DE2550011C2

DE2550011C2 - Verfahren zur Herstellung eines antihämophilen Mittels

Info

Publication number: DE2550011C2
Application number: DE2550011A
Authority: DE
Inventors: Norbert Dr. 3550 Marburg Heimburger; Horst Dipl.-Chem. Dr. Schwinn
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1975-11-07
Filing date: 1975-11-07
Publication date: 1982-11-25
Also published as: IL50847A; NO763776L; DE2550011A1; ZA766647B; LU76145A1; AT358737B; US4067964A; ES452923A1; BE848111A; IL50847A0; DK502176A; NL7612139A; JPS5257310A; ATA819476A; IT1063617B; FI763165A; CH630805A5; SE7612396L; AU1934176A; CA1077393A

Description

2. Verfahren zum Herstellen eines antihämophilen Produktes mit Faktor VIII-Aktivität dadurch gekennzeichnet, daß das nach Anspruch I erhaltene Flotat zur weiteren Reinigung nach Dispergieren in einer wäßrigen Salzlösung und Versetzen mit gerinnungsinerten Proteinen einer weiteren Rotation unterworfen wird.

3. Verfahren zum Herstellen eines antihämophilen Produktes mit Faktor VIII-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß das nach Anspruch 1 erhaltene Flotat zur weiteren Reinigung nach Dispergieren in einer wäßrigen Salzlösung und Versetzen mit gerinnungsinerten Proteinen und einer Polysaccharid-PoIyschwefelsäure-Verbindung mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel für Lipide mit einem Siedepunkt von 40 bis 80°C extrahiert wird.

4. Zur intravenösen Substitutionstherapie der Hämophilie A geeignetes Arzneimittel, enthaltend ein antihämophiles Mittel, erhältlich nach einem der Ansprüche I bis 3 und gegebenenfalls pharmazeutisch übliche Trägerstoffe.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines antihämophilen Mittels, das insbesondere eine Aktivuät des Gerinnungsfaktors VIII aufweist sowie Zubereitungen, insbesondere Hämostyptika und gerinnungsaktive Diagnostika, welche das antihämophile Mittel als eine wesentliche Wirksubstanz enthalten.

Die Blutgerinnung ist ein komplexer, ir Phasen ablaufender Vorgang, der durch verschiedene physiologische sowie pathologische Ursachen ausgelöst wird und dessen Ablauf von etwa 30 fördernden und hemmenden Faktoren abhängt. Durch Verminderung oder Vermehrung einzelner dieser Blutgerinnungsfaktoren können Störungen der Blutgerinnung auftreten, die sich teilweise als Krankheiten manifestieren. Die Hämophilie A wird durch die Verminderung des Faktors VIII der Blutgerinnung bedingt und ist durch Blutungen besonders in Gelenken und der Muskulatur charakterisiert. Es hat sich in den letzten Jahren gezeig'..

daß die Prognose der an dieser Hämophilie Erkrankten durch substituierende Therapie mit den Faktor VIII enthaltenden Präparaten wesentlich gebessert werden kann.

Als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Faktor Vlll-substituierenden Arzneimitteln waren bislang nur Blutplasma oder Blutplasmafraktionen bekannt. Es war jedoch zurh schon längere Zeit bekannt, daß der wäßrige Extrakt von nacemen ein stark gerinnungsak tives Material darstellt, dessen Aktivität als ihrombopla- s'isches Material zu kennzeichnen ist

Auch die Extraktion von Placemen mit Lipidlösungsmethoden führt zu gerinnungsaktivem Thromboplastin. Das auf diese Weise gewonnene geri.inungsaktive Material hat jedoch nicht die für die Antihämophilie-Substitutionstherapie geforderten Eigenschaften des Faktors VIII der Blutgerinnung.

Es wurde nun überraschend gefunden, dall ein durch wäßrige Extraktionen aus Placenten gewonnenes thromboplastisches Material sich in eine Faktor-Villspezifische Komponente und eine thronibcplastische Restaktivität trennen läßt Die so erhaltene antihämophile Komponente kann isoliert und gegebenenfalls weiter gereinigt werden.

