JP2535547B2 - 第▲viii▼因子抵抗性血友病a治療剤およびその製法 - Google Patents
第▲viii▼因子抵抗性血友病a治療剤およびその製法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、第VIII因子による通常の治療には応答しな
い血友病A患者を治療するための剤、およびその製造方
法に関する。
い血友病A患者を治療するための剤、およびその製造方
法に関する。
第VIII因子濃縮物で治療される血友病A患者の約1/4
までが、いわゆるインヒビター血友病を呈する。これら
に特徴的なことは、凝血活性を潜在的に有する第VIII因
子分子のサブユニツト(F VIII:C)に対する非沈殿性の
同種抗体が患者の血中を循環していることである。血友
病患者の血漿中に極めて高水準、すなわち100〜数千U/m
lに達することもある力価で存在するこれらの抗体は、
第VIII因子を合成しないかまたは合成しても不十分な量
でしかない患者において置換のために注入されると対応
するF VIIIの活性を中和してしまう。阻害性抗体の量は
しばしば第VIII因子を大量に投与してさえ治療が成功し
ない程に高くなる。
までが、いわゆるインヒビター血友病を呈する。これら
に特徴的なことは、凝血活性を潜在的に有する第VIII因
子分子のサブユニツト(F VIII:C)に対する非沈殿性の
同種抗体が患者の血中を循環していることである。血友
病患者の血漿中に極めて高水準、すなわち100〜数千U/m
lに達することもある力価で存在するこれらの抗体は、
第VIII因子を合成しないかまたは合成しても不十分な量
でしかない患者において置換のために注入されると対応
するF VIIIの活性を中和してしまう。阻害性抗体の量は
しばしば第VIII因子を大量に投与してさえ治療が成功し
ない程に高くなる。
抗体が発現している血友病A患者にしばしば生じる重
症出血の治療には多くの対策が試みられてはいるが、こ
れらの対策は部分的に成功しているにすぎない。これら
の対策には、第II、VII、IXおよびX因子を含むプロス
ロンビン複合体濃縮物(PCC)の注入が含まれる。救急
状態にあつては、異タンパク投与の危険を冒して、動物
血漿(主として牛または豚血漿)からの第VIII因子が用
いられてさえいる。最近では、活性化凝固因子(activa
ted coagulation factors)も用いられ一定の成功をお
さめている。このタイプの剤は、それに含まれる活性化
凝固酵素の作用が調節しにくいため、血栓症の危険を排
除できない。
症出血の治療には多くの対策が試みられてはいるが、こ
れらの対策は部分的に成功しているにすぎない。これら
の対策には、第II、VII、IXおよびX因子を含むプロス
ロンビン複合体濃縮物(PCC)の注入が含まれる。救急
状態にあつては、異タンパク投与の危険を冒して、動物
血漿(主として牛または豚血漿)からの第VIII因子が用
いられてさえいる。最近では、活性化凝固因子(activa
ted coagulation factors)も用いられ一定の成功をお
さめている。このタイプの剤は、それに含まれる活性化
凝固酵素の作用が調節しにくいため、血栓症の危険を排
除できない。
不溶化された第VIII因子への免疫吸着原理を用いて患
者血漿からこれらの抗体を除去しようという試みもなさ
れている。更に血漿搬出法も抗体の除去に用いられる。
最後に、F VIII:Cに対する抗体形成を治療的に阻止する
試みもなされている。
者血漿からこれらの抗体を除去しようという試みもなさ
れている。更に血漿搬出法も抗体の除去に用いられる。
最後に、F VIII:Cに対する抗体形成を治療的に阻止する
試みもなされている。
最近では、F VIIIと燐脂質との複合体もインヒビター
血友病の治療に考慮されている(J.Lab.Clin.Med.101,3
4−43,1983)。このアプローチは、F VIIIが燐脂質と結
合し、そしてこれらの結合部位がまさに血友病患者の同
種抗体が標的としているものであるという認識に基づい
ている。このことと符号して、F VIII燐脂質複合体は、
同種−および自己−抗体タイプのインヒビターによる攻
撃から守られる。相当する複合体、および活性化酵素
も、FEIBA(第VIII因子インヒビター・バイパス活性)
の活性主成分として示唆されている(Thrombosis Resea
rch 21,181−186,1981)。
血友病の治療に考慮されている(J.Lab.Clin.Med.101,3
4−43,1983)。このアプローチは、F VIIIが燐脂質と結
合し、そしてこれらの結合部位がまさに血友病患者の同
