JP5665262B2 - Bcr−ablチロシンキナーゼ活性測定用試薬 - Google Patents
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Shahら、Cancer cell、2002年、第2巻、第2号、第117−125頁 ten Hoeveら、Cancer Res.、1994年、第54巻、第10号、第2563−2567頁
また、既存の方法、例えばイムノブロッティングを用いた方法におけるBCR−ABLの薬剤抵抗性を判定する際の、当該薬剤の有効濃度は、概ね1μM以上、特に10μM以上であるのに対して、本発明の方法は、薬剤の濃度が0.1μM以下であっても、また10μM以上であっても、その薬剤に対するBCR−ABLの抵抗性を判定することができる。このことは本発明の方法は、既存の方法よりも広いダイナミックレンジを有する方法として、既存の方法よりも定量的な情報を取得することが可能である点で有利な方法であることを意味する。
(1)発現カセットを有するベクターの構築
EYFPの変異体であるVenusをコードする塩基配列を含むDNA(理化学研究所 宮脇敦史博士から譲渡を受けた)に対して、増幅後のDNA断片が、当該塩基配列の終止コドンが欠失され、かつ増幅後のcDNAの5’及び3’末端にそれぞれ制限酵素EcoRIとXhoIの認識配列が導入された塩基配列を有するように設計・合成されたプライマーDNAを用いて、前記VenusをコードするDNAに対してPCR反応を行い、増幅DNA断片1を得た。
CrkLの全長アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むベクターpCXN2−FLAG−CrkL(ロックフェラー大学Knudsen博士から分与を受けた)に対して、増幅後のcDNAが、当該塩基配列の終止コドンが欠失され、かつ5’及び3’末端にそれぞれ制限酵素XhoIとNotIの認識配列が導入された塩基配列を有するように設計・合成されたプライマーDNAを用いてPCR反応を行い、増幅DNA断片3を得た。
CrkLの全長アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むベクターpCXN2−FLAG−CrkLに対して、増幅後のcDNAがCrkLの1〜222番目までのアミノ酸配列をコードし、かつ5’及び3’末端にそれぞれ制限酵素XhoIとNotIの認識配列が導入された塩基配列を有するように設計・合成されたプライマーDNAを用いてPCR反応を行い、増幅DNA断片4を得た。
ベクターpECFP−C1(Clontech社)のECFPをコードする領域に対して、増幅後のcDNAが、当該領域の終止コドンが欠失され、かつ5’及び3’末端にそれぞれ制限酵素NotIとBglIIの認識配列が導入された塩基配列を有するように設計・合成されたプライマーDNAを用いてPCR反応を行って増幅DNA断片5を得た。
Pickle2.2:CFP157−238・1−156
Pickle2.3:CFP173−238・1−172
Pickle2.4:CFP195−238・1−194
Pickle2.5:CFP229−238・1−228
BCR−ABL全長の翻訳領域を含むcDNA(カリフォルニア工科大学Baltimore博士より分与を受けた)には、bcr−ablの開始コドンの5’側にEcoRIの認識配列、870−871番目のアミノ酸に相当する部位にHindIIIの認識配列、及び終止コドンの3’側にSpeIの認識配列が存在する。このcDNAをSpeIで消化し、dNTP存在下でDNAポリメラーゼI(Klenow酵素、Invitrogen社)を反応させて平滑末端化した後、HindIIIで消化して、cDNA断片(BCR−ABL(3’))を調製した。
293F細胞(Invirtogen社)をFree style 293 medium(同社)中で培養し、293fection(同社)に添付されたプロトコールに従って、pCMV−Myc−BCR−ABLとpPickle1.0〜2.5を導入し、前記培地中で24〜36時間インキュベーション後、遠心分離で細胞を回収した。細胞を可溶化バッファー(15mM NaCl、0.5% TritonX−100を含む20mMトリス塩酸緩衝液pH7.5)で溶解し、遠心分離後の上清をサンプルとして、分光光度計FP−750(日本分光社)を用いて、420nmの励起光により生じる蛍光発光(530nm)を測定した。蛍光強度の比較は、pPickle1.0〜2.5のみを導入した各コントロールとの間で行った。