Gegenstand der Erfindung ist durch den Anspruch 1 gekennzeichnet Die Ansprüche 2 und 3 beziehen sich auf die weitere Reinigung des nach Anspruch 1 erhaltenen Produktes und der Anspruch 4 hat schließlich die Konfektionierung des nach den Ansprüchen

jo 1 —3 erhaltenen Produktes zu einem Arzneimittel zum Gegenstand.

Als inerte wasserlösliche Verbindungen im Sinne der Erfindung kommen alle physiologisch unbedenklichen, mit den Bestandteilen der Extrakte keine chemische Bindung eingehenden Stoffe in Frage. Besonders geeignet sind physiologisch verträgliche Salze oder wasserlösliche Kohlenhydrate.

Die Weiterreinigung kann auch durch Extraktion des mit einem wäßrigen Medium verdünnten Flotats bei niedriger Leitfähigkeit und schwach saurem pH-Wert mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel für Lipide, zweckmäßig einem Kohlenwasserstoff oder Alkyläther mit einem Siedepunkt zwischen 40° und 80°, in Gegenwart eines gerinnungsinerten Schutzkolloids und einer zur Komplexbildung mit Polypeptiden bzw. Proteinen befähigten polaren polyionischen Verbindung, zweckmäßig eines Polyanions wie einer Polysaccharid-Polyschwefelsäure-Verbindung, z. B. Heparin oder eines Polykations, z. B. Protanrr., vorgenommen werden. Dabei reichert sich das antihämophile Mittel mit Faktor-Vl11-Aktivität in der wäßrigen Phase an und kann aus diese' gewonnen werden. Sie kann ferner durch Uitrazentrifugation des wieder aufgelösten Flotats in Gegenwart eines gerinnungsinerten Proteins vorgenommen werden.

Sie kann auch durch Behandlung des Flotats mit wäßriger Alkalilauge und Abtrennung der dialysablen Stoffe vorgenommen werden. Schließlich kann die Weiterreinigung durch Auflö sung des Flotats in einer wäßrigen Salzlösung wie we;ler unten beschrieben und Chromatografieren dieser Faktor-Vlll enthaltenden Salzlösung in Gegenwart eines gerinnungsinerten lipophilen Proteins durch ein Molekularsieb durchgeführt werden, wonach die Fak tor-VIII enthaltenden Fraktionen des Eluats gewonnen werden.

Die Reinigung der Faktor-VIll-aktiven placentären Substanz kann zudem auch durch Maßnahmen erfolgen,

wie sie zur Entfernung bekannter, die Gerinnung beeinflussender Faktoren bereits beschrieben wurden. So läßt sich eventuell noch vorhandenes Prothrombin, das die Faktor-VIII-Aktivität des erfindungsgemäßen Produkts herabzusetzen vermag, durch Absorption an Aluminiumhydroxid oder Bariumsulfat, durch Fällung mit Acridinbasen oder Chromatographie an Ionenaustauscherharzen entfernen.

Das nach diesen Verfahren erhaltene Phospholipid ist z. B. als Diagnostikum in all den Gerinnungstesten ei-jrjceizc;:, bei denen eine Faktor-VIII-Aktivität vorhanden sein soll.

Das vorliegende Verfahren geht von zerkleinerten, blutfrei gewaschenen Placemen aus. Menschliche Placemen werden bevorzugt Es können sowohl frisch gewonnene als auch bereits zur Lagerung eingefrorene Placemen zerkleinert und zur Entfernung von Blut- und Plasmabestandteilen mit einer isotonischen Salzlösung mehrfach gewaschen werden. Das gewaschene Placentenhomogenat wird durch Hitration oder Zentrifugation gewonnen und anschließend gegebenenfalls getrocknet Als besonöeis schonende Trocknung wird die Lypophilisation bevorzugt Das blutfrei gewaschene und getrocknete Placentengewebe wird zweckmäßig in einer 4-10%igen, insbesondere 5—7%igen Suspension, mit einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert zwischen 4,5 und 14 extrahiert, wobei das wäßrige Medium hypoton sein soll. Vorteilhaft werden hierfür Wasser oder hypotone Salz- oder Pufferlösungen verwendet, deren Konzentration und Elektrolytzusammensetzung zu einer osmotischen Konzentration von <330mM/l führen. Geeignet sind Neutralsalz-Lösungen, deren pH-We<.» nach der Suspension des Placentengewebes in der Lesung "it Basen wie Natronlauge oder Kalilauge ai-i den gewünschten pH-Wert eingestellt wird. Es ist nicht en?· leidend, bei welchem pH-Wert zwischen 4,5 und 14 die Extraktionen des Placentengewebes mit der hypotonen Lösung vorgenommen wird.

