JP5684984B2 - 順列置換及び非順列置換ルシフェラーゼバイオセンサー - Google Patents

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Description

本出願は、２００６年４月３日付の米国特許出願第６０／７８８６０８号、２００７年１月１０日付の米国特許出願第６０／８７９７７１号、及び２００７年２月１４日付の米国特許出願第６０／９０１１３３号の、米国法典第３５編１１９条（ｅ）項に基づく利益を請求し、これらの開示をその全体において、参照により本明細書に組み込む。
本発明は、生化学的アッセイ及び試薬の分野に関する。より具体的には、本発明は、改変ルシフェラーゼ及びその使用法に関する。
ルシフェラーゼは、基質（例えば、ルシフェリン）の酸化を触媒するとともに光子を放出する酵素である。ルシフェラーゼは、鞘翅目の節足動物及び多くの海洋生物を含む多数の種から単離されている。検出が容易で、その活性が高精度で定量可能であるため、ルシフェラーゼは、遺伝子発現及びタンパク質局在化の研究に広く用いられている。発色団を形成するのに最長３０分間を要する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と異なり、ルシフェラーゼ産物は、ポリペプチド鎖の合成終了直後に検出することができる（基質及び酸素も存在する場合）。加えて、酵素活性に翻訳後修飾を必要とせず、該酵素は、補欠分子族、補因子の結合、又はジスルフィド結合を含まない。ルシフェラーゼは、多数の種及び多種多様な細胞において有用なレポーターである。
ルシフェラーゼは、これらをバイオセンシング用のレポーター分子、すなわち、系の分子特性を明らかにする分子として特に有用とする付加的な特徴を有する。バイオセンサー（すなわち、生物学的要素を含むセンサー）は、一般に、生物学的要素を介するシグナル発生、及び電気的要素を介するシグナル伝達及び／又はシグナル増幅という、２段階の過程により機能する。シグナル発生は、結合、エネルギー移動、又は触媒作用を介して達成されるのが通例である。酵素触媒作用によるシグナル発生は、これらの化学過程に内在的な効率及び特異性のために、特に有用でありうる。大半の触媒反応は、ＡＴＰ２分子分の加水分解エネルギー、又は約７０ｋＪ／モル未満を生じる。しかし、ルシフェラーゼが引き起こす発光は、より高いエネルギー含量を有する。例えば、ホタルルシフェラーゼが触媒する反応（５６０ｎｍ）は、２１４ｋＪ／モルのエネルギーを放出する。さらに、ルシフェラーゼは、化学エネルギーの光子への変換においても高効率である、すなわち、高量子収率を有する。こうして、ルシフェラーゼは、検出可能なシグナルの発生にきわめて効率的である。
ルシフェラーゼバイオセンサーには、既報が存在する。例えば、Ｓａｌａ−Ｎｅｗｂｙら（１９９１）は、フォチヌス・ピラリスのルシフェラーゼｃＤＮＡを改変して、サイクリックＡＭＰ依存性プロテインキナーゼのリン酸化部位を産生することを開示する。特に、配列位置２１７のバリンをアルギニンに突然変異させて部位ＲＲＦＳ（配列番号１１７）を生じ、ブタピルビン酸キナーゼのリン酸化部位であるヘプタペプチドのケンプチドを該ルシフェラーゼのＮ末端又はＣ末端に付加した。Ｓａｌａ−Ｎｅｗｂｙらは、リン酸化部位を持つ該タンパク質が、その特異的活性である発光、放出される光の色に対するｐＨの効果、及びＡＴＰ存在下におけるプロテインキナーゼＡの触媒サブユニットの効果で特徴づけられたことを述べる。彼らは、組み換えタンパク質のうちただ１つ（ＲＲＦＳ、配列番号１１７）が野生型のルシフェラーゼと著明に異なること、及び該ＲＲＦＳ（配列番号１１７）突然変異体の方が、特異的活性が低く、最適ｐＨが低く、低ｐＨ時により緑色の強い光を放出し、リン酸化時にはその活性を最大で８０％低下させることを見出した。後者の効果は、ホスファターゼにより可逆化されることが開示された。
Ｗａｕｄら（１９９６）は、フォチヌス・ピラリスのルシフェラーゼｃＤＮＡ内にプロテインキナーゼ認識配列及びプロテイナーゼ部位を組み込んだ。Ｗａｕｄらは、該ルシフェラーゼの２つのドメインを改変した。１つはアミノ酸２０９と同２２７との間のドメインであり、もう１つはＣ末端のアミノ酸５３７と同５５０との間である。Ｗａｕｄらは、残基２０９と同２２７の間のアミノ酸の突然変異が、野生型の組み換え体の１％未満まで生物発光活性を低下させたのに対し、Ｃ末端におけるペプチド配列の組み込みは、野生型の組み換えルシフェラーゼの０．０６％〜１２０％の範囲に及ぶ特異的活性をもたらしたことを開示する。Ｗａｕｄらは、アミノ酸配列位置５４３がセリンであるキナーゼ認識配列ＬＲＲＡＳＬＧ（配列番号１）を組み込む、変異体ルシフェラーゼにサイクリックＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの触媒サブユニットを付加することによって、活性が３０％低下したことをも開示する。アルカリホスファターゼによる処理が、活性を回復させた。Ｗａｕｄらは、アミノ酸５４２と同５４３との間に開裂部位が位置するトロンビン認識配列ＬＶＰＲＥＳ（配列番号２）を含む変異体ルシフェラーゼの生物発光活性が、トロンビン存在下でインキュベートすると５０％低下したことをさらに開示する。
Ｏｚａｗａら（２００１）は、ホタルルシフェラーゼの合理的に設計された断片に対する、タンパク質スプライシングによって誘導される相補性に基づいて、バイオセンサーについて述べる。タンパク質スプライシングは、インテイン（介在タンパク質）を前駆体融合タンパク質から切り出し、隣接するエクステイン（隣接タンパク質）を連続的なポリペプチドに連結する翻訳後のタンパク質修飾である。シネコシスチス種ＰＣＣ６８０３株由来のＮ末端インテインＤｎａＥ及びＣ末端インテインＤｎａＥをそれぞれ、ルシフェラーゼのＮ末端及びＣ末端断片に融合したことが開示される。タンパク質間相互作用によりＤｎａＥインテインのフォールディングが始動し、タンパク質スプライシングが生じ、これによって連結されたルシフェラーゼのエクステインが酵素活性を回復する。Ｏｚａｗａらは、既知の結合パートナーであるリン酸化したインスリン受容体基質１（ＩＲＳ−１）とその標的であるＰＩ３キナーゼのＮ末端ＳＨ２ドメインとの間の相互作用を、インスリン存在下における分断されたルシフェラーゼを用いてモニターした。
Ｐａｕｌｍｕｒｕｇａｎら（２００１）は、分断されたホタルルシフェラーゼに基づくアッセイにより、相補性戦略及びインテインを介する再構成戦略をともに用いて、細胞培養及びマウスにおける２つのタンパク質、すなわちＭｙｏＤ及びＩｄの相互作用をモニターした。レポーター活性を保持するために、相補性戦略では、融合タンパク質がタンパク質相互作用を必要とする、すなわち、タンパク質パートナーＭｙｏＤ及びＩｄの相互作用によるのに対し、インテインを介するスプライシングにより形成される新規の完全な甲虫ルシフェラーゼは、該タンパク質パートナー間の連続的な相互作用の不在下においてもその活性を維持する。
Ｍｉｃｈｎｉｃｋら（米国特許出願第６，２７０，９６４号、同第６，２９４，３３０号、同第６，４２８，９５１号）では、タンパク質断片相補性アッセイが開示される。具体的には、Ｍｉｃｈｎｉｃｋは、分断されたマウスジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子に基づき、ＤＨＦＲのＮ末端断片及びＤＨＦＲのＣ末端断片をそれぞれＧＣＮ４ロイシンジッパー配列に融合させるアッセイについて述べる。ＤＨＦＲ活性は、両方の融合タンパク質を発現する細胞において検出した。Ｍｉｃｈｎｉｃｋらは、ネスト化した一連のＳ１ヌクレアーゼがアミノグリコシドキナーゼ（ＡＫ）遺伝子内に産生する欠失をロイシンジッパー構築物に導入し、結果として生じる一連の構築物を細胞に導入し、ＡＫ活性についてスクリーニングする別の相補性法についても述べている。
必要なことは、例えば、タンパク質間相互作用、細胞内シグナル伝達、又は生理学的変換などの細胞事象を検出するに際し、特異性が高くシグナル感度の高いバイオセンサーとして、改良組み換えルシフェラーゼを用いることである。
本発明は、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、キナーゼ、ホスファターゼ、又はカルシウムなど１つ又は複数の対象の分子の存在下において、１つ又は複数の変化した活性を有する改良遺伝子産物、例えば、ホタルルシフェラーゼ又はヒカリコメツキルシフェラーゼなどの改変甲虫ルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼなどの花虫類ルシフェラーゼ、又は甲殻類ルシフェラーゼなどの改変ルシフェラーゼを提供する。一実施形態において、改変ルシフェラーゼのアミノ酸配列は、改変、例えば、挿入、欠失、円順列置換、又はその任意の組合せに対して耐性である部位（残基）又は領域における１つ又は複数の改変の結果として、対応する非改変ルシフェラーゼ（天然ルシフェラーゼ、野生型ルシフェラーゼ、又は親ルシフェラーゼ、例えば、１つ又は複数の置換を含む突然変異ルシフェラーゼ）のアミノ酸配列とは異なる。一実施形態において、改変に対して耐性である領域は、天然ルシフェラーゼ、野生型ルシフェラーゼにおいて見出される、ベータシート又はアルファヘリックスなどの二次構造間の表面ループを含む。１つ又は複数の改変は、非改変ルシフェラーゼのＮ末端若しくはＣ末端に対して内部、及び／又は非改変ルシフェラーゼのＮ末端及び／若しくはＣ末端であってよく、例えば、ルシフェラーゼ配列の欠失、及び／又は、改変部位におけるルシフェラーゼ配列を場合によっては含む１つ若しくは複数のアミノ酸残基の挿入であってよく、これによって改変ルシフェラーゼを産生する。本発明の適用範囲内における欠失は、欠失に対して耐性であるルシフェラーゼ配列の部位又は領域における１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失を含む。改変は、結果として生じる改変ルシフェラーゼが、対象の分子との相互作用前及び／又は相互作用後において生物発光活性を有する、例えば、対象の分子との相互作用後において生物発光活性が変化する限りで、例えば、非改変ルシフェラーゼのＮ末端及び／又はＣ末端を含む改変に対して耐性である１つ又は複数の部位又は領域において、少なくともその１つが対象の分子と直接又は間接に相互作用する１つ又は複数の分離された（単離された）異種アミノ酸配列の円順列置換及び導入（挿入）を含んでもよく、場合によっては、１つ又は複数のアミノ酸の欠失を含んでもよい。一実施形態において、改変は、対応する非改変ルシフェラーゼではペプチド結合により結合される２つのアミノ酸の間の、改変ルシフェラーゼにおけるペプチド結合の不在であってよく、これが、対応する非改変ルシフェラーゼのＮ末端残基及びＣ末端残基又はその近傍に見出される残基の間の、改変ルシフェラーゼにおけるペプチド結合と組み合わさることにより、少なくともその１つが対象の分子と直接又は間接に相互作用する１つ又は複数の単離された異種のアミノ酸配列を場合によっては含む、円順列置換ルシフェラーゼを産生する。一実施形態において、対象の分子と直接又は間接に相互作用する１つ又は複数の異種アミノ酸配列は、対応する非改変ルシフェラーゼのＮ末端残基及び／又はＣ末端残基に対応する配列或いはその近傍における円順列置換ルシフェラーゼ中に存在する。別の実施形態において、対象の分子と直接又は間接に相互作用する１つ又は複数の異種アミノ酸配列は、円順列置換又は非円順列置換ルシフェラーゼのＮ末端残基及び／又はＣ末端残基或いはその近傍に存在する。一実施形態において、円順列置換ルシフェラーゼ内の、対象の分子と直接又は間接に相互作用する１つ又は複数の異種アミノ酸配列は、円順列置換ルシフェラーゼのＮ末端残基及び／又はＣ末端残基或いはその近傍に存在しない改変に対して耐性である１つ若しくは複数の部位又は１つ若しくは複数の領域に存在する、すなわち、該異種配列はＮ末端及びＣ末端に対して内部に存在する。一実施形態において、円順列置換ルシフェラーゼを改変して２つ以上の異種アミノ酸配列を含むようにすると、これらの異種アミノ酸配列は、対応する非改変ルシフェラーゼのＮ末端残基及び／若しくはＣ末端残基に対応する配列又はその近傍に、円順列置換ルシフェラーゼのＮ末端残基及び／若しくはＣ末端残基又はその近傍に、改変に対して耐性であり、円順列置換又は非円順列置換ルシフェラーゼのＮ末端残基及び／若しくはＣ末端残基又はその近傍に存在しない１つ若しくは複数の部位又は１つ若しくは複数の領域に、或いはその任意の組合せにおいて個別に存在する。一実施形態において、異種アミノ酸配列は、各々、異なる対象の分子と直接又は間接に相互作用する。さらなる実施形態において、円順列置換ルシフェラーゼは、特定の外因性作用物質の存在下又は不在下において相互作用し合う、少なくとも２つの異種アミノ酸配列を含む。２つの異種アミノ酸配列は、同一の配列又は異なる配列を含んでよい。さらに、改変ルシフェラーゼは、非改変ルシフェラーゼのＮ末端又はＣ末端に対応する１〜約１０若しくは約３０、又はその間の任意の整数、例えば１５のＮ末端残基及びＣ末端残基における欠失を含んでよい。欠失の長さは、特定のルシフェラーゼに応じて３０残基を超えてもよく、望ましい欠失の長さは所定の欠失分析により決定してよい。改変ルシフェラーゼを用いて、例えば、２つ以上の分子の結合、ジスルフィド結合の形成若しくはその他の立体構造変化、ｐＨ、温度、若しくは溶媒の疎水性などの状態変化といった可逆的相互作用、又は、発光強度、色、若しくは反応速度プロファイルの変化など、改変ルシフェラーゼの活性変化による不可逆的相互作用を検出してよい。改変ルシフェラーゼを用いて、改変ルシフェラーゼの構造的修飾、例えばキナーゼによるリン酸化又はプロテアーゼによる結合開裂をもたらす相互作用をも検出してよい。
以下に記載の通り、検出可能な活性を示す改変ヒカリコメツキルシフェラーゼをもたらすインフレームでの挿入は、ヒカリコメツキルシフェラーゼの残基２１、２５、１１７、３５８、３７６、３７９、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０５、４０６、４０７、４０９、又は４９０においてであった、すなわち、これらの残基及び／又はこれらの残基近傍の領域は、改変に対して耐性である。これも以下に記載の通り、検出可能な活性を示す改変ホタルルシフェラーゼをもたらすインフレームでの挿入は、ホタルルシフェラーゼの残基７、１２１、２３３、２６７、２９４、３０３、３６１、５４０、又は５４１においてであった、すなわち、これらの残基及び／又はこれらの残基近傍の領域は、改変に対して耐性である。改変に対して耐性である付加的な残基又は領域も、以下の本明細書に記載する。
こうして、甲虫ルシフェラーゼは、例えば、ヒカリコメツキルシフェラーゼの残基２１、２５、１１７、３５８、３７６、３７９、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０５、４０６、４０７、４０９、若しくは４９０、或いは残基１５〜３０に対応する領域では、例えば、残基２１若しくは２５、残基１１２〜１２２では、例えば、残基１１７、残基３５２〜３６２では、例えば、残基３５８、残基３７１〜３８４では、例えば、残基３７９、残基３９３〜４１４、又は残基４８５〜４９５、或いはまた、ホタルルシフェラーゼの残基７、３７、４７、７５、８３、１０７、１２１、１４４、１６０、１７４、１８８、１９８、２０５、２２５、２３３、２４２、２５５、２６８、３０８、３１６、３５８、３７７、４０３、４３５、４９０、若しくは５４０、或いは残基２〜１２に対応する領域、残基３２〜５３では、例えば、残基３２〜４３若しくは残基４２〜５２、残基７０〜８８では、例えば、残基７０〜８０若しくは残基７８〜８８、残基１０２〜１２６では、例えば、残基１０２〜１１２若しくは残基１１６〜１２６、残基１３９〜１６５、残基１８３〜２０３、残基２２０〜２４７では、例えば、残基２２８〜２３８、残基２６２〜２７３、残基３０３〜３１３、残基３５３〜４０８、残基４８５〜４９５、又は残基５３５〜５４６において改変してよい。対応する配列位置は、例えば、配列アライメントプログラムを用いてルシフェラーゼ配列を整列することにより同定してよい。改変に対して耐性であるルシフェラーゼ中の残基又は領域を部位として用いて、該ルシフェラーゼを円順列置換するか、該ルシフェラーゼに挿入するか、又はタンパク質相補性アッセイ若しくはタンパク質スプライシングアッセイにおいて用いうる２つの分子に該ルシフェラーゼを「分断」してよい。
本発明は、レニラルシフェラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＡＦ０２５８４３）の残基２、３０、３１、４２、４５、４６、６８、６９、９０、９１、９２、１１０、１１１、１５０、１５１、１６８、１６９、１９３、２０７、２０８、２２３、２２４、２５１、２５９、２７４、若しくは３１１に対応する残基、或いは同残基２〜１２、残基２６〜３６、残基３７〜４７、残基６４〜７４、残基８６〜９７、例えば、残基９０若しくは９１、残基９６〜１１６、残基１４７〜１５７、残基２１８〜２３４、例えば、残基２２３、２３４、２２８、２２９、若しくは２３０、又は残基３０１〜３１１に対応する領域を含むがこれに限定されない、改変に対して耐性である部位又は領域において少なくとも１つの改変を有する、改変花虫類ルシフェラーゼをさらに含む。対応する配列位置は、例えば、配列アライメントプログラムを用いてルシフェラーゼ配列を整列することにより同定してよい。改変に対して耐性であるルシフェラーゼ中の残基又は領域を部位として用いて、該ルシフェラーゼを円順列置換するか、該ルシフェラーゼに挿入するか、又はタンパク質相補性アッセイ若しくはタンパク質スプライシングアッセイにおいて用いうる２つの分子に該ルシフェラーゼを「分断」してよい。
さらに、ガウシアルシフェラーゼ（例えば、図４１を参照）の残基４３〜５３、残基６３〜７３、残基７９〜８９、残基９５〜１０５、残基１０５〜１１５、残基１０９〜１１９、残基１２１〜１３１、又は残基１５７〜１６８に対応する領域、或いは成体ヒオドシエビルシフェラーゼの残基４５〜５５、残基７９〜８９に対応する領域を含むがこれに限定されない、改変に対して耐性である部位又は領域において少なくとも１つの改変を有する、改変甲殻類ルシフェラーゼ、例えば、カイアシ類ルシフェラーゼを含む。対応する配列位置は、例えば、配列アライメントプログラムを用いてルシフェラーゼ配列を整列することにより同定してよい。改変に対して耐性であるルシフェラーゼ中の残基又は領域を部位として用いて、該ルシフェラーゼを円順列置換するか、該ルシフェラーゼに挿入するか、又はタンパク質相補性アッセイ若しくはタンパク質スプライシングアッセイにおいて用いうる２つの分子に該ルシフェラーゼを「分断」してよい。
一実施形態において、改変ルシフェラーゼは、検出可能な活性を有し、改変に対して耐性である部位又は領域において対応する非改変ルシフェラーゼと比べて１つ又は複数のアミノ酸の挿入を含み、この挿入が、例えば、対象の分子の認識配列を含む挿入であるなど、対象の分子と直接に相互作用するアミノ酸配列を含む、又は、例えば、別の分子を介するなど、対象の分子と間接に相互作用するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、改変ルシフェラーゼは、２つ以上、例えば、３、４、５、１０、２０、５０、１００、２００、３００以上であるが約１０００未満、又はその間の任意の整数個のアミノ酸残基の挿入を含む。例えば、ＩＰ３配列の挿入は、約７００アミノ酸残基を含んでよい。一実施形態において、挿入を含む改変ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼ配列の欠失、例えば、１つ又は複数であるが約１００未満、例えば、５０、４０、３０、２０、１０、若しくは５、又はその間の任意の整数個の残基の欠失をさらに含む。
一実施形態において、本発明は、例えば、対象の分子の認識配列を含む挿入など、対象の分子と直接に相互作用するアミノ酸配列の挿入を含む、又は、例えば、別の分子を介するなど、対象の分子と間接に作用するアミノ酸配列を含むようにさらに改変した円順列置換ルシフェラーゼを提供する。例えば、本明細書で以下に記載する通り、改変に対して耐性であるＮ末端及び／又はＣ末端のほか内部の残基又は領域をも有するルシフェラーゼを、耐性である残基又は領域、及び耐性である別の残基又は領域において円順列置換し、１つ又は複数の異種アミノ酸配列を挿入すると、少なくともその１つが対象の分子と直接又は間接に相互作用する。結果として得られる改変ルシフェラーゼは、対象の分子の存在下において、検出可能な活性の変化を有することが示された。
一実施形態において、ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰ結合部位を有する円順列置換甲虫ルシフェラーゼ、円順列置換十脚甲殻類ルシフェラーゼ（例えば、ヒオドシエビルシフェラーゼ）、又は円順列置換レニラルシフェラーゼは、サイクリックヌクレオチド、例えばｃＡＭＰ又はｃＧＭＰの存在下において、ルシフェラーゼ活性を変化させることが示された。本発明のルシフェラーゼにおいて有用なサイクリックヌクレオチドの結合部位は、Ｇ（Ｅ／Ｑ／Ｋ）（Ｌ／Ｋ／Ｓ／Ｉ）（Ａ／Ｉ／Ｃ／Ｇ）（Ｌ／Ｉ）Ｘ（Ｐ／Ｖ／Ｔ／Ｒ／Ｅ）Ｒ（Ａ／Ｔ／Ｈ／Ｓ）（Ａ／Ｓ）（Ｖ／Ｔ／Ｓ／Ｎ／Ｗ）（配列番号１１８）を有し、ここでＸは２〜６アミノ酸であってよい。本発明の円順列置換ルシフェラーゼにおいて有用なｃＡＭＰ結合部位（ドメイン）は、Ｅｐａｃ ２Ｂ、Ｅｐａｃ １、Ｅｐａｃ ＩＩＡを含むｃＡＭＰに直接活性化される交換タンパク質（Ｅｐａｃ）（Ｂｏｓら、２００３；及び、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ１１５４８０を参照のこと）、過分極作動性サイクリックヌクレオチド調節型チャネル（Ｚａｇｏｔｔａら、２００３）などのサイクリックヌクレオチド作動性イオンチャネル、神経障害標的エステラーゼ（Ｄｒｅｍｉｅｒら、２００３）、ＩＩβ型ＰＫＡ調節サブユニット（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号Ｍ１２４９２１を参照のこと）、例えば、ＰＫＡ ＩＩβＡ及びＰＫＡ ＩＩβＢ、Ｉα型ＰＫＡ調節サブユニット、例えば、ＰＫＡ ＩαＡ及びＰＫＡ ＩαＢ、ＰＫＧ ＩＩＡ、ＰＫＧ ＩＩＢ、並びにカタボライト活性化タンパク質中のｃＡＭＰ結合部位を含むがこれに限定されない。本明細書では、ｃＡＭＰ結合部位を有する非円順列置換レニラルシフェラーゼ及び非円順列置換十脚甲殻類ルシフェラーゼが、ｃＡＭＰ存在下においてルシフェラーゼ活性を変化させたことも記載する。本発明の円順列置換ルシフェラーゼにおいて有用なｃＧＭＰ結合部位は、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＧＫ）、例えば、ＧＫ１中のｃＧＭＰ結合部位、或いはホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）、例えば、ＰＤＥ２若しくはＰＤＥ５、アデニルシクラーゼ、又はＦｎｌＡ中のＧＡＦ調節領域を含むがこれに限定されない。一実施形態において、本発明のルシフェラーゼを含むサイクリックヌクレオチド結合ドメインは、サイクリックヌクレオチドの細胞内局在化及び／又は細胞内濃度を検出するのに有用な細胞内局在化シグナルをさらに含む。
本明細書で以下に記載の通り、ルシフェラーゼバイオセンサーは、少なくとも４つの異なる構造的折りたたみのクラスをなす各種配列の挿入により調製する。特に、折りたたみクラスの１つが、様々な小分子相互作用を介して、多数の酵素の調節に関与する。さらに、本発明のルシフェラーゼ中へのアロステリックドメイン、すなわち、別の分子と結合すると立体構造を変化させるドメインの挿入を用いることで、立体構造変化、例えば、リン酸化又はプロテアーゼ開裂を検出してよい。
したがって、一実施形態において、本発明の改変ルシフェラーゼは、非改変の野生型ルシフェラーゼなど、対応するルシフェラーゼのアミノ酸配列と比べて円順列置換したアミノ酸配列を含む結果、円順列置換ルシフェラーゼにおける新規のＮ末端及びＣ末端であって、少なくともその１つが改変に対して耐性である部位又は領域に存在し、例えば、サイクリックヌクレオチドと直接又は間接に相互作用する異種アミノ酸配列を導入することにより、加工され機能性を有するようになる、新規のＮ末端及びＣ末端をもたらす。別の実施形態において、円順列置換ルシフェラーゼは、円順列置換ルシフェラーゼのＮ末端又はＣ末端に対して内部の挿入及び／又は欠失、例えば、対応する非改変ルシフェラーゼのＮ末端の１〜約１０若しくは約３０又はその間の任意の整数個の残基に対応する、及び／又は同Ｃ末端の最終残基若しくは最終の約３０残基、例えば、最終の１５残基、若しくは最終の１〜３０の間の任意の整数個の残基に対応する残基など、対応する非改変ルシフェラーゼのＮ末端及びＣ末端又はその近傍における別の挿入及び／又は欠失を含むがこれに限定されない他の改変を含む。
一実施形態では、対象の分子の不在下において、本発明の改変ルシフェラーゼの活性は、対応する非改変ルシフェラーゼの活性を下回り、例えば、改変ルシフェラーゼのレポーター活性は、対応する非改変ルシフェラーゼの場合の約０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、５０％、７０％以上であるが１００％未満であり、この改変ルシフェラーゼの活性は、場合によって検出可能である。別の実施形態では、対象の分子の不在下において、本発明の改変ルシフェラーゼの活性は、対応する非改変ルシフェラーゼの活性と実質的に同じであるかこれを上回り、例えば、本発明の改変ルシフェラーゼのレポーター活性は、対応する非改変ルシフェラーゼの場合の約１．５倍、例えば、少なくとも２倍、３倍、又は５倍以上である。対象の分子の存在下では、本発明の改変ルシフェラーゼの活性が、検出可能に変化する。例えば、対象の分子の存在下における改変ルシフェラーゼ活性の検出可能な変化は、対象の分子の不在下における改変ルシフェラーゼの活性と比べ、少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、又は１００％で、多くとも２倍、４倍、１０倍、１００倍、１，０００倍、１０，０００倍以上の変化である。こうして、改変ルシフェラーゼにおいては存在するが対応する非改変ルシフェラーゼには存在しない改変と相互作用する対象の分子の物理的近接性が、改変ルシフェラーゼの活性を変化させる、例えば、低下、消滅、又は上昇させる。例えば、改変甲虫ルシフェラーゼ、同花虫類ルシフェラーゼ、又は同十脚甲殻類ルシフェラーゼは、ｃＡＭＰ結合部位を含む円順列置換甲虫ルシフェラーゼ、同花虫類ルシフェラーゼ、又は同十脚甲殻類ルシフェラーゼであってよい。ｃＡＭＰ存在下におけるこうした改変ルシフェラーゼの発光シグナルは、ｃＡＭＰ不在下における改変ルシフェラーゼの発光シグナル、又はｃＡＭＰ存在下若しくは不在下における対応する非改変甲虫ルシフェラーゼ、同花虫類ルシフェラーゼ、又は同十脚甲殻類ルシフェラーゼの発光シグナルと比べ、低下、消滅、又は上昇してよい。
したがって、本発明の改変ルシフェラーゼをバイオセンサーとして用いてよい。
本発明は、本発明の改変ルシフェラーゼをコードする核酸配列を含む、単離核酸分子（ポリヌクレオチド）をも提供する。さらに、改変ルシフェラーゼ、並びに、改変ルシフェラーゼのＮ末端（Ｎ末端融合パートナー）及び／又はＣ末端（Ｃ末端融合パートナー）における１つ又は複数のアミノ酸残基を含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、単離核酸分子をも提供する。こうして、本明細書で用いる「融合タンパク質」とは、本発明の改変ルシフェラーゼのＮ末端及び／又はＣ末端における１つ又は複数のアミノ酸残基を含むポリペプチドである。融合タンパク質中に１つ又は複数の融合パートナーが存在しても、融合タンパク質の検出可能な活性が、対応する改変ルシフェラーゼと比べて実質的に変化しないことが好ましい。Ｎ末端又はＣ末端の融合パートナーは、精製に用いる配列、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はポリＨｉｓ配列、改変ルシフェラーゼの特性を変化させることを目的とする配列、例えば、タンパク質不安定化配列、タンパク質又は核酸相互作用配列（例えば、結合配列）、細胞内局在化配列、又は融合タンパク質中のルシフェラーゼの１つ又は複数の特性と識別可能な特性を有する配列であってよい。一実施形態において、融合タンパク質は、改変ルシフェラーゼと、ルシフェラーゼとは異なるレポータータンパク質であって、分子内対照、例えば、蛍光タンパク質又は別のルシフェラーゼとして有用なレポータータンパク質である融合パートナーとを含む。別の実施形態において、本発明は、本発明の改変ルシフェラーゼを含む融合タンパク質をコードする核酸配列と、改変ルシフェラーゼにおけるルシフェラーゼとは異なるレポータータンパク質をコードする核酸断片とを含むベクターを含む。少なくともルシフェラーゼを、及び好ましくは、改変ルシフェラーゼ又は改変ルシフェラーゼを含む融合タンパク質をコードする最適化した核酸配列、例えば、ヒトコドンに最適化した配列は、ルシフェラーゼに対するシグナルの強度を増大させることができるので、場合によって、これらの最適化した配列を本発明の核酸分子において用いる。核酸配列の最適化は当技術分野において知られており、例えば、国際特許公開第０２／１６９４４号を参照のこと。
本発明は、本発明の改変ルシフェラーゼ又は融合タンパク質を発現する安定的な細胞系のほか、本発明の改変ルシフェラーゼ又は融合タンパク質をコードする核酸分子と、宿主細胞において本発明の核酸分子を発現することのできるベクター（例えば、プラスミド、ウイルス、又は失活したウイルス粒子）とを含む発現カセットをも含む。発現カセットは、プロモーター、例えば、核酸配列に機能的に結合した構成的プロモーター又は調節的プロモーターを含むことが好ましい。一実施形態において、発現カセットは、誘導的プロモーターを含む。本発明の発現カセット又はベクターを含む宿主細胞、例えば、原核細胞又は植物細胞若しくは脊椎動物細胞、例えば、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、又はげっ歯類（例えば、ウサギ、ラット、フェレット、又はマウス）細胞を含むがこれに限定されない哺乳類細胞などの真核細胞、及び、本発明の核酸分子、発現カセット、ベクター、宿主細胞、又は改変ルシフェラーゼ若しくは融合タンパク質を含むキットをも提供する。
本発明の改変ルシフェラーゼは、各種の状態又は対象の分子、例えば、ホルモン受容体結合部位、例えば、エストロゲン結合ドメイン、カルシウム結合ドメインの挿入によるステロイド、プロテアーゼ認識部位の挿入によるプロテアーゼ、又はサイクリックヌクレオチド結合部位の挿入によるサイクリックヌクレオチドを測定又は検出する機能的なレポーターとしてなど、非改変ルシフェラーゼを用いることのできない適用において用いてよい。例えば、ｃＡＭＰ結合部位の挿入を含む改変ルシフェラーゼをコードするベクター、又はｃＡＭＰ結合部位の挿入を含む改変ルシフェラーゼを、試料、例えば、細胞、細胞溶解物、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける転写／翻訳混合物、又は上清と混合し、試料中の改変ルシフェラーゼ活性を、例えば、場合によっては、１つ若しくは複数の時点において、また場合によっては、対応する非改変ルシフェラーゼ、又はｃＡＭＰとの相互作用が低下した類似の改変ルシフェラーゼ（例えば、特定のアミノ酸に対する突然変異によりさらに修飾され、ｃＡＭＰとの結合親和性を低下させる）、又はｃＡＭＰを有さない若しくは異なる量のｃＡＭＰを有する対照試料と比べて検出又は定量する。試料中の発光活性の変化、例えば、経時的な変化及び／又は対照、例えば、特定量のｃＡＭＰを有する細胞と比べた変化が、試料中のｃＡＭＰの存在若しくはｃＡＭＰ量、又は実験条件に関連するｃＡＭＰ量の変化を示す。一実施形態において、細胞を、プロモーター、例えば、調節的プロモーター又は構成的プロモーターと、サイクリックヌクレオチドと相互作用する挿入を含む本発明の改変ルシフェラーゼをコードする核酸配列とを含むベクターと接触させる。一実施形態において、トランスフェクトした細胞は、プロモーターが改変ルシフェラーゼの一過性発現を誘導する条件下で培養し、発光の存在を判定する又は発光量を定量する。別の実施形態では、サイクリックヌクレオチドと相互作用する挿入を含む本発明の改変ルシフェラーゼと、サイクリックヌクレオチドを有すると推定される試料とを混合する。次いで、発光量を測定する。こうして、本発明は、サイクリックヌクレオチド量の検出法を提供する。
一実施形態において、改変ルシフェラーゼは、改変レニラルシフェラーゼなどの改変花虫類ルシフェラーゼである。一実施形態において、改変花虫類ルシフェラーゼは、円順列置換レニラルシフェラーゼなどの円順列置換花虫類ルシフェラーゼである。別の実施形態において、改変花虫類ルシフェラーゼは円順列置換しない。改変花虫類ルシフェラーゼは、対象の分子と直接又は間接に相互作用する少なくとも１つの配列を含む、１つ又は複数の異種アミノ酸配列を有する。一実施形態において、該アミノ酸配列は、対象の分子との相互作用中又は相互作用後において立体構造変化を受ける配列であり、これが、該ルシフェラーゼの活性を変化させる、例えば、こうしたアミノ酸配列を含む改変レニラルシフェラーゼが、アロステリック相互作用を検出するのに有用である。
一実施形態において、改変ルシフェラーゼは、改変ヒオドシエビルシフェラーゼなどの改変十脚甲殻類ルシフェラーゼである。一実施形態において、改変十脚甲殻類ルシフェラーゼは、円順列置換ヒオドシエビルシフェラーゼなどの円順列置換十脚甲殻類ルシフェラーゼである。別の実施形態において、改変十脚甲殻類ルシフェラーゼは円順列置換しない。改変十脚甲殻類ルシフェラーゼは、対象の分子と直接又は間接に相互作用する少なくとも１つの配列を含む、１つ又は複数の異種アミノ酸配列を有する。一実施形態において、該アミノ酸配列は、対象の分子との相互作用中又は相互作用後において立体構造変化を受ける配列であり、これが、該ルシフェラーゼの活性を変化させる、例えば、こうしたアミノ酸配列を有する改変ヒオドシエビルシフェラーゼが、アロステリック相互作用を検出するのに有用である。
本発明の改変花虫類ルシフェラーゼ又は改変十脚甲殻類ルシフェラーゼに融合する例示的な対象のアミノ酸配列は、エンテロキナーゼ部位、プロテアーゼ開裂部位、例えば、カスパーゼ開裂部位、例えば、カスパーゼ３開裂部位、カスパーゼ８開裂部位、ＰＳＡ、又は、ライノウイルスプロテアーゼ開裂部位、ＳＡＲＳプロテアーゼ開裂部位、若しくはＴＥＶプロテアーゼ開裂部位（ＮＬＹＦＱＧ、配列番号１１９）などのウイルス性プロテアーゼ開裂部位、サイクリックヌクレオチド結合部位、ホルモン結合部位、ＥＧＴＡ及びＣａＣｌ２により調節されるカルモジュリンなどのカルシウム結合ドメイン、或いは相互作用し合い、場合によっては外因性作用物質、例えば、ラパマイシンが結合を誘導し、ＦＫ５０６が結合の解離を促進するＦＫＢＰ及びＦＲＢによって調節される配列を有する二重融合；ｃＡＭＰにより調節しうるＰＫＡ−Ｒ由来のドメイン及びＰＫＡ−Ｃ由来のドメイン；例えば、チロシンキナーゼ又はホスファターゼにより調節しうる、ＳＨ２由来のドメイン及びリン酸化可能なドメイン；例えば、ｃＡＭＰ−ＰＫＡにより調節しうる、１４−３−３ｔ由来のドメイン及びリン酸化可能なドメイン；例えば、Ｓｅｒ−Ｔｈｒキナーゼにより調節しうる、ＷＷ由来のドメイン及びリン酸化可能なドメイン；メトトレキサート（ＭＴＸ）又はＢｉｓＭＴＸにより調節しうる、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）由来のドメイン；クメルマイシン又はノボビオシンにより調節しうる、ジャイレースＢ（ＧｙｒＢ）由来のドメイン；或いは、同一のドメイン由来の配列を有する二重融合を含むがこれに限定されない。こうして、一実施形態において、円順列置換花虫類ルシフェラーゼ又は改変十脚甲殻類ルシフェラーゼを改変して、２つ以上の異種配列を含むようにし、これらの異種配列が、対応する非改変ルシフェラーゼのＮ末端残基及び／若しくはＣ末端残基に対応する配列又はその近傍、円順列置換ルシフェラーゼのＮ末端残基及び／若しくはＣ末端残基又はその近傍、円順列置換ルシフェラーゼのＮ末端残基及び／若しくはＣ末端残基又はその近傍には存在しない改変に対して耐性である１つ若しくは複数の部位又は１つ若しくは複数の領域、或いはその任意の組合せにおいて単独で存在し、この場合２つの異種アミノ酸配列が異なる対象の分子と相互作用してよい。
さらに、対象の分子を直接又は間接に調節する１つ又は複数の作用物質を同定する方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、細胞中の対象の分子を検出する、又は該分子の活性を定量する方法を提供する。該方法は、改変ルシフェラーゼ、例えば、改変甲虫ルシフェラーゼのオープンリーディングフレームを含む核酸配列を有するベクターを伴う細胞を含む発光反応混合物を提供するステップを含む。改変ルシフェラーゼは、対応する非改変ルシフェラーゼと比べて挿入を有し、この挿入が、改変に対して耐性であるルシフェラーゼ配列中の残基又は領域に存在する。該挿入は、対応する非改変ルシフェラーゼと比べて、対象の分子と直接又は間接に相互作用するアミノ酸配列を含む。混合物は、約２０℃〜約４７℃、例えば、約３７℃〜約４５℃である。次いで、混合物における発光を検出又は定量し、これにより、細胞中の分子の存在、量、又は活性を検出又は判定する。本明細書で以下に述べる通り、被験作用物質の添加以前の時間にわたり、生理学的温度及び／又は条件、例えば、約３７℃及び／又は約５％ＣＯ２でｃＡＭＰのバイオセンサーであるルシフェラーゼをコードする細胞とともに発光反応混合物をインキュベートすることで、より迅速な反応及びより大きなダイナミックレンジを提供した。
細胞又は多細胞生物、例えば、生体哺乳類におけるイメージングにも、本発明のバイオセンサーの使用を提供する。
定義
本明細書で用いる「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、又は「核酸配列」という用語は、ポリペプチド又はタンパク質前駆体の産生に必要な配列をコードすることを含む核酸、ＤＮＡ又はＲＮＡを指す。コードされるポリペプチドは、全長ポリペプチド、その断片（全長より短い）、又は、融合ポリペプチドを産生する、全長ポリペプチド若しくはその断片のいずれかと別のポリペプチドとの融合でよい。
本明細書で用いる「核酸」とは、１つのヌクレオチドの五炭糖の３’位が、ホスホジエステル基により、隣接するヌクレオチドの五炭糖の５’位に結合され、ヌクレオチド残基（塩基）が特定の配列、すなわち、ヌクレオチドの線形順序に結合される、ヌクレオチドの共有結合配列である。本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」とは、約１００ヌクレオチドを超える長さの配列を含む核酸である。本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」又は「プライマー」とは、短いポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの部分である。オリゴヌクレオチドは、約２〜約１００塩基の配列を含むのが通例である。「オリゴヌクレオチド」という言葉の代わりに、「オリゴ」という言葉を用いることもある。
核酸のホスホジエステル結合が置換基であるモノヌクレオチドのペントース環の５’位の炭素と３’位の炭素とに生じるため、核酸分子は「５’末端」（５’端）及び「３’末端」（３’端）を有するという。新規の結合が５’炭素に生じるようなポリヌクレオチドの端部が、その５’末端ヌクレオチドである。新規の結合が３’炭素に生じるようなポリヌクレオチドの端部が、その３’末端ヌクレオチドである。本明細書で用いる末端ヌクレオチドとは、３’末端又は５’末端の端位にあるヌクレオチドである。
１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸が、隣接するヌクレオチドの３’酸素に、ホスホジエステル結合を介して１方向的に付く形で、モノヌクレオチドが反応してオリゴヌクレオチドを形成するため、ＤＮＡ分子は、「５’端」及び「３’端」を有するという。したがって、オリゴヌクレオチドの端部は、その５’リン酸が、モノヌクレオチドペントース環の３’酸素に結合していない場合は「５’端」を指し、その３’酸素が後続のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に結合していない場合は「３’端」を指す。
本明細書で用いる核酸配列は、より大型のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの内部にある場合であっても、やはり５’端及び３’端を有するといってよい。線状又は環状のＤＮＡ分子において、分離された要素を、「下流」要素又は３’要素の「上流」要素又は５’要素であるという。この用語法は、ＤＮＡらせんに沿って５’〜３’方向に転写が進行する事実を反映する。結合された遺伝子（例えば、オープンリーディングフレーム又はコード領域）の転写を導くプロモーター及びエンハンサー要素は、一般に、コード領域の５’側又は上流側に位置することが通例である。ただし、エンハンサー要素は、プロモーター要素及びコード領域の３’側に位置する場合でも、その効果を及ぼすことができる。転写終結及びポリアデニル化のシグナルは、コード領域の３’側又は下流側に位置する。
本明細書で用いる「コドン」という用語は、ポリペプチド鎖に組み込まれる特定のアミノ酸を指定する３つのヌクレオチド配列からなる遺伝子コードの基本単位、又は開始若しくは終止のシグナルである。構造遺伝子を指して用いる「コード領域」という用語は、ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果として新生ポリペプチド中に見出されるアミノ酸をコードする、ヌクレオチド配列を指す。コード領域は、開始メチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ＡＴＧ」が５’側の、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）が３’側の境界となるのが通例である。場合によって、コード領域は、ヌクレオチドトリプレット「ＴＴＧ」により開始することも知られる。
「遺伝子」という用語は、コード配列と、場合によっては、ＤＮＡ配列からのポリペプチドの産生に必要な制御配列とを含むＤＮＡ配列を指す。
本明細書で用いる「異種」核酸配列又はタンパク質とは、基準配列と比べて異なる源泉を有する、例えば、外来種に由来する、又は、同一種に由来する場合でも、もとの形態から実質的に改変されうる配列を指す。
核酸は、異なる種類の突然変異を含むことが知られる。「点（ｐｏｉｎｔ）」突然変異とは、野生型配列からの、単一塩基位置におけるヌクレオチド配列の変化を指す。突然変異とは、１つ又は複数の塩基の挿入又は欠失により、核酸配列が基準配列、例えば、野生型配列と異なることをも指す。
本明細書で用いる「ハイブリッド形成する」及び「ハイブリッド形成」という用語は、標的核酸に対する相補的な配列のアニーリング、すなわち、相補的な配列を含む２つの核酸ポリマー（ポリヌクレオチド）が、塩基対合によりアニールする能力を指す。「アニールした」及び「ハイブリッド形成した」という用語は、本明細書全体において互換的に用い、部分的な相補性を有するに過ぎない領域の結合を含む、相補的配列と標的核酸との間の特異的で再現可能な相互作用を含むことを意図する。本発明の核酸に、天然の核酸において通常は見出されないある種の塩基を含めてよく、例えば、イノシン及び７−デアザグアニンを含める。核酸技術における当業者は、例えば、相補的配列の長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成及び塩基配列、ミスマッチ塩基対のイオン強度及び発生を含む多くの変数を経験的に考慮して、二本鎖の安定性を判定することができる。核酸二本鎖の安定性は、溶融温度、又は「Ｔｍ」により測定する。特定の条件下における特定の核酸二本鎖のＴｍは、平均で塩基対の半分が解離した温度である。
「組み換えＤＮＡ分子」という用語は、通常天然ではともに見出されない少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む、ハイブリッドＤＮＡ配列を意味する。
「ベクター」という用語は、その内部にＤＮＡの断片を挿入又はクローンしうる核酸分子を指して用い、１つ又は複数のＤＮＡ断片を細胞に導入するのに用いることができ、細胞内での複製が可能である。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、コスミドなどに由来してよい。
本明細書で用いる「組み換えベクター」及び「発現ベクター」という用語は、所望のコード配列と、特定の宿主生物内において機能的に結合したコード配列の発現に必要な、適切なＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列とを含む、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列を指す。原核発現ベクターは、プロモーター、リボゾーム結合部位、宿主細胞内における自己複製の複製起点、及びおそらくはその他の配列、例えば、任意のオペレーター配列、任意の制限酵素部位を含む。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させる、ＤＮＡ配列と定義される。真核発現ベクターは、プロモーター、場合によっては、ポリアデニル化シグナル、及び、場合によっては、エンハンサー配列を含む。
タンパク質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、遺伝子のコード領域を含む核酸配列を意味する、又は別の言い方をすれば、該核酸配列が遺伝子産物をコードする。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はＲＮＡのいずれの形態で存在してもよい。ＤＮＡ形態で存在する場合、オリゴヌクレオチドは、一本鎖（すなわち、センス鎖）又は二本鎖でよい。適正な転写の開始及び／又は一次ＲＮＡ転写物の正確なプロセシングを可能とするのに必要な場合は、遺伝子のコード領域のごく近傍に、エンハンサー／プロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化シグナルなどの適切な制御要素を置いてよい。或いは、コード領域。他の調節要素は、転写因子結合部位、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終止シグナル、及びエンハンサー要素を含むがこれに限定されない。
