CN114350627B

CN114350627B - 一种萤火虫荧光素酶突变体及其制备方法

Info

Publication number: CN114350627B
Application number: CN202111584801.3A
Authority: CN
Inventors: 岳敏; 李民强; 姜命国
Original assignee: Dalian Bgbioscience Co ltd
Current assignee: Dalian Bgbioscience Co ltd
Priority date: 2021-12-16
Filing date: 2021-12-16
Publication date: 2022-08-05
Anticipated expiration: 2041-12-16
Also published as: CN114350627A

Abstract

本发明属于基因改造和蛋白质工程技术领域，具体涉及一种萤火虫荧光素酶突变体及其制备方法，本发明从改造萤火虫荧光素酶分子结构入手，得到热稳定性高的荧光素酶突变体，氨基酸序列为SEQ ID NO.1；编码中所述蛋白质的DNA序列为SEQ ID NO.2。与现有荧光素酶生产方法相比，本发明由于突变了野生型萤火虫荧光素酶基因以及优化了该基因密码子，相比现有技术，使得该突变的萤火虫荧光素酶具有易于纯化，得率高以及稳定性强等特点，是一种高效生产萤火虫荧光素酶的方法。该方法简单易行，成本低廉。

Description

一种萤火虫荧光素酶突变体及其制备方法

技术领域

本发明属于基因改造和蛋白质工程技术领域，具体涉及一种萤火虫荧光素酶突变体及其制备方法。

背景技术

萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)是一种在三磷酸腺苷(ATP)、二价金属离子如镁离子和氧气的存在下催化氧化萤火虫荧光素并使其产生生物发光的酶。目前萤火虫荧光素酶已经作为研究领域的新工具出现在市场上，它具有反应灵敏、结果准确、操作简便、应用范围广、无毒副作用等优点，非常适合应用于分子生物学、生命科学、医学、刑侦、药理学、微生物检测等各个领域。

虽然萤火虫荧光素酶有着重要的应用价值，但该酶对热不稳定，制成试剂保存时易失活，故需提高萤火虫荧光素酶稳定性或进行酶活方面的改造，以更好的发挥萤火虫荧光素酶的功能和作用。

发明内容

本发明为解决现有技术问题提供了一种发光强度高，热稳定性好、易于获得的重组萤火虫荧光素酶突变体及其制备方法。

本发明为实现上述目的，采用如下技术方案来实现：

本发明一方面提供了一种萤火虫荧光素酶突变体，是通过将野生型的平家萤火虫荧光素酶的第208位的Lys突变为Arg，第217位的Ala突变为Pro，第231位的Asn突变为Ala获得，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

上述萤火虫荧光素酶突变体，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO.2。

本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO.2的萤火虫荧光素酶突变体基因的质粒。

本发明提供的表达载体中可包含附加序列，使萤火虫荧光素酶突变体以融合蛋白(与附加序列编码的蛋白或肽融合)的形式表达。

所述附加序列包括但不限于编码His标签或GST标签的核苷酸序列。

本发明还提供了一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。

本发明还提供了含有上述萤火虫荧光素酶突变体、DNA、表达载体和/或转化细胞的试剂盒。

本发明还提供了利用原核细胞制备上述萤火虫荧光素酶突变体的方法，该方法包含以下步骤：使用大肠杆菌BL21(DE3)细胞，采用热激转化法获得大肠杆菌的转化体，在培养基中培养含有本发明的萤火虫荧光素酶突变体的转化细胞。

挑取转化子进行摇瓶培养，离心获得发酵菌体检测酶表达量，选取一株表达量最高的菌株进行发酵培养，离心获得菌体。

本发明还提供了一种萤火虫荧光素酶突变体的纯化方法，包括如下步骤：在萤火虫荧光素酶突变体的C端添加六聚组氨酸标签，发酵液首先经离心分离，菌体沉淀采用机械法进行破碎，破碎液经离心分离，上清液经金属离子螯合亲和层析纯化，然后再经分子筛除盐、浓缩，最后冷冻干燥成为成品酶。