In einer Ausführungsform werden zerkleinerte, blutfrei gewaschene Placemen bei einem pH-Wert >4,5 mit einem wäßrigen Medium einer Osmolarität ύ 330 mM/1 extrahiert, der Extrakt vom Geweberückstand abgetrennt und einer Flotation unterworfen. Dazu wird der wäßrige Extrakt zur Erhöhung der Dichte der Lösung mit einer inerten wasserlöslichen Verbindung, z. B. einem Neutralsalz oder einem Kohlenhydrat, zweckmäßig einem Alkali- oder Erdalkali-Halogenid wie KBr, NaCI, NaBr, CsCIz oder Saccharose versetzt, wobei mit der zugesetzten Menge der geeigneten Stoffe eine Dichte der Lösung von mindestens 1, nach oben begrenzt durch die Löslichkeit der Salze, zweckmäßig eine Dichte von 1,06 bis 1,20 g/cm³ eingestellt wird. Die Lösung wird danach bei einer Beschleunigung von > 25 000 · g, zweckmäßig 50 000 · g, mindestens 60 Minuten, günstig 120 Minuten, zentrifugiert Nach der Zentrifugalion wird die auf der klaren darunter stehenden Salzlösung notierte etwas trübe Schicht gewonnen. Die Flotation der trüben Schicht in der Zentrifuge wird zweckmäßig unter den gleichen oder unter vergleichbaren Bedingungen z. B. bei 50 000— 150 000-g wiederholt und das Oberstehende Flotat schließlich gewonnen.

* Geeignete Flotationssysteme sind im übrigen dem Fachmann für die Abtrennung von Lipoproteinen aus Blutplasma geläufig. Bei der Anwendung von 20%iger j? wäßriger Kaliumbromidlösung und einer Umdrehungs-S geschwindigkeit der Ultrazentrifuge entsprechend 50 000 · g flotiert die antihämophil aktive Fraktion nach etwa 2 Stunden an der Oberfläche der Lösung weitgehend frei von restlichen Proteinbestandteilen, welche sedimentiert werden bzw. gelöst bleiben. Das in der beschriebenen Weise erhaltene Flotat wird in Wasser oder verdünnter Salzlösung, beispielsweise 03 bis l,2%iger Kochsalzlösung, zweckmäßig 03%iger Kochsalzlösung, dispergiert und in einer darauf zu entnehmenden Probe die Aktivität an Faktor VIII

ίο bestimmt Danach wird die Verdünnung in der Webe vorgenommen, daß die verdünnte Lösung des Flotats 10—200, vorzugsweise 20 Einheiten an Faktor VIII enthält

Die durch Flotation gewonnene rohe Faktor-VIII-

enthaltende Präparation kann gewünschtenfalls einer oder mehreren der folgenden Reinigungsoperationen unterworfen werden. Sofern das Produkt zur intravenösen Therapie angewandt werden soll, ist zumindest eine dieser Reinigungsoperationen erforderlich.

