JP2003501095A - ディクチオステリウムからのｃＡＰＭ依存プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の制御サブユニットのｃＡＰＭ測定のための使用 - Google Patents

ディクチオステリウムからのｃＡＰＭ依存プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の制御サブユニットのｃＡＰＭ測定のための使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ディクチオステリウム・ジスコイデウムからのｃＡＰＭ依存プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の制御サブユニットのｃＡＰＭ検出のための使用に関する。本発明は、Ｒ−サブユニットの大腸菌中での発現およびグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）への融合のための構築物を包含する。蛍光標識したｃＡＰＭもしくはｃＧＭＰを用いるかまたは吸光もしくは放射スペクトルが改変された変異体ＧＦＰを用いることにより、蛍光エネルギー輸送（ＦＲＥＴ）をｃＡＰＭ結合をモニターするための手段として用いる。ｃＡＰＭ結合によるＦＲＥＴの変化は、ｃＡＰＭレベルのインビトロかまたは生細胞内での測定を可能にするであろう。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明はインビトロまたは生細胞内でのｃＡＰＭの測定に関する。本発明はさ
らに、該方法に用いる分子、および該分子をコードするＤＮＡ構築物にも関する
。
【０００２】 （背景技術） 分子生物学、医薬品試験および医学的診断ではｃＡＰＭ濃度を測定することが
望ましい。なぜなら分子内ｃＡＰＭは多くの生細胞で共通する二次メッセンジャ
ーだからである。溶液中のｃＡＰＭ濃度は、現在、心筋タンパク質抽出物かまた
は抗体のいずれかを用いて日常的に測定されている（Amersham、ｃＡＰＭアッセ
イ、ＴＲＫ４３２またはＲＰＡ５０９）。
【０００３】 ｃＡＰＭレベルを測定するには、細胞を溶解し、ｃＡＰＭを可溶化する必要が
ある。そのような方法は時間がかかるうえ、ホスホジエステラーゼによるｃＡＰ
Ｍの分解、不完全な溶解またはマスキング剤の結果としての人工産物を生じやす
い。筋肉抽出物に基づく現在の方法では０.１２５〜３２ピコモル／ｍｌの範囲
の可溶化ｃＡＰＭの濃度を測定可能であり、ラジオイムノアッセイでは０.２５
〜１６ピコモル／ｍｌの範囲の測定が可能である。アセチル化は、これら検出限
界を３〜１０の次数で向上させる。シンチレーション近似アッセイは、検出閾値
を大幅に改善することなくラジオイムノアッセイをさらに簡単にする（Amersham
、ＲＰＡ５３８）。
【０００４】 （発明の開示） （発明が解決しようとする技術的課題） インビトロおよびインビボで使用可能な一層良好なｃＡＰＭ測定法に対する必
要性が依然として存在する。
【０００５】 （その解決方法） 本発明は、そのような方法を提供するものであり、以下の観察に基づく。 ディクチオステリウム（Dictyostelium）からのｃＡＰＭ依存プロテインキナ
ーゼ（ＰＫＡ）の制御サブユニットはｃＡＰＭに対する約２０ｎＭのＫＤを示し
、これは哺乳動物酵素の１０〜３０ｎＭと同様の範囲である。それゆえ、このＰ
ＫＡはｃＡＰＭ測定のための代替系を代表しうると考えられた。 さらに、このタンパク質は、適当な発現ベクター中にその遺伝子を入れること
によってあらゆる細胞内で産生することができ、かくして細胞内ｃＡＰＭを測定
することも可能となる。
【０００６】 ホルモンのような細胞外シグナルの膜結合レセプターへの結合は、細胞内での
ｃＡＰＭ濃度の上昇を引き起こす。細胞内ｃＡＰＭは主としてＰＫＡの制御サブ
ユニットに結合し、制御（Ｒ）サブユニットおよび触媒（Ｃ）サブユニットを解
離する。ついで、遊離された触媒サブユニットは、代謝経路を制御する酵素から
転写因子に至る多くの物質をリン酸化する。それゆえ、細胞内ｃＡＰＭ濃度の測
定は、外部刺激後の特定の細胞の活性化状態を反映している。細胞内のｃＡＰＭ
上昇を追跡する方法は、Ｒ−Ｃ複合体の比率および位置をモニターする蛍光比イ
メージング（fluorescence ratio imaging）であった（Adamsら、1991, Nature 349 , 694-697）。しかしながら、タンパク質を蛍光団でインビトロにて標識した
後にマイクロインジェクションによって細胞内に戻す必要があることが、この方
法の一般化を妨げていた。
【０００７】 ｃＡＰＭ依存プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）は、真核細胞で殆ど普遍的に存在
する。哺乳動物ではＰＫＡは２つの制御（Ｒ）サブユニットと酵素（Ｃ）サブユ
ニット（これらは別の遺伝子によってコードされている）からなるへテロ四量体
から構成されている。ディクチオステリウムではＰＫＡは１つのＲサブユニット
と１つのＣサブユニットとのへテロ二量体のみで構成されている。ディクチオス
テリウムからのＲサブユニットは哺乳動物のＲＩＩ型と極めて似ており、哺乳動
物のＣサブユニットと相互作用することができる（ReymondおよびVeron, 1995,
DdPKA, cAMP-dependent PK (D. discoideum), In: The protein kinase Facts b
ook, protein-serine kinase, G. HardieおよびS. Hanks編（ロンドン：アカデ
ミックプレス）、pp. 70-72）。しかしながら、ディクチオステリウムのＲサブ
ユニットは天然では二量体を形成しないという独特の性質を有している。本発明
者らは、このことがｃＡＰＭ結合の研究並びにＲ−Ｃ相互作用の研究を容易にす
るのではないかと期待した。
【０００８】 しかしながら、ｃＡＰＭの変化を検出することのできる生細胞内でのリポータ
ー分子が必要である。 アエクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria）からのグリーン蛍光タンパ
ク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子が、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリー
の技術を用いて非侵襲的に細胞内でタンパク質をモニターする新たな道を切り開
いた（Chalfieら、1994, Science 263, 802-805および米国特許第５,４９１,０
８４号）。ＧＦＰタンパク質は、Ｓｅｒ６５、Ｔｙｒ６６およびＧｌｙ６７残基
が関与する自己触媒反応を行い、蛍光団の生成に導く。アミノ酸６６の周辺で一
