JP5903017B2 - 定量方法、定量装置及び定量用キット - Google Patents
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Description
本発明は、リムルス試薬を活性化する反応及び／又はＡＴＰとルシフェリン若しくはルシフェリン誘導体（以下単に「ルシフェリン」という。）とルシフェラーゼ若しくはルシフェラーゼ変異体（以下単に「ルシフェラーゼ」という。）とによる生物化学発光反応を用いて被測定試料中の測定対象成分の量を測定する定量方法、定量装置及び定量キットに関するものである。
従来、食品衛生、医療、医薬品、臨床検査、環境など幅広い分野において、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）量を測定することが行われている。ＡＴＰはすべての生物の細胞内に含まれ、ＡＴＰ量は細胞数と相関があるため、ＡＴＰ量を測定することで細胞数や生菌等の定量を行うことができる。
ＡＴＰ量を測定する方法としては、ＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いて測定する生物化学発光法がある（特許文献１）。
この生物化学発光法により生菌等を定量するためには、その細胞中のＡＴＰをＡＴＰ抽出試薬を用いて抽出した後、発光試薬としてルシフェラーゼとルシフェリンとを作用させて、生物化学発光反応による発光量を発光検出器により測定する。そして、この発光量がＡＴＰ量と相関することを利用してＡＴＰ量を測定し、そのＡＴＰ量から生菌等を定量する。生化学研究の分野などにおいて、試料中のＡＴＰ量自体を測定の目的とする場合にも、生物化学発光法によるＡＴＰ量の測定が行われる。
また、従来、医療、医薬品、臨床検査などの分野において、生体試料（血液、尿、体液、組織、付着物その他の生体から採取した試料）、或いは医薬品（本明細書では医薬部外品を含む概念とする。）又はその原材料（本明細書では原材料そのものの他、溶媒、中間生成物等を含む概念とする。）に含まれるエンドトキシン量を測定することや医療用具（注射器、透析膜等）の製造においてエンドトキシンが混入していないことを確認することなどが行われている。エンドトキシンが体内に入ると、発熱、ショック、多臓器不全などを引き起こしたりする。そのため、生体試料中のエンドトキシン量を測定してこれらの診断をすること、又は上記医薬品やその原材料などに含まれるエンドトキシン量、或いはそれらの製造工程や医療用具の製造工程におけるエンドトキシン量を測定して、エンドトキシンが体内に注入されることを未然に防ぐことは重要である。
エンドトキシン量を測定する方法としては、カブトガニの血球抽出液（以下、「リムルス試薬」という。）の成分であるリムルス反応系がエンドトキシンにより活性化されるプロセスを利用したリムルステストがある（特許文献２）。そして、このリムルステストには、判定又は測定方法の違いから、ゲル化転倒法、比濁法、比色法、生物化学発光法がある。
ゲル化転倒法及び比濁法によるエンドトキシン量の測定は、エンドトキシンによりリムルス試薬が活性化されることで試料がゲル化する反応を利用することによりエンドトキシン量を判定又は測定する。
比色法によるエンドトキシン量の測定は、エンドトキシンによりリムルス試薬が活性化されることで発色基を遊離する発色合成基質を用い、遊離した発色基の量を吸光度又は透過光量の測定によって比色定量する。そして、この遊離した発色基の量がエンドトキシン量と相関することを利用して、エンドトキシン量を測定する。
生物化学発光法によるエンドトキシン量の測定は、エンドトキシンによりリムルス試薬が活性化されることでルシフェリンを遊離する発光合成基質を用い、遊離したルシフェリンを、前述の生物化学発光反応によるＡＴＰ量の測定原理を利用して測定する。即ち、リムルス反応系により遊離させたルシフェリンに、ＡＴＰとルシフェラーゼを作用させて生物化学発光反応による発光量を測定する。そして、この発光量がエンドトキシン量と相関することを利用して、エンドトキシン量を測定する。
また、従来、医療、医薬品、臨床検査、食品産業などの分野において、βグルカンを測定することが行われている。例えば、深在性真菌症が疑われる患者に対する治療方法の選択や治療効果の判定などのために、βグルカン量を測定することは重要である。βグルカン量を測定する方法としては、上記エンドトキシン量の測定と同様、ゲル化転倒法、比濁法、比色法、生物化学発光法によるリムルステストがある（特許文献３）。それぞれの方法は、リムルス反応系がβグルカンにより活性化されるプロセスを利用している点が上記エンドトキシン量の測定の場合と異なるが、それぞれの測定原理は上記エンドトキシン量の測定の場合と概略同様である。
上述の各種方法は、従来から広く用いられているが、試料中の妨害成分により測定精度が低下することがある。例えば、試料が透析液や血液である場合、上述の各種方法によりＡＴＰ、エンドトキシン又はβグルカンの量を測定すると、試料中の妨害成分であるナトリウムイオンによって測定に必要な反応が阻害される。このため、純水に既知量（濃度）の測定対象成分（ＡＴＰ、エンドトキシン又はβグルカン）を添加して調製した標準液を用いて作成した検量線により、試料中の測定対象成分の定量を行うと、実際よりも低い測定結果となる（図７）。
本発明者の検討によると、ＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応がナトリウムイオンによって阻害される。従って、生物化学発光反応を用いたＡＴＰ量、エンドトキシン量、βグルカン量の測定は、ナトリウムイオンにより妨害される。
また、エンドトキシン、βグルカンによるリムルス試薬の活性化がナトリウムイオンによって阻害される。従って、これによっても生物化学発光反応を用いたエンドトキシン量、βグルカン量の測定は妨害され、更にゲル化転倒法、比濁法、比色法によるリムルステストを用いたエンドトキシン量、βグルカン量の測定も妨害される。
この問題に対して、試料を十分に希釈して妨害成分の影響を抑制することが行われることがあるが、試料の希釈により感度が低下するという問題がある。
従って、本発明の目的は、生体試料や医薬品或いは食品などのナトリウムイオンを含有する試料について高感度、高精度の測定を行うことができる定量方法及び定量装置を提供することである。
また、本発明の他の目的は、ナトリウムイオンを含有する試料と水などのナトリウムイオンを実質的に含有しないか又は含有量がより少ない試料のいずれについても、同じ１つの検量線を用いて、高感度、高精度の測定を行うことのできる定量装置及び上記定量方法や定量装置に使用できる定量用キットを提供することである。