種抗体が標的としているものであるという認識に基づい
ている。このことと符号して、F VIII燐脂質複合体は、
同種−および自己−抗体タイプのインヒビターによる攻
撃から守られる。相当する複合体、および活性化酵素
も、FEIBA(第VIII因子インヒビター・バイパス活性)
の活性主成分として示唆されている(Thrombosis Resea
rch 21,181−186,1981)。
F VIII−燐脂質複合体の効果については十分な実験的
基礎がある。すなわち、例えば、J.Lab.Clin.Med.101,3
4−43(1983)においては、このタイプの複合体をイン
ヒビター血漿にF IXaと共に添加した場合、カルシウム
イオンが添加されるや否やそれによつてトロンビン形
成、従つて凝血も開始されることが実験的に示されてい
る。この治療概念は有望のようにみえるが、それでもな
お、活性化因子をその産生過程で調節はできても困難で
あり、その上にそれらの生体内効果を評価できないとい
う欠点がある。
基礎がある。すなわち、例えば、J.Lab.Clin.Med.101,3
4−43(1983)においては、このタイプの複合体をイン
ヒビター血漿にF IXaと共に添加した場合、カルシウム
イオンが添加されるや否やそれによつてトロンビン形
成、従つて凝血も開始されることが実験的に示されてい
る。この治療概念は有望のようにみえるが、それでもな
お、活性化因子をその産生過程で調節はできても困難で
あり、その上にそれらの生体内効果を評価できないとい
う欠点がある。
これらの方法には、すべて欠点があるのである。
それ故、本発明の目的は、第VIII因子抵抗性血友病治
療剤を提供することにある。
療剤を提供することにある。
本発明は、第VIII因子、抗トロンビンIII、燐脂質お
よびカルシウムイオンの混合物を水性溶液として1〜45
℃、好ましくは37℃の温度に少くとも1分間保ち、第IX
因子を添加し、そしてその溶液をこの溶液の試料のイン
ヒビター・プラズマへの添加が15〜30秒の部分的トロン
ボプラスチン時間(PTT)を与えるまで1〜45℃、好ま
しくは20℃の温度に保ち、適切な場合にはポリオールを
添加し、そして適切な場合にはアミノ酸、そして適切な
場合にはその溶液を乾燥することにより得られる、第VI
II因子による治療に抵抗性の血友病Aの治療剤に関す
る。
よびカルシウムイオンの混合物を水性溶液として1〜45
℃、好ましくは37℃の温度に少くとも1分間保ち、第IX
因子を添加し、そしてその溶液をこの溶液の試料のイン
ヒビター・プラズマへの添加が15〜30秒の部分的トロン
ボプラスチン時間(PTT)を与えるまで1〜45℃、好ま
しくは20℃の温度に保ち、適切な場合にはポリオールを
添加し、そして適切な場合にはアミノ酸、そして適切な
場合にはその溶液を乾燥することにより得られる、第VI
II因子による治療に抵抗性の血友病Aの治療剤に関す
る。
本発明はまた、この剤の製造方法にも関する。
前述の諸因子と燐脂質およびCaイオンとの相互作用を
介してインキユベーシヨン中に活性複合体が生じるが、
これはF VIIIに対する同種抗体の存在下にあつても内生
凝固径路を活性化できる。このための前提条件は、前記
諸因子が活性混合物中に、特定の割合で、好ましくは、
4UのF VIIIに対し0.5〜2UのF IXおよび0.5〜1UのAT III
の割合で、少くとも25μgの燐質および0.75ミリモル/l
に相当する濃度のCaCl2と共に存在することである。
介してインキユベーシヨン中に活性複合体が生じるが、
これはF VIIIに対する同種抗体の存在下にあつても内生
凝固径路を活性化できる。このための前提条件は、前記
諸因子が活性混合物中に、特定の割合で、好ましくは、
4UのF VIIIに対し0.5〜2UのF IXおよび0.5〜1UのAT III
の割合で、少くとも25μgの燐質および0.75ミリモル/l
に相当する濃度のCaCl2と共に存在することである。
本発明の方法により、アミド分解またはタンパク分解
活性をもたず(このことはKabi社から入手したクロモゲ
ン性基質S−2238およびS−2222を用いた試験により認
められる)、しかもフイブリノゲンをフイブリンに変え
ない剤が得られることは驚くべきことであつた。それ
故、この剤は、活性化酵素を全く含有し得ない。このこ
とは、それが活性混合物中でAT IIIの存在下に形成され
ること、および後者によりその作用が悪影響を受けない
ことと符号する(このことはインヒビターにより病理的
に増大した部分的トロンボプラスチン時間(PTT)が減
少することから明らかである)。
活性をもたず(このことはKabi社から入手したクロモゲ
