JP5553326B2 - 一分子型プローブ及びその利用 - Google Patents
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本発明に係る融合タンパク質は、一分子型プローブとして用いられ、リガンドを検出する融合タンパク質であって、前記リガンドに対するリガンド結合タンパク質と、当該リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識する認識タンパク質との間に、2つに分割された酵素の、C末側断片とN末側断片とを有し、前記C末側断片のC末端基が、前記N末側断片のN末端基の上流に位置しており、前記リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを前記認識タンパク質が認識した場合に、2つに分割された前記酵素断片が相補して酵素活性を変化させる融合タンパク質である。
本発明はまた、本発明に係る融合タンパク質を生物又は細胞内で発現させるベクターを提供する。本発明に係るベクターを用いれば、本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを生物又は細胞に導入し、当該生物又は細胞内において本発明に係る融合タンパク質を発現させることができる。
本発明はまた、本発明に係る融合タンパク質を発現させ得る形質転換体を提供する。本発明に係る形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチド、及び当該ポリヌクレオチドを含むベクターを含んでいることを特徴としている。本明細書中において、「形質転換体」は、細胞、組織又は器官だけでなく、生物個体をも含むことが意図される。本発明に係る形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチド、及び当該ポリヌクレオチドを含むベクターを含んでいる限り、特に限定されるものではない。
本発明は、さらに、被験試料中のリガンドを検出するリガンド検出方法及びキットを提供する。本発明に係るリガンド検出方法は、被験試料と、本発明に係る融合タンパク質とを接触させる工程を包含することを特徴としている。本方法においては、被験試料と接触させる融合タンパク質に含まれる酵素の基質を、適宜接触させてもよい。これにより、本発明に係る融合タンパク質からの発光量に基づいて、被験試料中のリガンドを検出する。本明細書中において、「被験試料」は、リガンドそのものであってもよく、リガンドを含む試料であってもよい。また、被験試料は、本発明に係る融合タンパク質が発現した細胞の細胞内物質であることもできる。
(i)本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するプラスミドを、24穴プレート上の生細胞に導入し、さらに16時間培養する。
(ii)上記細胞を、基質を含む溶液に浸す。
(iii)上記細胞を被験試料で刺激し、刺激前後の発光量の変化を発光度計で測定する。
(i)公知の方法により精製した発光プローブを直径1.2センチの十字架型紙片の末端に垂らして乾燥させる。
(ii)上記十字架型紙片の中央に刺激物質を含む基質溶液15mLを点滴し、即時に発光Scanner(例えば、RAS−3000;FujiFilm)で発光量を測定する。
本発明は、さらに、本発明に係るプローブの生産方法及びキットを提供する。本発明に係るプローブの生産方法は、本発明に係るポリヌクレオチド又は本発明に係るベクターを用いて細胞を形質転換する工程を包含することを特徴としている。本方法においては、本発明に係るポリヌクレオチド又は本発明に係るベクターを用いて細胞を形質転換し、本発明に係るプローブを細胞中に発現させることによって、本発明に係るプローブを生産する。細胞中に発現させたプローブは、公知の方法により細胞中から回収し、精製することができる。
適当なプライマー及びテンプレートを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)しながら断片のそれぞれの端部に特異的な制限酵素認識部位を導入し、円順列変異したプローブを構成する各cDNA断片を生成した。例えば、Xenopus Laevis由来のカルモジュリン(CaM)を増幅するために、Dr Miyawakiから提供されたYellow Cameleon−3.1(YC3.1)を、PCRのテンプレートとして用いた(非特許文献4参照)。特異的な制限酵素認識部位を図5に示す。