実施例1の(6)と同様にして293F細胞にpCMV−Myc−BCR−ABLとpPickle2.0を導入して、前記培地中で24〜36時間培養した。BCR−ABLの発現量を導入するベクター量の調整を行うことによって段階的に調節し、それぞれのロットにおける蛍光発光を、(6)と同様にして測定した。また、各ロットの細胞抽出物を、SDSゲルを用いて電気泳動した後、抗CrkL抗体、抗リン酸化CrkL抗体(いずれもCell Signalling Technology社)及び抗c−Abl抗体(Santa Cruz Biotechnology社)を用いてウエスタンブロッティングを行った。
実施例1の(6)と同様にして293F細胞にpCMV−Myc−BCR−ABLとpPickle2.0を導入して、さらに所定量(0.01〜10μM)のイマニチブ(ノバルティス社から供与を受けた)を培地に添加して、24〜48時間培養を行った。各ロットにおける蛍光発光を、実施例1の(6)と同様にして測定した。また、実施例2と同様にしてウエスタンブロッティングを行った。
BCR−ABL陽性であるヒト慢性骨髄性白血病由来K562細胞を、10%牛胎児血清を添加したRPMI1640培地(Sigma社)中で、37℃、5%CO2下で24時間培養した後、NucleofectorT−020 SolutionV(Amaxa社)を用いてpPickle2.0を導入した。細胞を1μMのイマニチブを含む前記培地/ポリLリジンコートした35mmガラス底培養皿に移し、提示毎にタイムラプス顕微鏡で観察を行いながら、48時間インキュベートした。観察法およびFRETの計算は、Ohbaらの方法(EMBO J.、2003年、第22巻、第4号、第859−869頁)に従って行った。
Claims (24)
- 蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする2種以上の分子により修飾された、BCR−ABLによってリン酸化される基質タンパク質又は被リン酸化部位を含むそのペプチド断片からなる、BCR−ABLのチロシンキナーゼ活性を検出するための試薬であって、前記蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする2種以上の分子のうちの少なくとも1が、配列番号8に示されるアミノ酸配列の465〜708番目までのアミノ酸配列からなるCFP変異体である前記試薬。
- 蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする2種以上の分子により修飾された、BCR−ABLによってリン酸化される基質タンパク質又は被リン酸化部位を含むそのペプチド断片からなる、BCR−ABLのチロシンキナーゼ活性を検出するための試薬であって、前記基質タンパク質又は被リン酸化部位を含むそのペプチド断片が、配列番号2に示されるアミノ酸配列の1〜222番目までのアミノ酸配列からなるペプチド断片である前記試薬。
- 前記基質タンパク質又は被リン酸化部位を含むそのペプチド断片のN末端とC末端がそれぞれ蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする2種以上の分子により修飾された、請求項1又は2に記載の試薬。
- 前記蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする2種以上の分子が、前記タンパク質又は被リン酸化部位を含むそのペプチド断片のN末端及びC末端に融合タンパク質として連結された蛍光タンパク質である、請求項1〜3の何れかに記載の試薬。
- 前記蛍光タンパク質が、GFP、eGFP、YFP、CFP、DsRed及びそれらの変異体よりなる群から選ばれる蛍光タンパク質である、請求項4に記載の試薬。
- 前記蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする2種以上の分子により修飾された、BCR−ABLによってリン酸化される基質タンパク質又は被リン酸化部位を含むそのペプチド断片が、配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質である、請求項1に記載の試薬。
- 前記蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする2種以上の分子により修飾された、BCR−ABLによってリン酸化される基質タンパク質又は被リン酸化部位を含むそのペプチド断片が、配列番号6又は配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質である、請求項2に記載の試薬。
