CN104781673A - 定量方法、定量装置及定量用套件 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种可以对生物样本或医药品或食品等含有钠离子的样本进行高灵敏度、高精度的测定的定量方法及定量装置。定量方法包括：校准曲线制作步骤，通过使用将鲎试剂活化的反应和/或ATP与萤光素及萤光素酶的生物化学发光反应的方法，测定以钠离子含量与被测定样本的钠离子含量相等的方式添加钠离子而成的标准液，并制作表示其测定值与测定对象成分的量的关系的校准曲线；样本测定步骤，通过与在所述校准曲线制作步骤中所用的方法相同的方法，测定所述被测定样本；定量步骤，使用所述校准曲线根据所述样本测定步骤中的测定值，求出所述被测定样本中的所述测定对象成分的量。

Description

定量方法、定量装置及定量用套件
技术领域
本发明涉及一种使用将鲎(Limulus)试剂活化的反应和/或三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)与萤光素(luciferin)或萤光素衍生物(以下简称为“萤光素”)及萤光素酶或萤光素酶变异体(以下简称为“萤光素酶”)的生物化学发光反应，测定被测定样本中的测定对象成分的量的定量方法、定量装置及定量套件。
背景技术
以前，在食品卫生、医疗、医药品、临床检查、环境等广泛的领域中，测定ATP(三磷酸腺苷)量。ATP包含在所有的生物的细胞内，ATP量与细胞数量相关，因此可以通过测定ATP量来进行细胞数量或活菌等的定量。
测定ATP量的方法有：使用ATP与萤光素及萤光素酶的生物化学发光反应来进行测定的生物化学发光法(专利文献1)。
为了通过所述生物化学发光法将活菌等定量，而使用ATP提取试剂将所述细胞中的ATP提取后，作为发光试剂使萤光素酶与萤光素作用，利用发光检测器测定因生物化学发光反应引起的发光量。并且，利用所述发光量与ATP量相关这一情况来测定ATP量，并根据所述ATP量将活菌等定量。在生物化学研究的领域等中，即便在将样本中的ATP量本身作为测定目的的情况下，也可以利用生物化学发光法进行ATP量的测定。
另外，以前在医疗、医药品、临床检查等的领域中，测定生物样本(血液、尿、体液、组织、自除去附着物的生物采集的样本)、或医药品(本说明书中设为包括准药品的概念)或其原材料(本说明书中设为除了原材料本身外还包括溶剂、中间产物等的概念)所含的内毒素量，或者确认在医疗用具(注射器、透析膜等)的制造中未混入内毒素等。若内毒素进入体内，则会引起发热、休克、多器官功能衰竭等。因此，重要的是：测定生物样本中的内毒素量并进行该些的诊断；或者测定所述医药品或其原材料等中所含的内毒素量、或所述的制造步骤或医疗用具的制造步骤中的内毒素量，预防内毒素注入体内。
测定内毒素量的方法有：利用使用内毒素将鲎的血细胞提取液(以下称为“鲎试剂”)的成分即鲎反应系活化的工艺的鲎试验(专利文献2)。并且，在所述鲎试验中，根据判定或测定方法的差异，有凝胶化颠倒法、比浊法、比色法、生物化学发光法。
利用凝胶化颠倒法及比浊法的内毒素量的测定，是通过利用以下反应来判定或测定内毒素量，所述反应是利用内毒素将鲎试剂活化，由此样本发生凝胶化。
利用比色法的内毒素量的测定，是使用利用内毒素将鲎试剂活化而使发色基团游离的发色合成基质，并通过吸光度或透射光量的测定来对游离的发色基团的量进行比色定量。继而，利用所述游离的发色基团的量与内毒素量相关这一情况来测定内毒素量。
利用生物化学发光法的内毒素量的测定，是使用利用内毒素将鲎试剂活化而使萤光素游离的发光合成基质，利用所述生物化学发光反应的ATP量的测定原理来测定游离的萤光素。即，使ATP与萤光素酶作用于因鲎反应系而游离的萤光素，而测定因生物化学发光反应引起的发光量。继而，利用所述发光量与内毒素量相关这一情况来测定内毒素量。
另外，以前在医疗、医药品、临床检查、食品产业等的领域中，测定β葡聚糖。例如，为了选择针对疑似患有深部真菌症的患者的治疗方法或判定治疗效果等，重要的是测定β葡聚糖量。测定β葡聚糖量的方法与所述内毒素量的测定同样地有利用凝胶化颠倒法、比浊法、比色法、生物化学发光法的鲎试验(专利文献3)。各方法在利用通过β葡聚糖将鲎反应系活化的工艺的方面，与所述内毒素量的测定的情形不同，但各测定原理与所述内毒素量的测定的情形大致相同。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利特开平7-110301号公报
专利文献2：国际公开第2009/063840号
专利文献3：日本专利特开2010-187634号公报
发明内容
发明所要解决的问题
