NO763776L - - Google Patents

Description

Antihemofilt middel og fremgangsmåte

til dets fremstilling.

Oppfinnelsen vedrører et bredt virksomt antihemofilt middel som overveiende har faktor VIII-, men også faktor IX-, faktor VII- og faktor X-aktivitet,

en fremgangsmåte til dets fremstilling samt tilberedninger, spesielt Håmostyptika og koaguleringsaktive diagnostika, som inneholder det antihemofile middel som et vesentlig virksomt ) stoff.

Blodkoagulering er en kompleks, i faser forløpende prosess, som utløses ved forskjellige fysiologiske samt patolo-giske årsaker og hvis forløp avhenger av ca. 30 befordrende og hemmende faktorer. Ved nedsettelse eller formering av noen av disse blodkoaguleringsfaktorer kan det opptre forstyrrelser i blodkoaguleringen som delvis manifesterer seg som sykdommer. Således ville f.eks. hemofilene A og B ved nedsettelse av faktorene VIII resp. IX betinge blodkoagulering og erkarakterisert vedblødninger, spesielt i ledd og muskulatur.

Det har i de siste år vist seg at prognosen av de av hemofili syke vesentlig kan forbedres ved substituerende terapi med preparater inneholdende faktor VIII resp. IX.

Som utgangsmaterial for fremstilling av faktor VIII- og faktor IX-substituerende legemidler var det hittil

bare kjent blodplasma eller blodplasmafraksjoner. Det var også allerede i lengere tid kjent at det vandige ekstrakt av placenter er et sterkt koaguleringsaktivt material, hvis aktivitet er å' karakterisere som tromboplastisk material. Slike preparater er fysiologisk forenlige. De kan ikke anvendes terapeutisk.

Også ekstrahering av placenter med lipidoppløs-ningsmetdder fører til koaguleringsaktivt tromboplastin. Det på denne måte fremstilte koaguleringsaktive material har imidlertid ikke de for antihemofili A og B-substitusjonsterapi krevede egenskaper.

Det er nå overraskende funnet at ved vandig ekstrahering av placenter utvunnet tromboplastisk material lar seg bringe i'en for substitusjonsterape egnet form. Det således dannede antihemofile middel kan isoleres og eventuelt videre-renses.

Oppfinnelsens gjenstand er følgelig et antihemofilt middel,karakterisert veddets egenskap i mangelplasmer å substituere koaguleringsfaktorene VIII, IX, VII og X. Den er blant annet karakteriserbar ved aktivitetsforholdet av faktorene VIII, -IX, -VII, -X.

Det er oppnåelig etter en fremgangsmåte som erkarakterisert vedat knuste, blodfrie vaskede placenter ekstraheres med et vandig hypotont medium ved en pH-verdi i svakt surt, nøytralt eller alkalisk område, ekstraktet adskilles fra vevresiduer, ekstraktets spesifikke tetthet økes ved tilsetning av en inert vannoppløselig forbindelse til opp-tak av koaguleringsaktive komponenter med overnevnte koaguler-ingsaktiviteter, det derved dannede flotat utvinnes og videre-renses hvis ønsket.

Por vidererensning kan det gjentas fIotasjon.

Som inerte vannoppløselige forbnmdelser innen oppfinnelsens ramme kommer det på tale alle fysiologisk tålbare stoffer som ikke inngår noen kjemisk binding med ekstraktets bestanddeler. Spesielt egnet er fysiologisk tålbare salter eller vannoppløselige kullhydrater.

Vidererensningen kan også foretas ved ekstrahering av et med et vandig medium fortynnet flotat ved lav ledningsevne og svak sur pH-verdi med et med vann ikke blandbart oppløsnings-middel for lipider, fortrinnsvis hydrokarbon eller alkyleter med et kokepunkt mellom 40 og 8o°C i nærvær av et koaguleringsinert beskyttelseskolloid og en til kompleksdanning med polypeptider resp. proteiner egnet polar polyionisk forbindelse, fortrinnsvis et polyanion som en polysakkarid-polysvovelsyre-forbindelse, f.eks. heparin eller et polykation, f.eks. protamin. Derved anriker det antihemofile middel seg i en vandig fase og kan utvinnes av denne. Det kan videre foretas ved ultrasentri-fugering av det igjen oppløste flotat i nærvær av et koaguleringsinert protein.

