CN109312328A - 突变型甲虫荧光素酶、基因、重组载体、转化体,以及突变型甲虫荧光素酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种突变型甲虫荧光素酶等,其在编码野生型甲虫荧光素酶的氨基酸序列中,具有以下突变:与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中、第288位的缬氨酸相当的氨基酸突变为异亮氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸;与其中第376位的亮氨酸相当的氨基酸突变为脯氨酸;与其中第455位的谷氨酸相当的氨基酸突变为缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸;或者与其中第488位的谷氨酸相当的氨基酸突变为缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或者苯丙氨酸,并且在0.9质量%的氯化钠溶液中由荧光素-荧光素酶发光反应产生的发光强度是在不含氯化钠的溶液中该反应的发光强度的50%以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种突变型甲虫荧光素酶、基因、重组载体、转化体,以及突变型甲虫荧光素酶的制备方法。
本申请要求2016年6月21日在日本提交的日本专利申请2016-122545的优先权,在此引用其内容。
背景技术
甲虫荧光素酶是一种在三磷酸腺苷(ATP)、镁离子和氧气的存在下催化氧化萤火虫荧光素并使其发光的酶。因此,甲虫荧光素酶及使用该酶的荧光素-荧光素酶发光反应,广泛应用于以ATP为指标检测样本中的微生物为目的的检查,例如微生物污染ATP检查或内毒素发光检查。
为了提高甲虫荧光素酶在ATP检测中的实用性,迄今已经制作了各种突变型甲虫荧光素酶。作为这样的突变型甲虫荧光素酶,已知有增强热稳定性的荧光素酶(例如,参见专利文献1)、提高底物亲和性的荧光素酶(例如,参见专利文献2)、改变发光波长的荧光素酶(例如,参见专利文献3)、增强发光持续性的荧光素酶(例如,参见专利文献4)、具有表面活性剂抗性的荧光素酶(例如,参见专利文献5)、增强发光强度的荧光素酶(例如,参见专利文献6)等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利第3048466号公报
专利文献2:日本特表2001-518799号公报
专利文献3:日本专利第2666561号公报
专利文献4:日本特开2000-197484号公报
专利文献5:日本特开平11-239493号公报
专利文献6:日本特开2007-97577号公报
发明内容
发明所要解决的问题
野生型甲虫荧光素酶在约0.9质量%的氯化钠水溶液中酶反应被抑制,与不含氯化钠的水溶液中相比,发光强度降低至约20%~50%。如专利文献1~6中所述的现有公知的突变型甲虫荧光素酶也同样地在约0.9质量%的氯化钠水溶液中发光强度降低。因此,对于透析液或输液等含有生理盐水水平的氯化钠的样本,在利用这些甲虫荧光素酶进行荧光素-荧光素酶发光反应时,存在着因氯化钠的发光抑制作用而导致ATP检测的测定灵敏度降低的问题。
因此,本发明的目的在于提供一种突变型甲虫荧光素酶,其与野生型甲虫荧光素酶相比,不易受到氯化钠的发光抑制影响。
用于解决问题的技术方案
为了实现上述目的,本发明人进行了深入研究,发现通过将野生型甲虫荧光素酶的氨基酸序列中特定位置的氨基酸置换为特定的其他氨基酸,即可防止氯化钠的发光抑制影响,从而完成了本发明。
即,根据本发明的突变型甲虫荧光素酶、基因、重组载体、转化体,以及突变型甲虫荧光素酶的制备方法为下述的[1]~[13]。
[1]一种突变型甲虫荧光素酶,其是在野生型甲虫荧光素酶中引入突变的突变型甲虫荧光素酶,其特征在于,
在编码野生型甲虫荧光素酶的氨基酸序列中,至少具有选自由下述(a)、(b)、(c)和(d)组成的组中的一种以上的突变,
在0.9质量%的氯化钠溶液中由荧光素-荧光素酶发光反应产生的发光强度为在不含氯化钠的溶液中该反应的发光强度的50%以上,
(a)与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第288位的缬氨酸相当的氨基酸突变为异亮氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸;
(b)与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第376位的亮氨酸相当的氨基酸突变为脯氨酸;
(c)与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第455位的谷氨酸相当的氨基酸突变为缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸;以及
(d)与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第488位的谷氨酸相当的氨基酸突变为缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸。
[2]上述[1]中所述的突变型甲虫荧光素酶,其中,所述野生型甲虫荧光素酶是野生型北美萤火虫荧光素酶。
[3]上述[1]中所述的突变型甲虫荧光素酶,其中,
所述野生型甲虫荧光素酶是野生型平家萤荧光素酶,
所述野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第288位的缬氨酸相当于野生型平家萤荧光素酶的氨基酸序列中第290位的缬氨酸;
所述野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第376位的亮氨酸相当于野生型平家萤荧光素酶的氨基酸序列中第378位的亮氨酸;
所述野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第455位的谷氨酸相当于野生型平家萤荧光素酶的氨基酸序列中第457位的谷氨酸;
所述野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第488位的谷氨酸相当于野生型平家萤荧光素酶的氨基酸序列中第490位的谷氨酸。
[4]上述[1]中所述的突变型甲虫荧光素酶,其中,
所述野生型甲虫荧光素酶是野生型源氏萤荧光素酶,
所述野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第288位的缬氨酸相当于野生型源氏萤荧光素酶的氨基酸序列中第290位的缬氨酸;
所述野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第376位的亮氨酸相当于野生型源氏萤荧光素酶的氨基酸序列中第378位的亮氨酸;
所述野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第455位的谷氨酸相当于野生型源氏萤荧光素酶的氨基酸序列中第457位的谷氨酸;
所述野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第488位的谷氨酸相当于野生型源氏萤荧光素酶的氨基酸序列中第490位的谷氨酸。
[5]上述[1]中所述的突变型甲虫荧光素酶,其中,
所述野生型甲虫荧光素酶是野生型发光叩甲虫荧光素酶,
在编码所述野生型甲虫荧光素酶的氨基酸序列中,至少具有选自由所述(a)、(c)和(d)组成的组中的一种以上的突变,
所述野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第288位的缬氨酸相当于野生型发光叩甲虫荧光素酶的氨基酸序列中第285位的缬氨酸;
所述野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第455位的谷氨酸相当于野生型发光叩甲虫荧光素酶的氨基酸序列中第452位的谷氨酸;
所述野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第488位的谷氨酸相当于野生型发光叩甲虫荧光素酶的氨基酸序列中第489位的谷氨酸。
[6]上述[1]~[5]中的任一项中所述的突变型甲虫荧光素酶,其中,具有所述(a)和(d)的突变。
[7]上述[1]~[4]中的任一项中所述的突变型甲虫荧光素酶,其中,具有选自由所述(a)、(b)和(d)组成的组中的两种以上的突变。
[8]上述[1]~[7]中的任一项中所述的突变型甲虫荧光素酶,其中,所述(a)、(c)和(d)分别是下述(a’)、(c’)和(d’):
(a’)与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第288位的缬氨酸相当的氨基酸突变为异亮氨酸;
(c’)与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第455位的谷氨酸相当的氨基酸突变为缬氨酸;以及
(d’)与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第488位的谷氨酸相当的氨基酸突变为缬氨酸。
[9]上述[1]~[8]中的任一项中所述的突变型甲虫荧光素酶,其在0.9质量%的氯化钠溶液中由荧光素-荧光素酶发光反应产生的发光强度大于野生型甲虫荧光素酶的发光强度。
[10]一种基因,其由上述[1]~[9]中的任一项所述的突变型甲虫荧光素酶进行编码。
[11]一种重组载体,其含有上述[10]中所述的基因。
[12]一种转化体,其携带上述[11]中所述的重组载体。
[13]一种突变型甲虫荧光素酶的制备方法,具有以下步骤:
培养步骤,培养上述[12]中所述的转化体,得到培养物;和
回收步骤,从由所述培养步骤所得到的培养物中回收突变型甲虫荧光素酶。
发明效果
根据本发明,提供一种突变型甲虫荧光素酶,其与野生型甲虫荧光素酶相比,不易受到氯化钠的发光抑制影响。通过使用该突变型甲虫荧光素酶进行荧光素-荧光素酶发光反应,可以对氯化钠浓度相当于生理盐水的样本进行高灵敏度ATP检测。
另外,通过使用根据本发明的基因、重组载体、转化体以及突变型甲虫荧光素酶的制备方法,能够高效地制备根据本发明的突变型甲虫荧光素酶。
附图说明
图1是绘制出了针对实施例2中各反应溶液的氯化钠浓度(mM)的、各甲虫荧光素酶的发光强度测定值(RLU)的图。
图2是绘制出了针对实施例3中各反应溶液的内毒素浓度的、野生型北美萤火虫荧光素酶的发光强度测定值(RLU)的图。
图3是绘制出了针对实施例3中各反应溶液的内毒素浓度的、突变型北美萤火虫荧光素酶(突变体(V288I+E488V))的发光强度测定值(RLU)的图。
具体实施方式
本发明和本申请的说明书中,除非另有说明,甲虫荧光素酶的“发光强度”是指在荧光素-荧光素酶发光反应中峰值时的发光强度,即,在ATP、二价金属离子和氧气的存在下,该甲虫荧光素酶与萤火虫荧光素反应的峰值时的发光强度。予以说明,“发光强度”越大则可以判定该甲虫荧光素酶的荧光素酶活性越强。
本申请的说明书中,甲虫荧光素酶的“残留活性(%)”是指将不含氯化钠的溶液中的发光强度作为100%时,0.9质量%氯化钠溶液中的发光强度的相对值([0.9质量%氯化钠溶液中的发光强度]/[不含氯化钠的溶液中的发光强度]×100)(%)。予以说明,荧光素-荧光素酶发光反应的反应溶液为“不含氯化钠的溶液”,其是指不混配氯化钠而制备的反应溶液。为了计算残留活性而进行荧光素-荧光素酶发光反应时的“不含氯化钠的溶液”与“0.9质量%的氯化钠溶液”,除了氯化钠以外的组成完全相同,反应温度及时间等反应条件也一致。
[突变型甲虫荧光素酶]
根据本发明的突变型甲虫荧光素酶是一种在野生型甲虫荧光素酶中引入突变的突变型甲虫荧光素酶,该突变型甲虫荧光素酶在0.9质量%氯化钠溶液中的发光强度为在不含氯化钠的溶液中的发光强度的50%以上。根据本发明的突变型甲虫荧光素酶的荧光素酶活性中,残留活性只要在50%以上即可,优选60%以上,更优选70%以上,进一步优选80%以上,更进一步优选90%以上。
