DD250711A1

DD250711A1 - PROCESS FOR PREPARING ANTITHROMBIN III CONCENTRATES

Info

Publication number: DD250711A1
Application number: DD29218786A
Authority: DD
Inventors: Guenter Dornheim
Original assignee: Bezirksinstitut Fuer Blutspend
Priority date: 1986-07-04
Filing date: 1986-07-04
Publication date: 1987-10-21

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Antithrombin-III-Konzentraten zur Therapie von Antithrombin-III-Mangelzustaenden. Das bekannte Verfahren der Anreicherung von Antithrombin III in einer Rohfraktion durch Adsorption an Aluminiumhydroxid wird als Einstufenverfahren mit den Verfahrensschritten Adsorption, Auswaschen von Begleitproteinen und Freisetzung des Antithrombin III so gestaltet und vereinfacht, dass ein Antithrombin-III-Konzentrat fuer den therapeutischen Einsatz erhalten wird. Das erfindungsgemaesse Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass die Ausgangsmaterialien vor der Antithrombin-III-Adsorption nicht defibriniert werden und dass das Antithrombin III vorzugsweise aus Plasmaueberstaenden nach Abtrennung der Humanplasmafraktionen Kryopraezipitat und/oder Cohn I und Prothrombinkomplexkonzentrat als therapeutisch einsetzbare Plasmafraktionen an Aluminiumoxidhydrat adsorbiert und von diesem mit Zitrat enthaltenden Elutionsfluessigkeiten freigesetzt wird. Das erfindungsgemaesse Verfahren schliesst die Verwendung von Heparin enthaltenden Plasmaueberstaenden, die Gegenwart von Heparin in allen Verfahrensschritten sowie den Einsatz solcher Ausgangsmaterialien ein, aus denen vor der AT-III-Adsorption Lipoproteine abgetrennt wurden.The present invention relates to a method for the production of antithrombin III concentrates for the therapy of antithrombin III deficiency states. The known method of enrichment of antithrombin III in a crude fraction by adsorption on aluminum hydroxide is designed and simplified as a one-step process with the steps adsorption, washing out of accompanying proteins and release of antithrombin III, that an antithrombin III concentrate is obtained for therapeutic use. The inventive method is characterized by the fact that the starting materials are not defibrinated before the antithrombin III adsorption and that the antithrombin III is preferably adsorbed from plasma Überstaenden after separation of the human plasma fractions Kryopraezipitat and / or Cohn I and prothrombin complex concentrate as therapeutically usable plasma fractions of alumina hydrate and liberated with citrate-containing elution liquids. The process according to the invention includes the use of heparin-containing plasma supernatants, the presence of heparin in all process steps, and the use of such starting materials from which lipoproteins were separated prior to AT-III adsorption.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Antithrombin-Ill-Konzentrates. Antithrombin III (ATIII) ist der wichtigste Inhibitor der Blutgerinnung. Die Therapie angeborener und erworbener Antithrombin-Ill-Mangelzustände erfordert den Einsatz von Antithrombin-Ill-Konzentraten, da der Gabe von Blutplasma zum Zwecke der Antithrombin-Ill-Substitution in der Regel volumenbedingte Grenzen gesetzt sind'.The invention relates to a method for producing an antithrombin III concentrate. Antithrombin III (ATIII) is the main inhibitor of blood clotting. The therapy of congenital and acquired antithrombin-Ill deficiency states requires the use of antithrombin-III concentrates, since the administration of blood plasma for the purpose of antithrombin III substitution is usually limited by volume.

Characteristic of the known technical solutions

Es ist bekannt, daß Antithrombin III aus Humanzitratplasma in einer Rohfraktion durch Adsorption an Aluminiumhydroxid angereichert werden kann (Monkhouse, F. C, France, E. S. and Seegers, W. H.: Studies on the antithrombin III and heparincofactor activities of a fraction adsorbed from plasma by aluminium hydroxide. Circulation research 3 [1955] 397). Von Rosenberg, R. D. und Damus, P.S. (The purification and mechanism of action of human antithrombin-heparin cofactor. Journal of Biological Chemistry 281 [1973] 6490-6505) werden die Anreicherung von ATIII und dessen weitere Reinigung ausführlich beschrieben: Vor der Adsorption des ATIII am Aluminiumhydroxid mußausdem Plasma (1 000 bis 1 500 ml) der Prothrombin komplex durch Adsorption an Bariumcarbonat abgetrennt und das Fibrinogen durch eine thermische Behandlung des Plasmas (3 Minuten bei 54°C) weitgehend entfernt werden. Nach schneller Abkühlung auf O⁰C, wobei zur Defibrinieru ng jeweils nur10bis15ml Plasma eingesetzt werden, wird das Fibrinogen durch Zentrifugation abgetrennt. Anschließend wird das Plasma 15 min mit Aluminiumhydroxid.behandelt, das Adsorptionsmittel wird durch Zentrifugation abgetrennt.It is known that antithrombin III can be enriched from human nitrate plasma in a crude fraction by adsorption on aluminum hydroxide (Monkhouse, F.C., France, ES and Seegers, WH: Studies on the antithrombin III and heparin incofactor activities of a fraction adsorbed by plasma by aluminum hydroxide, Circulation research 3 [1955] 397). Von Rosenberg, RD and Damus, PS (The purification and mechanism of action of human antithrombin-heparin cofactor Journal of Biological Chemistry 281 [1973] 6490-6505) described in detail the enrichment of ATIII and its further purification: Before the adsorption of ATIII on the aluminum hydroxide must be separated from the plasma (1000 to 1500 ml) of the prothrombin complex by adsorption on barium carbonate and the fibrinogen should be substantially removed by thermal treatment of the plasma (3 minutes at 54 ° C). After rapid cooling to ⁰ ° C., using only 10 to 15 ml of plasma for defibrination, the fibrinogen is separated by centrifugation. The plasma is then treated for 15 minutes with aluminum hydroxide, the adsorbent is separated by centrifugation.

Das erhaltene Präzipitat wird anschließend mit Natriumchloridlösung (0,15mol/l) ausgewaschen und anschließend das Antithrombin III mit Ammoniumphosphat (0,36mol/l, pH 8,1) in der3stufigen Elution freigesetzt, bei der insgesamt 540 ml Elutionsflüssigkeit eingesetzt werden. Durch Diafiltration wird das Eluat innerhalb von 12 bis 24 Stunden auf 35ml konzentriert. Bei einer AT-Ill-Ausbeute von 55% wird bis zu diesem Verfahrensschritt eine auf die Proteinmenge im Ausgangsmaterial bezogene 5- bis 8fache Anreicherung des Antithrombin III erhalten.The resulting precipitate is then washed with sodium chloride solution (0.15 mol / l) and then the antithrombin III is released with ammonium phosphate (0.36 mol / l, pH 8.1) in the 3-stage elution, in which a total of 540 ml of elution liquid are used. Diafiltration concentrates the eluate to 35ml in 12 to 24 hours. At an AT-III yield of 55%, a 5 to 8-fold enrichment of the antithrombin III, based on the amount of protein in the starting material, is obtained up to this process step.

Im USP 4301153 wird von Rosenberg, R. D. mitgeteilt, daß das Antithrombin-Ili-Präparat, isoliert auf dieser Verfahrensstufe, tiefgefroren bei -20⁰C oder -9O⁰C über 20 Stunden bis 7 Tage gelagert, bis zu 60% seiner Aktivität verliert. Das AT-Ill-Präparat dieser Verfahrensstufe wird durch Gelfiltration an Sephadex G 200, lonenaustauschchromatographie an DEAE-Zellulose oder DEAE-Sephadex A-50 und durch isolelektrische Fokussierung weiter gereinigt.In USP 4301153 is notified from Rosenberg, RD, that the antithrombin Ili preparation, isolated at this process stage, frozen at -20 ⁰ C or stored -9O ⁰ C for 20 hours to 7 days, loses up to 60% of its activity. The AT-III preparation of this step is further purified by gel filtration on Sephadex G 200, ion exchange chromatography on DEAE-cellulose or DEAE-Sephadex A-50, and by isoelectric focusing.