連の変異が導入されており、励起および放射の両波長を修飾することが可能とな
っている（米国特許第５,７７７,０７９号）。
【０００９】 ドナーおよびアクセプターとして作用する２つのＧＦＰの使用が、蛍光エネル
ギー輸送（ＦＲＥＴ）を得ることを可能にした。適当な波長で励起したとき、ド
ナーのＧＦＰはアクセプターのＧＦＰの励起波長の範囲の光を放射する。ＦＲＥ
Ｔは蛍光団間の距離（ｄ）に依存し、ｄ６の関数として低下するため、ドナーと
アクセプターとは極めて近接して配置しなければならない。ＦＲＥＴの結果、ド
ナーの放射ピークは低下し、一方、アクセプターの放射は増大する。
【００１０】 しかしながら、ＧＦＰの使用の主たる制限は、ＧＦＰが目的タンパク質のＮ末
端かまたはＣ末端かのいずれかに挿入されることであった。このような挿入は、
多くの場合、目的タンパク質の不活化という結果となる。 本発明に導いた研究過程で、ＧＦＰはＲサブユニット内の殆ど任意の位置にそ
の蛍光能を失うことなく挿入できることがわかった（Biondiら、1998, Nucleic
Acids Research 26, 4946-52）。さらに、機能的なＲサブユニットの特性、すな
わちｃＡＰＭ結合およびＣサブユニットとの相互作用が多くの融合物で保持され
た。そのようなタンパク質はｃＡＰＭ結合のモニターに使用できることが期待さ
れた。しかしながら、蛍光がｃＡＰＭ結合のときに変化するような試験が好まし
いであろう。
【００１１】 本発明に従い、ディクチオステリウム・ジスコイデウム（Dictyostelium disc
oideum）からの特定のＲ−ＧＦＰ融合体が、ＦＲＥＴ変化に基づいてｃＡＰＭの
測定に使用できることが示された。これらＲ−ＧＦＰ融合体はまた生細胞内でも
用いることができる。さらに、単一のｃＡＰＭ分子に高親和性で結合することの
できる先端欠失した（truncated）Ｒサブユニットを用いて簡単な定量を得るこ
とができる。それゆえ、本発明は、蛍光タンパク質に融合することによって修飾
したｃＡＰＭ結合タンパク質を提供する。
【００１２】 さらに詳細には、本発明は、ディクチオステリウム・ジスコイデウムからのｃ
ＡＰＭ依存プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の制御サブユニットへのｃＡＰＭの結
合を蛍光の変化によりモニターすることを可能にするＤＮＡ構築物および方法を
提供する。この方法は本質的にインビトロおよびインビボの両試験に適用可能で
ある。なぜならＲサブユニットをコードする遺伝子並びにグリーン蛍光タンパク
質（ＧＦＰ）との融合体は細菌からヒト細胞に至る様々な生物で発現できるから
である。
【００１３】 本発明では、ディクチオステリウムのＲサブユニットを大腸菌で産生するため
の方法および組成物が提供される。大腸菌中での融合タンパク質の発現を可能に
するＤＮＡ構築物が記載され、その際、ドナーおよび／またはアクセプターのＧ
ＦＰは蛍光エネルギー輸送（ＦＲＥＴ）を可能とするようにＲサブユニット内の
特定の位置に挿入される。ＦＲＥＴの存在の証拠は、蛍光ｃＡＰＭまたはｃＧＭ
Ｐの間か、またはアクセプターとドナーのＧＦＰ間のいずれかで提示される。Ｆ
ＲＥＴはｃＡＰＭ結合で修飾される。それゆえ、提示されたＧＦＰ−Ｒ融合タン
パク質はｃＡＰＭ濃度の測定に適用することができる。 さらに、該融合遺伝子の性質は生細胞内での発現に適合したものであるため、
細胞内ｃＡＰＭ濃度をインビボで測定することができる。
【００１４】 本発明は、とりわけ融合生成物の調製のためのＤＮＡ構築物に関し、該構築物
は二量体を形成することのできないｃＡＰＭ依存プロテインキナーゼの制御サブ
ユニット（Ｒ）の少なくとも１つのｃＡＰＭ結合部位のコード配列を含み、該コ
ード配列はリポーターポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結し
ており、該融合生成物はｃＡＰＭ濃度の測定に用いるためのものであることを特
徴とする。特別の態様において、ｃＡＰＭ依存プロテインキナーゼはディクチオ
ステリウム・ジスコイデウムからのものである。
【００１５】 リポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列は、該制御サブユニット内にイ
ンフレームで挿入するのが好ましい。しかしながら、本発明は、リポーター遺伝
子をコードするＤＮＡ配列がＲユニットの１つのｃＡＰＭ結合部位とはインフレ
ームであるが他のｃＡＰＭ結合部位とはインフレームでない構築物をも包含する
。 本発明の特定の態様において、リポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列
はＲサブユニット内の塩基５１０にて挿入され、その結果、図１の構築物Ｒ２６
に例として示すようにアミノ酸１７０の後で開裂されリポータータンパク質に融
合されるＲ−タンパク質が産生される。
【００１６】 本発明の第二の態様は、図１の構築物Ｒ２８に例として示すように、リポータ
ータンパク質をコードするＤＮＡ配列がＲサブユニットＤＮＡ配列内の塩基１４
７の後にインフレームで挿入されたＤＮＡ構築物に関する。 さらなる態様に従い、ＤＮＡ構築物は図１の構築物Ｒ３３に例として示すよう
に、リポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列がＲサブユニットＤＮＡ配列
内の塩基７９２の後にインフレームで挿入されたようなものである。
【００１７】 さらに、リポータータンパク質をコードする第二のＤＮＡ配列が該Ｒサブユニ
ットＤＮＡ配列内にインフレームで挿入される。これらリポータータンパク質を
コードする両ＤＮＡ配列は、ＲサブユニットＤＮＡ配列上の１つのｃＡＰＭ結合
部位の外側に位置するのが好ましい。図１の二重構築物に示すように、第一のリ
ポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列がたとえばＲサブユニットＤＮＡ配
列内の位置１４７に挿入され、第二のリポータータンパク質をコードするＤＮＡ
配列がＲサブユニットＤＮＡ配列内の位置７９２に挿入される。
【００１８】 上記態様において、リポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列のうちの少
なくとも１つが蛍光タンパク質、とりわけアエクオレア・ビクトリアからのグリ
ーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする。蛍光タンパク質は、ＧＦＰ変異体
ｗ７またはＧＦＰ変異体Ｓ６５Ｔであってよい。 構築物内でのこれら蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列の位置は、融合生
成物中のこれら蛍光タンパク質間での蛍光エネルギー輸送（ＦＲＥＴ）を可能に