根据本发明的突变型甲虫荧光素酶与野生型甲虫荧光素酶同样地可以用于荧光素-荧光素酶发光反应中,由于不易受到氯化钠的发光抑制影响,因此特别适合用于在对含氯化钠的样本进行荧光素-荧光素酶发光反应时的甲虫荧光素酶。例如,对于从人类等动物收集的样本和输注给人类等的输液或透析液,在为了以微生物检测为目的的ATP含量测定而进行荧光素-荧光素酶发光反应时,通过使用根据本发明的突变型甲虫荧光素酶,从而能够以更高的灵敏度检测ATP。
根据本发明的突变型甲虫荧光素酶在编码野生型甲虫荧光素酶的氨基酸序列中,至少具有选自由下述(a)、(b)、(c)和(d)组成的组中的一种以上的突变:
(a)与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第288位的缬氨酸相当的氨基酸突变为异亮氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸;
(b)与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第376位的亮氨酸相当的氨基酸突变为脯氨酸;
(c)与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第455位的谷氨酸相当的氨基酸突变为缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸;
(d)与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第488位的谷氨酸相当的氨基酸突变为缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸。
本发明和本申请的说明书中,“野生型甲虫荧光素酶”可举出:北美萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶(SEQ ID NO:1)、平家萤(Luciola lateralis)荧光素酶(SEQID NO:2)、源氏萤(Luciola cruciata)荧光素酶(SEQ ID NO:3)、东欧萤火虫(Luciolamingrelica)荧光素酶、大萤火虫(Lampyris noctiluca)荧光素酶、发光叩甲虫(Pyrophorus plagiophthalamus)荧光素酶(SEQ ID NO:4)等。予以说明,各种野生型甲虫荧光素酶的氨基酸序列可以在数据库(例如,EMBL-EBI数据库(http://www.ebi.ac.uk/queries/))中检索到。
当野生型甲虫荧光素酶不是北美萤火虫荧光素酶时,该野生型甲虫荧光素酶的氨基酸序列中的、“与北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第X位的氨基酸相当的氨基酸”是指使用氨基酸序列同源性分析软件(例如,Micro GenieTM(贝克曼公司制))等,以具有最高同源性的方式对该野生型甲虫荧光素酶和北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列进行比对时,位于与“北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第X位的氨基酸”相对应的位置上的氨基酸。
具体来说,与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第288位的缬氨酸相当的氨基酸分别相当于:野生型平家萤荧光素酶的氨基酸序列中第290位的缬氨酸、野生型源氏萤荧光素酶的氨基酸序列中第290位的缬氨酸、野生型发光叩甲虫荧光素酶的氨基酸序列中第285位的缬氨酸。野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第376位的亮氨酸分别相当于:野生型平家萤荧光素酶的氨基酸序列中第378位的亮氨酸、野生型源氏萤荧光素酶的氨基酸序列中第378位的亮氨酸。野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第455位的谷氨酸分别相当于:野生型平家萤荧光素酶的氨基酸序列中第457位的谷氨酸、野生型源氏萤荧光素酶的氨基酸序列中第457位的谷氨酸、野生型发光叩甲虫荧光素酶的氨基酸序列中第452位的谷氨酸。野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第488位的谷氨酸分别相当于:野生型平家萤荧光素酶的氨基酸序列中第490位的谷氨酸、野生型源氏萤荧光素酶的氨基酸序列中第490位的谷氨酸、野生型发光叩甲虫荧光素酶的氨基酸序列中第489位的谷氨酸。
当根据本发明的突变型甲虫荧光素酶具有所述(a)的突变时,作为该突变,与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第288位的缬氨酸相当的氨基酸优选突变为异亮氨酸或亮氨酸,更优选突变为异亮氨酸。
当根据本发明的突变型甲虫荧光素酶具有所述(c)的突变时,作为该突变,与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第455位的谷氨酸相当的氨基酸优选突变为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或丙氨酸,更优选突变为缬氨酸。
当根据本发明的突变型甲虫荧光素酶具有所述(d)的突变时,作为该突变,与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第488位的谷氨酸相当的氨基酸优选突变为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或丙氨酸,更优选突变为缬氨酸。
根据本发明的突变型甲虫荧光素酶可以只具有所述(a)、(b)、(c)和(d)的突变中的一种,也可以具有该等突变中的两种以上的组合。其中,从0.9质量%的氯化钠溶液中由荧光素-荧光素酶发光反应产生的发光强度大于野生型甲虫荧光素酶的发光强度的观点出发,优选:所述(a)、(b)、(c)和(d)的突变中,只具有所述(a)突变的突变型甲虫荧光素酶;只具有所述(b)突变的突变型甲虫荧光素酶;只具有所述(d)突变的突变型甲虫荧光素酶;具有所述(a)和(b)突变的突变型甲虫荧光素酶;具有所述(a)和(d)突变的突变型甲虫荧光素酶;或者具有所述(a)、(b)和(d)突变的突变型甲虫荧光素酶。进一步从残留活性也较高的观点出发,更优选:所述(a)、(b)、(c)和(d)的突变中,只具有所述(a)突变的突变型甲虫荧光素酶;只具有所述(d)突变的突变型甲虫荧光素酶;具有所述(a)和(b)突变的突变型甲虫荧光素酶;具有所述(a)和(d)突变的突变型甲虫荧光素酶;或者具有所述(a)、(b)和(d)突变的突变型甲虫荧光素酶。
作为根据本发明的突变型甲虫荧光素酶,例如可举出:与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第288位的缬氨酸相当的、氨基酸被置换为异亮氨酸的突变型甲虫荧光素酶,与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第376位的亮氨酸相当的、氨基酸被置换为脯氨酸的突变型甲虫荧光素酶,与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第455位的谷氨酸相当的、氨基酸被置换为缬氨酸的突变型甲虫荧光素酶,与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第488位的谷氨酸相当的、氨基酸被置换为缬氨酸的突变型甲虫荧光素酶,与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第288位的缬氨酸相当的、氨基酸被置换为异亮氨酸且与第376位的亮氨酸相当的、氨基酸被置换为脯氨酸的突变型甲虫荧光素酶,与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第288位的缬氨酸相当的、氨基酸被置换为异亮氨酸且与第488位的谷氨酸相当的、氨基酸被置换为缬氨酸的突变型甲虫荧光素酶,与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第288位的缬氨酸相当的、氨基酸被置换为异亮氨酸且与第376位的亮氨酸相当的、氨基酸被置换为脯氨酸且与第488位的谷氨酸相当的、氨基酸被置换为缬氨酸的突变型甲虫荧光素酶等。
根据本发明的突变型甲虫荧光素酶具有所述(a)、(b)、(c)和(d)的突变中的至少一种,从而耐盐性得到提高,与野生型甲虫荧光素酶相比,荧光素酶活性不易受到氯化钠的抑制。虽然通过这些特定突变而使耐盐性得到提高的原因尚不清楚,但可推测原因如下:伴随有分子大小和电荷变化的氨基酸置换被引入到这些特定位置,从而使甲虫荧光素酶的酶反应中活性中心周边的三维结构发生变化,抑制荧光素氧化反应的钠离子向反应部位的入侵得到抑制。
根据本发明的突变型甲虫荧光素酶除了所述(a)、(b)、(c)和(d)的突变以外,可以与野生型甲虫荧光素酶的氨基酸序列相同,也可以相对于野生型甲虫荧光素酶的氨基酸序列具有除了所述(a)等突变以外的其他突变。该其他突变没有特别限定,只要无损于荧光素酶活性和所述(a)等突变所发挥的提高耐盐性效果的即可,例如可举出专利文献1~6所记载的突变等。
作为根据本发明的突变型甲虫荧光素酶,例如可举出下述(1)~(3)的蛋白质:
(1)由在野生型甲虫荧光素酶的氨基酸序列中引入如下突变而得到的氨基酸序列组成的蛋白质,所述突变是选自由所述(a)、(b)、(c)和(d)组成的组中的一种以上的突变。
(2)由在野生型甲虫荧光素酶的氨基酸序列中具有如下突变的氨基酸序列组成且具有荧光素酶活性的蛋白质,所述突变是选自由所述(a)、(b)、(c)和(d)组成的组中的一种以上的突变,以及缺失、置换或增添一个或多个氨基酸的突变。
(3)由与野生型甲虫荧光素酶的氨基酸序列的序列一致性为80%以上的具有如下突变的氨基酸序列组成且具有荧光素酶活性的蛋白质,所述突变是选自由所述(a)、(b)、(c)和(d)组成的组中的一种以上的突变。
所述(2)的蛋白质中,除了所述(a)、(b)、(c)和(d)的突变以外,相对于野生型甲虫荧光素酶的氨基酸序列所缺失、置换或者增添的氨基酸的数目,优选为1~20个,更优选为1~10个,进一步优选为1~5个。
所述(3)的蛋白质中,与野生型甲虫荧光素酶的氨基酸序列的序列一致性没有特别限定,只要为80%以上且小于100%即可,优选为85%以上且小于100%,更优选为90%以上且小于100%,进一步优选为95%以上且小于100%,特别优选为98%以上且小于100%。
予以说明,关于氨基酸序列彼此之间的序列一致性(同源性),通过将两个氨基酸序列以使所对应的氨基酸达到最多一致的方式一边在相当于插入和缺失的部分加入空位(gap)一边使该两个氨基酸序列并列配置,求出在得到的比对中一致的氨基酸相对于除空位以外的氨基酸序列整体的比例来获得。氨基酸序列彼此之间的序列一致性可使用本技术领域中公知的各种同源性检索软件来求得。
作为根据本发明的突变型甲虫荧光素酶,可以在具有荧光素酶活性的区域的N末端或C末端添加各种标签。所述标签例如可以使用组氨酸标签、HA(hemagglutinin,血凝素)标签、Myc标签和Flag标签等广泛用于重组蛋白质表达与纯化的标签。
[突变型甲虫荧光素酶基因]
根据本发明的突变型甲虫荧光素酶编码基因(突变型甲虫荧光素酶基因)可以通过适当修饰野生型甲虫荧光素酶基因来获得。根据本发明的突变型甲虫荧光素酶基因可以是以将突变引入野生型甲虫荧光素酶基因的方式对编码相应氨基酸的密码子进行修饰而得到的基因,进而也可以是将简并密码子修饰为宿主的密码子使用频率较高的密码子而得到的基因。
