula de factor VIII que
muestra las subunidades (cadenas ligera y pesada) y los
dominios.
"Actividad específica", como se utiliza en
la presente memoria, designa la actividad que corregirá el defecto
de coagulación de plasma deficiente en factor VIII humano. La
actividad específica se mide en unidades de actividad de coagulación
por miligramo total de proteína factor VIII en un ensayo estándar en
el que se compara el tiempo de coagulación de plasma deficiente en
factor VIII humano con el de plasma humano normal. Una unidad de
actividad de factor VIII es la actividad presente en 1 ml de plasma
humano normal. En el ensayo, cuanto más corto es el tiempo de
formación de coágulo, mayor es la actividad del factor VIII que se
está ensayando.
"Deficiencia de factor VIII", como se
utiliza en la presente memoria, incluye deficiencia en la actividad
de coagulación causada por la producción de un factor VIII
defectivo, mediante la producción inadecuada o nula de factor VIII,
o mediante la inhibición parcial o total del factor VIII por
inhibidores. La hemofilia A es un tipo de deficiencia de factor VIII
como resultado de un defecto en un gen ligado al cromosoma X y a la
ausencia o deficiencia de la proteína factor VIII que codifica.
"Subunidades" de factor VIII humano o
porcino, como se utiliza en la presente memoria, son las cadenas
pesadas y ligeras de la proteína. La cadena pesada del factor VIII
contiene tres "dominios", A1, A2 y B. La cadena ligera del
factor VIII contiene también tres "dominios", A3, C1 y C2.
Se ha aislado y purificado a partir de plasma el
factor VIII porcino (Fass, D.N., et al., 59 Blood 594
(1982). Se muestran la secuencia aminoacídica de B y parte de
los dominios A2 del factor VIII porcino, como se reseña por Toole,
J.J., et al., 83 Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA
5939-5942 (1986), cuyas enseñanzas se incorporan a
la presente memoria, y la correspondiente secuencia de ADN genómico
en forma de la SEC Nº ID 6 y la SEC Nº ID 5, respectivamente. La
región de codificación en la secuencia nucleotídica comienza en la
posición 675 (GGT CTC TGG...), que corresponde a los aminoácidos
(Gly-Leu-Tyr), los aminoácidos
NH_{2} terminales.
Secuencias de ADN genómico de los dominios B y
parte del A2 del factor VIII porcino (SEQ ID Nº 5 en el disco de
PatentIn)
Secuencia de aminoácidos predicha de los
dominios B y parte del A2 del factor VIII porcino, basado en la
secuencia de ADN genómico anterior (SEQ ID Nº 6 en el disco de
patentIn): (Los Residuos de aminoácidos marcados "Xaa"
representan supresiones en el dominio B porcino con relación al
dominio B humano)
Se aislaron tanto factor VIII porcino como
humano a partir de plasma en forma de una proteína de dos
subunidades. La Fig 1 (técnica anterior) ilustra en un diagrama la
estructura de subunidades de la molécula. Las subunidades, conocidas
como la cadena pesada y la cadena ligera, se mantienen juntas
mediante un enlace no covalente que requiere calcio u otros iones
metálicos divalentes. La cadena pesada del factor VIII contiene tres
dominios, A1, A2 y B, que están unidos covalentemente. La cadena
ligera del factor VIII contiene también tres dominios designados A3,
C1 y C2. El dominio B no tiene función conocida y puede eliminarse
de la molécula proteolíticamente o mediante procedimientos de
tecnología de ADN recombinante sin alteración significativa de
ningún parámetro mensurable del factor VIII. El factor VIII
recombinante humano tiene una estructura y función similares al
factor VIII derivado de plasma, aunque no está glicosilado a menos
que se exprese en células de mamífero.