上記目的は本発明に係る定量方法、定量装置及び定量用キットにて達成される。要約すれば、第１の本発明は、水に異なる濃度の測定対象成分が添加された複数の標準液であって、それぞれにナトリウムイオン含有量が被測定試料のナトリウムイオン含有量と同等となるようにＮａＣｌを添加した複数の標準液を、リムルス試薬を活性化する反応及び／又はＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法により測定し、その測定値と前記測定対象成分の量との関係を表す検量線を作成する検量線作成工程と、前記検量線作成工程で用いた方法と同一の方法により前記被測定試料を測定する試料測定工程と、前記検量線を用いて前記試料測定工程における測定値から前記被測定試料中の前記測定対象成分の量を求める定量工程と、を含む定量方法である。
第２の本発明は、水に異なる濃度の測定対象成分が添加された複数の標準液であって、それぞれにナトリウムイオン含有量が被測定試料のナトリウムイオン含有量と同等となるようにＮａＣｌを添加した前記複数の標準液を、リムルス試薬を活性化する反応及び／又はＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法により測定し、その測定値と前記測定対象成分の量との関係を表す検量線を作成する検量線作成手段と、前記検量線作成手段が用いた方法と同一の方法により前記被測定試料を測定する試料測定手段と、前記検量線を用いて前記試料測定手段による測定値から前記被測定試料中の前記測定対象成分の量を求める定量手段と、を有する定量装置である。
第３の本発明は、リムルス試薬を活性化する反応及び／又はＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法により、被測定試料中の測定対象成分の量を定量するため、又は、該定量に用いる検量線を作成するための定量用キットであって、前記被測定試料又は前記検量線作成のための標準液に添加するＮａＣｌを有する定量用キットである。
本発明によれば、生体試料や医薬品或いは食品などのナトリウムイオンを含有する試料について高感度、高精度の測定を行うことができる。また、本発明によれば、ナトリウムイオンを含有する試料と水などのナトリウムイオンを実質的に含有しないか又は含有量がより少ない試料のいずれについても、同じ１つの検量線を用いて、高感度、高精度の測定を行うことができる。
以下、本発明に係る定量方法、定量装置及び定量キットを図面に則して更に詳しく説明する。
１．定量方法
本発明に係る定量方法は、次の各工程を含むものである。
（ａ）ナトリウムイオン含有量が被測定試料のナトリウムイオン含有量と同等となるようにナトリウムイオンを添加した標準液を、リムルス試薬を活性化する反応及び／又はＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法により測定し、その測定値と測定対象成分の量との関係を表す検量線を作成する検量線作成工程。
（ｂ）検量線作成工程で用いた方法と同一の方法により被測定試料を測定する試料測定工程。
（ｃ）検量線を用いて試料測定工程における測定値から被測定試料中の測定対象成分の量を求める定量工程。
本発明に係る定量方法は、次の各工程を含むものである。
（ａ）ナトリウムイオン含有量が被測定試料のナトリウムイオン含有量と同等となるようにナトリウムイオンを添加した標準液を、リムルス試薬を活性化する反応及び／又はＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法により測定し、その測定値と測定対象成分の量との関係を表す検量線を作成する検量線作成工程。
（ｂ）検量線作成工程で用いた方法と同一の方法により被測定試料を測定する試料測定工程。
（ｃ）検量線を用いて試料測定工程における測定値から被測定試料中の測定対象成分の量を求める定量工程。
測定対象成分は、上記（ａ）の検量線作成工程及び（ｂ）の試料測定工程において用いる方法により異なり、リムルス試薬を活性化する反応を用いた方法により測定する場合は、エンドトキシン又はβグルカンを挙げることができる。また、ＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法により測定する場合は、ＡＴＰを挙げることができる。更に、リムルス試薬を活性化する反応及びＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法により測定する場合は、エンドトキシン又はβグルカンを挙げることができる。
また、ＡＴＰを測定対象成分とする場合には、被測定試料中の生菌等の定量を最終的な目的として、生菌等からＡＴＰを抽出して測定する場合を含むものとすることができる。この場合、上記工程によりＡＴＰ量を測定した後、最終的な定量目的の生菌数とＡＴＰ量との関係を表す検量線から、当該生菌数を求めることができる。或いは、（ａ）で求めた検量線、及び生菌数とＡＴＰ量との関係を表す検量線から、発光量と生菌数との関係式を作成するなどして、生菌数を求めることもできる。なお、生菌等の細胞中のＡＴＰは、ＡＴＰ抽出試薬を用いて抽出することができる。
これらの測定は以下の原理に基づくものであるが、周知の測定方法であるため詳細な説明は省略する。
（１）リムルス試薬を活性化する反応を用いた方法によるエンドトキシン量の測定（以下「リムルス試薬によるエンドトキシン量の測定」ともいう。）
リムルス試薬に含まれるカブトガニの血球抽出液（ＬＡＬ：Limulus Amebocyte Lysate）には、エンドトキシンによって開始される連鎖反応系であるＣ因子リムルス反応系が存在する。エンドトキシンはＣ因子を活性化する。活性化されたＣ因子は、リムルス反応系のＢ因子を活性化する。活性化されたＢ因子は、リムルス反応系の凝固酵素前駆体を活性化し、凝固酵素を生成させる。この生成した凝固酵素の作用によりゲル化が生じる。
リムルス試薬に含まれるカブトガニの血球抽出液（ＬＡＬ：Limulus Amebocyte Lysate）には、エンドトキシンによって開始される連鎖反応系であるＣ因子リムルス反応系が存在する。エンドトキシンはＣ因子を活性化する。活性化されたＣ因子は、リムルス反応系のＢ因子を活性化する。活性化されたＢ因子は、リムルス反応系の凝固酵素前駆体を活性化し、凝固酵素を生成させる。この生成した凝固酵素の作用によりゲル化が生じる。
リムルス試薬によるエンドトキシン量の測定は、上述のようなプロセスを利用したものであり、ゲル化した試料の状態の測定（ゲル化転倒法）又は濁度の測定（比濁法）により行うことができる。或いは、発色合成基質を上記反応系に加えて発色基を遊離させ、その量を吸光度又は透過光量により測定すること（比色法）によりエンドトキシン量を測定することもできる。
（２）リムルス試薬を活性化する反応を用いた方法によるβグルカン量の測定（以下「リムルス試薬によるβグルカン量の測定」ともいう。）
