JP2003155298A - （１→３）−β−Ｄ−グルカン結合ドメインタンパク質、該物質を使用した測定法及び測定キット - Google Patents
（１→３）−β−Ｄ−グルカン結合ドメインタンパク質、該物質を使用した測定法及び測定キットInfo
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 (1→3)-β-D-グルカンの優れた定量剤ならび
に測定方法を提供する。 【解決手段】 カブトガニのアメボサイトライセートに
由来するG因子のαサブユニットに存在する(1→3)-β-D
-グルカン結合ドメインからなるタンパク質を遺伝子工
学的に調製した後、蛍光物質との複合体とし、これを用
いて蛍光偏光法により(1→3)-β-D-グルカンを高感度か
つ迅速に検出定量する。反応液に二価の陽イオン、特に
アルカリ土類金属イオンを共存させると測定感度が顕著
に上昇する。
に測定方法を提供する。 【解決手段】 カブトガニのアメボサイトライセートに
由来するG因子のαサブユニットに存在する(1→3)-β-D
-グルカン結合ドメインからなるタンパク質を遺伝子工
学的に調製した後、蛍光物質との複合体とし、これを用
いて蛍光偏光法により(1→3)-β-D-グルカンを高感度か
つ迅速に検出定量する。反応液に二価の陽イオン、特に
アルカリ土類金属イオンを共存させると測定感度が顕著
に上昇する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光標識された(1
→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質、当該蛍
光標識された(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタン
パク質を用いた蛍光偏光による測定法及び該方法を実施
するための測定キットに関する。
→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質、当該蛍
光標識された(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタン
パク質を用いた蛍光偏光による測定法及び該方法を実施
するための測定キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】生体物質間の相互作用を利用して、微量
の生体物質等を高感度に測定、解析できる方法として蛍
光偏光度測定法（Perrin, J. Phys. Rad. 1:390-401(19
26)）が活用されている。
の生体物質等を高感度に測定、解析できる方法として蛍
光偏光度測定法（Perrin, J. Phys. Rad. 1:390-401(19
26)）が活用されている。
【０００３】このような従来利用されていた相互作用と
しては、例えばDNAハイブリダイゼーション、DNA結合性
タンパク質とDNAの結合、抗原抗体反応、リガンド-レセ
プターの結合、糖-レクチンの結合の他、エンドトキシ
ンとエンドトキシン中和タンパク質の結合があげられる
（WO98/21357）。
しては、例えばDNAハイブリダイゼーション、DNA結合性
タンパク質とDNAの結合、抗原抗体反応、リガンド-レセ
プターの結合、糖-レクチンの結合の他、エンドトキシ
ンとエンドトキシン中和タンパク質の結合があげられる
（WO98/21357）。
【０００４】一方、深在性真菌症等の重篤な症状を引き
起こす真菌感染の有無の検出には、従来からカブトガニ
の血球抽出液（アメボサイトライセート）成分が真菌細
胞壁の構成成分である(1→3)-β-D-グルカンによって活
性化されることによるセリンプロテアーゼのカスケード
反応を利用した測定法が用いられている。しかし、カブ
トガニは極めて貴重な生物資源であり、一部の地域では
捕獲規制の対象ともなっている。
起こす真菌感染の有無の検出には、従来からカブトガニ
の血球抽出液（アメボサイトライセート）成分が真菌細
胞壁の構成成分である(1→3)-β-D-グルカンによって活
性化されることによるセリンプロテアーゼのカスケード
反応を利用した測定法が用いられている。しかし、カブ
トガニは極めて貴重な生物資源であり、一部の地域では
捕獲規制の対象ともなっている。
【０００５】カブトガニのアメボサイトライセート中に
含まれる、(1→3)-β-D-グルカンに結合する(1→3)-β-
D-グルカン感受性因子（G因子）はαサブユニット中の
(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインを介し(1→3)-β-
D-グルカンに結合することが知られており、そのアミノ
酸配列及びそれをコードするDNA配列が明かとなってい
る（WO95/01432）。
含まれる、(1→3)-β-D-グルカンに結合する(1→3)-β-
D-グルカン感受性因子（G因子）はαサブユニット中の
(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインを介し(1→3)-β-
D-グルカンに結合することが知られており、そのアミノ
酸配列及びそれをコードするDNA配列が明かとなってい
る（WO95/01432）。
【０００６】しかしながら、目的とする被検物質と蛍光
標識された該物質に対する特異的結合物質との結合反応
により分子量や分子構造に大きな変化がなければ蛍光偏
光度の変化が顕著なシグナルとして観察されないため、
蛍光標識される特異的結合物質の分子量があまりにも大
きく、それに結合する被検物質の分子量が数千Da程度の
場合には適さない方法であると考えられていた。
標識された該物質に対する特異的結合物質との結合反応
により分子量や分子構造に大きな変化がなければ蛍光偏
光度の変化が顕著なシグナルとして観察されないため、
蛍光標識される特異的結合物質の分子量があまりにも大
きく、それに結合する被検物質の分子量が数千Da程度の
場合には適さない方法であると考えられていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】貴重な生物資源である
カブトガニ由来のアメボサイトライセートは、将来にわ
たり益々拡大し続ける医療ならびに環境衛生分野で真菌
の検出に使用し続けるには量に制限がある。そのため、
上記アメボサイトライセートを用いたカスケード反応に
よる真菌成分の検出法と同等以上に優れた真菌成分の微
量検出法の開発が期待されている。
カブトガニ由来のアメボサイトライセートは、将来にわ
たり益々拡大し続ける医療ならびに環境衛生分野で真菌
の検出に使用し続けるには量に制限がある。そのため、
上記アメボサイトライセートを用いたカスケード反応に
よる真菌成分の検出法と同等以上に優れた真菌成分の微
量検出法の開発が期待されている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題に
鑑み、鋭意検討した結果、カブトガニのアメボサイトラ
イセートに由来する(1→3)-β-D-グルカン感受性因子
（G因子）のαサブユニット内に存在する(1→3)-β-D-
グルカン結合性ドメインのみからなるタンパク質（本明