1. Reinigungsverfahren durch Extraktion

Das durch Flotation über einer konzentrierten Salzlösung erhaltene Produkt, dessen Aktivität an Faktor VIII 10—200, vorzugsweise 20 Einheiten beträgt, wird mit einem gerinnungsinerten Protein, beispielsweise Albumin, zweckmäßig Humanalbumin, in einer Konzentration von 1 — 10%, zweckmäßig 5% versetzt danach mit einem zur Komplexbildung mit basischen Polypeptiden bzw. Proteinen befähigten Polyanion,

ίο günstig eine Polysaccharid-Polyschwefelsäure-Verbindung wie Heparin, zweckmäßig dessen Natriumsalz, in einer Menge von 0,095—0,5 mg/ml, bei Heparin entsprechend 1 —50 Einheiten pro ml der vorhandenen Lösung, versetzt Danach wird durch Verdünnung oder Salzzusatz — in der Regel ist letzteres erforderlich — auf eine Leitfähigkeit von < 14 mS/cm eingestellt und mit Säure, zweckmäßig einer Mineralsäure wie Salzsäure, auf einen pH-Wert von 33—6 einreguliert Ein Volumenteil der erhaltenen Suspension wird mit mindestens 1 Teil eines mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels für Lipide mit einem Siedepunkt von 40° bis 80⁰C, zweckmäßig mit einem aliphatischen Äther oder einem Kohlenwasserstoff, dessen Siedepunkt in dem vorgegebenen Siedebereich liegt oder einer Mischung derselben, wobei das Mischungsverhältnis beliebig sein kann, zweckmäßig jedoch mit einer Mischung von 8 Volumenteilen Petroläther und 2 Volumenteilen Diäthyläther, 2-8 Stunden bei 10-40⁰C, zweckmäßig bei Raumtemperatur, mindestens einmal geschüttelt oder gemischt, wozu mit Vorteil ein mechanisches Schüttel- oder Mischgerät verwendet .vird. Nach kurzzeitigem Stehenlassen kann die organische Phase abgetrennt und verworfen werden. Die wäßrige Phase wird, vorteilhaft im Vakuum, von restlichen Lösungsmitteln befreit Danach erfolgt die

Bestimmung der Faktor-VIII-Aktivität in der bekannten Weise. Das Produkt kann parenteral angewandt

werden.

Statt einer Polysaccharid-Polyschwefelsäure-Verbin-

dung kann im vorliegenden Verfahren auch eine polykationische Verbindung wie Protamin, zweckmäßig als dessen Chlorid oder Sulfat, in einer Konzentration von 1 — 10 mg/ml eingesetzt werden, um zu einem Produkt mit vergleichbarer Faktor-VIII-Aktivität zu kommen.

Für die parenterale Applikationsform werden 10—500 Einheiten Faktor VIII, zweckmäßig 20 Einheiten Faktor VIII, in der Verbrauchslösung als Einzeldosis

angestrebc. Vorh-. Ht eine Sterilfiliration zur Entfernung von kontaminierenden Mikroorganismen erforderlich. Die Präparation kann danach in die für die parenteral Applikation geeignete Zubereitungsforrr. gebracht werden, mit stabilisierenden Schutzkolloiden, z. B. Protein, versetzt und gegebenenfalls anschließend lyophil getrocknet werden. Das in einer physio-'n^isc!: verträglichen Lösung vorliegende Verfahrensprodukt oder das wieder aufgelöste Trockenpräparat kann für die Substitutionstherapie der Hämophilie A verwendet werden.

Oewigfiote Lösungsmittel sind beispielsweise: Destilliertes Wasser, physiologische NaCI-Lösung, gewünschtenfalls mit Zusatz einer Puffersubstanz, wie 0,02 molares Na-Citrat mit einem pH-Wert von 7,0.

Der Präparation können vor der Gefriertrocknung zur Stabilisierung Schuizkolloide wie Albumin und/oder Kohlenhydrate wie Fruktose zugesetzt werden. Im Hinblick auf eine therapeutische Verwendung des Endproduktes beim Menschen wird zweckmäßig Humanalbumin verwendet.