リムルス試薬に含まれるカブトガニの血球抽出液には、βグルカンによって開始される連鎖反応系であるＧ因子リムルス反応系が存在する。βグルカンはＧ因子を活性化する。活性化されたＧ因子は、リムルス反応系の凝固酵素前駆体を活性化し、凝固酵素を生成させる。この生成した凝固酵素の作用によりゲル化が生じる。
リムルス試薬に含まれるカブトガニの血球抽出液には、βグルカンによって開始される連鎖反応系であるＧ因子リムルス反応系が存在する。βグルカンはＧ因子を活性化する。活性化されたＧ因子は、リムルス反応系の凝固酵素前駆体を活性化し、凝固酵素を生成させる。この生成した凝固酵素の作用によりゲル化が生じる。
リムルス試薬によるβグルカン量の測定は、上述のようなプロセスを利用したものであり、エンドトキシン量の測定と同様に、ゲル化転倒法又は比濁法、或いは比色法によりβグルカン量を測定することができる。
（３）ＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法によるＡＴＰ量の測定（以下「生物化学発光法によるＡＴＰ量の測定」ともいう。）
ＡＴＰは、Ｍｇ2+（２価金属イオン）の存在下で、ルシフェラーゼの作用でルシフェリンと反応して、ＡＭＰとオキシルシフェリンとピロリン酸を生成する。その際に発生する光の発光量がＡＴＰ量と相関するので、これを利用してＡＴＰ量を測定することができる。
ＡＴＰは、Ｍｇ2+（２価金属イオン）の存在下で、ルシフェラーゼの作用でルシフェリンと反応して、ＡＭＰとオキシルシフェリンとピロリン酸を生成する。その際に発生する光の発光量がＡＴＰ量と相関するので、これを利用してＡＴＰ量を測定することができる。
（４）リムルス試薬を活性化する反応及びＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法によるエンドトキシン量の測定（以下「生物化学発光法によるエンドトキシン量の測定」ともいう。）
生物化学発光法によるエンドトキシン量の測定は、（１）で説明したのと同じリムルス反応系のプロセスに、（３）で説明した生物化学発光法によるＡＴＰ量の測定を応用したものである。即ち、発光基質であるルシフェリンを含有する発光合成基質をリムルス反応系に加え、エンドトキシンによるリムルス反応系の活性化によりルシフェリンを遊離させる。この遊離したルシフェリンにＡＴＰとルシフェラーゼを作用させて生物化学発光反応による発光量を測定する。発光量は遊離されたルシフェリン量（リムルス反応系の活性化の程度）と相関するので、結果としてエンドトキシン量を測定することができる。
生物化学発光法によるエンドトキシン量の測定は、（１）で説明したのと同じリムルス反応系のプロセスに、（３）で説明した生物化学発光法によるＡＴＰ量の測定を応用したものである。即ち、発光基質であるルシフェリンを含有する発光合成基質をリムルス反応系に加え、エンドトキシンによるリムルス反応系の活性化によりルシフェリンを遊離させる。この遊離したルシフェリンにＡＴＰとルシフェラーゼを作用させて生物化学発光反応による発光量を測定する。発光量は遊離されたルシフェリン量（リムルス反応系の活性化の程度）と相関するので、結果としてエンドトキシン量を測定することができる。
（５）リムルス試薬を活性化する反応及びＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法によるβグルカン量の測定（以下「生物化学発光法によるβグルカン量の測定」ともいう。）
生物化学発光法によるβグルカン量の測定は、（４）と同様に、リムルス反応系のプロセスに、生物化学発光法によるＡＴＰ量の測定を応用したものである。即ち、ルシフェリンを含有する発光合成基質をリムルス反応系に加え、βグルカンによるリムルス反応系の活性化によりルシフェリンを遊離させ、生物化学発光反応による発光量を測定することによりβグルカン量を測定する。
生物化学発光法によるβグルカン量の測定は、（４）と同様に、リムルス反応系のプロセスに、生物化学発光法によるＡＴＰ量の測定を応用したものである。即ち、ルシフェリンを含有する発光合成基質をリムルス反応系に加え、βグルカンによるリムルス反応系の活性化によりルシフェリンを遊離させ、生物化学発光反応による発光量を測定することによりβグルカン量を測定する。
前述のように、ＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼによる生物化学発光反応は、ナトリウムイオンによって阻害される。従って、生物化学発光法によるＡＴＰ量、エンドトキシン量、βグルカン量の測定は、ナトリウムイオンにより妨害される。
また、エンドトキシン、βグルカンによるリムルス反応系の活性化は、ナトリウムイオンによって阻害される。従って、リムルス試薬によるエンドトキシン量、βグルカン量の測定及び生物化学発光法によるエンドトキシン量、βグルカン量の測定は妨害される。
例えば、透析液や血液などの比較的高濃度でナトリウムイオンを含む試料について、生物化学発光法によるＡＴＰ量、エンドトキシン量又はβグルカン量の測定を行う場合、ナトリウムイオンを含まない純水等の溶媒に既知量（濃度）の測定対象成分（ＡＴＰ、エンドトキシン又はβグルカン）を添加して調製した標準液を用いて作成した検量線から、試料中の測定対象成分の量を定量すると、実際よりも低い測定結果となる（図７）。
そこで、本発明に係る定量方法は、（ａ）の検量線作成工程において、ナトリウムイオン含有量が被測定試料のナトリウムイオン含有量と同等となるようにナトリウムイオンを添加した標準液の測定を行い、その測定値をもとに検量線を作成する。つまり、透析液や血液など妨害成分（ナトリウムイオン）を多く含む試料の定量に先立って、被測定試料に含まれる妨害成分の量と同等になるように妨害成分を添加した標準液を測定した結果に基づき検量線を作成し、この検量線を用いて試料中の測定対象成分の定量を行うことにより、妨害成分の影響をキャンセルしようとするものである。
上記（ａ）の検量線作成工程において、標準液は、被測定試料中の測定対象成分の量に応じて、所望の測定精度が得られるように、所望の含有量（濃度）刻み幅で、所望の含有量（濃度）範囲にわたり用意する。そして、上記（ａ）の検量線作成工程における測定は、上記（ｂ）の試料測定工程における測定と実質的に同一の条件（測定対象成分を除く反応系の各成分の含有量（濃度）、反応温度、反応時間など）で行うことが好ましい。条件を揃えることによって、より高感度、高精度な測定を行うことができる。 被測定試料は、注射剤、輸液又は透析液など医療現場で使用される薬剤、目薬等の外用薬、各種の内服薬等の医薬品、水（常水、ＲＯ水、精製水、滅菌精製水、滅菌水、注射用水（注射用蒸留水）、純水、超純水、逆浸透水等）、医療用具や医療機器からの採取物、クリーンルームからの採取物、血液（全血、血清、血漿）又は尿などの生体試料（臨床試料）などである。また、食品加工や食品衛生、環境分野での各種試料を被測定試料とすることもできる。