Der Verfahrensschritt der thermischen Defibrinierung bei 54⁰C ist technisch sehr aufwendig, da wegen der Temperaturempfindlichkeit der meisten Proteine das Plasma sehr schnell auf 54°C erwärmt werden muß, die angegebene Zeit von 3 Minuten genau einzuhalten ist und aus den gleichen Gründen eine schnelle Abkühlung erforderlich ist. Nur so ist eine Denaturierung oder Inaktivierung des Antithrombin III in einem wesentlichen Umfang zu vermeiden, jedoch nicht auszuschließen. Das Verfahren kann deshalb nur mit kleinen Plasmamengen mit der notwendigen Sicherheit durchgeführt werden. Ein weiterer Nachteil ist, daß das Fibrinogen und die Faktoren des Prothrombinkomplexes nicht als therapeutisch einsetzbare Plasmafraktionen isoliert werden. Auch wird das isolierte und gereinigte ATIII nicht für therapeutische Zwecke eingesetzt.The process step of the thermal Defibrinierung at 54 ⁰ C is technically very complicated, since the plasma must be heated very quickly to 54 ° C because of the temperature sensitivity of most proteins, the specified time of 3 minutes must be followed exactly and for the same reasons a rapid cooling is required. Only in this way is denaturation or inactivation of antithrombin III to a significant extent to be avoided, but not excluded. The method can therefore be carried out only with small amounts of plasma with the necessary certainty. Another disadvantage is that the fibrinogen and the factors of the prothrombin complex are not isolated as therapeutically usable plasma fractions. Also, the isolated and purified ATIII is not used for therapeutic purposes.

Fischer, A. M. et'al. (Respective roles of antithrombin III and alpha 2-macroglobulin in thrombin inactivation. Thrombos.Fischer, A.M. et al. (Respective roles of antithrombin III and alpha 2-macroglobulin in thrombin inactivation.

Haemostas. 45 [1981 ] 51-54) defibrinieren das Plasma vor der AT-Ill-Adsorption an Aluminiumhyroxid mit Bentonit. Sie erreichen ähnliche Ergebnisse hinsichtlich der Ausbeute und des Anreicherungsgrades des ATIII nach Adsorption, Auswaschen und Freisetzung des ATIII vom Aluminiumhydroxid wie Rosenberg und Damus.Haemostas. 45 [1981] 51-54) defibrinate the plasma prior to AT-III adsorption on aluminum hydroxide with bentonite. They achieve similar results in terms of the yield and the degree of enrichment of the ATIII after adsorption, washing and release of the ATIII from aluminum hydroxide, such as Rosenberg and Damus.

Hensen, A. und Loeliger, E. A. (Antithromin III. Its metabolism and its function" in blood coagulation. Thrombos. Diathes.Hensen, A. and Loeliger, E.A. (Antithrombin III, Its metabolism and its function in blood coagulation, Thrombosis, Diathes.

Haemorrh. 9, Suppl. 1 [1963] 1—84) defibrinieren das Plasma zunächst ebenfalls durch thermische Behandlung bei 54°C über 2 min und entfernen vor der AT-Ill-Adsorption zusätzlich die Gerinnungsfaktoren Xl und XII durch Adsorption an Celit.Haemorrh. 9, Suppl. 1 [1963] 1-84) also initially defibrinate the plasma by thermal treatment at 54 ° C. for 2 minutes and, before the AT-III adsorption, additionally remove the coagulation factors XI and XII by adsorption on Celite.

Von Wickerhauser, M. und Sgouris, J. T. (Development of large scale fractionation methods. II. Isolation of a factor IX concentrate for clinical use. Vox Sang. 22 [1972] 137-160) wird Antithrombin III aus der Cohn-IV-Fraktion, die kein Fibrinogen enthält, durch Adsorption an Aluminiumhydroxid ebenfalls nur als Rohfraktion gewonnen, die nach weiterer Reinigung durch Fällung mit Ammoniumsulfat zur Stabilisierung von Prothrombinkomplexkonzentraten eingesetzt wird.Von Wickerhauser, M. and Sgouris, JT (Development of large scale fractionation methods., Vox Sang., 22 [1972], 137-160) discloses antithrombin III from the Cohn IV fraction , which contains no fibrinogen, also obtained by adsorption on aluminum hydroxide only as a crude fraction, which is used after further purification by precipitation with ammonium sulfate for the stabilization of Prothrombinkomplexkonzentraten.

Im USP 4087415 wird in einem Mehrstufenverfahren Antithrombin III durch Adsorption an Aluminiumhydroxid angereichert.In USP 4087415 antithrombin III is enriched by adsorption on aluminum hydroxide in a multi-stage process.

Hinsichtlich der Fibrinogenentfernung wird dort ausgeführt: „Wenn man die Kältefällung (Kryopräzipitation) in der anfänglichen Stufe zur Abtrennung des Fibrinogensund des Faktors VIII anwendet, wird der Überstand aus der 3. Stufe etwa 5 min auf etwa 56°C erhitzt, u meine vollständige Abtrennung des Fibrinogens zu gewährleisten." Die Anwendung des Verfahrens erfordert den Einsatz von Äthylenoxid-Propylenoxid-Blockpolymeren und Polyäthylenglykol in mehreren Verfahrensstufen, es läßt sich in ein vorhandenes System der Plasmafraktionierung deshalb nicht einordnen. Die Abtrennung des ATIII, adsorbiert am Aluminiumhydroxid, erfolgt in der 4. Verfahrensstufe und die Freisetzung des Antithrombin III wird durch Behandlung mit 0,37mol/l Natriumphosphat bei einem pH von 7,8 erreicht. Angaben zur Anreicherung des ATIII in dieser Verfahrensstufe werden nicht gemacht, es sind jedoch noch 2 weitere Verfahrensstufen zur Abrennung von Begleitproteinen des ATIII erforderlich.With regard to fibrinogen removal, it states: "When using the cold precipitation (cryoprecipitation) in the initial stage for the separation of the fibrinogen and the factor VIII, the supernatant from the 3rd stage is heated to about 56 ° C for about 5 minutes, u my complete separation The use of the process requires the use of ethylene oxide-propylene oxide block polymers and polyethylene glycol in several process stages, it can therefore not be classified in an existing system of plasma fractionation The separation of the ATIII adsorbed on the aluminum hydroxide takes place in the 4. Process stage and the release of antithrombin III is achieved by treatment with 0.37 mol / l of sodium phosphate at a pH of 7.8 Information on the accumulation of the ATIII in this process stage is not made, but there are two further process steps for the separation of Companion proteins of ATIII required.

Im USP 4340589 wird das Plasma ebenfalls durch eine Behandlung bei 56°C über 3min defibriniert. Die Freisetzung des Antithrombin III erfolgt nach Monkhouse ebenfalls mit einem Phosphatpuffer, es ist eine weitere Reinigung des ATIII durch Chromatographie, an DEAE-Zellulose erforderlich.In USP 4340589 the plasma is also defibrinated by treatment at 56 ° C for 3 min. According to Monkhouse, the release of the antithrombin III is likewise carried out with a phosphate buffer; further purification of the ATIII by chromatography on DEAE cellulose is necessary.

Es ist auch bekannt, die Faktoren II, VII, IX und X (Prothrombinkomplex) aus Humanzitratplasma durch Adsorption an Aluminiumhydroxid abzutrennen und das Konzentrat dieser Faktoren für therapeutische Zwecke einzusetzen (z. B. Barowcliffe,It is also known to separate factors II, VII, IX and X (prothrombin complex) from human nitrate plasma by adsorption on aluminum hydroxide and to use the concentrate of these factors for therapeutic purposes (eg Barowcliffe, US Pat.

T. W., Stableforth, P. and Dormandy, K. M.: Small scale preparation and clinical use of factor IX-prothrombincomplex. Vox Sang.T.W., Stableforth, P. and Dormandy, K.M .: Small scale preparation and clinical use of factor IX prothrombin complex. Vox Sang.