Weitere Möglichkeiten für eine Weiterreinigung sind beispielsweise die folgenden, wenn auch anzumerken ist, daß das nachstehend unter 2 beschriebene Verfahren für die Herstellung einer pharmazeutisch applizierbaren Präparation weniger gut geeignet ist

2. Reinigungsverfahren durch Alkalibehandlung

Die auf 10—200 Faktor-VHI-Einheiten eingestellte Lösung wird mit Alkalilauge auf einen pH-Wert zwischen 10 und 14, zweckmäßig 12 eingestellt. Hierzu dient beispielsweise 2—7 n, zweckmäßig 5 n, NaOH. Der Ansatz wird danach 15 Minuten bis 48 Stunden bsi diesem pH-Wert stehengelassen. Anschließend wird neutralisiert, d. h. auf einen pH-Wert in der Nähe des Neutralpunktes, zweckmäßig zwischen pH 6 und pH 8, eingestellt. Hierfür können anorganische Säuren beispielsweise 2—IOn, zweckmäßig 5 η HCI, verwendet werden. Zur Abtrennung niedrigmolekularer Bestandteile wird die neutralisierte Lösung einer Dialyse gegen eine physiologisch verträgliche Salzlösung, z. B. isotonische Kochsalzlösung, unterworfen. Vor, während oder nach die Dialyse können gegebenenfalls gerinnungsinerte Zusätze zur Stabilisierung der Aktivität des antihämophilen Mittels zugefügt werden. Besonders vorteilhaft erweist sich hierfür inertes Proteinmatcrial wie beispielsweise Albumin.

3. Reinigungsverfahren durch Chromatographie

Eine Reinigung der auf 10-200 Faktor-VIII-Einheiten eingestellten wäßi^en Lösung läßt sich ferner mit einer Fraktionierung auf einem Molekularsieb vornehmen, beispielsweise durch Gelfiltration in einer Säule. Als Molekularsieb in diesem Sinne wird vorteilhaft eine besonders aufgearbeitete Agarose verwendet, beispielsweise die unter dem geschützten Warenzeichen Sepharose® von der Firma Pharmacia, Uppsala, Schweden oder als Biogel A® von der Firma Biorad Laboratories, Richmond/Calif erhältliche. Der Fraktionierungsbereich dieses Materials soil für globuläre Moleküle bei Molekulargewichten zwischen IO⁴ und 10⁶ liegen. Vor der Durchführung der Molekularsieb-Chromatographie wird das antihämophile Mittel vorteilhaft einer Dialyse gegen eine verdünnte, zweckmäßig weitgehend isotonische Salzlösung unterworfen und danach zweckmäßig sowohl qualitativ als auch quantitativ hinsichtlich weiterer Zusätze zur Lösung möglichst weitgehend der Elutio?jlösung angeglichen, die für die des gewOriüchten Produktes bei der Molekuiarsieb-Chromatographie Verwendung findet. Die EIktionslöEung enthält rScufriiisahf: -*>i beispielsweise Natriumchlorid in einer Konzentration von 0,7% bis :■ υ.?"/·!, zweckmäßig 4,5 bis 5%, und einen stabilisierenden Zusatz eines inerten Proteins, beispielsweise Albumin, in einer Konzentration von 1 —10%, zweckmäßig ΖΎα. Die Chromatographie wird in bekannter Weise vorgenommen. Danach erfolgt die Testung der einzelnen dabei

in erhaltenen Fraktionen hinsichtlich der Faktor-VII!-Aktivität und ihrer thromboplastischen Aktivität, wobei diejenigen Fraktionen ausgewählt werde«, deren Faktor-VIII-Aktivität zur Restaktivität Thromboplastin > 5 :1 ist. Danach werden die entsprechenden Fraktionen gesammelt ur.d vereint und gegebenenfalls mit einer physiologisch verträglichen Salzlösung auf die gewünschten Einheiten an Faktor VIII eingestellt, oder falls dies erforderlich ist, mit einem Ultrafilter auf die gewünschte Anzahl von Einheiten an Faktor VIII konzentriert

Das vorbeschriebene Reinigungsverfahren ist zudem geeignet als eine zusätzliche Weiürreinigung der nach den aufgezeigten Schritten erhaltenen Produkte und insbesondere statt der Dialyse im Verfahren zur Alkalibehandlung angewendet zu werden.