真核生物における転写制御シグナルは、「プロモーター」要素及び「エンハンサー」要素を含む。プロモーター及びエンハンサーは、転写に関与する細胞内タンパク質と特異的に相互作用する一連の短いＤＮＡ配列からなる。プロモーター要素及びエンハンサー要素は、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞中の遺伝子を含めて、各種の真核生物の供給源から単離されている。プロモーター要素及びエンハンサー要素は、ウイルスからも単離されており、原核生物においてもプロモーターなど類似の制御要素が見出されている。特定のプロモーター及びエンハンサーの選択は、対象のタンパク質を発現するのに用いる細胞型に依存する。真核生物のプロモーター及びエンハンサーには、宿主域の広いものもあるが、細胞型の限られた一部において機能的であるものもある。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多くの哺乳類種を始めとする広範な細胞型においてきわめて活性であり、哺乳類細胞におけるタンパク質の発現に広く用いられている。広範な哺乳類細胞型において活性であるプロモーター／エンハンサー要素の他の２つの例は、ヒト伸長因子１遺伝子及びラウス肉腫ウイルスの長い末端反復に由来する要素、並びにヒトサイトメガロウイルスに由来する要素である。
「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター機能及びエンハンサー機能の両方（すなわち、上述のプロモーター要素及びエンハンサー要素が提供する機能）を提供することのできる配列を含むＤＮＡ断片を意味する。例えば、レトロウイルスの長い末端反復は、プロモーター機能及びエンハンサー機能の両方を含む。エンハンサー／プロモーターは、「内因性」でも「外因性」でも「異種」でもよい。「内因性」エンハンサー／プロモーターとは、ゲノム中の所与の遺伝子と天然に結合したエンハンサー／プロモーターである。「外因性」又は「異種」エンハンサー／プロモーターとは、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技術）により遺伝子に並置することで、結合したエンハンサー／プロモーターが該遺伝子の転写を導くエンハンサー／プロモーターである。
発現ベクターにおける「スプライシングシグナル」の存在は、真核宿主細胞における組み換え転写の発現レベルを上昇させることが多い。スプライシングシグナルは、一次ＲＮＡ転写物からのイントロンの除去を媒介し、スプライスドナー部位及びスプライス受容部位からなる。通常用いられるスプライスドナー部位及びスプライス受容部位は、ＳＶ４０の１６Ｓ ＲＮＡ由来のスプライス部位である。
真核細胞における組み換えＤＮＡ配列の効率的な発現には、効率的な終結及び結果として得られる転写産物の効率的なポリアデニル化を導くシグナルの発現が必要である。転写終結シグナルは、一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見出され、数百ヌクレオチド長である。本明細書で用いる「ポリＡ部位」又は「ポリＡ配列」という用語は、終結及び新生ＲＮＡ転写産物のポリアデニル化の両方を導くＤＮＡ配列を意味する。ポリＡテイルを欠く転写産物は不安定で即座に分解するので、組み換え転写産物の効率的なポリアデニル化が望ましい。発現ベクターにおいて用いるポリＡシグナルは、「異種」でも「内因性」でもよい。内因性ポリＡシグナルとは、ゲノム内における所与の遺伝子のコード領域の３’端において天然に見出される。異種ポリＡシグナルとは、ある遺伝子から単離され、別の遺伝子の３’側に位置するシグナルである。通常用いられる異種ポリＡシグナルは、ＳＶ４０ポリＡシグナルである。ＳＶ４０ポリＡシグナルは、２３７ ｂｐ ＢａｍＨ Ｉ／Ｂｃｌ Ｉ制限断片に含まれ、終結及びポリアデニル化の両方を導く。
真核発現ベクターは、「ウイルス複製」又は「ウイルス複製起点」をも含んでよい。ウイルス複製とは、適切な複製因子を発現する宿主細胞内におけるベクターの染色体外複製を可能にするウイルスＤＮＡ配列である。ＳＶ４０又はポリオーマウイルスの複製起点を含むベクターは、適切なウイルスＴ抗原を発現する細胞内において、高コピー数（最大１０４コピー／細胞）まで複製する。これに対して、ウシパピロウイルス又はエプスタインバーウイルス由来のレプリコンを含むベクターは、低コピー数（約１００コピー／細胞）で染色体外複製する。
「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、人工環境及び人工環境内で生じる過程又は反応を指す。ｉｎ ｖｉｔｒｏの環境は、試験管及び細胞溶解物を含むがこれに限定されない。「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、天然環境（例えば、動物又は細胞）及び天然環境内で生じる過程又は反応を指す。
「発現系」という用語は、対象の遺伝子の発現を判定する（例えば、検出する）任意のアッセイ又は系を指す。細胞生物学の当業者は、広範な発現系のいずれを用いてもよいことを理解するであろう。広範にわたる適切な哺乳類細胞が、広範な源泉（例えば、メリーランド州、ロックランド、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手できる。形質転換又はトランスフェクションの方法及び発現媒体の選択は、選択した宿主系によって決まる。形質転換又はトランスフェクションの方法は、当技術分野でよく知られている。発現系は、対象の遺伝子（例えば、レポーター遺伝子）を調節的配列に結合し、該遺伝子の発現を阻害又は誘導する作用物質による処理に続いて該遺伝子の発現をモニターする、ｉｎ ｖｉｔｒｏの遺伝子発現アッセイを含む。遺伝子発現の検出は、発現したｍＲＮＡ又はタンパク質（例えば、レポーター遺伝子の検出可能な産物）の検出を含むがこれに限定されない任意の適切な手段により、又は対象の遺伝子を発現する細胞の表現型における検出可能な変化により可能である。発現系は、開裂事象又は他の核酸若しくは細胞の変化を検出するアッセイをも含んでよい。
本明細書で用いる「野生型の」という用語は、遺伝子又は該遺伝子の特性を有する遺伝子産物又は自然発生の源泉から単離した遺伝子産物を指す。野生型の遺伝子とは、集団内で最も高頻度に観察されるため、適宜、該遺伝子の「野生型の」形態と指定される遺伝子である。これに対して、「突然変異の」という用語は、野生型の遺伝子又は遺伝子産物と比べると、配列及び／又は機能的な特性の修飾（すなわち、特性の変化）を示す遺伝子又は遺伝子産物を指す。自然発生の突然変異体を単離できることが指摘されている。これらは、野生型の遺伝子又は遺伝子産物と比べると、特性の変化を有する事実により同定される。
「単離オリゴヌクレオチド」又は「単離ポリヌクレオチド」における通り、核酸に関して用いる場合の「単離」という用語は、その源泉においては通常関連する少なくとも１つの不純物から識別され分離された核酸配列を指す。こうして、単離核酸とは、天然に見出される形態又は状況とは異なる形態又は状況において存在する。これに対して、非単離核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、天然に存在する状態で見出される。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、宿主細胞染色体において、隣接する遺伝子のごく近傍に見出される。ＲＮＡ配列（例えば、特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ）は、細胞内において、多数のタンパク質をコードする多数の他のｍＲＮＡとの混合物として見出される。一方、単離核酸は、例えば、核酸を通常発現する細胞内における核酸であって、天然細胞の場合とは異なる染色体位置にあるか、又は天然に見出されるのとは異なる核酸配列が別様に隣接する核酸を含む。単離核酸又は単離オリゴヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖の形態で存在してよい。単離核酸又は単離オリゴヌクレオチドをタンパク質の発現に用いようとする場合、該オリゴヌクレオチドは、最小限でもセンス鎖又はコード鎖を含むが（すなわち、該オリゴヌクレオチドは一本鎖でよい）、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含んでもよい（すなわち、該オリゴヌクレオチドは二本鎖でよい）。
「ペプチド」、「タンパク質」、及び「ポリペプチド」とは、長さ又は翻訳後修飾（例えば、グリコシル化又はリン酸化）に関わらず、任意のアミノ酸鎖を意味する。本発明の核酸分子は、由来元である自然発生の（天然の又は野生型の）タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を有する、自然発生のタンパク質又はそのポリペプチド断片の変異体をコードしてよい。「融合ポリペプチド」又は「融合タンパク質」という用語は、Ｎ末端及び／又はＣ末端において１つ又は複数の異種配列（例えば、非ルシフェラーゼポリペプチド）と結合した基準タンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）を含むキメラタンパク質を指す。一部の実施形態において、本発明の改変ポリペプチド、融合ポリペプチド、又は全長ポリペプチドの一部は、対応する機能的な（非キメラ）全長ポリペプチドの活性の少なくとも一部を保持してよい。他の実施形態では、外因性作用物質又は対象の分子の不在下において、本発明の改変ポリペプチド、融合ポリペプチド、又は機能的な全長ポリペプチドの一部は、対応する機能的な全長ポリペプチドと比べて、活性を欠いてよい。他の実施形態では、本発明の改変ポリペプチド、融合ポリペプチド、又は機能的な全長ポリペプチドの一部は、外因性作用物質の存在下において、対応する機能的な全長ポリペプチドと比べて、少なくとも一部の活性を保持するか又は実質的に同一の活性を有してよく、或いは活性を欠いてよい。
ペプチド結合が、第１のアミノ酸残基の主鎖アミノ基と、第２のアミノ酸残基の主鎖カルボキシル基との間で生じるので、ポリペプチド分子は、「アミノ末端」（Ｎ末端）及び「カルボキシ末端」（Ｃ末端）を有するという。ポリペプチド配列に関する「Ｎ末端」及び「Ｃ末端」という用語は、それぞれ、該ポリペプチドのＮ末端領域及びＣ末端領域の一部を含むポリペプチド領域を指す。ポリペプチドのＮ末端領域の一部を含む配列は、おもに、ポリペプチド鎖のＮ末端側の半分に由来するアミノ酸を含むが、こうした配列に限定されない。例えば、Ｎ末端配列は、ポリペプチドのＮ末端側の半分及びＣ末端側の半分の両方に由来する塩基を含むポリペプチド配列の内部を含んでよい。同じことは、Ｃ末端領域にも当てはまる。Ｎ末端領域及びＣ末端領域は、それぞれ、ポリペプチドの究極のＮ末端及びＣ末端を定めるアミノ酸を含んでよいが含まなくてもよい。
本明細書で用いる「組み換えタンパク質」又は「組み換えポリペプチド」という用語は、組み換えＤＮＡ分子から発現されたタンパク質分子を指す。これに対して、「天然タンパク質」という用語は、本明細書において、自然発生の（例えば、非組み換えの）源泉から単離したタンパク質を指す際に用いる。分子生物学的技術を用いて、タンパク質の天然形態と比べて同一の特性を有するタンパク質の組み換え形態を産生してよい。
本明細書で用いる「細胞」、「細胞系」、「宿主細胞」という用語は互換的に用い、こうした全ての呼称対象は、これらの呼称対象の子孫細胞又は潜在的な子孫細胞を含む。「形質転換細胞」とは、本発明の核酸分子を導入した細胞（又はその原細胞）を意味する。場合によっては、本発明の核酸分子を適切な細胞系に導入して、該遺伝子がコードするタンパク質又はポリペプチドを産生することのできる、安定的にトランスフェクトされた細胞系を作製してよい。このような細胞系を構築するベクター、細胞、及び方法は、当技術分野においてよく知られている。「形質転換体」又は「形質転換細胞」という語は、遺伝子導入の回数と無関係に、もとの形質転換細胞に由来する初代の形質転換細胞を含む。意図的な又は不慮の突然変異ゆえに、全ての子孫細胞は、ＤＮＡ含量が正確には同一でなくてよい。にもかかわらず、もとの形質転換細胞においてスクリーニングしたのと同じ機能性を有する突然変異体の子孫細胞を、形質転換体の定義に含める。
「相同性」という用語は、２つ以上の配列間の相補性の程度を指す。部分的な相同性又は完全な相同性（すなわち、同一性）があってよい。相同性は、配列解析ソフトウェア（例えば、１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７０５、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ作製のＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ）を用いて測定することが多い。こうしたソフトウェアは、各種の置換、欠失、挿入、及びその他の改変に対する相同性の程度を決定することにより、類似の配列をマッチさせる。既存の置換は、以下の群内における置換を含むことが通例である。グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。
「単離タンパク質」又は「単離ポリペプチド」における通り、ポリペプチドに関して用いる場合の「単離」という用語は、その源泉においては通常関連する少なくとも１つの不純物から識別され分離されたポリペプチドを指す。こうして、単離ポリペプチドとは、天然に見出される形態又は状況とは異なる形態又は状況において存在する。これに対して、非単離ポリペプチド（例えば、タンパク質及び酵素）は、天然に存在する状態で見出される。
「精製した」又は「精製する」という用語は、タンパク質又は核酸などの対象の成分から不純物の一部を除去する任意の処理の結果を意味する。これにより、試料中における精製した成分の百分率が上昇する。
本明細書で用いる「純粋な」は、対象種が、存在する主要な種であり（すなわち、モルベースで、組成物中他のいずれの個別種よりも多量である）、実質的に精製した部分が組成物であり、対象種が、存在する全ての高分子種の少なくとも約５０％（モルベースで）を占めることが好ましい。一般に、「実質的に純粋な」組成物とは、組成物中に存在する全ての高分子種の約８０％超を占め、約８５％超、約９０％超、約９５％超、及び約９９％超を占めることがより好ましい。対象種が基本的な均一性（既存の検出法により、組成物中に不純物種が検出できない）まで精製され、組成物が基本的に単一の高分子種からなることが最も好ましい。
本明細書で用いる「機能的に結合した」という用語は、所与の遺伝子の転写及び／又は所望のタンパク質分子の合成を導くことのできる核酸分子が産生される形の核酸配列の結合を指す。該用語は、機能的な（例えば、酵素活性である、結合パートナーに対する結合能がある、阻害能がある、など）タンパク質又はポリペプチドが産生される形でアミノ酸をコードする配列の結合をも指す。
本明細書で用いる「ポリヒスチジントラクト」（又はＨｉｓタグ）という用語は、２〜１０のヒスチジン残基を含む分子、例えば５〜１０残基のポリヒスチジントラクトを指す。ポリヒスチジントラクトは、固定化金属、例えば、ニッケル、亜鉛、コバルト、若しくは銅によるキレートカラム上の、又は別の分子（例えば、Ｈｉｓタグと反応性の抗体）との相互作用による、共有結合分子の親和性精製を可能にする。
「タンパク質不安定化配列」は、ＰＥＳＴ配列、例えば、サイクリン、例えば、有糸分裂サイクリン由来のＰＥＳＴ配列、ウラシル透過酵素又はＯＤＣ、ＯＤＣなどの短命タンパク質のＣ末端領域由来の配列、サイトカイン、リンホカインなどの初期反応タンパク質、癌原遺伝子、例えば、ｃ−ｍｙｃ若しくはｃ−ｆｏｓ、ＭｙｏＤ、ＨＭＧ ＣｏＡ還元酵素、又はＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素、ＣＬ配列、サイクリン破壊ボックス、又はＮ−デグロンを含むがこれに限定されない。
本明細書で用いる「マーカー遺伝子」又は「レポーター遺伝子」は、該遺伝子を発現する細胞に異なる表現型を与えることで、該遺伝子を有する細胞を、該遺伝子を有さない細胞から識別することを可能にする遺伝子である。このような遺伝子は、マーカーが、化学的手段、すなわち選択剤（例えば、除草剤、抗生剤など）の使用により「選択する」ことのできる特性を与えるマーカーであるか、又は単に観察又は試験により、すなわち「スクリーニング」により同定することのできる「レポーター」特性であるかに応じて、選択マーカー又はスクリーニングマーカーのいずれかをコードしてよい。本開示の要素は、特定のマーカー遺伝子の使用により詳細に例示される。当然ながら、適切なマーカー遺伝子又はレポーター遺伝子の多くの例が当技術分野では知られており、本発明の実施において用いることができる。したがって、以下の考察は、悉皆的というよりもむしろ例示的であることを理解されたい。本明細書で開示される技術及び当技術分野で知られる一般的な組み換え技術に照らして、本発明は、任意の遺伝子の変更を可能にする。例示的なレポータータンパク質は、ｎｅｏ遺伝子、β−ｇａｌ遺伝子、ｇｕｓ遺伝子、ｃａｔ遺伝子、ｇｐｔ遺伝子、ｈｙｇ遺伝子、ｈｉｓＤ遺伝子、ｂｌｅ遺伝子、ｍｐｒｔ遺伝子、ｂａｒ遺伝子、ニトリラーゼ遺伝子、ガラクトピラノシド遺伝子、キシロシダーゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、アラビノシダーゼ遺伝子、突然変異アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）若しくは突然変異アセト酸シンターゼ遺伝子（ＡＡＳ）、メトトレキサート耐性ｄｈｆｒ遺伝子、ダラポン脱ハロゲン酵素遺伝子、５−メチルトリプトファンに耐性を与える突然変異アントラニレートシンターゼ遺伝子（国際特許公開第９７／２６３６６号）、Ｒ−遺伝子座遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ｘｙｌＥ遺伝子、α−アミラーゼ遺伝子、チロシナーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子（例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、又はヒカリコメツキ（Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ）ルシフェラーゼ遺伝子）、エクオリン遺伝子、赤色蛍光タンパク質遺伝子、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子の改変を含むがこれに限定されない、改変レポーター遺伝子を含む核酸分子によりコードされる。
本明細書で同定される全てのアミノ酸残基は、天然のＬ型立体配置にある。標準的なポリペプチド命名法に従い、アミノ酸残基の略記法は、以下の対応表に示す通りである。
Figure 0005684984
Ｉ．改変に対して耐性であるルシフェラーゼの残基又は領域を同定する方法
改変可能な、例えば、分断されても転写及び翻訳されると、望ましい、例えば、容易に検出可能な遺伝子産物を産生する、ルシフェラーゼ遺伝子内の部位及び／又は領域を同定する多数の方法を用いることができる。例えば、増幅反応を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子内の１つ又は複数のアミノ酸残基に対応するヌクレオチドを欠失及び／又は挿入してよい。或いは、トランスポゾンを用いて、挿入による突然変異ライブラリーを調製してよい。トランスポゾンは、原核生物及び真核生物のゲノム中に見出される可動性ＤＮＡ配列である。トランスポゾン標識法は、プライマーの結合部位を無作為に分配し、遺伝子「ノックアウト」を作製し、大型の標的ＤＮＡ内に物理的標識又は遺伝子標識を導入する強力な研究ツールとして長く認知されている。本発明の改変ルシフェラーゼを調製するのに有用なレポーター遺伝子における挿入は、ルシフェラーゼのコード領域内部のインフレームでの挿入である。
よく用いられる転移システムの１つが、グラム陰性菌から単離されたＴｎ５システムである。Ｔｎ５トランスポザーゼは、高度の特異的活性にまでクローン化され精製されている小型の単一サブユニット酵素で、宿主細胞因子を必要とせずに転移を遂行する。さらに、標的ＤＮＡへのＴｎ５トランスポゾンの挿入は、高度に無作為であり、単純な過程により進行する。Ｔｎ５トランスポザーゼは、短い１９塩基対のＭｏｓａｉｃ Ｅｎｄ（ＭＥ）Ｔｎ５トランスポザーゼ認識配列間に含まれる任意のＤＮＡ配列を転移する。
ＧＰＳ−Ｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍは、ＴｎｓＡＢＣ＊トランスポザーゼを用いて、ＤＮＡ標的にＴｎ７に基づくトランスポゾンを無作為に挿入する。標的ＤＮＡは、プラスミドでも、コスミドでも、ＢＡＣでも、精製染色体ＤＮＡでもよい。挿入部位が翻訳される遺伝子断片内にある場合は、これは通常、ヌル（機能喪失）突然変異をもたらす。挿入には部位選好がほとんど存在しないので、任意のオープンリーディングフレームの分断が可能である。標的の免疫性により、約１９０ｋｂの距離にわたり、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＤＮＡ分子当たり１つの挿入のみが生じる。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける反応は、標的ＤＮＡ分子の集団を産生し、各々が異なる配列位置における転移因子を含む。
抗生剤、例えば、カナマイシンの耐性マーカーに付加、又は該マーカーを置換することにより、トランスポゾンドナーを改変することができる。該ドナープラスミドは、標準的な実験用大腸菌株中で成長させてよく、該ベクター骨格は、該トランスポゾン及び複製起点とは異なる抗生剤マーカー、例えば、Ａｍｐｒを擁する。非反応ドナー分子を破壊し、望ましくない反応産物を回避するため、まれな配列で切断する酵素、例えば、Ｐ１−Ｓｃｅ１（配列ＶＤＥ）での消化により、該ドナーを破壊することができる。突然変異を生じたＤＮＡを、天然のコンピテント生物（単一のＤＮＡ鎖を受け入れる）に形質転換する適用では、ギャップを埋め合わせ、連結する。
ルシフェラーゼ配列中で改変に対して耐性である部位を同定したら、配列の挿入、欠失、及び順列置換、又はこれらの組合せを調製してよい。順列置換配列について、Ｐｌａｉｎｋｕｍら（２００３）は、新規のＮ末端及びＣ末端と、プロテアーゼ認識部位を含みもとのＮ末端及びＣ末端を結合するペプチドリンカーとを有するリボヌクレアーゼＡの円順列置換形態が、活性部位の立体障害により、リボヌクレアーゼ活性を低下させることを報告した。Ｐｌａｉｎｋｕｍらは、プロテアーゼによる円順列置換リボヌクレアーゼＡの開裂が、おそらく活性部位への障害を除去することにより、該タンパク質の活性を上昇させることを見出した。ルシフェラーゼの場合、Ｎ末端とＣ末端とは、５〜６アミノ酸に相当する距離である約４０オングストローム離れている。円順列置換ホタルルシフェラーゼを調製したところ、その１つは、Ａｓｐ（２３４）における新規のＮ末端と、Ｐｒｏ（２３３）における新規のＣ末端と、Ａｓｐ（４）Ｌｙｓのカルボキシル末端側において開裂するプロテアーゼであるエンテロキナーゼの認識部位とを有した（米国公開出願第２００５０１５３３１０号及び特許協力条約／米国特許第２００４／０３２７０５号を参照のこと）。融合突然変異体タンパク質の活性は、エンテロキナーゼでの処理により約９０〜約１５０倍上昇した（図３）。他のバイオセンサーは、円順列置換ホタルルシフェラーゼ又はヒカリコメツキルシフェラーゼ（ＣＰ１：Ｒ＝Ａｓｎ４０１及びＣＰ２：Ｒ＝Ａｒｇ２２３）に挿入した、カスパーゼ３ ＤＥＶＤ開裂部位（図３）、ＰＳＡ開裂部位、例えば、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ（配列番号１７）、ライノウイルスプロテアーゼ部位、例えば、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号１９）、及びＳＡＲＳウイルスプロテアーゼ部位、例えば、ＴＳＡＶＬＱＳＧＦＲ（配列番号２０）を含んだ（米国公開出願第２００５０１５３３１０号及び特許協力条約／米国特許第２００４／０３２７０５号を参照のこと）。ＣＰ２は、ホタルルシフェラーゼ中の配列位置２３４に対応する、ヒカリコメツキルシフェラーゼ中の配列位置に挿入を有する。本明細書で以下に記す通り、円順列置換レニラルシフェラーゼを調製した。
本発明のバイオセンサーは、異種アミノ酸配列が、ＩＬ−１７ＲＡに結合するドメイン、例えば、ＩＬ−１７Ａ、若しくは、ＩＬ−１７ＲＡのＩＬ−１７Ａ結合ドメイン、ＥｒｇのＪｕｎ結合ドメイン、又はＪｕｎのＥＧ結合ドメインなどのタンパク質結合ドメイン；カリウムチャネル電位感知ドメイン、例えば、タンパク質の立体構造変化を検出するのに有用な該ドメイン、Ｃｄｃ４２又はｒａｃの標的であるＧＴＰａｓｅ結合ドメイン、若しくは他のＧＴＰａｓｅ結合ドメイン、キナーゼ若しくはホスファターゼ活性に関連するドメイン、例えば、ミオシン調節軽鎖、ＰＫＣδ、ＰＨ及びＤＥＰドメインを含むプレクストリン、他のリン酸化認識ドメイン及び基質；グルコース結合タンパク質ドメイン、グルタミン酸／アスパラギン酸結合タンパク質ドメイン、ＰＫＡ若しくはｃＡＭＰ依存性結合基質、ＩｎｓＰ３受容体、ＧＫＩ、ＰＤＥ、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン、ａｐｏＫ１−ｅｒ、又はカルモジュリン結合ドメインを含むバイオセンサーを含むがこれに限定されない。
一実施形態において、該バイオセンサーは、ＧＴＰａｓｅ、例えば、Ｃｄｃ４２又はＲａｃの、ＥＢＦＰ、ＥＧＦＰ ＰＡＫ断片、Ｒａｉｃｈｕ−Ｒａｃ、Ｒａｉｃｈｕ−Ｃｄｃ４２、インテグリンアルファｖベータ３、インポルチン−ａのＩＢＢ、ＣＲａｆ１のＤＭＣＡ又はＮＢＤ−Ｒａｓ（Ｒａｓ活性化の場合）、Ｒａｓプレニル化配列を含むＲａｓ／Ｒａｐ Ｒａｌ ＲＢＤの結合ドメインに対する結合を検出するのに有用である。一実施形態において、該バイオセンサーは、ＰＩ（４，５）Ｐ２（例えば、ＰＨ−ＰＣＬデルタ１、ＰＨ−ＧＲＰ１を使用）、ＰＩ（４，５）Ｐ２、又はＰＩ（４）Ｐ（例えば、ＰＨ−ＯＳＢＰ）、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３（例えば、ＰＨ−ＡＲＮＯ、又はＰＨ−ＢＴＫ、又はＰＨ−サイトヘシン１を使用）、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３若しくはＰＩ（３，４）Ｐ２（例えば、ＰＨ Ａｋｔを使用）、ＰＩ（３）Ｐ（例えば、ＦＹＶＥ−ＥＥＡ１を使用）、又はＣａ２＋（細胞質）（例えば、カルモジュリン、又はＰＫＣのＣ２ドメインを使用）を検出する。
一実施形態において、該ドメインは、ＥｒｂＢ２のリン酸化、Ｓｒｃ、Ａｂｌ及びＥＧＦＲにおけるチロシンのリン酸化、ＭＫＡ２の活性化（例えば、ＭＫ２を使用）、ｃＡＭＰが誘導するリン酸化、ＰＫＡの活性化、例えば、ＣＲＥＧのＫＩＤを使用、ＣｒｋＩＩのリン酸化、例えば、ＳＨ２ドメインのｐＴｙｒペプチドを使用、ｂＺＩＰ転写因子とＲＥＬタンパク質との結合、例えば、ｂＦｏｓとｂＪｕｎ ＡＴＦ２及びＪｕｎ、若しくはｐ６５ ＮＦカッパＢとの結合、又は微小管結合、例えば、キネシンを使用、を検出する、リン酸化チロシン（例えば、Ｓｒｃ、Ａｂｌ及びＥＧＦＲにおける）を含むドメインである。
こうして、本発明は、ルシフェラーゼ配列が、もとの（野生型の）Ｎ末端若しくはＣ末端、又はその両方における残基の欠失、例えば、Ｎ末端における１〜３残基以上及びＣ末端における１〜６残基以上のほか、対象の分子と直接又は間接に相互作用する配列の欠失を含みうる、円順列置換ルシフェラーゼを含むルシフェラーゼバイオセンサーを含む。
ＩＩ．例示的なポリヌクレオチドとタンパク質
本発明は、検出可能な活性、例えば、発光活性を有するポリペプチドを提供する任意のアミノ酸配列を含む改変ルシフェラーゼのほか、組み換え又は合成によって合成されるそのタンパク質断片を含む。改変ルシフェラーゼのルシフェラーゼ配列は、対応する非改変ルシフェラーゼのアミノ酸配列と同一であるか、又は実質的に同一である。実質的に同一の配列を有するポリペプチド又はペプチドとは、アミノ酸配列が、大部分同一であるが完全に同一でなくともよく、関連する配列の機能的な活性を保持することを意味する。一般に、２つのアミノ酸配列は、少なくとも７０％同一であれば、例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％以上の同一性を有するなら、実質的に同一又は実質的に相同である。
相同性又は同一性は、配列解析ソフトウェア（例えば、１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７０５、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ作製のＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ）を用いて測定することが多い。こうしたソフトウェアは、各種の置換、欠失、挿入、及びその他の改変に対する相同性の程度を決定することにより、類似の配列をマッチさせる。２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における「相同性」及び「同一性」という用語は、同一である２つ以上の配列又は部分配列、又は任意の数の配列比較アルゴリズムを用いて、若しくは手作業によるアライメント及び目視検査により測定する、比較ウインドウ若しくは指定領域にわたる最大限の対応性について比較し整列するときに同一である特定の割合のアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する、該配列又は部分配列を指す。
配列比較では、通常１つの配列が基準配列として働き、被験配列をこれと比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、被験配列及び基準配列をコンピュータに入力し、必要ならば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを用いることもでき、別のパラメータを指定することもできる。次いで、プログラムパラメータに基づき、配列比較アルゴリズムが、基準配列と比べた被験配列について、百分率による配列同一性を計算する。
比較のための配列アライメント法は、当技術分野においてよく知られている。比較のための最適な配列アライメントは、Ｓｍｉｔｈら（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅｒｓｏｎら（１９８８）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータへの実装（５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ作製のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ中の、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は手作業によるアライメント及び目視検査により実施することができる。
これらの数学的アルゴリズムのコンピュータへの実装を配列の比較に用いて、配列の同一性を判定することができる。このような実装は、ＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム中のＣＬＵＳＴＡＬ（カリフォルニア州、マウンテンビュー、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）；ＡＬＩＧＮプログラム（Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）並びにＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ（５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）作製）を含むがこれに限定されない。これらのプログラムを用いるアライメントは、デフォルトのパラメータを用いて実行することができる。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９８８）、Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９８９）、Ｃｏｒｐｅｔら（１９８８）、Ｈｕａｎｇら（１９９２）、及びＰｅａｒｓｏｎら（１９９４）により十分に説明されている。ＡＬＩＧＮプログラムは、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ（１９８８）のアルゴリズムに基づく。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）のＢＬＡＳＴプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）のアルゴリズムに基づく。
ＢＬＡＳＴ解析を実行するソフトウェアは、国立バイオテクノロジー研究センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から一般に入手できる。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さのワードにより整列したとき、ある正の値の閾値スコアＴだけマッチするか、又は該スコアＴを満たす、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することにより、まず、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を同定するステップを含む。Ｔを、隣接ワードスコア閾値という（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）。これらの初回の隣接ワードヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見出す検索を開始するきっかけとして働く。次いで、累積アライメントスコアが上昇する限りで、各配列の双方向にワードヒットを拡張する。ヌクレオチド配列の場合、パラメータＭ（マッチする残基対に対する加点スコア、常に＞０）及びパラメータＮ（ミスマッチする残基に対する減点スコア、常に＜０）を用いて、累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合は、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。累積アライメントスコアが、最大到達値から量Ｘだけ減少する場合、１つ又は複数の負のスコアの残基アライメントの累積により累積スコアがゼロ以下になる場合、又はいずれかの配列の端部に到達する場合は、各方向へのワードヒットの拡張を停止する。
百分率による配列の同一性に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性に関する統計学的解析をも実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間のマッチが、偶然に生じる確率の指標を与える。例えば、被験核酸配列を基準核酸配列と比較する場合の最小合計確率が、約０．１未満である場合、より好ましくは約０．０１未満である場合、最も好ましくは約０．００１未満である場合、該被験核酸配列は、基準配列に類似すると考える。
比較の目的でギャップを含むアライメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）に記載の通り、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ ２．０中の）を用いることができる。或いは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ ２．０中の）を用いて、分子間の距離関係を検出する反復検索を実行することができる。前出のＡｌｔｓｃｈｕｌらを参照のこと。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いる場合、各プログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ヌクレオチド配列にはＢＬＡＳＴＮ、タンパク質にはＢＬＡＳＴＸ）を用いることができる。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較をデフォルトとして用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムが、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、１９８９）をデフォルトとして用いる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
特に、ポリペプチドは、保存的変異を除き実質的に同類である場合がある。保存的変異とは、アミノ酸残基を、別の生物学的に類似の残基で置換することを意味する。保存的変異の例は、イソロイシン、バリン、ロイシン、又はメチオニンなどの１つの疎水性残基を別の疎水性残基に置換する、又は、アルギニンをリシンに、グルタミン酸をアスパラギン酸に、若しくはグルタミンをアスパラギンに置換するなど、１つの極性残基を別の極性残基に置換することを含む。保存性置換の他の例示的な例は、アラニンからセリンへ；アルギニンからリシンへ；アスパラギンからグルタミン又はヒスチジンへ；アスパラギン酸からグルタミン酸へ；システインからセリンへ；グルタミンからアスパラギンヘ；グルタミン酸からアスパラギン酸へ；グリシンからプロリンへ；ヒスチジンからアスパラギン又はグルタミンへ；イソロイシンからロイシン又はバリンへ；ロイシンからバリン又はイソロイシンへ；リシンからアルギニン、グルタミン、又はグルタミン酸へ；メチオニンからロイシン又はイソロイシンへ；フェニルアラニンからチロシン、ロイシン、又はメチオニンへ；セリンからスレオニンへ；スレオニンからセリンへ；トリプトファンからチロシンへ；チロシンからトリプトファン又はフェニルアラニンへ；バリンからイソロイシン、ロイシンへの変化を含む。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、特定の宿主における発現に最適化される。本明細書で用いる最適化は、コドン最適化のほか、真核細胞においては、コザック配列、及び／又は１つ若しくは複数のイントロンの導入を含む。こうして、核酸分子は、コドンの３０％、３５％、４０％を超える、又は４５％を超える、例えば、５０％、５５％、６０％以上において、非改変ルシフェラーゼをコードする野生型の核酸配列のコドンと異なるコドン組成を有してよい。本発明における使用に好ましいコドンは、特定の生物における同一のアミノ酸に対する他の少なくとも１つのコドンよりも高頻度で用いられるコドンであり、該生物中の低使用コドンでなく、該核酸分子の発現のためのクローニング又はスクリーニングに用いる生物中の低使用コドンでないことがより好ましい。さらに、特定のアミノ酸（すなわち、３つ以上のコドンを有するアミノ酸）に対する好ましいコドンは、他の（好ましくない）１つ又は複数のコドンよりも高頻度で用いられる２つ以上のコドンを含んでよい。核酸分子中に１つの生物において別の生物におけるよりも高頻度で用いられるコドンが存在する結果、これらのコドンをより高頻度で用いる生物の細胞に導入すると、これらの細胞中の野生型の核酸配列又は親核酸配列の発現よりも高いレベルで発現する核酸分子が、これらの細胞中において得られる。
本発明の一実施形態において、異なるコドンは、哺乳類においてより高頻度に用いられるコドンであるが、別の実施形態において、異なるコドンは、植物においてより高頻度に用いられるコドンである。哺乳類の特定の種類、例えば、ヒトは、哺乳類の別の種類とは異なる、好ましいコドンのセットを有してよい。同様に、植物の特定の種類は、植物の別の種類とは異なる、好ましいコドンのセットを有してよい。本発明の一実施形態において、異なるコドンの大多数は、所望の宿主細胞中で好ましいコドンである。哺乳類（例えば、ヒト）及び植物にとって好ましいコドンは、当技術分野で知られている（例えば、Ｗａｄａら、１９９０）。例えば、好ましいヒトコドンは、ＣＧＣ（Ａｒｇ）、ＣＴＧ（Ｌｅｕ）、ＴＣＴ（Ｓｅｒ）、ＡＧＣ（Ｓｅｒ）、ＡＣＣ（Ｔｈｒ）、ＣＣＡ（Ｐｒｏ）、ＣＣＴ（Ｐｒｏ）、ＧＣＣ（Ａｌａ）、ＧＧＣ（Ｇｌｙ）、ＧＴＧ（Ｖａｌ）、ＡＴＣ（Ｉｌｅ）、ＡＴＴ（Ｉｌｅ）、ＡＡＧ（Ｌｙｓ）、ＡＡＣ（Ａｓｎ）、ＣＡＧ（Ｇｌｎ）、ＣＡＣ（Ｈｉｓ）、ＧＡＧ（Ｇｌｕ）、ＧＡＣ（Ａｓｐ）、ＴＡＣ（Ｔｙｒ）、ＴＧＣ（Ｃｙｓ）、及びＴＴＣ（Ｐｈｅ）を含むがこれに限定されない（Ｗａｄａら、１９９０）。こうして、本発明の好ましい「ヒト化」合成核酸分子は、より多数の好ましいヒトコドン、例えば、ＣＧＣ、ＣＴＧ、ＴＣＴ、ＡＧＣ、ＡＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＴ、ＧＣＣ、ＧＧＣ、ＧＴＧ、ＡＴＣ、ＡＴＴ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＴＡＣ、ＴＧＣ、ＴＴＣ、又はこれらの任意の組合せを有することで、野生型の核酸配列と異なるコドン組成を有する。例えば、本発明の核酸分子は、野生型の核酸配列と比べて、より多数のＣＴＧ又はＴＴＧのロイシンをコードするコドン、ＧＴＧ又はＧＴＣのバリンをコードするコドン、ＧＧＣ又はＧＧＴのグリシンをコードするコドン、ＡＴＣ又はＡＴＴのイソロイシンをコードするコドン、ＣＣＡ又はＣＣＴのプロリンをコードするコドン、ＣＧＣ又はＣＧＴのアルギニンをコードするコドン、ＡＧＣ又はＴＣＴのセリンをコードするコドン、ＡＣＣ又はＡＣＴのスレオニンをコードするコドン、ＧＣＣ又はＧＣＴのアラニンをコードするコドン、又はこれらの任意の組合せを有してよい。同様に、植物においてより高頻度に用いられるコドンのより多数を有する核酸分子は、ＣＧＣ（Ａｒｇ）、ＣＴＴ（Ｌｅｕ）、ＴＣＴ（Ｓｅｒ）、ＴＣＣ（Ｓｅｒ）、ＡＣＣ（Ｔｈｒ）、ＣＣＡ（Ｐｒｏ）、ＣＣＴ（Ｐｒｏ）、ＧＣＴ（Ｓｅｒ）、ＧＧＡ（Ｇｌｙ）、ＧＴＧ（Ｖａｌ）、ＡＴＣ（Ｉｌｅ）、ＡＴＴ（Ｉｌｅ）、ＡＡＧ（Ｌｙｓ）、ＡＡＣ（Ａｓｎ）、ＣＡＡ（Ｇｌｎ）、ＣＡＣ（Ｈｉｓ）、ＧＡＧ（Ｇｌｕ）、ＧＡＣ（Ａｓｐ）、ＴＡＣ（Ｔｙｒ）、ＴＧＣ（Ｃｙｓ）、ＴＴＣ（Ｐｈｅ）又はこれらの任意の組合せを含むがこれに限定されない多数の植物コドンを有することで、野生型の核酸配列とは異なるコドン組成を有する（Ｍｕｒｒａｙら、１９８９）。好ましいコドンは、植物の異なる種類に応じて異なる（Ｗａｄａら、１９９０）。
本発明の改変ルシフェラーゼタンパク質又は融合タンパク質は、組み換え法又は固相化学ペプチド合成法により調製してよい。こうした方法は、当技術分野では１９６０年代初頭から知られており（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６３）（Ｓｔｅｗａｒｔら、『固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）』、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ロックフォード、第ＩＩＩ巻、１１〜１２頁をも参照のこと）、近年では、市販の実験用ペプチド設計及び合成キット（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）においても用いられている。こうした市販の実験用キットは、一般に、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）の教示を用い、単一のプレートに接続された多数の「ロッド」又は「ピン」の先端においてペプチドの合成を提供する。こうしたシステムを用いる場合、ロッド又はピンのプレートを反転して、適切なアミノ酸をピン又はロッドの先端に付着させる又は固定する溶液を含む、対応のウェル又は容器からなる別のプレートに挿入する。こうした工程段階、例えば、ロッド及びピンの先端を反転して適切な溶液内に挿入することを反復することにより、アミノ酸を所望のペプチド内に構成する。加えて、多数のＦＭＯＣペプチド合成システムが入手できる。例えば、ポリペプチド又は断片の構築は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の４３１Ａ型自動ペプチド合成機を用いる固相担体において行うことができる。こうした装置は、直接の合成、又は他の既知の技術を用いて組み合わせることのできる一連の断片の合成により、本発明のペプチドを容易に入手する機会を与える。
ＩＩＩ．本発明の改変ルシフェラーゼに有用な融合パートナー
改変ルシフェラーゼをコードする本発明のポリヌクレオチドは、他の核酸配列、例えば、ｃＤＮＡなどの天然の配列、又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて操作された配列、例えば、Ｎ末端との融合タンパク質、Ｃ末端との融合タンパク質、又はＮ末端及びＣ末端との融合タンパク質、例えば、選択マーカーを含む異なるレポーター遺伝子がコードするタンパク質との融合と併用してよい。適切な融合パートナーの多くの例が当技術分野に知られており、本発明の実施において用いることができる。
融合パートナーは、酵素活性を有する配列など、親和性ドメイン又はその他の機能的なタンパク質配列を含むがこれに限定されない。例えば、機能的なタンパク質配列は、キナーゼ触媒ドメイン（Ｈａｎｋｓ及びＨｕｎｔｅｒ、１９９５）をコードすることで、特定のアミノ酸にリン酸部分を酵素的に付加することのできる融合タンパク質を産生してもよく、Ｓｒｃ相同性２（ＳＨ２）ドメイン（Ｓａｄｏｗｓｋｉら、１９８６；Ｍａｙｅｒ及びＢａｌｔｉｍｏｒｅ、１９９３）をコードすることで、リン酸化したチロシンに特異的に結合する融合タンパク質を産生してもよい。