所述各种方法自以前以来就被广泛使用，但存在由于样本中的妨碍成分而测定精度降低的情况。例如在样本为透析液或血液时，若通过所述各种方法测定ATP、内毒素或β葡聚糖的量，则由于作为样本中的妨碍成分的钠离子而妨碍测定所必需的反应。因此，若利用使用标准液而制作的校准曲线来进行样本中的测定对象成分的定量，则获得低于实际的测定结果，所述标准液是在纯水中添加已知量(浓度)的测定对象成分(ATP、内毒素或β葡聚糖)制备而成(图7)。
根据本发明人的研究，ATP与萤光素及萤光素酶的生物化学发光反应因钠离子而受到阻碍。因此，使用生物化学发光反应的ATP量、内毒素量、β葡聚糖量的测定，因钠离子而受到妨碍。
另外，内毒素、β葡聚糖引起的鲎试剂的活化因钠离子而受到阻碍。从而，使用生物化学发光反应的内毒素量、β葡聚糖量的测定也因此受到妨碍，而且使用利用凝胶化颠倒法、比浊法、比色法的鲎试验的内毒素量、β葡聚糖量的测定也受到妨碍。
对于所述问题，有将样本充分稀释而抑制妨碍成分的影响的情况，但存在因样本的稀释而灵敏度降低的问题。
因此，本发明的目的是提供一种可以对生物样本或医药品或食品等含有钠离子的样本进行高灵敏度、高精度的测定的定量方法及定量装置。
另外，本发明的其他目的是提供一种对含有钠离子的样本与水等实质上不含钠离子或含量更少的样本的任一种，也可以使用同一个校准曲线，进行高灵敏度、高精度的测定的定量装置及所述定量方法或可以用于定量装置的定量用套件。
解决问题的技术手段
所述目的通过本发明的定量方法、定量装置及定量用套件而达成。总之，第一本发明是一种定量方法，其包括：校准曲线制作步骤，通过使用将鲎试剂活化的反应和/或ATP与萤光素及萤光素酶的生物化学发光反应的方法，测定以钠离子含量与被测定样本的钠离子含量相等的方式添加钠离子而成的标准液，并制作表示其测定值与测定对象成分的量的关系的校准曲线；样本测定步骤，通过与在所述校准曲线制作步骤中所用的方法相同的方法，测定所述被测定样本；定量步骤，使用所述校准曲线根据所述样本测定步骤中的测定值，求出所述被测定样本中的所述测定对象成分的量。
第二本发明是一种定量装置，其包括：校准曲线制作步骤，通过使用将鲎试剂活化的反应和/或ATP与萤光素及萤光素酶的生物化学发光反应的方法，测定以钠离子含量与被测定样本的钠离子含量相等的方式添加钠离子而成的标准液，并制作表示其测定值与测定对象成分的量的关系的校准曲线；样本测定步骤，通过与在所述校准曲线制作步骤中所用的方法相同的方法，测定所述被测定样本；定量步骤，使用所述校准曲线根据所述样本测定步骤中的测定值，求出所述被测定样本中的所述测定对象成分的量。
第三本发明是一种定量用套件，其通过使用将鲎试剂活化的反应和/或ATP与萤光素及萤光素酶的生物化学发光反应的方法，对被测定样本中的测定对象成分的量进行定量，或者制作所述定量中所使用的校准曲线，且具有将特定量的钠离子供给至所述被测定样本或用于所述校准曲线制作的标准液的钠离子源。
发明的效果
根据本发明，可以对生物样本或医药品或食品等含有钠离子的样本进行高灵敏度、高精度的测定。另外，根据本发明，对于含有钠离子的样本与水等实质上不含钠离子或含量更少的样本的任一种，也可以使用同一个校准曲线，进行高灵敏度、高精度的测定。
附图说明
图1是本发明的一个实施形态的定量装置的概略功能方块图。
图2是用以说明本发明的定量用套件的一例的示意图。
图3是表示示出利用生物化学发光法测定ATP量时的钠离子的影响及抑制所述影响的效果的图表的图。
图4是表示示出利用生物化学发光法测定内毒素量时的钠离子的影响及抑制所述影响的效果的图表的图。
图5是表示示出利用比浊法测定使用鲎试验的内毒素量时的钠离子的影响及抑制所述影响的效果的图表的图。
图6是表示示出标准溶液的NaCl浓度的差异与内毒素量的测定结果的关系的图表的图。
图7是用以说明以前的课题的说明图。
具体实施方式
以下，根据附图对本发明的定量方法、定量装置及定量套件进行更详细的说明。
1.定量方法
本发明的定量方法包括以下的各步骤。
(a)校准曲线制作步骤，通过使用将鲎试剂活化的反应和/或ATP与萤光素及萤光素酶的生物化学发光反应的方法，测定以钠离子含量与被测定样本的钠离子含量相等的方式添加钠离子而成的标准液，并制作表示其测定值与测定对象成分的量的关系的校准曲线。
(b)样本测定步骤，通过与在校准曲线制作步骤中所用的方法相同的方法，测定被测定样本。
(c)定量步骤，使用校准曲线根据样本测定步骤中的测定值，求出被测定样本中的测定对象成分的量。
测定对象成分根据在所述(a)校准曲线制作步骤及(b)样本测定步骤中所用的方法而不同，在通过使用将鲎试剂活化的反应的方法进行测定时，可以列举：内毒素或β葡聚糖。另外，在通过使用ATP与萤光素及萤光素酶的生物化学发光反应的方法进行测定时，可以列举：ATP。而且，在通过使用将鲎试剂活化的反应及ATP与萤光素及萤光素酶的生物化学发光反应的方法进行测定时，可以列举：内毒素或β葡聚糖。
另外，在将ATP设为测定对象成分时，将被测定样本中的活菌等的定量作为最终目的，可以包括自活菌等提取ATP进行测定的情形。