細書中では「(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタン
パク質」と記載する）を遺伝子工学的に調製した後、蛍
光標識し、検体中の(1→3)-β-D-グルカンを蛍光偏光法
によって測定したところ、極めて正確に検出することが
可能であること、また、反応液中に二価の陽イオン、特
にアルカリ土類金属イオンを共存させると、測定感度が
顕著に上昇することを見い出し、本発明を完成させた。
鑑み、鋭意検討した結果、カブトガニのアメボサイトラ
イセートに由来する(1→3)-β-D-グルカン感受性因子
（G因子）のαサブユニット内に存在する(1→3)-β-D-
グルカン結合性ドメインのみからなるタンパク質（本明
細書中では「(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタン
パク質」と記載する）を遺伝子工学的に調製した後、蛍
光標識し、検体中の(1→3)-β-D-グルカンを蛍光偏光法
によって測定したところ、極めて正確に検出することが
可能であること、また、反応液中に二価の陽イオン、特
にアルカリ土類金属イオンを共存させると、測定感度が
顕著に上昇することを見い出し、本発明を完成させた。
【０００９】すなわち、本発明は以下の通りである。
（１） 配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパ
ク質又は配列番号２にアミノ酸の置換、欠失、挿入、又
は転位を有するアミノ酸配列からなり、(１→３)-β-D-
グルカンへの結合性を有する分子量20k〜40kDaタンパク
質に、蛍光物質が結合してなる、蛍光標識した(1→3)-
β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質。 （２） 配列番号１記載の塩基配列からなる核酸がコー
ドするタンパク質、又は配列番号１記載の塩基配列に相
補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズする塩基配列からなる核酸がコードし、
(１→３)-β-D-グルカンへの結合性を有する分子量20k
〜40kDaのタンパク質に、蛍光物質が結合してなる、蛍
光標識した(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパ
ク質。 （３） 検体中の(1→3)-β-D-グルカンとを結合させ、
当該結合による蛍光偏光度の変化を検出し、蛍光偏光度
の変化量と検体中の(1→3)-β-D-グルカンの濃度とを関
連づけて(1→3)-β-D-グルカンを測定するための、
（１）又は（２）記載の蛍光標識した(1→3)-β-D-グル
カン結合性ドメインタンパク質を含む、(1→3)-β-D-グ
ルカン測定剤。 （４） 更に二価陽イオンを含む、（３）記載の(1→3)
-β-D-グルカン測定剤。 （５） 二価陽イオンがアルカリ土類金属イオンである
ことを特徴とする（４）記載の(1→3)-β-D-グルカン測
定剤。 （６） （１）又は（２）記載の蛍光標識した(1→3)-
β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質と検体中の(1
→3)-β-D-グルカンとを結合させ、当該結合による蛍光
偏光度の変化を検出し、蛍光偏光度の変化量と検体中の
(1→3)-β-D-グルカンの濃度とを関連づけることを特徴
とする(1→3)-β-D-グルカンの測定方法。 （７） 二価陽イオン共存下で蛍光標識した(1→3)-β-
D-グルカン結合性ドメインタンパク質と(1→3)-β-D-グ
ルカンとを結合させることを特徴とする（５）記載の(1
→3)-β-D-グルカンの測定方法。 （８） （１）又は（２）記載の蛍光標識された(1→3)
-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質を含む(1→3)
-β-D-グルカン測定キット。 （９） 更に二価陽イオンを含む（８）記載の(1→3)-
β-D-グルカン測定キット。 （１０） 二価陽イオンがアルカリ土類金属イオンであ
ることを特徴とする（９）記載の(1→3)-β-D-グルカン
測定キット。
ク質又は配列番号２にアミノ酸の置換、欠失、挿入、又
は転位を有するアミノ酸配列からなり、(１→３)-β-D-
グルカンへの結合性を有する分子量20k〜40kDaタンパク
質に、蛍光物質が結合してなる、蛍光標識した(1→3)-
β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質。 （２） 配列番号１記載の塩基配列からなる核酸がコー
ドするタンパク質、又は配列番号１記載の塩基配列に相
補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズする塩基配列からなる核酸がコードし、
(１→３)-β-D-グルカンへの結合性を有する分子量20k
〜40kDaのタンパク質に、蛍光物質が結合してなる、蛍
光標識した(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパ
ク質。 （３） 検体中の(1→3)-β-D-グルカンとを結合させ、
当該結合による蛍光偏光度の変化を検出し、蛍光偏光度
の変化量と検体中の(1→3)-β-D-グルカンの濃度とを関
連づけて(1→3)-β-D-グルカンを測定するための、
（１）又は（２）記載の蛍光標識した(1→3)-β-D-グル
カン結合性ドメインタンパク質を含む、(1→3)-β-D-グ
ルカン測定剤。 （４） 更に二価陽イオンを含む、（３）記載の(1→3)
-β-D-グルカン測定剤。 （５） 二価陽イオンがアルカリ土類金属イオンである
ことを特徴とする（４）記載の(1→3)-β-D-グルカン測
定剤。 （６） （１）又は（２）記載の蛍光標識した(1→3)-
β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質と検体中の(1
→3)-β-D-グルカンとを結合させ、当該結合による蛍光
偏光度の変化を検出し、蛍光偏光度の変化量と検体中の
(1→3)-β-D-グルカンの濃度とを関連づけることを特徴
とする(1→3)-β-D-グルカンの測定方法。 （７） 二価陽イオン共存下で蛍光標識した(1→3)-β-
D-グルカン結合性ドメインタンパク質と(1→3)-β-D-グ
ルカンとを結合させることを特徴とする（５）記載の(1
→3)-β-D-グルカンの測定方法。 （８） （１）又は（２）記載の蛍光標識された(1→3)
-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質を含む(1→3)
-β-D-グルカン測定キット。 （９） 更に二価陽イオンを含む（８）記載の(1→3)-
β-D-グルカン測定キット。 （１０） 二価陽イオンがアルカリ土類金属イオンであ
ることを特徴とする（９）記載の(1→3)-β-D-グルカン
測定キット。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を発明の実施の形態