4. Reinigungsverfahren durch Zentrifugation

Das durch Flotation über konzentrierten Salzlösungen erhaltene Rohprodukt wird mit destilliertem

jo Wasser auf 10—200 Einheiten, zweckmäßig 100 Einheiten, verdünnt und mit Kochsalz bis zu einer Konzentration von 0,0075—l,0M, zweckmäßig 0,15 M, versetzt. Danach wird der Lösung ein gerinnungsinertes, lipophiles Protein, z. B. Albumin, zweckmäßig Humanalbumin, bis zu einer Konzentration von 1 — 10%, zweckmäßig 2,5—5%, zugesetzt. Die Mischung wird für 1-10 Stunden, zweckmäßig 5 Stunden, bei 37°C inkubiert. Anschließend wird die Mischung bei 50 000 · g für 30—120 Minuten, vorzugsweise etwa 60 Minuten, zentrifugiert und die überstehende Lösung mit der Faktor-VIII-Aktivität gewonnen. Nach Zusatz von üblichen Schutzkolloiden und entsprechenden Stabilisatoren kann das annähernd klare Zentrifugal steril filtriert werden.

Die Ausbeute an Faktor-VIII-Aktivität wird zweckmäßig während des jeweiligen Aufarb".itungsverfahrens und/oder im Anschluß daran überprüft. Seine Bestimmung erfolgt beispielsweise nach folgender Methode:
1 Teil, z. B. 0,1 ml, partielies Thromboplastin (z. B.

,ο hergestellt nach der Patentanmeldung P 23 16 430.9-52 (= Ma 160)), wird mit einem Teil Faktor-VIll-Mangel-Plasma und einem Teil verdünntem Normalplasma vermischt. Diese Mischung wird 6 Minuten bei 37°C gehalten. Nach Zusatz von einem Teil einer auf 37° C vorgewärmten 0,025 molaren Calciumchiorid-Lösung wird die Zeit bestimmt, die vom Zusatz der Calciurnchlorid-Lösung bis zum Auftreten eines festen Gerinnsels verstreicht. Zur quantitativen Aussage wird die aus der Faktor-VllI-enthaltenden Lösung sich ergebende G^-

M) rinriiiiigszeif ufer Bezugnahme auf eine mit einer Normalplasma-Verdünnungsreihe erzielten Eichkurve abgelesen. 1 Einheit Faktor VIII entspricht der Faktor-VIII-Aklivität von 1 mi Normalplasma.
Der Bestimmung der thromboplastischen Restaktivi-

h-> tat wird die L'b^e^ung zugrundegelegt, daß Thromboplastin υ. 3 Fakt :«■· !X-Aktivität zeigt. Soir.l^ ist Hie Bestimmung des Faktors IX ein Maß für die thrombopidstische Restaktivität der Präparaten. Die

Bestimmung der Faktor-IX-Aktivität kann nach der vorangehend beschriebenen Methode /ur Faktor-VIII-Bestimmimg erfolgen, indem anstelle des Faktor-Vlll-Mangelplasma ein Faktor-L\-Mangelplasma eingesetzt wird.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein antihämophiles Mittel mit Faktor-Vlll-Aktivität erhältlich nach einem der vorbeschriebenen Verfahren.

Schließlich ist Gegenstand der Erfindung ein zu intravenösen Substitutionstherapie der Hämophilie A geeignetes Arzneimittel bestehend aus oder enthaltend ein antihämophiles Mittel erhältlich, gemäß einem der vorbeschriebenen Verfahren und das gegebenenfalls pharmazeutisch üblichen Trägerstoffe als Zusätze enthält. Das Präparat wird aus Gründen der Haltbarkeit zweckmäßig in trockener lyophiler Form gelagert. Vor der intravenösen Applikation ist das Trockenprodukt in für derartige Präparate bekannter Weise zu rekonstilnieren.

Die Erfindung soll an den) nachstehenden Beispiel näher erläutert werden.