するのが好ましい。
【００１９】 このことは、たとえば、構築物内でのこれら蛍光タンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列の位置が、融合生成物においてこれら蛍光タンパク質が制御サブユニット
の三次元構造の同じ面上に位置するようなものであるときに達成される。あるい
は、構築物内でのこれら蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列の位置は、融合
生成物においてこれら蛍光タンパク質が触媒サブユニット（Ｃ）への結合により
ＦＲＥＴが変化するような位置にある。
【００２０】 ｃＡＰＭの測定のためには、構築物内でのこれら蛍光タンパク質をコードする
ＤＮＡ配列の位置は、融合生成物においてこれら蛍光タンパク質がｃＡＰＭ結合
によりＦＲＥＴが変化するような位置にあるのが好ましい。 特に有利な態様において、構築物内でのこれら蛍光タンパク質をコードするＤ
ＮＡ配列の位置は、融合生成物においてこれら２つの蛍光タンパク質間の距離が
約４Åとなるようなものである。
【００２１】 本発明はまた、ｃＡＰＭ濃度の測定のための測定手段の調製法であって、 （ａ）本発明によるＤＮＡ構築物を適当な宿主細胞に導入し、 （ｂ）該ＤＮＡ構築物によってコードされた融合タンパク質を該宿主細胞で発現
させ、ついで （ｃ）ｃＡＰＭ濃度の測定のための手段である該融合タンパク質を単離する ことを含む方法にも関する。 宿主細胞は、たとえば細菌宿主、とりわけ大腸菌である。融合タンパク質の精
製は、Ｎｉ−およびｃＡＰＭ−アフィニティーおよびサイズ分画により行う。
【００２２】 本発明はまた本発明の構築物によってコードされた融合タンパク質にも関し、
該タンパク質はｃＡＰＭ濃度をインビボまたはインビトロで測定するため手段と
して用いることができる。 該手段は生物学的流体中のｃＡＰＭ濃度の測定方法に用いることができ、該方
法は、 （ａ）請求項２５または２６に記載の融合タンパク質を所定濃度の蛍光環状ヌク
レオチドとともに生物学的流体に加え、 （ｂ）蛍光放射を記録し、その蛍光の最大値を所定濃度のｃＡＰＭで得られた標
準曲線と比較することによって生物学的流体中のｃＡＰＭ濃度を決定する ことを含む。 蛍光ヌクレオチドは、ｃＧＭＰ、（８−{{２−{（フルオレセイニルチオ−ウ
レイド）アミノ}エチル}チオ}グアノシン−３’,５’−サイクリック一リン酸、
ｃＡＭＰおよび（８−{{２−{（フルオレセイニルチオ−ウレイド）アミノ}エチ
ル}チオ}アデノシン−３’,５’−サイクリック一リン酸から選ばれてよい。
【００２３】 本発明はさらに、蛍光エネルギー輸送（ＦＲＥＴ）を得るために蛍光ドナーお
よびアクセプタータンパク質をｃＡＰＭ依存プロテインキナーゼ制御サブユニッ
トに挿入する方法に関し、該方法は、 （ａ）本発明のＤＮＡ構築物を適当な発現ベクターに入れ、 （ｂ）該ＤＮＡ構築物を含む適当な発現ベクターで原核細胞かまたは真核細胞の
いずれかを形質転換し、 （ｃ）アクセプター蛍光タンパク質とドナー蛍光タンパク質とからの放射ピーク
の比を用いて生細胞または抽出物でのＦＲＥＴを測定する ことを含む。
【００２４】 上記方法においてＤＮＡ構築物は、該ＤＮＡ構築物によってコードされる蛍光
ドナータンパク質および蛍光アクセプタータンパク質が制御サブユニットの同じ
側に位置するように、または該ＤＮＡ構築物によってコードされる蛍光ドナータ
ンパク質および蛍光アクセプタータンパク質が制御サブユニットの両側に位置す
るようにデザインするのが好ましい。 上記方法において、ＦＲＥＴは制御サブユニットへの触媒サブユニットの結合
によって修飾され、またはＦＲＥＴは制御サブユニットへのｃＡＰＭの結合によ
って修飾される。 以下に本発明をグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に関して記載する。
【００２５】 Ｈｉｓ−タグに融合させたディクチオステリウム・ジスコイデウムのＲサブユ
ニットをｐＲＳＥＴｂ発現ベクターを用いて大腸菌で発現させた。Ｒサブユニッ
ト遺伝子を蛍光タンパク質のコード遺伝子に融合させた。ディクチオステリウム
のＲサブユニット内へのＳ６５Ｔかまたはｗ７変異体グリーン蛍光タンパク質（
ＧＦＰ）遺伝子（Biondi(1998)、上掲）のいずれかのランダム挿入は、１２０以
上のクローンの単離という結果となり、これらクローンのうち幾つかはインフレ
ームの融合タンパク質をコードしており、他のクローンはＧＦＰコード領域を超
えてフレームシフトを示した。操作は全てBiondiら、1998上掲の記載に従った。
【００２６】 本発明ではｃＡＰＭ濃度の測定を可能とするために特定のＲ−ＧＦＰ融合物を
選択したが、該融合物は二量体を形成できないディクチオステリウムのＲサブユ
ニットと、２つではなく単一のｃＡＰＭ分子と結合できる分子との組み合せから
なっており、それゆえ動力学が簡単となった。 本発明の第一の態様では、クローンＲ２６を選択した。このクローンＲ２６は
、ｗ７−ＧＦＰに融合した先端欠失Ｒサブユニットを発現する構築物である。Ｇ
ＦＰの挿入は１塩基対の欠失を導き、ＧＦＰを過ぎてフレームシフトする結果と
なる（細い線）。この約５０ｋＤａの融合タンパク質は、単一のｃＡＰＭ結合部
位（部位Ａ、図１）を含むＲサブユニットのＮ末端部分がｗ７ＧＦＰに融合した
ものである。
【００２７】 Ｒ２６−ＧＦＰは、そのＮ末端のＨｉｓ−タグの存在に基づき、Ｎｉ−ＮＴＡ
アガロースカラムで精製した。このカラムから溶出したタンパク質をさらにｃＡ
ＰＭ−アガロースで精製した。ｃＧＭＰを用いてｃＡＰＭアガロースカラムから
Ｒ２６−ＧＦＰを特異的に溶出した。Ｒ２６−ＧＦＰからのｃＧＭＰおよび可能
な他の残留混入物の分離は、ＢｉｏＳｅｃＳＥＰ３０００カラムを用いたＨＰＬ
Ｃにより行った。 精製したＲ２６−ＧＦＰタンパク質の蛍光は、４７５ｎｍで主要な放射ピーク
（図２、白丸）および４３３ｎｍで励起ピーク（データは示していない）を示し
、ｗ７について報告された値に極めて近かった。この結果は、Ｒサブユニットへ
の融合がＧＦＰの蛍光特性に影響を及ぼさないことを確認するものである。
【００２８】 蛍光標識したｃＧＭＰ（（８−{{２−{（フルオレセイニルチオウレイド）ア
ミノ}エチル}チオ}グアノシン−３’,５’−サイクリック一リン酸、Biolog）を
精製Ｒ２６−ＧＦＰに加え、４３３ｎｍで励起しながら蛍光放射を記録した。蛍
光強度は４７５ｎｍで減少し、一方、５２０ｎｍでは増加し、８−フルオロ−ｃ
ＧＭＰの蛍光の最大値に対応していた（図２、白四角）。同様のスペクトルは蛍
光標識したｃＡＭＰ（（８−{{２−{（フルオレセイニルチオウレイド）アミノ}
エチル}チオ}アデノシン−３’,５’−サイクリック一リン酸）を用いたときに
も得られた。８−フルオロ−ｃＧＭＰを単独で４３３ｎｍで励起すると、８−フ