アフリカ緑ザル腎臓由来のCOS−7細胞を、10%ステロイドフリーウシ胎児血清(FBS)及び1%ペニシリン−ストレプトマイシン(P/S)を添加したDulbecco改変イーグル培地(DMEM;Sigma製)を含む24ウエルプレートにおいて、cellインキュベータ(Sanyo製)中で、37℃、5%CO2存在下で培養した。導入試薬としてTransIT−LT1(Mirus製)を用いて、COS−7細胞に、pCFG、pCPF又はpCPC(各ウエル当り0.2μg)を一過性形質転換した。形質転換した細胞を、5%CO2存在下で16時間インキュベートした。
CPC、CPF又はCPGからの相対的な発光強度を、各リガンドの存在下又は非存在下において比較した。結果を図7に示す。
CBLuc又はその変異体は、pH、温度及び重金属イオンには感受性を示さず、組織透過性の高い615nmの赤色発光を生成する。我々は、CBLuc Redのこれらの利点を、新規のプローブの合成に利用した。ERリガンドの刺激により、ER LBDのY537がリン酸化される。これはSrcタンパク質のSH2ドメインによって感度よく認識される(非特許文献18)。本発明者らは、本発明のプローブを構築するために、この典型的なERの非ゲノム相互作用を利用した。
種々の濃度のリガンドに対するCPCのリガンド感受性を測定した。実施例2と同様に、24ウエルプレートで培養したCOS−7細胞をpCPCで一過性形質転換した。形質転換してから16時間経過後、種々の濃度のリガンドを用いて形質転換細胞を刺激した。発光強度を発光度計(Minilumat LB9506)を用いて測定した。細胞の刺激には、溶媒(終濃度0.1%DMSO)、OHT、エストロン、17β−エストラディオール(E2)、DHT及びコルチゾールを用いた。
CPCがERアゴニストではなく、ERアンタゴニストに対して感受性を示すという結果に基づいて、アンタゴニスト結合CPCに対するE2の抑制効果を調べた。実施例2と同様に、24ウエルプレートで培養したCOS−7細胞を、pCPCで一過性形質転換した。形質転換してから16時間経過した後、細胞を10−5M E2で5分間、前刺激した。E2刺激後の細胞を、種々の核レセプターアンタゴニストを更に導入し、インキュベートした。核レセプターアンタゴニストとして、シグリタゾン、ICII82780、ゲジステイン及びOHT(それぞれ終濃度10−6M)を用いた。結果として得られた発光強度を、核レセプターアンタゴニスト単独で刺激した細胞の発光強度と比較した。結果を図11に示す。
リガンド−プローブ結合の経時変化を、pCPCで形質転換したCOS−7細胞で評価した。実施例2と同様に、12ウエルプレートで培養したCOS−7細胞を、pCPCで一過性形質転換し、さらに6時間インキュベートした。インキュベート後の形質転換細胞に10−6M OHT又は溶媒(0.1%DMSO)を添加後、2、5、10、20及び30分後の発光強度を測定した。結果を図12に示す。
COS−7細胞における細胞質Ca2+の動向を、pCPGで形質転換した細胞、及びコントロールとして図14に示すSMGで形質転換した細胞においてそれぞれ観察した。哺乳動物細胞における遊離Ca2+は、代表的なセカンドメッセンジャーである。図14に示すように、CPGは、GLucをQ105地点で切断し、断片を10GSリンカーを用いて円順列変異し、その外側の端部に、M13ペプチド及びカルモジュリンをそれぞれ融合して合成した。SMGは、GLucのN末端断片とC末端断片との間にカルモジュリンとM13ペプチドとがつなげられている点においてCPGと異なっている。すなわち、SMGにおいては発光酵素を円順列変異していない。
細胞質Ca2+イオンレベルの保持を、pCPGで形質転換したCOS−7細胞からの発光強度に基づいて観察した。実施例2と同様に、24ウエルプレートで培養したCOS−7細胞を、pCPGで一過性形質転換し16時間インキュベートした。インキュベート後の形質転換細胞を、溶媒(PBS)、0.5mMヒスタミン、0.5mMヒスタミン及び10μMシクロヘプタジエン、0.5mMヒスタミン、0.5mM ATP、0.5mM ATP及び10μMシクロヘプタジエン、0.5mM ATP及び1μM タプシガーギン(thapsigargen)、2μMイオノマイシン、により20分間刺激した。
CPCのさらなるコントロールであるCPC−ctrlのリガンド感受性を、CPCのリガンド感受性とを比較した。図17に示すように、CPC−ctrlは、Src SH2と ER LBDとの間に、CBLucのN末端断片とC末端断片とが、この順に連結されている。すなわち、CPC−ctrlにおいては、Src SH2と ER LBDとの間に位置する酵素を円順列変異していない点においてのみCPCと異なっている。
帯域通過フィルターにより遮光したそれぞれの発光量を比較した。COS−7細胞から発する光の波長を、一連の帯域通過フィルターを用いて試験した。実施例2と同様に、24ウエルガラスプレートで培養したCOS−7細胞を、pCPCで一過性形質転換し、16時間インキュベートした。セレンテラジンと、溶媒(0.1% DMSO)、10−6M E2及び10−6M OHTのいずれか1つとを含むHBSSバッファ 500μLに、細胞を浸した。リガンド刺激後20分間のそれぞれの細胞からの発光量を、一連の帯域通過フィルターを用いて一定時間毎に、510±10nm、535±10nm、540±10nm、560±10nm、610±10nmの波長において観察した。結果を図19に示す。