25 [1973)426-441; Bruning, P. F., Loeliger, E. A.: Prothrombal: A new concentrate of human prothrombin complex for clinical use. British Journal of Haematology 21 [1971] 377-378).25 (1973) 426-441; Bruning, P.F., Loeliger, E.A .: Prothrombal: A novel concentrate of human prothrombin complex for clinical use. British Journal of Haematology 21 [1971] 377-378).

Das Verfahren war in dertechnischen Ausgestaltung schwierig, da bei der Adsorption des Prothrombinkomplexes kurze Kontaktzeiten von 5min genau eingehalten werden mußten. Eine Aktivierung der Faktoren des Prothrombinkomplexes war trotzdem nicht ganz zu vermeiden. Es ist bekannt, daß aktivierte Faktoren in Prothrombinkomplexkonzentraten zu thromboembolischen Komplikationen führen können.The process was difficult in the technical design, since in the adsorption of the prothrombin complex short contact times of 5min had to be met exactly. Activation of the factors of the prothrombin complex was nevertheless not completely avoidable. It is known that activated factors in prothrombin complex concentrates can lead to thromboembolic complications.

Es ist bekannt, daß durch einen Zusatz von Heparin und Antithrombin III in allen Verfahrensstufen der Isolierung des Prothrombinkomplexes die Aktivierung der Prokoagulantien II, VII, IX und X verringert oder überhaupt vermieden werden kann.It is known that the activation of procoagulants II, VII, IX and X can be reduced or even avoided by adding heparin and antithrombin III in all stages of the isolation of the prothrombin complex.

Solche Präparate zeigen keine thromboembolischen Komplikationen beim Empfänger (z.B. DDRWP 148297, DDRWP 157998, USP 4465 523). Es wird in diesen und anderen Quellen zum Ausdruck gebracht, daß der Zusatz von Heparin zum Antithrombin III enthaltenden Ausgangsmaterial möglichst frühzeitig vor dem Tieffrieren des Frischplasmas erfolgen sollte, da dadurch auch die Ausbeute an Faktor VIII, hergestellt durch Kryopräzipitation oder andere Verfahren, erhöht werden kann. Daraus ergibt sich, daß Heparin enthaltende Ausgangsmaterialien für eine Gewinnung weiterer therapeutisch einzusetzender Plasmafraktionen zur Verfugung stehen.Such preparations show no thromboembolic complications at the recipient (e.g., DDRWP 148297, DDRWP 157998, USP 4465 523). It is stated in these and other sources that the addition of heparin to the starting material containing antithrombin III should occur as early as possible before deep-freezing the fresh plasma, as this may also increase the yield of Factor VIII produced by cryoprecipitation or other methods , It follows that heparin-containing starting materials are available for obtaining further plasma fractions to be used therapeutically.

Es ist bekannt, daß organische Adsorbentien wie Heparin-Sepharose zur Isolierung und Reinigung von Antithrombin III eingesetzt werden können (z.B. Miller-Andersson, M., Borg, H. and Andersson, L. O.iPurification of antithrombin III by affinity chromatography. Th rom b. Res. 5 [1974] 439—452). Das Verfahren wird zur Herstellung von Antithrombin III für therapeutische Zwecke genutzt (Wickerhauser, M., Williams, C. and Mercer, J.: Development of large scale fractionation methods. VII. Preparation of a antithrombin III concentrate. Vox Sang. 36 [1979] 294-299; Wickerhauser, M. and Williams, C: A single step method for isolation of antithrombin III. Vox Sang. 47[1984] 397-405).It is known that organic adsorbents such as heparin-sepharose can be used for the isolation and purification of antithrombin III (eg Miller-Andersson, M., Borg, H. and Andersson, LOI Purification of antithrombin III by affinity chromatography. Res. 5 [1974] 439-452). The method is used for the production of antithrombin III for therapeutic purposes (Wickerhauser, M., Williams, C. and Mercer, J .: Development of large-scale fractionation methods., VII Preparation of an antithrombin III concentrate, Vox Sang., 36 [1979 Wickerhauser, M. and Williams, C: A single step method for isolation of antithrombin III, Vox Sang., 47 [1984] 397-405).

Bei einer AT-Ill-Ausbeute von ca. 30% wird eine hohe Anreicherung des Antithrombin III in einem Einstufenverfahren erreicht.With an AT-III yield of about 30%, high accumulation of the antithrombin III is achieved in a one-step process.

Die AT-Ill-Präparate zeigen jedoch einen Aktivitätsabfall bei der Lagerung im tiefgefrorenen Zustand und bei der Lyophilisation, ein entsprechender Hinweis ist u.a. im USP 4340589 enthalten. Die Adsorbentien sind teuer. Während der Adsorption sind Aktivierungsreaktionen nicht auszuschließen und die Freisetzung des ATIII von der Heparin enthaltenden Matrix kann zu Strukturveränderungen im AT-Ill-Molekül führen. Außerdem ist die AT-Ill-Bindung an die Heparin-Sepharose auch nicht spezifisch. AT-Ill-Protease-Komplexe und andere Proteine wie z. B. Lipoproteine, Komplementfaktoren, andere Proteaseinhibitoren, Fibronectin und andere Proteine der Zelloberfläche werden ebenfalls an der Heparinsepharose gebunden.However, the AT-III preparations show a decrease in activity during storage in the frozen state and in the lyophilization, a corresponding indication is i.a. in USP 4340589. The adsorbents are expensive. During adsorption, activation reactions can not be ruled out and the release of the ATIII from the heparin-containing matrix can lead to structural changes in the AT-III molecule. In addition, AT-III binding to heparin-Sepharose is also not specific. AT-III protease complexes and other proteins such. Lipoproteins, complement factors, other protease inhibitors, fibronectin and other cell surface proteins are also bound to heparin sepharose.

Diese Proteine müssen durch eine entsprechende Verfahrensgestaltung abgetrennt werden, wenn das ATIII therapeutisch eingesetzt werden soll.These proteins must be separated by a corresponding process design, if the ATIII is to be used therapeutically.

Es ist weiterhin bekannt, Antithrombin III durch Adsorption an tri-Calciumphosphat für therapeutische Zwecke zu isolieren (DDR WP 140981 und DEOS 2902158). Beide Verfahren sind jedoch auf den Einsatz zitratfreier Ausgangsmaterialien beschränkt, d.h., daß entweder Chelaplex III als Antikoagulans bei der Blutentnahme eingesetzt werden muß oder das Zitrat in einem technisch aufwendigen Verfahren vor der AT-Ill-Adsorption an tri-Calciumphosphat entfernt werden muß.It is also known to isolate antithrombin III by adsorption on tri-calcium phosphate for therapeutic purposes (DDR WP 140981 and DEOS 2902158). However, both methods are limited to the use of citrate-free starting materials, that is, either Chelaplex III must be used as an anticoagulant in the blood collection or citrate must be removed in a technically complex process prior to AT-III adsorption on tri-calcium phosphate.

Es ist bekannt, daß der therapeutische Einsatz von Plasmaproteinen mit der Gefahr der Übertragung der Hepatitis B, der NONA, NON B Hepatitis und anderer Krankheiten verbunden ist. Eine Präparation jedoch, die mindestens 10 Stunden bei 6O⁰C in wäßriger Lösung gehalten wird, gilt heute als praktisch hepatitissicher, insbesondere dann, wenn man Blutplasma einsetzt, in dem mit Testmethoden der 3. Generation Hepatitisviren nicht nachgewiesen wurden.It is known that the therapeutic use of plasma proteins is associated with the risk of transmission of hepatitis B, NONA, NON B hepatitis and other diseases. However, a preparation that is kept in aqueous solution at least 10 hours at 6O ⁰ C, is now considered virtually hepatitis sure, especially if one uses blood plasma, were not detected in the test methods with the 3rd generation hepatitis viruses.