ルオロ−ｃＧＭＰの励起は約４９４ｎｍで起こるために５２０ｎｍでは放射は殆
ど検出できない。これらの結果は、先端欠失したＲサブユニットに融合したｗ７
−ＧＦＰと８−フルオロ−ｃＧＭＰとの間でＦＲＥＴが生じたことを示している
。
【００２９】 さらなる実験において、非標識のｃＡＰＭを８−フルオロ−ｃＧＭＰの５倍過
剰量で加えた。４７５ｎｍでの蛍光強度はＲ２６−ＧＦＰ単独の場合とほぼ同一
レベルまで再度上昇し、一方、５２０ｎｍでの蛍光は減少した（図２、黒丸）。
それゆえ、非標識ｃＡＰＭと８−フルオロ−ｃＧＭＰとの間で競合が生じ、ＦＲ
ＥＴの変化により非標識ｃＡＰＭの直接測定が可能となる。 標識８−フルオロ−ｃＧＭＰの濃度は蛍光変化を記録している際にさまざまで
あった（図３、挿入図）。４７５ｎｍでの蛍光が最も変化が大きかったのでＦＲ
ＥＴ変異の測定に用いた。４７５ｎｍでの蛍光強度を８−フルオロ−ｃＧＭＰ濃
度に対してプロットしたときに単純な二次関係が得られたので約８０±１０ｎＭ
のみかけの解離定数ＫＤを測定することができた（図３）。
【００３０】 同様の実験を８−フルオロ−ｃＡＰＭを用いて行い、約４.５ｎＭのみかけの
ＫＤを測定することができた。 ｃＡＰＭの真のＫＤを測定するため、８−フルオロ−ｃＧＭＰ濃度を段階的に
変えることにより競合実験を行った。各８−フルオロ−ｃＧＭＰ濃度に対して増
大濃度の非標識ｃＡＰＭを加え、各場合のｃＡＰＭに対するみかけのＫＤを計算
することができた（図４）。みかけのＫＤは８−フルオロ−ｃＧＭＰ濃度と直線
関係にあったので、０に外挿したときにｃＡＰＭに対する真のＫＤを計算するこ
とができた（図４、挿入図）。
【００３１】 Ｒ２６−ＧＦＰのｃＡＰＭに対する真のＫＤは約２０ｎＭ±５ｎＭであり、一
方、逆の実験はｃＧＭＰに対する約１.８５±０.２μＭのＫＤの決定に導いた。
これらの実験は、Ｒ２６−ＧＦＰが溶液中のｃＡＰＭを正確に測定するのに用い
ることができることを示している。この試験は細胞溶解液や生物学的流体などの
ｃＡＰＭを含有するいかなる試料にも応用することができ、検量曲線との比較に
よりそのｃＡＰＭ濃度の決定を可能とするものである。
【００３２】 本発明の第二の態様は、ディクチオステリウムのＲサブユニットおよびＦＲＥ
Ｔの変化を用いた同じ原理によるものであるが、ｃＡＰＭ濃度のインビボ測定に
適合した仕方で行うものである。クローンＲ２８−ＧＦＰはＳ６５ＴＧＦＰに融
合したディクチオステリウムからのＲサブユニットを発現する（図１）。クロー
ンＲ３３ではｗ７−ＧＦＰがＲサブユニットのｃＡＰＭ結合部位Ｂ内に挿入され
ている。両融合タンパク質ともに溶液中でｃＡＰＭに結合することができる（Bi
ondiら、1998、上掲）。これら結果は、Ｒ２８−ＧＦＰタンパク質およびＲ３３
−ＧＦＰタンパク質の両者がｃＡＰＭ−アガロースカラム上で保持される能力に
よってさらに示されるように、ＲサブユニットがＧＦＰの存在にも拘らず適切に
折り畳まれていることを示している。
【００３３】 Ｒサブユニットは進化を通じてよく保存されており、ディクチオステリウムの
Ｒサブユニットは哺乳動物酵素の結晶座標にならってモデル化することができる
。ＧＦＰの挿入部位をそのようなモデルで位置付けた。ＦＲＥＴを得るためにド
ナーＧＦＰおよびアクセプターＧＦＰを極めて近接して置いた。本発明に従い、
ＦＲＥＴを得るために挿入部位が融合タンパク質の同じ面に位置する融合タンパ
ク質が提供される。この基準を適用して、１２０のランダムな挿入物からＧＦＰ
−Ｒ融合の適切なペアを選択した。Ｒ２８およびＲ３３はこの基準を満たしてお
り、さらにＲサブユニットのｃＡＰＭ結合部位Ａのいずれかの側にＧＦＰ挿入を
提供した。
【００３４】 変異体ＧＦＰｗ７は４３３ｎｍでの励起および４７５ｎｍでの放射の最大値を
示し、一方、変異体Ｓ６５Ｔはそれぞれ４８９ｎｍおよび５１１ｎｍで励起およ
び放射の最大値を示す（HeimおよびTsien, 1996, Current Biology 6, 178-82）
。両ＧＦＰ変異体とも重要な量子収量を示す（それぞれ、０.４２および０.６４
）。さらに、ｗ７の放射最大値はＳ６５Ｔの励起最大値と極めて近接しており、
極めて近接して配置したときにＦＲＥＴを生じさせることができる可能性がある
。
【００３５】 ＲサブユニットにフランキングするＸｈｏＩ部位および内部のＥｃｏＲＶ部位
を用い、融合Ｒタンパク質がｃＡＰＭ結合部位ＡをフランキングするＷ７および
Ｓ６５Ｔ−ＧＦＰの両者を含むような仕方でＲ２８のＲ−ＧＦＰコード断片をＲ
３３と組み合せた（図１、二重）。その結果得られる遺伝子は、理論的な分子量
が９６ｋＤａの二重ＧＦＰ融合タンパク質をコードする。これら構築物をＴ７プ
ロモーターの制御下にｐＲＳＥＴｂベクター内部で製造したのでＨｉｓ−タグ二
重ＧＦＰの大腸菌中での発現が可能となった。
【００３６】 この構築物で形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）細菌からの全タンパク質のウエ
スタンブロットは、抗Ｈｉｓ−タグ抗体と反応する予期したサイズのタンパク質
を示す（図５）。 大腸菌（ＢＬ２１ＤＥ３）で発現された二重ＧＦＰ−Ｒタンパク質をさらに精
製した。Ｎｉ−ＮＴＡ−アガロースおよびｃＡＰＭ−アガロースアフィニティー
クロマトグラフィーおよび／またはＨＰＬＣの組み合せは、結合ヌクレオチドを
欠く機能性の二重ＧＦＰ−Ｒの調製物を得ることを可能にした。
【００３７】 二重ＧＦＰ−Ｒのスペクトル特性を、光電子増倍管（photomultiplicator）を
備えた分光蛍光計ＰＴＩ Ｃ６０を用いて決定した。全細胞かまたは部分的に精
製したタンパク質のいずれかは、ｗ７の励起波長、すなわち４３４ｎｍで励起し
たときに、４７０ｎｍと４８０ｎｍとの間に肩、および５１１ｎｍに明らかなピ
ークを有する放射プロフィルを示した（図６Ａ、太い黒線）。肩はｗ７の放射に
対応し、一方、主要なピークはＳ６５Ｔ放射を表していた。
【００３８】 ＦＲＥＴと各ＧＦＰからの放射スペクトルとを区別するため、二重ＧＦＰ／Ｒ
をトリプシンで消化した。ＧＦＰはトリプシンに耐性であることがわかっていた
が、一方、Ｒサブユニットはトリプシンにより攻撃される。４７５ｎｍでの蛍光
の増大およびそれと同時の５１１ｎｍでの蛍光の減少がタンパク質加水分解的開
裂の後に観察されたが（図６Ａ、細い灰色の線）、このことは２つのＧＦＰが別
々に分散し、それゆえＦＲＥＴ効果が低下したことを示している。 Ｒ２８およびＲ３３を用いた対照実験は基本的に蛍光の変化を示さず、トリプ
シンがＧＦＰ自体の蛍光コアを修飾させないことを示していた（データは示して
いない）。二重ＧＦＰ／Ｒ構築物中での２つのＧＦＰの組み合せが蛍光エネルギ
ー輸送（ＦＲＥＴ）という結果となると結論付けられた。
【００３９】 Ｒサブユニットのコンホメーションの変化は２つのＧＦＰ間の距離を増大させ