により詳説する。 （１）本発明物質 本発明物質は蛍光物質が結合した(1→3)-β-D-グルカン
結合性ドメインタンパク質である。
により詳説する。 （１）本発明物質 本発明物質は蛍光物質が結合した(1→3)-β-D-グルカン
結合性ドメインタンパク質である。
【００１１】本発明物質における(1→3)-β-D-グルカン
結合性ドメインタンパク質は、カブトガニのアメボサイ
トライセート中に含まれる(1→3)-β-D-グルカン感受性
因子（G因子）のαサブユニットに存在する(1→3)-β-D
-グルカン結合ドメインと同一のアミノ酸配列（配列番
号２）からなるタンパク質であるか、その配列に置換、
欠失、挿入、又は転位を有するアミノ酸配列を有し、か
つ(1→3)-β-D-グルカン結合性を有する分子量20k〜40k
Daのタンパク質である。
結合性ドメインタンパク質は、カブトガニのアメボサイ
トライセート中に含まれる(1→3)-β-D-グルカン感受性
因子（G因子）のαサブユニットに存在する(1→3)-β-D
-グルカン結合ドメインと同一のアミノ酸配列（配列番
号２）からなるタンパク質であるか、その配列に置換、
欠失、挿入、又は転位を有するアミノ酸配列を有し、か
つ(1→3)-β-D-グルカン結合性を有する分子量20k〜40k
Daのタンパク質である。
【００１２】ここで、(1→3)-β-D-グルカン結合ドメイ
ンとは、配列番号３記載のG因子のαサブユニットのア
ミノ酸配列中、アミノ酸番号406〜672の268アミノ酸残
基からなるドメインを指称する。
ンとは、配列番号３記載のG因子のαサブユニットのア
ミノ酸配列中、アミノ酸番号406〜672の268アミノ酸残
基からなるドメインを指称する。
【００１３】従って、本発明物質における(1→3)-β-D-
グルカン結合性ドメインタンパク質は、配列番号２記載
のアミノ酸配列を有するか、又はそれに高い相同性を有
するアミノ酸配列、すなわち、70%以上100%未満、好ま
しくは80%以上100%未満、最も好ましくは90%以上100%未
満の相同性を有するアミノ酸配列を有する。従って、配
列番号２記載のアミノ酸配列にアミノ酸の置換、欠失、
挿入、又は転位を有するアミノ酸配列を有するタンパク
質も、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸配列と高い
相同性を有し、該タンパク質が(1→3)-β-D-グルカン結
合性を有する限りにおいて本発明物質における(1→3)-
β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質に含まれる。
ここで、置換、欠失、挿入、又は転位するアミノ酸の数
は、全アミノ酸数の30%未満、好ましくは20%未満、もっ
とも好ましくは10%未満であり、具体的には最大で40
個、好ましくは27個、より好ましくは13個までを指す。
グルカン結合性ドメインタンパク質は、配列番号２記載
のアミノ酸配列を有するか、又はそれに高い相同性を有
するアミノ酸配列、すなわち、70%以上100%未満、好ま
しくは80%以上100%未満、最も好ましくは90%以上100%未
満の相同性を有するアミノ酸配列を有する。従って、配
列番号２記載のアミノ酸配列にアミノ酸の置換、欠失、
挿入、又は転位を有するアミノ酸配列を有するタンパク
質も、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸配列と高い
相同性を有し、該タンパク質が(1→3)-β-D-グルカン結
合性を有する限りにおいて本発明物質における(1→3)-
β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質に含まれる。
ここで、置換、欠失、挿入、又は転位するアミノ酸の数
は、全アミノ酸数の30%未満、好ましくは20%未満、もっ
とも好ましくは10%未満であり、具体的には最大で40
個、好ましくは27個、より好ましくは13個までを指す。
【００１４】このようなタンパク質の分子量は20k〜40k
Da、好ましくは25k〜37kDa、より好ましくは27k〜32kD
a、最も好ましくは29k〜30kDaが例示される。
Da、好ましくは25k〜37kDa、より好ましくは27k〜32kD
a、最も好ましくは29k〜30kDaが例示される。
【００１５】尚、タンパク質中のアミノ酸が置換、欠
失、挿入、又は転位した変異タンパク質を得るには、そ
のアミノ酸に対応したDNAの塩基配列に対して置換、欠
失、挿入、又は転位を起こさせた変異DNAを発現させる
ことで可能であるが、このようなDNAの変異は、変異を
起こさせたい配列部分を含む塩基配列を有し、両末端に
制限酵素切断末端を有する塩基配列を有するDNA断片で
あって、当該DNA断片の1又は二以上（変異を起こさせた
いアミノ酸数に相当する塩基数）の塩基の置換、欠失、
挿入、又は転位を有する配列のDNA断片を合成し、これ
を未変異DNAの相当する塩基配列部分を入れ替えること
で容易に行うことが可能である。また部位特異的変異法
（Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. In Enzymol.,
154, 350(1987)、Kunkel, T. A. et al., Meth. In Enz
ymol., 154, 367(1987)）等の方法によっても、DNAに置
換、欠失、挿入、又は転位等の変異を起こさせることが
可能である。
失、挿入、又は転位した変異タンパク質を得るには、そ
のアミノ酸に対応したDNAの塩基配列に対して置換、欠
失、挿入、又は転位を起こさせた変異DNAを発現させる
ことで可能であるが、このようなDNAの変異は、変異を
起こさせたい配列部分を含む塩基配列を有し、両末端に
制限酵素切断末端を有する塩基配列を有するDNA断片で
あって、当該DNA断片の1又は二以上（変異を起こさせた
いアミノ酸数に相当する塩基数）の塩基の置換、欠失、
挿入、又は転位を有する配列のDNA断片を合成し、これ
を未変異DNAの相当する塩基配列部分を入れ替えること
で容易に行うことが可能である。また部位特異的変異法
（Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. In Enzymol.,
154, 350(1987)、Kunkel, T. A. et al., Meth. In Enz
ymol., 154, 367(1987)）等の方法によっても、DNAに置
換、欠失、挿入、又は転位等の変異を起こさせることが
可能である。
【００１６】また、上記配列番号２記載のアミノ酸配列
は、配列番号１記載の塩基配列を有する核酸がコードす
るアミノ酸配列である。尚、一つのアミノ酸に対応する
トリプレットが複数存在するが、同一のアミノ酸配列を
コードする限りにおいて、異なる塩基配列によってコー
ドされ、(1→3)-β-D-グルカン結合性を有する(1→3)-
β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質に蛍光物質が
結合したものであれば本発明物質に含まれるのは言うま
でもない。
は、配列番号１記載の塩基配列を有する核酸がコードす