また、被測定試料のナトリウムイオン含有量と同等であるとは、所望の測定精度に応じて、ナトリウムイオンが測定結果に与える影響を抑制し得る程度に等しい量である。詳しくは後述するように、本発明者の検討によれば、被測定試料に対する標準液のナトリウム含有量が−５０％〜＋７５％の範囲内にあれば、ナトリウムイオンが測定結果に与える影響を抑制することができる。好ましくは−１５％〜＋２５％、より好ましくは−５％〜＋１０％の範囲内とする。
なお、同じ検量線で高感度、高精度な測定を行うためには、透析液や血液などのナトリウムイオンを含有する試料のそれぞれは、ナトリウムイオン含有量が同等であることが必要である。この場合も、ナトリウムイオン含有量が同等であることの意義は、上述と同様である。ただし、例えば、透析液と血液など、ナトリウムイオン含有量が同等であれば、種類の異なる試料であっても、同じ検量線で高感度、高精度な測定を行うことができる。
また、上記（ａ）の検量線作成工程において、ナトリウムイオンは、好ましくは塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を添加することによって標準液又は被測定試料に添加する。また、標準液又は被測定試料にナトリウムイオンを添加するとは、標準液又は試料にＮａＣｌなどのナトリウムイオン源を乾燥薬剤又は溶液として投入又は注入することに限定されない。例えば、ＮａＣｌなどのナトリウムイオン源が乾燥薬剤又は溶液として収容された容器に標準液又は被測定試料を注入する方法でもよい。また、標準液又は被測定試料自体（又はこれらが希釈された希釈液）に投入又は注入される他の試薬（例えば、緩衝液、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、２価金属イオン、発光合成基質又は発色合成基質など）にＮａＣｌなどのナトリウムイオン源が含有されており、当該試薬が投入又は注入されることで実質的に標準液又は被測定試料に所定のナトリウムイオン量となるようにナトリウムイオンが添加される方法でもよい。
２．定量装置
本発明に係る定量装置は、前述の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の工程を含む。図１は、本発明に係る定量装置の一実施形態の概略機能ブロックを示す。
本発明に係る定量装置は、前述の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の工程を含む。図１は、本発明に係る定量装置の一実施形態の概略機能ブロックを示す。
図１に示すように、定量装置１００は、測定を実行する測定部１０１、測定動作の制御を行う制御部１０２、情報を記憶する記憶部１０３、制御部１０２に情報を入力するための入力部１０４、制御部１０２からの情報を出力する出力部１０５などを有する。
測定部１０１は、前述の（ａ）の検量線作成工程及び（ｂ）の試料測定工程において用いる方法に応じて構成される。例えば、生物化学発光法によるＡＴＰ量、エンドトキシン量又はβグルカン量の測定方法を用いる場合には、測定部１０１は、反応容器、発光検出器、被検液（被測定試料、標準液）供給手段、試薬供給手段などで構成することができる。また、リムルス試薬によるエンドトキシン量又はβグルカン量の測定方法を用いる場合、例えば比濁法又は比色法を採用するときには、測定部１０１は、反応容器、吸光光度計（透過光測定器）、被検液供給手段、試薬供給手段などで構成することができる。
制御部１０２は、定量装置１００の動作を統括的に制御するものであってよく、入力部１０４からの指示情報に応じて、記憶部１０３に記憶されたプログラムや各種設定情報に従って測定部１０１をシーケンス制御すると共に、測定部１０１による測定結果の処理を行い、出力部１０５に測定結果情報を出力するように、マイクロコンピュータなどで構成することができる。
記憶部１０３は、制御部１０２が用いる制御プログラムや各種設定情報、制御部１０２が求めた測定結果情報などの各種情報を記憶するように、電子的なメモリなどで構成することができる。
入力部１０４は、制御部１０２に各種設定情報や測定の開始・停止の指示情報などの各種情報を入力するための、定量装置１００に設けられた入力キーなどを有する操作部などで構成することができる。或いは、入力部１０４は、定量装置１００の外部の機器からの上記同様の情報を受信して制御部１０２に送信するインターフェース部であってもよい。
出力部１０５は、各種設定情報や測定結果情報を表示する液晶ディスプレイなどの表示部、又は同様の情報をプリントアウトするプリンター部などで構成することができる。或いは、出力部１０５は、制御部１０２からの上記同様の情報を受信して定量装置１００の外部の機器に送信するインターフェース部であってもよい。
次に、本発明の一実施形態に係る定量装置を用いて、透析液及び透析液を調製するための溶液（原液希釈用のＲＯ水）に含まれるエンドトキシン量を定量する場合について説明する。
（検量線作成工程）
この定量装置では、透析液及びＲＯ水（被測定試料）中のエンドトキシン（測定対象成分）の定量に先立ち、以下の要領で検量線の作成を行う。
この定量装置では、透析液及びＲＯ水（被測定試料）中のエンドトキシン（測定対象成分）の定量に先立ち、以下の要領で検量線の作成を行う。
エンドトキシン量が異なる２以上の標準液のそれぞれに、標準液のナトリウムイオン含有量が、透析液のナトリウムイオン含有量と同等となるようにナトリウムイオンを添加する。具体的には、透析液に含まれるナトリウムイオンは約１４０ｍｍｏｌ／Ｌであるため、それぞれの標準液のナトリウムイオン濃度が１４０ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにナトリウムイオンを添加する。
次に、前述のリムルス試薬によるエンドトキシン量の測定又は生物化学発光法によるエンドトキシン量の測定により、それぞれの標準液を測定して、検量線を作成する。
この際、制御部１０２は、記憶部１０３に記憶された制御プログラムや各種設定情報に従って、標準液について上記測定を測定部１０１に実行させ、取得した測定結果から検量線を作成して記憶部１０３に記憶させる。この検量線は、被測定試料中の測定対象成分の定量に用いられる。
（試料測定工程）
測定方法及び条件を前述の検量線作成工程と同一として、透析液及びＲＯ水をそれぞれ測定する。
測定方法及び条件を前述の検量線作成工程と同一として、透析液及びＲＯ水をそれぞれ測定する。
ここで、検量線作成工程において標準液のナトリウムイオン含有量の基準とした透析液を測定するときは、ナトリウムイオンを添加しない。一方、ナトリウムイオン含有量が透析液のナトリウムイオン含有量よりも少ないＲＯ水を測定するときには、検量線作成工程と同様に、ナトリウムイオン濃度が１４０ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにナトリウムイオンを添加してから測定を行う。