COS−7細胞において、細胞質Ca2+の挙動を、CPG及びCPG−ctrlを用いて観察した。GLucをQ105地点で切断し、断片を10GSリンカーを用いて円順列変異した。その外側の端部に、M13及びCaMをそれぞれ融合して、CPGを作製した。CPGのコントロールプローブとして、CPGと同一の構成要素を用いて、GLucを円順列変異しない点のみにおいてCPGと異なるCPG−ctrlを並行して作製した(図20)。
COS−7細胞におけるセレンテラジン飽和の反応速度を、pCPG−ctrlを導入したCOS−7細胞で観察した。実施例2と同様に、24ウエルプレートで培養したCOS−7細胞をpCPG−ctrlで一過性形質転換し、16時間インキュベートした。プレート上の細胞をHBSSバッファにより1回洗浄し、HBSSバッファ 500μLに浸した。セレンテラジン添加後の発光量の変化を、生物発光プレートリーダー(Mithras LB 940;Berthold)により追跡した。結果を図22に示す。図22に示すように、COS−7細胞において、セレンテラジンの吸収は8.5分後に飽和した。
Claims (19)
- リガンドを検出する融合タンパク質であって、
前記リガンドに対するリガンド結合タンパク質と、
当該リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識する認識タンパク質と、
その親水性領域において2つに分割された発光酵素の、C末側断片とN末側断片とを当該リガンド結合タンパク質及び当該認識タンパク質の間に有し、
前記C末側断片のC末端基が、前記N末側断片のN末端基の上流に位置しており、
前記リガンド結合タンパク質及び前記認識タンパク質は、下記(i)〜(iii)のいずれかであり:
(i)前記リガンド結合タンパク質がエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインであり、且つ、前記認識タンパク質はSrcタンパク質のSH2ドメインである;
(ii)前記リガンド結合タンパク質がアンドロゲン受容体であり、且つ、前記認識タンパク質は共転写因子である;
(iii)前記リガンド結合タンパク質がカルモジュリンであり、且つ、前記認識タンパク質はミオシン軽鎖キナーゼ由来のM13ペプチドである、
前記リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを前記認識タンパク質が認識した場合に、2つに分割された前記発光酵素の断片が相補して発光量を変化させることを特徴とする融合タンパク質。 - 前記発光酵素の活性部位の少なくとも一部が、前記C末側断片のN末端、及び前記N末側断片のC末端にそれぞれ位置するように、前記発光酵素が分割されていることを特徴とする請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記発光酵素は、ホタルルシフェリン、レニラルシフェリン又は脂質を基質とするものであることを特徴とする請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記発光酵素は、ホタルルシフェラーゼ、クリックビートルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、及び鉄道虫ルシフェラーゼからなる群より選択されることを特徴とする請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記リガンド結合タンパク質がエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインであり、前記認識タンパク質がSrcタンパク質のSH2ドメインであり、前記発光酵素がクリックビートルルシフェラーゼであることを特徴とする請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記リガンド結合タンパク質がアンドロゲン受容体であり、前記認識タンパク質が共転写因子であり、前記発光酵素がホタルルシフェラーゼであることを特徴とする請求項1に記載の融合タンパク質。
- 配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列からなる、融合タンパク質;あるいは