Proteine können jedoch 10 Stunden bei 60⁰C in wäßriger Lösung nur durch den Zusatz von stabilisierend wirkenden Substanzen behandelt werden, ohne daß sie in einem wesentlichen Umfang denaturiert werden.However, proteins can be treated in aqueous solution only by the addition of stabilizing substances for 10 hours at 60 ⁰ C, without being denatured to a substantial extent.

Für Antithrombin III wurde gefunden, daß dessen thermische Stabilität durch den Zusatz von 0,5 mol/l bis 2,0 mol/l Natriumzitrat erhöht werden kann und daß in solchen Lösungen Hepatitisviren inaktiviert werden (Tabor, E., Murano, G., Snoy, P. and Gerety,For antithrombin III it has been found that its thermal stability can be increased by the addition of 0.5 mol / l to 2.0 mol / l sodium citrate and that hepatitis viruses are inactivated in such solutions (Tabor, E., Murano, G. Snoy, P. and Gerety,

R. J.: Inactivation of hepatitis B virus by heat in antithrombin III stabilised with citrate. Throrhb. Res. 22 [1981] 233-238; Wickerhauser, M. and Williams, C: Antithrombin III concentrates for clinical use. The effects of pasteurisation and freeze drying.R.J .: Inactivation of hepatitis B virus by heat in antithrombin III stabilized with citrate. Throrhb. Res. 22 [1981] 233-238; Wickerhauser, M. and Williams, C: Antithrombin III concentrates for clinical use. The effects of pasteurisation and freeze drying.

Abstracts of the Congress of International Society of Haematology and International Society of Blood transfusion, Montreal 1980,Abstracts of the Congress of International Society of Haematology and International Society of Blood Transfusion, Montreal 1980,

Von McKay, E. J. (A simple two-step procedure for the isolation of antithrombin III from biological fluids. Throm. Res. 21 [1981] 375-382) wurde gefunden, daß es zweckmäßig ist, vor der AT-Ill-Isolierung durch Affinitätschromatographie an Heparin-Sepha.rose Lipoproteine und andere Proteine mit einer Affinität zum Heparin durch Behandlung mit hochmolekularem Dextransulfat und Calciumchlorid abzutrennen. Es ist bekannt, daß die Lipoproteine des Humanplasmas als wasserlösliche Transportform für Triglyceride, Cholesterinester und Phospholipide wegen ihrer Labilität die Stabilität von Plasma oderMcKay, EJ (A simple two-step procedure for the isolation of antithrombin III from biological fluids, Throm. Res. 21 [1981] 375-382) has found that it is desirable to obtain affinity chromatography prior to AT-III isolation to separate heparin-Sepha.rose lipoproteins and other proteins with an affinity for heparin by treatment with high molecular weight dextran sulfate and calcium chloride. It is known that the lipoproteins of human plasma as a water-soluble transport form for triglycerides, cholesterol esters and phospholipids because of their lability, the stability of plasma or

Plasmafraktionen ungünstig beeinflussen. . ir^u-xInfluencing plasma fractions unfavorably. , ir ^u -x

Lipoproteine können durch Flotation, Behandlung des Plasmas mit kolloidalem S1O2 (OS DE 3247150) adsorbiert, durch' Polyanionen wie Dextransulfat oder Heparin bei Gegenwart der Kationen Ca⁺⁺,Mg⁺⁺oderMn⁺⁺ präzipitiertoderan Derivate des Polyhydroxymethylens (OS DE 3330648) adsorbiert werden.Lipoproteins can be adsorbed by flotation, treatment of the plasma with colloidal S1O2 (OS DE 3247150), precipitated by polyanions such as dextran sulfate or heparin in the presence of the cations Ca ⁺⁺ , Mg ⁺⁺ or Mn ⁺⁺ or adsorbed on derivatives of polyhydroxymethylene (OS DE 3330648) ,

Es ist auch bekannt, daß durch Behandlung von Humanplasma mit nichttoxischen Detergentien wie Triton X100 undTween 80 gegebenenfalls bei Gegenwart von Äther im Plasma vorhandene Viren inaktiviert werden und daß bei dieser Behandlung verfahrensbedingt Lipoproteine und andere Eiweiße entfernt werden können (USP 4481189, USP 4314997).It is also known that viruses present in plasma are inactivated by treatment of human plasma with non-toxic detergents such as Triton X100 and Tween 80 in the presence of ether in the plasma, and that in this treatment process lipoproteins and other proteins can be removed (USP 4481189, USP 4314997).

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist es, das bekannte Verfahren der Anreicherung von Antithrombin III in einer Rohfraktion durch Adsorption an Aluminiumhydroxid als Einstufenverfahren mit den Verfahrensschritten Adsorption, Auswaschen von Begleitproteinen und Freisetzung des ATIII so zu gestalten, daß gegenüber dem Stand der Technik ein Antithrombin-Ill-Konzentrat für den therapeutischen Einsatz erhalten wird.The aim of the invention is to make the known method of enrichment of antithrombin III in a crude fraction by adsorption on aluminum hydroxide as a single-step process with the steps adsorption, washing out of accompanying proteins and release of the ATIII so that compared to the prior art, an antithrombin-Ill Concentrate for therapeutic use is obtained.

Gegenüber dem Stand der Technik sollen solche Bedingungen für die Adsorption und Elution (Freisetzung) des Antithrombin III gewählt werden, die die Gefahr irreversibler Strukturveränderungen des AT-Ill-Moleküls herabsetzen. Das Antithrombin III soll in der Zubereitung stabil sein und nach der Verfahrensstufe Elution soll eine solche spezifische Aktivität des Antithrombin III erreichtwerden, daß die El u ate ohne weitere Anreicherung (Reinigung) des Antith rombin III auf dieser Verfahrensstufe und ohne Umpufferung direkt zur Inaktivierung von möglicherweise im Präparat vorhandenen Krankheitserregern 10 Stunden bei 60"C pasteurisiert werden können, ohne daß die biologische Aktivität des Antithrombin III in einem wesentlichen Umfang durch diese Behandlung herabgesetzt wird, wobei in Abhängigkeit von der eingesetzten Menge Elutionsfiüssigkeit eine Konzentrierung der Eluate z. B. durch Diafiltration oder ein anderes Verfahren notwendig sein kann.Compared to the prior art, such conditions for the adsorption and elution (release) of the antithrombin III are to be chosen, which reduce the risk of irreversible structural changes of the AT-III molecule. The antithrombin III should be stable in the preparation and after the elution step, such a specific activity of the antithrombin III should be achieved that the eluate without further enrichment (purification) of the antithrombin III at this stage and without rebuffering directly to inactivation of possibly can be pasteurized in the preparation of pathogens for 10 hours at 60 ° C without the biological activity of antithrombin III is reduced to a significant extent by this treatment, depending on the amount of elution liquid used, a concentration of the eluates, for example by diafiltration or another procedure may be necessary.