、それゆえＦＲＥＴを減弱することがあり得る。まず、ＲサブユニットがＣサブ
ユニットに結合したときにＦＲＥＴが変化するか否かを分析した。ディクチオス
テリウムからの精製Ｃサブユニットを二重ＧＦＰ／Ｒの存在下でインキュベート
し、放射を記録した（図６Ａ、太い灰色の線）。４７５ｎｍでのピークは増大し
、一方、５１１ｎｍでのピークは減少し、ＦＲＥＴの低下に対応していた。二重
ＧＦＰ／ＲサブユニットをｃＡＰＭ（５０μＭ）とともに前以てインキュベート
すると５１１ｎｍでのピークは再び増大し、ＦＲＥＴが部分的に回復したことを
示していた（図６、細い黒線）。これら結果は、ＦＲＥＴが二重ＧＦＰ／Ｒサブ
ユニットのＣサブユニットへの結合によってｃＡＰＭに依存した仕方で修飾され
ることを示している。このことは、４７５ｎｍおよび５１１ｎｍでのピークの相
対強度に基づいて遊離のＲサブユニットと結合したＲサブユニットとの識別を可
能にするものであり、生細胞内でのそのような比率の決定への道を開くものであ
る。
【００４０】 コンホメーション変化はまた、単にｃＡＰＭが結合することによってもまた生
じ得る。二重ＧＦＰ−Ｒを増大濃度のｃＡＰＭとともにインキュベートした。図
６Ｂからわかるように、高濃度のｃＡＰＭ（５００μＭ、太線）のみが二重ＧＦ
Ｐ／Ｒ単独と比べて約１０％のみの振幅変化という結果となり（細い線）、この
モニターＦＲＥＴ変化は高濃度のｃＡＰＭの測定にのみ用いることができること
を示していた。
【００４１】 ｃＡＰＭ結合タンパク質、すなわちＲ−サブユニット上でのＦＲＥＴの測定可
能性は、ｃＡＰＭ濃度の測定への新たな道を開くものである。本発明によれば、
ＦＲＥＴが生じるのみならず、リガンド結合によってＦＲＥＴが変調されること
が示される。ＧＦＰを、ＧＦＰの末端挿入を有する組換え製造した断片の代わり
に完全なＲ−タンパク質に融合させた。タンパク質の三次元構造の予測から導き
出されるように、ＦＲＥＴは、２つの変異ＧＦＰがＲ−サブユニットの同じ面上
に極めて近接して配置されることによって得られた。これら２つの部位は、該分
子の同じ面上に２８Å離れて配置された。ＧＦＰ分子の直径は、その結晶構造か
ら導き出されるように約２４Åである。それゆえ、２つのＧＦＰバレル（barrel
s）の部位間の距離は約４Åであると推定できる。今度は同等の戦略を異なるタ
ンパク質に用いてＦＲＥＴを得ることができる。このアプローチは、三次元構造
が知られているかまたは導き出すことのできるいかなるタンパク質にも適用でき
る。タンパク質の同じ側に蛍光タンパク質を約４Å離れて配置されるように挿入
すると、エネルギーを相互に輸送することのできる可能性のある融合タンパク質
という結果となるであろう。
【００４２】 上記に記載した例に基づき、さらなるタンパク質融合物を認識することができ
る。可能な修飾の非網羅的な一覧には、Ｒ−サブユニットのＢ部位は完全なまま
で残しながらＡ部位から先端欠失させるもの、および／またはＲ−残基かまたは
ＧＦＰ−残基のいずれかの化学合成物を化学的結合により再結合したもの（特定
のアミノ酸の修飾を可能とする）が含まれる。 本発明の方法のさらなる拡張は、Ｒサブユニットに融合したｗ７またはＳ６５
Ｔ ＧＦＰを、異なるスペクトル特性かまたは他の発色団のいずれかを有する変
異タンパク質で置換することを含む。ＧＦＰの代わりに他の蛍光タンパク質また
はペプチド（HeimおよびTsien, 1996、上掲）を挿入することができる。
【００４３】 融合遺伝子は異なるプロモーターまたは停止配列下に配置することにより、デ
ィクチオステリウム、酵母または哺乳動物細胞のような他の宿主中で発現させる
ことができる。後者の場合、ＧＦＰおよびＲの両者のコドンは哺乳動物細胞中で
の発現に適合したものを採用し、かくして融合タンパク質の発現レベルを上昇さ
せることができる（Zolotukhinら、1996, Journal of Virology 70, 4646-4654
）。
【００４４】 本明細書に記載したタンパク質である二重ＧＦＰ−ＲはｃＡＰＭ濃度をインビ
トロおよびインビボで測定するのに用いることができる。後者の応用の場合、二
重ＧＦＰ−ＲコードＤＮＡを、選択した宿主に専用の発現ベクターに入れる。蛍
光を生細胞中で直接モニターする。ＦＲＥＴの発生および細胞内でｃＡＰＭ濃度
が増大したときのＦＲＥＴの修飾を、ドナーＧＦＰとアクセプターＧＦＰとの最
大放射の比により、細胞を殺すことなくモニターする。この非侵襲性の適用は特
に興味が持たれるものである。なぜなら細胞内でのｃＡＰＭレベルの変調はその
活性化状態を反映するものだからである。
【００４５】 とりわけ、細胞内ｃＡＰＭに対するホルモンの影響を、二重ＧＦＰ−Ｒを発現
する細胞内で直接モニターすることができる。この手順は、ホルモンアナログの
作用を追跡することを可能にするものであり、それゆえ医薬のスクリーニングに
適用することができる。そのような方法の利点は、ホルモンの結合をモニターす
るのみならず、デザインした物質が生物学的シグナル伝達を誘発する能力をもモ
ニターできることである。それゆえ、生細胞を試験することにより、細胞の生存
に影響を及ぼすことなくレセプターに対するアゴニスト活性またはアンタゴニス
ト活性を有する新規医薬の開発が可能となる。 一般に、本明細書に記載したＧＦＰに融合したＲ−サブユニットおよびその修
飾の使用は、ｃＡＰＭレベルの変化をインビトロかまたはインビボのいずれかで
測定するのに必要な手段を提供する。
【００４６】 本発明を以下の実施例によりさらに説明する。実施例 実施例１ ベクターおよび発現産物の調製 ディクチオステリウム・ジスコイデウムからのＲサブユニットの触媒コアをコ
ードするｃＤＮＡをＮ−末端Ｈｉｓ−タグに融合して発現ベクターｐＲＳＥＴｂ
（Etchebehereら、1997, Eur. J. Biochem. 248, 820-826）に挿入した（図１）
。このプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌（Stratagene）に形質転換し
、ウエスタンブロットによって認められるように（図５中のＲ）４４ｋＤａのタ
ンパク質を発現させた。 上記Ｒサブユニットプラスミド内にＧＦＰをランダム挿入することによりクロ
ーンＲ２６を得た（Biondiら、1998、上掲）。
【００４７】精製 大スケールの精製のため、蛍光細菌を白金耳を用いてＬＢ−寒天プレート上に
１条掻き取り、１０のＯＤ６００ｎｍまでＬＢブロス中に再浮遊させる。１０ｃ
ｍのペトリ皿当たり１００μｌの細菌浮遊液を接種する。２２℃で２〜４日間イ
ンキュベートした後、プレートから細菌を掻き取り、１５のペトリ皿について約
１０ｍｌのＬＢブロス中に再浮遊させる。ＳＳ３４Sorvalローターで６０００ｒ
ｐｍにて１０分間遠心した後、細菌を１０ｍｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８.