本发明和本申请的说明书中,“基因”包含DNA或RNA,是编码蛋白质的多核苷酸。此外,基因修饰可以通过本领域技术人员熟知的方法进行,如定点突变、随机突变、有机合成等。
定点突变或随机突变以野生型甲虫荧光素酶基因或含有野生型甲虫荧光素酶基因的重组载体为模板来进行。野生型甲虫荧光素酶基因或含有野生型甲虫荧光素酶基因的重组载体可以通过本领域技术人员熟知的方法(例如,如《基因工程实验笔记》(遺伝子工学実験ノート,羊土社)、日本特开平1-51086号公报、日本专利第3048466号公报等中所述的方法)来制备。此外,也可以使用市售产品。
定点突变可以通过本领域技术人员熟知的方法来进行,如使用选择引物和诱导突变引物并通过T4DNA聚合酶合成的方法等。在以含有野生型甲虫荧光素酶基因的重组载体为模板,使用选择引物和诱导突变引物进行定点突变时,例如,当将含有存在于所述重组载体内的限制酶识别序列和一个碱基不同的序列的DNA片段用作选择引物时,则由于未引入突变的重组载体中所述限制酶识别序列仍然存在,因此通过用对应的限制酶进行酶切处理,可以选择性地除去未引入突变的重组载体。
随机突变可以通过本领域技术人员熟知的方法来进行,例如,通过加入锰和dGTP降低保真度(fidelity)来进行聚合酶链反应(PCR)的方法、与试剂(羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等)接触的方法、照射紫外线的方法等。当进行随机突变时,通过对进行突变引入的基因的碱基序列进行确定,可以筛选出作为目标的突变型甲虫荧光素酶基因或含有该突变型甲虫荧光素酶基因的重组载体。
可以通过双脱氧法等本领域技术人员熟知的方法来确定引入突变的基因的碱基序列。予以说明,各种野生型甲虫荧光素酶基因(cDNA)的碱基序列可以在数据库(例如,EMBL Nucleotide Sequence Database(http://www.ebi.ac.uk/embl/))中检索到。
[重组载体]
根据本发明的重组载体含有根据本发明的突变型甲虫荧光素酶基因。
该重组载体可以根据本领域技术人员所熟知的方法,将根据本发明的突变型甲虫荧光素酶基因插入到如下载体中而得到,所述载体可以在质粒、噬菌体等宿主细胞中复制。该突变型甲虫荧光素酶基因可以通过如下方法插入于载体:将该突变型甲虫荧光素酶基因中增添了适当限制酶识别序列的DNA片段用对应的限制酶消化,将得到的基因片段插入到载体的对应限制酶识别序列或多克隆位点中并连接到载体上。
另外,该重组载体也可以如上所述通过在含有野生型甲虫荧光素酶基因的重组载体中引入突变而得到。
作为质粒可举出:来自于大肠杆菌的质粒(pET28a(+)、pGL2、pBR322、pUC18、pTrcHis、pBlueBacHis等)、来自于枯草芽孢杆菌的质粒(pUB110、pTP5等)、来自于酵母的质粒(YEp13、YEp24、YCp50、pYE52等)等,作为噬菌体可举出λ噬菌体等。
作为根据本发明的重组载体,优选在被引入宿主细胞时,能够利用该宿主细胞的表达系统表达突变型甲虫荧光素酶的重组载体。因此,作为根据本发明的重组载体,优选作为表达盒而被掺入的载体,所述表达盒在根据本发明的突变型甲虫荧光素酶基因的上游配置有在宿主细胞内发挥作用的适当启动子。在该表达盒中可以根据需要配置增强子、终止子、剪接信号、poly(A)加尾信号、核糖体结合序列(SD序列)等。
突变型甲虫荧光素酶的表达盒中,在突变型甲虫荧光素酶基因的上游配置的启动子序列可以是来源于与引入突变之前的野生型甲虫荧光素酶基因相同生物种类的启动子,也可以是来源于不同生物种类的启动子,也可以是人工合成的启动子。例如,当宿主细胞为大肠杆菌时,作为控制突变型甲虫荧光素酶基因表达的启动子可举出:trp启动子、lac启动子、T7启动子、PL启动子、PR启动子等。
根据本发明的重组载体,优选除了突变型甲虫荧光素酶的表达盒以外,同时含有用于筛选已转化细胞和未转化细胞的选择标记基因。作为该选择标记基因例如可举出:卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、双丙氨膦抗性基因等药物抗性基因。
如果将根据本发明的突变型甲虫荧光素酶基因用作报告基因,则能够以足够高的灵敏度进行报告检测。这样的报告检测可以利用含有所述突变型甲虫荧光素酶基因的根据本发明的重组载体来进行。
[转化体]
根据本发明的转化体携带根据本发明的重组载体。
根据本发明的转化体可以根据本领域技术人员所熟知的方法,通过将所述重组载体导入宿主细胞中而得到。将所述重组载体导入到宿主细胞可以通过氯化钙法、电穿孔法、聚乙二醇法、脂质体转染法、粒子枪法等本领域技术人员所熟知的方法来进行。
作为宿主细胞可举出:大肠杆菌(Escherichia coli),枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等细菌,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等酵母,曲霉(Aspergillus)属菌等丝状菌,Sf9细胞、Sf21细胞等昆虫细胞,COS细胞、CHO细胞等哺乳细胞等。作为根据本发明的转化体,从生长迅速且容易操作的观点出发,优选以大肠杆菌为宿主得到的转化体。
[突变型甲虫荧光素酶的制备方法]
根据本发明的突变型甲虫荧光素酶的制备方法具有如下步骤:培养根据本发明的转化体得到培养物的培养步骤、以及从由所述培养步骤所得到的培养物中回收突变型甲虫荧光素酶的回收步骤。通过该制备方法,可以得到根据本发明的突变型甲虫荧光素酶。
培养步骤是培养根据本发明的转化体而得到培养物的步骤。本文中,“培养物”可以是培养上清液、培养细胞和细胞破碎物中的任意一种。
所述转化体可以通过本领域技术人员所熟知的方法进行培养。用于所述转化体培养的培养基,例如,当宿主细胞为大肠杆菌、酵母等微生物时,只要是含有可同化微生物的碳源(葡萄糖、蔗糖、乳糖等)、氮源(蛋白胨、肉提取物、酵母提取物等)、无机盐类(磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐等)等,并且能够有效培养宿主细胞的培养基即可,可以是天然培养基和合成培养基中的任意一种,此外也可以是液体培养基和固体培养基中的任意一种。进行振荡培养、搅拌培养、静态培养等任意一种,或者其他培养条件(培养温度、培养基的pH、培养时间等)可以根据使用的宿主细胞、培养基等进行适当确定。例如,当宿主细胞为大肠杆菌时,培养温度通常为30℃~42℃,优选为37℃。培养基的pH通常为6.4~8.0,优选为7.0~7.4。当培养温度为37℃时,培养时间通常在预培养中为8小时~20小时,优选为12小时~16小时,在诱导表达前的正式培养中为2小时~8小时,优选为2小时~4小时。然而,最佳培养时间根据培养温度和培养基的pH来确定。
培养基中可以根据需要加入表达诱导物质。作为这样的表达诱导物质例如可举出:当所述重组载体含有lac启动子时为异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)等,此外当含有trp启动子时为吲哚丙烯酸(IAA)等。
当使用对抗生物质(卡那霉素、氨苄青霉素等)有抗性的载体制作所述重组载体时,通过在培养基中预先加入该抗生物质,可以将抗生物质抗性用于所述转化体的选择标记。
回收步骤是从由培养步骤中所得到的培养物中回收根据本发明的突变型甲虫荧光素酶的步骤。所述突变型甲虫荧光素酶可以通过本领域技术人员所熟知的方法进行回收,例如,通过离心分离从培养物中回收转化体,并对转化体进行冻融处理、超声波破碎处理,或者利用溶菌酶等溶菌酶的处理,从而从转化体回收突变型甲虫荧光素酶。予以说明,所述突变型甲虫荧光素酶也可以以溶液状态进行回收。
所述制备方法也可以在回收步骤之后,进一步对回收步骤中所得到的所述突变型甲虫荧光素酶(粗酶)进行纯化的纯化步骤。粗酶可以通过分别单独实施或适当组合如下方法来进行纯化,例如,硫酸铵沉淀、SDS-PAGE、凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和色谱等。
实施例
下面,示出实施例并对本发明作进一步详细说明,但本发明不限于以下实施例。
[实施例1]
制备如下突变型北美萤火虫荧光素酶,并测定其荧光素酶活性(发光强度):野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第288位的缬氨酸被置换为异亮氨酸的突变型北美萤火虫荧光素酶(突变体(V288I)),野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第376位的亮氨酸被置换为脯氨酸的突变型北美萤火虫荧光素酶(突变体(L376P)),野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第455位的谷氨酸被置换为缬氨酸的突变型北美萤火虫荧光素酶(突变体(E455V)),野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第488位的谷氨酸被置换为缬氨酸的突变型北美萤火虫荧光素酶(突变体(E488V)),野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第288位的缬氨酸被置换为异亮氨酸、且第376位的亮氨酸被置换为脯氨酸的突变型北美萤火虫荧光素酶(突变体(V288I+L376P)),野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第288位的缬氨酸被置换为异亮氨酸、且第488位的谷氨酸被置换为缬氨酸的突变型北美萤火虫荧光素酶(突变体(V288I+E488V)),野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第288位的缬氨酸被置换为异亮氨酸、且第376位的亮氨酸被置换为脯氨酸、且第488位的谷氨酸被置换为缬氨酸的突变型北美萤火虫荧光素酶(突变体(V288I+L376P+E488V))。
<含有突变型北美萤火虫荧光素酶基因的重组载体的制作>
首先,将野生型北美萤火虫荧光素酶基因(cDNA)(SEQ ID NO:5)整合到市售质粒(pGL2-Basic Vector(Promega公司制))中得到的重组质粒作为模板,使用含限制酶NcoI识别序列的引物(5'-gactccatggaagacgccaaaaac-3',SEQ ID NO:6)和含限制酶XhoI识别序列的引物(5'-gacactcgagcaatttggactttccgcc-3',SEQ ID NO:7)与TITANIUM Taq DNA聚合酶(Clontech公司制)进行PCR,得到在两端添加有限制酶识别序列的含有野生型北美萤火虫荧光素酶基因的DNA片段。所得到的DNA片段的碱基序列使用DTCS Quick StartMaster Mix试剂盒和电泳分析装置CEQ8000(均为Beckman Coulter公司制)来确定。对该DNA片段用限制酶NcoI和XhoI酶切,将其使用DNALigation Kit(BioDynamics Laboratory公司制)整合到预先用NcoI和XhoI酶切的质粒(pET-28a(+)plasmid DNA(Novagen公司制))中,从而制备成用于表达在C末端侧添加有组氨酸标签的野生型北美萤火虫荧光素酶的重组载体。予以说明,pET-28a(+)含有T7启动子和T7终止子,是含有以在待表达目标蛋白质的C末端侧添加有组氨酸标签的方式在克隆位点附近编码组氨酸标签的基因的载体。
接着,以所得到的重组载体作为模板,使用Transformer定点突变试剂盒(Clontech公司制)进行定点突变。作为选择引物使用pET-28a(+)中含有限制酶FspI识别序列和一个碱基不同的碱基序列的引物(5'-cacgatcatgagcacccgtgg-3',SEQ ID NO:8)。予以说明,用于得到选择引物和各突变体的基因的诱导突变引物,预先用T4多核苷酸激酶(TOYOBO公司制)使5’末端磷酸化。