Beispiel

Blutfrei gewaschenes lypophilisiertes Placentengewcbe wird in einer 5%igen Suspension in 0,05 M Na-Citratlösung 20 Minuten bei Zimmertemperatur kräftig durchmischt. Das Homogenat wird in einer Zentrifuge 30 Minuten bei 30 000 · g geschleudert, das Sediment verworfen und der sich bildende Überschub mit festem Kaliumbromid auf eine 2O°/oige Sättigung gebracht. In einer Ultrazentrifuge wird der Extrakt bei 50 000 ■ g 2 Stunden lang geschleudert, wobei ein gut abtrennbares Flotat entsteht. Diese überstehende Zone wird abgeschöpft. Da hierfür eine physiologische Verträglichkeit der Präparation die Voraussetzung ist, werden zur intravenösen Substitutionstherapie zweckmüßig nur Präparationen verwendet, welche einem der vorbeschriebenen Reinigungsverfahren unterzogen wurden. Nach einer erneuten Flotation bei 150 000 ■ g ist das Präparat als Faktor-VIII-Präparation gebrauchs-

fertig. Es wird die Aktivität an Faktor VIII getestet. Die Aktivität beträgt 200 E/ml.

Weiterreinigung

a) Das bei 150 000 ■ g flotiertc Präparat wird mit einer wäßrigen IO%igen Humanalbumin-Lösung, welche 10 E/ml an Herarin-Natrium enthält, zu gleichen Teilen verdünnt. Dabei muß beachtet werden, daß der Gesamt-Salzgehalt der Mischung einer elektrischen Leitfähigkeit von etwa 8 mS/cin entspricht. Der pH-Wert wird mit I N HCI auf 4.5 eingestellt. Die Mischung wird in eine Extraktionsapparatur nach Kutscher und Steudel gegeben und über 2 Stunden kontinuierlich mit 2Toi!en eines Petroläther (Fr. 60-80° )/Diäthyläthcr-Gemisches = 80/20 (Vol/Vol) extrahiert.
Nach der Operation wird der organische Lösungsmittelanteil unter schonenden Bedingungen im

it einfim DnlilinnE

²" beseitigt und die verbleibende wäßrige Phase mit

1 N NaOH auf pH 7,5-8,U eingestellt. Nach

2 Stunden Rühren bei Zimmertemperatur und Sterilfiltration ist das Präparat zur Substitutionstherapie von Faktor-Vlll-Mängeln gebrauchsfer-

-'' tig. Die Faktor-Vlll-Aktivität einer Probe wird auf

etwa 30 E/ml eingestellt.

Statt mit Heparin-Natrium kann die Faktor-VIII-Präparatitr,. im ersten Verfahrensschritt auch mit

·" Protaminsulfat f5 mg/ml) versetzt werden.

b) Dis bei 150 000-g floticrte Präpirat wird mit einer 0,15 M NaCI-Lösung, welche 5%ig an Humanalbumin ist, au^f eine Aktivität von etwa 100 Einheiten Faktor VIII verdünnt. Nach, inkuba-

>■> tion von 5 Stunden bei 37°C wird diev.;r An«»;:

¹Z₂ Stunde Hpi 50 000 · g zemiMugiert und nach einem Zusatz von 1% Fructose das nahezu klare Zentrifugal steril filtriert.
Diese Präparation zeigt sich in Tierversuchen, z. B.

⁴ⁿ in Kaninchen toxikologisch verträglich. Sie hat bei

gesunden Tieren eine dem antihämophilen Globulin-Konzentrat aus Plasma vergleichbare Wirkung.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines antihämophilen Produktes mit Faktor VW-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß

a) zerkleinerte, bluifrei gewaschene P^-jenii. mit Neutralsalzlösungen, deren pH-Wert auf 4,5 bis 14 eingestellt worden sind und die eine osmotische Konzentration von i330mM/l aufweisen, extrahiert werden,

b) der Extrakt vom Geweberückstand abgetrennt,

c) einer Flotation unterworfen wird, wozu die Dichte der Lösung mit physiologisch unbedenklichen wasserlöslichen Neutralsalzen oder wasserlöslichen Kohlenhydraten auf mindestens 1, und nach oben begrenzt durch die Löslichkeit der Salze oder Kohlenhydrate eingestellt, und bei einer Beschleunigung von > 25 000 · g bis zur Ausbildung eines Flotats zentrifugiert wird und

d) das Flotat gewonnen, gereinigt und in bekannter Weise konfektioniert wird.