Wird ein Antithrombin-Ill-Konzentrat höherer spezifischer Aktivität als das erfindungsgemäß hergestellte gefordert, soll eine weitere Reinigung des Eluats ohne wesentlichen Aktivitätsverlust nach bekannten Verfahren möglich sein. Ausgehend vom Stand der Technik sollen vorzugsweise die Nachteile beseitigt werden, daß das Fibrinogen im Ausgangsmaterial in einem der Antithrombin-Ill-Adsorption vorgeschalteten Verfahrensschritt obligatorisch vorzugsweise durch thermische Behandlung möglichst vollständig abzutrennen ist und daß das Antithrombin III lediglich in einer Rohfraktion mit einem für den therapeutischen Einsatz ungenügenden Anreicherungsgrad und unzureichender Stabilität isoliert wird. In der Verfahrensgestaltung soll gewährleistet sein, daß das nur in beschränkter Menge zur Verfügung stehende Humanplasma möglichst ökonomisch auch dadurch genutzt wird, daß die vor der Isolierung des Antithrombin III notwendigerweise abzutrennenden Plasmafraktionen wie Faktor VIII, die Faktoren des Prothrombinkomplexes und gegebenenfalls auch Fibrinogen in Zubereitungen isoliert werden, die direkt oder nach weiterer Reinigung für therapeutische Zwecke eingesetzt werden. Es soll auch erreicht werden, daß das Verfahren ohne Schwierigkeiten in ein vorhandenes System der Plasmafraktionierung eingeordnet werden kann und daß auch keine Verfahrensänderungen bei der Isolierung von z.B. Albumin und Gämmaglobulin notwendig sind, die in der Regel nach dem ATIII abgetrennt'werden.If an antithrombin III concentrate of higher specific activity than the one prepared according to the invention is required, a further purification of the eluate should be possible without substantial loss of activity according to known methods. Starting from the prior art, the disadvantages should preferably be eliminated that the fibrinogen in the starting material in a process step upstream of the antithrombin III adsorption is obligatorily preferably separated as completely as possible by thermal treatment and that the antithrombin III is only in a crude fraction with one for the therapeutic Insufficient degree of enrichment and insufficient stability is isolated. In the process design, it should be ensured that the human plasma which is only available in a limited amount is utilized as economically as possible by isolating the factors of the prothrombin complex and optionally also fibrinogen in preparations, before the isolation of the antithrombin III necessarily be separated plasma fractions such as factor VIII be used directly or after further purification for therapeutic purposes. It is also to be achieved that the process can be classified without difficulties into an existing system of plasma fractionation and that also no process changes in the isolation of e.g. Albumin and gamma globulin, which are usually separated after the ATIII.

Bei der Verfahrensgestaltung ist gleichermaßen zu gewährleisten, daß verschiedene Ausgangsmaterialien, die bei dem Stand der Technik zur Verfügung stehen und bei denen Zitrat, Chelaplex III und/oder Heparin als Antikoagulantien verwendet werden, aber auch das ohne Zusatz von Antikoagulantien gewonnene lonenaustauschplasma, eingesetzt werden können.In the process design is equally to ensure that various starting materials that are available in the prior art and in which citrate, chelaplex III and / or heparin are used as anticoagulants, but also the obtained without the addition of anticoagulants ion exchange plasma, can be used ,

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Antithrombin III aus Humanplasma, das die Antikoagulantien Zitrat, Chelaplex III und/oder Heparin enthalten kann oder das im Falle des lonenaustauscherplasmas frei von Antikoagulantien ist, vorzugsweise aber nach Abtrennung der Humanplasmafunktionen Kryopräzipitat und/oder Cohn I sowie der Humanplasmafraktion Prothrombinkomplexkonzentrat, in einem einfachen Einstufenverfahren als stabile Zubereitung einer solchen Zusammensetzung zu isolieren, die nach Pasteurisierung und Lyophilisation als Antithrombin-Ill-Konzentrat zur Therapie von Antithrombin-Ill-Mangelzuständen verwendet werden kann. Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung und Anreicherung von Antithrombin III in einem AT-Ill-Konzentrat durch Adsorption an Aluminiumoxidhydrat. Anmerkung:The invention is based on the object, antithrombin III from human plasma, which may contain the anticoagulants citrate, chelaplex III and / or heparin or which is free of anticoagulants in the case of ion exchange plasma, but preferably after separation of the human plasma functions cryoprecipitate and / or Cohn I and the Human plasma fraction Prothrombin complex concentrate, in a simple one-step process, to isolate as a stable preparation of such a composition which, after pasteurization and lyophilization, can be used as an antithrombin-III concentrate for the therapy of antithrombin-III deficiency states. The invention relates to a method for the isolation and accumulation of antithrombin III in an AT-Ill-concentrate by adsorption on alumina hydrate. Annotation:

In den im Abschnitt Charakteristik der bekannten technischen Lösungen angegebenen Quellen wird das Adsorbens entweder als Aluminiumhydroxid oder als alumina gel bezeichnet.In the sources specified in the section of the known technical solutions, the adsorbent is referred to as either aluminum hydroxide or alumina gel.

Für das in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Adsorptionsmittel trifft die der Formel Ai(OH)₃ entsprechende Zusammensetzung nicht zu, so daß in den weiteren Ausführungen die Bezeichnung Aluminiumoxidhydrat verwendet wird. Das Verfahren zur Anreicherung von Antithrombin III in einer Rohfraktion durch Adsorption an Aluminiumoxidhydrat hat bei dem Stand derTechnikfolgende entscheidende Nachteile:For the adsorbent used in the present invention, the composition corresponding to the formula Ai (OH) ₃ does not apply, so that in the further embodiments, the term alumina hydrate is used. The method of accumulating antithrombin III in a crude fraction by adsorption on alumina hydrate has the following disadvantages in the prior art:

Vorder Adsorption des ATIII an Aluminiumhydroxid muß das Fibrinogen obligatorisch weitgehend abgetrennt werden. Die bereits erwähnten Verfahren zur Abtrennung des Fibrinogens vorzugsweise durch thermische Behandlung des Plasmas über 3 bis 5 Minuten bei 54 bis 56⁰C sind für Großpool verfahren mit einer Chargengröße von mehr als 1001 technisch nur schwer zu lösen, da Zeit und Temperatur genau einzuhalten sind, die Solltemperatur möglichst schnell erreicht und nach Defibrinierung des Plasmasso schnell wie möglich auf O⁰C abgekühlt werden muß. Auch unabhängig von der Chargengröße sind die Defibrinierung bei 54bis56°C, aberauchdieFibrinogenadsorption an Bentonit bzw. kollidalem SiO₂, mit der Gefahr verbunden, daß die biologische Aktivität des Antithrombin III im Ausgangsmaterial durch diese Behandlung herabgesetzt wird.Before adsorption of the ATIII to aluminum hydroxide, the fibrinogen must obligatorily be largely separated. The aforementioned process for the separation of fibrinogen, preferably by thermal treatment of the plasma for 3 to 5 minutes at 54 to 56 ⁰ C are for large pool of process technology is difficult to solve, because time and temperature must be strictly observed with a batch size of more than 1001, the setpoint temperature must be reached as quickly as possible and after defibrination of the Plasmasso must be cooled as quickly as possible to ^{0 0} C. Regardless of the batch size, defibrination at 54-56 ° C, as well as fibrinogen adsorption on bentonite and collidal SiO ₂ , respectively, are associated with the risk that the biological activity of antithrombin III in the starting material will be lowered by this treatment.

Bei dem Stand der Technik wird das Antithrombin III in der Rohfraktion um das 5- bis 8fache angereichert. In der Rohfraktion ist das Antithrombin III nicht stabil, bereits durch Tieffrieren kommt es zu einem beträchtlichen Aktivitätsverlust.In the prior art, the antithrombin III in the crude fraction is enriched by 5 to 8 times. In the crude fraction, the antithrombin III is not stable, even deep-freezing leads to a considerable loss of activity.

Die Rohfraktion des ATIII muß durch Verfahren wie Adsorptionschromatographie an DEAE-ZeIIulose oder DEAE-Sephadex A-50 oder durch eine mehrstufige Fällung mit Polyäthylenoxid bzw. Äthylenoxid-Propylenoxid-Blockpolymeren weiter gereinigt werden, bevor das Antithrombin III pasteurisiert werden kann.The crude fraction of the ATIII must be further purified by methods such as adsorption chromatography on DEAE-cellulose or DEAE-Sephadex A-50 or by a multi-stage precipitation with polyethylene oxide or ethylene oxide-propylene oxide block polymers before the antithrombin III can be pasteurized.

Erfindungskennzeichnend ist, daß die eingesetzten Ausgangsmaterialien mit einem normalen oder erniedrigten Fibrinogengehalt ohne Defibrinierung direkt mit Aluminiumoxidhydrat zur Antithrombin-Ill-Adsorption behandelt werden und daß die Freisetzung des Antithrombin III vom Adsorptionsmittel nicht wie bisher üblich mit Natrium-oder Ammoniumphosphat, sondern mit Zitrat enthaltenden Elutionsflüssigkeiten erfolgt.It is characteristic of the invention that the starting materials having a normal or reduced fibrinogen content without defibrination are treated directly with alumina hydrate for antithrombin III adsorption and that the release of the antithrombin III from the adsorbent is not with sodium or ammonium phosphate but with citrate-containing elution liquids he follows.