Det kan også foretas ved behandling av flotatet med vandig alkalilut og adskillelse av de dialysable stoffer.

Endelig kan vidererensningen gjennomføres ved oppløsning av flotatet i en vandig saitbppløsning som nærmere omtalt nedenfor og kromatografering av denne koaguleringsaktive saltoppløsning i nærvær av et koaguleringsinert lipofilt protein gjennom en molekylarsikt, hvoretter de faktor-VIII, -IXj-VII og -X-holdige fraksjoner av eluatet utvinnes.

Rensningen av det antihemofile placentære stoff

kan dessuten også foregå ved forholdsregler, slik de allerede er omtalt til fjerning av kjente, koaguleringspåvirkende faktorer. Således lar det seg eventuelt dessuten fjerne tilstedeværende protrombin, som formår å nedsetfee faktor-VIII-aktiviteten av produktet ifølge oppfinnelsen, ved absorpsjon på aluminiumhydroksyd eller bariumsulfat, ved utfelling med akri-dinbaser eller kromatografi på ioneutvekslerharpikser.

Det ifølge fremgangsmåten oppnådde antihemofile middel er f.eks. å anvende som diagnostikum i alle de koagu-leringsprøver, hvor det skal være tilstede en faktor-VIII,

-IX, -VII og -X-aktivitet.

Foreliggende fremgangsmåte går ut fra knuste, blod-fri vaskede placenter. Menneskeplacenter foretrekkes. Det kan såvel knuses friske utvundne som også allerede til lagring innfrosne placenter og for fjerning av blod- og plasmabestand-deler vaskes flere ganger med en isotonisk saltoppløsning.

Det vaskede placentahomogenat utvinnes ved filtrering og sentri-

t

fugering og deretter eventuelt tørkes. Som spesielt skånende tørkning foretrekkes lyofiliseringen. Det blodfritt vaskede og tørkede placentavev ekstraheres fortrinnsvis i en 4 - 10%- ig, spesielt 5 - 7%-ig suspensjon, med et vandig medium med en pH-verdi mellom 4,5 og 14, idet det vandige medium skal være hypotont. Fortrinnsvis anvendes hertil vann eller hypotone salt-eller pufferoppløsninger, hvis konsentrasjon og elektrolytt-s' ammens et ni ng fører til en osmotisk konsentrasjon på under 330mM/ liter.

Spesielt egnet er nøytralsalt-oppløsninger, hvis pH-verdi etter suspensjon av placentavevet i oppløsningen med baser som natronlut eller kalilut innstilles på den ønskede pH-verdi. Det er ikke avgjørende, ved hvilken pH-verdi mellom 4,5 og 14 ekstraheringen av placentavevnaden med den hypotone opplø.sning foretas.

I en spesiell utførelsesform ekstraheres knuste, blodfrie vaskede placenter med en pH-verdi over 4,5 med et vandig medium av en osmolaritet mindre enn omtrent 330 mM/ liter, ekstraktet adskilles fra vevresiduet og underkastes en fIotasjon. Derved blandes det vandige ekstrakt for å øke tettheten av oppløsningen med en inert vannoppløselig forbindelse, f.eks. et nøytralsalt eller et kullhydrat, fortrinnsvis et alkali- eller jordalkali-halogenid, som KBr, NaBr, CCI2eller sakkarose, idet det med den tilsatte mengde av de egnede stoffer innstilles en tetthet av oppløsningen på minst 1,

oppad begrenset ved oppløseligheten av saltene, fortrinnsvis en tetthet fra 1,06 til 1,20 g/cm^. Oppløsningen sentrifugeres deretter ved en aksellerasjon på over lik 25.000 x g, fortrinnsvis 50.000 x g i minst 60 minutter, fortrinnsvis 120 minutter. Etfeer sentrifugeringen utvinnes det på den klare understående saltoppløsning floterte noe uklare sjikt. Plota-sjonen av det uklare sjikt i sentrifugen gjentas hensiktsmessig under de samme eller under sammenlignbare betingelser, f.eks. ved 50.000 - 150.000 x g og det overstående flotat utvinnes endelig.