Tanto el factor VIII activado humano como
porcino (factor VIIIa) tienen tres subunidades debido a la escisión
de la cadena pesada entre los dominios A1 y A2. Esta estructura se
designa A1/A2/A3-C1-C2. El factor
VIIIa humano no es estable en las condiciones que estabilizan al
factor VIIIa porcino. Esto es debido a la asociación más débil de la
subunidad A2 del factor VIIIa humano. La disociación de la subunidad
A2 del factor VIIIa humano y porcino está asociada a la pérdida de
actividad.
Puesto que la secuencia nucleotídica del dominio
B porcino es conocida, pueden construirse híbridos completos. Los
dominios individuales de ADNc del factor VIII porcino pueden
clonarse y sustituirse por los correspondientes dominios humanos
mediante técnicas de mutagénesis establecidas. Estas moléculas de
ADNc de factor VIII pueden clonarse en vectores de expresión para la
expresión última de moléculas de proteína factor VIII híbrido
humano/porcino.
Se secuenció el dominio A2 completo del factor
VIII, homólogo a los residuos 372-740 en el factor
VIII humano maduro (SEC Nº ID 3), y se predijo la secuencia
aminoacídica. Estas secuencias se muestran a continuación.
Secuencia de nucleótidos de la hebra de
polaridad positiva del dominio A2 del factor VIII (SEQ ID Nº 1 en el
disco de PatentIn):
Secuencia de aminoácidos predicha del dominio A2
del factor VIII porcino (Definido como residuos homólogos a la
secuencia del factor VIII humano 373 - 740, derivada de la secuencia
de ADNc excepto como se ha indicado) (Los residuos subrayados son de
la secuencia de aminoácidos porcino conocida) (SEQ ID Nº 2 en el
disco de patentIn):
Ejemplo
1
El factor VIII porcino tiene más actividad
coagulante que el factor VIII humano, basándose en la actividad
específica de la molécula. Estos resultados se muestran en la Tabla
II en el ejemplo 4. Esta conclusión está basada en el uso de curvas
patrón apropiadas que permiten comparar bien el factor VIII humano y
porcino. Los ensayos de coagulación están basados en la capacidad
del factor VIII de acortar el tiempo de coagulación de derivado de
plasma de un paciente con hemofilia A. Se emplearon dos tipos de
ensayos: el ensayo de una etapa y de dos etapas.
En el ensayo de una etapa, se incubaron 0,1 ml
de plasma de hemofilia A (Georg King Biomedical, Inc.) con 0,1 ml de
reactivo de tromboplastina parcialmente activada (APTT) (Organon
Teknika) y 0,01 ml de muestra o patrón, constituido por plasma
humano normal citrado diluido, durante 5 min a 37ºC en un baño de
agua. La incubación fue seguida por la adición de 0,1 ml de
CaCl_{2} 20 mM, y se determinó el tiempo de desarrollo de un
coágulo de fibrina mediante inspección visual.
Se define una unidad de factor VIII como la
cantidad presente en 1 ml de plasma humano normal citrado. Con
plasma humano como patrón, se compararon directamente la actividad
de factor VIII porcino y humano. Se realizaron diluciones del patrón
de plasma o proteínas purificadas con NaCl 0,15 M, HEPES 0,02 M, pH
7,4. Se construyó la curva patrón basándose en 3 ó 4 diluciones de
plasma, siendo la dilución mayor 1/50, y representando el tiempo de
coagulación en log10 frente a la concentración plasmática en log10,
lo que da como resultado una gráfica lineal. Se determinaron las
unidades de factor VIII en una muestra desconocida mediante
interpolación de la curva patrón.
El ensayo de una etapa se basa en la activación
endógena del factor VIII mediante activadores formados en el plasma
de hemofilia A, mientras que el ensayo de dos etapas mide la
actividad procoagulante de factor VIII preactivado. En el ensayo de
dos etapas, se añadieron muestras que contenían factor VIII que se
había hecho reaccionar con trombina a una mezcla de tromboplastina
parcialmente activada y plasma humano de hemofilia A que se había
preincubado durante 5 min a 37ºC. Se convirtieron después los
tiempos de coagulación resultantes en unidades/ml, basándose en la
misma curva patrón humana descrita anteriormente. La actividad
relativa en el ensayo de dos etapas fue mayor que en el ensayo de
una etapa debido a que el factor VIII se había preactivado.