この際、制御部１０２は、記憶部１０３に記憶された制御プログラムや各種設定情報に従って、被測定試料について上記測定を実行させる。測定部１０１によって取得された測定結果の情報は、記憶部１０３に記憶され、被測定試料中の測定対象成分の定量に用いられる。
（定量工程）
試料測定工程で測定した透析液の測定値及びＲＯ水の測定値は、いずれも、前述の検量線作成工程で作成した１つの検量線を用いてエンドトキシン量に換算される。
試料測定工程で測定した透析液の測定値及びＲＯ水の測定値は、いずれも、前述の検量線作成工程で作成した１つの検量線を用いてエンドトキシン量に換算される。
このような工程によって定量を行うことにより、透析液については妨害成分であるナトリウムイオンの影響を受けることなく高感度、高精度な測定を行うことができる。また、同じ１つの検量線を用いて、ナトリウムイオンをほとんど含まないＲＯ水についても、正確な測定を行うことができる。
例えば、オペレーターの入力によって、ナトリウムイオンを添加してから被測定試料を測定すべきか否かの情報を装置に与えることができる。また、あらかじめ、複数の被測定試料の導入順序とナトリウムイオン添加の有無とを、動作シーケンスとして設定しておくようにすることもできる。さらには、定量装置内にナトリウムイオン測定手段（例えば、イオン電極や導電率計）を備え、その測定値に応じて、ナトリウムイオンの添加の必要性や添加するナトリウムイオン量を自動的に判断させるようにすることや、外部からの信号（例えば、定量装置とは別に設けたイオン濃度計や導電率計からの信号）に応じて自動的に判断させるようにすることもできる。
また、被測定試料は２種類に限られず、３以上の試料について、ナトリウムイオンの添加をコントロールして測定することができる。例えば、医薬品製造工程において、完成品、中間生成物、原材料の３種を被測定試料とする場合に、ナトリウムイオン含有量が、中間生成物＞完成品＞原材料であれば、中間生成物のナトリウムイオン含有量を基準として検量線作成工程の検量線を作成し、完成品及び原材料の測定の際には中間生成物のナトリウムイオン含有量と同等となるようにナトリウムイオンを添加して測定すればよい。また、完成品のナトリウムイオン含有量を基準として検量線作成工程の検量線を作成し、完成品及び中間生成物の測定の際にはナトリウムイオンを添加せずに測定し、原材料の測定の際には完成品のナトリウムイオン含有量と同等となるようにナトリウムイオンを添加して測定することもできる。
このように、被測定試料は、ナトリウムイオン含有量の異なる複数の試料であってよい。この場合、検量線作成工程では、複数の試料のうち任意の試料のナトリウムイオン含有量と同等となるようにナトリウムイオンを添加した標準液を測定して検量線を作成することができる。そして、試料測定工程では、上記任意の試料及びナトリウムイオン含有量が上記任意の試料と同等以上の試料にはナトリウムイオンを添加せずに該試料を測定する。一方、ナトリウムイオン含有量が上記任意の試料と同等未満の試料には上記任意の試料のナトリウムイオン含有量と同等となるようにナトリウムイオンを添加してから該試料を測定する。
３．定量用キット
本発明に係る定量用キットについて説明する。
本発明に係る定量用キットについて説明する。
本発明に係る定量用キットは、上述の定量方法又は定量装置に好適に使用することができる。即ち、リムルス試薬を活性化する反応及び／又はＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法により被測定試料中の測定対象成分の量を定量する際、又は、その定量に用いる検量線を作成する際に、所定量のナトリウムイオンを被測定試料又は検量線作成のための標準液に供給するナトリウムイオン源を有する。
例えば、前述のように透析液中のエンドトキシン量を測定することに加えて、原液希釈用のＲＯ水中のエンドトキシン量を測定する場合、定量用キットは、透析液とＲＯ水について同じ１つの検量線を用いて測定することができるように、標準液とＲＯ水とに、これらのナトリウムイオン含有量が透析液のナトリウムイオン含有量と同等となるようにナトリウムイオンを供給するための、ナトリウムイオン源を有する構成とする。
透析液のナトリウムイオン濃度は、約１４０ｍｍｏｌ／Ｌであり、標準液やＲＯ水はナトリウムイオンをほとんど含まない。したがって、定量用キットを用いた測定に供する標準液やＲＯ水の量を常に一定量とすることにすれば、定量用キットが供給すべき所定量のナトリウムイオン量も常に一定量でよいこととなり、その量は簡単に算出することができる。つまり、被測定試料のナトリウムイオン濃度と定量用キットを用いた測定に供する液体量に応じて、定量用キットのナトリウムイオン供給量を適宜決定することができる。
本発明に係る定量用キットは、被測定試料を、血液などの生体試料とする場合や、注射剤、輸液、透析液、目薬、生理食塩水等とする場合に特に好適に用いることができる。これらのナトリウムイオン濃度はほぼ一定であり、その濃度から求めたナトリウムイオン量を供給することができる定量用キットを量産して使用することができるからである。
具体的には、血液のナトリウムイオン濃度は約１３５〜１４５ｍｍｏｌ／Ｌであり、透析液のナトリウムイオン濃度は約１４０ｍｍｏｌ／Ｌであり、生理食塩水のナトリウムイオン濃度は約１５５ｍｍｏｌ／Ｌであることから、これらを基準として算出したナトリウムイオン量を供給することができる定量用キットとすることができる。そのため、定量用キットのナトリウムイオン源は、被測定試料又は検量線作成のための標準液のナトリウムイオン濃度が１３５〜１５５ｍ ｍｏｌ／Ｌとなるようにナトリウムイオンを供給することが好ましい。
更に説明すると、例えば、図２に示すように、定量用キット１０は、ナトリウムイオン源としてＮａＣｌが乾燥薬剤又は溶液として収容された第１の容器１を有していてよい。第１の容器１には更に、ｐＨ緩衝作用物が乾燥薬剤又は溶液（緩衝液）として収容されていてよい。そして、この第１の容器１に、標準液、或いはナトリウムイオンを含有しないか又は含有量がより少ない水などの試料が注入されるようにすることができる。
また、定量用キット１０は更に、ナトリウムイオン源が収容されていない第２の容器２を有していてよい。第２の容器２には更に、ｐＨ緩衝作用物が乾燥薬剤又は溶液（緩衝液）として収容されていてよい。そして、この第２の容器２に、ナトリウムイオンを含有する透析液などの試料が注入されるようにすることができる。
試料や標準液が注入された第１の容器１と第２の容器２の内容物のナトリウムイオン濃度は同等となるように設定される。そして、この第１の容器１、第２の容器２内の試料や標準液を用いて測定する。
４．実施例
次に、本発明をより具体的な実施例に則して更に説明する。
次に、本発明をより具体的な実施例に則して更に説明する。
（実施例１）
生物化学発光法によるＡＴＰ量の測定におけるナトリウムイオンの影響及びその影響を抑制する効果について確認した。