使用Transformer定点突变试剂盒带有的T4DNA聚合酶和T4DNA连接酶,合成重组质粒。将连接酶反应后的反应物用限制酶FspI酶切处理后,将未被FspI酶切的重组质粒导入到大肠杆菌的错配修复缺陷菌株BMH71-18mutS,培养大肠杆菌。所得到的重组质粒进一步用FspI进行酶切处理,选择未被FspI酶切的重组质粒作为引入突变的重组载体。
引入突变的重组载体中突变型北美萤火虫荧光素酶基因(DNA)的碱基序列使用DTCS Quick Start Master Mix试剂盒和电泳分析装置CEQ8000(均为Beckman Coulter公司制)来确定。由此,制备了整合有目标突变体编码基因的重组载体。编码突变体(V288I)的碱基序列表示为SEQ ID NO:9;编码突变体(L376P)的碱基序列表示为SEQ ID NO:10;编码突变体(E455V)的碱基序列表示为SEQ ID NO:11;编码突变体(E488V)的碱基序列表示为SEQ ID NO:12;编码突变体(V288I+L376P)的碱基序列表示为SEQ ID NO:13;编码突变体(V288I+E488V)的碱基序列表示为SEQ ID NO:14;编码突变体(V288I+L376P+E488V)的碱基序列表示为SEQ ID NO:15。
<转化大肠杆菌的制作>
通过氯化钙法,将含有各突变型北美萤火虫荧光素酶基因的重组载体导入到基因组DNA中整合有T7RNA聚合酶基因的大肠杆菌HMS174(DE3)株(Novagen公司制)中,并将该大肠杆菌在含30μg/mL卡那霉素的选择性琼脂培养基上进行平板培养,以筛选转化大肠杆菌。
<突变型北美萤火虫荧光素酶的回收和纯化>
使用振荡培养机(高崎科学器械株式会社制)将经卡那霉素筛选的转化大肠杆菌在37℃下、200mL的2×YT培养基(含30μg/mL卡那霉素)中振荡培养2.5小时,随后加入200μL的100mM IPTG使培养基中的IPTG浓度为0.1mM,在25℃下诱导表达6小时。予以说明,IPTG是消除lac阻遏物引起的表达抑制并诱导T7RNA聚合酶的表达诱导物质。
通过对培养液在8000rpm下离心分离5分钟来回收大肠杆菌的菌体,并在-20℃冷冻保存。冷冻菌体用5mL结合缓冲液(含500mM NaCl和20mM咪唑的20mM NaH2PO4(pH7.4))解冻并悬浮,然后利用超音波破碎。得到的菌体破碎液在9000rpm下离心分离30分钟,回收上清液作为突变型北美萤火虫荧光素酶(粗酶)的溶液。
由于在表达的突变型萤火虫荧光素酶的C末端侧添加有组氨酸标签,因此用镍离子金属螯合亲和层析来纯化粗酶。首先,将0.5mL镍-琼脂糖凝胶(Ni Sepharose 6FastFlow,安玛西亚生物技术公司制)填充到色谱柱(PIERCE公司制一次性聚苯乙烯柱(Disposable Polystyrene Column))中,用结合缓冲液进行平衡。接着,将5mL粗酶溶液加到色谱柱中,用结合缓冲液洗涤,然后用2.5mL洗脱缓冲液(含500mM NaCl和500mM咪唑的20mM NaH2PO4(pH7.4))洗脱出突变型北美萤火虫荧光素酶。进一步,使用PD-10脱盐柱(Desalting column,安玛西亚生物技术公司制),洗脱缓冲液置换为3.5mL反应缓冲液(含10mM MgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4))。从而得到纯化的突变型北美萤火虫荧光素酶。
<突变型北美萤火虫荧光素酶发光强度的测定>
使用基于Bradford法的Bio-Rad蛋白测定试剂盒(Bio-Rad Protein Assay,BIORAD公司制),以IgG为标准对得到的突变型北美萤火虫荧光素酶进行蛋白质定量。将50μL含有突变型北美萤火虫荧光素酶(20μg/mL)的反应缓冲液加入到96孔板(Nunc公司制的LuminuncTM酶标板)中,然后使用酶标仪(Perkin-Elmer公司制的ARVO MX)附带的喷射器,加入50μL含氯化钠的底物缓冲液(含1.8质量%氯化钠、2×10-6M D-萤火虫荧光素(和光纯药工业公司制)、2×10-7M ATP和10mM MgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4))或50μL不含氯化钠的底物缓冲液(含2×10-6M D-萤火虫荧光素(和光纯药工业公司制)、2×10-7M ATP和10mM MgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4))。接着,用所述酶标仪测定发光强度。加入了含氯化钠的底物缓冲液的反应溶液的氯化钠最终浓度为0.9质量%。对于野生型北美萤火虫荧光素酶,使用含有野生型北美萤火虫荧光素酶基因(cDNA)的重组载体来代替含有突变型北美萤火虫荧光素酶基因的重组载体,除此以外,与突变型北美萤火虫荧光素酶同样地制作转化大肠杆菌,进行酶的收集和纯化,并测定酶的发光强度。
对于野生型和各突变体,由发光强度测定值计算残留活性(%)。计算结果如表1所示。表1中,“No NaCl”列表示在不含氯化钠的反应溶液的发光强度测定值,“+0.9%NaCl”列表示含0.9质量%氯化钠的反应溶液的发光强度(相对光单位,Relative Light Unit;RLU)的测定值。
[表1]
由上述结果可知,在野生型中,残留活性非常低至约40%,氯化钠引起的发光抑制影响很大,而在任意的突变体中残存率均为50%以上,与野生型相比耐盐性得到提高。其中,在第288位、第376位或第488位引入突变的突变体中,在存在0.9质量%氯化钠的条件下的发光强度高于野生型的发光强度,荧光素酶活性强,特别是突变体(V288I+L376P)、突变体(V288I+E488V)和突变体(V288I+L376P+E488V)中残留活性高达85%以上,即使是在存在氯化钠的条件下,也能够以与不存在氯化钠的条件下基本相同程度的灵敏度对ATP进行检测。
[实施例2]
对于根据本发明的突变型甲虫荧光素酶,考察了氯化钠浓度对荧光素酶活性的影响。作为甲虫荧光素酶使用了实施例1中制备的野生型北美萤火虫荧光素酶、突变体(V288I+L376P)和突变体(V288I+E488V)。
具体地,在96孔板(Nunc公司制的LuminuncTM酶标板)的各孔中,分别加入混合含有甲虫荧光素酶(0.5mg/mL)的所述反应缓冲液50μL、D-萤火虫荧光素(和光纯药工业公司制,1.5mM)50μL、ATP溶液(含2×10-9M ATP和10mM MgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4))50μL和氯化钠水溶液(40mM~2.4M)或水50μL而成的反应溶液,与实施例1同样地对发光强度进行了测定。各反应溶液的最终氯化钠浓度设为0mM、10mM、50mM、100mM、140mM、200mM、400mM或600mM。
图1是绘制出了针对各反应溶液的氯化钠浓度的各甲虫荧光素酶的发光强度的图。予以说明,氯化钠浓度140mM基本相当于生理盐水的盐浓度。由此结果可知,在存在10mM~600mM的氯化钠的条件下,突变体(V288I+L376P)和突变体(V288I+E488V)的发光强度均高于野生型,耐盐性得到了提高。
[实施例3]
使用根据本发明的突变型甲虫荧光素酶,检测内毒素。作为甲虫荧光素酶使用了实施例1中制备的野生型北美萤火虫荧光素酶和突变体(V288I+E488V)。
具体地,将内毒素溶于离子交换水或1.8质量%的氯化钠水溶液中而制备的测试液体100μL加入到冻干鲎试剂(和光纯药工业公司制,Single Test Wako),并在37℃下加热10分钟,随后加入75μM的发光底物Bz-Leu-Gly-Arg-氨基荧光素水溶液50μL,进一步在37℃下加热5分钟。将此反应液100μL加入到96孔板(Nunc公司制,LuminuncTM酶标板)中,然后使用酶标仪(Perkin-Elmer公司制,ARVO MX)附带的喷射器,加入50μL含有甲虫荧光素酶(20μg/mL)的反应缓冲液(含2×10-4M ATP和10mM MgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)),与实施例1同样地测定各反应溶液的发光强度。各反应溶液的内毒素的最终浓度设为0EU/mL、0.001EU/mL或0.005EU/mL。此外,含氯化钠的内毒素溶液的氯化钠最终浓度为0.9质量%。
图2和图3是绘制出了针对各反应溶液的内毒素浓度(EU/mL)的、各甲虫荧光素酶的发光强度测定值的图。图2是野生型北美萤火虫荧光素酶的结果,图3是突变体(V288I+E488V)的结果。此外,这些图中,“no NaCl”是不含氯化钠的反应溶液的结果,“NaCl(0.9%)”是含氯化钠的反应溶液的结果。由该结果可知,在野生型中,氯化钠的最终浓度为0.9质量%的反应溶液中的发光强度明显弱于不含氯化钠的反应溶液中的发光强度,导致检测到的内毒素含量低于实际量。与此相对,在突变体(V288I+E488V)中,0.9质量%的氯化钠反应溶液中的发光强度与不含氯化钠的反应溶液中的发光强度基本相同,确认了不易受到氯化钠的发光抑制。
序列表
<110> 东亚DKK株式会社
<120> 突变型甲虫荧光素酶、基因、重组载体、转化体,以及突变型甲虫荧光素酶的制备方法
<130> J02871A1
<160> 15
<210> 1
<211> 550
<212> PRT
<213> 北美萤火虫
<220>
<223> 荧光素酶
<400> 1
Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro
1 5 10 15
Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg
20 25 30
Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu
35 40 45
Val Asn Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala
50 55 60
Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val
65 70 75 80
Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu
85 90 95
Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg
100 105 110
Glu Leu Leu Asn Ser Met Asn Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val
115 120 125
Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro
130 135 140
Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly
145 150 155 160
Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe
165 170 175
Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile
180 185 190
Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val
195 200 205
Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp
210 215 220
Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val
225 230 235 240
Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu
245 250 255
Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu
260 265 270
Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val
275 280 285
Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr
290 295 300
Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser
305 310 315 320
Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile
325 330 335
Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr
340 345 350
Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe
355 360 365
Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val
370 375 380
Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly
385 390 395 400
Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly
405 410 415
Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe
420 425 430
Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln
435 440 445
Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile
450 455 460
Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu
465 470 475 480
Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys
485 490 495
Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu
500 505 510
Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly
515 520 525
Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys
530 535 540
Gly Gly Lys Ser Lys Leu
545 550
<210> 2
<211> 548
<212> PRT
<213> 平家萤
<220>
<223> 荧光素酶
<400> 2
Met Glu Asn Met Glu Asn Asp Glu Asn Ile Val Tyr Gly Pro Glu Pro
1 5 10 15
Phe Tyr Pro Ile Glu Glu Gly Ser Ala Gly Ala Gln Leu Arg Lys Tyr
20 25 30
Met Asp Arg Tyr Ala Lys Leu Gly Ala Ile Ala Phe Thr Asn Ala Leu
35 40 45
Thr Gly Val Asp Tyr Thr Tyr Ala Glu Tyr Leu Glu Lys Ser Cys Cys
50 55 60
Leu Gly Glu Ala Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Val Val Asp Gly Arg Ile
65 70 75 80
Ala Leu Cys Ser Glu Asn Cys Glu Glu Phe Phe Ile Pro Val Leu Ala
85 90 95
Gly Leu Phe Ile Gly Val Gly Val Ala Pro Thr Asn Glu Ile Tyr Thr
100 105 110
Leu Arg Glu Leu Val His Ser Leu Gly Ile Ser Lys Pro Thr Ile Val
115 120 125
Phe Ser Ser Lys Lys Gly Leu Asp Lys Val Ile Thr Val Gln Lys Thr
130 135 140
Val Thr Ala Ile Lys Thr Ile Val Ile Leu Asp Ser Lys Val Asp Tyr
145 150 155 160
Arg Gly Tyr Gln Ser Met Asp Asn Phe Ile Lys Lys Asn Thr Pro Pro
165 170 175
Gly Phe Lys Gly Ser Ser Phe Lys Thr Val Glu Val Asn Arg Lys Glu
180 185 190
Gln Val Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys
195 200 205
Gly Val Gln Leu Thr His Glu Asn Ala Val Thr Arg Phe Ser His Ala
210 215 220
Arg Asp Pro Ile Tyr Gly Asn Gln Val Ser Pro Gly Thr Ala Ile Leu
225 230 235 240
Thr Val Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly
245 250 255
Tyr Leu Thr Cys Gly Phe Arg Ile Val Met Leu Thr Lys Phe Asp Glu
260 265 270
Glu Thr Phe Leu Lys Thr Leu Gln Asp Tyr Lys Cys Ser Ser Val Ile
275 280 285
Leu Val Pro Thr Leu Phe Ala Ile Leu Asn Arg Ser Glu Leu Leu Asp
290 295 300
Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu Val Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro
305 310 315 320
Leu Ser Lys Glu Ile Gly Glu Ala Val Ala Arg Arg Phe Asn Leu Pro
325 330 335
Gly Val Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Ile
340 345 350
Ile Thr Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Ser Gly Lys Val Val
355 360 365
Pro Leu Phe Lys Ala Lys Val Ile Asp Leu Asp Thr Lys Lys Thr Leu
370 375 380
Gly Pro Asn Arg Arg Gly Glu Val Cys Val Lys Gly Pro Met Leu Met
385 390 395 400
Lys Gly Tyr Val Asp Asn Pro Glu Ala Thr Arg Glu Ile Ile Asp Glu
405 410 415
Glu Gly Trp Leu His Thr Gly Asp Ile Gly Tyr Tyr Asp Glu Glu Lys
420 425 430
His Phe Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly
435 440 445
Tyr Gln Val Pro Pro Ala Glu Leu Glu Ser Val Leu Leu Gln His Pro
450 455 460
Asn Ile Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Val Pro Asp Pro Ile Ala Gly
465 470 475 480
Glu Leu Pro Gly Ala Val Val Val Leu Glu Lys Gly Lys Ser Met Thr
485 490 495
Glu Lys Glu Val Met Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Ser Asn Ala Lys
500 505 510
Arg Leu Arg Gly Gly Val Arg Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu
515 520 525
Thr Gly Lys Ile Asp Gly Lys Ala Ile Arg Glu Ile Leu Lys Lys Pro
530 535 540
Val Ala Lys Met
545
<210> 3
<211> 548
<212> PRT
<213> 源氏萤
<220>
<223> 荧光素酶
<400> 3
Met Glu Asn Met Glu Asn Asp Glu Asn Ile Val Val Gly Pro Lys Pro
1 5 10 15
Phe Tyr Pro Ile Glu Glu Gly Ser Ala Gly Thr Gln Leu Arg Lys Tyr
20 25 30
Met Glu Arg Tyr Ala Lys Leu Gly Ala Ile Ala Phe Thr Asn Ala Val
35 40 45
Thr Gly Val Asp Tyr Ser Tyr Ala Glu Tyr Leu Glu Lys Ser Cys Cys
50 55 60
Leu Gly Lys Ala Leu Gln Asn Tyr Gly Leu Val Val Asp Gly Arg Ile
65 70 75 80
Ala Leu Cys Ser Glu Asn Cys Glu Glu Phe Phe Ile Pro Val Ile Ala
85 90 95
Gly Leu Phe Ile Gly Val Gly Val Ala Pro Thr Asn Glu Ile Tyr Thr
100 105 110
Leu Arg Glu Leu Val His Ser Leu Gly Ile Ser Lys Pro Thr Ile Val
115 120 125
Phe Ser Ser Lys Lys Gly Leu Asp Lys Val Ile Thr Val Gln Lys Thr
130 135 140
Val Thr Thr Ile Lys Thr Ile Val Ile Leu Asp Ser Lys Val Asp Tyr
145 150 155 160
Arg Gly Tyr Gln Cys Leu Asp Thr Phe Ile Lys Arg Asn Thr Pro Pro
165 170 175
Gly Phe Gln Ala Ser Ser Phe Lys Thr Val Glu Val Asp Arg Lys Glu
180 185 190
Gln Val Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys
195 200 205
Gly Val Gln Leu Thr His Glu Asn Thr Val Thr Arg Phe Ser His Ala