るアミノ酸配列である。尚、一つのアミノ酸に対応する
トリプレットが複数存在するが、同一のアミノ酸配列を
コードする限りにおいて、異なる塩基配列によってコー
ドされ、(1→3)-β-D-グルカン結合性を有する(1→3)-
β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質に蛍光物質が
結合したものであれば本発明物質に含まれるのは言うま
でもない。
【００１７】また、配列番号１記載の塩基配列と相補的
な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズする塩基配列からなるDNAがコードするアミノ酸配列
を有し、(1→3)-β-D-グルカン結合性を有するタンパク
質も、上記(1→3)-β-D-グルカン結合ドメインタンパク
質には包含される。
な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズする塩基配列からなるDNAがコードするアミノ酸配列
を有し、(1→3)-β-D-グルカン結合性を有するタンパク
質も、上記(1→3)-β-D-グルカン結合ドメインタンパク
質には包含される。
【００１８】上記塩基配列は例えば配列番号１記載の塩
基配列に相補的な塩基配列を有するDNAにストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、このDNA
を常法に従って適当な宿主（例えば枯草菌、大腸菌等の
原核細胞、酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞などの真核細
胞、特に原核細胞が好ましく、その中でも大腸菌が好ま
しい）に導入し、常法に従って遺伝子を組換え、導入遺
伝子を発現させることによって(1→3)-β-D-グルカン結
合性ドメインタンパク質を調製することが可能である。
基配列に相補的な塩基配列を有するDNAにストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、このDNA
を常法に従って適当な宿主（例えば枯草菌、大腸菌等の
原核細胞、酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞などの真核細
胞、特に原核細胞が好ましく、その中でも大腸菌が好ま
しい）に導入し、常法に従って遺伝子を組換え、導入遺
伝子を発現させることによって(1→3)-β-D-グルカン結
合性ドメインタンパク質を調製することが可能である。
【００１９】尚、本明細書における「ストリンジェント
な条件」とは、例えば50%ホルムアミド、5×SSPE（20×
SSPE：2.97M NaCl、0.2M NaH2PO4・H2O、0.025M EDTAを
含むpH7.4の水溶液）、5×デンハルト溶液（100×デン
ハルト液：1gのフィコール400（ファルマシア社製）、1
gのポリビニルピロリドン（PVP-360：シグマ社製）、1g
のBSAフラクションV（牛血清アルブミン：シグマ社製）
を50mlの水に溶解した水溶液）、0.5%SDS（ドデシル硫
酸ナトリウム）の存在下、42℃で16時間のインキュベー
ト、更にその後の0.1%SDSを含む1×SSPE、0.1%SDSを含
む0.1×SSPEによる55℃での順次洗浄を行う条件又はこ
れと核酸のハイブリダイズにおいて同等の機能の条件を
指称する。このような条件下で、あるDNAにハイブリダ
イズするDNAは、あるDNAに対して相同性が70%以上ある
と考えられ、たとえば807塩基からなるDNAにおいては、
560塩基以上の塩基配列が共通していることになる。
な条件」とは、例えば50%ホルムアミド、5×SSPE（20×
SSPE：2.97M NaCl、0.2M NaH2PO4・H2O、0.025M EDTAを
含むpH7.4の水溶液）、5×デンハルト溶液（100×デン
ハルト液：1gのフィコール400（ファルマシア社製）、1
gのポリビニルピロリドン（PVP-360：シグマ社製）、1g
のBSAフラクションV（牛血清アルブミン：シグマ社製）
を50mlの水に溶解した水溶液）、0.5%SDS（ドデシル硫
酸ナトリウム）の存在下、42℃で16時間のインキュベー
ト、更にその後の0.1%SDSを含む1×SSPE、0.1%SDSを含
む0.1×SSPEによる55℃での順次洗浄を行う条件又はこ
れと核酸のハイブリダイズにおいて同等の機能の条件を
指称する。このような条件下で、あるDNAにハイブリダ
イズするDNAは、あるDNAに対して相同性が70%以上ある
と考えられ、たとえば807塩基からなるDNAにおいては、
560塩基以上の塩基配列が共通していることになる。
【００２０】本発明物質における蛍光物質は、安定した
蛍光を発する物質であれば特に限定はされない。例えば
そのような物質としてはフルオロセイン、フルオロセイ
ン誘導体（フルオロセインスクシンイミジルエステル
（FS）、フルオロセインC6スクシンイミジルエステル
（C6スペーサーを導入したFS）、5-((2-アミノエチル)
チオウリジル)、フルオロセイン、フルオロセインイソ
チオシアネート(FITC)、5-(4,6-ジクロトリアジン-2-イ
ル)アミノフルオロセイン等）、4,4-ジフルオロ-4-ボラ
3a,4a-ジアザ-5-インダセン-3-プロピオン酸スクシンイ
ミジルエステル、6-(((4-(4,4-ジフルオロ-5-(2-チエニ
ル)-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-5-インダセン-3-イル)フェノ
キシ)アセチル)アミノ)ヘキサン酸スクシンイミジルエ
ステル、4-アセトアミド-4'-イソシアナトスチルベン-
2,2'-ジスルホン酸、7-アミノ-4-メチルクマリン、7-ア
ミノ-4-トリメチルクマリン、N-(4-アニリノ-1-ナフチ
ル)マレイミド、ダンシルクロライド、4',6-ジアミジノ
-2-フェニルインドール、4,4'-ジイソチオシアナトスチ
ルベン-2,2'-ジスルホン酸、エオシンイソチオシアネー
ト、エリトロシンB、フルオレサミン、フルオレセイン-
5(6)-カルボキシアミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル、フルオレセイン-5-イソチオシアネ
ートジアセテート、4-メチルウンベリフェロン、o-フタ
ルジアルデヒド、ローダミンBイソチオシアネート、硫
酸ローダミン101酸クロライド、テトラメチル-ローダミ
ンイソチオシアネート、及び2',7'-ジフルオロフルオレ
セインなどが挙げられ、フルオロセイン又はフルオロセ
イン誘導体が好ましく、特にFITCが好ましい。
蛍光を発する物質であれば特に限定はされない。例えば
そのような物質としてはフルオロセイン、フルオロセイ
ン誘導体（フルオロセインスクシンイミジルエステル
（FS）、フルオロセインC6スクシンイミジルエステル
（C6スペーサーを導入したFS）、5-((2-アミノエチル)
チオウリジル)、フルオロセイン、フルオロセインイソ
チオシアネート(FITC)、5-(4,6-ジクロトリアジン-2-イ
ル)アミノフルオロセイン等）、4,4-ジフルオロ-4-ボラ