生物化学発光法によるＡＴＰ量の測定におけるナトリウムイオンの影響及びその影響を抑制する効果について確認した。
本実施例では、異なる濃度に希釈したＡＴＰを含むＡＴＰ含有液を、溶媒として水、透析液、ＮａＣｌ水溶液を用いてそれぞれ調製し、各ＡＴＰ含有液についてＡＴＰ濃度と生物化学発光反応による発光量との関係を求めた。
・試薬
ＡＴＰ標準液として、東亜ディーケーケー社製ＡＦ−２Ａ１を用いた。このＡＴＰ標準液は、概略、０．０２５ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に１×１０-7ＭのＡＴＰが溶解されたものである。また、水として、注射用水（大塚製薬社製大塚蒸留水）を用いた。ルシフェリン、ルシフェラーゼ変異体として、これらを含有する発光試薬（バイオエネックス社製のルシフェラーゼＦＭ＋）を用いた。透析用剤として、キンダリー３Ｄ（扶桑薬品工業社製）を用いた。キンダリー３Ｄは、透析液のＡ剤が電解質分であるＡ−１剤と、グルコース（非電解質）分であるＡ−２とで構成されるものである。
ＡＴＰ標準液として、東亜ディーケーケー社製ＡＦ−２Ａ１を用いた。このＡＴＰ標準液は、概略、０．０２５ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に１×１０-7ＭのＡＴＰが溶解されたものである。また、水として、注射用水（大塚製薬社製大塚蒸留水）を用いた。ルシフェリン、ルシフェラーゼ変異体として、これらを含有する発光試薬（バイオエネックス社製のルシフェラーゼＦＭ＋）を用いた。透析用剤として、キンダリー３Ｄ（扶桑薬品工業社製）を用いた。キンダリー３Ｄは、透析液のＡ剤が電解質分であるＡ−１剤と、グルコース（非電解質）分であるＡ−２とで構成されるものである。
・方法
透析液は、キンダリー３ＤのＡ剤とＢ剤とを、処方に従って注射用水を用いて溶解して調製した。このキンダリー３Ｄのナトリウムイオン濃度は、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ（１４０ｍＥｑ／Ｌ）である。
透析液は、キンダリー３ＤのＡ剤とＢ剤とを、処方に従って注射用水を用いて溶解して調製した。このキンダリー３Ｄのナトリウムイオン濃度は、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ（１４０ｍＥｑ／Ｌ）である。
ＮａＣｌ水溶液は、ＮａＣｌを注射用水で溶解して、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ（１４０ｍＥｑ／Ｌ）の濃度に調製した。即ち、このＮａＣｌ水溶液のナトリウムイオン濃度は、上記透析液のナトリウムイオン濃度と等しい。
ＡＴＰ含有液は、上記ＡＴＰ標準液を注射用水、透析液、ＮａＣｌ水溶液で希釈することにより、１×１０-14、１×１０-13、１×１０-12、１×１０-11、１×１０-10、１×１０-9、１×１０-8の濃度に調製した。
次に、各ＡＴＰ含有液の１００μＬを反応容器に移し、各反応容器に１００μＬの発光試薬を添加し、混合する。その後、その反応液について、発光検出器（浜松ホトニクス社製微弱発光計数装置）を用いて発光量を測定した。
・結果
結果を図３に示す。図３の横軸はＡＴＰ含有液のＡＴＰ濃度（ｍｏｌ／Ｌ）、縦軸は発光量（発光強度：ＲＬＵ）である。
結果を図３に示す。図３の横軸はＡＴＰ含有液のＡＴＰ濃度（ｍｏｌ／Ｌ）、縦軸は発光量（発光強度：ＲＬＵ）である。
溶媒として水を用いた場合、ＡＴＰ濃度と発光量との関係は、溶媒として透析液を用いた場合とは大きく異なる。特に、図３に示すように、各ＡＴＰ濃度における発光量は、溶媒として水を用いた場合よりも透析液を用いた場合の方が低い。従って、単に水に既知濃度のＡＴＰを添加して調製した標準液を用いて作成した検量線を用いて、透析液中のＡＴＰ量を定量すると、実際よりも低濃度の測定結果となる。
これに対して、溶媒としてＮａＣｌ水溶液を用いた場合、ＡＴＰ濃度と発光量との関係は、溶媒として透析液を用いた場合とほぼ一致する。従って、透析液と等しい濃度でナトリウムイオンを含有するＮａＣｌ水溶液に既知濃度のＡＴＰを添加して調製した標準液を用いて作成した検量線を用いることで、透析液中のＡＴＰ量を高精度に測定し得ることがわかる。また、ナトリウムイオンの影響を抑制するために試料を希釈しなくてよいため、高感度に測定し得ることがわかる。また、試料が例えばナトリウムイオンを含有しない水などである場合には、標準液と等しい（即ち、透析液と等しい）濃度でナトリウムイオンを含有するようにＮａＣｌを添加することで、その試料中のＡＴＰについても、透析液の場合と同じ検量線を用いて高感度、高精度に測定し得ることがわかる。
（実施例２）
生物化学発光法によるエンドトキシン量の測定におけるナトリウムイオンの影響及びその影響を抑制する効果について確認した。
生物化学発光法によるエンドトキシン量の測定におけるナトリウムイオンの影響及びその影響を抑制する効果について確認した。
本実施例では、異なる含有量に希釈したエンドトキシンを含むエンドトキシン含有液を、溶媒として水、透析液、ＮａＣｌ水溶液を用いてそれぞれ調製し、各エンドトキシン含有液についてエンドトキシン量と生物化学発光反応による発光量との関係を求めた。
・試薬
リムルス試薬（ＬＡＬ）として、エンドトキシン測定試薬である和光純薬社製リムルスＥＳ−IIを用いた。また、エンドトキシン標準物質として、和光純薬社製コントロールス
タンダードエンドトキシン（ＣＳＥ）を用いた。また、水として、注射用水（大塚製薬社製注射用水）を用いた。また、発光合成基質として、ベンゾイル−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ルシフェリンを用いた。ルシフェラーゼとしては、変異型ルシフェラーゼ（バイオエネックス社製ルシフェラーゼＦＭ）を用いた。透析用剤として、キンダリー３Ｄ（扶桑薬品工業社製）と、カーボスターＰ（味の素製薬社製）とを用いた。カーボスターＰは、透析液のＡ剤が１剤化されたものである。
リムルス試薬（ＬＡＬ）として、エンドトキシン測定試薬である和光純薬社製リムルスＥＳ−IIを用いた。また、エンドトキシン標準物質として、和光純薬社製コントロールス
タンダードエンドトキシン（ＣＳＥ）を用いた。また、水として、注射用水（大塚製薬社製注射用水）を用いた。また、発光合成基質として、ベンゾイル−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ルシフェリンを用いた。ルシフェラーゼとしては、変異型ルシフェラーゼ（バイオエネックス社製ルシフェラーゼＦＭ）を用いた。透析用剤として、キンダリー３Ｄ（扶桑薬品工業社製）と、カーボスターＰ（味の素製薬社製）とを用いた。カーボスターＰは、透析液のＡ剤が１剤化されたものである。
・方法