Ejemplo
2
Se ha descrito en la bibliografía el aislamiento
de factor VIII porcino y humano derivado de plasma y factor VIII
recombinante humano. Fulcher, C.A. y T.S. Zimmerman, 79 Proc.
Nat'l. Acad. Sci. USA 1648-1652 (1982); Toole,
J.J., et al., 312 Nature 342-347
(1984) (Genetics Institute); Gitschier, J., et al., 312
Nature 326-330 (1984) (Genentech); Wood,
W.I.,. et al., 312 Nature 330-337
(1984) (Genentech); Vehar, G.A., et al., 312 Nature
337-342 (1984) (Genentech); Fass, D.N., et
al., 59 Blood 594 (1982); Toole, J.J., et al., 83
Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 5939-5942 (1986).
Esto puede conseguirse de diversos modos. Todas estas preparaciones
son similares en la composición de subunidades, aunque esta es la
primera descripción de la diferencia funcional entre factor VIII
humano y porcino, no observada anteriormente en parte debido a la
falta de uso de un patrón común con el que compararlos.
Para la comparación de factor VIII recombinante
humano y porcino, se sometieron preparaciones de factor VIII
recombinante humano altamente purificado (Cutter Laboratories,
Berkeley, CA) y factor VIII porcino (inmunopurificado como se
describe en Fass, D.N., et al., 59 Blood 594 (1982)) a
cromatografía líquida de alta presión (HPLC) en una columna de
intercambio aniónico Mono Q™ (Pharmacia-LKB,
Piscataway, NJ) (Pharmacia, Inc.) Los fines de la etapa de HPLC en
Mono Q™ fueron la eliminación de las impurezas minoritarias y el
intercambio de factor VIII humano y porcino en un tampón común con
fines comparativos. Se reconstituyeron viales que contenían
1000-2000 unidades de factor VIII con 5 ml de
H_{2}O. Se añadió después Hepes (2 M a pH 7,4) a una concentración
final de 0,02 M. Se aplicó factor VIII a una columna Mono Q™ HR 5/5
equilibrada con NaCl 0,15 M, Hepes 0,02 M, CaCl_{2} 5 mM a pH 7,4
(tampón A más NaCl 0,15 M); se lavó con 10 ml de tampón A + NaCl
0,15 M; y se eluyó con un gradiente lineal de 20 ml de NaCl 0,15 M a
0,90 M en tampón A a un caudal de 1 ml/min.
Para comparación del factor VIII humano
(derivado de plasma y purificado mediante HPLC en Mono Q™) y factor
VIII porcino, se diluyó 1:4 factor VIII porcino derivado de plasma
purificado por inmunoafinidad con Hepes 0,04 M, CaCl_{2} 5 mM,
Tween-80 al 0,01% a pH 7,4, y se sometió a HPLC en
Mono Q™ en las mismas condiciones descritas en el párrafo anterior
para el factor VIII humano. Estos procedimientos para el aislamiento
de factor VIII humano y porcino son estándar para los expertos en la
técnica.
Se ensayó la actividad del factor VIII en las
fracciones de columna mediante un ensayo de coagulación de una
etapa. Se dan los resultados promedio de los ensayos, expresados en
unidades de actividad por A_{280} del material en la Tabla I, y se
indica que el factor VIII porcino tiene al menos seis veces más
actividad que el factor VIII humano cuando se utiliza el ensayo de
una etapa.