Es wurde gefunden, daß auch das zur Adsorption des Antithrombin III eingesetzte Aluminiumoxidhydrat bekanntermaßen die Faktoren des Prothrombinkomplexes, Fibrinogen, Plasminogen und andere Proteine adsorbiert, die mit den üblicherweise eingesetzten Phosphat enthaltenden Elutionsflüssigkeiten zumindest teilweise das Eluat verunreinigen, so daß nur eine ca.It has also been found that the alumina hydrate used for the adsorption of the antithrombin III is also known to adsorb the factors of the prothrombin complex, fibrinogen, plasminogen and other proteins which at least partially contaminate the eluate with the phosphate-containing elution liquids usually used, so that only one approx.

8fache Anreicherung des Antithrombin III mit den Verfahrensschritten Adsorption, Auswaschen des Adsorbens und Elution erreicht werden kann.8-fold enrichment of the antithrombin III can be achieved with the process steps adsorption, washing out of the adsorbent and elution.

Überraschend wurde nun gefunden, daß durch den Einsatz von Zitrat enthaltenden Pufferlösungen zur Elution des AntithrombinSurprisingly, it has now been found that by the use of citrate-containing buffer solutions for the elution of antithrombin

III vom Aluminumoxidhydrat in Abhängigkeit von der Zitratkonzentration der auf Protein bezogene Anreicherungsgrad |III of alumina hydrate as a function of citrate concentration protein-related enrichment degree |

(spezifische Aktivität) des Antithrombin III gezielt erhöht werden kann, ohne daß Aktivierungsreaktionen über die noch im j(specific activity) of the antithrombin III can be specifically increased without activation reactions on the still in j

Ausgangsmaterial vorhandenen Prokoagulantien in einem wesentlichen Umfang ablaufen, die die Ausbeute an Antithrombin III IStarting material existing Prokoagulantien proceed to a significant extent, the yield of antithrombin III I

verringern würden und daß unerwünschte Begleitproteine im Eluat nicht oder nur in geringer Konzentration vorhanden sind. ;would reduce and that unwanted accompanying proteins in the eluate are not present or only in low concentration. ;

Ein Hinweis auf den geringen Umfang einer unerwünschten Aktivierung von Prokoagulantien durch deren Oberflächenkontakt iAn indication of the low level of unwanted activation of procoagulants by their surface contact i

mit dem Adsorptionsmittel ergibt sich auch aus derTatsache, daß die Bedingungen für die Adsorption des AT III in !with the adsorbent also results from the fact that the conditions for the adsorption of AT III in!

verhältnismäßig weiten Grenzen variiert werden können. Es wurde gefunden, daß die Temperatur bei der AT-Ill-Adsorption zwischen -2⁰C und 25°C betragen und die Dauer d er Adsorption zwischen 3 Minuten und 24 Stunden liegen kann, ohne daß Ausbeute und spezifische Aktivität bei verlängerten Kontaktzeiten in einem wesentlichen Umfang negativ beeinträchtigt werden.relatively wide limits can be varied. It has been found that the temperature in the AT-III adsorption between -2 ⁰ C and 25 ° C and the duration of d Adsorption can be between 3 minutes and 24 hours, without the yield and specific activity at extended contact times in a substantial negative impact.

Es wurde gefunden, daß auch der pH bei der Adsorption, bei der Entfernung von Begleitproteinen durch Auswaschen des ]It has also been found that the pH in the adsorption, in the removal of accompanying proteins by washing out the]

Adsorptionsmittelsund bei der Elution des Antithrombin III kein kritischer Parameter ist. Es kann bei einem pH zwischen 7,0 und 9,1 gearbeitet werden, vorzugsweise wird bei einem pH zwischen 7,0 und 8,0 gearbeitet.Adsorbent and in the elution of antithrombin III is not a critical parameter. It can be carried out at a pH between 7.0 and 9.1, preferably is carried out at a pH between 7.0 and 8.0.

Es wurde gefunden, daß die Freisetzung des Antithrombin III vom Aluminiumoxidhydrat mit Lösungen erfolgen kann, die zwischen 0,50 und 2,0mol/l Natriumzitrat, Kaliumzitrat oder Ammoniumzitrat enthalten.It has been found that the release of the antithrombin III from the alumina hydrate can be carried out with solutions containing between 0.50 and 2.0 mol / l of sodium citrate, potassium citrate or ammonium citrate.

Es ist vorteilhaft, den Elutionsflüssigkeiten, aber auch den Waschflüssigkeiten zur Bindung eventuell vorhandener Aluminiumionen geeignete Komplexbildner zuzusetzen, wiez. B. 0,001 bis 0,05 mol/l Chelaplexlll (Dinatriumäthylendiamintetraazetat-2-hydrat).It is advantageous to add suitable complexing agents to the elution liquids, but also to the washing liquids for binding any aluminum ions present, such as. B. 0.001 to 0.05 mol / l ChelaplexIII (disodium ethylenediaminetetraacetate 2-hydrate).

Es wurde gefunden, daß die Elutions- und Waschflüssigkeiten zweckmäßigerweise Glycin in einer Konzentration bis zu 0,25 mol/l enthalten.It has been found that the elution and washings suitably contain glycine in a concentration up to 0.25 mol / l.

Es wurde gefunden, daß es zweckmäßig ist, die Eluate, gegenbenenfalls nach Konzentrierung, beispielsweise durch Diafiltration, ohne weitere Reinigungsschritte auf dieser Verfahrensstufe zu pasteurisieren.It has been found that it is expedient to pasteurize the eluates, if necessary after concentration, for example by diafiltration, without further purification steps at this process stage.

Es wurde gefunden, daß zur Herstellung von Antithrombin-Ill-Konzentraten Ausgangsmaterialien eingesetzt werden können, die als Antikoagulantien Zitrat, Chelaplex III und/oder Heparin in bei der Blutkonservierung üblichen Konzentrationen enthalten oder die wie das lonenaustauscherplasma frei von diesen Antikoagulantien sind und die Fibrinogen in normaier^Konzentration enthalten.It has been found that starting materials which contain citrate, chelaplex III and / or heparin in concentrations customary in blood preservation as anticoagulants or which, like the ion exchange plasma, are free of these anticoagulants and which have fibrinogen in. Can be used for the production of antithrombin III concentrates normaier ^ Concentration included.

Es ist jedoch nicht zuletzt auch aus ökonomischen Gründen vorteilhaft, Ausgangsmaterialien einzusetzen, aus denen der Faktor VIII und auch Fibrinogen zumindest teilweise durch Kryopräzipitation, Äthanolfällung oder ein anderes Verfahren sowie die Faktoren des Prothrombinkomplexes als therapeutisch einsetzbare Präparate abgetrennt wurden. Es wurde gefunden, daß'es günstig ist, die Faktoren des Prothrombinkomplexes möglichst vollständig abzutrennen. Werden beispielsweise die Faktoren des Prothrombinkomplexes durch Adsorption an DEAE-Sephadex A-50 entfernt, dann kann es in Abhängigkeit von der Gestaltung dieses Verfahrens zweckmäßig sein, die nach der Adsorption an DEAE-Sephadex A-50 im Plasmaüberstand noch vorhandenen Prokoagulantien II, IX und X, besonders aber den Faktor VII, durch geeignete Verfahren zu entfernen.However, not least for economic reasons, it is advantageous to use starting materials from which the factor VIII and also fibrinogen were separated at least partially by cryoprecipitation, ethanol precipitation or another method and the factors of the prothrombin complex as therapeutically usable preparations. It has been found that it is beneficial to separate the factors of the prothrombin complex as completely as possible. If, for example, the factors of the prothrombin complex are removed by adsorption on DEAE-Sephadex A-50, then, depending on the design of this method, it may be expedient to use the procoagulants II, IX and., Which are still present in the plasma supernatant after adsorption on DEAE-Sephadex A-50 X, but especially the factor VII, by suitable methods to remove.