ン性基質S−2238およびS−2222を用いた試験により認
められる)、しかもフイブリノゲンをフイブリンに変え
ない剤が得られることは驚くべきことであつた。それ
故、この剤は、活性化酵素を全く含有し得ない。このこ
とは、それが活性混合物中でAT IIIの存在下に形成され
ること、および後者によりその作用が悪影響を受けない
ことと符号する(このことはインヒビターにより病理的
に増大した部分的トロンボプラスチン時間(PTT)が減
少することから明らかである)。
この方法により製造される剤は、4℃で数日間安定で
ある。このことは驚くべきことである。何故ならば、第
X因子またはプロトロンビンのアクチベータの形で生体
内形成されるような活性複合体は不安定であることが知
られているからである。
ある。このことは驚くべきことである。何故ならば、第
X因子またはプロトロンビンのアクチベータの形で生体
内形成されるような活性複合体は不安定であることが知
られているからである。
この方法により得られる剤が、水性溶液として凍結さ
れそして再び解凍されまたは凍結乾燥された場合に失効
するということも驚くべきことであつた。しかしなが
ら、この剤は解凍後好ましくは30〜37℃に加熱するとそ
の活性を取り戻す。その再活性化は図に示された活性化
に相当するものである。凍結または凍結乾燥による失活
に鑑み、炭水化物、好ましくは、二糖類のスクロースを
添加することにより失活を防止できるということは驚く
べきことであつた。
れそして再び解凍されまたは凍結乾燥された場合に失効
するということも驚くべきことであつた。しかしなが
ら、この剤は解凍後好ましくは30〜37℃に加熱するとそ
の活性を取り戻す。その再活性化は図に示された活性化
に相当するものである。凍結または凍結乾燥による失活
に鑑み、炭水化物、好ましくは、二糖類のスクロースを
添加することにより失活を防止できるということは驚く
べきことであつた。
最後に、本発明による剤のインヒビター中和活性がSe
pharose CL 6Bで分離後排出ピークに現れることも驚く
べきことであつた。活性を含む画分は添加されたすべて
の燐脂質を含んでいることも見出された。免疫ブロツテ
イング法を(SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り分離後)用いることにより、これらの画分中に、AT I
II、F IX、F VIIIの誘導体、および100kDの分子量を有
しかつ添加された因子濃縮物には全く存在しなかつた成
分を検出することができた。これらの知見は、本発明に
よる剤が、AT IIIによる保護下に燐脂質およびCaイオン
と共に形成される修飾F VIIIおよびF IXの複合体である
ことを示唆している。
pharose CL 6Bで分離後排出ピークに現れることも驚く
べきことであつた。活性を含む画分は添加されたすべて
の燐脂質を含んでいることも見出された。免疫ブロツテ
イング法を(SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り分離後)用いることにより、これらの画分中に、AT I
II、F IX、F VIIIの誘導体、および100kDの分子量を有
しかつ添加された因子濃縮物には全く存在しなかつた成
分を検出することができた。これらの知見は、本発明に
よる剤が、AT IIIによる保護下に燐脂質およびCaイオン
と共に形成される修飾F VIIIおよびF IXの複合体である
ことを示唆している。
以下の実施例は、本発明を例示するものである。
以下の実施例において、本発明による剤の製造および
特徴付けに用いられる材料: 第VIII因子:F VIII調製物を含む、すべて商業的に入手
し得る第VIII因子濃縮物(バイオテクノロージーにより
得られるものであつてもよい)、特に低温殺菌製品;好
ましくはBehringwerke AG社(ドイツ連邦共和国、Marbu
rg)の Haemate Pと称される第VIII因子濃縮物50IU/ml
を、0.06モル/lのNaClおよび1%グリシンを含有する酢
酸ナトリウム緩衝液(0.02モル/l、pH7.0)に対して透
析したもの; 第XI因子:前記酢酸ナトリウム緩衝液によりヘパリンお
よびクエン酸イオンを含まない第IX因子濃縮物HS Behri
ngwerke(120IU/ml F IX); 燐脂質溶液:血液不含に洗浄し乾燥した胎盤からのテト
ラヒドロフラン抽出物250mgを50mlの蒸留水に乳化し、
過により滅菌しそして0℃の氷浴で20分間50,000Hzで
音波処理し、次いで100,000×gで4℃で1時間遠心分
離したもの。透明上清を用いた。それは次の燐脂質の混