210 215 220
Arg Asp Pro Ile Tyr Gly Asn Gln Val Ser Pro Gly Thr Ala Val Leu
225 230 235 240
Thr Val Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly
245 250 255
Tyr Leu Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Met Leu Thr Lys Phe Asp Glu
260 265 270
Glu Thr Phe Leu Lys Thr Leu Gln Asp Tyr Lys Cys Thr Ser Val Ile
275 280 285
Leu Val Pro Thr Leu Phe Ala Ile Leu Asn Lys Ser Glu Leu Leu Asn
290 295 300
Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu Val Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro
305 310 315 320
Leu Ser Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Arg Arg Phe Asn Leu Pro
325 330 335
Gly Val Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Ile
340 345 350
Ile Thr Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Ser Gly Lys Val Val
355 360 365
Pro Leu Phe Lys Ala Lys Val Ile Asp Leu Asp Thr Lys Lys Ser Leu
370 375 380
Gly Pro Asn Arg Arg Gly Glu Val Cys Val Lys Gly Pro Met Leu Met
385 390 395 400
Lys Gly Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Lys Glu Leu Ile Asp Glu
405 410 415
Glu Gly Trp Leu His Thr Gly Asp Ile Gly Tyr Tyr Asp Glu Glu Lys
420 425 430
His Phe Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly
435 440 445
Tyr Gln Val Pro Pro Ala Glu Leu Glu Ser Val Leu Leu Gln His Pro
450 455 460
Ser Ile Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Val Pro Asp Pro Val Ala Gly
465 470 475 480
Glu Leu Pro Gly Ala Val Val Val Leu Glu Ser Gly Lys Asn Met Thr
485 490 495
Glu Lys Glu Val Met Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Ser Asn Ala Lys
500 505 510
Arg Leu Arg Gly Gly Val Arg Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu
515 520 525
Thr Gly Lys Ile Asp Gly Arg Ala Ile Arg Glu Ile Leu Lys Lys Pro
530 535 540
Val Ala Lys Met
545
<210> 4
<211> 543
<212> PRT
<213> 发光叩甲虫
<220>
<223> 荧光素酶
<400> 4
Met Met Lys Arg Glu Lys Asn Val Val Tyr Gly Pro Glu Pro Lys His
1 5 10 15
Pro Leu Gly Asn Phe Thr Ala Gly Glu Met Leu Tyr Asn Ala Leu His
20 25 30
Lys His Ser His Ile Pro Gln Ala Ile Leu Asp Val Met Gly Asn Glu
35 40 45
Ser Leu Ser Tyr Gln Glu Phe Phe Asp Thr Thr Val Lys Leu Gly Gln
50 55 60
Ser Leu Gln Asn Cys Gly Tyr Lys Met Asn Asp Val Val Ser Ile Cys
65 70 75 80
Ala Glu Asn Asn Lys Arg Phe Phe Ile Pro Ile Ile Ser Ala Trp Tyr
85 90 95
Ile Gly Met Val Val Ala Pro Val Asn Glu Asp Tyr Ile Pro Asp Glu
100 105 110
Leu Cys Lys Val Thr Gly Ile Ser Lys Pro Ile Leu Val Phe Thr Thr
115 120 125
Arg Lys Ile Leu Pro Lys Val Leu Glu Val Lys Asp Arg Thr Asn Tyr
130 135 140
Ile Lys Arg Ile Ile Ile Leu Asp Ser Glu Glu Asn Leu Leu Gly Cys
145 150 155 160
Glu Ser Leu His Asn Phe Met Ser Arg Tyr Ser Asp Asn Asn Leu Gln
165 170 175
Thr Phe Lys Pro Leu His Tyr Asp Pro Val Asp Gln Val Ala Ala Ile
180 185 190
Leu Cys Ser Ser Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Met Gln Thr
195 200 205
His Arg Asn Ile Cys Val Arg Leu Thr His Ala Ser Asp Pro Arg Val
210 215 220
Gly Thr Gln Leu Ile Pro Gly Val Ser Val Leu Ala Tyr Leu Pro Phe
225 230 235 240
Phe His Ala Phe Gly Phe Ser Ile Asn Leu Gly Tyr Phe Met Val Gly
245 250 255
Leu Arg Val Val Met Leu Arg Arg Phe Asn Gln Glu Val Phe Leu Lys
260 265 270
Ala Ile Gln Asp Tyr Glu Val Arg Ser Val Ile Asn Val Pro Ser Thr
275 280 285
Ile Leu Phe Leu Ser Lys Ser Pro Leu Val Asp Lys Tyr Asp Leu Ser
290 295 300
Thr Leu Ala Glu Leu Cys Cys Gly Ala Ala Pro Leu Ala Lys Glu Val
305 310 315 320
Ala Glu Ile Ala Val Lys Arg Leu Asn Leu Pro Gly Ile Arg Cys Gly
325 330 335
Tyr Gly Leu Thr Glu Ser Thr Ser Ala Asn Ile His Thr Leu His Asn
340 345 350
Glu Phe Lys Ser Gly Ser Leu Gly Lys Val Thr Pro Tyr Met Ala Ala
355 360 365
Lys Ile Ile Asp Arg Asn Thr Gly Glu Ala Leu Gly Pro Asn Gln Val
370 375 380
Gly Glu Leu Cys Ile Trp Gly Pro Met Val Thr Lys Gly Tyr Val Asn
385 390 395 400
Asn Pro Gln Ala Thr Lys Glu Ala Ile Asp Asp Asp Gly Trp Leu His
405 410 415
Ser Gly Asp Phe Gly Tyr Tyr Asp Glu Asp Glu Tyr Phe Tyr Ile Val
420 425 430
Asp Arg Tyr Lys Glu Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln Val Ala Pro
435 440 445
Val Glu Leu Glu Glu Ile Leu Leu Gln His Pro Gly Ile Arg Asp Val
450 455 460
Ala Val Val Gly Ile Pro Asp Ile Glu Ala Gly Glu Leu Pro Ala Gly
465 470 475 480
Phe Val Val Lys Gln Pro Gly Ala Gln Leu Thr Ala Lys Glu Val Tyr
485 490 495
Asp Phe Leu Ala Gln Arg Val Ser His Ser Lys Tyr Leu Arg Gly Gly
500 505 510
Val Arg Phe Val Asp Ser Ile Pro Arg Asn Val Thr Gly Lys Ile Ser
515 520 525
Arg Lys Glu Leu Arg Glu Ala Leu Met Glu Lys Ala Ser Lys Leu
530 535 540
<210> 5
<211> 1650
<212> DNA
<213> 北美萤火虫
<220>
<223> 荧光素酶
<400> 5
atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatcctct agaggatgga 60
accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc cggaacaatt 120
gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc 180
gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta 240
tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt 300
gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt 360
tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa 420
aaaaaattac caataatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga 480
tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat 540
tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgataatgaa ttcctctgga 600
tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt ccgcatagaa ctgcctgcgt cagattctcg 660
catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt 720
gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt 780
cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttt tacgatccct tcaggattac 840
aaaattcaaa gtgcgttgct agtaccaacc ctattttcat tcttcgccaa aagcactctg 900
attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg 960
aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatacg acaaggatat 1020
gggctcactg agactacatc agctattctg attacacccg agggggatga taaaccgggc 1080
gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa 1140
acgctgggcg ttaatcagag aggcgaatta tgtgtcagag gacctatgat tatgtccggt 1200
tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct 1260
ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tagttgaccg cttgaagtct 1320
ttaattaaat acaaaggata tcaggtggcc cccgctgaat tggaatcgat attgttacaa 1380
caccccaaca tcttcgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt 1440
cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat 1500
tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac 1560
gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata 1620
aaggccaaga agggcggaaa gtccaaattg 1650
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明: 引物
<400> 6
gactccatgg aagacgccaa aaac 24
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明: 引物
<400> 7
gacactcgag caatttggac tttccgcc 28
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明: 引物
<400> 8
cacgatcatg agcacccgtg g 21
<210> 9
<211> 1656
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明: 编码突变体(V288I)的核苷酸序列
<400> 9
atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatcctct agaggatgga 60
accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt 120
gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc 180
gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta 240
tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt 300
gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt 360
tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa 420
aaaaaattac caataatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga 480
tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat 540
tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgataatgaa ttcctctgga 600
tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt ccgcatagaa ctgcctgcgt cagattctcg 660
catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt 720
gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt 780
cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttt tacgatccct tcaggattac 840
aaaattcaaa gtgcgttgct aataccaacc ctattttcat tcttcgccaa aagcactctg 900
attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg 960
aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatacg acaaggatat 1020
gggctcactg agactacatc agctattctg attacacccg agggggatga taaaccgggc 1080
gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa 1140
acgctgggcg ttaatcagag aggcgaatta tgtgtcagag gacctatgat tatgtccggt 1200
tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct 1260
ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tagttgaccg cttgaagtct 1320
ttaattaaat acaaaggata tcaggtggcc cccgctgaat tggaatcgat attgttacaa 1380
caccccaaca tcttcgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt 1440
cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat 1500
tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac 1560
gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata 1620
aaggccaaga agggcggaaa gtccaaattg ctcgag 1656
<210> 10
<211> 1656
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明: 编码突变体(L376P)的核苷酸序列
<400> 10
atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatcctct agaggatgga 60
accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt 120
gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc 180
gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta 240
tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt 300
gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt 360
tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa 420
aaaaaattac caataatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga 480
tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat 540
tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgataatgaa ttcctctgga 600
tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt ccgcatagaa ctgcctgcgt cagattctcg 660
catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt 720
gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt 780
cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttt tacgatccct tcaggattac 840
aaaattcaaa gtgcgttgct agtaccaacc ctattttcat tcttcgccaa aagcactctg 900
attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg 960
aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatacg acaaggatat 1020
gggctcactg agactacatc agctattctg attacacccg agggggatga taaaccgggc 1080
gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatccgga taccgggaaa 1140
acgctgggcg ttaatcagag aggcgaatta tgtgtcagag gacctatgat tatgtccggt 1200
tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct 1260
ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tagttgaccg cttgaagtct 1320