3a,4a-ジアザ-5-インダセン-3-プロピオン酸スクシンイ
ミジルエステル、6-(((4-(4,4-ジフルオロ-5-(2-チエニ
ル)-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-5-インダセン-3-イル)フェノ
キシ)アセチル)アミノ)ヘキサン酸スクシンイミジルエ
ステル、4-アセトアミド-4'-イソシアナトスチルベン-
2,2'-ジスルホン酸、7-アミノ-4-メチルクマリン、7-ア
ミノ-4-トリメチルクマリン、N-(4-アニリノ-1-ナフチ
ル)マレイミド、ダンシルクロライド、4',6-ジアミジノ
-2-フェニルインドール、4,4'-ジイソチオシアナトスチ
ルベン-2,2'-ジスルホン酸、エオシンイソチオシアネー
ト、エリトロシンB、フルオレサミン、フルオレセイン-
5(6)-カルボキシアミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル、フルオレセイン-5-イソチオシアネ
ートジアセテート、4-メチルウンベリフェロン、o-フタ
ルジアルデヒド、ローダミンBイソチオシアネート、硫
酸ローダミン101酸クロライド、テトラメチル-ローダミ
ンイソチオシアネート、及び2',7'-ジフルオロフルオレ
セインなどが挙げられ、フルオロセイン又はフルオロセ
イン誘導体が好ましく、特にFITCが好ましい。
【００２１】(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタン
パク質と蛍光物質との結合は、検出操作において行われ
る通常の洗浄操作などでも蛍光物質が遊離しない程度の
結合であれば結合様式を問わない。具体的には水素結
合、イオン結合、共有結合などの化学結合が挙げられる
が、特に結合が強固である点から共有結合により結合し
ていることが最も好ましい。共有結合は(1→3)-β-D-グ
ルカン結合性ドメインタンパク質に含まれるアミノ酸の
側鎖や末端のカルボキシル基、アミノ基などの官能基を
利用して調製することが可能である。この結合は(1→3)
-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質と(1→3)-β-
D-グルカンとの結合を妨げない限り、いずれの官能基を
使用して調製しても良い。尚、このような化学結合のう
ち、特に(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク
質の安定性の観点から、室温よりも低い温度条件下で形
成が可能な化学結合であることが好ましく、蛍光物質の
チオシアン基と(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタ
ンパク質のアミノ基とのチオアミド結合の形成が、常温
においても容易になされるため最も好ましい。
パク質と蛍光物質との結合は、検出操作において行われ
る通常の洗浄操作などでも蛍光物質が遊離しない程度の
結合であれば結合様式を問わない。具体的には水素結
合、イオン結合、共有結合などの化学結合が挙げられる
が、特に結合が強固である点から共有結合により結合し
ていることが最も好ましい。共有結合は(1→3)-β-D-グ
ルカン結合性ドメインタンパク質に含まれるアミノ酸の
側鎖や末端のカルボキシル基、アミノ基などの官能基を
利用して調製することが可能である。この結合は(1→3)
-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質と(1→3)-β-
D-グルカンとの結合を妨げない限り、いずれの官能基を
使用して調製しても良い。尚、このような化学結合のう
ち、特に(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク
質の安定性の観点から、室温よりも低い温度条件下で形
成が可能な化学結合であることが好ましく、蛍光物質の
チオシアン基と(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタ
ンパク質のアミノ基とのチオアミド結合の形成が、常温
においても容易になされるため最も好ましい。
【００２２】本発明物質はたとえば以下の方法によって
調製することが可能である。すなわち、(1→3)-β-D-グ
ルカン結合性ドメインタンパク質と蛍光物質とが結合し
た本発明物質は、遺伝子工学的に調製した(1→3)-β-D-
グルカン結合性ドメインタンパク質を、好ましくは精製
し、該タンパク質の(1→3)-β-D-グルカン結合性が損な
われない条件下で蛍光物質を結合させて調製することが
可能である。
調製することが可能である。すなわち、(1→3)-β-D-グ
ルカン結合性ドメインタンパク質と蛍光物質とが結合し
た本発明物質は、遺伝子工学的に調製した(1→3)-β-D-
グルカン結合性ドメインタンパク質を、好ましくは精製
し、該タンパク質の(1→3)-β-D-グルカン結合性が損な
われない条件下で蛍光物質を結合させて調製することが
可能である。
【００２３】(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタン
パク質を調製するために使用するDNAは、たとえばリム
ルス・ポリフェムス（Limulus polyphemus）、タキプレ
ウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）、タ
キプレウス・ギガス（Tachypleus gigas）、ならびにタ
キプレウス（カルシノスコルピウス）・ロツンディカウ
ダ（Tachypleus(Carcinoscorpius) rotundicauda）等の
カブトガニの血球（アメボサイト）から常法に従って調
製したcDNAライブラリーを、たとえば配列番号４及び５
記載の人工的に調製した塩基配列のプライマーを使用し
てPolymerase Chain Reaction(以下「PCR」とも記載す
る)法により目的DNAを増幅させて調製することができ
る。PCR産物は、ゲル電気泳動などの分子量による分離
手段を用いて分離し、公知の手段によりJetsorb（ジェ
ノメッド社製）等を用いて約800bpのバンドを回収する
ことで、容易に単離することができる。
パク質を調製するために使用するDNAは、たとえばリム
ルス・ポリフェムス（Limulus polyphemus）、タキプレ
ウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）、タ
キプレウス・ギガス（Tachypleus gigas）、ならびにタ
キプレウス（カルシノスコルピウス）・ロツンディカウ
ダ（Tachypleus(Carcinoscorpius) rotundicauda）等の
カブトガニの血球（アメボサイト）から常法に従って調
製したcDNAライブラリーを、たとえば配列番号４及び５
記載の人工的に調製した塩基配列のプライマーを使用し
てPolymerase Chain Reaction(以下「PCR」とも記載す
る)法により目的DNAを増幅させて調製することができ
る。PCR産物は、ゲル電気泳動などの分子量による分離