５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１錠剤／５０ｍｌの完全プロテアーゼインヒ
ビターカクテル（Boehringer ＮｏＩ６９７４９８１）中に再浮遊させる。１ｍ
ｌのリゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ、Sigma）を加え、試料を室温でわずかに攪拌
しながら３０分間インキュベートする。
【００４８】 ドライアイス−エタノール中での凍結および２２℃での解凍のサイクルを３サ
イクル行うことにより細菌を溶解させる。室温で３０分間インキュベートする前
にＭｇＣｌ２（５ｍＭまで）、ＮＰ４０（１％まで）、ＮａＣｌ（３００ｍＭま
で）、イミダゾール（５ｍＭまで）およびＤＮアーゼＩ（１μｇ／ｍｌまで）を
加えて溶解を完了させ、細菌ＤＮＡを分画する。 ＳＳ３４Sorvalローターで１６０００ｒｐｍにて１５分間遠心した後、上澄み
液を１ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロース（Qiagen）と混合し、室温で１時間インキ
ュベートする。このスラリーをカラムに負荷し、１０ベッド容量の５０ｍＭのＨ
ＥＰＥＳ（ｐＨ８.５）、３００ｍＭのＮａＣｌ、０.１％のTween 20、５ｍＭの
イミダゾールおよび上記プロテアーゼインヒビターで３回洗浄する。Ｈｉｓ−タ
グタンパク質の溶出は、イミダゾールの濃度を５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８.
５）および３００ｍＭのＮａＣｌ中で３００ｍＭまで上昇させることによって得
られる。
【００４９】 Ｒ２６−ＧＦＰの場合はわずかに変更した手順を用いた。Ｒ２６−ＧＦＰを寒
天プレートの代わりにロータリーシェーカー上の液体ＬＢ中で培養した。さらに
正確には、１白金耳の凍結ストックをアンピシリンを含む３０ｍｌのＬＢ中に接
種した。密度が０.３のＯＤ６００ｎｍに達するまでインキュベーションを３７
℃で行った。１５ｍｌを４００ｍｌのＬＢ中に希釈し、密度が０.５〜０.７のＯ
Ｄ６００ｎｍに達するまで３７℃で振盪を続けた。ついで、ＩＰＴＧを０.５ｍ
Ｍまで加え、インキュベーションを２２℃で一夜続けた。上記と同様にして遠心
分離および溶解を行った。
【００５０】 ついで、Ｎｉ−ＮＴＡ溶出液をｃＡＰＭアガロースカラム（Sigma、Ａ−７３
９６、約３マイクロモルｃＡＰＭ／ｍｌ（樹脂））に通す。２０ｍｇの樹脂を１
０ベッド容量の１ｍＭ ＥＤＴＡに懸濁し、室温で１時間インキュベートする。
樹脂をカラムに注ぎ、１０ベッド容量の洗浄緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐ
Ｈ８.５、１００ｍＭのＮａＣｌ、０.１％のトリトンＸ１００および０.５ｍＭ
のＤＴＴ）を通して平衡化する。試料をカラムに３回通す。ついで、カラムを、
（１）未添加、（２）５ｍＭの５’ＡＭＰ（５’アデノシン一リン酸）、（３）
５００ｍＭのＮａＣｌ、（４）未添加、を含有する１０ベッド容量の洗浄緩衝液
で順に洗浄する。Ｒ−ＧＦＰの溶出は、洗浄緩衝液中の５０ｍＭのｃＧＭＰ中、
室温で行う。
【００５１】 Ｒ−ＧＦＰからｃＧＭＰを除去するため、試料を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐ
Ｈ８.５、１００ｍＭのＮａＣｌ、０.１％のトリトンＸ１００、０.５ｍＭのＤ
ＴＴ（ジチオトレイトール）中で平衡化したセファロースＧ５０カラム（Pharma
cia）に通した。Ｒ−ＧＦＰは排除容量中に溶出するのに対し、ｃＧＭＰはカラ
ムに保持される。別法として、Ｇ５０カラムを５倍希釈緩衝液中で平衡化し、溶
出した試料を５倍に真空濃縮した。
【００５２】 時には５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７.２中で平衡化したＢｉｏＳｅｐ ＳＥ
Ｃ３０００カラム（Phenomenex）を用いたＨＰＬＣ（Hewlett Packard 1090）に
試料を通すことによりさらなる精製を行った。フラクションを回収し、ＰＫＡ触
媒活性の抑制、タンパク質純度（銀染色ＳＤ−ＰＡＧＥ電気泳動）または抗Ｈｉ
ｓタグ抗体を用いたウエスタンブロッティングのいずれかについてアッセイした
。 精製の各段階で、ｗ７ＧＦＰについては４３４ｎｍで励起させて蛍光放射スペ
クトルを記録した。約５０％の蛍光物質がＮｉ−ＮＴＡアガロースカラムに結合
していたのに対し、ｃＡＰＭ−アガロースカラムには１０％しか保持されなかっ
た。最終純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の染色から導き出されるように（銀、クー
マシー、またはポンソー）約５０％未満であった。
【００５３】ＦＲＥＴ測定 ＦＲＥＴ測定のため、Ｒ２６−ＧＦＰを約０.１μＭに希釈した。励起を４３
３ｎｍにて行い、一方、放射をＰＴＩ Ｃ６０分光蛍光計（Photon Technology I
nternational）で４５０〜５５０ｎｍの範囲で記録した。
【００５４】結果 Ｒ２６−ＧＦＰは４７５ｎｍで放射ピークを示す。種々の濃度の８−フルオロ
−ｃＧＭＰ（（８−{{２−{（フルオレセイニルチオウレイド）アミノ}エチル}
チオ}グアノシン−３’,５’−サイクリック一リン酸、Biolog）を指示に従って
加え（図２において５倍過剰量、白い四角）、放射スペクトルを再度記録した。
８−フルオロ−ｃＧＭＰは５２０ｎｍで放射ピークを示す。競合実験では非標識
ｃＡＰＭを所定濃度で加えた（図２、１００μＭ）。
【００５５】実施例２ 材料 プラスミドｐＲＳＥＴｂ−Ｒ−ＧＦＰはすでに記載した（Biondiら、1998、上
掲）。 大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）はStratageneから得た。制限酵素および完全プロ
テアーゼインヒビターカクテル錠剤はBoehringer Mannheimから得た。 蛍光スクリーニングは、ＢＰ４５０−４９０励起フィルター、ビームスプリッ
ター（beamsplitter）ＦＴ５１０およびＢＰ５１５−５６５放射フィルター（Ze
iss）を備えた倒立顕微鏡Axiovert 25（Zeiss）を用いて行った。 モノクローナル抗Ｈｉｓ−ＲＧＳ抗体はQiagenから得た。
【００５６】 ウエスタンブロット検出はAmershamからの化学ルミネセンスキットＥＣＬを用
いて行った。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥのための前染色タンパク質分子量標準（高）はGibcoから得
た。 蛍光スペクトルはPhoton Technology International C60装置を用いて得、デ
ータ処理はフェリックスソフトウエアを用いて行った。 標準法は、特に断らない限り、Sambrookら、1989（Molecular Cloning. A Lab
oratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）に
見出すことができる。
【００５７】方法 ディクチオステリウムの触媒コアの座標を、コンピュータープログラム「Swis
s pdb viewer 3」を用いてマウスＲサブユニットのモデルに適合させた。そのよ
うなモデル化は進化の過程でのＲサブユニットの高い保存によって可能である。
ついで、ＧＦＰとインフレームにある３５の融合体の挿入部位を入れた。２つの
挿入部位がＲサブユニットの同じ側に位置しているのみならず、挿入部位が約２
８Å離れていることから、Ｒ２８およびＲ３３を選択した。この組み合せは２つ
のＧＦＰバレル間で約４Åの距離という結果となり、それゆえＦＲＥＴを生じる
結果となる。
【００５８】 Ｓ６５Ｔ ＧＦＰに融合したＲサブユニットの一部を含有するＲ２８からのＥ
ｃｏＲＶ−ＸｈｏＩ断片（Biondiら、1998、上掲）を、Ｒ部分を含むＥｃｏＲＶ
−ＸｈｏＩ断片を除去したＲ３３からのｐＲＳＥＴｂ−Ｒ−ｗ７ ＧＦＰ中にラ
イゲートした。この構築物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、二重ＧＦ