此时，通过所述步骤测定ATP量后，可以根据表示最终定量目的的活菌数量与ATP量的关系的校准曲线，求出所述活菌数量。或者，也可以根据(a)中所求出的校准曲线、及表示活菌数量与ATP量的关系的校准曲线，制作发光量与活菌数量的关系式等，而求出活菌数量。另外，活菌等细胞中的ATP可以使用ATP提取试剂进行提取。
所述测定根据以下原理进行，但由于为众所周知的测定方法，因此省略详细的说明。
(1)利用使用将鲎试剂活化的反应的方法进行的内毒素量的测定(以下也称为“利用鲎试剂的内毒素量的测定”)
鲎试剂中所含的鲎的血细胞提取液(LAL：Limulus Amebocyte Lysate)中，存在作为因内毒素而开始的连锁反应系的C因子鲎反应系。内毒素将C因子活化。经活化的C因子将鲎反应系的B因子活化。经活化的B因子将鲎反应系的凝固酶前驱物活化，而生成凝固酶。利用所述生成的凝固酶的作用而产生凝胶化。
利用鲎试剂的内毒素量的测定，是利用如上所述的工艺的测定，可以通过经凝胶化的样本的状态测定(凝胶化颠倒法)或浊度测定(比浊法)进行。或者，也可以将发色合成基质添加至所述反应系中使发色基团游离，通过吸光度或透射光量测定其量(比色法)，从而测定内毒素量。
(2)利用使用将鲎试剂活化的反应的方法进行的β葡聚糖量的测定(以下也称为“利用鲎试剂的β葡聚糖量的测定”)
鲎试剂中所含的鲎的血细胞提取液中，存在作为因β葡聚糖而开始的连锁反应系的G因子鲎反应系。β葡聚糖将G因子活化。
经活化的G因子将鲎反应系的凝固酶前驱物活化，而生成凝固酶。利用所述生成的凝固酶的作用而产生凝胶化。
利用鲎试剂的β葡聚糖量的测定，是利用如上所述的工艺的测定，可以与内毒素量的测定同样地通过凝胶化颠倒法或比浊法、或比色法测定β葡聚糖量。
(3)利用使用ATP与萤光素及萤光素酶的生物化学发光反应的方法进行的ATP量的测定(以下也称为“利用生物化学发光法的ATP量的测定”)
ATP在Mg2+(2价金属离子)的存在下利用萤光素酶的作用与萤光素反应，而生成一磷酸腺苷(Adenosine Monophosphate，AMP)与氧化萤光素以及焦磷酸。此时所产生的光的发光量与ATP量相关，因此可以利用所述关系测定ATP量。
(4)利用使用将鲎试剂活化的反应及ATP与萤光素及萤光素酶的生物化学发光反应的方法进行的内毒素量的测定(以下也称为“利用生物化学发光法的内毒素量的测定”)
利用生物化学发光法的内毒素量的测定，是在与(1)中所说明者相同的鲎反应系工艺中，应用(3)中所说明的利用生物化学发光法的ATP量的测定。即，将含有作为发光基质的萤光素的发光合成基质添加至鲎反应系中，通过因内毒素引起的鲎反应系的活化而使萤光素游离。使ATP与萤光素酶作用于所述游离的萤光素，而测定因生物化学发光反应引起的发光量。发光量与游离的萤光素量(鲎反应系的活化的程度)相关，因此结果可以测定内毒素量。
(5)利用使用将鲎试剂活化的反应及ATP与萤光素及萤光素酶的生物化学发光反应的方法进行的β葡聚糖量的测定(以下也称为“利用生物化学发光法的β葡聚糖量的测定”)
利用生物化学发光法的β葡聚糖量的测定与(4)相同，是在鲎反应系的工艺中应用利用生物化学发光法的ATP量的测定。即，将含有萤光素的发光合成基质添加至鲎反应系中，通过因β葡聚糖引起的鲎反应系的活化使萤光素游离，而测定因生物化学发光反应引起的发光量，由此测定β葡聚糖量。
如上所述般，ATP与萤光素及萤光素酶的生物化学发光反应因钠离子而受到阻碍。因此，利用生物化学发光法的ATP量、内毒素量、β葡聚糖量的测定，因钠离子而受到妨碍。
另外，因内毒素、β葡聚糖引起的鲎反应系的活化因钠离子而受到阻碍。因此，利用鲎试剂的内毒素量、β葡聚糖量的测定及利用生物化学发光法的内毒素量、β葡聚糖量的测定受到妨碍。
例如，在对透析液或血液等以相对较高浓度含有钠离子的样本，进行利用生物化学发光法的ATP量、内毒素量或β葡聚糖量的测定时，若根据使用标准液制作的校准曲线对样本中的测定对象成分的量进行定量，则获得低于实际的测定结果，所述标准液是在不含钠离子的纯水等溶剂中添加已知量(浓度)的测定对象成分(ATP、内毒素或β葡聚糖)制备而成(图7)。
因此，本发明的定量方法中，在(a)校准曲线制作步骤中，对以钠离子含量与被测定样本的钠离子含量相等的方式添加钠离子而成的标准液进行测定，根据其测定值制作校准曲线。即，在透析液或血液等包含大量的妨碍成分(钠离子)的样本的定量之前，根据对以与被测定样本中所含的妨碍成分的量相等的方式添加妨碍成分而成的标准液进行测定而得的结果，制作校准曲线，使用所述校准曲线进行样本中的测定对象成分的定量，由此抵消妨碍成分的影响。