手段を用いて分離し、公知の手段によりJetsorb（ジェ
ノメッド社製）等を用いて約800bpのバンドを回収する
ことで、容易に単離することができる。
【００２４】単離して得られたDNA断片は、(1→3)-β-D
-グルカン結合性ドメインタンパク質を発現させる宿主
細胞（たとえば微生物細胞、動物細胞、昆虫細胞など）
に適したベクターに組み込むために、該ベクターに対応
する制限酵素断片を常法に従って連結させる。このよう
に調製した(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパ
ク質をコードするDNAを常法に従って上記ベクターに組
み込むことが可能であるが、宿主細胞の培養物から(1→
3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質の精製を容
易とするために、任意のタグ（T7タグ、Sタグ、Hisタ
グ、HSVタグ、pelB/ompT、KSI、Trxタグ、PKA、プロテ
インA、FLAG、カルモジュリン結合ドメイン、グルタチ
オンSトランスフェラーゼ（GST）など）を同一発現領域
として含むように構築されたベクターを使用することが
好ましい。制限酵素、ベクター、タグ、宿主、融合タン
パク質の精製手段、及び融合タンパク質からのタグの切
断手段の組み合わせの選択は、遺伝子工学分野に携わる
当業者であれば、常套的に適切な組み合わせを選択する
ことが可能である。
-グルカン結合性ドメインタンパク質を発現させる宿主
細胞（たとえば微生物細胞、動物細胞、昆虫細胞など）
に適したベクターに組み込むために、該ベクターに対応
する制限酵素断片を常法に従って連結させる。このよう
に調製した(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパ
ク質をコードするDNAを常法に従って上記ベクターに組
み込むことが可能であるが、宿主細胞の培養物から(1→
3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質の精製を容
易とするために、任意のタグ（T7タグ、Sタグ、Hisタ
グ、HSVタグ、pelB/ompT、KSI、Trxタグ、PKA、プロテ
インA、FLAG、カルモジュリン結合ドメイン、グルタチ
オンSトランスフェラーゼ（GST）など）を同一発現領域
として含むように構築されたベクターを使用することが
好ましい。制限酵素、ベクター、タグ、宿主、融合タン
パク質の精製手段、及び融合タンパク質からのタグの切
断手段の組み合わせの選択は、遺伝子工学分野に携わる
当業者であれば、常套的に適切な組み合わせを選択する
ことが可能である。
【００２５】たとえば、ベクターとしてpGEX-2T(ファル
マシアバイオテック社製)、タグとしてGSTを使用する場
合には、BamHI及びEcoRIの制限酵素切断部位を付加した
PCR増幅産物を制限酵素BamHI及びEcoRIで消化した後、
そのBamHI及びEcoRIによる制限酵素断片を常法によりpG
EX-2Tに導入することができる。
マシアバイオテック社製)、タグとしてGSTを使用する場
合には、BamHI及びEcoRIの制限酵素切断部位を付加した
PCR増幅産物を制限酵素BamHI及びEcoRIで消化した後、
そのBamHI及びEcoRIによる制限酵素断片を常法によりpG
EX-2Tに導入することができる。
【００２６】尚、DNAを挿入するためのベクターにはア
ンピシリンやネオマイシンなどの抗生物質耐性を発現す
る遺伝子やペルオキシダーゼ遺伝子を組み込んでおくこ
とでトランスフェクトされた宿主細胞の選択が容易とな
るため好ましい。
ンピシリンやネオマイシンなどの抗生物質耐性を発現す
る遺伝子やペルオキシダーゼ遺伝子を組み込んでおくこ
とでトランスフェクトされた宿主細胞の選択が容易とな
るため好ましい。
【００２７】たとえばアンピシリン耐性遺伝子を有する
上記ベクターpGEX-2Tを使用する場合には、常法に従っ
て宿主細胞である大腸菌BL21株に目的遺伝子を導入し、
大腸菌をアンピシリンが含まれた培地で培養すること
で、トランスフェクトされた形質転換体が選択される。
上記ベクターpGEX-2Tを使用する場合には、常法に従っ
て宿主細胞である大腸菌BL21株に目的遺伝子を導入し、
大腸菌をアンピシリンが含まれた培地で培養すること
で、トランスフェクトされた形質転換体が選択される。
【００２８】選択された形質転換体を、それに応じた方
法で生育（例えば培養）させ、生育物（培養細胞、菌
体、培地等）から目的とする(1→3)-β-D-グルカン結合
性ドメインタンパク質を調製する。
法で生育（例えば培養）させ、生育物（培養細胞、菌
体、培地等）から目的とする(1→3)-β-D-グルカン結合
性ドメインタンパク質を調製する。
【００２９】形質転換体を生育させた生育物からの本発
明物質の調製は、たとえば以下の方法によって行う事が
可能である。尚、ここで「生育」とは、形質転換体であ
る細胞、微生物を培養するだけでなく、形質転換体を組
み込んだ動物や昆虫などの生育も含む概念である。「生
育物」とは、形質転換体を生育させた後の培地及び培養
された宿主細胞、分泌物、排出物などを包含する概念で
ある。
明物質の調製は、たとえば以下の方法によって行う事が
可能である。尚、ここで「生育」とは、形質転換体であ
る細胞、微生物を培養するだけでなく、形質転換体を組
み込んだ動物や昆虫などの生育も含む概念である。「生
育物」とは、形質転換体を生育させた後の培地及び培養
された宿主細胞、分泌物、排出物などを包含する概念で
ある。
【００３０】上述の例で使用し、目的のDNAを発現する
ように構築したベクター（pGEX-2Tを(1→3)-β-D-グル
カン結合性ドメインタンパク質のDNAとGSTタグが融合タ
ンパク質として発現するように構築したベクター）を使
用する場合には、宿主細胞の培養物（培養上清及び培養
した宿主細胞の破砕物）を、GSTタグを特異的に結合す
るグルタチオンが結合したアフィニティーカラムに通筒
することで融合タンパク質として容易に分離することが
できる。
ように構築したベクター（pGEX-2Tを(1→3)-β-D-グル
カン結合性ドメインタンパク質のDNAとGSTタグが融合タ
ンパク質として発現するように構築したベクター）を使
用する場合には、宿主細胞の培養物（培養上清及び培養
した宿主細胞の破砕物）を、GSTタグを特異的に結合す
るグルタチオンが結合したアフィニティーカラムに通筒
することで融合タンパク質として容易に分離することが
できる。
【００３１】融合タンパク質からの(1→3)-β-D-グルカ
ン結合性ドメインタンパク質の切り出しは、タグの種類
に適した方法を当業者であれば任意に選択することが可
能である。上述のGSTタグとの融合タンパク質として(1
→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質を発現さ
せた場合には、たとえばエンテロキナーゼやトロンビン
を作用させることで容易に(1→3)-β-D-グルカン結合性
ドメインタンパク質を切り出すことが可能である。この
場合、グルタチオンが結合したアフィニティーカラムに
吸着した融合タンパク質に対して当該酵素を作用させる