Ｐ−Ｒの存在をＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化することによって確認した（２４００
ｂｐ断片）。
【００５９】 形質転換した細菌をＬＢアガロース上、室温で４日間増殖させるか、または上
記ＩＰＴＧで一夜誘発させる。細菌タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し
、イムノブロッティングにより分析する。Qiagenからの抗Ｈｉｓ−ＲＧＳモノク
ローナル抗体（１：５０００に希釈）は、Ｒサブユニット（４４ｋＤａ）と単一
のＧＦＰ（２７ｋＤａ）との融合から予期されるように、Ｒ−サブユニット、Ｒ
２８−ＧＦＰおよびＲ３３−ＧＦＰに対してそれぞれ約４０ｋＤａおよび２つの
７０ｋＤａのバンドを明らかにした。二重ＧＦＰ−Ｒ構築物で形質転換した細菌
は約１００ｋＤａのタンパク質を示したが、これはＲ−サブユニットに融合した
２つのＧＦＰに対して予期されたサイズであった（図１および図５）。より短い
分解産物もまた観察された。
【００６０】 大腸菌で発現された二重ＧＦＰ−Ｒを本質的に実施例１の記載に従って精製す
る。Ｎｉ−ＮＴＡ精製の後、染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で複数のバンドが観察
され、そのうち最大のものは約１００ｋＤａである。抗Ｈｉｓ−ＲＧＳ抗体を用
いたイムノブロッティングは約１００ｋＤａのバンドを示すが、これは２つのＧ
ＦＰとＲ−サブユニットとの融合に対して予期されたサイズである。ｃＡＰＭア
ガロースおよびＧ５０クロマトグラフィーの後、１００ｋＤａのバンドは全物質
の５０％未満を表していた。
【００６１】 部分的に精製した物質を実施例１の記載に従って蛍光について分析した。４５
０〜５５０ｎｍからの放射スペクトルを、８ｎｍのバンド幅および０.２〜１秒
の統合時間（integration time）を用い、４３４ｎｍでの所定の励起を用いて記
録した（図６）。 トリプシンを５０μｇ／ｍｌまで加え、蛍光を分析する前にインキュベーショ
ンを室温で３０分行った。５１１ｎｍでのピークサイズの減少およびそれと同時
の４７５ｎｍでのピークサイズの増大は、Ｒサブユニット部分のトリプシン開裂
によるＦＲＥＴの低減を示している。ＧＦＰはトリプシン開裂に対して全く耐性
であることが示されている。
【００６２】 ディクチオステリウムのＣ−サブユニットを大腸菌で発現させた（Etchebeher
eら、1997、上掲）。Ｃ−末端Ｈｉｓタグを有する形態を部分精製した形態で用
いた。５μｌのＣ−サブユニットを、放射スペクトルを記録する前に、最終容量
２００μｌの２０ｍＭのトリス、ｐＨ７.４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭの
ＡＴＰ中で１０分間、１００μｌの精製二重ＧＦＰ−Ｒとともにインキュベート
した（図６）。所望なら、Ｃ−サブユニットを加える前にｃＡＰＭ（５０μＭ、
最終濃度）を二重ＧＦＰ−Ｒとともに室温にて５分間、前以てインキュベートし
た。
【００６３】 第二の実験では、部分的に精製した二重ＧＦＰ−Ｒを増大濃度のｃＡＰＭの存
在下でインキュベートした（図６Ｂ）。すでに１ｍＭのｃＡＰＭが５１１ｎｍで
の放射を有意に減弱させ（点線）、３ｍＭのｃＡＰＭではこのピークをさらに強
く低減させた（太線）。約４８０ｎｍでピークが同時に増大したことは、ｃＡＰ
Ｍの結合によってＦＲＥＴが実際に低減したことを示していた。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＤＮＡ構築物の部分マップを示す。「ＰＳ」はプロモーター配列
であり、「Ａ」はｃＡＰＭ結合部位Ａを示し、一方、「Ｂ」はｃＡＰＭ結合部位
Ｂを示す。「Ｈ」はＨｉｓタグを示す。
【図２】 ＲサブユニットとＧＦＰとの融合体であるＲ２６−ＧＦＰ単独、
または８−フルオロ−ｃＧＭＰとｃＡＰＭとの競合の存在下での蛍光スペクトル
を示す。
【図３】 Ｒ２６−ＧＦＰに添加した８−フルオロ−ｃＧＭＰの増大濃度の
関数としてプロットした４７５ｎｍでの蛍光の低下を示す。
【図４】 Ｒ２６−ＧＦＰへの結合に対する非標識ｃＡＰＭと８−フルオロ
−ｃＧＭＰとの間の競合の効果を示す。挿入図は、みかけのＫＤ値をｃＡＰＭ濃
度の関数としてプロットしてある。真のＫＤ値である２０ｎＭはゼロへの外挿か
ら導き出すことができる。
【図５】 大腸菌中で発現したＲ２８、Ｒ３３および二重ＧＦＰのＧＦＰ−
Ｒ融合タンパク質のウエスタンブロットを示す。
【図６】 Ａは、二重ＧＦＰ−Ｒ融合タンパク質単独、トリプシンとのイン
キュベーション後、Ｃサブユニットとのインキュベーション後、およびＣサブユ
ニットおよびｃＡＰＭとのインキュベーション後の放射スペクトルを示す。Ｂは
、増大濃度のｃＡＰＭ単独とインキュベーションした同タンパク質の放射スペク
トルを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 DA12 FB07 FB12 GC15 2G054 AA06 CA22 EA02 4B024 AA11 BA80 CA04 CA07 DA11 EA04 FA02 GA11 HA01 HA11 4B063 QA01 QQ06 QQ13 QQ63 QR33 QR60 QR75 QR80 QS05 QS36 QX02 4H045 AA20 AA30 BA10 BA41 CA10 CA50 DA00 EA50 FA72 FA74 GA26

Claims (37)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 融合生成物の調製のためのＤＮＡ構築物であって、二量体を
    形成することのできないｃＡＰＭ依存プロテインキナーゼの制御サブユニット（
    Ｒ）の少なくとも１つのｃＡＰＭ結合部位のコード配列を含み、該コード配列は
    リポーターポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結しており、該
    融合生成物はｃＡＰＭ濃度の測定に用いるためのものであることを特徴とするＤ
    ＮＡ構築物。
  2. 【請求項２】 該ｃＡＰＭ依存プロテインキナーゼがディクチオステリウム
    ・ジスコイデウムからのものである、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
  3. 【請求項３】 該リポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列が該制御サ
    ブユニット内にインフレームで挿入される、請求項１または２に記載のＤＮＡ構
    築物。
  4. 【請求項４】 該リポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列がＲサブユ
    ニット内の塩基５１０にて挿入され、その結果、アミノ酸１７０の後で開裂され
    該リポータータンパク質に融合されたＲ−タンパク質が産生される、請求項２ま
    たは３に記載のＤＮＡ構築物。
  5. 【請求項５】 図１に記載の構築物Ｒ２６である、請求項４に記載のＤＮＡ
    構築物。
  6. 【請求項６】 該リポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列がＲサブユ
    ニットＤＮＡ配列内の塩基１４７の後にインフレームで挿入されている、請求項
    ２または３に記載のＤＮＡ構築物。
  7. 【請求項７】 図１に記載の構築物Ｒ２８である、請求項６に記載のＤＮＡ
    構築物。
  8. 【請求項８】 該リポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列がＲサブユ
    ニットＤＮＡ配列内の塩基７９２の後にインフレームで挿入されている、請求項
    ２または３に記載のＤＮＡ構築物。
  9. 【請求項９】 図１に記載の構築物Ｒ３３である、請求項８に記載のＤＮＡ
    構築物。
  10. 【請求項１０】 リポータータンパク質をコードする第二のＤＮＡ配列が該