ttaattaaat acaaaggata tcaggtggcc cccgctgaat tggaatcgat attgttacaa 1380
caccccaaca tcttcgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt 1440
cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat 1500
tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac 1560
gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata 1620
aaggccaaga agggcggaaa gtccaaattg ctcgag 1656
<210> 11
<211> 1656
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明: 编码突变体(E455V)的核苷酸序列
<400> 11
atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatcctct agaggatgga 60
accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt 120
gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc 180
gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta 240
tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt 300
gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt 360
tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa 420
aaaaaattac caataatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga 480
tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat 540
tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgataatgaa ttcctctgga 600
tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt ccgcatagaa ctgcctgcgt cagattctcg 660
catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt 720
gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt 780
cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttt tacgatccct tcaggattac 840
aaaattcaaa gtgcgttgct agtaccaacc ctattttcat tcttcgccaa aagcactctg 900
attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg 960
aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatacg acaaggatat 1020
gggctcactg agactacatc agctattctg attacacccg agggggatga taaaccgggc 1080
gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa 1140
acgctgggcg ttaatcagag aggcgaatta tgtgtcagag gacctatgat tatgtccggt 1200
tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct 1260
ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tagttgaccg cttgaagtct 1320
ttaattaaat acaaaggata tcaggtggcc cccgctgaat tggtatcgat attgttacaa 1380
caccccaaca tcttcgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt 1440
cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat 1500
tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac 1560
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<210> 12
<211> 1656
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明: 编码突变体(E488V)的核苷酸序列
<400> 12
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Claims (13)
1.一种突变型甲虫荧光素酶,其是在野生型甲虫荧光素酶中引入突变的突变型甲虫荧光素酶,其特征在于,
在编码野生型甲虫荧光素酶的氨基酸序列中,至少具有选自由下述(a)、(b)、(c)和(d)组成的组中的一种以上的突变,
在0.9质量%的氯化钠溶液中由荧光素-荧光素酶发光反应产生的发光强度为在不含氯化钠的溶液中该反应的发光强度的50%以上,
(a)与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第288位的缬氨酸相当的氨基酸突变为异亮氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸;
(b)与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第376位的亮氨酸相当的氨基酸突变为脯氨酸;
(c)与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第455位的谷氨酸相当的氨基酸突变为缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸;以及
(d)与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第488位的谷氨酸相当的氨基酸突变为缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的突变型甲虫荧光素酶,其中,所述野生型甲虫荧光素酶是野生型北美萤火虫荧光素酶。
3.根据权利要求1所述的突变型甲虫荧光素酶,其中,
所述野生型甲虫荧光素酶是野生型平家萤荧光素酶,
所述野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第288位的缬氨酸相当于野生型平家萤荧光素酶的氨基酸序列中第290位的缬氨酸;
所述野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第376位的亮氨酸相当于野生型平家萤荧光素酶的氨基酸序列中第378位的亮氨酸;
所述野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第455位的谷氨酸相当于野生型平家萤荧光素酶的氨基酸序列中第457位的谷氨酸;
所述野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第488位的谷氨酸相当于野生型平家萤荧光素酶的氨基酸序列中第490位的谷氨酸。
4.根据权利要求1所述的突变型甲虫荧光素酶,其中,
所述野生型甲虫荧光素酶是野生型源氏萤荧光素酶,
所述野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第288位的缬氨酸相当于野生型源氏萤荧光素酶的氨基酸序列中第290位的缬氨酸;
所述野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第376位的亮氨酸相当于野生型源氏萤荧光素酶的氨基酸序列中第378位的亮氨酸;
所述野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第455位的谷氨酸相当于野生型源氏萤荧光素酶的氨基酸序列中第457位的谷氨酸;
所述野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第488位的谷氨酸相当于野生型源氏萤荧光素酶的氨基酸序列中第490位的谷氨酸。
5.根据权利要求1所述的突变型甲虫荧光素酶,其中,
所述野生型甲虫荧光素酶是野生型发光叩甲虫荧光素酶,
在编码所述野生型甲虫荧光素酶的氨基酸序列中,至少具有选自由所述(a)、(c)和(d)组成的组中的一种以上的突变,
所述野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第288位的缬氨酸相当于野生型发光叩甲虫荧光素酶的氨基酸序列中第285位的缬氨酸;
所述野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第455位的谷氨酸相当于野生型发光叩甲虫荧光素酶的氨基酸序列中第452位的谷氨酸;
所述野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第488位的谷氨酸相当于野生型发光叩甲虫荧光素酶的氨基酸序列中第489位的谷氨酸。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的突变型甲虫荧光素酶,其中,具有所述(a)和(d)的突变。
7.根据权利要求1~4中任一项所述的突变型甲虫荧光素酶,其中,具有选自由所述(a)、(b)和(d)组成的组中的两种以上的突变。
8.根据权利要求1~7中任一项所述的突变型甲虫荧光素酶,其中,所述(a)、(c)和(d)分别是下述(a’)、(c’)和(d’):
(a’)与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第288位的缬氨酸相当的氨基酸突变为异亮氨酸;
(c’)与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第455位的谷氨酸相当的氨基酸突变为缬氨酸;以及
(d’)与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中第488位的谷氨酸相当的氨基酸突变为缬氨酸。
9.根据权利要求1~8中任一项所述的突变型甲虫荧光素酶,其中,
在0.9质量%的氯化钠溶液中由荧光素-荧光素酶发光反应产生的发光强度大于野生型甲虫荧光素酶的发光强度。
10.一种基因,其由权利要求1~9中任一项所述的突变型甲虫荧光素酶进行编码。
11.一种重组载体,其含有权利要求10所述的基因。
12.一种转化体,其携带权利要求11所述的重组载体。
13.一种突变型甲虫荧光素酶的制备方法,其具有以下步骤:
培养步骤,培养权利要求12所述的转化体,得到培养物;和
回收步骤,从由所述培养步骤所得到的培养物中回收突变型甲虫荧光素酶。
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