親和性ドメインは、一般に、例えば、固相担体上に固定したパートナーなどの結合パートナーと相互作用することのできるペプチド配列である。ヒスチジンなど単一のアミノ酸を複数個連続してコードするＤＮＡ配列は、発現するタンパク質と融合させる場合、ニッケルセファロースなどの樹脂カラムへの高親和性結合により、組み換えタンパク質の１段階精製に用いてよい。キチン結合ドメイン（キチンに結合する）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（グルタチオンに結合する）、ビオチン（アビジン及びストレプトアビジンに結合する）などのペプチドをコードする配列も、対象のタンパク質の生成を容易とするのに用いることができる。親和性ドメインは、インテイン（タンパク質の自己スプライシング要素［Ｃｈｏｎｇら、１９９７］）の使用を含む、当技術分野でよく知られた方法により、対象のタンパク質から分離することができる。例示的な親和性ドメインは、ＨｉｓＶ５（ＨＨＨＨＨ）（配列番号４）、ＨｉｓＸ６（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号５）、Ｃ−ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（配列番号６）、Ｆｌａｇ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号７）、ＳｔｅｐｔＴａｇ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）（配列番号８）、ヘマグルチニン、例えば、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号９）、ＧＳＴ、チオレドキシン、セルロース結合ドメイン、ＲＹＩＲＳ（配列番号１０）、Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ（配列番号１１）、キチン結合ドメイン、Ｓ−ペプチド、Ｔ７ペプチド、ＳＨ２ドメイン、Ｃ端ＲＮＡタグ、ＷＥＡＡＡＲＥＡＣＣＲＥＣＣＡＲＡ（配列番号１２）、金属結合ドメイン、例えば、亜鉛結合ドメイン又はカルシウム結合タンパク質由来のドメイン、例えば、カルシウム結合ドメイン、例えば、カルモジュリン、トロポニンＣ、カルシネウリンＢ、ミオシン軽鎖、レコベリン、Ｓ−モジュリン、ビシニン、ＶＩＬＩＰ、ニューロカルシン、ヒポカルシン、フレクエニン、カルトラクチン、カルパイン大サブユニット、Ｓ１００タンパク質、パルブアルブミン、カルビンジンＤ９Ｋ、カルビンジンＤ２８Ｋ、及びカルレチニンなどのカルシウム結合ドメイン、インテイン、ビオチン、ストレプトアビジン、ＭｙｏＤ、Ｉｄ、ロイシンジッパー配列、及びマルトース結合タンパク質を含む。一実施形態において、融合パートナーは、融合タンパク質、例えば、Ｈｉｓタグ又はＧＳＴタグを精製するのに有用な配列であり、また、一実施形態において、精製タグは、円順列置換ルシフェラーゼのＮ末端又はＣ末端に融合される。
融合パートナーの別のクラスは、ｎｅｏ遺伝子、β−ｇａｌ遺伝子、ｇｕｓ遺伝子、ｃａｔ遺伝子、ｇｐｔ遺伝子、ｈｙｇ遺伝子、ｈｉｓＤ遺伝子、ｂｌｅ遺伝子、ｍｐｒｔ遺伝子、ｂａｒ遺伝子、ニトリラーゼ遺伝子、ガラクトピラノシド遺伝子、キシロシダーゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、アラビノシダーゼ遺伝子、突然変異アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）又は突然変異アセト酸シンターゼ遺伝子（ＡＡＳ）、メトトレキサート耐性ｄｈｆｒ遺伝子、ダラポン脱ハロゲン酵素遺伝子、５−メチルトリプトファンに耐性を与える突然変異アントラニレートシンターゼ遺伝子（国際特許公開第９７／２６３６６号）、Ｒ−遺伝子座遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ｘｙｌＥ遺伝子、α−アミラーゼ遺伝子、チロシナーゼ遺伝子、花虫類ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子（例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子）、エクオリン遺伝子、赤色蛍光タンパク質遺伝子、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子を含むがこれに限定されないレポーター遺伝子がコードするタンパク質を含む。選択マーカー遺伝子又はスクリーニングマーカー遺伝子という用語には、形質転換した細胞の同定又は選択の手段としてその分泌を検出することのできる「分泌マーカー」をコードする遺伝子をも含む。例は、抗体の相互作用により同定することのできる分泌抗原をコードするマーカー、又はその触媒活性により検出することのできる分泌酵素をコードするマーカーさえも含む。分泌タンパク質は、例えば、ＥＬＩＳＡ法で検出可能な小型で拡散性のタンパク質、及び細胞膜内に挿入される又は取り込まれるタンパク質を含む多数のクラスに分かれる。
ＩＶ．改変ルシフェラーゼ又はその融合をコードするベクター及び宿主細胞
改変ルシフェラーゼ又はその融合をコードする望ましい核酸分子を調製したら、改変ルシフェラーゼ又は改変ルシフェラーゼを含む融合タンパク質をコードする発現カセットを調製する。例えば、改変ルシフェラーゼをコードする核酸配列を含む核酸分子は、場合によって、転写調節配列、例えば、１つ又は複数のエンハンサー、プロモーター、転写終結配列、又はこれらの組合せに機能的に結合させることで、発現カセットを形成する。核酸分子又は発現カセットは、ベクター、例えば、場合によっては選択マーカー遺伝子を含むプラスミド又はウイルスベクターに導入してよく、該ベクターは、対象の細胞、例えば、大腸菌、ストレプトマイセス属種、バチルス属種、ブドウ球菌種などの原核細胞のほか、植物（双子葉又は単子葉）細胞、真菌細胞、酵母細胞、例えば、ピキア、サッカロマイセス、若しくはシゾサッカロマイセス、又は哺乳類細胞を含む真核細胞などの対象の細胞に導入してよい。好ましい哺乳類細胞は、ウシ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、非ヒト霊長類細胞、例えば、サル細胞、及びヒト細胞を含む。好ましい哺乳類細胞系は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＶ−１細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、及びＮＩＨ３Ｔ３細胞を含むがこれに限定されない。
コードされた改変ルシフェラーゼの発現は、原核細胞又は真核細胞中で発現することのできる任意のプロモーターにより制御してよい。好ましい原核プロモーターは、ＳＰ６プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、ｔａｃプロモーター、ｂｌａプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｇａｌプロモーター、ｌａｃプロモーター、又はマルトースプロモーターを含むがこれに限定されない。好ましい真核プロモーターは、構成的プロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、及びＲＳＶプロモーターなどのウイルスプロモーターのほか、調節的プロモーター、例えば、ｔｅｔプロモーター、ｈｓｐ７０プロモーターなどの誘導的プロモーター又は抑制的プロモーター、及びＣＲＥにより調節される合成的プロモーターを含むがこれに限定されない。カルシウムを介する形質転換法、電気穿孔法、微量注入法、リポフェクション法などを含むがこれに限定されない任意の方法により、本発明の核酸分子、発現カセット、及び／又はベクターを細胞に導入してよい。
Ｖ．例示的使用
改変ルシフェラーゼ又はその融合は、特定の分子（バイオセンサー）の量若しくは存在を検出すること、特定の分子を単離すること、特定の分子における立体構造変化を、例えば、結合、リン酸化、若しくはイオン化により検出すること、ハイスループット若しくはロースループットのスクリーニングを容易にすること、タンパク質間相互作用、タンパク質−ＤＮＡ間相互作用、若しくはその他のタンパク質に基づく相互作用を検出すること、又はバイオセンサーを選択若しくは展開することを含むがこれに限定されないいずれの目的にも有用である。例えば、改変ルシフェラーゼ又はその融合は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は細胞に基づくアッセイにおいて、特定のキナーゼ（例えば、レポータータンパク質にキナーゼ部位を挿入することによる）、ＲＮＡｉ（レポータータンパク質のコード配列にＲＮＡｉが認識すると推定される配列を挿入し、次いで、ＲＮＡｉの添加後におけるレポーター活性をモニターすることによる）、又はウイルス若しくは抗体の存在の指標である特定のウイルスプロテアーゼの存在を検出するプロテアーゼなどのプロテアーゼの量、存在、若しくは活性を検出する；阻害剤、例えば、プロテアーゼ阻害剤をスクリーニングする；認識部位を同定する若しくは基質特異性を検出する、例えば、選択された認識配列を含む改変ルシフェラーゼ、若しくは単一の対象の分子を含む複数の異なる配列を有する改変ルシフェラーゼのライブラリー、若しくは複数の（例えば、ライブラリー）分子を用いる；バイオセンサー若しくは対象の分子、例えば、プロテアーゼを選択若しくは展開する；又は相補性若しくは結合を介して、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくは細胞に基づく手法によりタンパク質間相互作用を検出するのに有用である。一実施形態では、挿入を含む改変ルシフェラーゼを、分子の無作為ライブラリー又は突然変異ライブラリーと接触させて、該挿入と相互作用する分子を同定する。別の実施形態では、複数の挿入を有する改変ルシフェラーゼのライブラリーを分子と接触させ、該分子と相互作用する改変ルシフェラーゼを同定する。一実施形態において、改変ルシフェラーゼ又はその融合は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は細胞に基づくアッセイにおいて、ｃＡＭＰ若しくはｃＧＭＰの量若しくは存在を検出すること（例えば、円順列置換ルシフェラーゼにｃＡＭＰ若しくはｃＧＭＰ結合部位を挿入することによる）、阻害剤若しくは活性剤、例えば、ｃＡＭＰ若しくはｃＧＭＰの阻害剤若しくは活性剤、ｃＡＭＰ結合部位に対するｃＡＭＰ結合の阻害剤若しくは活性剤、又はＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の阻害剤若しくは活性剤をスクリーニングすること、認識部位を同定する若しくは基質特異性を検出すること、例えば、選択された認識配列を含む改変ルシフェラーゼ、若しくは単一の対象の分子を含む複数の異なる配列を有する改変ルシフェラーゼのライブラリー、若しくは複数の（例えば、ライブラリー）分子を用いること、ｃＡＭＰ若しくはｃＧＭＰ結合部位を選択若しくは展開すること、或いは全ての動物イメージングに有用である。
本発明は、改変ルシフェラーゼ又はその融合タンパク質を用いて、細胞における分子の発現、場所、及び／又はトラフィキングをモニターする方法のほか、細胞内の微環境の変化をモニターする方法をも提供する。一実施形態において、改変ルシフェラーゼは、分子の認識部位を含み、該分子が該認識部位と相互作用すると該ルシフェラーゼの活性が上昇し、このため、該分子の存在又は量を検出又は定量するのに用いることができる。例えば、一実施形態において、改変ルシフェラーゼは、特定の条件下で相互作用し合う２つのドメインを含む内部挿入を含む。一実施形態では、該挿入における１つのドメインがリン酸化することのできるアミノ酸を含み、他のドメインがホスホアミノ酸結合ドメインである。適切なキナーゼ又はホスファターゼの存在下で、挿入における２つのドメインは相互作用し、改変ルシフェラーゼの立体構造を変化させ、改変ルシフェラーゼの検出可能な活性を変化させる。別の実施形態において、改変ルシフェラーゼは、分子の認識部位を含み、該分子が該認識部位と相互作用すると該ルシフェラーゼの活性が上昇し、このため、他の分子の存在又は量を検出又は定量するのに用いることができる。
２−ハイブリッドシステムは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるタンパク質間相互作用を検出するほか、タンパク質間相互作用に関与する残基／ドメインを同定するのにきわめて強力な方法である。２−ハイブリッドシステムの基盤は、一部の転写因子中に見出される以下のモジュラードメイン、特定のＤＮＡ配列に結合するＤＮＡ結合ドメイン、及び基本転写装置（Ｓａｄｏｗｓｋｉ、１９８８）と相互作用する転写活性化ドメインである。ＤＮＡ結合ドメインと関連する転写活性化ドメインは、ＴＡＴＡボックスにおけるＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体の構築を促進し、転写を増大させうる。ＣｈｅｃｋＭａｔｅ（登録商標）哺乳類２−ハイブリッドシステム（ウィスコンシン州、マジソン、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）において、別個のプラスミドが産生するＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインとは、ＤＮＡ結合ドメインに融合した１つのタンパク質（Ｘ）が、転写活性化ドメインに融合した別のタンパク質（Ｙ）と相互作用する場合に密接に関連する。このシステムでは、タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとの間の相互作用が、レポーター遺伝子又は選択マーカー遺伝子のいずれかの転写をもたらす。特に、ｐＢＩＮＤベクターが、複数のクローニング領域の上流にある酵母ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインを含み、ｐＡＣＴベクターが、複数のクローニング領域の上流にある単純ヘルペスウイルスＶＰ１６活性化ドメインを含む。加えて、ｐＢＩＮＤベクターは、ウミシイタケルシフェラーゼを発現する。２つの相互作用する可能性のある対象のタンパク質をコードする２つの遺伝子を、ｐＢＩＮＤベクター及びｐＡＣＴベクターにクローンすることにより、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン及びＶＰ１６の活性化ドメインをそれぞれ含む融合タンパク質を産生する。ｐＧ５ｌｕｃベクターは、最小限のＴＡＴＡボックスの上流にある５つのＧＡＬ４結合部位を含み、これらの結合部位が、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ＋）の上流にある。ｐＧＡＬ４とｐＶＰ１６との融合構築物を、ｐＧ５ｌｕｃベクターとともに哺乳類細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションの２〜３日後に細胞を溶解し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）レポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、型番Ｅ１９１０）を用いて、レニラルシフェラーゼ及びホタルルシフェラーゼの量を定量化することができる。ＧＡＬ４とＶＰ１６との融合構築物など、２つの被験タンパク質の間の相互作用が、陰性対照に対するホタルルシフェラーゼ発現の上昇をもたらす。本発明の改変ルシフェラーゼ、例えば、改変に対して耐性である部位又は領域において欠失されるルシフェラーゼ（Ｎ末端断片）をＤＮＡ結合ドメインに融合する一方、該ルシフェラーゼの残余（Ｃ末端断片）を転写活性化ドメインに融合する。
本発明は、サイクリックヌクレオチドなどの対象の分子の量を調節することのできる作用物質（「被験」作用物質）をスクリーニングする方法をも提供する。「調節」とは、特性の変更、すなわち、生物学的又は化学的活性の促進又は阻害であって、シグナル伝達経路の活性化など特定の事象の発生に付随することがある、及び／又は特定の細胞型においてのみ明らかとなることがある特性の変更を指す。「調節因子」とは、例えば、生体高分子（例えば、核酸、タンパク質、非ペプチド、又は有機分子）、生体小分子、細菌細胞、植物細胞、真菌細胞、若しくは動物（特に哺乳類）細胞又は組織、或いはその他の作用物質などの生体物質由来の抽出物など、作用物質（自然発生又は非自然発生）を指す。本明細書に記載のスクリーニングアッセイに組み込むことにより、１つ又は複数の生物学的過程の（直接の又は間接の）阻害剤又は活性剤（例えば、アゴニスト、部分アンタゴニスト、部分アゴニスト、又はアンタゴニスト）としての潜在的活性について、調節因子を評価する。調節因子の複数の活性（又は１つの活性）は、既知、未知、又は部分的に既知である。本発明の方法を用いて、こうした調節因子をスクリーニングすることができる。「被験作用物質」という用語は、本発明の１つ又は複数のスクリーニング法により推定調節因子として調べる作用物質を指す。通例、０．０１μＭ、０．１μＭ、１．０μＭ、及び１０．０μＭなど、各種所定の濃度をスクリーニングに用いる。対照は、被験作用物質の不在下におけるシグナルの測定、標的を調節することが知られている作用物質との比較、又は被験作用物質との接触前、接触中、及び／又は接触後における試料（例えば、細胞、組織、又は生体）との比較を含む。
一実施形態において、該方法は、プロテアーゼ活性を調節する作用物質をスクリーニングするステップを含む。例えば、一実施形態において、アポトーシスを調節することのできる作用物質の同定法を提供する。カスパーゼファミリーのプロテアーゼが、アポトーシスと関連している。こうして、該方法は、カスパーゼファミリーのプロテアーゼを含むと推定される試料を、カスパーゼ活性を調節すると推定される作用物質、及びカスパーゼにより開裂可能な開裂部位を有する改変ルシフェラーゼと接触させるステップを含む。改変ルシフェラーゼの活性は、被験作用物質との接触の前後に、試料中において検出する。作用物質との接触後における活性の上昇は、アポトーシスを阻害する作用物質を示し、低下は、アポトーシスを活性化させる作用物質を示す。
したがって、本発明は、本発明の改変ルシフェラーゼタンパク質中に存在する認識配列の開裂を調節する作用物質を同定すること、及びその活性を検出することに有用である。これにより、プロテアーゼ活性調節物質のスクリーニングを迅速に行うことが可能となる。本明細書に記載のスクリーニングシステムの使用は、プロテアーゼ、例えば、カスパーゼファミリーのプロテアーゼを調節する（例えば、阻害する又は活性化する）作用物質の高感度で迅速な同定手段を提供する。
こうして、本発明の改変ルシフェラーゼタンパク質は、改変ルシフェラーゼタンパク質への挿入と対象の分子との相互作用を調節する作用物質又は条件を調べる基質として有用である。特に、本発明は、挿入が、対象の酵素の開裂部位であるアミノ酸配列を含む、改変ルシフェラーゼタンパク質を意図する。こうして、対象の分子がプロテアーゼである場合、該挿入は、該プロテアーゼの開裂認識配列を含むペプチドを含む。プロテアーゼの開裂認識配列は、タンパク質分解による開裂中にプロテアーゼが認識する、特定のアミノ酸配列である。したがって、本発明は、試料を本発明の改変ルシフェラーゼポリペプチドと接触させ、ルシフェラーゼ活性の変化を測定することにより、試料中のプロテアーゼ量を定量する方法を提供する。本発明の改変ルシフェラーゼタンパク質は、とりわけ、改変ルシフェラーゼを発現する細胞内部におけるプロテアーゼ活性をモニターするのに用いることができる。
一実施形態において、本発明の改変ルシフェラーゼは、こうして、改変ルシフェラーゼ中のサイクリックヌクレオチド結合部位とサイクリックヌクレオチドなどの対象の分子との間の相互作用を調節する作用物質若しくは条件、サイクリックヌクレオチドの存在若しくは量を調節する作用物質若しくは条件、又は細胞内のサイクリックヌクレオチド濃度と関連する受容体などの分子を調節する作用物質若しくは条件を調べる基質として有用である。特に、本発明は、挿入がｃＡＭＰ又はｃＧＭＰ結合部位を含む改変ルシフェラーゼタンパク質を意図する。こうして、対象の分子がｃＡＭＰ又はｃＧＭＰである場合、本発明は、試料を本発明の改変ルシフェラーゼポリペプチドに接触させ、ルシフェラーゼ活性の変化を測定することにより、試料中のｃＡＭＰ又はｃＧＭＰの存在又は量を定量する方法を提供する。本発明の改変ルシフェラーゼタンパク質は、とりわけ、ｃＡＭＰ若しくはｃＧＭＰ又は改変ルシフェラーゼを有する細胞内部におけるｃＡＭＰ若しくはｃＧＭＰの量若しくは存在を変化させる分子の量又は存在をモニターするのに用いることができる。
本発明のアッセイを用いて、例えば、サイクリックヌクレオチドの量を変化させる化合物、又はサイクリックヌクレオチド結合部位に対するサイクリックヌクレオチドの結合を変化させる化合物を同定する薬剤をスクリーニングすることができる。一実施形態において、該アッセイは、ｃＡＭＰを含むｉｎ ｖｉｔｒｏの試料に対して実施する。既知量のｃＡＭＰを含む試料を本発明の改変ルシフェラーゼ及び被験作用物質と混合する。次いで、試料中のルシフェラーゼ活性量を定量する。次いで、被験作用物質存在下におけるｃＡＭＰモルあたりの活性量を、被験作用物質不在下におけるｃＡＭＰモルあたりの活性量と比べてよい。差は、被験作用物質が、ｃＡＭＰ量又はｃＡＭＰ結合部位に対するｃＡＭＰの結合を変化させることを示す。
一実施形態では、例えば、ｃＡＭＰの量又は結合を直接又は間接に調節すると推定される作用物質により細胞を条件づけるか、又は細胞を該作用物質と接触させる。細胞又は培養内の細胞を溶解し、ｃＡＭＰ量を測定する。例えば、既知量又は未知量のｃＡＭＰを含む溶解細胞試料を、本発明の改変ルシフェラーゼと混合する。次いで、対照又は非処理試料中及び処理済み溶解細胞試料中の改変ルシフェラーゼ活性の程度を測定することにより、試料中のｃＡＭＰ量を前述の通りに定量する。活性又は阻害は、試料中のマイクログラム又はミリグラムあたりのタンパク質に基づいて計算することができる。差は、ｃＡＭＰの絶対量を算出する基準測定値で標準化するのが通例である。
本発明のアッセイで用いる材料及び組成物は、キットの調製に適切であることが理想的である。こうしたキットは、各容器手段が、該方法において用いる個別の要素の１つを含むバイアル、試験管など１つ又は複数の容器手段を含む担体手段を含んでよい。該容器の１つは、本発明の改変ルシフェラーゼ又はポリペプチド（例えば、ベクターの形態による）を含む。別の容器は、改変ルシフェラーゼの基質を含んでよい。
以下の非限定的実施例により、本発明についてさらに説明する。
（実施例１）
ヒカリコメツキ及びホタルのルシフェラーゼにおける改変に寛容な部位
ヒカリコメツキ及びホタルのルシフェラーゼにおいて改変に寛容である配列位置並びに特定の改変ルシフェラーゼは、米国特許公開出願第２００５０１５３３１０号及びＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３２７０５において開示されており、その開示を本明細書に参考として組み込む（図１及び表１も参照）。
Figure 0005684984
（実施例２）
ｃＡＭＰ結合部位に融合した円順列置換ホタルルシフェラーゼ
ｃＡＭＰは細胞内シグナル伝達のための最も重要なセカンドメッセンジャーの１つである。ｃＡＭＰアッセイは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）創薬について非常に重要である。ｃＡＭＰに対するバイオセンサーを同定するために、ｃＡＭＰ結合部位を、円順列置換ホタルルシフェラーゼ（ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ）に融合した（図５Ａ〜Ｂ）（ｐＢＦＢ８、ｐＢＦＢ９、ｐＢＦＢ１０、ｐＢＦＢ１１、ｐＢＦＢ２２、ｐＢＦＢ４０、ｐＢＦＢ４１、ｐＢＦＢ４２）。１つのＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ ｃＡＭＰ結合部位融合物は、ヒトＥｐａｃ１（ｃＡＭＰに直接活性化される交換タンパク質）由来のｃＡＭＰ結合部位を採用した（Ｂｏｓ、２００３年）。先行研究は、ヒトＥｐａｃ１由来の一本鎖断片（１５７から３１６残基）がｃＡＭＰに結合することを示した（Ｎｉｋｏｌａｅｖ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．、２７９、３７２１５（２００４年））。第２のＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ ｃＡＭＰ結合部位融合物は、ヒトＩＩＢ型ＰＫＡ調節サブユニット（ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ）由来のＢドメインを採用した。
材料と方法
ヒトＥｐａｃ１の１５７〜３１６残基をコードするＤＮＡ断片を合成した、それは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での発現を増大させる可能性があるいくつかのサイレントヌクレオチドの変更を含有していた（図５Ｃ）。５’末端及び３’末端にそれぞれＸｈｏＩ及びＮｃｏＩ部位を有するＥＰＡＣ１のＰＣＲ断片を生成するために、２種類のプライマーを使用した、５’プライマー：ａｔｇｃｃｔｃｇａｇＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧ（配列番号２２）、３’プライマー：ａｔｇｃｃａｔｇｇＡＡＣＴＣＣＡＴＧＴＴＣＴＴＣＴＡＡＡＣＧＣ（配列番号２３）。得られたＰＣＲ断片を消化し、円順列置換甲虫ルシフェラーゼ構築物のＸｈｏＩ及びＮｃｏＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドは、本来のＮ末端とＣ末端の間に挿入されたＥＰＡＣ１を有する改変ホタル（ｐＳＰＬｕｃ＋、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）ルシフェラーゼを発現した。適正な大きさの融合タンパク質が、ＴｎＴ無細胞発現及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６）によって確認された。本構築物を、ＦＦ１０５と同定した。
ＲＩＩβＢをコードするＤＮＡを、ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合物［Ｌｕｃ２．０（２３４〜５４４）−リンカーＸ−ヒトＲＩｌβ（２６６−４１４残基）−リンカーＹ−Ｌｕｃ（４〜２３３）］をコードする新規発現ベクターに挿入した。制限酵素の特有の組合せを使用することによって、様々なＸ／Ｙペプチドリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃに融合したＲＩＩβＢを有する様々な構築物を生成した。
続くＲＩＩβＢの挿入のためのＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミドの合成
ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ（ＤＮＡ２．０；配列番号１６、図２０を参照）をコードする合成１８１６ｂｐ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで消化し、ｐＧＬ４．７４（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）の３２６５ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ断片に連結した。得られたプラスミドは、４２アミノ酸のＧｌｙ／Ｓｅｒリッチペプチドによって接続されたホタルルシフェラーゼの５４４及び４アミノ酸を有する合成ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２．０；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）の円順列置換突然変異体をコードする［Ｌｕｃ２．０（２３４〜５４４）−４２ａａＧｌｙ／Ｓｅｒリッチペプチド−Ｌｕｃ２．０（４〜２３３）］（ｐＢＦＢ８）。図５Ａは、この親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）及び様々なリンカー長を作製し且つｃＡＭＰドメインを挿入するために使用する特有の制限酵素部位を示す。本融合タンパク質は、Ｔ７又はＨＳＶ−ＴＫプロモーターをそれぞれ使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで発現できる。加えて、追加的プラスミド（Ｆｌｅｘｉ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）への本オープンリーディングフレームの続く遺伝子導入を促進するために、ＳｇｆＩ及びＰｍｅＩ制限酵素部位が５’及び３’末端に含まれた。
（Ｘ＝４、Ｙ＝４；ｐＢＦＢ９）、（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０；ｐＢＦＢ１０）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０；ｐＢＦＢ１１）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質をコードするプラスミドの合成
上記プラスミドＤＮＡ構築物を、（Ｘ＝４、Ｙ＝４）、（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢの発現構築物の合成を可能にするために、Ｌｕｃ２．０（２３３〜５４４）及びＬｕｃ２．０（４〜２３３）をコードするＤＮＡ断片に結合しているマルチクローニング部位（ＭＣＳ）に存在する特有の制限酵素で消化した。図５Ｂは、ｐＢＦＢ９（Ｘ＝４、Ｙ＝４）、ｐＢＦＢ１０（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０）及びｐＢＦＢ１１（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０）を作製するためにＲＩＩβＢドメインに隣接するリンカー長を表す。
リンカー長（Ｘ＝４、Ｙ＝４）を有する構築物を合成するために、プライマー５’−ＡＡＡ ＡＡＡ ＧＴＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＡＡＴ ＧＴＡ ＴＧＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＡＴ ＴＧＡ ＧＴＣ ＡＣＴ ＧＣＣ−３’（配列番号２５；ＢＦＢ５１）及び５’−ＡＡＡ ＡＡＡ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＣＡ ＡＣＡ ＡＴＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＣＡ ＡＡＣ−３’（配列番号２６；ＢＦＢ２０）を、ＡＴＣＣ１０６２５２３３（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＢＣ０７５８００）からＲＩＩβＢ ＤＮＡを増幅するために使用した。得られた産物を制限酵素ＳａｌＩ／ＳａｃＩで消化し、ＸｈｏＩ／ＳａｃＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。本新規構築物をｐＢＦＢ９と同定する。
リンカー長（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０）を有する構築物を合成するために、プライマー５’−ＡＡＡ ＡＡＡ ＴＣＣ ＧＧＡ ＡＴＧ ＴＡＴ ＧＡＡ ＡＧＣ ＴＴＴ ＡＴＴ ＧＡＧ ＴＣＡ ＣＴＧ ＣＣ−３’（配列番号２１１；ＢＦＢ２１）及び５’−ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＧＧ ＣＣＴ ＡＣＡ ＡＴＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＣＡ ＡＡＣ−３’（配列番号２７；ＢＦＢ２２）を、ＡＴＣＣ１０６２５２３３（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＢＣ０７５８００）からＲＩＩβＢ ＤＮＡを増幅するために使用した。得られた産物を制限酵素ＢｓｐＥＩ／ＳｔｕＩで消化し、ＢｓｐＥＩ／ＺｒａＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。本新規構築物をｐＢＦＢ１０と同定する。
リンカー長（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０）を有する構築物を合成するために、プライマー５’−ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＣＣ ＧＧＧ ＡＴＧ ＴＡＴ ＧＡＡ ＡＧＣ ＴＴＴ ＡＴＴ ＧＡＧ ＴＣＡ ＣＴＧ ＣＣ−３’（配列番号２８；ＢＦＢ２３）及び５’−ＡＡＡ ＡＡＡ ＴＣＣ ＧＧＡ ＣＣＣ ＡＡＣ ＡＡＴ ＡＴＣ ＣＡＴ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＣ ＡＡＡ Ｃ−３’（配列番号２９；ＢＦＢ２４）を、ＡＴＣＣ１０６２５２３３（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＢＣ０７５８００）からＲＩＩβＢ ＤＮＡを増幅するために使用した。得られた産物を制限酵素ＢｓｐＥＩ／ＳｍａＩで消化し、ＡｇｅＩ／ＮｒｕＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。本新規構築物をｐＢＦＢ１１と同定する。
（Ｘ＝４、Ｙ＝４）、（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質の発現
予想される大きさの融合タンパク質の合成を、ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）をＦｌｕｏｒｏＴｅｃｔ ＧｒｅｅｎＬｙｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）と共に使用して、（Ｘ＝４、Ｙ＝４；ｐＢＦＢ９）、（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０；ｐＢＦＢ１０）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０；ｐＢＦＢ１１）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質について確認した。簡潔には、製造者の推奨する手順書に従って、以下の成分を混合した：
４００ｎｇ プラスミドＤＮＡ
１０μＬ ＴｎＴ Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ Ｅｘｔｒａｃｔ
０．８μＬ ＴＮＴ反応緩衝液
０．４μＬ Ｔ７ポリメラーゼ
０．４μＬ アミノ酸混合物
０．４μＬ ｒＲＮａｓｉｎ
０．４μＬ ＦｌｕｏｒｏＴｅｃｔ ＧｒｅｅｎＬｙｓ ｌａｂｅｌ
ｄＨ２Ｏを合計容量２０μＬまで
３０℃、１．５時間のインキュベーションに続いて、ＴＮＴ反応物５μＬを、製造者の手順書に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ４〜１２％ ｂｉｓ−ｔｒｉｓ ｇｅｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）によって解析した。翻訳されたタンパク質は、続いてｆｌｕｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｍｏｄｅ Ｉｍａｇｅｒ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって可視化した。デンシトメトリー分析（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、可変Ｘ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質が、４２アミノ酸Ｇｌｙ／Ｓｅｒリッチペプチド（ｐＢＦＢ８）及びＥｐａｃ１（ＦＦ１０５）を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ融合タンパク質と同様に発現されたことを示した。
（Ｘ＝４、Ｙ＝４；ｐＢＦＢ９）、（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０；ｐＢＦＢ１０）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０；ｐＢＦＢ１１）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質の機能評価
１００μＭ ｃＡＭＰの存在下及び非存在下でのルシフェラーゼ活性を、（Ｘ＝４、Ｙ＝４；ｐＢＦＢ９）、（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０；ｐＢＦＢ１０）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０；ｐＢＦＢ１１）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質についてＴＮＴ（登録商標）Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を使用する発現に続いて測定した。簡潔には、製造者の推奨する手順書に従って、以下の成分を混合した：
４００ｎｇ プラスミドＤＮＡ
１０μＬ ウサギ網状赤血球抽出物
０．８μＬ ＴＮＴ反応緩衝液
０．４μＬ Ｔ７ポリメラーゼ
０．４μＬ アミノ酸混合物
０．４μＬ ｒＲＮａｓｉｎ
ｄＨ２Ｏを合計容量２０μＬまで
３０℃、１．５時間のインキュベーションに続いて、各融合タンパク質を、ＴＮＴ（登録商標）反応物９μＬと１ｍＭ ｃＡＭＰ保存液又はｄＨ２Ｏ １μＬとを組み合わせることにより１００μＭ ｃＡＭＰの存在下又は非存在下でインキュベートした。１０分間、室温でのインキュベーションに続いて、試料１μＬをＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＡＲ；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）溶液１００μＬ＋／−１００μＭ ｃＡＭＰ（９０μＬ ＬＡＲ＋１０μＬ １ｍＭ ｃＡＭＰ保存液又はｄＨ２Ｏ）に加えた。発光をＶｅｒｉｔａｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ｐｒｏｇｒａｍ Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ）を使用して測定した。
（Ｘ＝４、Ｙ＝４；ｐＢＦＢ９）、（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０；ｐＢＦＢ１０）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０；ｐＢＦＢ１１）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質を使用する用量反応実験
（Ｘ＝４、Ｙ＝４；ｐＢＦＢ９）、（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０；ｐＢＦＢ１０）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０；ｐＢＦＢ１１）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質のｃＡＭＰ用量反応を、ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を使用する発現に続いて測定した。簡潔には、製造者の推奨する手順書に従って、以下の成分を混合した：
２０００ｎｇ プラスミドＤＮＡ
５０μＬ ウサギ網状赤血球抽出物
４μＬ ＴＮＴ反応緩衝液
２μＬ Ｔ７ポリメラーゼ
２μＬ アミノ酸混合物
２μＬ ｒＲＮａｓｉｎ
ｄＨ２Ｏを合計容量１００μＬまで
３０℃、２時間のインキュベーションに続いて、それぞれの融合タンパク質を、ＴＮＴ（登録商標）反応物９μＬとｃＡＭＰ保存溶液１μＬとを組み合わせることにより様々な濃度のｃＡＭＰ（最終濃度０、０．０１、０．０２５、０．１、０．２５、１、２．５、１０、２５又は１００μＭ ｃＡＭＰ）と共にインキュベートした。室温、≧２５分間のインキュベーションに続いて、試料１μＬを各濃度のｃＡＭＰ（９０μＬ ＬＡＲ＋１０μＬ ｃＡＭＰ保存溶液）を含むＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＡＲ；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）１００μＬに加えた。発光をＶｅｒｉｔａｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ｐｒｏｇｒａｍ Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ）を使用して測定した。
（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０；ｐＢＦＢ１０）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質の選択性
他の環状ヌクレオチドと比較した、ｃＡＭＰ活性化について（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０；ｐＢＦＢ１０）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質の選択性を、ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を使用する発現に続いて測定した。簡潔には、製造者の推奨する手順書に従って、以下の成分を混合した：
６０００ｎｇ プラスミドＤＮＡ
１５０μＬ ウサギ網状赤血球抽出物
１２μＬ ＴＮＴ反応緩衝液
６μＬ Ｔ７ポリメラーゼ
６μＬ アミノ酸混合物
６μＬ ｒＲＮａｓｉｎ
ｄＨ２Ｏを合計容量３００μＬまで
３０℃、２．３時間のインキュベーションに続いて、融合タンパク質を、ＴＮＴ（登録商標）反応物９μＬと環状ヌクレオチド保存溶液１μＬとを組み合わせることにより、様々な濃度（最終濃度０、０．０１、０．０２５、０．１、０．２５、１、２．５、１０、２５又は１００μＭ ｃＡＭＰ）のｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ又はＮ６−ベンゾイルｃＡＭＰとインキュベートした。室温、≧２９分間のインキュベーションに続いて、試料１μＬをそれぞれの濃度の環状ヌクレオチド（９０μＬ ＬＡＲ＋１０μＬ 環状ヌクレオチド保存溶液）を含むＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＡＲ；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）１００μＬに加えた。発光をＶｅｒｉｔａｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ｐｒｏｇｒａｍ Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ）を使用して測定した。
結果
ＩＩβ型プロテインキナーゼＡ調節サブユニット（ＰＲＫＡＲ２Ｂ）は、Ａ及びＢ、２個のｃＡＭＰ結合部位を有する。Ｂドメイン由来のｃＡＭＰ結合部位（ＲＩＩβＢ）を、円順列置換ルシフェラーゼ（ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ）でＲＩＩβＢを有するもの（ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ）を調製するために使用した。（Ｘ＝４、Ｙ＝４；ｐＢＦＢ９）、（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０；ｐＢＦＢ１０）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０；ｐＢＦＢ１１）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有する各ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質は、１００μＭ ｃＡＭＰの存在下で、それぞれ２３倍、５８倍及び３９倍のルシフェラーゼ活性の誘導を示した（図７）。予想される通り、４２アミノ酸Ｇｌｙ／Ｓｅｒリッチペプチドを有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ融合タンパク質（ｐＢＦＢ８）についてｃＡＭＰ調節は観察されなかった。ＲＩＩβＢに加えて、Ｅｐａｃ１由来のｃＡＭＰ結合部位をｃＡＭＰセンサー（ＦＦ１０５）を生成するために使用した。しかし、ルシフェラーゼ活性の発光量比はＲＩＩβＢに基づくセンサーより低かった（図７）。
各ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質は、５０％最大発光量比に対する効果濃度について様々な値を有する特有の用量反応を示した（図８Ａ）。（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０；ｐＢＦＢ１０）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質は、他の環状ヌクレオチドと比較してｃＡＭＰへの結合について増強された選択性を示した（図８Ｂ）。
（実施例３）
ｃＡＭＰ結合部位を有する円順列置換レニラルシフェラーゼ
材料と方法