Egnede fIotasjonssystemer er forøvrig vanlige for fagfolk for adskillelse av lipoproteiner fra blodplasma. Ved anvendelsen av 20$-ig vandig kaliumbromidoppløsning og en om-dreiningshastighet av ultrasentrifugen tilsvarende 50.000 x g floterer den antihemofilt virksomme fraksjon etter ca. 2 timer til overflaten av oppløsningen meget fri for resterende protein-bestanddeler som sedimenteres resp. forblir oppløst. Det på denne måte dannede flotat dispergeres i vann eller fortynnet saltoppløsning, eksempelvis 0,5 til 1,2%-ig kokesaltoppløsning, fortrinnsvis 0,9%-ig koksaltoppløsning og i en derpå uttatt prøve bestemmes faktor VIII og -IX-aktivitet.

Deretter foretas fortynningen således at den for-tynnede oppløsning av flotatet inneholder 10-200, fortrinnsvis 20 enheter av faktor VIII.

Det ved fIotasjon fremstilte råpreparat av det antihemofile middel kan hvis ønsket underkastes en eller flere av følgende renseoperasjoner. Hvis produktet skal anvendes til intravenøs terapi er det minst nødvendig en av disse renseope-ras joner .

1. Rensefremgangsmåte ved ekstrahering.

Det ved flotasjon over en konsentrert saltoppløs-ning dannede produkt, hvis aktivitet på faktor VIII utgjør 10 - 200, fortrinnsvis 20 enheter, blandet med et koaguleringsinert protein, eksempelvis albumin, fortrinnsvis humanalbumin, i en konsentrasjon på 1 - 10%, fortrinnsvis 5%, deretter blandes med et polyanion som er i stand til kompleksdannelse med basiske polypeptider, proteiner eller fosforlipider, spesielt en polysakkarid-polysvovelforbindelser som heparin, fortrinnsvis dets natri-umsalt i en mengde på 0,005 - 0,5-mg/ml, ved heparin, tilsvarende 1-50 enheter pr. ml av den tilstedeværende oppløs-ning. Deretter innstilles ved fortynning eller salttilsetning - vanligvis er sistnevnte nødvendig - til en ledningsevne på under 14 mS/cm og med syre, fortrinnsvis en mineralsyre som saltsyre innreguleres på en pH-verdi på 3,5 - 6. En volumdel av den dannede suspensjon blir med minst 1 del av et med vann ikke blandbart oppløsningsmiddel for lipider med et kokepunkt fra 40 til 80°C, fortrinnsvis med en alifatisk eter eller et hydrokarbon, hvis kokepunkt ligger i overnevnte kokeområde eller en blanding av dette, idet blandingsforholdet kan være vilkårlig, fortrinnsvis imidlertid med en blanding av 8 volumdeler petroleter og 2 volumdeler dietyleter, rystet eller blandet 2-8 timer ved 10 - 40°C, fortrinnsvis ved værelsestemperatur minst en gang, hvortil det med fordel anvendes et mekanisk ryste- eller blandeapparat. Etter kort tids henstand kan den organiske fase adskilles eller kasseres. Den vandige fase befris, fortrinnsvis i vakuum for resterende oppløsningsmidler. Deretter foregår bestemmelsen av faktor VIII og -IX-aktivitet på kjent måte. Produktet kan anvendes parenteralt.

Istedenfor en polysakkarid-polysvovelsyre-forbindelse kan det i foreliggende fremgangsmåte også anvendes en polykationisk forbindelse som protamin, fortrinnsvis som dets klorid eller sulfat, i en konsentrasjon på 1 - 10 mg/ml, for å komme til et produkt med sammenlignbar faktor Vlll-aktivitet,

Por den parenterale applikasjonsform tilstrebes

10 - 500 enheter faktor VIII, fortrinnsvis 20 enheter faktor VIII, i forbruksoppløsningen som enkeltdose. På forhånd er det nødvendig med en sterilisering for å fjerne kontaminerende mikro-organismer. Preparatet kan deretter bringes i den for den parenterale applikasjon egnede tilberedningsform, blandes med stabi liserende beskyttelseskolloider, f.eks. protein og eventuelt deretter tørkes lyofilt. Det i en fysiologisk tålbar oppløs-ning foreliggende fremgangsmåteprodukt eller det igjen opp-løste tørrpreparat kan anvendes for substitusjonsterapi, f.eks. av hemofili A.