合物を含有した:ホスフアチジルエタノールアミン(P
E)、ホスフアチジルセリン(PS)、ホスフアチジルコ
リン(PC)、ホスフアチジルイノシトール(PI)、スフ
インゴミエリン(Sph)およびリソホスホグリセリド類
(L); 0.1モル/lの水性塩化カルシウム溶液; 抗トロンビンIII溶液: Kybernin HS 500(Behringwer
ke AG)。1パツクは500U(ヘパリン補助因子として測
定)を10mlの蒸留水中に溶存含有。
特徴付けに用いられる材料: 第VIII因子:F VIII調製物を含む、すべて商業的に入手
し得る第VIII因子濃縮物(バイオテクノロージーにより
得られるものであつてもよい)、特に低温殺菌製品;好
ましくはBehringwerke AG社(ドイツ連邦共和国、Marbu
rg)の Haemate Pと称される第VIII因子濃縮物50IU/ml
を、0.06モル/lのNaClおよび1%グリシンを含有する酢
酸ナトリウム緩衝液(0.02モル/l、pH7.0)に対して透
析したもの; 第XI因子:前記酢酸ナトリウム緩衝液によりヘパリンお
よびクエン酸イオンを含まない第IX因子濃縮物HS Behri
ngwerke(120IU/ml F IX); 燐脂質溶液:血液不含に洗浄し乾燥した胎盤からのテト
ラヒドロフラン抽出物250mgを50mlの蒸留水に乳化し、
過により滅菌しそして0℃の氷浴で20分間50,000Hzで
音波処理し、次いで100,000×gで4℃で1時間遠心分
離したもの。透明上清を用いた。それは次の燐脂質の混
合物を含有した:ホスフアチジルエタノールアミン(P
E)、ホスフアチジルセリン(PS)、ホスフアチジルコ
リン(PC)、ホスフアチジルイノシトール(PI)、スフ
インゴミエリン(Sph)およびリソホスホグリセリド類
(L); 0.1モル/lの水性塩化カルシウム溶液; 抗トロンビンIII溶液: Kybernin HS 500(Behringwer
ke AG)。1パツクは500U(ヘパリン補助因子として測
定)を10mlの蒸留水中に溶存含有。
スクロース:特級品(extra pure)(ドイツ連邦共和国
Darmstadt,Merck社製); 緩衝液: a)20ミリモル/l酢酸ナトリウム、20ミリモル/l NaC
l、pH7.5(伝導率3.8mS/cm、25℃) b)50ミリモル/lイミダゾール、20ミリモル/l NaCl、p
H7.5(伝導率3.7mS/cm、25℃) 実施例1 1.本発明による剤の製造 1.4mlの第VIII因子濃縮物を14.5mlの緩衝液aで希釈
し、そして175μlの抗トロンビンIII溶液、80μlの燐
脂質溶液、120μlの塩化カルシウム溶液および0.32gの
スクロースを添加し、そしてその混合物を37℃に30分間
維持した。次に70μlの第IX因子溶液をピペツトで採取
添加した。その混合物を20℃に3時間維持し、そして規
定された時間間隔(図参照)をおいて、アリクオートを
採取し「インヒビター・プラズマ」すなわち、第VIII因
子に対する抗体を含む血漿における部分的トロンボプラ
スチン時間(PTT)の測定により試験した。燐脂質また
は塩化カルシウムを含まない混合物を対照例として用い
た。試験手順としては、37℃で、0.1mlの前述の如く製
造された混合物、0.1mlのPTT試薬例えば Pathromtinそ
して6分後に0.1mlの0.025モル/l塩化カルシウム溶液を
0.1mlの80Bu/ml(Bu=ベセスダ(Bethesda)単位)のイ
ンヒビター・プラズマに添加した。
Darmstadt,Merck社製); 緩衝液: a)20ミリモル/l酢酸ナトリウム、20ミリモル/l NaC
l、pH7.5(伝導率3.8mS/cm、25℃) b)50ミリモル/lイミダゾール、20ミリモル/l NaCl、p
H7.5(伝導率3.7mS/cm、25℃) 実施例1 1.本発明による剤の製造 1.4mlの第VIII因子濃縮物を14.5mlの緩衝液aで希釈
し、そして175μlの抗トロンビンIII溶液、80μlの燐
脂質溶液、120μlの塩化カルシウム溶液および0.32gの
スクロースを添加し、そしてその混合物を37℃に30分間
維持した。次に70μlの第IX因子溶液をピペツトで採取
添加した。その混合物を20℃に3時間維持し、そして規
定された時間間隔(図参照)をおいて、アリクオートを
採取し「インヒビター・プラズマ」すなわち、第VIII因
子に対する抗体を含む血漿における部分的トロンボプラ
スチン時間(PTT)の測定により試験した。燐脂質また
は塩化カルシウムを含まない混合物を対照例として用い
た。試験手順としては、37℃で、0.1mlの前述の如く製