４つのヒト化レニラルシフェラーゼＤＮＡ断片を、ｐＦ５ＲＫ又はｐｈＲＬ−ｎｕｌｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）のいずれかから増幅し、Ｓｅｒ９１／Ｔｙｒ９２又はＩｌｅ２２３／Ｐｒｏ２２４のいずれかの配列位置の間で分断した円順列置換レニラルシフェラーゼオープンリーディングフレーム（ＣＰＭ−ｈＲＬ）（図５Ｄ）を生成するためにＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ融合タンパク質構築物［Ｌｕｃ２．０（２３４〜５４４）−４２アミノ酸Ｇｌｙ／Ｓｅｒリッチペプチド−Ｌｕｃ２．０（４〜２３３）］（ｐＢＦＢ８；図５Ａ）にクローニングした。４つのヒト化レニラルシフェラーゼＤＮＡ断片を生成するために使用した配列決定用プライマーは、５’−ＡＴＧＧＧＣＧＡＴＣＧＣＣａｔｇｔａｔｃｇｃｃｔｃｃｔｇｇａｔｃａｃｔａｃａａｇ−３’（ｈＲＬ９２ ＳｇｆＩ；ＦＦ２７３；配列番号１１０）；５’−ＡＴＧＧＧＣＧＡＴＣＧＣＣａｔｇｃｃｔｃｔｃｇｔｔａａｇｇｇａｇｇｃａａｇｃ−３’（ｈＲＬ２２４ ＳｇｆＩ；ＦＦ２７７；配列番号１１１）；５’−ｇｃａｔＣＴＣＧＡＧｃｃｃｔｇｃｔｃｇｔｔｃｔｔｃａｇｃａｃｇｃｇｃ−３’（ｈＲＬ３１１／ＸｈｏＩ；ＦＦ２９４；配列番号１１２）；５’−ａｔｇｃＧＡＧＣＴＣａｇｇａｇｃｔｔｃｃａａｇｇｔｇｔａｃｇａｃｃｃｇ−３’（ｈＲＬ２ ＳｃａＩ；ＦＦ２９５；配列番号１１３）；５’−ＴＴＧＴＧＴＴＴＡＡＡＣｔｇａｇｃｃａｔｔｃｃｃｇｃｔｃｔｔｇｃｃｇ−３’（ｈＲＬ９１／ＰｍｅＩ；ＦＦ２７６；配列番号１１４）及び５’−ＴＴＧＴＧＴＴＴＡＡＡＣｇａｔｃｔｃｇｃｇａｇｇｃｃａｇｇａｇａｇｇ−３’（ｈＲＬ２２３ ＰｍｅＩ；ＦＦ２７８；配列番号１１５）；であった。プライマー対ＦＦ２７３／ＦＦ２９４及びＦＦ２７７／ＦＦ２９４を、ヒト化レニラルシフェラーゼＤＮＡのＣ末端断片（それぞれｈＲＬ９２〜３１１及びｈＲＬ２２４〜３１１）を増幅するために使用した。得られた産物を、制限酵素ＳｇｆＩ／ＸｈｏＩで消化し、ＳｇｆＩ／ＸｈｏＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ融合タンパク質構築物［Ｌｕｓ２．０（２３４〜５４４）−４２アミノ酸Ｇｌｙ／Ｓｅｒリッチペプチド−Ｌｕｃ２．０（４〜２３３）］ｐＢＦＢ８、に連結した。プライマー対ＦＦ２７６／ＦＦ２９５及びＦＦ２７８／ＦＦ２９５を、ヒト化レニラルシフェラーゼＤＮＡのＮ末端断片（それぞれｈＲＬ２〜９１及びｈＲＬ２〜２２３）を増幅するために使用した。得られた産物を、制限酵素ＳａｃＩ／ＰｍｅＩで消化し、ＳａｃＩ／ＰｍｅＩで消化した［ｈＲＬ（９２〜３１１又は２２４〜３１１）−４２アミノ酸Ｇｌｙ／Ｓｅｒリッチペプチド−Ｌｕｃ２．０（４〜２３３）］をコードする中間体ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ｈＲＬプラスミドに連結した。これは、円順列置換ｈＲＬルシフェラーゼ断片に４２アミノ酸Ｇｌｙ／Ｓｅｒリッチペプチド（図５ＡのＧｌｙ／Ｓｅｒリッチペプチドと同じ、２０１３２５．１５．Ａ１（ＣＰＭ９１）；２０１３２５．１５．Ｂ６（ＣＰＭ２２３））が融合しているＣＰＭ−ｈＲＬ発現ベクターの生成を生じた。ヒトＲＩＩβＢ ２６６〜４１４アミノ酸（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＢＣ０７５８００）をコードする本配列を、ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰセンサー（図５Ｄ）について既に記載の通り、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリッチペプチド中に存在するアミノ酸をコードする特有の制限酵素部位のサブセットにクローニングした。得られた構築物は、Ｘ＝４、Ｙ＝２０（２０１３２５．４４．Ｈ６（ＣＰＭ９１）；２０１３２５．３３．Ｃ９（ＣＰＭ２２３））、Ｘ＝１０、Ｙ＝４（２０１３２５．５０．Ｄ１２（ＣＰＭ９１）；２０１３２５．５４．Ｅ２（ＣＰＭ２２３））、又はＸ＝１０、Ｙ＝２０（２０１３２５．５８．Ｅ１１（ＣＰＭ９１）；２０１３２５．５４．Ｅ１２（ＣＰＭ２２３））のいずれかを有するＣＰＭ−ｈＲＬ／ＲＩＩβＢ融合物をコードする。Ｇｌｙ／Ｓｅｒリッチリンカーは、ＲＩＩβＢのＮ及びＣ末端のそれぞれに融合した（図５Ｄ）。加えて、全長ｈＲＬオープンリーディングフレームは、Ｌｕｃ２．０（２３４〜５４４）−４２アミノ酸Ｇｌｙ／Ｓｅｒリッチペプチド−Ｌｕｃ２．０（４〜２３３）（２０１３２５．５０．Ａ７、図５Ａ）をコードするＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミドのＳｇｆＩ／ＰｍｅＩ部位にクローニングした。
Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ ＴｎＴ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ＃Ｌ４１４０）の反応物５０μｌ当たり、精製プラスミドＤＮＡ１μｇを、タンパク質産物を発現するために使用した。Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ ＴｎＴ（登録商標）反応は、ＦｌｕｏｒｏＴｅｃｔ（商標）ＧｒｅｅｎＬＹＳｔＲＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ＃Ｌ５００１）の存在下で３０℃、１時間実施した。ＣＰＭ−ｈＲＬ構築物は、以下のコントロールと共に発現させた：Ｘ＝１０、Ｙ＝４を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ（ｐＢＦＢ４１）、全長レニラルシフェラーゼ（２０１３２２５．５０．Ａ７）及び「ＤＮＡ不含有」（ネガティブコントロール）。各可溶化物１５μｌを、１ｍＭ ｃＡＭＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ＃Ｖ６４２Ａ、最終濃度１００μＭ）又は水（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ＃Ｐ１１９Ｃ）１．５μｌのいずれかと混合し、１０分間、室温でインキュベートした。１×Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（５×Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ＃Ｅ２９１Ａ）加える水（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ＃Ｐ１１９Ｃ）の７５μＬを、レニラルシフェラーゼ反応及び「ＤＮＡ不含有」試料に加え、混合し、各混合物２０μｌを３回反復で９６ウェル白平底プレートに入れた。Ｘ＝１０、Ｙ＝４リンカーを有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ試料（ｐＢＦＢ４１）２μｌを、３回反復で９６ウェル白平底プレートに入れた。Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ １００μＬ加える１×Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．；ｃａｔ＃Ｅ２８２０）の１００μｌを、レニラルシフェラーゼ及び「ＤＮＡ不含有」の各ウェルに加えた。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ加えるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．；ｃａｔ＃Ｅ１５００）の１００μｌを、Ｘ＝１０、Ｙ＝４リンカーを有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ（ｐＢＦＢ４１）を含む各ウェルに加えた。Ｖｅｒｉｔａｓ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して発光を測定した。ｃＡＭＰインキュベーションの前に、各可溶化物１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで大きさによって分画した。蛍光タンパク質産物をＴｙｐｈｏｏｎ ｉｍａｇｅｒで可視化した。
結果
Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ ＴｎＴ（登録商標）反応は、等量程度の各構築タンパク質を生じた。「ＤＮＡ不含有」試料からは、可視化されるタンパク質は生じなかった。全長レニラルシフェラーゼ構築物（２０１３２５．５０．Ａ７）は、ＣＰＭ−ｈＲＬ９１〜４２ａａ構築物（２０１３２５．１５．Ａ１）よりも約１００倍強い発光を、及びＣＰＭ−ｈＲＬ２２３〜４２ａａ構築物（２０１３２５．１５．Ｂ６）よりも約１０００００倍強い発光を生じた。ＲＩＩβＢ構築物ＣＰＭ−ｈＲＬ９１−４ａａ−ＲＩＩβＢ−２０ａａ（２０１３２５．４４．Ｈ６）及びＣＰＭ−ｈＲＬ９１−１０ａａ−ＲＩＩβＢ−２０ａａ（２０１３２５．５８．Ｅ１１）は、１００μＭ ｃＡＭＰと共にインキュベートした場合に水との場合よりも強い発光（それぞれ１１５から１４６倍及び１００倍）を生じた。ＲＩＩβＢ構築物ＣＰＭ−ｈＲＬ２２３−４ａａ−ＲＩＩβＢ−２０ａａ（２０１３２５．３３．Ｃ９）、ＣＰＭ−ｈＲＬ２２３−１０ａａ−ＲＩＩβＢ−４ａａ（２０１３２５．５４．Ｅ２）及びＣＰＭ−ｈＲＬ２２３−１０ａａ−ＲＩＩβＢ−２０ａａ（２０１３２５．５４．Ｅ１２）は、１００μＭ ｃＡＭＰと共にインキュベートした場合に水との場合よりも１．７から２．１倍強い発光を生じた。全長レニラルシフェラーゼ（２０１３２５．５０．Ａ７）、ＣＰＭ−ｈＲＬ９１−４２ａａ（２０１３２５．１５．Ａ１）及びＣＰＭ−ｈＲＬ２２３−４２ａａ構築物（２０１３２５．１５．Ｂ６）は、水と比較したｃＡＭＰとのインキュベーションにおいて１．３倍を超えては変化しなかった。Ｘ＝１０、Ｙ＝４リンカーを有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢセンサー構築物（ｐＢＦＢ４１）は、ｃＡＭＰの存在下で８５〜９０倍強い発光を生じた。「ＤＮＡ不含有」反応は、弱い発光であり（全長レニラルシフェラーゼの１００００００分の１）、且つｃＡＭＰとのインキュベーションで変化しなかった（図１０参照）。
（実施例４）
ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰバイオセンサーでのｃＡＭＰのｉｎ ｖｉｔｒｏ検出
材料と方法
細胞可溶化物中及び細胞溶解界面活性剤の存在下でのｃＡＭＰ測定の有効性を示すために、ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を使用して（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０；ｐＢＦＢ１０）のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質を発現させた。簡潔には、製造者の推奨する手順書に従って、以下の成分を混合し、３０℃、１．５時間インキュベートした：
１０００ｎｇ プラスミドＤＮＡ
２５μＬ ウサギ網状赤血球抽出物
２μＬ ＴＮＴ反応緩衝液
１μＬ Ｔ７ポリメラーゼ
１μＬ アミノ酸混合物
１μＬ ｒＲＮａｓｉｎ
ｄＨ２Ｏを合計容量５０μＬまで
細胞の界面活性剤介在の溶菌に続くｃＡＭＰ測定の実験条件を模倣するために以下の成分を最終濃度０、０．０１、０．０２５、０．１、０．２５、１、２．５、１０及び２５μＭ ｃＡＭＰと室温で混ぜた：
０．５μＬ ＴＮＴ（登録商標）発現ｃＡＭＰセンサー
１９．５μＬ Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．；ｃａｔ＃Ｌ４１４０、ｐａｒｔ＃Ｌ４１１Ａ）
５μＬ ｃＡＭＰ保存溶液
２５μＬ Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、ｃａｔ＃Ｅ２６１０）
混ぜた反応物をただちに混合し、ルシフェラーゼ活性を、Ｔｕｒｎｅｒ ２０／２０Ｎ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して１秒当たり１回測定で継続的に測定した。
いくつかの実験において、シグナルの安定性及び発光を増強するために、反応混合物は、４ｍＭルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、２ｍＭ コエンザイムＡ（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ ＡＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、１０ｍＭ ＤＴＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１６ｍＭ 硫酸マグネシウム、１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０（Ｆｉｓｈｅｒ）、１％ Ｔｅｒｇｉｔｏｌ Ｎ１０１（Ｓｉｇｍａ）、１％ Ｍａｚｕ ＤＦ１０１及び１ｍＭ ＣＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を含有する。ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳されたＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰバイオセンサーは、合計反応容量５０μｌについてプラスミドＤＮＡ １μｇを使用して、ＴｎＴ（登録商標）Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して合成し、ｃＡＭＰアッセイの直前に反応混合物に加えた（１００μｌアッセイ試薬当たり１μｌの翻訳産物の添加）。センサーを加えたアッセイ試薬１００μｌを、細胞培養液１００μｌ又は完全培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ）に希釈したｃＡＭＰ １００μｌのいずれかに加えた。
細胞培養
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析のために、ＨＥＫ−２９３細胞を９６ウェルプレートに蒔き、５０〜９０％コンフルエンスまで、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１００μｌで３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。細胞は、０．０２から２５０μＭフォルスコリン（Ｓｉｇｍａ）で刺激し、ここでフォルスコリンは、完全培地中で２倍に希釈した。
ｃＡＭＰでの標準曲線
１ｍＭ ｃＡＭＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を１０％ＦＢＳを含む完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、０．００５から５０μＭ ｃＡＭＰの濃度範囲で希釈した、ここでｃＡＭＰは、２倍系列希釈する。ｃＡＭＰ １００μｌを同種のｃＡＭＰ発光アッセイ試薬１００μｌと混合した。
結果
ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰセンサーは、様々なルシフェラーゼ試薬を含む様々なリシス緩衝液中で機能した。さらに、ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰセンサーを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｃＡＭＰの検出のための同種アッセイ形式において採用した（図９、１１Ａ及び１１Ｂ）。例えばコムギ胚芽抽出物を使用して、ルシフェラーゼ活性の用量依存値は、０．０２５から２５μＭ ｃＡＭＰの間のｃＡＭＰ検出のダイナミックレンジで３分間程度以内に展開した（図９）。最適化した試薬処方を使用する追加的例において、ｃＡＭＰのｉｎ ｖｉｔｒｏ検出は、バックグラウンド比２０のシグナル及び１．２８μＭのＥＣ５０を、Ｘ＝１０、Ｙ＝４（ｐＢＦＢ４１）のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰセンサーについて示した（図１１Ａ）。同様に、同じ最適化された試薬処方を使用して、ｃＡＭＰのｉｎ ｖｉｔｒｏ検出は、バックグラウンド比１１のシグナル及び０．６４μＭのＥＣ５０を、（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０）（ｐＢＦＢ１０）のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰセンサーについて示した（図１１Ａ）。本ｃＡＭＰアッセイは、以下の利点：化合物の干渉を低減する生物発光の読み取り；同種のワンステップ形式；並びに結合及び立体構造変化を誘導する能力の両方を必要とする特異性。
（実施例５）
ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰバイオセンサーを使用するｃＡＭＰ濃度変化の細胞内検出
細胞培養
細胞は、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２ ６０ｍｌ中で３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
プラスミド
（Ｘ＝１０、Ｙ＝０）のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰバイオセンサーをコードするＯＲＦをＦｌｅｘｉベクターｐＦ４Ｋ（Ｆｌｅｘｉ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）に遺伝子導入した。得られたプラスミド構築物（ｐＢＦＢ１４１）は、哺乳類細胞内での付随するｃＡＭＰバイオセンサーの発現のために上流ＣＭＶプロモーターを利用する。
トランスフェクション
細胞を、ＴｒａｎｓＩｔ（登録商標）−ＬＴ１ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＭＩＲＵＳ）で、９６ウェルプレートの１ウェル当たり、ＴｒａｎｓＩｔ（登録商標）−ＬＴ１ ｒｅａｇｅｎｔ ０．３μｌ及びＤＮＡ ０．１５μｇを使用してトランスフェクトした。細胞は、一晩増殖させ、翌日アッセイした。
バイオセンサーの調節
トランスフェクションの１日程度後、細胞をインキュベーターから出し、室温に平衡化した。最終濃度５ｍＭ程度のルシフェリンを得るために１００ｍＭ ルシフェリンＥＦの５μｌ一定分量を、細胞培養物加えるトランスフェクション試薬の合計９０μｌに加えた。次いで、細胞を室温で少なくとも９０分間インキュベートした。室温での９０分後、発光のベースライン測定を９６ウェルＶｅｒｉｔａｓ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；１ウェル当たり０．５秒間の積分時間）を使用して測定した。次いで、細胞を１０μＭイソプレテレノール（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）、５０ｍＭフォルスコリン（Ｓｉｇｍａ）で誘導したか、又は、誘導せず（０．１％ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ）、発光を約３０分間継続的に測定した。３０分後、１０ｍＭプロプラノロール（Ｓｉｇｍａ）をイソプレテレノールでの細胞に加え、他の全ての試料には、０．１％ＤＭＳＯを加えた。次いで続く３０分間、発光を継続的に測定した。５０μＭ フォルスコリンの最終添加をイソプレテレノール／プロプラノロール試料に加え、他の全ての試料に０．１％ＤＭＳＯを加えた。次いで、続く半時間、発光を継続的に測定した。試料は、１２回反復のセットで測定した。イソプレテレノール、プロプラノロール、フォルスコリン及びＤＭＳＯの１０×保存物は、１×ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に作製した。
結果
ｃＡＭＰの細胞内濃度の変化を測定するために、ＨＥＫ２９３細胞をＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ（Ｘ＝１０、Ｙ＝０、ｐＢＦＢ１４１）構築物で一過性にトランスフェクトし、ＧＰＣＲ活性化を通じて細胞内ｃＡＭＰ濃度を増大させる（イソプレテレノール、β−アドレナリン受容体アゴニスト）、ＧＰＣＲ阻害を通じて細胞内ｃＡＭＰ濃度を減少させる（プロプラノロール、β−アドレナリン受容体アンタゴニスト）又はアデニルシクラーゼの活性化を通じて細胞内ｃＡＭＰ濃度を増大させる（フォルスコリン）ことが既知である化合物で処理した。イソプレテレノール及びフォルスコリン処理の両方は、細胞内ｃＡＭＰ濃度の増大を反映して、トランスフェクトした細胞からの光出力を単独で２倍程度増大させた（図１１Ｃ）。加えて、ｃＡＭＰ濃度の変化の一時的反応に続いてトランスフェクトした細胞を、イソペルテレノール、プロプラノロールに続いてフォルスコリンで処理した（図１１Ｃ）。野生型ルシフェラーゼ及び４２アミノ酸Ｇｌｙ／Ｓｅｒリッチペプチドを発現しているＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質（ｐＢＦＢ８）も、検査し、細胞内ｃＡＭＰ濃度の既知の調節因子の添加に特異的な反応を示さなかった。
（実施例６）
光出力及び発光量比は、ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーについてＸ／Ｙペプチドリンカー長の関数として変化する
Ａ．可変Ｘ／Ｙペプチドリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーをコードするプラスミドの合成
可変Ｘ／Ｙペプチドリンカー長［２ｘ（ｘ＝０〜５）、２ｙ（ｙ＝０〜５）］を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーのセットを生成するために、（Ｘ＝０、Ｙ＝０、ｐＢＦＢ８９）、（Ｘ＝２、Ｙ＝２、ｐＢＦＢ９６）、（Ｘ＝６、Ｙ＝６、ｐＢＦＢ１０８）、及び（Ｘ＝８、Ｙ＝８、ｐＢＦＢ１１５）のセンサーをコードするプラスミドを、スプライスオーバーラップ伸長ＰＣＲ（ＳＯＥ ＰＣＲ）を使用して合成した。一度得られれば、標準的分子クローニング技術を、本セットにおける残りの全てのクローンを生成するために、（Ｘ＝０、Ｙ＝０）、（Ｘ＝２、Ｙ＝２）、（Ｘ＝４、Ｙ＝４）、（Ｘ＝６、Ｙ＝６）、（Ｘ＝８、Ｙ＝８）及び（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０）ペプチドリンカーを有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーをコードするプラスミド間のＤＮＡ断片の交換に使用した。追加的に、ＳＯＥ ＰＣＲを［１０＋２ｎ（ｎ＝０〜５）、０］及び［１０、−２ｎ（ｎ＝１〜７）］セットで、クローンを合成するために使用した（表２）。
Figure 0005684984
Figure 0005684984
ｉ．ペプチドリンカー（Ｘ＝０、Ｙ＝０；ｐＢＦＢ８９）を欠失しているＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーをコードするプラスミドの合成
ペプチドリンカー（Ｘ＝０、Ｙ＝０）を欠失している構築物を合成するために、３種の別々のＰＣＲ産物を生成するための３種の別々のプライマー対をＲＩＩβＢ ＤＮＡを増幅するために使用した。プライマー対５’−ＣＣＴ ＣＧＡ ＡＣＡ ＣＣＧ ＡＧＣ ＧＡＣ Ｃ−３’（配列番号３１）及び５’−ＧＣＡ ＧＴＧ ＡＣＴ ＣＡＡ ＴＡＡ ＡＧＣ ＴＴＴ ＣＡＴ ＡＣＡ ＴＣＴ ＴＣＴ ＴＧＧ ＣＣＴ ＴＡＡ ＴＧＡ ＧＡＡ ＴＣＴ ＣＧ−３’（配列番号１８）を産物＃１を生成するために使用し；プライマー対５’−ＣＧＡ ＧＡＴ ＴＣＴ ＣＡＴ ＴＡＡ ＧＧＣ ＣＡＡ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＴＡ ＴＧＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＡＴ ＴＧＡ ＧＴＣ ＡＣＴ ＧＣ−３’（配列番号３２）及び５’−ＧＧＣ ＣＣＴ ＴＣＴ ＴＡＡ ＴＧＴ ＴＴＴ ＴＧＧ ＣＴＡ ＣＡＡ ＴＡＴ ＣＣＡ ＴＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＣＡＡ ＡＣＡ Ｇ−３’（配列番号３３）を産物２を生成するために使用し；プライマー対５’−ＣＴＧ ＴＴＴ ＧＧＡ ＡＣＧ ＡＡＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＴＡ ＧＣＣ ＡＡＡ ＡＡＣ ＡＴＴ ＡＡＧ ＡＡＧ ＧＧＣ Ｃ−３’（配列番号３４）及び５’−ＧＴＡ ＴＣＴ ＴＡＴ ＣＡＴ ＧＴＣ ＴＧＣ ＴＣＧ ＡＡＧ ＣＧ−３’（配列番号３５）を産物３を生成するために使用した。３種の産物のＳＯＥ ＰＣＲは、全長ＰＣＲ産物を産生し、それを続いて制限酵素ＳｇｆＩ／ＸｂａＩで消化し、ＳｇｆＩ／ＸｂａＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。
ｉｉ．ペプチドリンカー長（Ｘ＝２、Ｙ＝２；ｐＢＦＢ９６）を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーをコードするプラスミドの合成
ペプチドリンカー（Ｘ＝２、Ｙ＝２）を有する構築物を合成するために、３種の別々のＰＣＲ産物を生成するための３種の別々のプライマー対をＲＩＩβＢを増幅するために使用した。プライマー対５’−ＣＣＴ ＣＧＡ ＡＣＡ ＣＣＧ ＡＧＣ ＧＡＣ Ｃ−３’（配列番号３６；ＢＦＢ３１）及び５’−ＣＡＡ ＴＡＡ ＡＧＣ ＴＴＴ ＣＡＴ ＡＣＡ ＴＣＧ ＡＧＣ ＣＣＴ ＴＣＴ ＴＧＧ ＣＣＴ ＴＡＡ ＴＧＡ ＧＡＡ ＴＣＴ ＣＧ−３’（配列番号３７；ＢＦＢ１２０）を産物１を生成するために使用し；プライマー対５’−ＣＧＡ ＧＡＴ ＴＣＴ ＣＡＴ ＴＡＡ ＧＧＣ ＣＡＡ ＧＡＡ ＧＧＧ ＣＴＣ ＧＡＴ ＧＴＡ ＴＧＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＡＴ ＴＧ−３’（配列番号３８；ＢＦＢ１１９）及び５’−ＣＴＴ ＣＴＴ ＡＡＴ ＧＴＴ ＴＴＴ ＧＧＣ ＡＣＣ ＧＧＡ ＴＡＣ ＡＡＴ ＡＴＣ ＣＡＴ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＣ ＡＡＡ ＣＡＧ−３’（配列番号３９；ＢＦＢ１２２）を産物２を生成するために使用し；プライマー対５’−ＣＴＧ ＴＴＴ ＧＧＡ ＡＣＧ ＡＡＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＴＡ ＴＣＣ ＧＧＴ ＧＣＣ ＡＡＡ ＡＡＣ ＡＴＴ ＡＡＧ ＡＡＧ−３’（配列番号４０；ＢＦＢ１２２）及び５’−ＧＴＡ ＴＣＴ ＴＡＴ ＣＡＴ ＧＴＣ ＴＧＣ ＴＣＧ ＡＡＧ ＣＧ−３’（配列番号４１；ＢＦＢ３４）を産物３を生成するために使用した。３種の産物のＳＯＥ ＰＣＲは、全長ＰＣＲ産物をもたらし、それを続いて制限酵素ＳｇｆＩ／ＸｂａＩで消化し、ＳｇｆＩ／ＸｂａＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。
ｉｉｉ．ペプチドリンカー長（Ｘ＝６、Ｙ＝６；ｐＢＦＢ１０８）を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーをコードするプラスミドの合成
ペプチドリンカー（Ｘ＝６、Ｙ＝６）を有する構築物を合成するために、プライマー５’−ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＧＴＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＡＧＧ ＴＴＣ ＡＡＴ ＧＴＡ ＴＧＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＡＴ ＴＧＡ ＧＴＣ ＡＣＴ ＧＣ−３’（配列番号４２；ＢＦＢ１２３）及び５’−ＡＡＡ ＡＡＡ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＣＴ ＣＣＡ ＧＡＴ ＡＣＡ ＡＴＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＣＡ ＡＡＣ ＡＧ−３’（配列番４３；ＢＦＢ１２４）をＲＩＩβＢ ＤＮＡを増幅するＰＣＲに使用した。得られた産物を制限酵素ＳａｌＩ／ＳａｃＩで消化し、ＸｈｏＩ／ＳａｃＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。
ｉｖ．ペプチドリンカー長（Ｘ＝８、Ｙ＝８；ｐＢＦＢ１１５）を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーをコードするプラスミドの合成
ペプチドリンカー（Ｘ＝８、Ｙ＝８）を有する構築物を合成するために、プライマー５’−ＡＡＡ ＡＡＡ ＧＴＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＡＧＧ ＴＴＣ ＡＧＧ ＣＧＧ ＴＡＴ ＧＴＡ ＴＧＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＡＴ ＴＧＡ ＧＴＣ ＡＣＴ ＧＣ−３’（配列番号４４；ＢＦＢ１２５）及び５’−ＡＡＡ ＡＡＡ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＣＴ ＣＣＡ ＧＡＴ ＣＣＡ ＣＣＴ ＡＣＡ ＡＴＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＣＡ ＡＡＣ ＡＧ−３’（配列番１１６；ＢＦＢ１２６）をＲＩＩβＢ ＤＮＡを増幅するＰＣＲに使用した。得られた産物を制限酵素ＳａｌＩ／ＳａｃＩで消化し、ＸｈｏＩ／ＳａｃＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。
ｖ．［２ｘ（ｘ＝０〜５）、２ｙ（ｙ＝０〜５）］のセットのペプチドリンカー長を有する残りのＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーをコードするプラスミドの合成
（Ｘ＝０、Ｙ＝０）、（Ｘ＝２、Ｙ＝２）、（Ｘ＝４、Ｙ＝４）、（Ｘ＝６、Ｙ＝６）、（Ｘ＝８、Ｙ＝８）及び（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０）のペプチドリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーをコードするプラスミドについて、ＸｈｏＩ／ＸｂａＩ又はＸｍｎＩ／ＸｂａＩ制限酵素消化を実施した。それぞれについて、制限酵素消化は２個の断片：ＲＩＩβＢのＣ末端部分、リンカーＹ及びＬｕｃ２．０ ４〜２３３断片をコードする小断片；並びに、Ｌｕｃ２．０ ２３４〜５４４をコードする配列、リンカーＸ及びＲＩＩβＢのＮ末端部分を含むもとのプラスミドの残り全ての要素を含む大断片；を生成する。［２ｘ（ｘ＝０〜５）、２ｙ（ｙ＝０〜５）］のセットの３６個全てのクローンを生成するために小断片を、様々な制限酵素消化由来の大断片に連結した。
ｖｉ．［１０＋２ｎ（ｎ＝１〜５）、０］のセットのペプチドリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーをコードするプラスミドの合成
ペプチドリンカー長（Ｘ＝１２、Ｙ＝０；ｐＢＦＢ１３５）を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーをコードするプラスミドを合成するために、２種の別々のＰＣＲ産物を生成するための２種の別々のプライマー対をＲＩＩβＢを増幅するために使用した。プライマー対５’−ＡＡＡ ＡＡＡ ＴＣＣ ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＧＴ ＡＴＧ ＴＡＴ ＧＡＡ ＡＧＣ ＴＴＴ ＡＴＴ ＧＡＧ ＴＣＡ ＣＴＧ Ｃ−３’（配列番号４６；ＢＦＢ１４２）及び５’−ＧＧＣ ＣＣＴ ＴＣＴ ＴＡＡ ＴＧＴ ＴＴＴ ＴＧＧ ＣＴＡ ＣＡＡ ＴＡＴ ＣＣＡ ＴＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＣＡＡ ＡＣＡ Ｇ−３’（配列番号４７；ＢＦＢ１１８）を産物＃１を生成するために使用し；プライマー対５’−ＣＴＧ ＴＴＴ ＧＧＡ ＡＣＧ ＡＡＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＴＡ ＧＣＣ ＡＡＡ ＡＡＣ ＡＴＴ ＡＡＧ ＡＡＧ ＧＧＣ Ｃ−３’（配列番号４８；ＢＦＢ１１７）及び５’−ＧＴＡ ＴＣＴ ＴＡＴ ＣＡＴ ＧＴＣ ＴＧＣ ＴＣＧ ＡＡＧ ＣＧ−３’（配列番号４９；ＢＦＢ３４）を産物２を生成するために使用した。２種の産物のＳＯＥ ＰＣＲは、全長ＰＣＲ産物をもたらし、それを続いて制限酵素ＢｓｐＥＩ／ＸｂａＩで消化し、ＢｓｐＥＩ／ＸｂａＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。
ペプチドリンカー長（Ｘ＝１４、Ｙ＝０；ｐＢＦＢ１３６）を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーをコードするプラスミドを合成するために、２種の別々のＰＣＲ産物を生成するための２種の別々のプライマー対をＲＩＩβＢを増幅するために使用した。プライマー対５’−ＡＡＡ ＡＡＡ ＴＣＣ ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＧＴ ＴＣＴ ＧＧＣ ＡＴＧ ＴＡＴ ＧＡＡ ＡＧＣ ＴＴＴ ＡＴＴ ＧＡＧ ＴＣＡ ＣＴＧ Ｃ−３’（配列番号４５；ＢＦＢ１４３）及び５’−ＧＧＣ ＣＣＴ ＴＣＴ ＴＡＡ ＴＧＴ ＴＴＴ ＴＧＧ ＣＴＡ ＣＡＡ ＴＡＴ ＣＣＡ ＴＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＣＡＡ ＡＣＡ Ｇ−３’（配列番号２１；ＢＦＢ１１８）を産物１を生成するために使用し；プライマー対５’−ＣＴＧ ＴＴＴ ＧＧＡ ＡＣＧ ＡＡＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＴＡ ＧＣＣ ＡＡＡ ＡＡＣ ＡＴＴ ＡＡＧ ＡＡＧ ＧＧＣ Ｃ−３’（配列番号２４；ＢＦＢ１１７）及び５’−ＧＴＡ ＴＣＴ ＴＡＴ ＣＡＴ ＧＴＣ ＴＧＣ ＴＣＧ ＡＡＧ ＣＧ−３’（配列番号３０；ＢＦＢ３４）を産物２を生成するために使用した。２種の産物のＳＯＥ ＰＣＲは、全長ＰＣＲ産物をもたらし、それを続いて制限酵素ＢｓｐＥＩ／ＸｂａＩで消化し、ＢｓｐＥＩ／ＸｂａＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。
ペプチドリンカー長（Ｘ＝１６、Ｙ＝０；ｐＢＦＢ１３７）を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーをコードするプラスミドを合成するために、２種の別々のＰＣＲ産物を生成するための２種の別々のプライマー対をＲＩＩβＢを増幅するために使用した。プライマー対５’−ＡＴＡ ＡＡＴ ＴＣＣ ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＧＴ ＴＣＴ ＧＧＣ ＧＧＡ ＴＣＡ ＡＴＧ ＴＡＴ ＧＡＡ ＡＧＣ ＴＴＴ ＡＴＴ ＧＡＧ ＴＣＡ ＣＴＧ Ｃ−３’（配列番号５０；ＢＦＢ１４４）及び５’−ＧＧＣ ＣＣＴ ＴＣＴ ＴＡＡ ＴＧＴ ＴＴＴ ＴＧＧ ＣＴＡ ＣＡＡ ＴＡＴ ＣＣＡ ＴＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＣＡＡ ＡＣＡ Ｇ−３’（配列番号５１；ＢＦＢ１１８）を産物１を生成するために使用し；プライマー対５’−ＣＴＧ ＴＴＴ ＧＧＡ ＡＣＧ ＡＡＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＴＡ ＧＣＣ ＡＡＡ ＡＡＣ ＡＴＴ ＡＡＧ ＡＡＧ ＧＧＣ Ｃ−３’（配列番号５２；ＢＦＢ１１７）及び５’−ＧＴＡ ＴＣＴ ＴＡＴ ＣＡＴ ＧＴＣ ＴＧＣ ＴＣＧ ＡＡＧ ＣＧ−３’（配列番号５３；ＢＦＢ３４）を産物２を生成するために使用した。２種の産物のＳＯＥ ＰＣＲは、全長ＰＣＲ産物をもたらし、それを続いて制限酵素ＢｓｐＥＩ／ＸｂａＩで消化し、ＢｓｐＥＩ／ＸｂａＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。
ペプチドリンカー長（Ｘ＝１８、Ｙ＝０；ｐＢＦＢ１３８）を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーをコードするプラスミドを合成するために、２種の別々のＰＣＲ産物を生成するための２種の別々のプライマー対をＲＩＩβＢを増幅するために使用した。プライマー対５’−ＡＡＡ ＡＡＴ ＴＣＣ ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＧＴ ＴＣＴ ＧＧＣ ＧＧＡ ＴＣＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＡＴＧ ＴＡＴ ＧＡＡ ＡＧＣ ＴＴＴ ＡＴＴ ＧＡＧ ＴＣＡ ＣＴＧ Ｃ−３’（配列番号５４；ＢＦＢ１４５）及び５’−ＧＧＣ ＣＣＴ ＴＣＴ ＴＡＡ ＴＧＴ ＴＴＴ ＴＧＧ ＣＴＡ ＣＡＡ ＴＡＴ ＣＣＡ ＴＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＣＡＡ ＡＣＡ Ｇ−３’（配列番号５５；ＢＦＢ１１８）を産物１を生成するために使用し；プライマー対５’−ＣＴＧ ＴＴＴ ＧＧＡ ＡＣＧ ＡＡＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＴＡ ＧＣＣ ＡＡＡ ＡＡＣ ＡＴＴ ＡＡＧ ＡＡＧ ＧＧＣ Ｃ−３’（配列番号５６；ＢＦＢ１１７）及び５’−ＧＴＡ ＴＣＴ ＴＡＴ ＣＡＴ ＧＴＣ ＴＧＣ ＴＣＧ ＡＡＧ ＣＧ−３’（配列番号５７；ＢＦＢ３４）を産物２を生成するために使用した。２種の産物のＳＯＥ ＰＣＲは、全長ＰＣＲ産物をもたらし、それを続いて制限酵素ＢｓｐＥＩ／ＸｂａＩで消化し、ＢｓｐＥＩ／ＸｂａＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。
ｖｉｉ．［１０、−２ｎ（ｎ＝１〜７）］のセットのペプチドリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーをコードするプラスミドの合成
（Ｘ＝１０）のＮ末端ペプチドリンカー長を有し、Ｃ末端ペプチドリンカーを欠失しており、ＲＩＩβＢ ２６６〜４１２残基を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーをコードするプラスミド（１０、−２；ｐＢＦＢ１２８）を合成するために、２種の別々のＰＣＲ産物を生成するための２種の別々のプライマー対をＲＩＩβＢ ＤＮＡを増幅するために使用した。プライマー対５’−ＡＡＡ ＡＡＡ ＧＴＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＡＧＧ ＴＴＣ ＡＧＧ ＣＧＧ ＴＴＣ−３’（配列番号５８；ＢＦＢ１２７）及び５’−ＧＧＣ ＣＣＴ ＴＣＴ ＴＡＡ ＴＧＴ ＴＴＴ ＴＧＧ ＣＡＴ ＣＣＡ ＴＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＣＡＡ ＡＣＡ ＧＧ−３’（配列番号５９；ＢＦＢ１２８）を産物１を生成するために使用し；プライマー対５’−ＣＣＴ ＧＴＴ ＴＧＧ ＡＡＣ ＧＡＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＧＣ ＣＡＡ ＡＡＡ ＣＡＴ ＴＡＡ ＧＡＡ ＧＧＧ ＣＣ−３’（配列番号６０；ＢＦＢ１２９）及び５’−ＧＴＡ ＴＣＴ ＴＡＴ ＣＡＴ ＧＴＣ ＴＧＣ ＴＣＧ ＡＡＧ ＣＧ−３’（配列番号６１；ＢＦＢ３４）を産物２を生成するために使用した。２種の産物のＳＯＥ ＰＣＲは、全長ＰＣＲ産物をもたらし、それを続いて制限酵素ＳａｌＩ／ＸｂａＩで消化し、ＸｈｏＩ／ＸｂａＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。
（Ｘ＝１０）のＮ末端ペプチドリンカー長を有しＣ末端ペプチドリンカーを欠失しており、ＲＩＩβＢ ２６６〜４１０残基を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーをコードするプラスミド（１０、−４；ｐＢＦＢ１２９）を合成するために、２種の別々のＰＣＲ産物を生成するための２種の別々のプライマー対をＲＩＩβＢ ＤＮＡを増幅するために使用した。プライマー対５’−ＡＡＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＣＧＧＡＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＴＴＣ−３’（配列番号６２；ＢＦＢ１２７）及び５’−ＧＧＣＣＣＴＴＣＴＴＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＧＣＧＴＴＣＧＴＴＣＣＡＡＡＣＡＧＧＧＣＡＡＣＴＡＡＣ−３’（配列番号６３；ＢＦＢ１３０）を産物＃１を生成するために使用し；プライマー対５’−ＧＴＴＡＧＴＴＧＣＣＣＴＧＴＴＴＧＧＡＡＣＧＡＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＡＡＧＡＡＧＧＧＣＣ−３’（配列番号６４；ＢＦＢ１３１）及び５’−ＧＴＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＴＣＧＡＡＧＣＧ−３’（配列番号６５；ＢＦＢ３４）を産物２を生成するために使用した。２種の産物のＳＯＥ ＰＣＲは、全長ＰＣＲ産物をもたらし、それを続いて制限酵素ＳａｌＩ／ＸｂａＩで消化し、ＸｈｏＩ／ＸｂａＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。
（Ｘ＝１０）のＮ末端ペプチドリンカー長を有し、Ｃ末端ペプチドリンカーを欠失しており、ＲＩＩβＢ ２６６〜４０８残基を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーをコードするプラスミド（１０、−６；ｐＢＦＢ１３０）を合成するために、２種の別々のＰＣＲ産物を生成するための２種の別々のプライマー対をＲＩＩβＢ ＤＮＡを増幅するために使用した。プライマー対５’−ＡＡＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＣＧＧＡＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＴＴＣ−３’（配列番号６６；ＢＦＢ１２７）及び５’−ＧＧＣＣＣＴＴＣＴＴＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＧＣＴＣＣＡＡＡＣＡＧＧＧＣＡＡＣＴＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＣ−３’（配列番号６７；ＢＦＢ１３２）を産物１を生成するために使用し；プライマー対５’−ＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＴＡＧＴＴＧＣＣＣＴＧＴＴＴＧＧＡＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＡＡＧＡＡＧＧＧＣＣ−３’（配列番号６８；ＢＦＢ１３３）及び５’−ＧＴＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＴＣＧＡＡＧＣＧ−３’（配列番号６９；ＢＦＢ３４）を産物２を生成するために使用した。２種の産物のＳＯＥ ＰＣＲは、全長ＰＣＲ産物をもたらし、それを続いて制限酵素ＳａｌＩ／ＸｂａＩで消化し、ＸｈｏＩ／ＸｂａＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。
（Ｘ＝１０）のＮ末端ペプチドリンカー長を有し、Ｃ末端ペプチドリンカーを欠失しており、ＲＩＩβＢ ２６６〜４０６残基を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーをコードするプラスミド（１０、−８；ｐＢＦＢ１３１）を合成するために、２種の別々のＰＣＲ産物を生成するための２種の別々のプライマー対をＲＩＩβＢ ＤＮＡを増幅するために使用した。プライマー対５’−ＡＡＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＣＧＧＡＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＴＴＣ−３’（配列番号７０；ＢＦＢ１２７）及び５’−ＧＧＣＣＣＴＴＣＴＴＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＡＣＴＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＣＡＴＡＧＧ−３’（配列番号７１；ＢＦＢ１３４）を産物１を生成するために使用し；プライマー対５’−ＣＣＴＡＴＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＴＡＧＴＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＡＡＧＡＡＧＧＧＣＣ−３’（配列番号７２；ＢＦＢ１３５）及び５’−ＧＴＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＴＣＧＡＡＧＣＧ−３’（配列番号７３；ＢＦＢ３４）を産物２を生成するために使用した。２種の産物のＳＯＥ ＰＣＲは、全長ＰＣＲ産物をもたらし、それを続いて制限酵素ＳａｌＩ／ＸｂａＩで消化し、ＸｈｏＩ／ＸｂａＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。