Egnede oppløsningsmidler er eksempelvis destillert vann, fysiologisk NaCl-oppløsning, hvis ønsket med tilsetning av et pufferstoff, som 0,02 molar Na-citrat med en pH-verdi på 7,0.

Til preparatene kan det før frysetørkningen for stabiliseringen settes beskyttelseskolloider som albumin og/ eller kullhydrater som fruktose. Med hensyn til en terapeutisk anvendelse av sluttproduktet hos mennesker anvendes hensiktsmessig humanalbumin.

Videre muligheter for en vidererensning er eksempelvis følgende, enskjønt det også skal bemerkes at den nedenfor, under punkt 2 omtalte fremgangsmåte er mindre godt egnet for fremstilling av farmasøytisk appliserbare preparater.

2. Rensefremgangsmåte ved alkalibehandling.

Den til 10 - 200 faktor Vlll-enheter innstilte oppløsning innstilles med alkalilut til en-pH-verdi mellom 10 og l4, fortrinnsvis 12. Hertil tjener eksempelvis 2 - 7 N, fortrinnsvis 5 N NaOH. Blandingen hensettes deretter i 15 minutter til 48 timer ved denne pH-verdi. Deretter nøytraliseres, dvs. innstilles til en pH-verdi i nærheten av nøytralpunktet, fortrinnsvis mellom pH 6 og pH 8. Hertil kan det anvendes uor-ganiske syrer, eksempelvis 2 - 10 N, fortrinnsvis 5 N HC1.

Por adskillelse av lavmolekylære bestanddeler underkastes den nøytraliserte oppløsning en dialyse mot en fysiologisk tålbar saltoppløsning, f.eks. isotonisk koksaltoppløsning. Før, under eller etter dialysen kan det eventuelt tilsettes koagulerings-inerte tilsetninger for stabilisering av aktiviteten av det antihemofile middel. Spesielt fordelaktig viser det seg hertil inert proteinmaterial som eksempelvis albumin.

3» Rensefremgangsmåte ved kromatografi.

En rensning av den til 10 - 200 faktorer VIII-enheter innstillede vandige oppløsning lar seg videre foreta med en fraksjonering på en molekylsikt, eksempelvis ved gelfil-trering i en søyle. Som molekylarsikt i denne forbindelse anvendes fortrinnsvis en spesielt opparbeidet agarose, eksempelvis de som er oppnåelige under betegnelsen "Sepharose" fra Firma Pharmacia, Uppsala, Sverige eller "Biogel A" fra Firma Biorad Laboratories, Richmond/California. Fraksjoneringsområdet av dette material bør for de globulære molekyler ligge ved mole-4 6

kylvekter mellom 10 og 10 . Før gjennomføring av molekylsikt-kromatografi underkastes det'antihemofile middel, fortrinnsvis en dialyse mot en fortynnet, fortrinnsvis sterkt isotonisk saltoppløsning og deretter utlignes hensiktsmessig såvel kvalitativt som også kvantitativt med hensyn til ytterligere tilsetninger til oppløsningen den elusjonsoppløsning mest mulig som finner anvendelse for eluering av det ønskede produkt ved molekylarsikt-kromatografi. Elueringsoppløsningen inneholder nøytralsalter, som eksempelvis natriumklorid i en konsentrasjon fra 0, 7% til 5,8%, fortrinnsvis 4,5 til 5% og en stabiliserende tilsetning av et inert protein, eksempelvis albumin i en konsentrasjon på 1 - 10%, fortrinnsvis 3%. Kroma-tografien foretas på kjent måte.