造された混合物、0.1mlのPTT試薬例えば Pathromtinそ
して6分後に0.1mlの0.025モル/l塩化カルシウム溶液を
0.1mlの80Bu/ml(Bu=ベセスダ(Bethesda)単位)のイ
ンヒビター・プラズマに添加した。
図はその結果を含んでいる: × 本発明による剤; + この剤からカルシウムイオンを除いたもの; ○ この剤から燐脂質を除いたもの。
2.F VIII:Cのインヒビターを含有する血友病A血漿を用
いた本発明による剤の特徴付け1.で製造した剤を各種力
価の抗体を有するインヒビター・プラズマで試験した。
いた本発明による剤の特徴付け1.で製造した剤を各種力
価の抗体を有するインヒビター・プラズマで試験した。
その結果を次表に示す。
これらの結果は、80〜640Bu/mlに相当する抗体力価を
有するインヒビター・プラズマの病理的に増大したPTT
が本発明による剤によつて正常化することを示してい
る。このタイプの剤を添加しないと、80Buのインヒビタ
ー・プラズマも640Buのものも約120秒のPTTを与え、ま
たこれらは第VIII因子を添加しても短縮されなかつた。
従つて、第1表の実験結果は(第VIII因子とは対照的
に)本発明による剤がインヒビターにより捕獲、中和さ
れないことをはつきりと示している。従つてこの剤は、
例えば同種抗体タイプの第VIII因子のインヒビターをも
つ血友病患者の治療に極めて適している。
有するインヒビター・プラズマの病理的に増大したPTT
が本発明による剤によつて正常化することを示してい
る。このタイプの剤を添加しないと、80Buのインヒビタ
ー・プラズマも640Buのものも約120秒のPTTを与え、ま
たこれらは第VIII因子を添加しても短縮されなかつた。
従つて、第1表の実験結果は(第VIII因子とは対照的
に)本発明による剤がインヒビターにより捕獲、中和さ
れないことをはつきりと示している。従つてこの剤は、
例えば同種抗体タイプの第VIII因子のインヒビターをも
つ血友病患者の治療に極めて適している。
本発明による剤の効果はクエン酸塩加ヒト全血を用い
たトロンボエラストグラフイ(TEG)によつて実証する
こともできる。
たトロンボエラストグラフイ(TEG)によつて実証する
こともできる。
クエン酸塩加全血(230μl)をインヒビター・プラ
ズマ(20μl、1,400Bu/ml含有)と混合しておいたとこ
ろ、予期されたとおりトロンボエラストグラムのrおよ
びk時間は増加した。その増加したrおよびk値は、実
施例1よりの本発明による剤(10μl)の添加により正
常化した。
ズマ(20μl、1,400Bu/ml含有)と混合しておいたとこ
ろ、予期されたとおりトロンボエラストグラムのrおよ
びk時間は増加した。その増加したrおよびk値は、実
施例1よりの本発明による剤(10μl)の添加により正
常化した。
3.クエン酸塩加血漿における本発明による剤の安定性 クエン酸塩加ヒト血漿における本発明による剤の安定
性を試験するために、それを1+1または1+7の割合
でクエン酸塩加ヒト血漿とインキユベートした。規定さ
れた時間に、0.2mlのアリクオートを混合物から取り、
0.1mlのPTT試薬とインキユベートし、そして37℃で6分
後に0.1mlの0.025モル/l CaCl2溶液を添加した。規定さ
れたインキユベーシヨン時間後に得られたPTTを次の第
2表に記録する。
性を試験するために、それを1+1または1+7の割合
でクエン酸塩加ヒト血漿とインキユベートした。規定さ
れた時間に、0.2mlのアリクオートを混合物から取り、
0.1mlのPTT試薬とインキユベートし、そして37℃で6分
後に0.1mlの0.025モル/l CaCl2溶液を添加した。規定さ
れたインキユベーシヨン時間後に得られたPTTを次の第
2表に記録する。
これらの結果から、本発明による剤がクエン酸塩加血
漿中で少くとも1時間、そして更に1 1/2時間後でもな
お有効であることが明らかである。緩衝剤を用いた対照
例に比べてPTTが減少していることは、本発明による剤
がクエン酸塩加血漿に対して強力な凝血促進効果を有し
ていることを示している。クエン酸塩加血漿とのインキ
ユベーシヨン中でさえ失効することがないことから、こ
の効果を凝血酵素に連関させることはできない。これ
は、クエン酸塩加血漿はすべての凝血酵素を中和する抗
トロンビンIIIを含んでいるからである。
漿中で少くとも1時間、そして更に1 1/2時間後でもな
お有効であることが明らかである。緩衝剤を用いた対照
例に比べてPTTが減少していることは、本発明による剤
がクエン酸塩加血漿に対して強力な凝血促進効果を有し