本发明具有以下有益效果：

1.发光强度高：同等条件下，经过本发明改造后获得的荧光素酶(RM)比野生型(W)的荧光素酶发光强度提高了2倍左右，表现出酶活的提高。

2.热稳定性好：野生型在40℃水浴10min后酶活性几乎散失，发光强度很弱，但是突变体却可以保持90％左右的发光强度。在同等测定条件下，野生型荧光素酶在37℃水浴20min后发光强度降到原来的30％左右，时间越久，发光强度越弱，但突变体荧光素酶即使在37℃水浴20min以后还可以保有90％以上的发光强度。

3.本发明还提供了高效便捷的表达上述突变体荧光素酶的方法，并具体公开了纯化办法。

附图说明

图1显示本发明的萤火虫荧光素酶突变体氨基酸序列中突变位点的概要图；

图2表示利用SDS-PAGE电泳对经纯化后的萤火虫荧光素酶突变体纯度进行检测的结果；

图3表示突变体与野生型荧光素酶发光强度比较示意图；

图4表示本发明的萤火虫荧光素酶突变体的稳定性结果；

图5表示突变体与野生型荧光素酶检测ATP标准品的比较示意图；

图6表示突变体与野生型荧光素酶检测CHO细胞的比较示意图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。

表1为本发明具体序列。

表1序列表

实施例

本发明的萤火虫荧光素酶突变体，如图1所示，将野生型的平家萤火虫荧光素酶的第208位的Lys突变为Arg，第217位的Ala突变为Pro，第231位的Asn突变为Ala获得，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

在本发明中，“208位”、“217位”、“231位”并不是必然表示从所述萤火虫荧光素酶的N端起的绝对位置，而是表示与SEQ ID NO.1的氨基酸序列相比的相对位置。例如，在含有SEQ ID NO.1的氨基酸序列的萤火虫荧光素酶中，当该荧光素酶208位的N端某一位置缺失了一个氨基酸，上述的208位即变为207位。即使在这一情况下，所述从N端残基起计数为207位的氨基酸在本发明中仍为“208位”的氨基酸。通过将感兴趣的萤火虫荧光素酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.1的氨基酸序列进行比对而确定所述氨基酸的相对位置。

一种萤火虫荧光素酶基因，该序列编码一种热稳定性高及酶活性好的荧光素酶突变体蛋白，具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述萤火虫荧光素酶的氨基酸序列为SEQID NO.1。

实施例1：本发明的萤火虫荧光素酶的制备方法，按照如下步骤进行：

a.将平家萤火虫荧光素酶(GenBank:CAA47358.1)的氨基酸序列第208位的Lys突变为Arg，第217位的Ala突变为Pro，第231位的Asn突变为Ala，并在序列C端添加六聚组氨酸标签，获得荧光素酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。根据大肠杆菌密码子偏爱性，对荧光素酶突变体的基因编码区序列进行优化，得到核苷酸序列为SEQ ID NO.2的萤火虫荧光素酶变体序列；

b.在萤火虫荧光素酶变体序列的5’端添加限制性内切酶Nde I的酶切位点，在优化序列的3’端添加限制性内切酶HindⅢ的酶切位点，进行全基因合成(北京六合华大基因科技有限公司)，并连接入原核表达载体pET30a(购自Novagen公司)的Nde I酶切位点和HindⅢ酶切位点之间，得到重组原核表达质粒pET30a-RM；

c.将得到的重组原核表达质粒pET30a-RM通过热激法转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，在含终浓度30μg/ml卡那霉素的LB平板上培养，挑取单菌落进行测序鉴定；

d.取含有重组阳性质粒的单菌落，接种到含有终浓度为30μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养12～16h，按照体积比为1％的比例将培养的菌液接种到新鲜的含30μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养至菌液浓度OD600在0.8～1.2，加入诱导物IPTG至工作浓度1mM继续培养24小时，4℃、8000rpm离心10min收集菌体；

e.将离心收集的菌体，用PBS清洗两遍，加入LB培养基1/10体积的PBS，充分悬浮菌体，加入PMSF至工作浓度1mM，混匀，于冰上超声破碎，功率200W，超声5s，间隔5s，10min，然后于4℃，8000rpm，离心30min，取含有可溶性总蛋白的上清液。