（Ｘ＝１０）のＮ末端ペプチドリンカー長を有し、Ｃ末端ペプチドリンカーを欠失しており、ＲＩＩβＢ ２６６〜４０４残基を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーをコードするプラスミド（１０、−１０；ｐＢＦＢ１３２）を合成するために、２種の別々のＰＣＲ産物を生成するための２種の別々のプライマー対をＲＩＩβＢ ＤＮＡを増幅するために使用した。プライマー対５’−ＡＡＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＣＧＧＡＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＴＴＣ−３’（配列番号７４；ＢＦＢ１２７）及び５’−ＧＧＣＣＣＴＴＣＴＴＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＧＣＡＡＣＴＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＣＡＴＡＧＧＴＡＧＣＧＡＴＧ−３’（配列番号７５；ＢＦＢ１３６）を産物１を生成するために使用し；プライマー対５’−ＣＡＴＣＧＣＴＡＣＣＴＡＴＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＴＡＧＴＴＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＡＡＧＡＡＧＧＧＣＣ−３’（配列番号７６；ＢＦＢ１３７）及び５’−ＧＴＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＴＣＧＡＡＧＣＧ−３’（配列番号７７；ＢＦＢ３４）を産物２を生成するために使用した。２種の産物のＳＯＥ ＰＣＲは、全長ＰＣＲ産物をもたらし、それを続いて制限酵素ＳａｌＩ／ＸｂａＩで消化し、ＸｈｏＩ／ＸｂａＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。
（Ｘ＝１０）のＮ末端ペプチドリンカー長を有し、Ｃ末端ペプチドリンカーを欠失しており、ＲＩＩβＢ ２６６〜４０２残基を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーをコードするプラスミド（１０、−１２；ｐＢＦＢ１３３）を合成するために、２種の別々のＰＣＲ産物を生成するための２種の別々のプライマー対をＲＩＩβＢ ＤＮＡを増幅するために使用した。プライマー対５’−ＡＡＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＣＧＧＡＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＴＴＣ−３’（配列番号７８；ＢＦＢ１２７）及び５’−ＧＧＣＣＣＴＴＣＴＴＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＧＣＣＴＧＴＴＣＴＴＣＡＴＡＧＧＴＡＧＣＧＡＴＧＴＴＣＣ−３’（配列番号７９；ＢＦＢ１３８）を産物１を生成するために使用し；プライマー対５’−ＧＧＡＡＣＡＴＣＧＣＴＡＣＣＴＡＴＧＡＡＧＡＡＣＡＧＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＡＡＧＡＡＧＧＧＣＣ−３’（配列番号８０；ＢＦＢ１３９）及び５’−ＧＴＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＴＣＧＡＡＧＣＧ−３’（配列番号８１；ＢＦＢ３４）を産物２を生成するために使用した。２種の産物のＳＯＥ ＰＣＲは、全長ＰＣＲ産物をもたらし、それを続いて制限酵素ＳａｌＩ／ＸｂａＩで消化し、ＸｈｏＩ／ＸｂａＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。
（Ｘ＝１０）のＮ末端ペプチドリンカー長を有し、Ｃ末端ペプチドリンカーを欠失しており、Ｒ２βＢ ２６６〜４００残基を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーをコードするプラスミド（１０、−１４；ｐＢＦＢ１３４）を合成するために、２種の別々のＰＣＲ産物を生成するための２種の別々のプライマー対をＲＩＩβＢ ＤＮＡを増幅するために使用した。プライマー対５’−ＡＡＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＣＧＧＡＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＴＴＣ−３’（配列番号８２；ＢＦＢ１２７）及び５’−ＧＧＣＣＣＴＴＣＴＴＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＧＣＴＴＣＡＴＡＧＧＴＡＧＣＧＡＴＧＴＴＣＣＴＴＴＴＣ−３’（配列番号８３；ＢＦＢ１４０）を産物１を生成するために使用し；プライマー対５’−ＧＡＡＡＡＧＧＡＡＣＡＴＣＧＣＴＡＣＣＴＡＴＧＡＡＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＡＡＧＡＡＧＧＧＣＣ−３’（配列番号８４；ＢＦＢ１４１）及び５’−ＧＴＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＴＣＧＡＡＧＣＧ−３’（配列番号８５；ＢＦＢ３４）を産物２を生成するために使用した。２種の産物のＳＯＥ ＰＣＲは、全長ＰＣＲ産物をもたらし、それを続いて制限酵素ＳａｌＩ／ＸｂａＩで消化し、ＸｈｏＩ／ＸｂａＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。
Ｂ．可変のＸ／Ｙペプチドリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーの機能評価
ｉ．［２ｘ（ｘ＝０〜５）、２ｙ（ｙ＝０〜５）］のセットのＸ／Ｙペプチドリンカーを有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーの機能評価
ｃＡＭＰの存在下及び非存在下におけるルシフェラーゼ活性を、ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を使用する発現に続いて、［２ｘ（ｘ＝０〜５）、２ｙ（ｙ＝０〜５）］のセットのＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰセンサーについて測定した。簡潔には、製造者の推奨する手順書に従って、以下の成分を混合した：
４００ｎｇ プラスミドＤＮＡ
１０μＬ ウサギ網状赤血球抽出物
０．８μＬ ＴＮＴ反応緩衝液
０．４μＬ Ｔ７ポリメラーゼ
０．４μＬ アミノ酸混合物
０．４μＬ ｒＲＮａｓｉｎ
ｄＨ２Ｏを合計容量２０μＬまで
３０℃、１．５時間のインキュベーションに続いて、各融合タンパク質を、ＴＮＴ（登録商標）反応物９μＬと１ｍＭ ｃＡＭＰ保存液又はｄＨ２Ｏ １μＬとを組み合わせることによって１００μＭ ｃＡＭＰの存在下又は非存在下でインキュベートした。室温、≧１５分間のインキュベーションに続いて、試料１μＬをＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＡＲ；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）溶液＋／−１００μＭ ｃＡＭＰ（９０μＬ ＬＡＲ＋１０μＬ １ｍＭ ｃＡＭＰ保存液又はｄＨ２Ｏ）１００μＬに加えた。発光をＶｅｒｉｔａｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ｐｒｏｇｒａｍ Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ）を使用して測定した。総合的に、［２ｘ（ｘ＝０〜５）、２ｙ（ｙ＝０〜５）］のセットのＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合物において、ペプチドリンカー長の増大に伴って１００μＭ ｃＡＭＰの存在下又は非存在下におけるルシフェラーゼ活性の増大が測定される傾向が観察された（図１２）。加えて、ペプチドリンカー長の増大に伴って１００μＭ ｃＡＭＰの存在下におけるルシフェラーゼ活性の発光量比が増大する第二の傾向が観察された（図１３）。
ｉｉ．［１０、−２ｎ（ｎ＝１〜７）］、［１０、２ｎ（ｎ＝１〜５）］及び［１０＋２ｎ（ｎ＝０〜５）、０］のアミノ酸残基のセットのＸ／Ｙペプチドリンカーを有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーの機能評価
１００μＭ ｃＡＭＰの存在下及び非存在下でのルシフェラーゼ活性を、ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を使用する発現に続いて、［１０、−２ｎ（ｎ＝１〜７）］、［１０、２ｎ（ｎ＝１〜５）］及び［１０＋２ｎ（ｎ＝０〜５）、０］のアミノ酸残基のセットのＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰセンサーについて測定した。簡潔には、製造者の推奨する手順書に従って、以下の成分を混合した：
４００ｎｇ プラスミドＤＮＡ
１０μＬ ウサギ網状赤血球抽出物
０．８μＬ ＴＮＴ反応緩衝液
０．４μＬ Ｔ７ポリメラーゼ
０．４μＬ アミノ酸混合物
０．４μＬ ｒＲＮａｓｉｎ
ｄＨ２Ｏを合計容量２０μＬまで
３０℃、１時間のインキュベーションに続いて、各融合タンパク質を、ＴＮＴ（登録商標）反応物９μＬと１ｍＭ ｃＡＭＰ保存液又はｄＨ２Ｏ １μＬとを組み合わせることによって１００μＭ ｃＡＭＰの存在下又は非存在下でインキュベートした。室温、≧９分間のインキュベーションに続いて、試料１μＬをＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＡＲ；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）溶液＋／−１００μＭ ｃＡＭＰ（９０μＬ ＬＡＲ＋１０μＬ １ｍＭ ｃＡＭＰ保存液又はｄＨ２Ｏ）１００μＬに加えた。発光をＶｅｒｉｔａｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ｐｒｏｇｒａｍ Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ）を使用して測定した。一般に１００μＭ ｃＡＭＰの存在下又は非存在下におけるルシフェラーゼ活性は、Ｃ末端ペプチドリンカーを欠失しているＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰセンサーについてＲＩＩβＢのＣ末端短縮の増大と共に減少した（図１４）。加えて、［１０、−２ｎ（ｎ＝１〜７）］及び［１０、２ｎ（ｎ＝１〜５）］のセットのＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰセンサーについて、１００μＭ ｃＡＭＰの存在下における最大の発光量比は、（Ｘ＝１０、Ｙ＝０；ｐＢＦＢ１１７）のペプチドリンカーを有するセンサーにおいてであった。さらに、［１０＋２ｎ（ｎ＝０〜５）、０］のセットのＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰセンサーは、（Ｘ＝１０、Ｙ＝０；ｐＢＦＢ１１７）アミノ酸残基のペプチドリンカーを有するセンサーについて最大の発光量比を示した（図１５）。
（実施例７）
円順列置換ヒカリコメツキルシフェラーゼ及びＩＩβ型ＰＫＡ調節サブユニット由来Ｂドメインを有するｃＡＭＰバイオセンサー
Ａ．続くＲＩＩβＢ（ｐＢＦＢ５３）の挿入のためのＣＰＭ−ヒカリコメツキＬｕｃ発現プラスミドの合成
実施例１０、Ａ節において合成されたプラスミドのヒカリコメツキ変異体を合成するために、プライマー５’−ＴＡＴＡＡＴＧＣＴＡＧＣＧＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＧＴＧＡＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＧＴＡＴＣ−３’（配列番号８６；ＢＦＢ９４）及び５’−ＴＴＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＴＴＴＴＴＣＧＡＧＧ−３’（配列番号８７；ＢＦＢ９５）を、プラスミドｐＣＢＧ６８−ｂａｓｉｃ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ＃ＡＹ２５８５９３；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ）から、２３４〜５４４残基（ヒカリコメツキルシフェラーゼ２３１〜５４２アミノ酸）をコードするホタルルシフェラーゼ断片のヒカリコメツキ等価物を増幅するために使用した。得られた産物を制限酵素ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩで消化し、プラスミド中間体Ｉを得るために、ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。続いて、プライマー５’−ＡＡＡＡＡＡＧＡＧＣＴＣＣＧＧＴＧＡＡＡＡＧＡＡＣＧＴＧＡＴＣＴＡＣＧＧＣＣ−３’（配列番号８８；ＢＦＢ９６）及び５’−ＡＡＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＧＴＴＴＡＡＡＣＡＧＧＧＡＴＣＡＡＴＴＧＡＧＴＡＣＣＣＡＣＡＣ−３’（配列番号８９；ＢＦＢ９７）を、プラスミドｐＣＢＧ６８−ｂａｓｉｃ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ＃ＡＹ２５８５９３；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ）から、４〜２３３残基（ヒカリコメツキルシフェラーゼ５〜２３０アミノ酸）をコードするホタルルシフェラーゼ断片の、ヒカリコメツキ等価物を増幅するために使用した。得られた産物を制限酵素ＳａｃＩ／ＸｂａＩで消化し、ＳａｃＩ／ＸｂａＩで消化した上記プラスミド中間体Ｉに連結した。
Ｂ．ペプチドリンカー（Ｘ＝４、Ｙ＝４；ｐＢＦＢ５４）及び（Ｘ＝１０、Ｙ＝４；ｐＢＦＢ５５）アミノ酸残基を有するＣＰＭ−ヒカリコメツキＬｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質をコードするプラスミドの合成
リンカー長（Ｘ＝４、Ｙ＝４）を有する構築物を合成するために、プライマー５’−ＡＡＡ ＡＡＡ ＧＴＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＡＡＴ ＧＴＡ ＴＧＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＡＴ ＴＧＡ ＧＴＣ ＡＣＴ ＧＣＣ−３’（配列番号９０；ＢＦＢ５１）及び５’−ＡＡＡ ＡＡＡ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＣＡ ＡＣＡ ＡＴＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＣＡ ＡＡＣ−３’（配列番号９１；ＢＦＢ２０）を、ＡＴＣＣ１０６２５２３３（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＢＣ０７５８００）からＲＩＩβＢ ＤＮＡを増幅するために使用した。得られた産物を制限酵素ＳａｌＩ／ＳａｃＩで消化し、親ＣＰＭ−ヒカリコメツキＬｕｃ（ｐＢＦＢ５３）に連結した。
リンカー長（Ｘ＝１０、Ｙ＝４）を有する構築物を合成するために、プライマー５’−ＡＡＡ ＡＡＡ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＣＡ ＡＣＡ ＡＴＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＣＡ ＡＡＣ−３’（配列番号９２；ＢＦＢ２０）及び５’−ＡＡＡ ＡＡＡ ＴＣＣ ＧＧＡ ＡＴＧ ＴＡＴ ＧＡＡ ＡＧＣ ＴＴＴ ＡＴＴ ＧＡＧ ＴＣＡ ＣＴＧ ＣＣ−３’（配列番号９３；ＢＦＢ２１）を、ＡＴＣＣ１０６２５２３３（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＢＣ０７５８００）からＲＩＩβＢ ＤＮＡを増幅するために使用した。得られた産物を制限酵素ＢｓｐＩ／ＳａｃＩで消化し、ＢｓｐＩ／ＳａｃＩで消化した親ＣＰＭ−ヒカリコメツキＬｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ５３）に連結した。
Ｂ．ペプチドリンカー（Ｘ＝４、Ｙ＝４；ｐＢＦＢ５４）及び（Ｘ＝１０、Ｙ＝４；ｐＢＦＢ５５）アミノ酸残基を有するＣＰＭ−ヒカリコメツキＬｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質の機能評価
Ｘ／Ｙリンカー長（Ｘ＝４、Ｙ＝４；ｐＢＦＢ５４）及び（Ｘ＝１０、Ｙ＝４；ｐＢＦＢ５５）アミノ酸残基を有するＣＰＭ−ヒカリコメツキＬｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質のｃＡＭＰ用量反応を、ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を使用する発現に続いて測定した。簡潔には、製造者の推奨する手順書に従って、以下の成分を混合した：
２４００ｎｇ プラスミドＤＮＡ
６０μＬ ウサギ網状赤血球抽出物
４．８μＬ ＴＮＴ反応緩衝液
２．４μＬ Ｔ７ポリメラーゼ
２．４μＬ アミノ酸混合物
２．４μＬ ｒＲＮａｓｉｎ
ｄＨ２Ｏを合計容量１２０μＬまで
３０℃、１．５時間のインキュベーションに続いて各融合タンパク質を、ＴＮＴ（登録商標）反応物９μＬとｃＡＭＰ保存液１μＬとを組み合わせることによって様々な濃度のｃＡＭＰ（最終濃度０、０．０１、０．０２５、０．１、０．２５、１、２．５、１０及び２５μＭ ｃＡＭＰ）とインキュベートした。２０分間程度の室温への平衡化に続いて、試料１μＬを各濃度のｃＡＭＰ（９０μＬ ＬＡＲ＋１０μＬ ｃＡＭＰ保存液）を含有するＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＡＲ；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）溶液１００μＬに加えた。発光をＶｅｒｉｔａｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ｐｒｏｇｒａｍ Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ）を使用して測定した。（Ｘ＝４、Ｙ＝４；ｐＢＦＢ５４）及び（Ｘ＝１０、Ｙ＝４；ｐＢＦＢ５５）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ヒカリコメツキＬｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質は、ルシフェラーゼ活性について２５μＭ ｃＡＭＰでそれぞれ４．０及び５．５の発光量比を示した。しかし、ヒカリコメツキルシフェラーゼに基づくｃＡＭＰセンサーについての発光量比は、検査した全ての濃度においてホタルルシフェラーゼに基づくセンサーの発光量比より低かった。（図１６）。
（実施例８）
円順列置換ホタルルシフェラーゼ及びＩα型ＰＫＡ調節サブユニット由来Ｂドメインを利用するｃＡＭＰバイオセンサー
ヒトＩα型ＰＫＡ調節サブユニット（ＲＩαＢ）由来のＢドメインをコードするＤＮＡを、ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩαＢ融合物［Ｌｕｃ２．０（２３４〜５４４）−リンカーＸ−ヒトＲＩα（２４５〜３８１残基）−リンカーＹ−Ｌｕｃ２．０（４〜２３３）］をコードする発現ベクターに連結した。
Ａ．（Ｘ＝４、Ｙ＝４；ｐＢＦＢ５６）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０；ｐＢＦＢ５８）アミノ酸残基のペプチドリンカーを有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩαＢ融合タンパク質の合成
リンカー長（Ｘ＝４、Ｙ＝４）を有する構築物を合成するために、プライマー５’−ＡＴＡＴＡＡＣＴＣＧＡＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＴＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＴＡＧＴＡＡＡＧＴＣＴＣＴＡＴＴＴＴＡＧ−３’（配列番号９４；ＢＦＢ９８）及び５’−ＡＡＡＡＡＡＧＡＧＣＴＣＣＣＧＡＣＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＴＧＴＡＣ−３’（配列番号９５；ＢＦＢ９９）を、ＲＩαＢ ＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ＃ＢＣ０３６２８５）を増幅するために使用した。得られた産物を制限酵素ＸｈｏＩ／ＳａｃＩで消化し、ＸｈｏＩ／ＳａｃＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。
リンカー長（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０）を有する構築物を合成するために、プライマー５’−ＡＴＴＡＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＧＴＡＴＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＴＡＧＴＡＡＡＧＴＣＴＣＴＡＴＴＴＴＡＧ−３’（配列番号９６；ＢＦＢ１０２）及び５’−ＡＡＡＡＡＡＴＣＣＧＧＡＣＣＣＧＡＣＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＴＧＴＡＣ−３’（配列番号９７；ＢＦＢ１０３）を、（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ＃ＢＣ０３６２８５からＲＩαＢ ＤＮＡを増幅するために使用した。得られた産物を制限酵素ＳｍａＩ／ＢｓｐＥＩで消化し、ＮｒｕＩ／ＡｇｅＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。
Ｂ．（Ｘ＝４、Ｙ＝４；ｐＢＦＢ５６）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０；ｐＢＦＢ５８）アミノ酸残基のペプチドリンカーを有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩαＢ融合タンパク質の機能評価
（Ｘ＝４、Ｙ＝４；ｐＢＦＢ５６）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０；ｐＢＦＢ５８）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩαＢ融合タンパク質のｃＡＭＰ用量反応を、ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を使用する発現に続いて測定した。簡潔には、製造者の推奨する手順書に従って、以下の成分を混合した：
２４００ｎｇ プラスミドＤＮＡ
６０μＬ ウサギ網状赤血球抽出物
４．８μＬ ＴＮＴ反応緩衝液
２．４μＬ Ｔ７ポリメラーゼ
２．４μＬ アミノ酸混合物
２．４μＬ ｒＲＮａｓｉｎ
ｄＨ２Ｏを合計容量１２０μＬまで
３０℃、１．５時間のインキュベーションに続いて各融合タンパク質を、ＴＮＴ（登録商標）反応物９μＬとｃＡＭＰ保存液１μＬとを組み合わせることによって様々な濃度のｃＡＭＰ（最終濃度０、０．０１、０．０２５、０．１、０．２５、１、２．５、１０、２５及び１００μＭ ｃＡＭＰ）とインキュベートした。室温、≧１０分間の平衡化に続いて、試料１μＬを各濃度のｃＡＭＰ（９０μＬ ＬＡＲ＋１０μＬ ｃＡＭＰ保存液）を含有するＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＡＲ；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）溶液１００μＬに加えた。発光をＶｅｒｉｔａｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ｐｒｏｇｒａｍ Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ）を使用して測定した。（Ｘ＝４、Ｙ＝４；ｐＢＦＢ５６）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０；ｐＢＦＢ５８）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩαＢ融合タンパク質は、ルシフェラーゼ活性について１００μＭ ｃＡＭＰで１．８の発光量比を示した。しかし、ＲＩαＢに基づくｃＡＭＰセンサーについての発光量比は、濃度≧０．０２５μＭにおいてＲＩＩβＢに基づくセンサーの発光量比より低かった。（図１７）。
（実施例９）
円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ及びＩＩβ型ＰＫＡ調節サブユニット由来Ｂドメインを利用するｃＡＭＰバイオセンサー
Ａ．続くＲＩＩβＢの挿入のためのＣＰＭ−熱安定性Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ４５）の合成
熱安定性ルシフェラーゼ（ＵｌｔｒａＧｌｏ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を合成するために、プライマー５’−ＡＡＴＴＡＡＧＣＴＡＧＣＧＡＴＣＧＣＣＡＴＧＡＣＧＴＣＡＧＣＡＡＴＴＴＴＡＡＣＧＧＴＡＡＴＡＣＣ−３’（配列番号９８；ＢＦＢ８８）及び５’−ＴＴＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧＣＣＡＴＴＧＧＴＧＴＧＴＴＴＴＴＣＴＡＡＣＡＴＴＴＧＴＣＴＴＡＡＣ−３’（配列番号９９；ＢＦＢ８９）を、２３４〜５４４残基をコードするホタルルシフェラーゼ断片のＵｌｔｒａＧｌｏルシフェラーゼ等価物（ＵｌｔｒａＧｌｏルシフェラーゼ２３３〜５４３残基）を増幅するために使用した。得られた産物を制限酵素ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩで消化し、プラスミド中間体１を得るために、ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。続いて、プライマー５’−ＡＡＴＴＴＴＧＡＧＣＴＣＣＧＧＴＧＡＴＡＡＧＡＡＴＡＴＴＴＴＡＴＡＴＧＧＧＣＣＣＧＡＡＣ−３’（配列番号１００；ＢＦＢ９０）及び５’−ＡＡＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＧＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴＡＣＣＡＡＡＡＧＴＡＧ−３（配列番号１０１；ＢＦＢ９１）を、４〜２３３残基をコードするホタルルシフェラーゼ断片のヒカリコメツキ等価物（ＵｌｔｒａＧｌｏルシフェラーゼ３〜２３２残基）を増幅するために使用した。得られた産物を制限酵素ＳａｃＩ／ＸｂａＩで消化し、ＳａｃＩ／ＸｂａＩで消化した上記のプラスミド中間体１に連結した。
Ｂ．（Ｘ＝４、Ｙ＝４；ｐＢＦＢ５１）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０；ｐＢＦＢ５２）アミノ酸残基のペプチドリンカー長を有するＣＰＭ−熱安定性Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質をコードするプラスミドの合成
リンカー長（Ｘ＝４、Ｙ＝４）を有するＣＰＭ−熱安定性Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質をコードするプラスミドを合成するために、プライマー５’−ＡＡＡ ＡＡＡ ＧＴＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＡＡＴ ＧＴＡ ＴＧＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＡＴ ＴＧＡ ＧＴＣ ＡＣＴ ＧＣＣ−３’（配列番号１０２；ＢＦＢ５１）及び５’−ＡＡＡ ＡＡＡ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＣＡ ＡＣＡ ＡＴＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＣＡ ＡＡＣ−３’（配列番号１０３；ＢＦＢ２０）を、ＡＴＣＣ１０６２５２３３（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＢＣ０７５８００）からＲＩＩβＢ ＤＮＡを増幅するために使用した。得られた産物を制限酵素ＳａｌＩ／ＳａｃＩで消化し、ＸｈｏＩ／ＳａｃＩで消化した上記、親ＣＰＭ−熱安定性Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ４５）に連結した。
リンカー長（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０）を有するＣＰＭ−熱安定性Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質をコードするプラスミドを合成するために、プライマー５’−ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＣＣ ＧＧＧ ＡＴＧ ＴＡＴ ＧＡＡ ＡＧＣ ＴＴＴ ＡＴＴ ＧＡＧ ＴＣＡ ＣＴＧ ＣＣ−３’（配列番号１０４；ＢＦＢ２３）及び５’−ＡＡＡ ＡＡＡ ＴＣＣ ＧＧＡ ＣＣＣ ＡＡＣ ＡＡＴ ＡＴＣ ＣＡＴ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＣ ＡＡＡ Ｃ−３’（配列番号１０５；ＢＦＢ２４）を、ＡＴＣＣ１０６２５２３３（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＢＣ０７５８００）からＲＩＩβＢ ＤＮＡを増幅するために使用した。得られた産物を制限酵素ＢｓｐＥＩ／ＳｍａＩで消化し、ＡｇｅＩ／ＮｒｕＩで消化した上記、親ＣＰＭ−熱安定性Ｌｕｃ発現プラスミドに連結した。
Ｃ．（Ｘ＝４、Ｙ＝４；ｐＢＦＢ５１）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０；ｐＢＦＢ５２）アミノ酸残基のペプチドリンカーを有するＣＰＭ−熱安定性Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質の機能評価
（Ｘ＝４、Ｙ＝４；ｐＢＦＢ５１）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０；ｐＢＦＢ５２）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−熱安定性Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質のｃＡＭＰ用量反応を、ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を使用する発現に続いて測定した。簡潔には、製造者の推奨する手順書に従って、以下の成分を混合した：
２４００ｎｇ プラスミドＤＮＡ
６０μＬ ウサギ網状赤血球抽出物
４．８μＬ ＴＮＴ反応緩衝液
２．４μＬ Ｔ７ポリメラーゼ
２．４μＬ アミノ酸混合物
２．４μＬ ｒＲＮａｓｉｎ
ｄＨ２Ｏを合計容量１２０μＬまで
３０℃、１．５時間のインキュベーションに続いて各融合タンパク質を、ＴＮＴ（登録商標）反応物９μＬとｃＡＭＰ保存液１μＬとを組み合わせることによって様々な濃度のｃＡＭＰ（最終濃度０、０．０１、０．０２５、０．１、０．２５、１、２．５、１０、２５及び１００μＭ ｃＡＭＰ）とインキュベートした。室温、≧１９分間の平衡化に続いて、試料１μＬを各濃度のｃＡＭＰ（９０μＬ ＬＡＲ＋１０μＬ ｃＡＭＰ保存液）を含むＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＡＲ；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）溶液１００μＬに加えた。発光をＶｅｒｉｔａｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ｐｒｏｇｒａｍ Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ）を使用して測定した。Ｘ＝４、Ｙ＝４アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−熱安定性Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質（ｐＢＦＢ５１）は、ルシフェラーゼ活性について１００μＭ ｃＡＭＰで１．５の発光量比を示した（図１８）。しかし、Ｘ＝２０、Ｙ＝２０アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−熱安定性Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質（ｐＢＦＢ５２）は、ｃＡＭＰに反応しなかった（図１８）。どちらの場合においても、ＣＰＭ−熱安定性Ｌｕｃ／ＲＩαＢに基づくｃＡＭＰセンサーについてのルシフェラーゼ活性での発光量比は、濃度≧０．０２５μＭにおいてホタルルシフェラーゼに基づくセンサーの発光量比より低かった。（図１８）。
（実施例１０）
ＣＰＭレニラルシフェラーゼ／ＲＩＩβＢバイオセンサーを使用するｃＡＭＰ濃度変化の細胞内検出（フォルスコリン滴定）
細胞培養
ＨＥＫ−２９３細胞１００μｌを、９６ウェルプレートに蒔き、７０〜９０％培養密度までＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中で３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。
トランスフェクション
細胞を、ＴｒａｎｓＩｔ（登録商標）−ＬＴ１ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＭＩＲＵＳ）で、９６ウェルプレートの１ウェル当たり、ＴｒａｎｓＩｔ（登録商標）−ＬＴ１ ｒｅａｇｅｎｔ ０．３μＬ及びＤＮＡ（（Ｘ＝４、Ｙ＝２０）のＸ／Ｙペプチドリンカー長を有するＣＰＭ−ｈＲＬ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰバイオセンサー（２０１３２５．７８．Ｅ５））０．１５μｇを使用してトランスフェクションした。細胞は、一晩増殖させ、翌日アッセイした。
バイオセンサーの調節
トランスフェクションの１日程度後、細胞をインキュベーターから出し、室温に平衡化させた。６００μＭ ＥｎｄｕＲｅｎ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の１０μｌ一定分量を、細胞培養物に合計１００μＬで加え、最終濃度６０μＭ程度のセレントラジンを得た。次いで、細胞を室温で少なくとも１５分間インキュベートした。室温での１５分後、発光のベースライン測定を９６−ｗｅｌｌ Ｖｅｒｉｔａｓ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｕｒｎｅｒ）を使用して、１ウェル当たり０．５秒間で測定した。次いで、細胞を０．０２５μＭ〜２５０μＭフォルスコリン（Ｓｉｇｍａ）で誘導したか、又は、しなかった（０．１％ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ）、発光を約３０分間継続的に測定した（図１９）。試料は、フォルスコリンの濃度１種類当たり５回反復のセットで測定した。ＥＣ５０は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ｖｅｒｓｉｏｎ４を使用して算出した。
結果
（Ｘ＝４、Ｙ＝２０）（２０１３２５．７８．Ｅ５）のＸ／Ｙペプチドリンカー長を有するＣＰＭ−ｈＲＬ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰバイオセンサーをコードするＤＮＡでトランスフェクトした細胞由来の、光出力は、フォルスコリンでの刺激に続いて増大した（図１９）。最高レベルのフォルスコリンは、未処理の細胞の３．６倍の光出力を誘導した。加えて、フォルスコリン反応のＥＣ５０は、０．０５９μＭであった（図１９）。
（実施例１１）
円順列置換ホタルルシフェラーゼ及びｃＧＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＧＫＩ−Ｂ）由来Ｂドメイン又はヒトホスホジエステラーゼ２Ａ（ＰＤＥ２Ａ）を利用するｃＧＭＰバイオセンサー
ｃＧＭＰは、様々な生理学的機能を、具体的には心臓血管系及び神経系において有する重要な細胞二次メッセンジャーである。ｃＧＭＰセンサーのシリーズは、円順列置換ホタルルシフェラーゼをｃＧＭＰ結合ドメインに融合することによって調製した。
Ａ．（Ｘ＝４、Ｙ＝４）及び（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０）アミノ酸残基のペプチドリンカーを有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＧＫＩ−Ｂ融合タンパク質をコードするプラスミドの合成
リンカー長（Ｘ＝４、Ｙ＝４）を有する構築物を合成するために、プライマー５’−ＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＣＧＧＡＴＴＡＡＡＡＡＧＣＧＴＴＣＣＡＡＣＡＴＴＣＣＡＧ−３’（配列番号１０６；ＢＦＢ１５１）及び５’−ＡＡＡＡＡＡＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＴＴＧＧＣＧＡＡＧ−３’（配列番号１０７；ＢＦＢ１６３）を、ヒトＧＫＩ−Ｂ ＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ、ｃａｔ＃ＴＣ１１６２５２；Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ＃ＮＭ＿００６２５８）、すなわち、２３１から３５０残基（ｐＢＦＢ１６４、ｐＢＦＢ１６５）、又は２３１から３７３残基（ｐＢＦＢ１７１、ｐＢＦＢ１７２）に対応するＤＮＡを増幅するために使用した。得られた産物を制限酵素ＸｈｏＩ／ＳａｃＩで消化し、ＸｈｏＩ／ＳａｃＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。
リンカー長（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０）を有する構築物を合成するために、プライマー５’−ＡＡＡＡＡＡＴＣＣＧＧＡＴＴＡＡＡＡＡＧＣＧＴＴＣＣＡＡＣＡＴＴＣＣＡＧ−３’（配列番号１０８；ＢＦＢ１５３）及び５’−ＡＡＡＡＡＡＡＧＧＣＣＴＧＡＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＴＴＧＧＣＧＡＡＧ−３’（配列番号１０９；ＢＦＢ１６４）を、ヒトＧＫＩ−Ｂ ＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ、ｃａｔ＃ＴＣ１１６２５２；Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ＃ＮＭ＿００６２５８）を増幅するために使用した。得られた産物を制限酵素ＢｓｐＥＩ／ＳｔｕＩで消化し、ＢｓｐＥＩ／ＺｒａＩで消化した親ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ発現プラスミド（ｐＢＦＢ８）に連結した。
Ｂ．（Ｘ＝４、Ｙ＝４）及び（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＧＫＩ−Ｂ融合タンパク質の機能評価
（Ｘ＝４、Ｙ＝４）及び（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＧＫＩ−Ｂ融合タンパク質について１００μＭ ｃＧＭＰの存在下及び非存在下でのルシフェラーゼ活性を、ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を使用する発現に続いて測定した。簡潔には、製造者の推奨する手順書に従って、以下の成分を混合した：
４００ｎｇ プラスミドＤＮＡ
１０μＬ ウサギ網状赤血球抽出物
０．８μＬ ＴＮＴ反応緩衝液
０．４μＬ Ｔ７ポリメラーゼ
０．４μＬ アミノ酸混合物
０．４μＬ ｒＲＮａｓｉｎ
ｄＨ２Ｏを合計容量２０μＬまで
３０℃、１時間のインキュベーションに続いて各融合タンパク質を、ＴＮＴ（登録商標）反応物９μＬと１ｍＭ ｃＧＭＰ保存液又はｄＨ２Ｏ １μＬとを組み合わせることによって、１００μＭのｃＧＭＰの存在下又は非存在下でインキュベートした。室温、≧１０分間でのインキュベーションに続いて、試料１μＬをＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＡＲ；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）溶液１００μＬ＋／−１００μＭ ｃＧＭＰ（ＬＡＲ ９０μＬ＋１ｍＭ ｃＧＭＰ保存液又はｄＨ２Ｏ １０μＬ）に加えた。発光をＶｅｒｉｔａｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ｐｒｏｇｒａｍ Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ）を使用して測定した。リンカー長（Ｘ＝４、Ｙ＝４）を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＧＫＩ−Ｂ融合タンパク質（ｐＢＦＢ１７１）は、１００μＭ ｃＧＭＰの存在下でルシフェラーゼ活性について１／２倍の減少を示した。加えて、リンカー長（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０）を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＧＫＩ−Ｂ融合タンパク質（ｐＢＦＢ１７２）は、１００μＭ ｃＧＭＰの存在下でルシフェラーゼ活性について２／３倍の減少を示した。
Figure 0005684984
Ｃ．ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ヒトホスホジエステラーゼ２Ａをコードするプラスミドの合成（ＰＤＥ２Ａ；Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ＿００２５９９：アミノ酸４１６〜５４９残基）
それぞれ２３４及び２３３残基で工学的に操作されたＮ及びＣ末端を有する円順列置換ホタルルシフェラーゼ構築物をコードするＤＮＡ配列を、ＲＩＩβＢドメインと比較して異なるタンパク質折りたたみを有するヒトＰＤＥ２Ａをコードする配列に融合した［Ｍｅｔ−（Ｌｕｃ２．０ ２３４〜５４４）−（リンカーＸ）−（ヒトＰＤＥ２Ａ ４１６〜５４９）−（リンカーＹ）−（Ｌｕｃ２．０ ４〜２３３）−Ｖａｌ］。ヒトＰＤＥ２Ａ由来のｃＧＭＰ結合ドメインは、ＧＡＦドメインと称される低分子結合単位の大きなファミリーに属している。構築物は、（ｐＢＦＢ１６７；Ｘ＝４、Ｙ＝４）、（ｐＢＦＢ１６８；Ｘ＝１０、Ｙ＝１０）及び（ｐＢＦＢ１６９；Ｘ＝２０、Ｙ＝２０）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長で作製した（図２１）。ＰＤＥ２Ａに基づくバイオセンサーは、Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現に続いて、１００μＭ ｃＧＭＰの存在下での発光活性において、（ｐＢＦＢ１６８；Ｘ＝１０、Ｙ＝１０）及び（ｐＢＦＢ１６９；Ｘ＝２０、Ｙ＝２０）アミノ酸リンカーを有する構築物について２及び１１の発光量比で同定された（図２２）。さらに、これらのバイオセンサーのｃＧＭＰによる活性化が、Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍを使用する発現に続く別々の実験において、ｃＡＭＰよりも容量依存性であり、且つ選択的であることが見出された（ｐＢＦＢ１６９；図２３）。
したがって、これらのｃＧＭＰセンサーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃＧＭＰ濃度の変化の検出について有用であり、これらのバイオセンサーは、細胞培養実験又は動物全体をイメージングする研究における使用のための生存細胞におけるｃＧＭＰの濃度変化を検出するために有用である可能性がある。
（実施例１２）
ルシフェラーゼカルシウムバイオセンサー
カルシウムセンサーは、それぞれ２３４残基及び２３３残基で工学的に操作されたＮ及びＣ末端を有する円順列置換ホタルルシフェラーゼをコードする配列を、カルシウムに結合するタンパク質ドメインをコードする配列に融合することによって調製した。１つの型のカルシウムバイオセンサーは、速筋型ニワトリ骨格筋トロポニンＣ（ＴｎＣ）の突然変異体（アミノ酸１５〜１６３；Ｎ１０９Ｄ、Ｄ１１１Ｎ、Ｎ１４５Ｄ、Ｄ１４７Ｎ；Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ＿２０５４５０）［Ｍｅｔ−（Ｌｕｃ２．０ ２３４〜５４４）−（リンカーＸ）−（ＴｎＣ）−（リンカーＹ）−（Ｌｕｃ２．０ ４〜２３３）Ｖａｌ］を利用し、第二の型のカルシウムバイオセンサーは、ヒトカルモジュリン（ＣａＭ）（アミノ酸５〜１４８；Ｇｅｎｂａｎｋ ＢＣ００５１３７）［Ｍｅｔ−Ｌｕｃ＋（２３４〜５４４）−（リンカーＸ）−ヒトカルモジュリン（５〜１４８）−（リンカーＹ）−Ｌｕｃ＋（４〜２３３）］を利用する。
様々なＸ／Ｙペプチドリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＴｎＣ及びＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＣａＭ構築物を、Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで発現させた（ｐＢＦＢ２２５、ｐＢＦＢ２２６、ｐＢＦＢ２２７、ｐＢＦＢ７；図２４）。反応物に、次いで１０ｍＭ ＣａＣｌ２、又は１０ｍＭ ＥＤＴＡに加えて２．５ｍＭ ＥＧＴＡを補充した。最大反応は、Ｘ＝ＬＥＧＳＧＧＧＧ（配列番号３０６）且つＹ＝ＧＧＧＧＳＧＰＷ（配列番号３０７）である（Ｘ＝８、Ｙ＝８；ｐＢＦＢ７）を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＣａＭバイオセンサーについて、カルシウム存在下で発光活性が６０分の１未満に減少することで観察された。低い強度であるが、同様の反応が異なるＸ／Ｙペプチドリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＣａＭ構築物（ｐＢＦＢ２２５、ｐＢＦＢ２２６、ｐＢＦＢ２２７）について観察された。ランダム４２アミノ酸リンカーを有する対照構築物又は野生型ホタルルシフェラーゼについては、反応は、観察されなかった（ｐＢＦＢ８及びｐＢＦＢ２２；図２５）。
これらのバイオセンサーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び生体細胞内のカルシウム濃度の変化の検出について有用である可能性がある。
（実施例１３）
ホタルルシフェラーゼ中の改変の多重部位を使用するｃＡＭＰバイオセンサー
円順列置換などの改変の追加的部位を、ホタルルシフェラーゼバイオセンサー、例えばｃＡＭＰバイオセンサーの開発のために使用できる。上記ｃＡＭＰバイオセンサーは、一次構造が、Ｍｅｔ−（Ｌｕｃ２．０ ２３４〜５４４残基）−ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ−ＲＩＩβＢ−（Ｌｕｃ２．０ ４〜２３３残基）−Ｖａｌ（配列番号１８４；ＲＩＩβＢは、ヒトＩＩβ型ＰＫＡ調節ドメイン２６６〜４１４アミノ酸由来のＢ ｃＡＭＰ結合ドメイン）を有するホタルルシフェラーゼの円順列置換突然変異体を使用して調製した。類似の構築物を、追加的残基で円順列置換ホタルルシフェラーゼ突然変異体を使用して調製した。結果として、以下の型：Ｍｅｔ−（Ｌｕｃ２．０ Ｘ−５４４残基）−ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ−ＲＩＩβＢ−（Ｌｕｃ２．０ ４−Ｙ）−Ｖａｌ（ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧは、配列番号１２１に対応する；図２６に、様々な構築物についてのＸ／Ｙ値を示す）の融合タンパク質をコードする２３種の独立した構築物を検査した。これらの各構築物について、２５５残基での円順列置換を有する構築物は除き、部位は、円順列置換のためにＰＤＢファイル１ＬＣＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ．ｄｏ）を使用して、ベータシート又はアルファヘリックスなどの二次構造によって境界付けられた、溶媒暴露表面のループ中で選択した。溶媒暴露表面のループは、円順列置換などの改変の部位として、タンパク質の核中に埋まっている部位又はアルファ若しくはベータ構造中に含まれる部位よりもさらに改変され易い可能性がある。このことは、２５５での円順列置換を有する構築物について観察される活性の欠失によって支持される、ここでＴｙｒ２５５は、タンパク質の核中に埋まっているアルファヘリックスの構成要素である。構築物のこのコレクションは、１ＬＣＩ結晶構造において明らかになった多数であるが、全てではない表面を代表している。
ＴＮＴ Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍを使用した発現に続いて、発光活性がルミノメーターのバックグラウンド検出レベルを超えており、且つ１００μＭ ｃＡＭＰの存在下での発光量比が２倍を超えていた円順列置換の多数の異なる部位を同定した（ＣＰＭ部位：３７、４７、７５、８３、１０７、１４４、１６０、１８８、２２５、２３３、２４２、２６８、３０８、３５８、３７７、４０３及び４９０）。加えて、本実験で２００倍を超える最大活性化比値を有し、発光活性における発光量比がＣＰＭ２３３を超えている構築物を同定した。選択された構築物をコードしているＤＮＡを、ＣＭＶプロモーター（ｐＦ９Ａ；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を含む哺乳類発現ベクターに遺伝子導入した。構築物は、：ｐＢＦＢ３１７（ＣＰＭ部位２６８）、ｐＢＦＢ３１８（ＣＰＭ部位３５８）、ｐＢＦＢ３１９（ＣＰＭ部位４７）、ｐＢＦＢ３２１（ＣＰＭ部位２２５）、ｐＢＦＢ３２２（ＣＰＭ部位２３３）、ｐＢＦＢ３２５（ＣＰＭ部位３０８）、ｐＢＦＢ３２６（ＣＰＭ部位３７７）、ｐＢＦＢ３２７（ＣＰＭ部位４０３）、ｐＢＦＢ３２８（ＣＰＭ部位７５）、ｐＢＦＢ３２９（ＣＰＭ部位８３）（Ｘ、Ｙ値については図２６を参照）であった。様々なＭｅｔ−（Ｌｕｃ２．０ Ｘ−５４４残基）−ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ−ＲＩＩβＢ−（Ｌｕｃ２．０ ４−Ｙ残基）−Ｖａｌ（ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧは、配列番号１２１に対応する）構築物をコードするＤＮＡでの一過性トランスフェクションに続いて、ＨＥＫ２９３細胞を５０μＭフォルスコリンで、内在性アデニルシクラーゼを活性化するために処理した。１６分間のインキュベーションに続いて、生体細胞集団からの発光を測定した。予想された通り、様々な構築物が生体細胞内でｃＡＭＰバイオセンサーとして機能した。興味深いことに、細胞内で最も高い発光量比を示した構築物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで最も高い発光量比を有したものと同じ構築物ではなかった（図２７〜２８を比較）。
（実施例１４）
非順列置換レニラルシフェラーゼｃＡＭＰバイオセンサー
本明細書において記載の通り、円順列置換レニラルシフェラーゼ構築物をバイオセンサーとして採用できる。改変に耐性である部位、例えば９１／９２、２２３／２２４又は２２９／２３０残基の間に挿入されたＲＩＩβＢを有する非順列置換レニラルシフェラーゼ構築物を調製した。構築物は、上記に記載の通り生成した。それらは、ｈＲＬ（１〜９１）−４アミノ酸ペプチドリンカー−ＲＩＩＢｅｔａＢ−４アミノ酸ペプチドリンカー−ｈＲＬ（９２〜３１１）（２０１３６０．１７．Ａ３）、ｈＲＬ（１〜９１）−４アミノ酸ペプチドリンカー−ＲＩＩＢｅｔａＢ−２０アミノ酸ペプチドリンカー−ｈＲＬ９９２〜３１１）（２０１３６０．１７．Ａ１２）、ｈＲＬ（１〜９１）−１０アミノ酸ペプチドリンカー−ＲＩＩＢｅｔａＢ−４アミノ酸リンカー−ｈＲＬ（９２〜３１１）（２０１３６０．１７．Ｄ７）、ｈＲＬ（１〜９１）−４２アミノ酸ペプチドリンカー−ｈＲＬ（９２〜３１１）（２０１３２５．１６５．Ａ２）、ｈＲＬ（１〜２２３）−４アミノ酸ペプチドリンカー−ＲＩＩＢｅｔａＢ−４アミノ酸リンカー−ｈＲＬ（２２４〜３１１）（２０１３６０．２４．Ａ１）、ｈＲＬ（１〜２２３）−４アミノ酸ペプチドリンカー−ＲＩＩＢｅｔａＢ−２０アミノ酸リンカー−ｈＲＬ（２２４〜３１１）（２０１３６０．２４．Ａ１０）、ｈＲＬ（１〜２２３）−１０アミノ酸ペプチドリンカー−ＲＩＩＢｅｔａＢ−４アミノ酸リンカー−ｈＲＬ（２２４〜３１１）（２０１３６０．２４．Ｃ５）、ｈＲＬ（１〜２２３）−１０アミノ酸ペプチドリンカー−ＲＩＩＢｅｔａＢ−２０アミノ酸リンカー−ｈＲＬ（２２４〜３１１）（２０１３６０．２４．Ｅ１１）、ｈＲＬ（１〜２２３）−４２アミノ酸ペプチドリンカー−ｈＲＬ（２２４〜３１１）（２０１３２５．１７．Ｂ７）、ｈＲＬ（１〜２２９）−４アミノ酸ペプチドリンカー−ＲＩＩＢｅｔａＢ−４アミノ酸リンカー−ｈＲＬ（２３０〜３１１）（２０１３６０．１９．Ｅ９）、ｈＲＬ（１〜２２９）−４アミノ酸ペプチドリンカー−ＲＩＩＢｅｔａＢ−２０アミノ酸リンカー−ｈＲＬ（２３０〜３１１）（２０１３６０．５４．Ａ１）、ｈＲＬ（１〜２２９）−４２アミノ酸ペプチドリンカー−ｈＲＬ（２３０〜３１１）（２０１３２５．１６５．Ｃ５）（図２９）であった。
タンパク質は、ＴｎＴ Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍを使用して構築物から発現させ、ＴＮＴ反応物１７μＬを、１ｍＭ ｃＡＭＰ保存液又はｄＨ２Ｏ ３．４μＬを補充した３００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／２００ｍＭチオ尿素（ｐＨ約７．５）１７μＬと混合した；反応物を、１０分間程度室温でインキュベートした。各試料１０μＬを９６ウェルプレートのウェルに３回反復で加え、発光をＧｌｏｍａｘ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ上でＲｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ １００μＬを使用して測定した。
ｈＲＬ（１〜９１）−リンカー−ＲＩＩｂｅｔａＢ−リンカー−ｈＲＬ（９２〜３１１）タンパク質は、約１２から２３倍誘導され、ｈＲＬ（１〜２２３）−リンカーＲＩＩｂｅｔａＢ−リンカー−ｈＲＬ（２２４〜３１１）タンパク質は、誘導されず、ｈＲＬ（１〜２２９）−リンカー−ＲＩＩＢｅｔａＢ−（２３０〜３１１）タンパク質は、約２から９倍誘導された。４２アミノ酸リンカー構築物で誘導されたものは無く、全長レニラルシフェラーゼ構築物（２０１３２５．５０．Ａ７）又は「ＤＮＡ不含有」対照も誘導されなかった（図３０）。
（実施例１５）
光出力及び発光量比は、ＣＰＭ−ｈＲＬ９１ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーについてＸ／Ｙペプチドリンカー長の関数として変化する
可変のＸ／Ｙペプチドリンカー長を有するＣＰＭ−ｈＲＬ９１ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーをコードする構築物を生成した（図３１）。タンパク質は、ＴｎＴ Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍを使用して構築物から発現され、ＴＮＴ反応物１７μＬを、１ｍＭ ｃＡＭＰ保存液又はｄＨ２Ｏを３．４μＬ補充した３００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／２００ｍＭチオ尿素（ｐＨ約７．５）１７μＬと混合した；反応物を、１０分間程度室温でインキュベートした。各試料１０μＬを９６ウェルプレートのウェルに３回反復で加え、発光をＧｌｏｍａｘ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ上でＲｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ １００μＬを使用して測定した。図３２に示す通り、光出力及び発光量比は、リンカー長で変化した。発光量比は、約８７から３３１の範囲であった。４２アミノ酸リンカー構築物、全長レニラルシフェラーゼ構築物及び「ＤＮＡ不含有」対照は、誘導されなかった（図３２）。
（実施例１６）
円順列置換レニラルシフェラーゼ及びＩα型ＰＫＡ調節サブユニット由来Ｂドメイン又はＧＡＦドメインを利用するｃＡＭＰバイオセンサー
ヒトＩα型ＰＫＡ調節サブユニット由来のＢドメイン（ＲＩαＢ）をコードするＤＮＡを、ＣＰＭ−ｈＲＬ９１ Ｌｕｃ／ＲＩαＢ融合物［ｈＲＬ（９２〜３１１）−リンカーＸ−ヒトＲＩα（２４５〜３８１残基）−リンカーＹ−ｈＲＬ（１〜９１）］；（Ｘ＝４、Ｙ＝２０；ｐＢＦＢ２１０）、（Ｘ＝４、Ｙ＝４；ｐＢＦＢ２１１）、（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０；ｐＢＦＢ２１２）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０；ｐＢＦＢ２１３）をコードする発現ベクターに連結した（図３３）。タンパク質は、ＴｎＴ Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍを使用して構築物から発現させ、ＴＮＴ反応物１７μＬを、１ｍＭ ｃＡＭＰ保存液又はｄＨ２Ｏ ３．４μＬを補充した３００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／２００ｍＭチオ尿素（ｐＨ約７．５）１７μＬと混合した；反応物を、１０分間程度室温でインキュベートした。各試料１０μＬを９６ウェルプレートのウェルに３回反復で加え、発光をＧｌｏｍａｘ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ上でＲｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ １００μＬを使用して測定した。図３４に示す通り、光出力及び発光量比は、リンカー長と共に変化した。発光量比は、約２．８から６．８の範囲であった。４２アミノ酸リンカー構築物（２０１３２５．１５．Ａ１）、全長レニラルシフェラーゼ構築物（２０１３２５．５０．Ａ７）及び「ＤＮＡ不含有」対照は、誘導されなかった（図３４）。
追加的な型のｃＡＭＰバイオセンサーは、円順列置換レニラルシフェラーゼ（ｈＲＬ）及びＧＡＦドメインを使用して構築した。プラスミドＤＮＡ構築物は、以下の融合タンパク質をコードする：Ｍｅｔ−（ｈＲＬ９２〜３１１）−ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ−（トリパノソーマ ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）ＰＤＥ由来ＧＡＦ Ａドメイン；Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＦ１９２７５５ ２４１〜３７５アミノ酸）−ＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＴＳＧＧＳＧＧＳＳＧ−Ａ−（ｈＲＬ３〜９１）−Ｖａｌ（配列番号１８５）［クローンｐＢＦＢ２３２］。Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍを使用した発現に続いて、発光活性を外因性ｃＡＭＰの存在下又は非存在下で測定した。ｃＡＭＰの存在下において測定された活性は、７５９５ＲＬＵ；ｃＡＭＰの非存在下において測定された活性は２９８ＲＬＵ（約２５倍変化）であった。これらの結果は、追加的ドメインをバイオセンサーの生成においてＣＰＭ ｈＲＬ構築物中で使用できることを示唆している。この型の試薬は、生体細胞中のｃＡＭＰ濃度の変化のモニタリングを可能にでき、そのアッセイ形式において既存のＦＲＥＴに基づくｃＡＭＰバイオセンサーを超える明確な利点も提供できる。さらに、ＧＡＦドメインは、広範な分子の結合に関与する天然において高度に保存された折りたたみであることから、この折りたたみを使用して追加的な型のＣＰＭ ｈＲＬバイオセンサーを作製できる可能性がある。
（実施例１７）
レニラルシフェラーゼ中の改変の多重部位を使用するｃＡＭＰバイオセンサー
一次構造Ｍｅｔ−（ｈＲＬ９２〜３１１）−ＧＳＴＧ−ＲＩＩβＢ−ＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＴＳＧＧＳＧＧＳＳＧ（ｈＲＬ２〜９１）−Ｖａｌ（配列番号１８６；ＲＩＩβＢは、ＩＩベータ型ヒトＰＫＡ調節ドメインアミノ酸２６６〜４１４由来のＢ ｃＡＭＰ結合ドメイン）を有するレニラルシフェラーゼの円順列置換突然変異体を有するｃＡＭＰバイオセンサーは、ｃＡＭＰへの結合で発光活性の増大を示した。類似構築物、「分断（ｓｐｌｉｔ）」タンパク質又は円順列置換タンパク質のいずれも、追加的な残基で改変されたレニラルシフェラーゼ突然変異体を使用して生成できる。結果として、以下の型：Ｍｅｔ−（ｈＲＬ Ｘ−３１１）−ＧＳＴＧ−ＲＩＩβＢ−ＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＴＳＧＧＳＧＧＳＳＧ（ｈＲＬ２−Ｙ）−Ｖａｌ（ＧＳＴＧは、配列番号１２２に対応し、：ＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＴＳＧＧＳＧＧＳＳＧは、配列番号１２３に対応する）の融合タンパク質をコードする１４個の独立した円順列置換構築物を検査した。以下の表は、１４個の構築物についてのＸ／Ｙ値を提供する。
Figure 0005684984
これらの構築物のうち４つを除く全てについて、部位は、１ＢＮ６（ロドコッカスｓｐ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ））及び２ＤＨＤ（キサントバクター・アウトロフィカス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ））ハロアルカンデハロゲナーゼ結晶構造を鋳型として使用する、レニラルシフェラーゼの相同性モデルを円順列置換のために使用して、溶媒暴露表面のループ中で選択した。溶媒暴露表面のループは、例えば円順列置換などの改変の部位として、タンパク質の核中に埋まっている部位又はアルファ若しくはベータ構造中に含まれる部位よりもさらに改変され易い可能性がある。この仮説は、２５５での円順列置換を有するホタルルシフェラーゼ構築物について観察される活性の欠失によって支持される、ここでＴｙｒ２５５は、タンパク質の核中に埋まっているアルファヘリックスの構成要素である。構築物のこのコレクションは、相同性モデル構造において明らかになった、全てではないが、いくつかの表面を代表している。４つのＣＰＭ部位：９１、１１１、２２３及び２２９は、既報（Ｋａｉｈａｒａら、２００３年、Ｒｅｍｙら、２００５年及びＰａｕｌｍｕｒｕｇａｎら、２００３年）に基づいて選択した。構築物は、ＴＮＴ Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ又はＴｎＴ Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍを使用して発現させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで検査した（図３５及び３６）。
結果は、円順列置換の異なる多数の部位を、ｃＡＭＰバイオセンサーなどのバイオサンサーを生成するために使用できることを示唆している。円順列置換の代替部位は、活性の非誘導／誘導でのレベルが９１での円順列置換を有する初期構築物（ＣＰＭ９１）を超えたことで同定した。加えて、構築物は、発光活性における発光量比がＣＰＭ９１を超えた場合に同定した。加えて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現された場合のＣＰＭ９１の非常に低い溶解性により、追加的な構築物は、この構築物と比較して増大した溶解性について検査される。増大した溶解性は、ｃＡＭＰ検出試薬などのｉｎ ｖｉｔｒｏバイオセンサーの開発を促進する可能性がある。
結果は、多数の部位が、円順列置換のために有用でないことも示唆している。１６９から２７４残基の間の全ての部位は、低く誘導された及び誘導されない活性を有し、発光活性における発光量比は、約２倍又はそれより低かった。
構築物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現（Ｔ７プロモーター）及び哺乳類発現（ＣＭＶプロモーター）の両方を可能にするベクター骨格（ｐＦ５Ａ；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）中に設計した。様々なＭｅｔ−（ｈＲＬ Ｘ−３１１残基）−ＧＳＴＧ−ＲＩＩβＢ−ＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＴＳＧＧＳＧＧＳＳＧ−（ｈＲＬ ２−Ｙ残基）−Ｖａｌ（ＧＳＴＧは、配列番号１２２に対応する；ＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＴＳＧＧＳＧＧＳＳＧは、配列番号１２３に対応する）構築物（ｐＢＦＢ２７６、ｐＢＦＢ２７７、ｐＢＦＢ２７８、ｐＢＦＢ２７９、ｐＢＦＢ２８０、ｐＢＦＢ２８７）をコードするＤＮＡでの一過性トランスフェクションに続いて、ＨＥＫ２９３細胞を内在性アデニルシクラーゼを活性化するために１００μＭ フォルスコリンで処理した。１４分間のインキュベーションに続いて、発光を生体細胞集団から測定した。予想された通り、様々な構築物が生体細胞内でｃＡＭＰバイオセンサーとして機能した。興味深いことに、構築物ＣＰＭ３１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで最も高い発光量比を示したが、細胞内ではそうではなかった。しかし一般的には、光出力及び発光量比は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで類似の傾向を示した（図３７）。
（実施例１８）
多数の異なる遺伝子構築物を、分泌シグナルとして作用するＮ末端ペプチド１７アミノ酸を欠失しているガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＡＧ５４０９５；アミノ酸１８〜１８５）を使用するバイオセンサーの作製の可能性を検査するために調製した。Ｎ末端シグナルペプチドを有するか又は有さないガウシアルシフェラーゼは、生体細胞から測定した場合に他のルシフェラーゼと比較してさらに強い光強度を与えると報告されている（Ｔａｎｎｏｕｓら、２００５年；Ｒｅｍｙら、２００６年）。加えて、Ｇｌｕｃの断片は、タンパク質相補性の系において使用されており（「１１０アミノ酸残基でのＧｌｕｃ分断（Ｇｌｕｃ ｓｐｌｉｔ ａｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅ １１０）」Ｒｅｍｙら、２００６年）；したがって、Ｇｌｕｃもこの部位又は他の部位で円順列置換され易い可能性がある。
Ｇｌｕｃ ｃＡＭＰバイオセンサーを調製するために、タンパク質の二次構造予測を、Ｇｌｕｃ円順列置換の様々な部位を選択するために使用した：Ｍｅｔ−（Ｇｌｕｃ Ａ−１８５）−（リンカーＸ）−（ヒトＲＩＩｂｅｔａＢ Ｇｅｎｂａｎｋ ＢＣ０７５８００ ２６６〜４１４アミノ酸残基）−（リンカーＹ）−（Ｇｌｕｃ １８−Ｂ）。
Figure 0005684984
ここで、様々なリンカー組合せが有する配列：
Figure 0005684984
Ｇｌｕｃ ｃＡＭＰに有用な部位は、この円順列置換の部位を使用する他の分子についてのバイオセンサーを生成するために置換できる。さらに、カイアシ類ルシフェラーゼにおいて円順列置換され易い部位は、メトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）由来のルシフェラーゼなどの他のカイアシ類ルシフェラーゼにおいて有用である可能性がある。
（実施例１９）
細胞に基づくＧＰＣＲアッセイの方法は、細胞内シグナル伝達事象の直接検出を含みうる。最も成功したのは、細胞内カルシウムのリアルタイムモニタリングのための蛍光色素又はエクオリンを使用する方法である。しかし、類似の技術は、細胞内ｃＡＭＰダイナミクスの検出が欠けている。プロテインキナーゼＡのアロステリックＲＩＩβＢ ｃＡＭＰ結合ドメインを有する円順列置換ホタルルシフェラーゼは、ｃＡＭＰの濃度に比例して光を発することができるセンサーである。このセンサーを使用する生体細胞、ゼロステップＧＰＣＲアッセイは、安定に、又は一過性にトランスフェクトした細胞系を使用してｃＡＭＰ濃度変化の動的な検出を可能にする。加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｃＡＭＰの検出のためのシングルステップの同種のアッセイ形式を開発することが可能である（図３８）。
「ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ」と称されるバイオセンサーのクラスでの、ｐＢＦＢ１３５由来のＯＲＦを、以下に記載する一過性の及び安定な細胞系を生成するために使用した。これらの細胞系は、「ＣＰ２３４−Ｌｕｃ／ＲＩＩＢ」、「ｃＡＭＰ ＬｕｃＳｅｎｓｏｒ」、「ＬｕｃＳｅｎｓｏｒ」及び「ＦＦ ｃＡＭＰ Ｓｅｎｓｏｒ」と称される。
ＣＰ２３４−Ｌｕｃ／ＲＩＩＢ（ｐＢＦＢ１３５由来ＯＲＦ）を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を、完全培地に再懸濁し、５ｍＭルシフェリン−ＥＦと混合した。細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり細胞１×１０５個で蒔き、１．５時間、室温に平衡化した。フォルスコリンでの刺激後、１５分で発光を、ＧｌｏＭａｘ（商標）Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して測定した。結果は、本アッセイがフォルスコリンについて０．３６μＭのＥＣ５０値を生じたことを示した（図３８）。
Ｚ’測定のために、３８４ウェルプレートに１ウェル当たり細胞２×１０４個を分注し、同様の手順で平衡化した。プレートの半分は、２０μＭフォルスコリンで誘導したが、残りの半分は誘導しなかった。発光を誘導の１５分後にＴＥＣＡＮ ＧＥＮｉｏｓ Ｐｒｏ（商標）ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して捕捉した。誘導の比は、６．１であり、Ｚ’は、０．８３であった。Ｚ’が０．５を超えるアッセイは、ハイスループットのスクリーニング（ＨＴＳ）のために良い品質であると考えられることから、ｃＡＭＰバイオセンサーに基づくアッセイはＨＴＳに適している。
ドーパミンＤ１受容体を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を、ＣＰ２３４−Ｌｕｃ／ＲＩＩＢ又はＲ３６１Ｋ突然変異体（ｃＡＭＰ結合ドメイン中に突然変異）（それぞれｐＢＦＢ１３５及びｐＢＦＢ１４７由来のＯＲＦ）をコードするプラスミドＤＮＡで一過性にトランスフェクトした。細胞を既に記載の通りルシフェリン−ＥＦと共にプレートに蒔き、平衡化し、ＬＯＰＡＣライブラリー（プレート６）由来の化合物を各ウェルに加えた（１０μＭ）。５０分間のインキュベーションに続いて、プレートをＴＥＣＡＮ ＧＥＮｉｏｓ Ｐｒｏ（商標）ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒで読み取った。ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ（ＣＲＥ反応エレメント）を使用することでも同定されたヒットを赤で示す（図３９）。ｃＡＭＰバイオセンサーアッセイによって同定されたほとんどのヒットは、ＣＲＥ−Ｌｕｃレポーターアッセイによって同定されたヒットと相関しており、ｃＡＭＰバイオセンサーＧＰＣＲアッセイの生物学的な妥当性を確認している。
細胞は、ルシフェリン−ＥＦと共にプレートに蒔き、平衡化し、次いで化合物の添加後４０分で発光をＧｌｏＭａｘ（商標）Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して測定した。ｃＡＭＰバイオセンサーアッセイを使用して導いた薬物動態学的パラメータ、ＥＣ５０及びＩＣ５０値は、他の方法を使用した文献における報告と良く相関し、再度ｃＡＭＰバイオセンサーＧＰＣＲアッセイの生物学的な妥当性を確認している（図４０）。
反応は、異なる温度で（図４２）、並びに様々なアゴニスト及びアンタゴニストと共に（図４３）インキュベートした細胞においても検査した。ｃＡＭＰ ＬｕｃＳｅｎｓｏｒ（ｐＢＦＢ１３５由来のＯＲＦ）及びドーパミンＤ１受容体を発現しているＨＥＫ２９３細胞を、ルシフェリンと共に１．５時間、室温又は３７℃でインキュベートし、次いでアゴニスト又はアンタゴニストと接触させた。反応をルミノメーターで測定した。細胞を生理学的条件下、例えば３７℃及びＣＯ２でインキュベートした場合に、化合物へのさらに迅速且つ動的な反応があった。３７℃での結果は、細胞内ｃＡＭＰ動態について予想されたものと質的に類似していた。室温では、大規模スクリーニングに有用でありうる、低いダイナミックレンジで遅い反応であった。
図４４は、ｃＡＭＰ ＬｕｃＳｅｎｓｏｒで安定にトランスフェクトし、且つ異なる量のドーパミンと接触させた細胞における発光量比の時間経過を示している。結果は、系が、生体細胞中でリアルタイムでのｃＡＭＰ動態のモニタリングを可能にすることを示している。さらに図４５の結果は、系が、化合物の有効性の評価を可能にしており、それが異なる時点で比較的一致していることを示している。図４６は、有効性順位（ＥＣ５０）及び様々なアゴニストに対する結果を提供し、いくつかの化合物が部分的にアゴニストであることを示している。アンタゴニスト有効性（ＩＣ５０）についてのデータを図４７に示す。
ｃＡＭＰ ＬｕｃＳｅｎｓｏｒは、既に宿主細胞で発現されたＧＰＣＲ（内在性ＧＰＣＲ）の調節の測定にも使用できる。一例を、ベータ２−アドレナリン受容体を発現しており、且つｃＡＭＰ ＬｕｃＳｅｎｓｏｒで安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を使用して示す。ドーパミン受容体についての記載と同様の手順に従って、図４８〜４９は、様々なアゴニスト及びアンタゴニストの有効性順位をそれぞれ示した。
３種の生物発光のＧＰＣＲアッセイの比較を実施した。これらのアッセイの結果及びアゴニストを、図５０に示す。アンタゴニストでの３種の生物発光のアッセイの結果を図５１に示す。検査した化合物についての順位は、３種全てのアッセイにおいて同じであった。
ｃＡＭＰ存在下でのｃＡＭＰ ＬｕｃＳｅｎｓｏｒの発光の増大は、「開（ｏｐｅｎ）」から「閉（ｃｌｏｓｅｄ）」への立体構造変化における効率の増大の結果である可能性がある。
ドーパミンＤ１受容体を安定に発現しているＨＥＫ２９３細胞を、ＣＭＶプロモーター（２０１３２５．７８．Ｅ５）又はＴＫプロモーター（２０１３２５．４４．Ｈ６）の下でＣＰＭ−ｈＲＬ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ Ｘ＝４、Ｙ＝２０をコードするプラスミドＤＮＡでも一過性にトランスフェクトし、次いで、フォルスコリン、ＳＫＦ３８３９３又はドーパミンのいずれかで刺激した。野生型レニラルシフェラーゼ及びＲＩＩβＢドメインを含まないＣＰＭ−ｈＲＬ Ｌｕｃも、検査し、ｃＡＭＰ調節に特異的な反応を示さなかった（データは未記載）。細胞は、Ｔ７５フラスコ中でＴｒａｎｓＩｔ（登録商標）−ＬＴ１ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＭＩＲＵＳ）で、フラスコ１個当たり、ＴｒａｎｓＩｔ（登録商標）−ＬＴ１ ｒｅａｇｅｎｔ ６０μＬ及びＤＮＡ ３０μｇを使用してトランスフェクトし、一晩増殖させ、翌日にアッセイした。トランスフェクションから１日程度後、細胞をインキュベーターから出し、トリプシン処理し、カウントし、且つ１ウェル当たり細胞１００００個を９６ウェルプレート中の１０％ ＦＢＳ及び６０μＭ ＥｎｄｕＲｅｎ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に蒔いた。ＥｎｄｕＲｅｎ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をＤＭＳＯ １００μＬに再構成し、あらかじめ温めた完全培地に最終濃度６０μＭで加えた。次いで細胞を少なくとも１時間、３７℃でインキュベートし、次いで室温に冷ました。室温で１５分後、発光のベースライン測定を、９６ウェルＧｌｏＭａｘ（商標）Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して１ウェル当たり０．５秒間で行った。次いで、細胞をフォルスコリン（Ｓｉｇｍａ）、ＳＫＦ３８３９３（Ｓｉｇｍａ）、ドーパミン（Ｓｉｇｍａ）の完全培地中に作製した１０×保存液で誘導したか、又は、誘導せず（０．１％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ））、発光を約３０分間継続的に測定した。フォルスコリン、ドーパミン又はＳＫＦ３８３９３の１濃度当たり４回反復のセットで試料を測定した。ＥＣ５０データは、インダクションの１５分後で表しており、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ｖｅｒｓｉｏｎ４を使用して算出した。
ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢバイオセンサーと同様に、ＣＰＭ−ｈＲＬ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ Ｘ＝４、Ｙ＝２０バイオセンサー（２０１３２５．４４．Ｈ６及び２０１３２５．７８．Ｅ５）を使用して導いたＥＣ５０値は、他の方法を使用した文献における報告と良く相関し、再度ｃＡＭＰバイオセンサーＧＰＣＲアッセイの生物学的な妥当性を確認している（図５２Ａ〜Ｄ）。
（実施例２０）
ＣＰＭ−ｈＲＬ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰバイオセンサーを使用するｃＡＭＰ濃度変化の細胞内検出
細胞培養
細胞は、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２ ２ｍｌ中に３７℃、５％ＣＯ２で６ウェルプレートで培養した。
プラスミド
実施例１７に記載の３種の構築物をｃＡＭＰ濃度の細胞内変化の検出に使用した。使用した構築物は、ｐＢＦＢ２７７、ｐＢＦＢ２７９及びｐＢＦＢ２８７であった。ＣＰＭ９１−ｈＲＬ／ＲＩＩβＢ（２０１３２５．４４．Ｈ６由来のＯＲＦを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞をこれらの実験にも使用した。
トランスフェクション
ＨＥＫ２９３細胞を、ＴｒａｎｓＩｔ（登録商標）−ＬＴ１ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＭＩＲＵＳ）で、６ウェルプレートの１ウェル当たり、ＴｒａｎｓＩｔ（登録商標）−ＬＴ１ ｒｅａｇｅｎｔ ６μＬ及びＤＮＡ（ｐＢＦＢ２７７、ｐＢＦＢ２７９及びｐＢＦＢ２８７）２μｇを使用してトランスフェクションした。細胞は、一晩増殖させ、翌日アッセイした。
バイオセンサーの調節
トランスフェクションの１日程度後、細胞をトリプシン処理し、１％ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む新鮮ＤＭＥＭ／Ｆ１２中に再懸濁し、１ウェル当たり細胞１００００個程度で９６ウェルプレートに蒔いた。別法として、ＣＰ９１−ｈＲＬ／ＲＩＩβＢを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞系を１ウェル当たり細胞１００００個程度で９６ウェルプレートに蒔いた。６００μＭ ＥｎｄｕＲｅｎの１０μＬ一定分量を細胞培養物の合計１００μＬに加え、最終濃度５．５μＭ程度のＥｎｄｕＲｅｎを得た。細胞を次いで３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。５時間後、プレートをインキュベーターから出し、少なくとも２０分間室温に冷却した。２０分後、発光のベースライン測定値を９６ウェルＶｅｒｉｔａｓ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；１ウェル当たり０．５秒間の積分時間）を使用して測定した。次いで、細胞を１０μＭイソプレテレノール（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）、５０μＭフォルスコリン（Ｓｉｇｍａ）で誘導したか、又は、誘導せず（０．１％ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ）、発光を約３０分間継続的に測定した。３０分後、１０μＭプロプラノロール（Ｓｉｇｍａ）を既にイソプレテレノールで誘導した細胞に加え、他の全ての試料には、０．１％ＤＭＳＯを加えた。続く３０分間、発光を継続的に測定した。５０μＭ フォルスコリンの最後の添加をイソプレテレノール／プロプラノロール試料に加え、他の全ての試料に０．１％ＤＭＳＯを加えた。次いで、続く半時間、発光を継続的に測定した。試料は、４〜６回反復のセットで測定した。イソプレテレノール、プロプラノロール、フォルスコリン及びＤＭＳＯの１０×保存物は、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中に作製した。
結果
ｃＡＭＰの細胞内濃度の変化を測定するために、ＨＥＫ２９３細胞を３種のＣＰＭ−ｈＲＬ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ（Ｘ＝４、Ｙ＝２０）構築物（レニラルシフェラーゼの異なる配列位置で円順列置換した）で一過性にトランスフェクトし、続いて、ＧＰＣＲ活性化を通じて細胞内ｃＡＭＰ濃度を増大させる（イソプレテレノール、β−アドレナリン受容体アゴニスト）、ＧＰＣＲ阻害を通じて細胞内ｃＡＭＰ濃度を減少させる（プロプラノロール、β−アドレナリン受容体アンタゴニスト）又はアデニルシクラーゼの活性化を通じて細胞内ｃＡＭＰ濃度を増大させる（フォルスコリン）ことが既知である化合物で処理した。イソプレテレノール処理及びフォルスコリン処理の両方は、細胞内ｃＡＭＰ濃度の増大を反映して、トランスフェクトした細胞からの光出力を単独で２倍程度増大させた（図５３）。加えて、ｃＡＭＰ濃度の変化への時間的変化が、イソペルテレノールに続いてプロプラノロール、続いてフォルスコリンで細胞を処理することによって観察された（図５３）。レニラルシフェラーゼバイオセンサーを使用するｃＡＭＰ調節の検出も、ＣＰＭ９１−ｈＲＬ／ＲＩＩβＢを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞において示された。これらのデータは、イソプレテレノール及びフォルスコリンでの処理への反応において光出力の約５倍の増大を示した（図５３）。一過性にトランスフェクトした細胞と同様に、ｃＡＭＰ濃度の変化への時間的変化が、細胞をイソペルテレノールに続いて、プロプラノロール、続いてフォルスコリンで処理することによって観察された（図５３）。
（実施例２１）
順列置換していないホタルルシフェラーゼｃＡＭＰバイオセンサー
改変に寛容である部位、例えば２３３／２３４、３５５／３５９、８２／８３及び３０７／３０８残基の間に直接挿入したＲＩＩβＢを有する、様々な順列置換していないホタルルシフェラーゼ構築物を調製した。以下の融合タンパク質をコードするＤＮＡをベクターｐＦ９Ａにクローニングした：
Figure 0005684984
タンパク質は、これらの構築物からＴｎＴ Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍを使用して発現させた。発現に続いて、ＴＮＴ反応物９μＬを、１ｍＭ ｃＡＭＰ保存液又はＨ２Ｏ １μＬと混合し、反応物を１５分間程度室温でインキュベートした。インキュベーションに続いて、溶液２μＬを９６ウェルプレートの個々のウェルに３回反復で分注した。発光をＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ １００μＬの注入に続いてＧｌｏｍａｘ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して測定した（積分時間０．５秒間）。
結果は、ｃＡＭＰバイオセンサーは、選択された４つの挿入部位のいずれかへのＲＩＩβＢの直接挿入によって生成できることを示している（図５４参照）。結果は、円順列置換に寛容である部位は、生存可能なバイオセンサーを生成するための直接挿入にも寛容であると明らかになったことも示している。
（実施例２２）
順列置換した及び順列置換していないヒオドシエビルシフェラーゼｃＡＭＰバイオセンサー
ヒオドシエビ（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ）ルシフェラーゼ（ＯｐＬｕｃ）は、セレントラジンの酸化を触媒し、青色光を発する。成熟型酵素は、１８．７ｋＤａ（１６９ａａ）である。本来のＯＲＦは、分泌のためのシグナルペプチドと推定される２７個の余分の残基を含む。２７ａａ推定シグナルペプチドの除去は、ルシフェラーゼ活性の約５０倍の増大を生じる。それが低分子であることから、ＯｐＬｕｃは、バイオセンサーとして又はＰＣＡにおける使用に特に適している。
ＯｐＬｕｃは、ＴｎＴ無細胞抽出物又は大腸菌可溶化物中に存在する場合、活性且つ安定である。しかし、精製の際に速やかに不活性化する。ゲル濾過は、ルシフェラーゼ（天然の生物中に見出された３５ｋＤタンパク質を含まずに大腸菌で発現された）が、１３．７と２９ｋＤのタンパク質スタンダードの間に溶出したことを示した。酵素のＭＷは、１８．７ｋＤである。したがって、３５ｋＤタンパク質無しで発現された場合、ルシフェラーゼが単量体として維持されていることは、明らかである。酵素は、ｐＨ７．５〜９で活性であり、活性は、ｐＨ９．５で減少し始める。
改変に寛容である部位、例えば５０／５１及び８４／８５残基の間に直接挿入したＲＩＩβＢを有する、順列置換していない様々なヒオドシエビルシフェラーゼ（ＯｐＬｕｃ）構築物を調製した。以下の融合タンパク質をコードするＤＮＡをベクターｐＦ５Ｋにクローニングした：
Figure 0005684984
タンパク質は、これらの構築物からＴｎＴ Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍを使用して発現させた。発現に続いて、ＴＮＴ反応物９μＬを、１ｍＭ ｃＡＭＰ保存液又はＨ２Ｏ １μＬと混合し、反応物を１５分間程度室温でインキュベートした。インキュベーションに続いて、２×緩衝液（３００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、２００ｍＭチオ尿素）１０μＬを各反応物に加え、発光を、Ｒｅｎｉｌｌａ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ １００μＬの添加に続いて、得られた溶液２０μＬからＴｕｒｎｅｒ ２０／２０Ｎ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して測定した（積分時間１秒間）。結果を以下の表に示す：
Figure 0005684984
他のベクターは、Ｔ７及びＣＭＶプロモーター下での発現を可能にするために、ｐＦ４Ｋ−ＣＭＶプラスミドにクローニングしたＲＩＩβＢドメインを有するヒオドシエビルシフェラーゼ（ＯｐＬｕｃ）の円順列置換突然変異体を含む。改変に寛容な部位に挿入されたＲＩＩβＢを有する、様々な円順列置換ヒオドシエビルシフェラーゼ（ＯｐＬｕｃ）構築物も調製した（ＣＰＭ ＯｐＬｕｃ／ＲＩＩβＢ）。図６３を参照。カッコ内の数字は、成熟型ヒオドシエビルシフェラーゼにおけるアミノ酸残基に対応する。整数「４」、「１０」及び「２０」は、リンカーの対応する長さを示す。Ｍｅｔ及びＶａｌ残基をルシフェラーゼのＮ末端に加えたことに注意されたい。したがって、円順列置換突然変異体における各分断の配列位置は、アミノ酸２残基移動する。例えば、分断マーカー「５０〜５１」（酵素の天然成熟型における残基順を表す）は、使用された実際のルシフェラーゼバージョンにおいては、５２と５３残基との間で生じる。
ｐＦ４Ｋ−ＣＭＶ−［５１−１６９］−４−ＲＩＩβＢ−４−［１−５０］−ＯｐＬｕｃ
ｐＦ４Ｋ−ＣＭＶ−［５１−１６９］−１０−ＲＩＩβＢ−１０−［１−５０］−ＯｐＬｕｃ
ｐＦ４Ｋ−ＣＭＶ−［５１−１６９］−２０−ＲＩＩβＢ−２０−［１−５０］−ＯｐＬｕｃ
ｐＦ４Ｋ−ＣＭＶ−［８５−１６９］−４−ＲＩＩβＢ−４−［１−８４］−ＯｐＬｕｃ
ｐＦ４Ｋ−ＣＭＶ−［８５−１６９］−１０−ＲＩＩβＢ−１０−［１−８４］−ＯｐＬｕｃ
ｐＦ４Ｋ−ＣＭＶ−［８５−１６９］−２０−ＲＩＩβＢ−２０−［１−８４］−ＯｐＬｕｃ
ｐＦ４Ｋ−ＣＭＶ−［１１３−１６９］−４−ＲＩＩβＢ−４−［１−１１２］−ＯｐＬｕｃ
ｐＦ４Ｋ−ＣＭＶ−［１１３−１６９］−１０−ＲＩＩβＢ−１０−［１−１１２］−ＯｐＬｕｃ
ｐＦ４Ｋ−ＣＭＶ−［１１３−１６９］−２０−ＲＩＩβＢ−２０−［１−１１２］−ＯｐＬｕｃ
ｐＦ４Ｋ−ＣＭＶ−［ｌ３５−１６９］−４−ＲＩＩβＢ−４−［１−１３４］−ＯｐＬｕｃ
ｐＦ４Ｋ−ＣＭＶ−［１３５−１６９］−１０−ＲＩＩβＢ−１０−［１−１３４］−ＯｐＬｕｃ
ｐＦ４Ｋ−ＣＭＶ−［１３５−１６９］−２０−ＲＩＩβＢ−２０−［１−１３４］−ＯｐＬｕｃ
全長ヒオドシエビルシフェラーゼＯＲＦでクローニングされた（ＤＮＡ２．０によって）ｐＪ１５：４８０９−ＯｇＬｕｃ−２．７ｋｂプラスミド
成熟ヒオドシエビルシフェラーゼＯＲＦ（２７ａａシグナルペプチドは除去）のＯＲＦを有する（ＤＮＡ２．０によって）ｐＪ１５：４８１０−２．６ｋｂプラスミド
ｐＦ１Ｋ−ＯｇＬｕｃＳ−３．７ｋｂ。全長ヒオドシエビルシフェラーゼＯＲＦをｐＦ１Ｋにクローニングした（ＦＬ ＯｐＬｕｃ）。
ｐＦ１Ｋ−ＯｇＬｕｃ−３．６ｋｂ。成熟ルシフェラーゼのＯＲＦをｐＦ１Ｋにクローニングした。
ｐＦ１Ｋ−ＯｐＬｕｃＤＮ−３．６ｋｂ。Ｎ末端の最初の４残基を除去した以外はｐＦ１Ｋ−ＯｇＬｕｃと同一。
ｐＦ１Ｋ−ＯｐＬｕｃＤＣ−３．６ｋｂ。Ｃ末端の最後の３残基を除去した以外はｐＦ１Ｋ−ＯｇＬｕｃと同一。
ｐＦ１Ｋ−ＯｐＬｕｃＤＮＤＣ−３．６ｋｂ。Ｎ末端の最初の４残基及びＣ末端の最後の３残基を除去した以外はｐＦ１Ｋ−ＯｇＬｕｃと同一。
ｐＦＶＤｎＫ−ＯｇＬｕｃＳ−４．４ｋｂ。ＨａｌｏＴａｇを全長ルシフェラーゼＯＲＦと融合した。
ｐＦＶＤｎＫ−ＯｇＬｕｃ−４．５ｋｂ。ＨａｌｏＴａｇを成熟ルシフェラーゼＯＲＦと融合した。
ｐＦＮ６Ｋ−ｏｐＬｕｃ−３．６ｋｂ。ＨＱ−ｔａｇを成熟ルシフェラーゼのＯＲＦのＮ末端に導入した。
ＣＰＭ ＯｐＬｕｃ／ＲＩＩβＢ構築物の等量（反応混合物５０μｌ当たりプラスミド０．１μｇ；図６４）をｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ＴｎＴ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｌ１１７０）で発現させた。ＴｎＴ反応終了後、ｃＡＭＰを最終濃度０．１ｍＭで加え、混合物をさらに室温で１５分間インキュベートした。反応物をＲｅｎｉｌｌａ ｌｙｓｉｓ緩衝液で１０倍に希釈し、ルシフェラーゼ活性を推奨の通り、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅａｇｅｎｔ中で測定した（Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、＃Ｅ２８１０、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）。
ルシフェラーゼ活性の誘導を４種全ての円順列置換ルシフェラーゼ構築物で観察した（図６４）。８４と８５残基の間で分断されたルシフェラーゼを有する構築物は、最も高い誘導を示した（約２５０倍）。２０アミノ酸リンカーは、最も有効な折りたたみを補助した。