在所述(a)校准曲线制作步骤中，标准液根据被测定样本中的测定对象成分的量，以获得所期望的测定精度的方式，在所期望的含量(浓度)跨度、所期望的含量(浓度)范围中准备。并且，所述(a)校准曲线制作步骤中的测定，优选在与所述(b)样本测定步骤中的测定实质上相同的条件(除了测定对象成分外的反应系的各成分的含量(浓度)、反应温度、反应时间等)下进行。通过使条件一致，而可以进行更高灵敏度、高精度的测定。被测定样本为注射剂、输液或透析液等医疗现场所使用的药剂，眼药等外用药，各种内服药等医药品，水(普通水、反渗透(Reverse Osmosis，RO)水、纯化水、灭菌纯化水、灭菌水、注射用水(注射用蒸馏水)、纯水、超纯水、反渗透水等)，来自医疗用具或医疗设备的采集物，来自无尘室的采集物，血液(全血、血清、血浆)或尿等生物样本(临床样本)等。另外，也可以将食品加工或食品卫生、环境领域中的各种样本作为被测定样本。
另外，所谓与被测定样本的钠离子含量相等，是根据所期望的测定精度，与可以抑制钠离子对测定结果造成的影响的程度相等的量。详细而言，如后述般，根据本发明人的研究，若相对于被测定样本的标准液的钠含量为-50％～+75％的范围内，则可以抑制钠离子对测定结果造成的影响。钠含量优选设为-15％～+25％，更优选设为-5％～+10％的范围内。
另外，为了利用相同的校准曲线进行高灵敏度、高精度的测定，而透析液或血液等含有钠离子的各样本的钠离子含量必须相等。此时，钠离子含量相等的意义也与所述相同。但是，例如若透析液与血液等中的钠离子含量相等，则即便是种类不同的样本，也可以利用相同的校准曲线进行高灵敏度、高精度的测定。
另外，在所述(a)校准曲线制作步骤中，钠离子优选通过添加氯化钠(NaCl)而添加至标准液或被测定样本中。另外，所谓在标准液或被测定样本中添加钠离子，并不限定于在标准液或样本中以干燥药剂或溶液的形态投入或注入NaCl等钠离子源。例如，可以为在以干燥药剂或溶液的形态收纳有NaCl等钠离子源的容器中注入标准液或被测定样本的方法。另外，也可以是如下的方法：在投入或注入至标准液或被测定样本本身(或将这些稀释而成的稀释液)的其他试剂(例如缓冲液、萤光素、萤光素酶、ATP、2价金属离子、发光合成基质或发色合成基质等)中含有NaCl等钠离子源，通过投入或注入所述试剂，而实质上在标准液或被测定样本中以成为特定的钠离子量的方式添加钠离子。
2.定量装置
本发明的定量装置包括所述(a)、(b)、(c)步骤。图1表示本发明的定量装置的一个实施形态的概略功能方块。
如图1所示般，定量装置100具有：实行测定的测定部101、进行测定运作的控制的控制部102、存储信息的存储部103、用以对控制部102输入信息的输入部104、输出来自控制部102的信息的输出部105等。
测定部101根据在所述(a)校准曲线制作步骤及(b)样本测定步骤中所用的方法而构成。例如在使用利用生物化学发光法的ATP量、内毒素量或β葡聚糖量的测定方法时，测定部101可以包括：反应容器、发光检测器、被检测液(被测定样本、标准液)供给元件、试剂供给元件等。另外，在使用利用鲎试剂的内毒素量或β葡聚糖量的测定方法时，在采用例如比浊法或比色法时，测定部101可以包括：反应容器、吸光光度计(透射光测定器)、被检测液供给元件、试剂供给元件等。
控制部102可以总括地控制定量装置100的运作，根据来自输入部104的指示信息，且根据存储在存储部103中的程序或各种设定信息按顺序控制测定部101，并且进行测定部101的测定结果的处理，为了对输出部105输出测定结果信息，可以包括：微电脑等。
存储部103为了存储控制部102所用的控制程序或各种设定信息、控制部102所要求的测定结果信息等各种信息，可以包括：电子存储器等。
输入部104可以包括操作部等，所述操作部用以对控制部102输入各种设定信息或测定的开始、停止的指示信息等各种信息，并具有设置于定量装置100的输入键等。或者，输入部104可以为接受来自定量装置100的外部设备的与所述相同的信息而发送至控制部102的界面部。
输出部105可以包括：显示各种设定信息或测定结果信息的液晶显示器等显示部、或印出相同的信息的打印部等。或者，输出部105可以为接受来自控制部102的与所述相同的信息而发送至定量装置100的外部设备的界面部。
继而，对使用本发明的一个实施形态的定量装置，将透析液及用以制备透析液的溶液(原液稀释用RO水)所含的内毒素量定量的情形进行说明。
(校准曲线制作步骤)
在所述定量装置中，在透析液及RO水(被测定样本)中的内毒素(测定对象成分)的定量之前，根据以下要领进行校准曲线的制作。
在内毒素量不同的2种以上的标准液中分别以标准液的钠离子含量与透析液的钠离子含量相等的方式添加钠离子。具体而言，由于透析液中所含的钠离子为约140mmol/L，因此以各标准液的钠离子浓度成为140mmol/L的方式添加钠离子。
继而，通过所述利用鲎试剂的内毒素量的测定或利用生物化学发光法的内毒素量的测定，来测定各标准液，而制作校准曲线。
此时，控制部102根据存储在存储部103中的控制程序或各种设定信息，在测定部101中对标准液实行所述测定，根据取得的测定结果制作校准曲线而存储在存储部103中。所述校准曲线用于被测定样本中的测定对象成分的定量。