Actividad (U/A_{280}) | |
Porcino | 21.300 |
Humano derivado de plasma | 3.600 |
Recombinante humano | 2.400. |
Ejemplo
3
Los resultados del ensayo de una etapa para el
factor VIII reflejan la activación del factor VIII a factor VIIIa en
la muestra y posiblemente la pérdida de actividad del factor VIIIa
formado. Se realizó una comparación directa de la estabilidad de
factor VIII humano y porcino. Se diluyeron las muestras de HPLC en
Mono Q™ a la misma concentración y se hizo reaccionar la composición
en tampón con trombina. Se retiraron en diversos momentos muestras
para el ensayo de coagulación de dos etapas. Típicamente, la
actividad máxima (a los 2 min) fue 10 veces mayor para factor VIIIa
porcino que para humano, y las actividades tanto de factor VIIIa
porcino como humano se redujeron posteriormente, reduciéndose más
rápidamente la actividad del factor VIIIa humano.
Generalmente, los intentos de aislar factor
VIIIa humano estable no son exitosos incluso cuando se utilizan
condiciones que producen factor VIIIa porcino estable. Para
demostrar esto, se activó factor VIII humano purificado mediante
HPLC con Mono Q™ con trombina y se sometió a HPLC de intercambio
catiónico en Mono-S™ (Pharmacia, Inc.) en
condiciones que producen un factor VIIIa porcino estable (Lollar,
J.S., y Parker, C.G., 28 Biochemistry 666, 1989, cuyas
enseñanzas se incorporan a la presente memoria).
Se hizo reaccionar factor VIII humano, 43
\mug/ml (0,2 \muM), en NaCl 0,2 M, Hepes 0,01 M, CaCl_{2} 2,5
M a pH 7,4 en 10 ml de volumen total con trombina (0,036 \muM)
durante 10 min, en cuyo momento se añadió
FPR-CH_{2}Cl,
D-fenilprolilarginilclorometilcetona, a una
concentración de 0,2 \muM para la inactivación irreversible de la
trombina. Se diluyó después la mezcla 1:1 con ácido
2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) 40 mM, CaCl_{2}
5 mM a pH 6,0, y se cargó a 2 ml/min en una columna de HPLC Mono S™
HR 5/5 equilibrada con MES 5 mM, CaCl_{2} 5 mM a pH 6,0 (tampón B)
más NaCl 0,1 M. Se eluyó el factor VIIIa sin lavado de columna con
20 ml de un gradiente desde NaCl 0,1 M a NaCl 0,9 M en tampón B a 1
ml/min.
Se eluyó la fracción con actividad coagulante en
el ensayo de dos etapas en forma de un solo pico en estas
condiciones. La actividad específica de la fracción de pico fue
aproximadamente de 7.500 U/A_{280}. La electroforesis en gel de
poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio
(SDS-PAGE) del pico de factor VIIIa en Mono S™,
seguido de tinción con plata de la proteína, reveló dos bandas
correspondientes a un derivado heterodimérico
(A3-C1-C2/A1) del factor VIII.
Aunque el fragmento A2 no se identificó mediante tinción con planta
en estas condiciones debido a su baja concentración, se identificó
como un oligoconstituyente mediante marcaje con ^{125}I.
En contraposición con los resultados con factor
VIII humano, el factor VIIIa porcino aislado mediante HPLC en Mono
S™ en las mismas condiciones tenía una actividad específica de 1,6 a
10[ ] U/A_{280}. El análisis del factor VIIIa porcino mediante
SDS-PAGE reveló 3 fragmentos correspondientes a las
subunidades A1, A2 y A3-C1-C2,
demostrando que el factor VIIIa porcino posee las tres
subunidades.
Los resultados de la HPLC en Mono S™ de
preparaciones de factor VIII humano activado con trombina a pH 6,0
indican que el factor VIIIa humano es lábil en condiciones que
proporcionan factor VIIIa porcino estable. Sin embargo, a pesar de
que se identificaron cantidades traza de fragmento de A2 en la
fracción de pico, la determinación de si la actividad coagulante
daba como resultado pequeñas cantidades de factor VIIIa
heterotrimérico o de factor VIIIa heterodimérico que tuviera una
baja actividad específica no fue posible con este procedimiento
solo.