f.采用Ni-NTA琼脂糖层析柱，先用5倍柱床体积平衡缓冲液(20mM磷酸盐，500mMNaCl，5mM咪唑，pH 7.8)平衡层析柱，将含有可溶性总蛋白的上清液以1mL/min的速度上柱，当层析柱中所有流穿液流出介质后，加入洗脱缓冲液(20mM磷酸盐，500mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.8)进行洗脱，分管收集，SDS-PAGE鉴定每管目的蛋白的纯度，收集纯度大于95％的组份；

g.采用Sephadex G25层析柱进行脱盐，根据紫外检测器检测的出峰收集样品。

用BCA法测定蛋白浓度，并进行SDS-PAGE电泳检测，电泳结果如图2所示：M为蛋白分子量标准；RM为纯化后的荧光素酶突变体重组蛋白；R为纯化前总蛋白。

实施例2：突变体蛋白RM活性检测及其他酶学性质检测。

发光强度分析：采用BCA蛋白浓度测定法进行蛋白浓度的测定，以BSA作标准曲线。蛋白定量后配制0.1mg/ml的蛋白液，测定体系为10μl 0.1mg/ml的蛋白液，30μl pH 7.4，50mM Tris-HCl，10mM MgCl₂的缓冲液以及10μl的底物混合液。使用BioTek公司的多功能酶标仪进行测定，如图3所示，在同等条件下，改造后获得的荧光素酶(RM)比野生型(W)的荧光素酶发光强度提高了2倍左右，表现出酶活的提高。

热稳定性分析：，将野生型和突变体酶液分别放置在25℃、30℃、35℃、37℃、40℃水浴中孵育10min，迅速取出放入冰水中冷却1min，之后进行发光测定。如图4(a)所示，野生型和突变体荧光素酶的发光强度都随着水浴温度的升高而降低，野生型在40℃水浴10min后酶活性几乎散失，发光强度很弱，但是突变体却可以保持90％左右的发光强度。

同一水浴温度下水浴不同时间后荧光素酶的发光情况，如图4(b)所示，在同等测定条件下，野生型荧光素酶在37℃水浴20min后发光强度降到原来的30％左右，时间越久，发光强度越弱，但突变体荧光素酶即使在37℃水浴20min以后还可以保有90％以上的发光强度。这说明改造后获得的突变体较野生型荧光素酶具有很好的热稳定性，能够满足更多的实际应用需要。

实施例3：萤火虫荧光素酶用于ATP标准品和CHO细胞活力的检测

根据BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度结果，用纯化得到的萤火虫荧光素酶配制细胞活力检测试剂(配方为：20mM Tris，pH 7.8，200mM NaCl，0.1％gelatin，0.5％Triton X-100，20mM MgSO₄，1mM荧光素，10μg/ml萤火虫荧光素酶)测定ATP标准品和CHO细胞的活力。

结果显示，萤火虫萤光素酶突变体较野生型具有更高的检测灵敏度和活力。ATP标准品在0-10μM浓度范围内线性良好，CHO细胞在10-5万个细胞范围内具有良好的线性关系(图5-图6)。

实施例4：萤火虫荧光素酶在细菌总数检测(即ATP检测)中的应用

根据BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度结果，用纯化得到的萤火虫荧光素酶配制细菌总数检测试剂(配方为：50mM Tris，pH 7.4，10mM MgCl₂，5μM荧光素，5μg/ml萤火虫荧光素酶)。取检测试剂50μl，分别加入ATP标准液或经过裂解处理的待测样品10μl，混匀后迅速置于发光测定仪中，测定560nm处的发光情况。根据标准曲线可得待测样品(食品或水)中ATP的含量。经测定，萤火虫荧光素酶突变体比野生型的最低检测限至少提高10倍，检测终浓度为1nmol/L的ATP。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的保护范围，即大凡依本发明权利要求书及实用新型内容所做的简单的等效变化与修改，皆仍属于本发明专利申请的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 大连博格林生物科技有限公司

<120> 一种萤火虫荧光素酶突变体及其制备方法

<130> 2021

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 554

<212> PRT

<213> 人工

<400> 1

Met Glu Asn Met Glu Asn Asp Glu Asn Ile Val Tyr Gly Pro Glu Pro

1 5 10 15

Phe Tyr Pro Ile Glu Glu Gly Ser Ala Gly Ala Gln Leu Arg Lys Tyr

20 25 30

Met Asp Arg Tyr Ala Lys Leu Gly Ala Ile Ala Phe Thr Asn Ala Leu

35 40 45

Thr Gly Val Asp Tyr Thr Tyr Ala Glu Tyr Leu Glu Lys Ser Cys Cys

50 55 60

Leu Gly Glu Ala Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Val Val Asp Gly Arg Ile