(样本测定步骤)
将测定方法及条件设为与所述校准曲线制作步骤相同，分别测定透析液及RO水。
此处，在校准曲线制作步骤中测定作为标准液的钠离子含量的基准的透析液时，不添加钠离子。另一方面，在测定钠离子含量少于透析液的钠离子含量的RO水时，与校准曲线制作步骤相同，以钠离子浓度成为140mmol/L的方式添加钠离子后进行测定。
此时，控制部102根据存储在存储部103中的控制程序或各种设定信息，对被测定样本实行所述测定。由测定部101取得的测定结果的信息存储在存储部103中，且用于被测定样本中的测定对象成分的定量。
(定量步骤)
在样本测定步骤中测定的透析液的测定值及RO水的测定值，均使用在所述校准曲线制作步骤中所制作的1个校准曲线换算成内毒素量。
通过利用此种步骤进行定量，而可以在不受到妨碍成分即钠离子的影响的情况下对透析液进行高灵敏度、高精度的测定。另外，也可以使用同一个校准曲线，对几乎不含钠离子的RO水进行准确的测定。
例如，通过操作员的输入，可以对装置提供添加钠离子后是否应测定被测定样本的信息。另外，也可以预先按照运作顺序设定多个被测定样本的导入顺序与钠离子添加的有无。继而，也可以在定量装置内具备钠离子测定元件(例如离子电极或导电率计)，根据其测定值，自动判断钠离子的添加的必要性或所添加的钠离子量，或者根据来自外部的信号(例如来自与定量装置分开设置的离子浓度计或导电率计的信号)自动判断钠离子的添加的必要性或所添加的钠离子量。
另外，被测定样本并不限定于2种，对于3种以上的样本，可以控制钠离子的添加而进行测定。例如，在医药品制造步骤中，将完成品、中间产物、原材料这3种作为被测定样本时，若钠离子含量为中间产物＞完成品＞原材料，则将中间产物的钠离子含量作为基准而制作校准曲线制作步骤的校准曲线，在完成品及原材料的测定时，只要以与中间产物的钠离子含量相等的方式添加钠离子进行测定即可。另外，也可以将完成品的钠离子含量作为基准而制作校准曲线制作步骤的校准曲线，在完成品及中间产物的测定时，不添加钠离子进行测定，在原材料的测定时，以与完成品的钠离子含量相等的方式添加钠离子进行测定。
如此，被测定样本可以为钠离子含量不同的多个样本。此时，在校准曲线制作步骤中，可以对以与多个样本中任意的样本的钠离子含量相等的方式添加钠离子而成的标准液进行测定而制作校准曲线。并且，在样本测定步骤中，在所述任意的样本及钠离子含量大于或等于所述任意的样本的样本中不添加钠离子而测定所述样本。另一方面，在钠离子含量小于所述任意的样本的样本中，以与所述任意的样本的钠离子含量相等的方式添加钠离子后测定所述样本。
3.定量用套件
对本发明的定量用套件进行说明。
本发明的定量用套件可以适用于所述定量方法或定量装置。即，在通过使用将鲎试剂活化的反应和/或ATP与萤光素及萤光素酶的生物化学发光反应的方法，对被测定样本中的测定对象成分的量进行定量时，或者在制作所述定量中使用的校准曲线时，具有将特定量的钠离子供给至被测定样本或用于校准曲线制作的标准液的钠离子源。
例如如上所述般除了测定透析液中的内毒素量外，还测定原液稀释用RO水中的内毒素量时，定量用套件为了可使用同一个校准曲线对透析液与RO水进行测定，而设为具有钠离子源的构成，所述钠离子源用于对标准液与RO水以这些的钠离子含量与透析液的钠离子含量相等的方式供给钠离子。
透析液的钠离子浓度为约140mmol/L，标准液或RO水几乎不含钠离子。因此，若始终将供于使用定量用套件的测定的标准液或RO水的量设为固定量，则定量用套件所应供给的特定量的钠离子量也始终可为固定量，其量可以简单地算出。即，可以根据被测定样本的钠离子浓度与供于使用定量用套件的测定的液体量，适当确定定量用套件的钠离子供给量。
本发明的定量用套件在将被测定样本设为血液等生物样本时，或设为注射剂、输液、透析液、眼药、生理盐水等时，可以特别适合地使用。原因是，这些的钠离子浓度大致固定，可以量产而使用能够供给根据所述浓度求出的钠离子量的定量用套件。
具体而言，血液的钠离子浓度为约135mmol/L～145mmol/L，透析液的钠离子浓度为约140mmol/L，生理盐水的钠离子浓度为约155mmol/L，因此可以设为能够供给将所述钠离子浓度作为基准而算出的钠离子量的定量用套件。因此，定量用套件的钠离子源优选以被测定样本或用于校准曲线制作的标准液的钠离子浓度成为135mmol/L～155mmol/L的方式供给钠离子。
若进一步进行说明，则例如如图2所示般，定量用套件10可以具有第1容器1，所述第1容器1以干燥药剂或溶液的形态收纳作为钠离子源的NaCl。第1容器1中可以进一步以干燥药剂或溶液(缓冲液)的形态收纳pH缓冲作用物。并且，在所述第1容器1中，可以注入标准液、或不含钠离子或含量更少的水等样本。