Valg av de enkelte derved oppnådde fraksjoner foregår etter deres innhold av faktor VIII, VII og -IX-aktivitet, idet fraksjonene med anriket faktor Vlll-aktivitet samles og forenes og innstilles eventuelt med en fysiologisk tålbar salt-oppløsning på de ønskede enheter av faktor VIII eller hvis. dette er nødvendig, konsentreres med ét ultrafilter til det ønskede antall enheter av faktor VIII.

Den overnevnte rensefremgangsmåte er dessuten egnet til å anvendes som en ekstra vidererensning av det etter de angitte trinn oppnådde produkter og spesielt istedenfor dialyse i fremgangsmåten til alkalibehandling.

4. Rensefremgangsmåter ved sentrifugering.

Det ved flotasjon over konsentrerte saltoppløs-ninger dannede råprodukt fortynnes med destillert vann til 10 - 200 enheter faktor VIII, fortrinnsvis 100 enheter og blandes med kokesalt inntilr-e.n konsentrasjon på 0,075~1,0-M, fortrinnsvis 0,15 M. Deretter tilsettes til denne oppløsning et koagulasjonsinert, lipofilt protein, f.eks. albumin, fortrinnsvis humanalbumin, inntil en konsentrasjon på 1 - 10%, fortrinnsvis 2,5 - 5%'Blandingen inkuberes i 1 - 10 timer, fortrinnsvis 2-5 timer, ved 37°C. Deretter sentrifugeres blandingen med

50.000 x g i 30 - 120 minutter, fortrinnsvis omtrent 60 minutter og den overstående oppløsning med det antihemofile middel ut-

vinnes.

Etter tilsetning av vanlige beskyttelseskolloider og tilsvarende stabilisator kan det tilnærmet klare sentrifugat sterilfiltreres. Utbytte av faktor VIII og -IX-aktivitet undersøkes under den eventuelle opparbeidelsesfremgangsmåte og/eller i tilknytning til dette. Dens bestemmelse foregår eksempelvis etter følgende metode: 1 del, f.eks. 0,1 ml partielt tromboplastin (f.eks. fremstillet ifølge tysk søknad P 23 16 430.9-52 (Ma l60), blandes med en del faktor Vlll-mangelplasma og en del fortynnet normalplasma. Denne blanding holdes 6 minutter ved 37°C. Etter tilsetning av en del av en til 37°C foroppvarmet 0,025 molar kalsiumkloridoppløsning bestemmes den tid som går fra tilsetning av kalsiumkloridoppløsning til opptreden av en fast koagulerings-kjerne. Tilkkvantitativ angivelse avleses den koagulasjonstid som fremkommer fra den faktor Vlll-holdige oppløsning under hensyntagen til en med normalplasma-fortynningsrekke oppnådd j usteringskurve. 1 enhet faktor VIII tilsvarer faktor Vlll-aktiviteten av 1 ml normalplasma.

Bestemmelsen av faktor IX-aktiviteten kan etter overnevnte metode foregå til faktor Vlll-best-emmelse, idet istedenfor faktor Vlll-mangelplasma anvendes en faktor IX-mangelplasma.

Faktorene VII og X bestemmes analogt ved hjelp

av kongenital faktor VII- og X-mangelplasma.

Oppfinnelsens gjenstand er også et antihemofilt middel med faktor VIII, -IX, -VII og -X-aktivitet, oppnådd etter en av de overnevnte fremgangsmåter.

Endelig er oppfinnelsens gjenstand et til intrave-nøs substitusjonsterapi av hemofili A og B egnet legemiddel, bestående av eller inneholdende et antihemofilt middel oppnåelig ifølge en av de overnevnte fremgangsmåter og som eventuelt inneholder farmasøytisk vanlige bærestoffer som tilsetninger. Preparatet lagres av holdbarhetsgrunner, hensiktsmessig i tørr, lyofil form. Før den intravenøse applikasjon er tørrproduktet å rekonstituere på en for slike preparater kjent måte. Preparatet substituerer: 1. Faktor VIII- og -IX-mangeltilstander prøvet etter den parti-elle tromboplastintid-metode (PTT) på de tilsvarende kongeni tale mangelplasmer, Aktiviteten lar seg angi i enheter referert til standard-human-plasma (l E/ml). Faktor IX-aktiviteten ble målt ved flere charger med 0,5 - 1 E pr.