ていることを示している。クエン酸塩加血漿とのインキ
ユベーシヨン中でさえ失効することがないことから、こ
の効果を凝血酵素に連関させることはできない。これ
は、クエン酸塩加血漿はすべての凝血酵素を中和する抗
トロンビンIIIを含んでいるからである。
実施例2 本発明による剤を製造するために、80mlのF VIII濃縮
物を920mlの緩衝液bと混合した。これによつて得られ
る4U/mlを含有する1000mlのF VIII溶液に次の物質を混
合した:50U/mlを含有する10.1mlのAT III濃縮物、5mlの
0.5%強度(g/100ml)燐脂質、7.6mlの0.1モル/l CaCl2
溶液および20gのスクロース。
物を920mlの緩衝液bと混合した。これによつて得られ
る4U/mlを含有する1000mlのF VIII溶液に次の物質を混
合した:50U/mlを含有する10.1mlのAT III濃縮物、5mlの
0.5%強度(g/100ml)燐脂質、7.6mlの0.1モル/l CaCl2
溶液および20gのスクロース。
この混合物を37℃で30分間インキユベート後、4.2ml
のF IX濃縮物(120UのF IX/ml)を添加し、そしてその
混合物を20℃で3時間インキユベートした。この時間中
に、それを用いて測定されたインヒビター・プラズマに
おけるPTTは25秒に低下していた。その溶液を過によ
り滅菌し、10mlずつパツクしそして凍結乾燥した。この
凍結乾燥物をもとの容量に溶解し、そして4ml/kg体重に
相当する量をウサギに静注した。それら動物に与えたプ
ラセボは前記溶液と同様に調製されるが塩化カルシウム
は含まない溶液とした。2つの動物群(各3匹のウサギ
より成る)から5、10、15および30分後に採血し、そし
てそれより得られる血漿中のPTTを、血友病A患者から
のインヒビター・プラズマを1回は添加せずに、他方で
は添加して測定した。それらの結果を表にしたが、それ
らの結果から、プラセボを与えたウサギのPTTは5分後
にやつとわずかに減少したにすぎないが、本発明による
剤を注射した動物のPTTは更に一段と減少したことがわ
かる(第3a表)。
のF IX濃縮物(120UのF IX/ml)を添加し、そしてその
混合物を20℃で3時間インキユベートした。この時間中
に、それを用いて測定されたインヒビター・プラズマに
おけるPTTは25秒に低下していた。その溶液を過によ
り滅菌し、10mlずつパツクしそして凍結乾燥した。この
凍結乾燥物をもとの容量に溶解し、そして4ml/kg体重に
相当する量をウサギに静注した。それら動物に与えたプ
ラセボは前記溶液と同様に調製されるが塩化カルシウム
は含まない溶液とした。2つの動物群(各3匹のウサギ
より成る)から5、10、15および30分後に採血し、そし
てそれより得られる血漿中のPTTを、血友病A患者から
のインヒビター・プラズマを1回は添加せずに、他方で
は添加して測定した。それらの結果を表にしたが、それ
らの結果から、プラセボを与えたウサギのPTTは5分後
にやつとわずかに減少したにすぎないが、本発明による
剤を注射した動物のPTTは更に一段と減少したことがわ
かる(第3a表)。
後者の動物群の血漿はまた、インヒビターの添加によ
り人為的に増加させたPTTを減少させた(第3b表)。
り人為的に増加させたPTTを減少させた(第3b表)。
このことは、本発明による剤が動物中で活性な形で循
環することを実証している。
環することを実証している。
本発明による剤がSepharose CL 6Bでの分離に付した
ところすべてのインヒビター中和活性は排除容量(excl
usion volume)中に見出された。燐脂質も同じ画分中に
確認され、同様に、F VIII、F IXおよび抗トロンビンII
Iに対する抗血清を用いた免疫ブロツテイング法を用い
て試料を分析したところ以下の成分が確認された:von W
illebrand因子のほかに、70〜75kDの分子量を有するタ
ブレツトとしてのF VIII:Cの修飾されたL鎖、F IX、抗
トロンビンIII、および100kDの分子量を有する成分。
ところすべてのインヒビター中和活性は排除容量(excl
usion volume)中に見出された。燐脂質も同じ画分中に
確認され、同様に、F VIII、F IXおよび抗トロンビンII
Iに対する抗血清を用いた免疫ブロツテイング法を用い
て試料を分析したところ以下の成分が確認された:von W
illebrand因子のほかに、70〜75kDの分子量を有するタ
ブレツトとしてのF VIII:Cの修飾されたL鎖、F IX、抗
トロンビンIII、および100kDの分子量を有する成分。
図は、本発明による剤の効果を示す試験例の結果を示す