配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列の1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、2つに分割された発光酵素断片が相補して発光量を変化させる、融合タンパク質。 - 請求項1〜7のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
- 配列番号4又は5に示される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド;
配列番号4又は5に示される塩基配列の1個又は数個の塩基配列が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、2つに分割された発光酵素断片が相補して発光量を変化させる融合タンパク質をコードする塩基配列からなる、ポリヌクレオチド;
配列番号4又は5に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、2つに分割された発光酵素断片が相補して発光量を変化させる融合タンパク質をコードする塩基配列からなる、ポリヌクレオチド;あるいは
配列番号4又は5に示される塩基配列と少なくとも90%同一であり、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、2つに分割された発光酵素断片が相補して発光量を変化させる融合タンパク質をコードする塩基配列からなる、ポリヌクレオチド。 - 請求項8又は9に記載のポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とするベクター。
- 請求項8又は9に記載のポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とする非ヒト形質転換体。
- 請求項10に記載のベクターを含んでいることを特徴とする非ヒト形質転換体。
- 被験試料中のリガンドを検出する方法であって、
前記被験試料と、請求項1〜7のいずれかに記載の融合タンパク質とを接触させる工程を包含することを特徴とする方法。 - 請求項1〜7のいずれかに記載の融合タンパク質を備えることを特徴とする被験試料中のリガンドを検出するためのキット。
- 請求項8又は9に記載のポリヌクレオチドを用いて細胞を形質転換する工程を包含することを特徴とするプローブの生産方法。
- 請求項8又は9に記載のポリヌクレオチドを備えていることを特徴とするプローブの生産キット。
- 請求項10に記載のベクターを用いて細胞を形質転換する工程を包含することを特徴とするプローブの生産方法。
- 請求項10に記載のベクターを備えていることを特徴とするプローブの生産キット。
- リガンドを検出する融合タンパク質からなるプローブを生産する生産方法であって、
発光酵素の親水性領域における隣接する2アミノ酸残基の間を中心とするC末側断片およびN末側断片を、それぞれが独立して1つずつコードしている2つのポリヌクレオチドを作製する工程と、
前記リガンドに対するリガンド結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、当該リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識する認識タンパク質をコードするポリヌクレオチドとの間に、前記C末側断片をコードするポリヌクレオチドと前記N末側断片をコードするポリヌクレオチドとを連結して、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得る連結工程と、
前記連結工程で得られた、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、生細胞内外または非ヒト形質転換体において発現させる発現工程とを包含し、
前記融合タンパク質において前記C末側断片のC末端基と、前記N末側断片のN末端基とが連結されるように、前記連結工程において、前記C末側断片をコードするポリヌクレオチドと前記N末側断片をコードするポリヌクレオチドとを連結し、
前記リガンド結合タンパク質及び前記認識タンパク質は、下記(i)〜(iii)のいずれかであることを特徴とするプローブの生産方法:
(i)前記リガンド結合タンパク質がエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインであり、且つ、前記認識タンパク質はSrcタンパク質のSH2ドメインである;
(ii)前記リガンド結合タンパク質がアンドロゲン受容体であり、且つ、前記認識タンパク質は共転写因子である;又は
(iii)前記リガンド結合タンパク質がカルモジュリンであり、且つ、前記認識タンパク質はミオシン軽鎖キナーゼ由来のM13ペプチドである。
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