另外，定量用套件10可以进一步具有未收纳钠离子源的第2容器2。第2容器2中可以进一步以干燥药剂或溶液(缓冲液)的形态收纳pH缓冲作用物。并且，在所述第2容器2中，可以注入含有钠离子的透析液等样本。
注入了样本或标准液的第1容器1与第2容器2的内容物的钠离子浓度设定为相等。并且，使用所述第1容器1、第2容器2内的样本或标准液进行测定。
实施例
继而，根据更具体的实施例对本发明进一步进行说明。
实施例1
对利用生物化学发光法的ATP量的测定时的钠离子的影响及抑制所述影响的效果进行确认。
在本实施例中，使用水、透析液、NaCl水溶液作为溶剂，分别制备包含稀释成不同浓度的ATP的含有ATP的溶液，对各含有ATP的溶液求出ATP浓度与因生物化学发光反应引起的发光量的关系。
·试剂
ATP标准液是使用东亚迪开开(DKK-TOA)公司制造的AF-2A1。所述ATP标准液是大致在0.025M的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲液中溶解1×10-7M的ATP而成的溶液。另外，水是使用注射用水(大塚制药公司制造的大塚蒸馏水)。萤光素、萤光素酶变异体是使用含有所述成分的发光试剂(巴依欧艾耐克斯(Bioenex)公司制造的萤光素酶FM+)。透析用剂是使用肯达利(Kindaly)3D(扶桑药品工业公司制造)。肯达利(Kindaly)3D包含透析液的A剂为电解质成分的A-1剂、与葡萄糖(非电解质)成分的A-2。
·方法
透析液是根据配方使用注射用水将肯达利(Kindaly)3D的A剂与B剂溶解而制备。所述肯达利(Kindaly)3D的钠离子浓度为140mmol/L(140mEq/L)。
NaCl水溶液是利用注射用水将NaCl溶解，制备成140mmol/L(140mEq/L)的浓度而成。即，所述NaCl水溶液的钠离子浓度与所述透析液的钠离子浓度相等。
含有ATP的溶液是通过利用注射用水、透析液、NaCl水溶液将所述ATP标准液稀释，而制备成1×10-14、1×10-13、1×10-12、1×10-11、1×10-10、1×10-9、1×10-8的浓度而成。
继而，将各含有ATP的溶液的100μL移至反应容器中，在各反应容器中添加100μL的发光试剂并混合。然后，使用发光检测器(浜松光子学(Hamamatsu Photonics)公司制造的微弱发光计数装置)对其反应液测定发光量。
·结果
将结果表示于图3。图3的横轴为含有ATP的溶液的ATP浓度(mol/L)，纵轴为发光量(发光强度：RLU)。
在使用水作为溶剂时，ATP浓度与发光量的关系与使用透析液作为溶剂时大大不同。特别是如图3所示般，关于各ATP浓度下的发光量，与使用水作为溶剂时相比，使用透析液时较低。因此，若使用利用标准液而制作的校准曲线，对透析液中的ATP量进行定量，则获得比实际低的浓度的测定结果，所述标准液是单纯地在水中添加已知浓度的ATP制备而成。
相对于此，在使用NaCl水溶液作为溶剂时，ATP浓度与发光量的关系与使用透析液作为溶剂时大致一致。因此可知，通过使用利用标准液而制作的校准曲线，而可以高精度地测定透析液中的ATP量，所述标准液是在以与透析液相等的浓度含有钠离子的NaCl水溶液中添加已知浓度的ATP制备而成。另外可知，为了抑制钠离子的影响也可以不稀释样本，因此可以高灵敏度地测定。另外可知，在样本为例如不含有钠离子的水等时，通过以与标准液相等(即与透析液相等)的浓度含有钠离子的方式添加NaCl，则即便对于所述样本中的ATP，也可以使用与为透析液时的校准曲线相同的校准曲线进行高灵敏度、高精度的测定。
实施例2
对利用生物化学发光法的内毒素量的测定时的钠离子的影响及抑制所述影响的效果进行确认。
在本实施例中，使用水、透析液、NaCl水溶液作为溶剂，分别制备包含稀释成不同的含量的内毒素的含有内毒素的溶液，并对各含有内毒素的溶液求出内毒素量与因生物化学发光反应引起的发光量的关系。
·试剂
鲎试剂(LAL)是使用作为内毒素测定试剂的和光纯药公司制造的鲎ES-II。另外，内毒素标准物质是使用和光纯药公司制造的对照标准内毒素(Control Standard Endotoxin，CSE)。另外，水是使用注射用水(大塚制药公司制造的注射用水)。另外，发光合成基质是使用苯甲酰基-Leu-Gly-Arg-萤光素。萤光素酶是使用变异型萤光素酶(巴依欧艾耐克斯公司制造的萤光素酶FM)。透析用剂是使用肯达利(Kindaly)3D(扶桑药品工业公司制造)、与卡波斯塔(CARBOSTAR)P(味之素制药公司制造)。卡波斯塔(CARBOSTAR)P为将透析液的A剂进行1剂化而成者。
·方法
透析液是根据配方使用注射用水将肯达利(Kindaly)3D、卡波斯塔(CARBOSTAR)P分别溶解而制备。所述肯达利(Kindaly)3D、卡波斯塔(CARBOSTAR)P的溶液的钠离子浓度分别为140mmol/L(140mEq/L)。