ものである。
ものである。
Claims (6)
- 【請求項1】第VIII因子、抗トロンビンIII、燐脂質お
よびカルシウムイオンの混合物を水性溶液として1〜45
℃の温度に少くとも1分間保ち、第IX因子を添加し、そ
してその溶液を、この溶液の試料のインヒビター・プラ
ズマへの添加が15〜30秒の部分的トロンボプラスチン時
間(PTT)を与えるまで1〜45℃の温度に保ち、適切な
場合にはポリオールを添加し、そして適切な場合にはア
ミノ酸を添加し、そして適切な場合にはその溶液を乾燥
することにより得られる、第VIII因子による治療に抵抗
性の血友病Aの治療剤。 - 【請求項2】混合物が4Uの第VIII因子あたり0.5〜2Uの
第IX因子、0.5〜1Uの抗トロンビンIII、少くとも25μg
の燐脂質および0.6〜0.9ミリモル/lのカルシウムイオン
を含む特許請求の範囲第1項記載の剤。 - 【請求項3】ポリオールを含有する特許請求の範囲第1
項記載の剤。 - 【請求項4】アミノ酸を含有する特許請求の範囲第1項
記載の剤。 - 【請求項5】乾燥形態にある特許請求の範囲第1項記載
の剤。 - 【請求項6】次の諸特徴、すなわち 強力な凝血促進作用を有するが活性化凝血酵素は含まな
い(FIIaおよびXaに対するクロモゲン性基質を用いた試
験により示される); クエン酸塩加ヒト血漿中で安定である; 正常クエン酸塩加ヒト血漿のPTTおよびF VIII:Cのイン
ヒビターを含有する血漿のPTTを減少させる; F IXに対する抗体によって効果が損われない; Sepharose CL 6Bでのゲル濾過において活性は排除容量
に移行し、そして阻止活性を有する画分は燐脂質、von
Willebrand抗原、F VIII:Cの修飾されたL鎖(分子量75
〜75,000kD)、F IX、100kDの分子量を有する成分およ
び抗トロンビンIIIを含有する; という特徴を有する特許請求の範囲第1項記載の治療
剤。
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CA2090738C (en) * | 1993-02-24 | 1996-05-21 | Hema-Quebec | Use of paf |
US7582712B1 (en) | 2008-05-09 | 2009-09-01 | Formosa Plastics Corporation, U.S.A. | Alpha-olefins polymerization catalyst |
CN108226540B (zh) * | 2018-02-08 | 2020-07-03 | 武汉市长立生物技术有限责任公司 | 一种鞣花酸试剂及其配制方法与活化部分凝血活酶时间测定试剂、aptt试剂盒 |
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AT350726B (de) * | 1976-08-30 | 1979-06-11 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung einer blut- gerinnungsfoerdernden praeperation aus menschlichem blutplasma |
JPS597693B2 (ja) * | 1978-01-07 | 1984-02-20 | 株式会社ミドリ十字 | 抗トロンビン製剤及びその製法 |
DE2916711A1 (de) * | 1979-04-25 | 1980-11-06 | Behringwerke Ag | Blutgerinnungsfaktoren und verfahren zu ihrer herstellung |
FR2472390A1 (fr) * | 1979-05-04 | 1981-07-03 | Merieux Inst | Procede de preparation de concentres de complexe prothrombinique hautement purifies, et concentres obtenus |
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US4404132A (en) * | 1980-05-27 | 1983-09-13 | Cutter Laboratories, Inc. | Blood coagulation promoting product |