Es wurde gefunden, daß es zweckmäßig ist, vor der At-Ill-Adsorption diese Prokoagulantien ebenfalls an Aluminiumoxidhydrat zu adsorbieren, wobei zwischen 5 und 15% der später für die AT-Ill-Adsorption eingesetzten Menge Aluminiumoxidhydrat Verwendung finden.It has been found that it is desirable to also adsorb these procoagulants to alumina hydrate prior to At-III adsorption using between 5 and 15% of the alumina hydrate used later for AT-III adsorption.

Überraschend wurde nun gefunden, daß nach einer solchen Behandlung des Ausgangsmaterials die spezifische Aktivität des Antithrombin III im Eluat erhöht werden kann, da die Menge einzusetzenden Aluminiumoxidhydrats reduziert werden kann. Wird der Prothrombinkomplex dagegen aus Chelaplex III enthaltendem Plasma oder dessen äthanolhaltigem Überstand nach Abtrennung des Fibrinogen in der Fraktion I durch Adsorption an tri-Calciumphosphat entfernt oder wird Aluminiumoxidhydrat zur Adsorption des Prothrombinkomplexes eingesetzt, ist erfahrungsgemäß ein zusätzlicher Adsorptionsschritt nicht notwendig, da in den Plasmaüberständen die Prokoagulantien II, VII, IX und X nur noch in geringer Konzentration vorliegen. Da das Alüminiumoxidhydrat kein für Antithrombin III spezifisches Adsorbens darstellt, kann in Abhängigkeit von der Menge des eingesetzten Adsorptionsmittels zwar die spezifische Aktivität des ATIIl im Eluat beeinflußt werden, jedoch verbleibt bei reduzierten Adsorptionsmittelmengen Antithrombin im Ausgangsmaterial, die Erhöhung der spezifischen Aktivität erfolgt zu Lasten der Ausbeute.Surprisingly, it has now been found that after such a treatment of the starting material, the specific activity of the antithrombin III in the eluate can be increased, since the amount of alumina hydrate to be used can be reduced. If, on the other hand, the prothrombin complex is removed from plasma containing chelaplex III or its ethanol-containing supernatant after separation of the fibrinogen in fraction I by adsorption on tri-calcium phosphate or if aluminum oxide hydrate is used for adsorption of the prothrombin complex, experience has shown that an additional adsorption step is not necessary, since in the plasma supernatants Procoagulants II, VII, IX and X are present only in low concentration. Since the alumina hydride is not specific for antithrombin III adsorbent, depending on the amount of adsorbent used, although the specific activity of the ATIIl be influenced in the eluate, but remains at reduced amounts of adsorbent antithrombin in the starting material, the increase in specific activity at the expense of yield ,

Es wurde jedoch gefunden, daß Lipoproteine aber auch andere Proteine des Ausgangsmaterials affine Stellen des Adsorptionsmittels für Antithrombin III zumindest teilweise blockieren und so zu einem Mehrbedarf an diesem führen, wenn die gleiche Menge Antithrombin III adsorbiert werden soll.It has been found, however, that lipoproteins, but also other proteins of the starting material, at least partially block affine sites of the adsorbent for antithrombin III and thus lead to an increased need for this if the same amount of antithrombin III is to be adsorbed.

Erfindungsgemäß hat die Herstellung von Antithrombin-Ill-Konzentraten aus Ausgangsmaterialien mit einem verringerten Gehalt an Lipoproteinen den Vorteil, daß im Vergleich zum nicht vorbehandelten Plasma AT-Ill-Präparate mit einer höheren spezifischen Aktivität erhalten.werden. Es wurde gefunden, daß bei vergleichbaren Ausbeuten in der Regel die Menge eingesetzten Aluminiumoxidhydrats verringert werden kann.According to the invention, the preparation of antithrombin III concentrates from starting materials having a reduced content of lipoproteins has the advantage that AT-III preparations with a higher specific activity are obtained in comparison to the non-pretreated plasma. It has been found that at comparable yields, the amount of alumina hydrate used can generally be reduced.

Es wurde gefunden, daß Antithrombin III aus Plasmaüberständen, denen vor der Isolierung des Faktors VIII durch Kryopräzipitation bzw. vor der Abtrennung der Faktoren des Prothrombinkomplexes Heparin (0,1 bis 2IE/ml) zugesetzt wurde, mit Vorteilen hinsichtlich der Ausbeute und spezifischen Aktivitäten isoliert werden kann. In einer besonderen Ausführungsform wird das Heparin in einer Konzentration von 0,05 bis2IE/ml dem Ausgangsmaterial bzw. dem Adsorptionsmittel vorder Antithrombin-Ill-Adsorption zugesetzt.It has been found that antithrombin III is isolated from plasma supernatants to which heparin (0.1 to 2 U / ml) has been added prior to the isolation of factor VIII by cryoprecipitation or before separation of the factors of the prothrombin complex, with advantages in yield and specific activities can be. In a particular embodiment, the heparin is added in a concentration of 0.05 to 2 U / ml to the starting material or adsorbent prior to antithrombin III adsorption.

Es wurde gefunden, daß es bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zweckmäßig ist, Heparin bis zu einer Konzentration von 11Ε/ml den Waschflüssigkeiten zuzusetzen und die Freisetzung des Antithrombin Ml mit Elutionsflüssigkeiten durchzuführen, die neben Natriumzitrat Heparin in einer Konzentration zwischen 0,05 und 2IE/ml enthalten.It has been found that in this embodiment of the method according to the invention it is expedient to add heparin to the washing liquids up to a concentration of 11Ε / ml and to carry out the release of the antithrombin Ml with elution liquids which in addition to sodium citrate have heparin in a concentration of between 0.05 and 2 / ml included.

embodiments example 1

*M50ml Humanzitratplasma werden nach Abrennung des Faktors VIII durch Kryopräzipitation und Isolierung des Prothrombinkompiexes durch Adsorption an DEAE-Sephadex A-50 gemäß DDR-WP 141 262 bei 4°C mit 65ml Aluminiumoxidhydrat Typ 8025 (VEB Säureschutz Berlin) versetzt und bei Raumtemperatur 15 min geschüttelt. Danach wird das Adsorptionsmittel durch Zentrifugieren vom Überstandsplasma getrennt. Das Präzipitat wird zweimal mit jeweils 300ml Waschflüssigkeit (0,003mol/l Chelaplex III, pH7,4) ausgewaschen und wiederum zentrifugiert.M50ml human nitrate plasma after removal of factor VIII by cryoprecipitation and isolation of Prothrombinkompiexes by adsorption to DEAE-Sephadex A-50 according to DDR-WP 141 262 at 4 ° C with 65ml alumina hydrate type 8025 (VEB Säureschutz Berlin) and at room temperature for 15 min shaken. Thereafter, the adsorbent is separated by centrifugation from the supernatant plasma. The precipitate is washed twice with 300 ml of washing liquid (0.003 mol / l Chelaplex III, pH 7.4) and again centrifuged.