ことで、(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク
質のみを溶出することが可能である。
ン結合性ドメインタンパク質の切り出しは、タグの種類
に適した方法を当業者であれば任意に選択することが可
能である。上述のGSTタグとの融合タンパク質として(1
→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質を発現さ
せた場合には、たとえばエンテロキナーゼやトロンビン
を作用させることで容易に(1→3)-β-D-グルカン結合性
ドメインタンパク質を切り出すことが可能である。この
場合、グルタチオンが結合したアフィニティーカラムに
吸着した融合タンパク質に対して当該酵素を作用させる
ことで、(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク
質のみを溶出することが可能である。
【００３２】(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタン
パク質への蛍光物質の結合は、常法に従って行うことが
可能である。たとえば、カルボジイミドなどの活性化試
薬を使用して、蛍光物質又は(1→3)-β-D-グルカン結合
性ドメインタンパク質の官能基を活性化し、各々を結合
させることも可能である。しかし、縮合剤、活性化剤な
どの試薬の添加や、酸、アルカリ等のpH条件、高い温度
条件を必要としない蛍光物質を用いることが、(1→3)-
β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質の安定性の面
からも好ましい。そのような蛍光物質としてもチオシア
ン基を有する蛍光物質が最も好ましく、特に上記で最も
好ましい例として挙げたFITCなどは、4℃条件下であっ
ても、(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質
のアミノ基とFITCのチオシアン基とのチオアミド結合に
より特異的に結合させることができるため極めて好まし
い。
パク質への蛍光物質の結合は、常法に従って行うことが
可能である。たとえば、カルボジイミドなどの活性化試
薬を使用して、蛍光物質又は(1→3)-β-D-グルカン結合
性ドメインタンパク質の官能基を活性化し、各々を結合
させることも可能である。しかし、縮合剤、活性化剤な
どの試薬の添加や、酸、アルカリ等のpH条件、高い温度
条件を必要としない蛍光物質を用いることが、(1→3)-
β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質の安定性の面
からも好ましい。そのような蛍光物質としてもチオシア
ン基を有する蛍光物質が最も好ましく、特に上記で最も
好ましい例として挙げたFITCなどは、4℃条件下であっ
ても、(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質
のアミノ基とFITCのチオシアン基とのチオアミド結合に
より特異的に結合させることができるため極めて好まし
い。
【００３３】FITCと(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメイ
ンタンパク質との結合は、たとえばFITCを非プロトン性
有機溶媒（たとえばジアルキルスルホキシド、ジアルキ
ルホルムアミド、又はヘキサアルキルホスホルアミドが
挙げられ、例えばジメチルスルフォキシド（DMSO）、ジ
エチルスルフォキシド、ジメチルホルムアミド及びヘキ
サメチルホスホルアミド等が具体的には例示され、特に
DMSOが好ましい）中に溶解し、pH7〜9、好ましくは7.5
〜8.5条件下で、(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメイン
タンパク質が溶解した緩衝液に対して、上記非プロトン
性有機溶媒中に溶解したFITCを添加し、数時間、好まし
くは1〜8時間、より好ましくは2〜6時間、1〜24℃、好
ましくは2〜10℃条件下で反応させて行うことができ
る。
ンタンパク質との結合は、たとえばFITCを非プロトン性
有機溶媒（たとえばジアルキルスルホキシド、ジアルキ
ルホルムアミド、又はヘキサアルキルホスホルアミドが
挙げられ、例えばジメチルスルフォキシド（DMSO）、ジ
エチルスルフォキシド、ジメチルホルムアミド及びヘキ
サメチルホスホルアミド等が具体的には例示され、特に
DMSOが好ましい）中に溶解し、pH7〜9、好ましくは7.5
〜8.5条件下で、(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメイン
タンパク質が溶解した緩衝液に対して、上記非プロトン
性有機溶媒中に溶解したFITCを添加し、数時間、好まし
くは1〜8時間、より好ましくは2〜6時間、1〜24℃、好
ましくは2〜10℃条件下で反応させて行うことができ
る。
【００３４】このようにして調製された本発明物質は、
反応液から分子量によって分画する常法（たとえばゲル
濾過、ゲル電気泳動、限外濾過など）に従って単離、精
製することが可能である。
反応液から分子量によって分画する常法（たとえばゲル
濾過、ゲル電気泳動、限外濾過など）に従って単離、精
製することが可能である。
【００３５】（２）本発明測定剤
本発明測定剤は、検体中の(1→3)-β-D-グルカンと結合
させ、当該結合による蛍光偏光度の変化を検出し、蛍光
偏光度の変化量と検体中の(1→3)-β-D-グルカンの濃度
とを関連づけて測定するための本発明物質を含む(1→3)
-β-D-グルカン測定剤である。
させ、当該結合による蛍光偏光度の変化を検出し、蛍光
偏光度の変化量と検体中の(1→3)-β-D-グルカンの濃度
とを関連づけて測定するための本発明物質を含む(1→3)
-β-D-グルカン測定剤である。
【００３６】蛍光標識のために使用する蛍光物質、蛍光
物質とタンパク質の結合様式は、本発明物質で記載した
ものと同様である。
物質とタンパク質の結合様式は、本発明物質で記載した
ものと同様である。
【００３７】本発明測定剤は、検体と混合して検体中の
(1→3)-β-D-グルカンと本発明物質とを結合させ、当該
結合によってタンパク質に結合している蛍光物質の蛍光
偏光度の変化を捕らえ、該変化量と検体中の(1→3)-β-
D-グルカンの濃度とを結びつけることにより検体中の(1
→3)-β-D-グルカンの濃度の測定、すなわち後述の本発
明測定法に使用することができ、また例えば特に医療現
場においては真菌症の診断薬として使用したり、真菌症
の診断キットとして使用することもできる。
(1→3)-β-D-グルカンと本発明物質とを結合させ、当該
結合によってタンパク質に結合している蛍光物質の蛍光
偏光度の変化を捕らえ、該変化量と検体中の(1→3)-β-
D-グルカンの濃度とを結びつけることにより検体中の(1
→3)-β-D-グルカンの濃度の測定、すなわち後述の本発
明測定法に使用することができ、また例えば特に医療現
場においては真菌症の診断薬として使用したり、真菌症
の診断キットとして使用することもできる。