透析液は、キンダリー３Ｄ、カーボスターＰのそれぞれを、処方に従って注射用水を用いて溶解して調製した。このキンダリー３Ｄ、カーボスターＰの溶液のナトリウムイオン濃度は、それぞれ１４０ｍｍｏｌ／Ｌ（１４０ｍＥｑ／Ｌ）である。
透析液は、キンダリー３Ｄ、カーボスターＰのそれぞれを、処方に従って注射用水を用いて溶解して調製した。このキンダリー３Ｄ、カーボスターＰの溶液のナトリウムイオン濃度は、それぞれ１４０ｍｍｏｌ／Ｌ（１４０ｍＥｑ／Ｌ）である。
ＮａＣｌ水溶液は、ＮａＣｌを注射用水で溶解して、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ（１４０ｍＥｑ／Ｌ）の濃度に調製した。即ち、このＮａＣｌ水溶液のナトリウムイオン濃度は、上記透析液のナトリウムイオン濃度と等しい。
エンドトキシン含有液は、エンドトキシン標準物質を注射用水で溶解して、１０００ＥＵ／ｍＬの含有量に調製したものを原液として、この原液を注射用水、透析液、ＮａＣｌ水溶液で希釈することにより、０．００１、０．０１、０．１、１ＥＵ／ｍＬの含有量に調製した。
リムルス試薬は、２００μＬの注射用水を用いて調製した。
次に、各エンドトキシン含有液の５０μＬを反応容器に移し、各反応容器に２５μＬのリムルス試薬を添加し、混合した後、３７℃で２０分間加温した。
次に、各反応容器に、０．００１Ｍ酢酸マグネシウムと５％トレハロースを含む０．０４Ｍトリシン緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解した６．７×１０-5Ｍの発光合成基質を５０μＬ添加し、３７℃で５分間加温した。
次に、各反応容器に、０．０２５ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）に溶解した１０-6ＭのＡＴＰを５０μＬ、０．００１Ｍの酢酸マグネシウムと０．１５Ｍトレハロースを含む０．０４Ｍトリシン緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解したルシフェラーゼ（ＦＭ１ｇを４ｍＬに溶解）を５０μＬ添加し、その反応液について、発光検出器（東亜ディーケーケー社製ＡＦ−１００）を用いて発光量を測定した。
・結果
結果を図４に示す。図４の横軸はエンドトキシン含有液のエンドトキシン量（ＥＵ／ｍＬ）、縦軸は発光量（発光強度：ＲＬＵ）である。
結果を図４に示す。図４の横軸はエンドトキシン含有液のエンドトキシン量（ＥＵ／ｍＬ）、縦軸は発光量（発光強度：ＲＬＵ）である。
溶媒として水を用いた場合、エンドトキシン量と発光量との関係は、溶媒として透析液を用いた場合とは大きく異なる。特に、図４に示すように、各エンドトキシン量における発光量は、溶媒として水を用いた場合よりも透析液を用いた場合の方が低い。従って、単に水に既知量のエンドトキシンを添加して調製した標準液を用いて作成した検量線を用いて、透析液中のエンドトキシン量を定量すると、実際よりも低い測定結果となる。
これに対して、溶媒としてＮａＣｌ水溶液を用いた場合、エンドトキシン濃度と発光量との関係は、溶媒として透析液を用いた場合とほぼ一致する。従って、透析液と等しい濃度でナトリウムイオンを含有するＮａＣｌ水溶液に既知量のエンドトキシンを添加して調製した標準液を用いて作成した検量線を用いることで、透析液中のエンドトキシン量を高精度に測定し得ることがわかる。また、ナトリウムイオンの影響を抑制するために試料を希釈しなくてよいため、高感度に測定し得ることがわかる。また、試料が例えばナトリウムイオンを含有しない水などである場合には、標準液と等しい（即ち、透析液と等しい）濃度でナトリウムイオンを含有するようにＮａＣｌを添加することで、その試料中のエンドトキシンについても、透析液の場合と同じ検量線を用いて高感度、高精度に測定し得ることがわかる。
（実施例３）
比濁法によるリムルステストを用いたエンドトキシン量の測定におけるナトリウムイオンの影響及びその影響を抑制する効果について確認した。
比濁法によるリムルステストを用いたエンドトキシン量の測定におけるナトリウムイオンの影響及びその影響を抑制する効果について確認した。
本実施例では、異なる含有量に希釈したエンドトキシンを含むエンドトキシン含有液を、溶媒として水、透析液、ＮａＣｌ水溶液を用いてそれぞれ調製し、各エンドトキシン含有液についてエンドトキシン量と比濁法による反応時間の測定値との関係を求めた。
・試薬
リムルス試薬（ＬＡＬ）、エンドトキシン標準物質としては、実施例２と同じものを用いた。また、水としては実施例２と同じものを用いた。また、透析用剤としては、実施例１と同じキンダリー３Ｄを用いた。
リムルス試薬（ＬＡＬ）、エンドトキシン標準物質としては、実施例２と同じものを用いた。また、水としては実施例２と同じものを用いた。また、透析用剤としては、実施例１と同じキンダリー３Ｄを用いた。
・方法
透析液、ＮａＣｌ水溶液は、実施例１、２と同様にして調製した。
透析液、ＮａＣｌ水溶液は、実施例１、２と同様にして調製した。
エンドトキシン含有液は、エンドトキシン標準物質を注射用水で溶解して、１０００ＥＵ／ｍＬの含有量に調製したものを原液として、この原液を注射用水、透析液、ＮａＣｌ水溶液で希釈することにより、０．００１２５、０．００２５、０．００５、０．０１ＥＵ／ｍＬの含有量に調製した。
次に、各エンドトキシン含有液の２００μＬをリムルス試薬を含む反応容器に移し、その反応液について、測定装置（和光純薬社製ＥＴ−６０００）を用いて透過光量が所定の閾値（約９０％）に減少するまでの反応時間を測定した。
・結果
結果を図５に示す。図５の横軸はエンドトキシン含有液のエンドトキシン量（ｌｏｇ（ＥＵ／ｍＬ））、縦軸は反応時間（ｌｏｇ（分））である。
結果を図５に示す。図５の横軸はエンドトキシン含有液のエンドトキシン量（ｌｏｇ（ＥＵ／ｍＬ））、縦軸は反応時間（ｌｏｇ（分））である。
溶媒として水を用いた場合、エンドトキシン量と反応時間との関係は、溶媒として透析液を用いた場合とは大きく異なる。特に、図５に示すように、各エンドトキシン量における反応時間は、溶媒として水を用いた場合よりも透析液を用いた場合の方が長い。従って、単に水に既知量のエンドトキシンを添加して調製した標準液を用いて作成した検量線を用いて、透析液中のエンドトキシン量を定量すると、実際よりも低い測定結果となる。
これに対して、溶媒としてＮａＣｌ水溶液を用いた場合、エンドトキシン量と反応時間との関係は、溶媒として透析液を用いた場合に近づく。従って、透析液と等しい濃度でナトリウムイオンを含有するＮａＣｌ水溶液に既知量のエンドトキシンを添加して調製した標準液を用いて作成した検量線を用いることで、透析液中のエンドトキシン量をより高精度に測定し得ることがわかる。また、ナトリウムイオンの影響を抑制するために試料を希釈しなくてよいため、高感度に測定し得ることがわかる。また、試料が例えばナトリウムイオンを含有しない水などである場合には、標準液と等しい（即ち、透析液と等しい）濃度でナトリウムイオンを含有するようにＮａＣｌを添加することで、その試料中のエンドトキシンについても、透析液の場合と同じ検量線を用いて高感度、高精度に測定し得ることがわかる。