Das Präzipitat wird mit 90 ml Elutionsflüssigkeit (1,35 mol/l Natriumzitrat, 0,003 mol/l Chelaplex III, pH 7,6) behandelt und das Antithrombin M! unter Schütteln vom Aluminiumoxidhydrat freigesetzt, erneut zentrifugiert und eine 2.Elution mit 30 ml Elutionsflüssigkeit unter den gleichen Bedingungen durchgeführt. Im Eluat sind 196 Einheiten Antithrombin III enthalten (Ausbeute 63%), wobei eine Einheit Antithrombin III der AT-Ill-Aktivitätvon 1 ml Frischplasma entspricht. Die Antithrombin-Ill-Aktivität wurde amidolytisch mit Chromozym TH (Fa. Boehringer Mannheim) nach den Angaben des Herstellers bestimmt. Im Eluat ist Antithrombin III bezogen auf die eingesetzte Proteinmenge 40fach angereichert. Nach Pasteurisierung des Eluates 10h bei 60⁰C sowie nach Konzentrierung, Entsalzung und Gefriertrocknung werden 157 Einheiten Antithrombin IM erhalten. Das entspricht einer Ausbeute von 50%.The precipitate is treated with 90 ml of elution liquid (1.35 mol / l sodium citrate, 0.003 mol / l Chelaplex III, pH 7.6) and the antithrombin M! shaken off from the alumina hydrate, centrifuged again and a second elution with 30 ml of elution liquid was carried out under the same conditions. The eluate contains 196 units of antithrombin III (yield 63%), with one unit of antithrombin III corresponding to the AT-III activity of 1 ml of fresh plasma. The antithrombin III activity was determined amidolytically using Chromozym TH (Boehringer Mannheim) according to the manufacturer's instructions. In the eluate antithrombin III is forty times enriched based on the amount of protein used. After pasteurization of the eluate 10h at 60 ⁰ C and after concentration, desalination and freeze-drying, 157 units antithrombin be obtained. That corresponds to a yield of 50%.

Example 2

Die Durchführung erfolgte wie im Beispiel 1 angegeben. Die Freisetzung des Antithrombin III erfolgte jedoch mit 90 ml (LEIution) bzw. 30 ml (2.Elution) einer 0,37 mol/l Natriumphosphat (pH 8,10) enthaltenden Elutionsflüssigkeit. Bei einer Ausbeute von 60% wird nun eine 8fache Anreicherung des Antithrombin III erreicht.The procedure was carried out as indicated in Example 1. However, the release of the antithrombin III was carried out with 90 ml (LEIution) or 30 ml (2nd elution) of an elution liquid containing 0.37 mol / l sodium phosphate (pH 8.10). With a yield of 60%, an 8-fold accumulation of antithrombin III is now achieved.

Example 3

Das Ausgangsmaterial wird nach den Angaben von McKay, E. J. (A simple two-step procedure for the isolation of antithrombin III from biological fluids. Thromb. Res. 21 [1981] 375-382) mit CaCI₂ und Dextransulfat behandelt.The starting material is treated with CaCl ₂ and dextran sulfate as described by McKay, EJ (A simple two-step procedure for the isolation of antithrombin III from biological fluids, Thromb. Res. 21 [1981] 375-382).

Die AT-III-Adsorption wurde, wie im Beispiel 1 angegeben, durchgeführt, wobei jedoch nur 30ml Aluminiumoxidhydrat eingesetzt wurden. Das Auswaschen und die Elution wurden, wie im Beispiel 1 angegeben, durchgeführt.The AT III adsorption was carried out as indicated in Example 1, but using only 30 ml of alumina hydrate. The washing and the elution were carried out as indicated in Example 1.

Bei einer Ausbeute von 58% wird eine 60fache Anreicherung des Antithrombin III im Eluat erhalten.With a yield of 58%, a 60-fold enrichment of antithrombin III is obtained in the eluate.

Claims

1. A process for the preparation of antithrombin-III concentrates by adsorption on alumina hydrate, characterized in that the starting materials are not defibrinated prior to the AT-III adsorption that human plasma or plasma fractions, preferably the plasma supernatants after separation of the human plasma fractions cryoprecipitate and / or Cohn I and after separation of the factors of the prothrombin complex with a fibrinogen content between 1.0 and 4.5 g / l, a content of heparin between 0.0 and 5IE / ml and a normal or reduced content of lipoproteins for the adsorption of antithrombin III are used and that the antithrombin III is liberated after washing out of the adsorbent with a citrate-containing elution liquid from the alumina hydrate.

2. The method according to item 1, characterized in that human plasma is used as the starting material, are used in the citrate or chelaplex III or heparin as anticoagulants in the concentrations usually used or that is as an ion-exchange plasma free of any anticoagulants.

3. The method according to item 1 and 2, characterized in that the starting material in addition to the anticoagulant citrate or Chelaplex III contains up to 2IE heparin / ml.

4. The method according to item 1 and 2, characterized in that the heparin-free starting material prior to the antithrombin-III adsorption heparin in a concentration of 0.05 to 2 ΙΕ / ml is added.

5. The method of item 1 and item 2, characterized in that the adsorbent alumina hydrate, the heparin is added in such an amount before adsorption of the antithrombin III that in the adsorbent-plasma suspension, a heparin content of 0.1 to 2IE / ml is achieved ,

6. The method according to item 1 to 3, characterized in that are separated from the starting material factor VIII and / or fibrinogen by cryoprecipitation, by precipitation with ethanol or another method as human plasma fractions for therapeutic use.

7. The method according to item 1 to 3 and 6, characterized in that the factors of the prothrombin complex either by adsorption to DEAE-Sephadex A-50, DEAE cellulose, tri-calcium phosphate, penta-calcium hydroxide triphosphate or alumina hydrate as much as possible as human plasma fraction for therapeutic Use to be separated.

8. The method according to item 1 and item 7, characterized in that adsorption is carried out with 5 to 15% of the amount of alumina hydrate used for AT-III adsorption to remove residual procoagulants of the prothrombin complex prior to the antithrombin III adsorption.

9. The method according to item 1 to 3, characterized in that in the starting material before the AT-III adsorption of the content of lipoproteins by known methods before or after the separation of the therapeutically used plasma fractions cryoprecipitate or Cohn I and prothrombin complex concentrate is lowered.

10. The method according to item 1 to 9, characterized in that the antithrombin III adsorption is carried out at a pH between 7.0 and 9.1, preferably at a pH between 7.0 and 8.0.

11. The method according to item 1 and 10, characterized in that the adsorption time is 3 minutes to 24 hours, preferably 15 to 30 minutes.

12. The method according to item 1 to 11, characterized in that the removal of associated proteins citrate hypotonic to hypertonic washing liquids having a pH between 5.5 and 9.1, preferably having a pH between 7.0 and 8.0 are used a complexing agent, preferably Chelaplex III in a concentration of 0.001 to 0.05 mol / l.

13. The method according to item 1 and item 12, characterized in that preferably sodium chloride is used as the neutral electrolyte.

14. The method according to item 1 and items 12 to 13, characterized in that the washing liquid contains glycine, preferably in a concentration between 0.05 and 0.25 mol / l.

15. The method according to item 1 and items 12 to 14, characterized in that the Waschflüssigkeit be added up to 11E heparin / ml.

16. The method according to item 1 to 15, characterized in that a 0.50 to 2.0 mol / l sodium citrate buffer solution is used to release the antithrombin III from the alumina hydrate.

17. The method according to item 1 and 16, characterized in that the elution of the antithrombin III at a pH between 7.0 and 9.1, preferably at a pH between 7.0 and 8.0 occurs.

18. The method according to Punkti and items 16 to 17, characterized in that the elution buffer containing a complexing agent, preferably Chelaplex 111 in a concentration between 0.001 and

• 0.05 mol / l.

19. Method according to item 1 and items 16 to 18, characterized in that glycine is added to the elution buffer to a concentration of 0.25 mol / l.

20. The method according to item 1 and items 16 to 19, characterized in that the elution buffer contains heparin in a concentration up to 2 ΙΕ / ml.

21. The method according to item 1 and item 16 to 20, characterized in that instead of sodium citrate potassium citrate in a concentration of 0.50 to 2.0 mol / l is used to release the antithrombin III.

22. The method according to item 1 and item 16 to 20, characterized in that instead of sodium citrate ammonium citrate in a concentration of 0.5 to 2.0 mol / l is used to release the antithrombin III.

23. The method according to item 1 and item 10 to 22, characterized in that the method steps adsorption, washing out of accompanying proteins and elution of the antithrombin III at temperatures between -2 ° C and 25 ° C, preferably at temperatures between 4 ° C and 15 ⁰ C, be performed.