結果は、ｃＡＭＰバイオセンサーは、円順列置換又は、上記で選択した任意の挿入部位へのＲＩＩβＢの直接挿入のいずれによっても生成できることを示している。
（実施例２３）
ヒオドシエビルシフェラーゼとのタンパク質相補性
タンパク質の相補性において有用であるヒオドシエビルシフェラーゼ中の部位を決定するために、Ｎ末端及びＣ末端融合物を調製した。ベクター骨格は、ｐＦ３Ａをｉｎ ｖｉｔｒｏ実験のために、及びｐＦ５Ｋを細胞実験のために含んでいた。以下の構築物を調製した：「Ｎ ｔｅｒｍ−ＦＲＢ」、すなわちＯｐＬｕｃ（１〜５０又は１〜８４）１０ａａ Ｇ／Ｓリンカー−ＦＲＢ、「ＦＫＢＰ−Ｃ ｔｅｒｍ」、すなわちＦＫＢＰ−（Ｇ４Ｓ）２リンカー−ＯｐＬｕｃ（５１〜１７０又は８５〜１７０）、「ＦＲＢ−Ｎ ｔｅｒｍ」、すなわちＦＲＢ−（Ｇ４Ｓ）２リンカー−ＯｐＬｕｃ（１〜５０又は１〜８４）及び「Ｃ ｔｅｒｍ−ＦＫＢＰ」、すなわちＯｐＬｕｃ（５１〜１７０又は８５〜１７０）−１０ａａ Ｇ／Ｓリンカー−ＦＫＢＰ。以下の表を参照。
Figure 0005684984
タンパク質は、３０℃、２時間でＴｎＴ（登録商標）ＳＰ６ Ｈｉｇｈ−Ｙｉｅｌｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、を使用して単独で発現させたか又は同時発現させた（製造者の手順書の通りの量で；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）。可溶化物２０μＬを＋／−１μＭラパマイシンで室温、１５分間インキュベートした。１０μＬ可溶化物を２×ＨＥＰＥＳ／チオ尿素中に１：１で希釈し、５μＬを９６ウェルプレートのウェルに３回反復で入れた。インジェクターでＲｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒ−ＬＡＲ）１００μＬを添加することによって発光を測定した。配列位置５０／５１（５０−ＦＲＢ＋ＦＫＢＰ−５１）での分断についてのｉｎ ｖｉｔｒｏの結果を図５６に示し、８４／８５（８４−ＦＲＢ＋ＦＫＢＰ−８５）についての結果を図５８に示す。図５７及び５９は、それぞれのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。−／＋ラパマイシン可溶化物５μＬは、４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで大きさによって分画した。図６１〜６２は、５１−ＦＫＢＰ＋ＦＲＢ−５０及び８５−ＦＫＢＰ＋ＦＲＢ−８５の向きにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏでの結果を示す。図６２におけるデータについて、７．５μＬ＋／−ラパマイシン可溶化物は、４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで大きさによって分画した。
図６０は、ＨＥＫ２９３細胞を使用した細胞内での結果を表す。ＨＥＫ２９３細胞を、ヒオドシエビルシフェラーゼの相補断片又は個々の断片で６ウェルプレートにおいて一過性にトランスフェクションし、一晩インキュベーションした。翌日、細胞をトリプシン処理し、１ウェル当たり細胞２００００個で９６ウェルプレートに蒔いた。同時に、１μＭラパマイシン又は媒体（ＤＭＳＯ）を細胞に加え、それらを３７℃、５％ＣＯ２で一晩回復させた。翌日、培地を除去し、１×Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ ２０μＬを各試料に加え、プレートを１５分間、５００ｒｐｍで震盪した。Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ １００μＬを各ウェルに注入し、試料を０．５秒遅延で１ウェル当たり３秒で測定した。
（実施例２４）
ＣＰＭホタルルシフェラーゼ（ＦＦ Ｌｕｃ）及びレニラルシフェラーゼ（ｈＲＬ Ｌｕｃ）もバイオセンサーとして、キナーゼ／ホスファターゼ活性をアッセイするために使用した。ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ及びカルシウムの前述のバイオセンサーと同様の方法で、円順列置換した様々な（ＣＰＭ）ＦＦ Ｌｕｃ及びｈＲＬ Ｌｕｃ構築物を、チロシン、又はセリン／スレオニンキナーゼによるリン酸化（下記の構築物において、それぞれ下線を付けたＴｒｙ又はＴｈｒ残基でのリン酸化）を検出するために作製した。つながれたリン酸化ペプチド認識ドメインと、リン酸化されたペプチド配列との結合によって生じる立体構造変化は、融合したバイオセンサーのルシフェラーゼ活性の調節を可能にできる。これは、おそらく既存のＦＲＥＴに基づくバイオセンサーと比較して増強された性能特性を有し、キナーゼの活性を測定できる新しい種類の試薬を示している。
チロシンキナーゼ及びセリン／スレオニンキナーゼについて使用されるペプチド配列及び認識ドメインは、それぞれ：リン酸化ペプチド認識ドメイン、ヒトＳｒｃ ＳＨ２ドメイン（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ＿００５４１７；１５１〜２４８ａａ残基）を有するペプチドＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＥＩＹＧＥＦ（配列番号２９５）又はＥＩＹＧＥＦ（配列番号２９６）、及びＲａｄ５３ｐ由来リン酸化ペプチド認識ドメイン、ＦＨＡ２（１７１７〜２１８６塩基を整列したＧｅｎｂａｎｋアクセション＃ＡＹ６９３００９の核酸配列のコドンを最適化したバージョン；アクセション＃ＡＡＴ９３０２８の５７３〜７３０ａａ残基）を有するＲＫＲＤＲＬＧＴＬＧＩ（配列番号２９７）であった。
ＦＦ Ｌｕｃ及びｈＲＬ Ｌｕｃにおいてバイオセンサーを生成するための機能として既に同定したＣＰＭについての多重部位を、キナーゼバイオセンサーの構築のために使用した。これらの構築物は、特有の制限酵素部位に連結したＰＣＲ産物又は、オーバーラップ伸長ＰＣＲによるスプライシング（ＳＯＥ−ＰＣＲ）のいずれかを使用して作製した。ＦＦ Ｌｕｃ構築物は、ｐＦ９Ａ骨格に、及びｈＲＬ Ｌｕｃ構築物は、ｐＦ５Ａ骨格に作製したが、実施例２において記載した改変ｐＧＬ４．７４骨格に作製したプラスミドｐＢＦＢ１７４、１７５、１７６、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、２２８、２２９及び２３０は、除く。
以下の構築物を作製した：Ｍｅｔ−（Ｌｕｃ２．０又はｈＲＬ Ｃ末端断片）−（リンカーＸ）−（キナーゼによってリン酸化されたペプチド）−（リンカー）−（リン酸化ペプチド認識ドメイン）−（リンカーＹ）−（Ｌｕｃ２．０又はｈＲＬ Ｎ末端断片）−Ｖａｌ。構築物は、キナーゼでリン酸化されたペプチドと、リン酸化ペプチド認識ドメインの順序を変えても作製した。加えて、チロシンキナーゼＦＦ Ｌｕｃ バイオセンサーについて以下の構築物を作製した：Ｍｅｔ−（キナーゼでリン酸化された短ペプチド）−（リンカーＸ）−（Ｌｕｃ２．０）−（リンカー）−（リン酸化ペプチド認識ドメイン）−Ｖａｌ。図６５参照。
チロシンキナーゼ構築物
１）Ｍｅｔ−（Ｌｕｃ２．０ ２３４〜５４４）−ＧＳＳＧ−（ヒトＳｒｃ ＳＨ２ドメイン）−ＧＳＧ−ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＥＩＹＧＥＦ−（リンカーＹ）−（Ｌｕｃ２．０ ４〜２３３）−Ｖａｌ、ここでＹ＝ＧＳＧＧＳＧＧＳＳＧ（配列番号２９１）又はＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＳＧ（配列番号２８６）。（ＧＳＳＧは、配列番号２７０に対応；ＧＳＧＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＥＩＹＧＥＦは、配列番号２９８に対応）。クローンｐＢＦＢ１８０、１８１、１８２、３６５、３６６、３６７。
２）Ｍｅｔ−ＥＩＹＧＥＦ−（リンカーＸ）−（Ｌｕｃ２．０ ４〜５４４）−ＧＳＳＧ−（ヒトＳｒｃ ＳＨ２ドメイン）、ここでＸ＝ＧＳＳＧ（配列番号２７０）、又はＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２７６）又は、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２７７）。（ＥＩＹＧＥＦは、配列番号２９６に対応）。クローンｐＢＦＢ１７４、１７５、１７６。
３）Ｍｅｔ−（ｈＲＬ ９２〜３１１）−ＧＳＧ−（ヒトＳｒｃ ＳＨ２ドメイン）−ＧＳＧ−ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＥＩＹＧＥＦ−（リンカーＸ）−ＧＳＳＧ−（ｈＲＬ ２〜９１）−Ｖａｌ、ここでＸ＝ＧＳＳＧ（配列番号２７０）、ＧＳＧＧＳＧＧＳＳＧ（配列番号２９１）又はＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＳＧ（配列番号２８６）。（ＧＳＧＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＥＩＹＧＥＦは、配列番号２９８に対応）。クローンｐＢＦＢ２２８、２２９、２３０。
４）Ｍｅｔ−（Ｌｕｃ２．０ Ａ−５４４）−（リンカーＸ）−（ヒトＳｒｃ ＳＨ２ドメイン）−ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＥＩＹＧＥＦ−（リンカーＹ）−（Ｌｕｃ２．０ ４−Ｂ）−Ｖａｌ、ここでＸ＝ＧＳＴＧ（配列番号２７５）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２７６）又は、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２７７）、及びＹ＝ＧＳＳＧ（配列番号２７０）、ＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＳＧ（配列番号２９９）又はＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＳＧ（配列番号２８６）。（ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＥＩＹＧＥＦは、配列番号２９５に対応）。ＣＰＭ部位［Ａ、Ｂ］＝［２３５、２３３］、［３５９、３５５］、［８４、８２］、［３０９、３０７］。クローンｐＢＦＢ３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９。
５）Ｍｅｔ−（ｈＲＬ Ａ−３１１）−（リンカーＸ）−（ヒトＳｒｃ ＳＨ２ドメイン）−ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＥＩＹＧＥＦ−（リンカーＹ）−（ｈＲＬ ３−Ｂ）−Ｖａｌ、ここでＸ＝ＧＳＳＧ（配列番号２７０）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２７６）又は、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２７７）、及びＹ＝ＧＳＳＧ（配列番号２７０）、ＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＳＧ（配列番号２９９）又はＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＳＧ（配列番号２８６）（ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＥＩＹＧＥＦは、配列番号２９５に対応）。ＣＰＭ部位［Ａ、Ｂ］＝［９２、９１］、［４２、４１］、［１１１、１１０］、［３１、３０］、［６９、６８］。クローンｐＢＦＢ３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４。
セリン／スレオニンキナーゼ構築物
１）Ｍｅｔ−（Ｌｕｃ２．０Ａ−５４４）−（リンカーＸ）−ＲＫＲＤＲＬＧＴＬＧＩ−（ＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ）−（Ｒａｄ５３ｐ ＦＨＡ２ドメイン）−（リンカーＹ）−（Ｌｕｃ２．０ ４−Ｂ）、ここでＸ＝ＧＳＳＧ（配列番号２７０）、ＧＧＳＧＧＳＧＳＳＧ（配列番号３００）又は、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＳＳＧ（配列番号３０１）、Ｙ＝ＧＳＳＧ（配列番号２７０）、ＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号２８１）又はＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＴＳＧＧＳＧＧＳＳＧ（配列番号２７８）。（ＲＫＲＤＲＬＧＴＬＧＩＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧは、配列番号２８３に対応）。ＣＰＭ部位は、［Ａ、Ｂ］＝［２３５、２３３］、［３５９、３５５］、［８４、８２］、［３０９、３０７］。クローンｐＢＦＢ３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６。
２）Ｍｅｔ−（ｈＲＬ Ａ−３１１）−（リンカーＸ）−ＲＫＲＤＲＬＧＴＬＧＩ−（ＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ）−（Ｒａｄ５３ｐ ＦＨＡ２ドメイン）−（リンカーＹ）−（ｈＲＬ ３−Ｂ）、ここでＸ＝ＧＳＳＧ（配列番号２７０）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号３０２）又は、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２７７）、及びＹ＝ＧＳＳＧ（配列番号２７０）、ＧＳＧＧＳＧＧＳＳＧ（配列番号２９１）又はＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＴＳＧＧＳＧＧＳＳＧ（配列番号２７８）。（ＲＫＲＤＲＬＧＴＬＧＩＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧは、配列番号２８３に対応）。ＣＰＭ部位は、［Ａ、Ｂ］＝［９２、９１］、［４２、４１］、［１１１、１１０］、［３１、３０］、［６９、６８］。クローンｐＢＦＢ３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４。
３）Ｍｅｔ−（Ｌｕｃ２．０Ａ−５４４）−（リンカーＸ）−（Ｒａｄ５３ｐ ＦＨＡ２ドメイン）−ＧＧＳＳＧ−ＲＫＲＤＲＬＧＴＬＧＩ−（リンカーＹ）−（Ｌｕｃ２．０ ４−Ｂ）、ここでＸ＝ＧＳＧＧ（配列番号２９３）、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号２９４）又は、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２７７）、Ｙ＝ＧＧＳＳＧ（配列番号３０４）、ＧＳＳＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号３０５）又はＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＴＳＧＧＳＧＧＳＳＧ（配列番号２７８）。（ＧＧＳＳＧＲＫＲＤＲＬＧＴＬＧＩは、配列番号３０３に対応）。ＣＰＭ部位は、［Ａ、Ｂ］＝［２３５、２３３］、［３５９、３５５］、クローンｐＢＦＢ４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２。
４）Ｍｅｔ−（ｈＲＬ Ａ−３１１）−（リンカーＸ）−（Ｒａｄ５３ｐ ＦＨＡ２ドメイン）ＧＧＳＳＧ−ＲＫＲＤＲＬＧＴＬＧＩ−（リンカーＹ）−（ｈＲＬ ３−Ｂ）、ここでＸ＝ＧＳＧＧ（配列番号２９３）、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号２９４）又は、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２７７）、及びＹ＝ＧＧＳＳＧ（配列番号３０４）、ＧＳＳＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号３０５）又はＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＴＳＧＧＳＧＧＳＳＧ（配列番号２７８）。（ＧＧＳＳＧＲＫＲＤＲＬＧＴＬＧＩは、配列番号３０３に対応）。ＣＰＭ部位は、［Ａ、Ｂ］＝［４２、４１］、［１１１、１１０］。クローンｐＢＦＢ４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８。
セリン／スレオニンキナーゼのサブセットのｉｎ ｖｉｔｒｏ検査
構築物、ｐＢＦＢ３３５、３３６、３３８、３３９、３４０、４１７、４１８、４１９、４２２、２２及び８を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＮＴ（登録商標）Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を使用して検査した。簡潔には、製造者の推奨する手順書に従って、以下の成分を混合した：
１μｇ プラスミドＤＮＡ
２５μＬ ウサギ網状赤血球抽出物
２μＬ ＴＮＴ反応緩衝液
１μＬ Ｔ７ポリメラーゼ
１μＬ アミノ酸混合物
１μＬ ｒＲＮａｓｉｎ
ｄＨ２Ｏを合計容量５０μＬまで
３０℃、１時間のインキュベーションに続いて、それぞれの融合タンパク質を、ＴＮＴ（登録商標）反応物 ２μＬと水８μＬ＋５×反応緩衝液（４０ｍＭ ＭＯＰＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）４μＬ＋５×Ｍｇ−ＡＴＰ（５０ｍＭ酢酸Ｍｇ、０．５ｍＭ ＡＴＰ）４μＬ＋５ｎｇ／μＬ 酵素（１００ｎｇ／ｕｌ保存液からＰＫＢ希釈緩衝液［２０ｍＭ ＭＯＰＳ（７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール、０．０５％ＤＴＴ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ］中に希釈）２μＬ又はＰＫＢ希釈緩衝液２μＬのみとを組み合わせることにより１０ｎｇ Ａｋｔ１／ＰＫＢアルファ組み換え酵素（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の存在下又は非存在下でインキュベートした。次いで試料を３０℃、２０分間インキュベートした。試料５μＬをＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＡＲ；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）溶液１００μＬに加え、混合するために上下に４回素早くピペッティングした。発光は、Ｔｕｒｎｅｒ ２０／２０Ｎ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；積分時間１秒間）を使用して測定した。全ての試料は、３回反復で測定した。
結果
構築物ｐＢＦＢ３４０は、Ａｋｔ１／ＰＫＢ存在下で、Ａｋｔ１／ＰＫＢ非存在下と比較して発光の５０％減少を示した。対照構築物ｐＢＦＢ２２及びｐＢＦＢ８は、Ａｋｔ１／ＰＫＢの添加で変化しなかった（図６６）。
他のセリン／スレオニンキナーゼセンサーについての手順は、ＣＰＭ ｈＲＬ Ｌｕｃ試料についてのものを除いて上記と同じであり、試料５μＬを、界面活性剤を含まない２×Ｒｅｎｉｌｌａ ｌｙｓｉｓ緩衝液（１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭチオ尿素）５μＬを含む９６ウェルプレートに加え、Ｒｅｎｉｌｌａ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）１００μＬをＶｅｒｉｔａｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用してインジェクターで加え、発光を測定する（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ ｐｒｏｇｒａｍ；積分時間３秒間）。ＦＦ Ｌｕｃ試料は、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＡＲ；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）１００μＬを試料５μＬに９６ウェルプレート中で、Ｖｅｒｉｔａｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用してインジェクターによって加え、発光を測定する（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ ｐｒｏｇｒａｍ；積分時間３秒間）ことにより測定した。
チロシンキナーゼセンサーは、以下の通り検査した：タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＮＴ（登録商標）Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を使用して発現させる。簡潔には、製造者の推奨する手順書に従って、以下の成分を混合した：
１μｇ プラスミドＤＮＡ
２５μＬ ウサギ網状赤血球抽出物
２μＬ ＴＮＴ反応緩衝液
１μＬ Ｔ７ポリメラーゼ
１μＬ アミノ酸混合物
１μＬ ｒＲＮａｓｉｎ
ｄＨ２Ｏを合計容量５０μＬまで
３０℃、１時間のインキュベーションに続いて、各融合タンパク質を、以下の通り５０μｌキナーゼ反応に使用する：１×ＰｒｏＦｌｏｕｒ反応緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）＋ＲＲ ＴｎＴ反応物１０μｌ＋１００μＭバナジン酸ナトリウム＋１ｍＭ ＭｎＣｌ２＋１ｍＭ ＭｇＡＴＰ＋０．５μｌ ｃ−Ｓｒｃキナーゼ又は水。Ｓｒｃキナーゼの添加後、０、３０及び６０分で、１０μｌ一定分量を採取し、アッセイまで−２０℃で保存する。ＣＰＭ ＦＦ Ｌｕｃ試料については、５μｌを９６ウェルプレートに移し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＡＲ；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）１００μＬをＶｅｒｉｔａｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用してインジェクターで加え、発光を測定する（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ ｐｒｏｇｒａｍ；積分時間３秒間）。ＣＰＭ ｈＲＬ Ｌｕｃ試料については、試料５μｌを界面活性剤を含まない２×Ｒｅｎｉｌｌａ ｌｙｓｉｓ緩衝液（１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭチオ尿素）５μＬを含む９６ウェルプレートに加え、Ｒｅｎｉｌｌａ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）１００μＬをＶｅｒｉｔａｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用してインジェクターで加え、発光を測定した（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ ｐｒｏｇｒａｍ；積分時間３秒間）。
キナーゼセンサーを細胞内で検査するために、ＦＦ Ｌｕｃ及びＣＰＭ ｈＲＬ Ｌｕｃセリン／スレオニンキナーゼバイオセンサーを以下の通り検査する：ＨＥＫ２９３及びＮＩＨ／３Ｔ３細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり細胞１〜１．５×１０４個の細胞密度でＣＯ２非依存培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１０％ＦＢＳ中に蒔く。次いでそれらを、１ウェル当たりＴｒａｓＩｔ（登録商標）−ＬＴ１ ｒｅａｇｅｎｔ ４．２μＬ及びＤＮＡ １．４μｇを使用してＴｒａｓＩｔ（登録商標）−ＬＴ１ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＭＩＲＵＳ）でトランスフェクトする。細胞を一晩３７℃／１０％ＣＯ２で増殖させる。翌日、細胞を血清不足にするために培地をＣＯ２非依存培地＋０．２％ＦＢＳに交換する。次いで細胞を３７℃／１０％ＣＯ２で一晩増殖させる。トランスフェクションの２日程度後に、細胞を、ＦＦ Ｌｕｃセンサーについては最終濃度５ｍＭ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ−ＥＦ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）に、ＣＰＭ ｈＲＬ Ｌｕｃセンサーについては６０μＭ ＥｎｄｕＲｅｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）に平衡化する。全ての細胞は、１．５時間、３７℃／１０％ＣＯ２で平衡化する。１．５時間後、発光のベースライン測定をＭｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１ウェル当たり積分時間１秒間）を使用して３７℃で測定する。次に半分の細胞をＰｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ、最終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）などのキナーゼ活性化因子で処理する。次いで発光を続く３０分間、３７℃で継続的に測定する。
（実施例２５）
三次元タンパク質構造情報を使用しない円順列置換タンパク質を作製するための適切な分断箇所の決定
方法
１）対象タンパク質のアミノ酸配列の取得。
２）適切な分断箇所の決定を支援するタンパク質構造の特徴を予測するための１つ又は複数のコンピュータプログラムの使用。適切な分断箇所は、タンパク質表面に露出している可能性がある。ヘリックス及びシートなどの通常の二次構造要素の外に位置する分断箇所は、タンパク質の構造及び機能を破壊する可能性が少ない。
表面に露出したタンパク質領域の予測：暴露領域は、親水性である可能性がある。タンパク質配列中の親水性及び疎水性残基の分布（疎水性プロット／スコア）は、オープンアクセスウェブサイト（例えば、Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓのＥｘＰＡＳｙ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｓｅｒｖｅｒからのＰｒｏｔＳｃａｌｅ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）で入手可能なプログラム及び市販の配列分析パッケージの一部（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲからのＬａｓｅｒｇｅｎｅ）を使用して一般に使用される疎水性スケールに基づいて算出できる。
タンパク質二次構造予測：このようなプログラムは、オープンアクセスウェブサイト（ＥｘＰＡＳｙ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｔｏｏｌｓ ｗｅｂｓｉｔｅ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／＃ｓｅｃｏｎｄａｒｙのリストを参照）及び市販の配列分析パッケージの一部として（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲからのＬａｓｅｒｇｅｎｅ）入手可能である。
３）１つ又は複数の予測方法からの結果に基づく分断箇所の選択。
例
１）タンパク質配列：ヒオドシエビ（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇａｒｃｉｌｏｒｏｓｔｒｉｓ）成熟ルシフェラーゼ配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション ＢＡＢ１３７７６、２８〜１９６残基）
２）表面に露出したタンパク質領域の予測：表面に露出していると推定される領域の発見のために推奨される範囲を特定する、ｗｉｎｄｏｗ ｓｉｚｅ ５及び７を使用するＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ ｓｃａｌｅに基づいて残基ごとの疎水性スコアを算出（Ｋｙｔｅ Ｊ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ ＲＦ：「タンパク質の疎水性親水性指標の特性を表示するための簡易な方法（Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５、１９８２年）。
タンパク質二次構造予測：５つの異なる予測アルゴリズムを使用；
ａ．ＰＳＩＰＲＥＤ（Ｊｏｎｅｓ ＤＴ．（１９９９年）「配列位置特異的スコアリングマトリックスに基づくタンパク質二次構造予測（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｃｅｓ）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２：１９５〜２０２．ＭｃＧｕｆｆｉｎ ＬＪ、Ｂｒｙｓｏｎ Ｋ、Ｊｏｎｅｓ ＤＴ）
ｂ．ＪＰＲＥＤ（Ｃｕｆｆ ＪＡ、Ｃｌａｍｐ ＭＥ、Ｓｉｄｄｉｑｕｉ ＡＳ、Ｆｉｎｌａｙ Ｍ及びＢａｒｔｏｎ ＧＪ．１９９８年、Ｊｐｒｅｄ：「共通二次構造予測サーバー（Ａ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｅｒ）」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４：８９２〜８９３）
ｃ．ＰＯＲＴＥＲ（Ｇ Ｐｏｌｌａｓｔｒｉ、Ａ ＭｃＬｙｓａｇｈｔ、「Ｐｏｒｔｅｒ：タンパク質二次構造予測のための新規の正確なサーバー（Ｐｏｒｔｅｒ：ａ ｎｅｗ，ａｃｃｕｒａｔｅ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ）」Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２１（８）、１７１９〜２０、２００５年）
ｄ．ＳＣＲＡＴＣＨ（Ｇ Ｐｏｌｌａｓｔｒｉ、Ｄ Ｐｒｚｙｂｙｌｓｋｉ、Ｂ Ｒｏｓｔ、Ｐ Ｂａｌｄｉ：「回帰型神経網及びプロファイルを使用する、３及び８クラスのタンパク質二次構造予測の改善（Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ａｎｄ ｅｉｇｈｔ ｃｌａｓｓｅｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ａｎｄ ｐｒｏｆｉｌｅｓ）」Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、４７、２２８〜３３５、２００２年）
ｅ．ＰＲＯＦ（Ｍ Ｏｕａｌｉ、Ｒ Ｋｉｎｇ：「二次構造予測のためのカスケード多重分類（Ｃａｓｃａｄｅｄ ｍｕｉｔｉｐｌｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒｓ ｆｏｒ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ）」、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、９、１１６２〜１１７６、１９９９年）。
３）比較のためにタンパク質構造特性予測の結果を表に集計。親水性（低疎水性スコア）であり、且つ予測された通常の二次構造要素（ヘリックス及びシート）の外に位置する領域内の、適切な分断箇所を選択。表９（以下の３セクション）を参照。
表９：ヒオドシエビ（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｏｒｏｓｔｒｉｓ）成熟ルシフェラーゼについての、構造特性予測結果の集計。二次構造予測結果の符号は、Ｈ＝ヘリックス、Ｅ＝シート、Ｃ＝コイル、空欄（ｂｌａｎｋ）＝コイル。疎水性予測スコアは、疎水性領域では、＞０であり、親水性領域では、＜０である。適切な分断箇所の例は、最右欄に×××を記す。
Figure 0005684984
Figure 0005684984
Figure 0005684984
したがって、例えばＰＣＡにおいて使用されるもの又はバイオセンサーとして使用される任意のタンパク質について（分断部位の間への直接の、又は分断部位で円順列置換した円順列置換突然変異体へのドメインの挿入）分断部位は、三次構造無しで選択できる。
Figure 0005684984

Figure 0005684984
全ての出版物、特許及び特許出願を本明細書に参考として組み込む。前記明細書において、本発明をその特定の好ましい実施形態に関して記載し、多数の詳細を例示の目的で述べたが、本発明が追加的実施形態を許容し、且つ本明細書の特定の詳細を本発明の基本的原理から逸脱することなく相当に変更できることは、当業者に明らかであろう。
ヒカリコメツキルシフェラーゼ中のＴｎ５挿入物（太字）の配列位置（アミノ酸配列は配列番号３に対応する）を示す表である。 親（未改変）ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列（ｌｕｃ＋）（配列番号２１０）を示す表である。 円順列置換ルシフェラーゼでの発光ｃＡＭＰ結合アッセイを示す模式図である。 ＩＩβ型ＰＫＡ調節サブユニット（ＲＩＩβＢ）。ラットＲＩＩβＢ ２６４〜４１２アミノ酸（ＰＤＢ １ＣＸ４）のＸ線結晶構造を示す図である。ＲＩＩβＢは、赤リボンで表されており、ｃＡＭＰは、球と棒で表されている。ラット（２６４〜４１２アミノ酸）とヒト（２６６〜４１４アミノ酸）ＲＩＩβＢの間の一次配列類似性は、９６．６％（ｐｒｏｇｒａｍ Ｍｅｇａｌｌｉｇｎ，ＤＮＡＳｔａｒ）である。 円順列置換ホタルルシフェラーゼ（ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ）発現プラスミドを示す図である。ＨＳＶ−ＴＫ又はＴ７プロモーターを、円順列置換ホタルルシフェラーゼを哺乳類細胞又は可溶化物で発現するためにそれぞれ利用した。ホタルルシフェラーゼのアミノ酸５４４及び４をＧｌｙ／Ｓｅｒリッチ４２アミノ酸ペプチド（配列番号１９６）で結合させた。 ＲＩＩβＢに融合させたＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ（ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ）のための発現ペプチドを示す図である。制限酵素の特有の組合せは、ＲＩＩβＢをコードするＤＮＡが、様々なＸ／Ｙペプチドリンカー長（ＧＳＴＧは、配列番号１２２対応；ＧＳＳＧは、配列番号１９７に対応；ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧは、配列番号１９８に対応；ＧＳＧＧＳＧＧＳＳＧは、配列番号１９９に対応；ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧは、配列番号２００に対応；及びＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＴＳＧＧＳＧＧＳＳＧは、配列番号２０１に対応）を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質をコードするプラスミドを生成するために、フレーム単位でつなぎ合わされることを可能にする。 大腸菌発現のために改変されたＥｐａｃ ＤＮＡ配列（配列番号１５）を示す表である。 円順列置換レニラルシフェラーゼ（ＣＰＭ−ｈＲＬ）発現プラスミド及びＲＩＩβＢと融合したＣＰＭ−ｈＲＬ（ＣＰＭ−ｈＲＬ／ＲＩＩβＢ）を発現する構築物を示す図である。制限酵素の特有の組合せは、ＲＩＩβＢをコードするＤＮＡが、様々なＸ／Ｙペプチドリンカー長（ＧＳＴＧは、配列番号１２２に対応；ＧＳＳＧは、配列番号１９７に対応；ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧは、配列番号１９８に対応；ＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＴＳＧＧＳＧＧＳＳＧは、配列番号２０１に対応）を有するＣＰＭ−ｈＲＬ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質をコードするプラスミドを生成するために、フレーム単位でつなぎ合わされることを可能にする。Ｇｌｙ／Ｓｅｒリッチ４２アミノ酸ペプチドは、配列番号１９６に対応する。 ｃＡＭＰ結合部位を有する円順列置換甲虫ルシフェラーゼのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。（Ｘ＝４、Ｙ＝４）、（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ融合タンパク質の発現。 （Ｘ＝４、Ｙ＝４）、（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーの機能評価を示すグラフである。 （Ｘ＝４、Ｙ＝４）、（Ｘ＝１０、Ｙ＝１０）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーを使用する用量反応実験を示すグラフである。 （Ｘ＝１０、Ｙ＝１０）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰセンサーの選択性を示すグラフである。 （Ｘ＝１０、Ｙ＝１０）のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰバイオセンサーでの反応からの同種ｃＡＭＰアッセイデータを示すグラフである。 円順列置換レニラルシフェラーゼを含有するｃＡＭＰ結合部位についてのＲＬＵ活性の比較を示すグラフである。 円順列置換レニラルシフェラーゼを含有するｃＡＭＰ結合部位についてのＲＬＵ活性の比較を示すグラフである。 ２種の異なるＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰバイオセンサーを有する、フォルスコリン処理したＨＥＫ２９３細胞の可溶化物中のｃＡＭＰ濃度の測定を示すグラフである。 ２種の異なるＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰバイオセンサーを有する、フォルスコリン処理したＨＥＫ２９３細胞の可溶化物中のｃＡＭＰ濃度の測定を示すグラフである。 （Ｘ＝１０、Ｙ＝０）のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢに基づくｃＡＭＰルシフェラーゼバイオセンサーをコードするＤＮＡを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞における経時的ＲＬＵを示すグラフである。 ［２ｘ（ｘ＝０〜５）、２ｙ（ｙ＝０〜５）］アミノ酸残基のセットで、Ｘ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰバイオセンサーの機能評価を示すグラフである。１００μＭ ｃＡＭＰの存在下及び非存在下でのルシフェラーゼ活性。リンカー組合せ（１０、２）及び（１０、６）は未記載。 ［２ｘ（ｘ＝０〜５）、２ｙ（ｙ＝０〜５）］アミノ酸残基のセットで、Ｘ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰセンサーの機能評価を示すグラフである。１００μＭ ｃＡＭＰの存在下でのルシフェラーゼ活性の発光量比。リンカー組合せ（１０、２）及び（１０、６）は未記載。 ［１０、−２ｎ（ｎ＝１〜７）］、［１０、２ｎ（ｎ＝１〜５）］及び［１０＋２ｎ（ｎ＝１〜５）、０］アミノ酸残基のセットで、Ｘ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰセンサーの機能評価を示すグラフである。１００μＭ ｃＡＭＰの存在下又は非存在下でのルシフェラーゼ活性。 ［１０、−２ｎ（ｎ＝１〜７）］、［１０、２ｎ（ｎ＝１〜５）］及び［１０＋２ｎ（ｎ＝１〜５）、０］アミノ酸残基のセットで、Ｘ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰセンサーの機能評価を示すグラフである。１００μＭ ｃＡＭＰの存在下でのルシフェラーゼ活性の発光量比。 （Ｘ＝４、Ｙ＝４）及び（Ｘ＝１０、Ｙ＝４）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭヒカリコメツキＬｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰセンサー並びに対応するＣＰＭ−ＦＦルシフェラーゼを使用する用量反応実験の比較を示すグラフである。 （Ｘ＝４、Ｙ＝４）及び（Ｘ＝１０、Ｙ＝４）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭヒカリコメツキＬｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰセンサー並びに対応するＣＰＭ−ＦＦルシフェラーゼを使用する用量反応実験の比較を示すグラフである。 （Ｘ＝４、Ｙ＝４）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰセンサー並びに対応するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢを使用する用量反応実験の比較を示すグラフである。 （Ｘ＝４、Ｙ＝４）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰセンサー並びに対応するＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢを使用する用量反応実験の比較を示すグラフである。 （Ｘ＝４、Ｙ＝４）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ熱安定性Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰセンサー並びに対応するＣＰＭ−ＦＦルシフェラーゼを使用する用量反応実験の比較を示すグラフである。 （Ｘ＝４、Ｙ＝４）及び（Ｘ＝２０、Ｙ＝２０）アミノ酸残基のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ熱安定性Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰセンサー並びに対応するＣＰＭ−ＦＦルシフェラーゼを使用する用量反応実験の比較を示すグラフである。 （Ｘ＝４、Ｙ＝２０）のＸ／Ｙリンカー長を有するＣＰＭ−ｈＲＬ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰバイオセンサーを使用するＨＥＫ２９３細胞中のｃＡＭＰ濃度変化のモニタリングを示すグラフである。 ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃの配列（配列番号１６）を示す表である。 ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ ＧＡＦ構築物の模式図である。ＧＳＴＧは、配列番号１２２に対応；ＧＳＳＧは、配列番号１９７に対応；ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧは、配列番号１９８に対応；ＧＳＧＧＳＧＧＳＳＧは、配列番号１９９に対応；ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧは、配列番号２００に対応；ＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＴＳＧＧＳＧＧＳＳＧは、配列番号２０１に対応；及び４２ＲＴ対照ペプチドは、配列番号１９６に対応。 ｃＧＭＰ存在下及び非存在下における様々なＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ ＧＡＦ構築物についてのＲＬＵを示すグラフである。 ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ ＧＡＦ構築物についてのｃＧＭＰ又はｃＡＭＰの濃度の増大に伴う発光量比を示すグラフである。 ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃカルシウムバイオセンサーの模式図である。ＧＳＴＧは、配列番号１２２に対応；ＧＳＳＧは、配列番号１９７に対応；ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧは、配列番号１９８に対応；ＧＳＧＧＳＧＧＳＳＧは、配列番号１９９に対応；ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧは、配列番号２００に対応；及びＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＴＳＧＧＳＧＧＳＳＧは、配列番号２０１に対応；４２ＲＴ対照ペプチドは、配列番号１９６に対応；ＬＥＧＳＧＧＧＧは、配列番号２０２に対応；及びＧＧＧＧＳＧＰＷは、配列番号２０３に対応。 ＣａＣｌ２又はＥＤＴＡ及びＥＧＴＡ存在下における様々なＣＰＭ−ＦＦ ＬｕｃカルシウムバイオセンサーについてのＲＬＵを示すグラフである。 ホタルルシフェラーゼの改変のための追加的部位を示す表である。 様々な部位でのＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ ｃＡＭＰバイオセンサーについてのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＬＵ及び発光量比を示すグラフである。 様々な部位でのＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ ｃＡＭＰバイオセンサーについてのｉｎ ｖｉｖｏ ＲＬＵ及び発光量比を示すグラフである。 