    ＲサブユニットＤＮＡ配列内にインフレームで挿入されている、請求項１ないし
    ９のいずれかに記載のＤＮＡ構築物。
  11. 【請求項１１】 該リポータータンパク質をコードする両ＤＮＡ配列がＲサ
    ブユニットＤＮＡ配列上の１つのｃＡＰＭ結合部位の外側に位置している、請求
    項１０に記載のＤＮＡ構築物。
  12. 【請求項１２】 該第一のリポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列が
    ＲサブユニットＤＮＡ配列内の位置１４７に挿入され、該第二のリポータータン
    パク質をコードするＤＮＡ配列がＲサブユニットＤＮＡ配列内の位置７９２に挿
    入されている、請求項１０または１１に記載のＤＮＡ構築物。
  13. 【請求項１３】 図１に記載の二重構築物である、請求項１２に記載のＤＮ
    Ａ構築物。
  14. 【請求項１４】 該リポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列のうちの
    少なくとも１つが蛍光タンパク質をコードする、請求項１ないし１３のいずれか
    に記載のＤＮＡ構築物。
  15. 【請求項１５】 該蛍光リポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列がエ
    クオレア・ビクトリアからのグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする、
    請求項１４に記載のＤＮＡ構築物。
  16. 【請求項１６】 該蛍光タンパク質がＧＦＰ変異体ｗ７である、請求項１４
    または１５に記載のＤＮＡ構築物。
  17. 【請求項１７】 該蛍光タンパク質がＧＦＰ変異体Ｓ６５Ｔである、請求項
    １４または１５に記載のＤＮＡ構築物。
  18. 【請求項１８】 該構築物内での該蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列
    の位置が、融合生成物中の該蛍光タンパク質間での蛍光エネルギー輸送（ＦＲＥ
    Ｔ）を可能にするものである、請求項１０ないし１７のいずれかに記載のＤＮＡ
    構築物。
  19. 【請求項１９】 該構築物内での該蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列
    の位置が、融合生成物において該蛍光タンパク質が制御サブユニットの三次元構
    造の同じ面上に位置するようなものである、請求項１０ないし１８のいずれかに
    記載のＤＮＡ構築物。
  20. 【請求項２０】 該構築物内での該蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列
    の位置が、融合生成物において該蛍光タンパク質が触媒サブユニット（Ｃ）への
    結合によりＦＲＥＴが変化するような位置にあるものである、請求項１０ないし
    １９のいずれかに記載のＤＮＡ構築物。
  21. 【請求項２１】 該構築物内での該蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列
    の位置が、融合生成物において該蛍光タンパク質がｃＡＰＭ結合によりＦＲＥＴ
    が変化するような位置にあるものである、請求項１０ないし２０のいずれかに記
    載のＤＮＡ構築物。
  22. 【請求項２２】 該構築物内での該蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列
    の位置が、融合生成物において２つの該蛍光タンパク質間の距離が約４Åとなる
    ようなものである、請求項１０ないし２１のいずれかに記載のＤＮＡ構築物。
  23. 【請求項２３】 ｃＡＰＭ濃度の測定のための測定手段の調製法であって、
    （ａ）請求項１ないし２２のいずれかに記載のＤＮＡ構築物を適当な宿主細胞に
    導入し、 （ｂ）該ＤＮＡ構築物によってコードされた融合タンパク質を該宿主細胞で発現
    させ、ついで （ｃ）ｃＡＰＭ濃度の測定のための手段である該融合タンパク質を単離する ことを含む方法。
  24. 【請求項２４】 該宿主が、細菌宿主、とりわけ大腸菌である、請求項２３
    に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 融合タンパク質の単離を、Ｎｉ−およびｃＡＰＭ−アフィ
    ニティーおよびサイズ分画により行う、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 請求項１ないし２２のいずれかに記載の構築物によってコ
    ードされたｃＡＰＭ濃度測定のための融合タンパク質。
  27. 【請求項２７】 請求項２３ないし２５のいずれかに記載の方法によって得
    られる、請求項２６に記載の融合タンパク質。
  28. 【請求項２８】 生物学的流体中のｃＡＰＭ濃度の測定方法であって、 （ａ）請求項２６または２７に記載の融合タンパク質を所定濃度の蛍光環状ヌク
    レオチドとともに生物学的流体に加え、 （ｂ）蛍光放射を記録し、その蛍光の最大値を所定濃度のｃＡＰＭで得られた標
    準曲線と比較することによって生物学的流体中のｃＡＰＭ濃度を決定する ことを含む方法。
  29. 【請求項２９】 該蛍光ヌクレオチドが、８−{{２−{（フルオレセイニル
    チオウレイド）アミノ}エチル}チオ}グアノシン−３’,５’−サイクリック一リ
    ン酸（ｃＧＭＰ）である、請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 該蛍光ヌクレオチドが、８−{{２−{（フルオレセイニル
    チオ−ウレイド）アミノ}エチル}チオ}アデノシン−３’,５’−サイクリック一
    リン酸（ｃＡＭＰ）である、請求項２８に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 蛍光エネルギー輸送（ＦＲＥＴ）を得るために蛍光ドナー
    タンパク質および蛍光アクセプタータンパク質をｃＡＰＭ依存プロテインキナー
    ゼ制御サブユニットに挿入する方法であって、 （ａ）請求項１ないし２２のいずれかに記載のＤＮＡ構築物を適当な発現ベクタ
    ーに入れ、 （ｂ）該ＤＮＡ構築物を含む適当な発現ベクターで原核細胞かまたは真核細胞の
    いずれかを形質転換し、 （ｃ）アクセプター蛍光タンパク質とドナー蛍光タンパク質とからの放射ピーク
    の比を用いて生細胞または抽出物でのＦＲＥＴを測定する ことを含む方法。
  32. 【請求項３２】 該ＤＮＡ構築物が、該ＤＮＡ構築物によってコードされる
    蛍光ドナータンパク質および蛍光アクセプタータンパク質が制御サブユニットの
    同じ側に位置するようにデザインされている、請求項３１に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 該ＤＮＡ構築物が、該ＤＮＡ構築物によってコードされる
    蛍光ドナータンパク質および蛍光アクセプタータンパク質がｃＡＰＭ結合ドメイ
    ンの両側に位置するようにデザインされている、請求項３１または３２に記載の
    方法。
  34. 【請求項３４】 該蛍光ドナータンパク質および蛍光アクセプタータンパク
    質がＧＦＰである、請求項３１ないし３３のいずれかに記載のタンパク質。
  35. 【請求項３５】 該蛍光ドナータンパク質および蛍光アクセプタータンパク
    質が変異体ｗ７およびＳ６５Ｔである、請求項３４に記載のタンパク質。
  36. 【請求項３６】 ＦＲＥＴが制御サブユニットへの触媒サブユニットの結合
    によって修飾される、請求項３１ないし３５のいずれかに記載の方法。
  37. 【請求項３７】 ＦＲＥＴが制御サブユニットへのｃＡＰＭの結合によって
    修飾される、請求項３１ないし３６のいずれかに記載の方法。
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