E 'faktor VIII.

2. Faktor VIII av hemmelegemehemofilier, slik den kan opptre ved polytransfunderte hemofili A-pasienter; 3. kongenitale faktor X-mangel, bestemt i PTT og Russel-Viper-Venom-tid.

Følgelig erstatter hemostyptikum fra placenter alle faktorer av den endogene aktiveringsvei mer eller mindre sterkt, mest virksom faktor VIII; dessuten blir imidlertid også

4. kongenitale faktor VII-mangeltilstander normalisert,

målt i PTT og enfasekoaguleringstid ifølge Quick;

5. kumarin-induserte koaguleringsdefekter, som fører til dan-nelse av fysiologisk ikke aktiverbart protrombin (protrombin indusert av vitamin K fravær = PIVKA), substitueres partielt. Korrekturen foregår høyst sannsynlig i størrelsesorden av det ennu aktiverbare protrombin: 15 - 20% av aktiviteten av

normalplasmaet ved godt innstilte pasienter,

6. Protrombin (høyrenset, faktor VII og -X fritt) aktiveres sterkt.

Etter tilsetning av dekalsifisert humanplasma er det aktive prinsipp stabilt flere timer; en hemming opptrer først etter tilsetning av heparin, som virker som antidot. Sammenfattende kan det sies: Hemostyptikum fra placenter substituerer av faktorene av det endogene koaguleringssystem spesielt virksomt faktor VIII og IX, partielt imidlertid også faktor VII og X

av det eksogene system. Ifølge sammensetninger og egenskaper er hemostyptikumet fra placenter et kompleks, som inneholder en liten protein- men høy fosfolipiddel, som ved komplesering med albumin får egenskapene av en ekte oppløsning.

Hemostyptikum fra human-placenter inneholder de for dannelsen av faktor X-aktivatoren nødvendige fosforlipider i en spesiell virksom form. For bred terapeutisk virkning bi-drar i tillegg et stoff som er lignende, men ikke identisk med den aktiverte faktor X. Det katalyserer direkte omdannelsen av protrombin til trombin i omgåelse av faktorene VIII og IX

og påvirkes ikke av hemmelegemer i virkningen. Med hemostyptikumet fra human-placenta står det til disposisjon et preparat

som stiller terapien av hemofile påeen ny basis. Dette gjelder såvel for den brede anvendelse som også råstoffet. Hemostyptikumet adskiller seg etter fremstillingsfremgangsmåter, sammen-setning og virkningsmåte fra de andre kjente preparater. Et indikasjonstyngdepunkt ligger sannsynligvis i behandling av hemmelegemet-hemofilier, som tidligere under tiden bare kunne behandles med dyrisk antihemofilt globulin og vurderingsfaktorer eller med aktiverte faktorer.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av et eksempel.

Eksempel.

Blodfritt vasket lyofilisert placentavev gjennom-blandes kraftig i en 5%~ig suspensjon i 0,05 molar Na-citrat-oppløsning i 20 minutter ved værelsestemperatur. Homogenatet slynges i en sentrifuge 30 minutter ved 30.000 x g, sedimentet kasseres og det dannede overstående bringes med fast kaliumbromid

til en 20%- ig metning. I en ultrasentrifuge slynges ekstraktet ved 50.000 x g 2 timer, idet det oppstår et godt adskillbart flotat. Denne overstående sone tømmes.. Da det hertil er for-utsetningen en fysiologisk forenlighet av preparatene anvendes til intravenøs substitusjonsterapi hensiktsmessig bare preparater som underkastes en av de tidligere angitte rensefremgangsmåter. Etter en ny flotasjon ved 150.000 x g er preparatet bruksferdig som faktor Vlll-preparat. Det undersøkes aktiviteten av faktorene VIII, IX, X og VII.

Faktor Vlll-aktiviteten utgjør 200 E/ml.

Vidererensning:

a) Det ved 150.000 x g floterte preparat fortynnes med en vandig 10%- ig humanalbuminoppløsningjsom inneholder 10 enheter/ml

av heparin-natrium, til like deler. Derved må det påses at det samlede saltinnhold av blandingen tilsvarer en elektrisk ledningsevne på ca. 8 mS/cm. pHvverdien innstilles med 1 N HC1 til 4,5.