65 70 75 80

Ala Leu Cys Ser Glu Asn Cys Glu Glu Phe Phe Ile Pro Val Leu Ala

85 90 95

Gly Leu Phe Ile Gly Val Gly Val Ala Pro Thr Asn Glu Ile Tyr Thr

100 105 110

Leu Arg Glu Leu Val His Ser Leu Gly Ile Ser Lys Pro Thr Ile Val

115 120 125

Phe Ser Ser Lys Lys Gly Leu Asp Lys Val Ile Thr Val Gln Lys Thr

130 135 140

Val Thr Ala Ile Lys Thr Ile Val Ile Leu Asp Ser Lys Val Asp Tyr

145 150 155 160

Arg Gly Tyr Gln Ser Met Asp Asn Phe Ile Lys Lys Asn Thr Pro Gln

165 170 175

Gly Phe Lys Gly Ser Ser Phe Lys Thr Val Glu Val Asn Arg Lys Glu

180 185 190

Gln Val Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Arg

195 200 205

Gly Val Gln Leu Thr His Glu Asn Pro Val Thr Arg Phe Ser His Ala

210 215 220

Arg Asp Pro Ile Tyr Gly Ala Gln Val Ser Pro Gly Thr Ala Ile Leu

225 230 235 240

Thr Val Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly

245 250 255

Tyr Leu Thr Cys Gly Phe Arg Ile Val Met Leu Thr Lys Phe Asp Glu

260 265 270

Glu Thr Phe Leu Lys Thr Leu Gln Asp Tyr Lys Cys Ser Ser Val Ile

275 280 285

Leu Val Pro Thr Leu Phe Ala Ile Leu Asn Arg Ser Glu Leu Leu Asp

290 295 300

Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu Val Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro

305 310 315 320

Leu Ser Lys Glu Ile Gly Glu Ala Val Ala Arg Arg Phe Asn Leu Pro

325 330 335

Gly Val Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Ile

340 345 350

Ile Thr Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Ser Gly Lys Val Val

355 360 365

Pro Leu Phe Lys Ala Lys Val Ile Asp Leu Asp Thr Lys Lys Thr Leu

370 375 380

Gly Pro Asn Arg Arg Gly Glu Val Cys Val Lys Gly Pro Met Leu Met

385 390 395 400

Lys Gly Tyr Val Asp Asn Pro Glu Ala Thr Arg Glu Ile Ile Asp Glu

405 410 415

Glu Gly Trp Leu His Thr Gly Asp Ile Gly Tyr Tyr Asp Glu Glu Lys

420 425 430

His Phe Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly

435 440 445

Tyr Gln Val Pro Pro Ala Glu Leu Glu Ser Val Leu Leu Gln His Pro

450 455 460

Asn Ile Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Val Pro Asp Pro Ile Ala Gly

465 470 475 480

Glu Leu Pro Gly Ala Val Val Val Leu Glu Lys Gly Lys Ser Met Thr

485 490 495

Glu Lys Glu Val Met Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Ser Asn Ala Lys

500 505 510

Arg Leu Arg Gly Gly Val Arg Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu

515 520 525

Thr Gly Lys Ile Asp Gly Lys Ala Ile Arg Glu Ile Leu Lys Lys Pro

530 535 540

Val Ala Lys Met His His His His His His

545 550

<210> 2

<211> 1665

<212> DNA

<213> 人工

<400> 2

atggaaaaca tggaaaacga tgaaaacatt gtttacggcc cggaaccgtt ttatccgatt 60

gaagaaggta gtgccggtgc acagctgcgt aaatatatgg atcgttatgc caaactgggt 120

gcaattgcat tcactaatgc cctgaccggc gttgattata cctatgcaga atatctggaa 180

aaaagttgtt gtctgggtga agccctgaaa aattatggtc tggtggtgga tggccgcatt 240

gcactgtgca gcgaaaattg cgaagaattt ttcattccgg ttctggccgg cctgtttatt 300

ggtgtgggcg ttgcaccgac caatgaaatc tataccctgc gcgaactggt tcatagtctg 360

ggcattagta aaccgaccat tgtttttagc agcaaaaaag gtctggataa agttattacc 420

gtgcagaaaa ccgttaccgc cattaagacc attgtgattc tggatagcaa agttgattat 480

cgcggctatc agagtatgga taattttatt aagaagaaca ccccgcaggg ttttaaaggt 540

agtagtttta aaaccgttga ggtgaatcgc aaagaacagg tggccctgat tatgaatagt 600

agcggtagta ccggcctgcc gcgtggtgtt cagctgaccc atgaaaatcc ggtgacccgt 660

tttagccatg cccgtgatcc gatctatggt gcacaggtta gcccgggtac cgcaattctg 720

accgttgttc cgtttcatca tggctttggc atgtttacca ccctgggcta tctgacctgc 780

ggttttcgta ttgtgatgct gaccaaattt gatgaagaaa cctttctgaa aaccctgcag 840

gattataaat gcagcagcgt gattctggtt ccgaccctgt ttgcaattct gaatcgcagc 900

gaactgctgg ataaatatga tctgagcaat ctggtggaaa ttgccagcgg cggcgcaccg 960

ctgagtaaag aaattggcga agccgtggcc cgccgtttta atctgccggg cgttcgtcag 1020

ggctatggcc tgaccgaaac caccagtgca attattatta ccccggaagg cgatgataaa 1080

ccgggtgcca gcggcaaagt ggttccgctg tttaaagcaa aagttattga tctggatacc 1140

aaaaagactc tgggtccgaa tcgtcgcggt gaagtttgcg ttaaaggtcc gatgctgatg 1200

aaaggttatg ttgataatcc ggaagcaacc cgcgaaatta ttgatgaaga aggttggctg 1260

cataccggcg atattggtta ttatgatgaa gaaaaacact tcttcatcgt ggatcgcctg 1320

aaaagtctga ttaagtataa aggctatcag gtgccgccgg cagaactgga aagcgtgctg 1380

ctgcagcatc cgaatatttt tgatgccggt gtggcaggtg ttccggatcc gattgccggt 1440

gaactgccgg gcgcagttgt ggtgctggaa aaaggcaaaa gcatgaccga aaaagaagtg 1500

atggattatg ttgccagcca ggttagcaat gccaaacgtc tgcgtggtgg cgttcgtttt 1560

gttgatgaag ttccgaaagg cctgaccggt aaaattgatg gtaaagcaat tcgtgaaatc 1620

ctgaaaaaac cggtggcaaa aatgcatcat catcatcacc attaa 1665

Claims

1.一种萤火虫荧光素酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。

2.编码如权利要求1所述的萤火虫荧光素酶突变体的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种表达载体，其特征在于，包含如权利要求2所述的核酸分子。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，包含附加序列，所述附加序列与所述编码萤火虫荧光素酶突变体的核苷酸序列能够融合表达。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述附加序列为编码标签蛋白的核苷酸序列。

6.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述附加序列为编码His标签或GST标签的核苷酸序列。

7.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求3所述的表达载体。

8.一种试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的萤火虫荧光素酶突变体、或如权利要求2所述的核酸分子、或如权利要求3-6任一项所述的表达载体、或如权利要求7所述的宿主细胞。

9.如权利要求1所述的一种萤火虫荧光素酶突变体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：使用大肠杆菌BL21（DE3）细胞，采用热激转化法获得大肠杆菌的转化体，在培养基中培养含有权利要求1所述的萤火虫荧光素酶突变体的转化细胞；挑取转化子进行摇瓶培养，离心获得发酵菌体检测酶表达量，选取一株表达量最高的菌株进行发酵培养，离心获得菌体。

10.如权利要求1所述的一种萤火虫荧光素酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在所述萤火虫荧光素酶突变体的C端添加六聚组氨酸标签，发酵液首先经离心分离，菌体沉淀采用机械法进行破碎，破碎液经离心分离，上清液经金属离子螯合亲和层析纯化，然后再经分子筛除盐、浓缩，最后冷冻干燥成为成品酶。