Es deseable un modo de aislar factor VIIIa
humano antes de que pierda su subunidad A2 para resolver esta
cuestión. Con este fin, se realizó el aislamiento en un
procedimiento que implica la reducción del pH de los tampones Mono
S™ a pH 5. Se diluyó el factor VIII humano purificado (0,5 mg) en
Mono Q™ con H_{2}O, proporcionando una composición final de 0,25
mg/ml (1 \muM) de factor VIII en NaCl 0,25 M, Hepes 0,01 M,
CaCl_{2} 2,5 mM, Tween-80 al 0,005% a pH 7,4
(volumen total 7,0 ml). Se añadió trombina a una concentración final
de 0,072 \muM y se dejó reaccionar durante 3 min. Se inactivó
después la trombina con FPR-CH_{2}Cl (0,2 \muM).
Se diluyó después la mezcla 1:1 con acetato de sodio 40 mM,
CaCl_{2} 5 mM, Tween-80 al 0,01% a pH 5,0, y se
cargó a 2,0 ml/min en una columna Mono S™ HR 5/5 equilibrada con
acetato de sodio 0,01 M, CaCl_{2} 5 mM, Tween-80
al 0,01% a pH 5,0, más NaCl 0,1 M. Se eluyó el factor VIIIa sin
lavado de columna con 20 ml de un gradiente de NaCl 0,1 M a NaCl 1,0
M en el mismo tampón a 1 ml/min. Esto dio como resultado la
recuperación de la actividad coagulante en un pico que contenía
cantidades detectables del fragmento A2, como se muestra por
SDS-PAGE y tinción con plata. La actividad
específica de la fracción de pico era diez veces mayor que la
recuperada a pH 6,0 (75.000 U/A_{280}) frente a 7.500
U/A_{280}). Sin embargo, en contraposición con el factor VIIIa
porcino aislado a pH 6,0, que es indefinidamente estable a 4ºC, la
actividad del factor VIIIa humano se redujo constantemente durante
un periodo de varias horas después de la elución de Mono S™.
Adicionalmente, la actividad específica del factor VIIIa purificado
a pH 5,0 y ensayado inmediatamente es sólo un 5% de la del factor
VIIIa porcino, indicando que ocurrió una disociación sustancial
antes del
ensayo.
ensayo.
Estos resultados demuestran que tanto el factor
VIIIa humano como porcino están compuestos por tres subunidades (A1,
A2 y A3-C1-C2). La disociación de la
subunidad A2 es responsable de la pérdida de actividad tanto del
factor VIIIa humano como porcino en ciertas condiciones, tales como
fuerza iónica, pH y concentración fisiológicos. La estabilidad
relativa del factor VIIIa porcino en ciertas condiciones es debida a
la mayor asociación de la subunidad A2.
Ejemplo
4
Se han secuenciado sólo el dominio B y parte del
dominio A2 del factor VIII porcino (Toole, J.J., et al., 83
Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 5939-5942
(1986)), SEC Nº ID 5. La secuencia de ADN genómico del dominio B del
factor VIII porcino y la secuencia de ADNc del dominio A2 completo
del factor VIII porcino se dan a conocer en la presente memoria.
Se clonó el dominio A2 del factor VIII porcino
mediante transcripción inversa de ARN total de bazo porcino y
amplificación por PCR; se utilizaron cebadores degenerados basados
en la secuencia de ADNc conocida del factor VIII humano y un cebador
porcino exacto basado en una parte de la secuencia del factor VIII
porcino. Se aisló un producto de PCR de 1 kb y se amplificó mediante
inserción en un vector fagémido Bluescript™ (Stratagene).
Se secuenció completamente el dominio A2 porcino
mediante secuenciación didesoxi. La secuencia es como se ha descrito
anteriormente.
<110> Universidad de Emory
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Factor VIII híbrido
humano/porcino
\vskip1.000000\baselineskip
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<130> 75-95A WO
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