Blandingen haés i et ekstraheringsapparat ifølge Kutscher og Steudel og ekstraheres over 2 timer kontinuerlig med 2 deler av en petroleter (fraksjon 60 - 80°C)/dietyleter-blanding = 80/20 (volum/volum).

Etter operasjonen fjernes den organiske oppløsnings-middeldel under skånende betingelser i vakuum ved 20°C med en rotasjonsfordamper og den gjenblivende vandige fase innstilles med 1 N NaOH på pH 7,5 - 8,0. Etter 2 timers omrøring ved værelsestemperatur og sterilfiltrering er preparatet bruksferdig til substitusjonsterapi av faktor Vlll-mangler.

Faktor Vlll-aktiviteten av en prøve innstilles på ca. 30 enheter/ml.

Istedenfor med heparin-natrium kan faktor VIII-preparatet i første fremgangsmåtetrinn også blandes med

protaminsulfat (5 mg/ml),

b) Det ved 150.000 x g floterte preparat fortynnes med 0,15 molar •NaCl-oppløsning, som er 5%-ig på humanalbumin, til en

aktivitet på ca. 100 enheter faktor VIII. Etter inkubasjon på 5 timer ved 37°C sentrifugeres denne blanding \ time ved 50.000 x g og etter'en tilsetning av 1% fruktose sterilfiltreres. det omtrent klare sentrifugat.

Dette preparat viser seg i dyreforsøk, f.eks. på kaniner toksikologisk tålbart. De har hos sunne dyr en virkning som er sammenlignbar med det antihemofile globulin-konsentrat av plasma.

Tabellarisk oppstilling av virkningen av hemostyptikum fra human-placenta på plasmakoaguleringstider av normalplasma, faktor mangelplasmaer og hemmlegemeplasmaer bestemt i PTT+^.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av et antihemofilt middel, karakterisert vee d at knuste, blodfrie vaskede placenter ekstraheres med et vandig hypotont medium i svakt surt til alkalisk område, ekstraktet adskilles fra vevresiduer, den spesifikke tetthet av ekstraktet økes ved tilsetning av en inert vannoppløselig forbindelse til oppskumming og flotatet utvinnes.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at flotatet underkastes en ytterligere rensning.

3- Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at vidererensningen gjennomføres ved gjentagelse av flotasjon.

4. ' Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at en vidererensning foretas ved ekstrahering av det med et vandig medium fortynnet flotat ved lav ledningsevne og svak sur pH-verdi med et med vann ikke blandbart oppløsnings-midler for lipider i nærvær av en koaguleringsinert beskyttelseskolloid og en til kompleksdannelse med polypeptider resp. proteiner egnet polar polyionisk forbindelse, hvoretter det antihemofile middel anriker seg med faktor VIII-, IX-, VII- og X-aktivitet i den vandige fase og denne utvinnes.

5' Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at vidererensningen foretas ved behandling av flotatet med vandig alkalilut og adskillelse av de dialysable stoffer.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at vidererensningen av saltoppløsningen som inneholder faktorene VIII, IX, VII og X foretas ved dispergering av flotatet i en vandig saltoppløsning og kromatografering under tilsetning av et koaguleringsinert protein gjennom en molekylar sikt og de faktor Vlll-holdige fraksjoner utvinnes.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at vidererensningen foretas ved dispergering av flotatet i en vandig saltoppløsning, tilsetning av et koaguleringsinert protein til denne oppløsning og dens sentrifugering og sentrifugeoverstående som inneholder faktor VIII utvinnes.

8. Antihemofilt middel fremstillet ifølge en av fremgangsmåten ifølge krav 1 til 7.

9. Legemiddel egnet til intravenøs substitusjonsterapi av hemofiler bestående av eller inneholdende et ant i-,-, hemofilt middel ifølge krav 2 til 7 og eventuelt farmasøytisk vanlige bærestoffer.

10. Antihemofilt middel, karakterisert ved dets egenskap til, i mangelplasmaer å substituere koaguleringsfaktorene VIII, IX, VII og X.