円順列置換されていないレニラルシフェラーゼ中にＲＩＩβＢの挿入を有する構築物を示す表である。 図２９に示す構築物についてのＲＬＵ及び発光量比を示すグラフである。 円順列置換レニラルシフェラーゼ中のＲＩＩβＢ及び様々なリンカー長を有する構築物を示す表である。 図３１の構築物についてのＲＬＵ及び発光量比を示すグラフである。 円順列置換レニラルシフェラーゼ中のＲＩαＢを有する構築物を示す表である。 図３３の構築物についてのＲＬＵ及び発光量比を示すグラフである。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性検査を表すグラフである。構築物ｐＢＦＢ２８７を９１部位について使用した。ＴｎＴ Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍを使用した発現の後、ＴｎＴ反応物８．５μＬを、１ｍＭ ｃＡＭＰ保存液又はｄＨ２Ｏ １．７μＬを補充した３００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／２００ｍＭチオ尿素（ｐＨ約７．５）８．５μＬと混合した；反応物を室温で１０分間程度インキュベートした。各試料の５μＬを９６ウェルプレートのウェルに３回反復で加え、発光をＲｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ １００μＬを使用してＧｌｏｍａｘ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒで測定した。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性検査を表すグラフである。構築物２０１３２５．４４．Ｈ６を９１部位について使用した。ＴｎＴ Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍを使用した発現の後、ＴｎＴ反応物１５μＬに、１ｍＭ ｃＡＭＰ保存液又はｄＨ２Ｏ １．５μＬを補充した；反応物を室温で１０分間程度インキュベートした。次いでこの混合物１５μＬを１×Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ ７５μｌに加え、各試料２０μＬを９６ウェルプレートのウェルに３回反復で加え、９１及び２２３構築物について発光をＲｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ １００μＬを使用してＧｌｏｍａｘ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒで測定した。２２９構築物については、ｃＡＭＰ誘導を図３５に記載の通り測定した。 ＣＰＭ ＲＬｕｃ ｃＡＭＰバイオセンサーについての一過性トランスフェクションデータを示すグラフである。 ＣＰＭ ＦＦ Ｌｕｃ ｃＡＭＰバイオセンサーを有するＧＰＣＲについてのシングルステップアッセイの模式図である。 ＣＰＭ ＦＦ Ｌｕｃ ｃＡＭＰアッセイにおけるＲＬＵ対フォルスコリン濃度の増大を示すグラフである。 ＣＰＭ ＦＦ Ｌｕｃ ｃＡＭＰバイオセンサーでの化合物ライブラリーのスクリーニングのデータを示す図である。 ＣＰＭ ＦＦ Ｌｕｃ ｃＡＭＰバイオセンサーを使用する具体的な化合物の用量反応を示すグラフである。 例示的にカイアシ類ルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号２０４；Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＡＡＧ５４０９５）を示す表である。 ＣＰＭ ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰバイオセンサーの室温時及び３７℃における経時的相対反応の比較を示すグラフである。 様々なアゴニスト（Ａ）の存在下における室温及び３７℃での、ＣＲＥリポーター及びＣＰＭ ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰバイオセンサーのＲＬＵを示すグラフである。 様々なアンタゴニスト（Ｂ）の存在下における室温及び３７℃での、ＣＲＥリポーター及びＣＰＭ ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰバイオセンサーのＲＬＵを示すグラフである。 ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢで安定にトランスフェクトされ、且つ異なる量のドーパミンに３７℃でさらされた細胞での経時的発光量比を示すグラフである。 ３７℃におけるＲＬＵ対ｌｏｇ Ｍ ドーパミンを示すグラフである。 ３７℃における様々なアゴニストについての作用強度順位を示すグラフである。 ３７℃における様々なアンタゴニストについての作用強度順位を示すグラフである。 ＨＥＫ２９３／ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢを使用する、ベータ２アドレナリン受容体のアゴニストの作用強度順位を示すグラフである。ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩβＢを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を、内因性ベータ２アドレナリン受容体のアゴニストで刺激した。室温、２６分間のインキュベーションの後に発光を測定した。 ＨＥＫ２９３を使用する、ベータ２アドレナリン受容体のアゴニストの作用強度順位を示すグラフである。ＣＰＭ−ＦＦ Ｌｕｃ／ＲＩＩＢを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を、０．０３３μＭイソプレテレノールの存在下でアンタゴニストとインキュベートした。室温、３１分間のインキュベーションの後に発光を測定した。 様々なアゴニストでの生物発光のＧＰＣＲアッセイの比較を示すグラフである。 様々なアンタゴニストでの生物発光のＧＰＣＲアッセイの比較を示すグラフである。 ＣＰＭ ＲＬｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰバイオセンサーでのｃＡＭＰの細胞内変化の検出を示すグラフである。Ａ）異なるプロモーターでの検出の比較。Ｂ）フォルスコリン誘導。Ｃ）ＳＫ３８３９３誘導。Ｄ）ドーパミン誘導。 ＣＰＭ ＲＬｕｃ／ＲＩＩβＢ ｃＡＭＰバイオセンサーでの細胞におけるｃＡＭＰの細胞内変化の検出を示すグラフである。 ＲＩＩβＢ及び様々なリンカー長を有するＦＬｕｃ構築物についてのＲＬＵを示すグラフである。 ヒオドシエビルシフェラーゼ及びその融合構築物についての核酸配列（配列番号２０５、２０６、２０７、２０８、２０９）を示す表である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質相補性アッセイ（ＰＣＡ）におけるヒオドシエビルシフェラーゼ融合物についてのＲＬＵを示すグラフである。発光量比は、バックグラウンド減算後に決定した。 ヒオドシエビルシフェラーゼ（ＯｐＬｕｃ）融合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１）全長ＯｐＬｕｃ；レーン２）同時発現させた５０−ＦＲＢとＦＫＢＰ−５１；レーン３）５０−ＦＲＢ；レーン４）ＦＫＢＰ−５１；及びレーン５）；ＤＮＡ不含有対照。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＣＡにおけるヒオドシエビルシフェラーゼ融合物についてのＲＬＵを示すグラフである。発光量比は、バックグラウンド減算後に決定した。 ヒオドシエビルシフェラーゼ融合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１）全長ＯｐＬｕｃ；レーン２）同時発現させた８４−ＦＲＢとＦＫＢＰ−８５；レーン３）８４−ＦＲＢ；レーン４）ＦＫＢＰ−８５；及びレーン５）；ＤＮＡ不含有対照。 細胞に基づくＰＣＡにおけるヒオドシエビルシフェラーゼ融合物についてのＲＬＵを示すグラフである。Ｎ＝３。ｓｓ＝分断部位。発光量比は、バックグラウンド減算後に決定した。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＣＡにおけるヒオドシエビルシフェラーゼ円順列置換様融合物についてのＲＬＵを示すグラフである。発光量比は、バックグラウンド減算後に決定した。 ヒオドシエビルシフェラーゼ円順列置換様融合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１）全長ＯｐＬｕｃ；レーン２）同時発現させた５１−ＦＫＢＰ及びＦＲＢ−５０；レーン３）同時発現させた８５−ＦＫＢＰ及びＦＲＢ−８４；レーン４）ＦＲＢ−５０；レーン５）ＦＲＢ−８４；レーン５）５１−ＦＫＢＰ；レーン７）８５−ＦＫＢＰ；及びレーン８）ＤＮＡ不含有対照。 ８４−ＦＲＢ；レーン４）ＦＫＢＰ−８５；及びレーン５）ＤＮＡ不含有対照。 ＣＰ ヒオドシエビルシフェラーゼに基づくベクターを示す図である。 ＲＩＩｂｅｔａＢ ＣＰ ヒオドシエビルシフェラーゼに基づくベクターでの結果を示すグラフである。左カラムは、未改変のルシフェラーゼ（対照）の活性を示す。左から二番目のカラムは、４ａａリンカーを有する対応する構築物。左から三番目のカラムは、１０ａａリンカーを有する−’’−である。左から四番目のカラムは、２０ａａリンカーを有する−’’−である。 セリン／スレオニンキナーゼ／ホスファターゼ構築物を示す表である。表中で具体的に同定されるペプチド配列はＥＩＹＧＥＦＧＳＳＧ（配列番号２６７）、ＥＩＹＧＥＦＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２６８）、ＥＩＹＧＥＦＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２６９）、ＧＳＳＧ（配列番号２７０）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＥＩＹＧＥＦＧＳＳＧ（配列番号２７１）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＥＩＹＧＥＦＧＳＧＧＳＧＧＳＳＧ（配列番号２７２）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＥＩＹＧＥＦＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＳＧ（配列番号２７３）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＥＩＹＧＥＦＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＳＧ（配列番号２７４）、ＧＳＴＧ（配列番号２７５）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２７６）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２７７）、ＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＴＳＧＧＳＧＧＳＳＧ（配列番号２７８）、ＧＳＳＧＲＫＲＤＲＬＧＴＬＧＩＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号２７９）、ＧＧＳＧＧＳＧＳＳＧＲＫＲＤＲＬＧＴＬＧＩＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号２８０）、ＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号２８１）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＳＳＧＲＫＲＤＲＬＧＴＬＧＩＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号２８２）、ＲＫＲＤＲＬＧＴＬＧＩＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号２８３）、ＧＧＳＳＧＲＫＲＤＲＬＧＴＬＧＩＧＧＳＳＧ（配列番号２８４）、ＧＧＳＳＧＲＫＲＤＲＬＧＴＬＧＩＧＳＳＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号２８５）、ＧＧＳＳＧＲＫＲＤＲＬＧＴＬＧＩＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＴＳＧＧＳＧＧＳＳＧ（配列番号２８７）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２８８）、ＧＧＳＳＧＲＫＲＤＲＬＧＴＬＧＩＧＳＳＧＳＧＧＳＧＧＴＳＧＧＳＧＧＳＳＧ（配列番号２８９）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＲＫＲＤＲＬＧＴＬＧＩＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号２９０）、ＧＳＧＧＳＧＧＳＳＧ（配列番号２９１）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＲＫＲＤＲＬＧＴＬＧＩＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号２９２）、ＧＳＧＧ（配列番号２９３）、及びＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号２９４）である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｆｌｕｃセリン／スレオニンキナーゼアッセイを示すグラフである。 代表的核酸配列を示す表である。

Claims (13)

  1. サイクリックヌクレオチド結合部位を含む円順列置換ルシフェラーゼのオープンリーディングフレームを含む核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、このルシフェラーゼが、対応する非順列置換ルシフェラーゼ中の、改変に対して耐性である部位又は領域において順列置換されており、円順列置換ルシフェラーゼの発光活性が検出可能であり、かつサイクリックヌクレオチドの結合により変化し、該サイクリックヌクレオチドが、ｃＡＭＰであり、
    前記順列置換が、
    ａ）配列番号２１０で示されるホタルルシフェラーゼの残基32-53、70-88、102-126、139-165、183-203、220-247、262-273、303-313、353-408、又は485-495、
    ｂ）配列番号３で示されるヒカリコメツキルシフェラーゼの残基233、
    ｃ）Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＡＦ０２５８４３で示されるレニラルシフェラーゼの残基26-47、64-74、86-116、145-157、又は223-234、又は
    ｄ）Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション ＢＡＢ１３７７６で示されるヒオドシエビルシフェラーゼの残基45-55、79-89、又は112、
    に対応する部位又は領域に存在し、
    前記サイクリックヌクレオチド結合部位が、両端にヌクレオチド長が、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０であるリンカーＸ及びＹが結合したＲＩＩβＢであり、かつ非改変ルシフェラーゼのＮ末端及び／又はＣ末端に対応する配列に存在することを特徴とするポリヌクレオチド。
  2. 改変ルシフェラーゼが、Ｎ末端、Ｃ末端、又はその両方において、少なくとも１つのアミノ酸タグをさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. タグが、ＰＥＳＴ配列、ＧＳＴ配列、又はポリヒスチジン配列である、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
  4. 改変ルシフェラーゼが、非改変ルシフェラーゼのＮ末端及び／又はＣ末端に対応する配列においてルシフェラーゼ配列の欠失をさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  5. Ｎ末端又はＣ末端における欠失が、ルシフェラーゼ配列の１５残基以下である、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
  6. 請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  7. 請求項６に記載のベクター中のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
  8. 請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドがコードする改変ルシフェラーゼ。
  9. 試料又は宿主中におけるサイクリックヌクレオチド又はサイクリックヌクレオチドの調節因子の量を検出又は定量する方法であって、以下の工程、
    ａ）発光反応用の試薬を、以下、
    １）前記サイクリックヌクレオチド又は該サイクリックヌクレオチドの調節因子を有することが疑われる試料、及び
    i)請求項７の宿主細胞又はその溶解物、又は
    ii)請求項８の改変ルシフェラーゼ、又は
    ２）請求項７の宿主細胞又はその溶解物、
    と混合する工程、及び
    ｂ）混合物中の発光量を検出又は定量する工程と、
    を含むことを特徴とする方法。
  10. 前記サイクリックヌクレオチドの量を検出又は定量する、請求項９に記載の方法。
  11. 試料が、細胞、細胞溶解物、又は細胞画分を含む、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 細胞が、動物由来である、請求項１１に記載の方法。
  13. 改変ルシフェラーゼへのサイクリックヌクレオチドの結合が、発光の増大をもたらす、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
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Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007508014A (ja) 2003-10-10 2007-04-05 プロメガ　コーポレイション ルシフェラーゼバイオセンサー
CA2648263A1 (en) 2006-04-03 2007-10-25 Promega Corporation Permuted and nonpermuted luciferase biosensors
US8658777B2 (en) * 2007-05-09 2014-02-25 The University Of Tokyo Activated protease indicator
EP2215227A2 (en) * 2007-11-05 2010-08-11 Promega Corporation Hybrid fusion reporter and uses thereof
JP2009153399A (ja) * 2007-12-25 2009-07-16 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 一分子型リアルタイム生物発光イメージングプローブ
JP5553326B2 (ja) 2008-04-25 2014-07-16 独立行政法人産業技術総合研究所 一分子型プローブ及びその利用
US9045730B2 (en) 2008-05-19 2015-06-02 Promega Corporation Luciferase biosensors for cAMP
JP5586285B2 (ja) * 2009-03-18 2014-09-10 オリンパス株式会社 受容体相互作用検出方法およびサイクリックａｍｐセンサータンパク質
PL3409764T3 (pl) 2009-05-01 2020-07-13 Promega Corporation Syntetyczne lucyferazy z krewetki oplορηorus emitującej bardziej intensywne światło
US8741591B2 (en) 2009-10-09 2014-06-03 The Research Foundation For The State University Of New York pH-insensitive glucose indicator protein
JP6032862B2 (ja) * 2010-03-23 2016-11-30 オリンパス株式会社 サイクリックｇｍｐ解析方法
EP3508570B1 (en) * 2010-05-11 2020-07-22 Promega Corporation Mutant protease biosensors with enhanced detection characteristics
US9290794B2 (en) 2010-05-11 2016-03-22 Promega Corporation Mutant protease biosensors with enhanced detection characteristics
JP5893241B2 (ja) * 2010-08-31 2016-03-23 オリンパス株式会社 カルシウム解析方法
CN101982778B (zh) * 2010-09-17 2014-02-19 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 一种定量分析蛋白质间相互作用的方法及其应用
CN103180324A (zh) 2010-11-02 2013-06-26 普罗美加公司 腔肠素衍生物及其使用方法
CA2817102C (en) 2010-11-02 2020-07-28 Promega Corporation Oplophorus-derived luciferases, novel coelenterazine substrates, and methods of use
JP6067019B2 (ja) 2011-09-02 2017-01-25 プロメガ コーポレイションＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 代謝的に活性な細胞の酸化還元状態を評価するための化合物及び方法、ならびにｎａｄ（ｐ）／ｎａｄ（ｐ）ｈを測定するための方法
EP3467119B1 (en) * 2011-11-11 2022-02-23 Promega Corporation Mutant protease biosensors with enhanced detection characteristics
US9506073B2 (en) 2011-11-18 2016-11-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Blue-light inducible system for gene expression
EP2969435B1 (en) 2013-03-15 2021-11-03 Promega Corporation Substrates for covalent tethering of proteins to functional groups or solid surfaces
WO2015116867A1 (en) 2014-01-29 2015-08-06 Promega Corporation Quinone-masked probes as labeling reagents for cell uptake measurements
WO2015116806A1 (en) 2014-01-29 2015-08-06 Promega Corporation Pro-substrates for live cell applications
EP3191600A1 (en) 2014-09-11 2017-07-19 Promega Corporation Luciferase sequences utilizing infrared-emitting substrates to produce enhanced luminescence
JP6730795B2 (ja) * 2015-02-26 2020-07-29 公立大学法人 富山県立大学 Ｖｄｒビタミンｄ結合ドメインを含む融合タンパク質及びその使用
EP3510035B1 (en) 2016-09-09 2021-04-07 Promega Corporation Dual protected pro-coelenterazine substrates
US11891634B2 (en) * 2017-06-23 2024-02-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University PDE5A destabilizing domains
CN113501881B (zh) * 2017-09-27 2023-07-28 北京大学 融合蛋白
US20210147831A1 (en) 2018-04-27 2021-05-20 The Broad Institute, Inc. Sequencing-based proteomics
WO2021072330A1 (en) 2019-10-09 2021-04-15 Silverback Therapeutics, Inc. Galnac-tgfbr1 inhibitor conjugates for the treatment of liver diseases
KR20220151168A (ko) * 2020-02-09 2022-11-14 엔엘씨 파르마 엘티디 Sars-cov-2에 대한 신속한 검출 테스트
US20210301319A1 (en) * 2020-03-26 2021-09-30 Cellex, Inc. Protease assays and their applications
US20240240228A1 (en) * 2021-05-21 2024-07-18 Qatar Foundation For Education, Science And Community Development Bret-based coronavirus mpro protease sensor and uses thereof
CN113981004B (zh) * 2021-11-01 2024-02-09 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针及其制备方法与应用
CN114350627B (zh) * 2021-12-16 2022-08-05 大连博格林生物科技有限公司 一种萤火虫荧光素酶突变体及其制备方法
US20240174992A1 (en) 2022-05-04 2024-05-30 Promega Corporation Split modified dehalogenase variants
WO2023215432A1 (en) 2022-05-04 2023-11-09 Promega Corporation Circularly permuted dehalogenase variants
WO2024148226A2 (en) * 2023-01-06 2024-07-11 Central Michigan University Genetically encoded bioluminescent sensors
CN116555204B (zh) * 2023-07-04 2023-09-12 苏州驾玉生物医药有限公司 一种性能提升的突变荧光素酶及其应用

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NO864301L (no) 1986-10-28 1988-04-29 Tore Jahnsen Dna-prober for human regulatorisk enhet av camp-avhengige proteinkinaser.
WO1990005745A1 (en) 1988-11-18 1990-05-31 The General Hospital Corporation A cAMP-RESPONSIVE TRANSCRIPTIONAL ENHANCER BINDING PROTEIN
GB8916806D0 (en) 1989-07-22 1989-09-06 Univ Wales Medicine Modified proteins
US5683888A (en) * 1989-07-22 1997-11-04 University Of Wales College Of Medicine Modified bioluminescent proteins and their use
FR2682122B1 (fr) 1991-10-03 1995-06-09 Pasteur Institut Nouveaux genes d'helicobacter pylori. leur utilisation pour la preparation de souches recombinantes de h. pylori.
US6118047A (en) 1993-08-25 2000-09-12 Dekalb Genetic Corporation Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction
AU698424C (en) 1994-01-03 2002-10-10 Promega Corporation Mutant luciferases
US6294330B1 (en) 1997-01-31 2001-09-25 Odyssey Pharmaceuticals Inc. Protein fragment complementation assays for the detection of biological or drug interactions
CA2196496A1 (en) 1997-01-31 1998-07-31 Stephen William Watson Michnick Protein fragment complementation assay for the detection of protein-protein interactions
US7312302B2 (en) 1997-02-20 2007-12-25 Oncolmmunin, Inc. Compositions for the detection of enzyme activity in biological samples and methods of use thereof
US6037137A (en) 1997-02-20 2000-03-14 Oncoimmunin, Inc. Fluorogenic peptides for the detection of protease activity
US6602677B1 (en) * 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
WO1999014336A2 (en) * 1997-09-19 1999-03-25 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
US6342611B1 (en) * 1997-10-10 2002-01-29 Cytovia, Inc. Fluorogenic or fluorescent reporter molecules and their applications for whole-cell fluorescence screening assays for capsases and other enzymes and the use thereof
US6884870B2 (en) 1998-03-20 2005-04-26 California Institute Of Technology Fusion proteins for identifying proteases, protease target sites and regulators of protease activity in living cells
US6855515B1 (en) 1998-04-22 2005-02-15 Merck & Co., Inc. Autoantigenic fragments, methods and assays
GB9819666D0 (en) 1998-09-09 1998-11-04 Univ Aberdeen Biosensor
US20020192719A1 (en) 1998-09-30 2002-12-19 Caliper Technologies Corp. Homogeneous assay methods
AU1223200A (en) 1998-10-23 2000-05-15 Massachusetts Institute Of Technology Genes integrating signal transduction pathways
GB9823468D0 (en) 1998-10-28 1998-12-23 Secr Defence Novel enzyme
US6670144B1 (en) 1999-02-26 2003-12-30 Cyclacel, Ltd. Compositions and methods for monitoring the phosphorylation of natural binding partners
JP3059435B1 (ja) 1999-03-18 2000-07-04 扶桑薬品工業株式会社 ｃＡＭＰおよびアデニル酸シクラ―ゼの酵素的蛍光定量アッセイ
US6573059B1 (en) 1999-06-04 2003-06-03 Rmf Dictagene S.A. Use of the regulatory subunit of the camp dependent protein kinase (PKA) from dictyostelium for camp measurements
US7109315B2 (en) * 2000-03-15 2006-09-19 Bruce J. Bryan Renilla reniformis fluorescent proteins, nucleic acids encoding the fluorescent proteins and the use thereof in diagnostics, high throughput screening and novelty items
US6808874B2 (en) 2000-06-13 2004-10-26 Cyclacel Ltd. Methods of monitoring enzyme activity
US6890745B1 (en) 2000-07-19 2005-05-10 Chemicon International, Inc. Protease specific cleavable luciferases and methods of use thereof
US6541196B2 (en) 2000-07-26 2003-04-01 Jackson State University Method for cAMP production
JP3772193B2 (ja) 2000-07-26 2006-05-10 独立行政法人科学技術振興機構 蛋白質−蛋白質相互作用解析用プローブ及びそれを利用した蛋白質−蛋白質相互作用の解析方法
US7879540B1 (en) 2000-08-24 2011-02-01 Promega Corporation Synthetic nucleic acid molecule compositions and methods of preparation
US20020073441A1 (en) 2000-12-13 2002-06-13 Ross Brian D. Compositions and methods for detecting proteolytic activity
US7083911B2 (en) * 2001-02-16 2006-08-01 Promega Corporation Method for detection of ATP
US20030053995A1 (en) 2001-06-15 2003-03-20 Mien-Chie Hung Methods and compositions for inhibiting EGF receptor activity
US7422862B2 (en) 2001-11-28 2008-09-09 The Burnham Institute Methods for identifying modulators of apoptosis
US7927871B2 (en) 2002-01-29 2011-04-19 Oncoimmunin, Inc. Visualization and quantitation of cellular cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic protease substrates and caspase activity indicator markers
WO2003066883A2 (en) 2002-02-08 2003-08-14 The Regents Of The University Of California A transcription amplification system for molecular imaging
US6730492B2 (en) 2002-03-09 2004-05-04 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Cell-based screening methods
US20030170850A1 (en) 2002-03-09 2003-09-11 Cardone Michael H. Cell-based screening methods
US6850133B2 (en) 2002-08-14 2005-02-01 Intel Corporation Electrode configuration in a MEMS switch
ATE487797T1 (de) * 2002-09-06 2010-11-15 Promega Corp Verfahren zum nachweis von transferase- enzymaktivität
GB0221915D0 (en) 2002-09-20 2002-10-30 Skeland Stein O D Assay
WO2004038039A2 (en) 2002-10-21 2004-05-06 The Regents Of The University Of California Optical imagiong of renilla luciferase reporter gene expression in living organisms
AU2003287635A1 (en) 2002-11-08 2004-06-03 Sanjiv Sam Gambhir Imaging protein-protein interactions in living subjects
US7741067B2 (en) 2002-12-23 2010-06-22 Promega Corporation Luciferase-based assays
WO2004081189A2 (en) 2003-03-07 2004-09-23 Stanford University Multimodality imaging of reporter gene expression using a novel fusion vector in living cells and organisms
US7619059B2 (en) 2003-07-29 2009-11-17 Life Technologies Corporation Bimolecular optical probes
CA2445420A1 (en) 2003-07-29 2005-01-29 Invitrogen Corporation Kinase and phosphatase assays
US7442518B2 (en) 2003-08-06 2008-10-28 Washington University Imaging regulated protein-protein interactions in cells and living animals by enhanced luciferase protein fragment complementation
US7488583B2 (en) 2003-09-25 2009-02-10 Odyssey Thera, Inc. Fragment complementation assays for G-protein-coupled receptors and their signaling pathways
JP2007508014A (ja) 2003-10-10 2007-04-05 プロメガ　コーポレイション ルシフェラーゼバイオセンサー
EP1536020A1 (en) 2003-11-26 2005-06-01 Bayerische Julius-Maximilians-Universität Würzburg Means and methods for optical determination of cAMP in vitro and in vivo
US20060110364A1 (en) 2004-08-20 2006-05-25 Ludwig Institute For Cancer Research Vector-mediated delivery of polynucleotides encoding soluble VEGF receptors
EP1791972A4 (en) 2004-08-23 2009-12-02 Univ Johns Hopkins CAMP RAPPORTEURS
US20060048592A1 (en) * 2004-09-09 2006-03-09 Ung Tom T Damping nut for screw-driven mechanism
ATE526398T1 (de) * 2005-08-19 2011-10-15 Commw Scient Ind Res Org Arachnocampa-luciferasen
CA2648263A1 (en) 2006-04-03 2007-10-25 Promega Corporation Permuted and nonpermuted luciferase biosensors
WO2008030968A2 (en) 2006-09-06 2008-03-13 Phase Bioscience, Inc. Fusion peptide therapeutic compositions
US7812002B2 (en) 2007-03-21 2010-10-12 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotide inhibitors of NRF2 and methods of use thereof for treatment of cancer
US8658777B2 (en) 2007-05-09 2014-02-25 The University Of Tokyo Activated protease indicator
WO2009049892A1 (en) 2007-10-17 2009-04-23 European Molecular Biology Laboratory (Embl) Polypeptides comprising an annexin core domain, compositions, methods and use thereof
EP2215227A2 (en) * 2007-11-05 2010-08-11 Promega Corporation Hybrid fusion reporter and uses thereof
WO2009140662A1 (en) * 2008-05-15 2009-11-19 Illumina, Inc. Engineered luciferases
US9045730B2 (en) * 2008-05-19 2015-06-02 Promega Corporation Luciferase biosensors for cAMP
US9290794B2 (en) 2010-05-11 2016-03-22 Promega Corporation Mutant protease biosensors with enhanced detection characteristics
EP3508570B1 (en) 2010-05-11 2020-07-22 Promega Corporation Mutant protease biosensors with enhanced detection characteristics
JP5501862B2 (ja) 2010-05-24 2014-05-28 株式会社サンユー 金属被膜見本キット
CA2817102C (en) 2010-11-02 2020-07-28 Promega Corporation Oplophorus-derived luciferases, novel coelenterazine substrates, and methods of use
EP3467119B1 (en) 2011-11-11 2022-02-23 Promega Corporation Mutant protease biosensors with enhanced detection characteristics

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