NaCl水溶液是利用注射用水将NaCl溶解，制备成140mmol/L(140mEq/L)的浓度而成。即，所述NaCl水溶液的钠离子浓度与所述透析液的钠离子浓度相等。
含有内毒素的溶液是利用注射用水将内毒素标准物质溶解，制备成1000EU/mL的含量，并将所得的溶液作为原液，利用注射用水、透析液、NaCl水溶液将所述原液稀释，从而制备成0.001EU/mL、0.01EU/mL、0.1EU/mL、1EU/mL的含量而成。
鲎试剂是使用200μL的注射用水制备而成。
继而，将各含有内毒素的溶液的50μL移至反应容器中，在各反应容器中添加25μL的鲎试剂并混合后，在37℃下进行20分钟加温。
继而，在各反应容器中，添加溶解于0.04M三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)缓冲液(pH值为8.5)而成的6.7×10-5M的发光合成基质50μL，在37℃下进行5分钟加温，所述0.04M三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液包含0.001M乙酸镁与5％海藻糖。
继而，在各反应容器中，添加溶解于0.025M的HEPES缓冲液(pH值为7)的10-6M的ATP 50μL、溶解于0.04M三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液(pH值为8.5)的萤光素酶(将FM 1g溶解于4mL中)50μL，对所述反应液使用发光检测器(东亚迪开开公司制造的AF-100)测定发光量，所述0.04M三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液包含0.001M的乙酸镁与0.15M海藻糖。
.结果
将结果表示于图4。图4的横轴为含有内毒素的溶液的内毒素量(EU/mL)，纵轴为发光量(发光强度：RLU)。
在使用水作为溶剂时，内毒素量与发光量的关系与使用透析液作为溶剂时大大不同。特别是如图4所示般，关于各内毒素量下的发光量，与使用水作为溶剂时相比，使用透析液时较低。因此，若使用利用标准液而制作的校准曲线，将透析液中的内毒素量定量，则获得比实际低的测定结果，所述标准液是单纯地在水中添加已知量的内毒素制备而成。
相对于此，在使用NaCl水溶液作为溶剂时，内毒素浓度与发光量的关系与使用透析液作为溶剂时大致一致。因此可知，通过使用利用标准液而制作的校准曲线，而可以高精度地测定透析液中的内毒素量，所述标准液是在以与透析液相等的浓度含有钠离子的NaCl水溶液中添加已知量的内毒素制备而成。另外可知，为了抑制钠离子的影响也可以不稀释样本，因此可以高灵敏度地测定。另外可知，在样本为例如不含有钠离子的水等时，通过以与标准液相等(即与透析液相等)的浓度含有钠离子的方式添加NaCl，则即便对于所述样本中的内毒素，也可以使用与为透析液时的校准曲线相同的校准曲线进行高灵敏度、高精度的测定。
实施例3
对利用比浊法测定使用鲎试验的内毒素量时的钠离子的影响及抑制所述影响的效果进行确认。
在本实施例中，使用水、透析液、NaCl水溶液作为溶剂，分别制备包含稀释成不同含量的内毒素的含有内毒素的溶液，并对各含有内毒素的溶液求出内毒素量与利用比浊法的反应时间的测定值的关系。
·试剂
鲎试剂(LAL)、内毒素标准物质是使用与实施例2相同者。另外，水是使用与实施例2相同者。另外，透析用剂是使用与实施例1相同的肯达利(Kindaly)3D。
·方法
透析液、NaCl水溶液以与实施例1、实施例2相同的方式进行制备。
含有内毒素的溶液是利用注射用水将内毒素标准物质溶解，制备成1000EU/mL的含量，并将所得的溶液作为原液，利用注射用水、透析液、NaCl水溶液将所述原液稀释，从而制备成0.00125EU/mL、0.0025EU/mL、0.005EU/mL、0.01EU/mL的含量而成。
继而，将各含有内毒素的溶液的200μL移至包含鲎试剂的反应容器中，对所述反应液使用测定装置(和光纯药公司制造的ET-6000)，测定直至透射光量减少至特定阈值(约90％)的反应时间。
·结果
将结果表示于图5。图5的横轴为含有内毒素的溶液的内毒素量(log(EU/mL))，纵轴为反应时间(log(分钟))。
在使用水作为溶剂时，内毒素量与反应时间的关系与使用透析液作为溶剂时大大不同。特别是如图5所示般，关于各内毒素量下的反应时间，与使用水作为溶剂时相比，使用透析液时较长。因此，若使用利用标准液而制作的校准曲线，将透析液中的内毒素量定量，则获得比实际低的测定结果，所述标准液是单纯地在水中添加已知量的内毒素制备而成。
相对于此，在使用NaCl水溶液作为溶剂时，内毒素量与反应时间的关系与使用透析液作为溶剂时接近。因此可知，通过使用利用标准液而制作的校准曲线，而可以更高精度地测定透析液中的内毒素量，所述标准液是在以与透析液相等的浓度含有钠离子的NaCl水溶液中添加已知量的内毒素制备而成。另外可知，为了抑制钠离子的影响也可以不稀释样本，因此可以高灵敏度地测定。另外可知，在样本为例如不含有钠离子的水等时，通过以与标准液相等(即与透析液相等)的浓度含有钠离子的方式添加NaCl，则即便对于所述样本中的内毒素，也可以使用与为透析液时的校准曲线相同的校准曲线进行高灵敏度、高精度的测定。