- チロシンキナーゼ阻害剤と請求項1〜7の何れかに記載の試薬と患者から採取された検体とをインキュベートする工程、及び前記試薬からの蛍光発光を検出する工程を含む、前記検体に含まれるチロシンキナーゼの前記チロシンキナーゼ阻害剤に対する抵抗性を確認する方法。
- 蛍光発光が、蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする2種以上の分子間における蛍光共鳴エネルギー移動により生ずる蛍光発光である、請求項8に記載の方法。
- 検体が腫瘍細胞であり、インキュベートが当該腫瘍細胞の内部で行われる、請求項8又は9に記載の方法。
- 試験化合物の存在下で請求項1〜7の何れかに記載の試薬とBCR−ABLとを反応させる工程、及び前記試薬からの蛍光発光を測定する工程を含む、BCR−ABLのチロシンキナーゼ活性に対する阻害剤をスクリーニングする方法。
- 試験化合物の存在下で請求項1〜7の何れかに記載の試薬とBCR−ABLとを反応させる工程がBCR−ABLを発現することのできる細胞の内部で行われる、請求項11に記載の方法。
- SH2ドメインを含むペプチドとBCR−ABLによって認識される被リン酸化部位を含むペプチドの2種のペプチドからなる、BCR−ABLのチロシンキナーゼ活性を検出するための試薬であって、前記2種のペプチドがそれぞれ蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする異なる分子により修飾されており、前記蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする異なる分子のうちの1が、配列番号8に示されるアミノ酸配列の465〜708番目までのアミノ酸配列からなるCFP変異体である前記試薬。
- 前記SH2ドメインを含むペプチドが配列番号9に示されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項13に記載の試薬。
- 前記BCR−ABLによって認識される被リン酸化部位が配列番号2に示されるアミノ酸配列の204〜211番目のアミノ酸配列である、請求項13又は14に記載の試薬。
- SH2ドメインを含むペプチドとBCR−ABLによって認識される被リン酸化部位を含むペプチドの2種のペプチドからなる、BCR−ABLのチロシンキナーゼ活性を検出するための試薬であって、前記2種のペプチドがそれぞれ蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする異なる分子により修飾されており、前記2種のペプチドのうちの少なくともいずれかが、配列番号2に示されるアミノ酸配列の1〜222番目までのアミノ酸配列からなるペプチド断片である前記試薬。
- 前記蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする異なる分子が、前記SH2ドメインを含むペプチドのN末端と前記BCR−ABLによって認識される被リン酸化部位を含むペプチドのC末端に融合タンパク質として連結された異なる蛍光タンパク質である、請求項13〜16の何れかに記載の試薬。
- 前記蛍光タンパク質が、GFP、eGFP、YFP、CFP、DsRed及びそれらの変異体よりなる群から互いに異なって選ばれる蛍光タンパク質である、請求項17に記載の試薬。
- チロシンキナーゼ阻害剤と請求項13〜18の何れかに記載の試薬と患者から採取された検体とをインキュベートする工程、及び前記試薬からの蛍光発光を検出する工程を含む、前記検体に含まれるチロシンキナーゼの前記阻害剤に対する抵抗性を確認する方法。
- 蛍光発光が、蛍光共鳴エネルギー移動を可能とする2種以上の分子間における蛍光共鳴エネルギー移動により生ずる蛍光発光である、請求項19に記載の方法。
- 検体が腫瘍細胞であり、インキュベートが当該腫瘍細胞の内部で行われる、請求項19又は20に記載の方法。
- 試験化合物の存在下で請求項13〜18の何れかに記載の試薬とBCR−ABLとを反応させる工程、及び前記試薬からの蛍光発光を測定する工程を含む、BCR−ABLのチロシンキナーゼ活性に対する阻害剤をスクリーニングする方法。
- 試験化合物の存在下で請求項13〜18の何れかに記載の試薬とBCR−ABLとを反応させる工程が、BCR−ABLを発現することのできる細胞の内部で行われる、請求項22に記載の方法。
- 下記(i)または(ii)をコードするDNA;
(i)請求項1〜7の何れかに記載の基質タンパク質もしくはペプチド断片、
(ii)請求項13〜18の何れかに記載の2種のペプチド。
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