JPS5770814A (en) * | 1980-10-17 | 1982-05-01 | Isamu Horikoshi | Oral preparation of blood clotting eighth factor |
JPS5874617A (ja) * | 1981-10-28 | 1983-05-06 | Green Cross Corp:The | 人由来血液凝固第7因子含有水溶液の加熱処理方法 |
DE3237512A1 (de) * | 1982-10-09 | 1984-04-12 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur pasteurisierung von antihaemophilem kryopraezipitat (ahk) und danach hergestelltes antihaemophiles kryopraezipitat |
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AT379510B (de) * | 1983-05-20 | 1986-01-27 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung einer faktor viii (ahf) -haeltigen praeparation |
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US4536392A (en) * | 1983-06-27 | 1985-08-20 | Queen's University At Kingston | Method for controlling hemophilia in mammals |
US4710381A (en) * | 1984-05-22 | 1987-12-01 | The Blood Center Of Southeastern Wisconsin | Method for maintaining intact, non-degraded factor VIII/von-Willebrand factor during blood processing |
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-
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- 1987-07-21 EP EP87110539A patent/EP0255651B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-21 AT AT87110539T patent/ATE73673T1/de not_active IP Right Cessation
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- 1987-07-22 FI FI873222A patent/FI87044C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-07-23 PT PT85386A patent/PT85386B/pt not_active IP Right Cessation
- 1987-07-23 CA CA000542881A patent/CA1321139C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-07-23 JP JP62182442A patent/JP2535547B2/ja not_active Expired - Fee Related
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1988
- 1988-08-10 US US07/230,717 patent/US5091363A/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-06-11 GR GR920401114T patent/GR3004868T3/el unknown
Also Published As
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PT85386A (pt) | 1988-07-29 |
FI87044B (fi) | 1992-08-14 |
DK166652B1 (da) | 1993-06-28 |
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