表１は、透析液に既知量のエンドトキシンを添加した試料について、上記手順に従って比濁法による反応時間を測定し、検量線として図５に示す溶媒として水を用いた場合の関係（水検量線）、溶媒としてＮａＣｌ水溶液を用いた場合の関係（ＮａＣｌ）を用いた場合の回収率を算出した結果を示す。
水検量線からエンドトキシン量を算出した場合、−２０％〜−３０％の回収率となり、ナトリウムイオンがリムルス反応系の活性化を阻害していることがわかる。一方、ＮａＣｌ検量線から算出すると、回収率は±１０％の範囲となり、高精度な測定が可能であることがわかる。
（実施例４）
標準液のナトリウム含有量と被測定試料のナトリウムイオン含有量とのずれの影響を確認した。
標準液のナトリウム含有量と被測定試料のナトリウムイオン含有量とのずれの影響を確認した。
ここでは、生物化学発光法によるエンドトキシン量の測定に用いる検量線を、ナトリウムイオン濃度が１４０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ水溶液を用いて調製し、生物化学発光法により測定して作成した。
次に、ナトリウムイオン濃度を１４０ｍｍｏｌ／Ｌを基準として、−７５％〜＋１００％の範囲で変化させたＮａＣｌ水溶液を用いて、０．０１ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン含有液を調製した。そして、これらナトリウムイオン濃度の異なる０．０１ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン含有液のそれぞれを生物化学発光法により測定して、上記検量線を用いて、エンドトキシン含有量を計算した。図６に結果を示す。図６は、横軸に計算に使用した検量線を作成する際の、標準液のナトリウムイオン濃度の基準値に対するずれ（％）、縦軸に各検量線を用いて計算したエンドトキシン含有量を示す。
図６の結果から、ＮａＣｌ水溶液のナトリウムイオン濃度が−１５％〜＋２５％の範囲内であれば、±３０％の回収率を達成でき、−５％〜＋１０％の範囲内であれば、±１５％の回収率を達成できることがわかった。
以上説明したように、本発明によれば、生体試料（血液など）や医薬品（透析液など）或いは食品などのナトリウムイオンを含有する試料について高感度、高精度の測定を行うことができる。また、本発明によれば、ナトリウムを含有する試料（透析液など）と水（医薬品の原料水など）などのナトリウムイオンを実質的に含有しないか又は含有量がより少ない試料のいずれについても、同じ１つの検量線を用いて、高感度、高精度の測定を行うことができる。
１ 第１の容器
２ 第２の容器
１０ 定量用キット
１００ 定量装置
２ 第２の容器
１０ 定量用キット
１００ 定量装置
Claims (9)
- 水に異なる濃度の測定対象成分が添加された複数の標準液であって、それぞれにナトリウムイオン含有量が被測定試料のナトリウムイオン含有量と同等となるようにＮａＣｌを添加した複数の標準液を、リムルス試薬を活性化する反応及び／又はＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法により測定し、その測定値と前記測定対象成分の量との関係を表す検量線を作成する検量線作成工程と、
前記検量線作成工程で用いた方法と同一の方法により前記被測定試料を測定する試料測定工程と、
前記検量線を用いて前記試料測定工程における測定値から前記被測定試料中の前記測定対象成分の量を求める定量工程と、
を含む定量方法。 - 前記被測定試料は、ナトリウムイオン含有量の異なる複数の試料であり、
前記検量線作成工程は、前記複数の試料のうち任意の試料のナトリウムイオン含有量と同等となるようにＮａＣｌを添加した前記複数の標準液を測定して前記検量線を作成し、
前記試料測定工程は、前記任意の試料及びナトリウムイオン含有量が前記任意の試料と同等以上の試料にはＮａＣｌを添加せずに該試料を測定し、ナトリウムイオン含有量が前記任意の試料と同等未満の試料には前記任意の試料のナトリウムイオン含有量と同等となるようにＮａＣｌを添加してから該試料を測定する請求項１に記載の定量方法。 - 前記測定対象成分が、エンドトキシン、βグルカン又はＡＴＰである請求項１又は２に記載の定量方法。
- 水に異なる濃度の測定対象成分が添加された複数の標準液であって、それぞれにナトリウムイオン含有量が被測定試料のナトリウムイオン含有量と同等となるようにＮａＣｌを添加した前記複数の標準液を、リムルス試薬を活性化する反応及び／又はＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法により測定し、その測定値と前記測定対象成分の量との関係を表す検量線を作成する検量線作成手段と、
前記検量線作成手段が用いた方法と同一の方法により前記被測定試料を測定する試料測定手段と、
前記検量線を用いて前記試料測定手段による測定値から前記被測定試料中の前記測定対象成分の量を求める定量手段と、
を有する定量装置。 - 前記被測定試料は、ナトリウムイオン含有量の異なる複数の試料であり、
前記検量線作成手段は、前記複数の試料のうち任意の試料のナトリウムイオン含有量と同等となるようにＮａＣｌを添加した前記複数の標準液を測定して前記検量線を作成する手段であり、
前記試料測定手段は、前記任意の試料及びナトリウムイオン含有量が前記任意の試料と同等以上の試料にはＮａＣｌを添加せずに該試料を測定し、ナトリウムイオン含有量が前記任意の試料と同等未満の試料には前記任意の試料のナトリウムイオン含有量と同等となるようにＮａＣｌを添加してから該試料を測定する手段である請求項４に記載の定量装置。 - 前記複数の試料が、医薬品及び該医薬品を調製するための溶液である請求項５に記載の定量装置。
- 前記測定対象成分が、エンドトキシン、βグルカン又はＡＴＰである請求項４〜６のいずれかの項に記載の定量装置。
- リムルス試薬を活性化する反応及び／又はＡＴＰとルシフェリンとルシフェラーゼとによる生物化学発光反応を用いた方法により、被測定試料中の測定対象成分の量を定量するため、又は、該定量に用いる検量線を作成するための定量用キットであって、
前記被測定試料又は前記検量線作成のための標準液に添加するＮａＣｌを有する定量用キット。 - 前記被測定試料又は前記検量線作成のための標準液のナトリウムイオン濃度が１３５〜１５５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように前記被測定試料又は前記検量線作成のための標準液に添加するＮａＣｌを有する請求項８に記載の定量用キット。
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