表1表示对在透析液中添加已知量的内毒素的样本，根据所述顺序测定利用比浊法的反应时间，并算出使用图5所示的使用水作为溶剂时的关系(水校准曲线)、使用NaCl水溶液作为溶剂时的关系(NaCl)作为校准曲线的情况下的回收率的结果。
[表1]
在根据水校准曲线算出内毒素量时，为-20％～-30％的回收率，可知钠离子阻碍鲎反应系的活化。另一方面，若根据NaCl校准曲线算出，则回收率为±10％的范围，可知可以进行高精度的测定。
实施例4
确认标准液的钠含量与被测定样本的钠离子含量的差异的影响。
此处，使用钠离子浓度为140mmol/L的NaCl水溶液进行制备，通过生物化学发光法进行测定，而制作利用生物化学发光法的内毒素量的测定中所用的校准曲线。
继而，将钠离子浓度为140mmol/L作为基准，使用在-75％～+100％的范围内变化的NaCl水溶液，而制备0.01EU/mL的含有内毒素的溶液。继而，通过生物化学发光法测定所述钠离子浓度不同的0.01EU/mL的各含有内毒素的溶液，使用所述校准曲线，计算内毒素含量。图6表示结果。图6中，横轴表示制作用于计算的校准曲线时相对于标准液的钠离子浓度的基准值的差异(％)，纵轴表示使用各校准曲线计算的内毒素含量。
根据图6的结果可知，若NaCl水溶液的钠离子浓度为-15％～+25％的范围内，则可以达成±30％的回收率，若NaCl水溶液的钠离子浓度为-5％～+10％的范围内，则可以达成±15％的回收率。
如以上所说明般，根据本发明，可以对生物样本(血液等)或医药品(透析液等)或食品等含有钠离子的样本进行高灵敏度、高精度的测定。另外，根据本发明，即便对于含有钠的样本(透析液等)与水(医药品的原料水等)等实质上不含有钠离子或含量更少的样本的任一个，也可以使用同一个校准曲线，进行高灵敏度、高精度的测定。
符号的说明
1：第1容器
2：第2容器
10：定量用套件
100：定量装置

Claims (8)

1.一种定量方法，其包括：
校准曲线制作步骤，通过使用将鲎试剂活化的反应和/或三磷酸腺苷与萤光素及萤光素酶的生物化学发光反应的方法，测定以钠离子含量与被测定样本的钠离子含量相等的方式添加钠离子而成的标准液，并制作表示其测定值与测定对象成分的量的关系的校准曲线；
样本测定步骤，通过与在所述校准曲线制作步骤中所用的方法相同的方法，测定所述被测定样本；以及
定量步骤，使用所述校准曲线根据所述样本测定步骤中的测定值，求出所述被测定样本中的所述测定对象成分的量。
2.根据权利要求1所述的定量方法，其中所述测定对象成分为内毒素、β葡聚糖或三磷酸腺苷。
3.一种定量装置，其包括：
校准曲线制作步骤，通过使用将鲎试剂活化的反应和/或三磷酸腺苷与萤光素及萤光素酶的生物化学发光反应的方法，测定以钠离子含量与被测定样本的钠离子含量相等的方式添加钠离子而成的标准液，并制作表示其测定值与测定对象成分的量的关系的校准曲线；
样本测定步骤，通过与在所述校准曲线制作步骤中所用的方法相同的方法，测定所述被测定样本；
定量步骤，使用所述校准曲线根据所述样本测定步骤中的测定值，求出所述被测定样本中的所述测定对象成分的量。
4.根据权利要求3所述的定量装置，其中所述被测定样本为钠离子含量不同的多种样本；
所述校准曲线制作步骤中，测定以与所述多种样本中任意的样本的钠离子含量相等的方式添加钠离子而成的所述标准液，而制作所述校准曲线；
所述样本测定步骤中，在所述任意的样本及钠离子含量大于或等于所述任意的样本的样本中不添加钠离子而测定所述样本，并在钠离子含量小于所述任意的样本的样本中以与所述任意的样本的钠离子含量相等的方式添加钠离子后测定所述样本。
5.根据权利要求4所述的定量装置，其中所述多种样本为医药品及用以制备所述医药品的溶液。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的定量装置，其中所述测定对象成分为内毒素、β葡聚糖或三磷酸腺苷。
7.一种定量用套件，其通过使用将鲎试剂活化的反应和/或三磷酸腺苷与萤光素及萤光素酶的生物化学发光反应的方法，对被测定样本中的测定对象成分的量进行定量，或者制作所述定量中所使用的校准曲线，且具有将特定量的钠离子供给至所述被测定样本或用于所述校准曲线制作的标准液的钠离子源。
8.根据权利要求7所述的定量用套件，其中所述钠离子源以所述被测定样本或用于所述校准曲线制作的标准液的钠离子浓度为135mmol/L～155mmol/L的方式供给钠离子。
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