【００３８】尚、本発明物質と(1→3)-β-D-グルカンと
の結合は、二価陽イオン、好ましくはアルカリ土類金属
イオン、特にカルシウムイオンによって促進されること
が、明かとなったことから、本発明測定剤には、これら
のイオンが含まれていてもよい。
の結合は、二価陽イオン、好ましくはアルカリ土類金属
イオン、特にカルシウムイオンによって促進されること
が、明かとなったことから、本発明測定剤には、これら
のイオンが含まれていてもよい。
【００３９】（３）本発明測定法
本発明測定法は、本発明物質と検体中の(1→3)-β-D-グ
ルカンとを結合させ、当該結合による蛍光偏光度の変化
を検出し、蛍光偏光度の変化量と検体中の(1→3)-β-D-
グルカンの濃度とを関連づけることを特徴とする(1→3)
-β-D-グルカンの測定法である。
ルカンとを結合させ、当該結合による蛍光偏光度の変化
を検出し、蛍光偏光度の変化量と検体中の(1→3)-β-D-
グルカンの濃度とを関連づけることを特徴とする(1→3)
-β-D-グルカンの測定法である。
【００４０】本発明測定法における本発明物質と検体中
の(1→3)-β-D-グルカンとの結合は、これらの結合が起
こりうる条件下で行う限り、特に限定はされないが、そ
の中でも特にイオン強度0.01〜1の条件下で行うことが
好ましい。また、pH6.5〜8.5、特に7.0〜8.0の範囲内で
行うことが、測定が安定して行うことができることから
好ましく、このようなイオン強度、pHを保つために、結
合は緩衝液中で行うことが好ましい。このような緩衝液
としては、例えばリン酸緩衝生理的食塩水（以下「PB
S」とも記載する）、トリス塩酸緩衝生理的食塩水（以
下、「TBS」とも記載する）等が挙げられるが特にTBSを
使用するのが好ましい。TBSを使用する場合は、0.1〜10
倍（1×TBS：20mM Tris-HCl、0.15M NaCl）の範囲の濃
度で使用するのが好ましい。
の(1→3)-β-D-グルカンとの結合は、これらの結合が起
こりうる条件下で行う限り、特に限定はされないが、そ
の中でも特にイオン強度0.01〜1の条件下で行うことが
好ましい。また、pH6.5〜8.5、特に7.0〜8.0の範囲内で
行うことが、測定が安定して行うことができることから
好ましく、このようなイオン強度、pHを保つために、結
合は緩衝液中で行うことが好ましい。このような緩衝液
としては、例えばリン酸緩衝生理的食塩水（以下「PB
S」とも記載する）、トリス塩酸緩衝生理的食塩水（以
下、「TBS」とも記載する）等が挙げられるが特にTBSを
使用するのが好ましい。TBSを使用する場合は、0.1〜10
倍（1×TBS：20mM Tris-HCl、0.15M NaCl）の範囲の濃
度で使用するのが好ましい。
【００４１】本発明測定法における検体は、特にイオン
強度が0.01〜1であることが好ましい。このような検体
としては、体内から取り出した血液や尿、医薬品製造工
程においてサンプリングした検体、大気中等の環境中か
らインピンジャー等でサンプリングした検体、環境中か
らフィルター等でトラップした粒子等を溶解又は懸濁し
た検体などを必要に応じて希釈したものが例示され、い
ずれの検体であっても、本測定を妨害する因子を除タン
パクやイオン交換などの常法により除去することで、本
発明測定方法を用いて再現性の良い安定した(1→3)-β-
D-グルカンの微量測定が可能であり、また本発明測定方
法は特に医療現場において真菌症の検出にも用いること
ができる。
強度が0.01〜1であることが好ましい。このような検体
としては、体内から取り出した血液や尿、医薬品製造工
程においてサンプリングした検体、大気中等の環境中か
らインピンジャー等でサンプリングした検体、環境中か
らフィルター等でトラップした粒子等を溶解又は懸濁し
た検体などを必要に応じて希釈したものが例示され、い
ずれの検体であっても、本測定を妨害する因子を除タン
パクやイオン交換などの常法により除去することで、本
発明測定方法を用いて再現性の良い安定した(1→3)-β-
D-グルカンの微量測定が可能であり、また本発明測定方
法は特に医療現場において真菌症の検出にも用いること
ができる。
【００４２】
【実施例】（１）(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメイン
タンパク質の調製 <1>(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質のD
NAの調製Tachypleus tridentatus のアメボサイトから、全RNAを
抽出し、常法に従って、ポリ(A)+RNAから cDNAライブラ
リーを作製した。使用したプラスミドはλgt11で、詳細
は、Amersham-Japan社のｃDNAクローニングシステムλg
t11によった。牟田らが確立したJ. Biol. Chem. 268 (1
994), 1370-1374に記載された方法にしたがって、G因子
ならびにそれぞれのサブユニット（α、β）を精製、47
7 A Protein sequencer（Applied Biosystems社製）
にて全アミノ酸配列を決定した。当該配列に基づいて、
オリゴヌクレオチドプライマーを合成、AmpliTaq（Perk
inElmer社製）を用いたPCR法にて各DNAを35サイクルま
で増幅した。ひきつづき、[α-32P]dCTP標識後、上記のc
DNAライブラリーからの検出プローブとして使用し、プ
ラークハイブリダイゼーション法にて目的のDNA配列を
確認した。このようにして得られたG因子のαサブユニ
ットのcDNAを鋳型として用い、配列番号４および５に記
載されたプライマーを使用して常法に従ってPCR法によ
り配列番号１に記載された(1→3)-β-D-グルカン結合性
ドメインタンパク質をコードするDNAを調製した。PCR産
物として得られたこのDNAの5'末端にBamHI断片を、3'末
端にEcoRI断片を常法に従って連結し、このDNAをBamHI
及びEcoRIで処理したpGEX-2Tプラスミドベクター（ファ
ルマシアバイオテック社製）のBamHI-EcoRI領域に挿入
した。
タンパク質の調製 <1>(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質のD
NAの調製Tachypleus tridentatus のアメボサイトから、全RNAを
抽出し、常法に従って、ポリ(A)+RNAから cDNAライブラ
リーを作製した。使用したプラスミドはλgt11で、詳細
は、Amersham-Japan社のｃDNAクローニングシステムλg
t11によった。牟田らが確立したJ. Biol. Chem. 268 (1
994), 1370-1374に記載された方法にしたがって、G因子
ならびにそれぞれのサブユニット（α、β）を精製、47
7 A Protein sequencer（Applied Biosystems社製）
にて全アミノ酸配列を決定した。当該配列に基づいて、
オリゴヌクレオチドプライマーを合成、AmpliTaq（Perk
inElmer社製）を用いたPCR法にて各DNAを35サイクルま
で増幅した。ひきつづき、[α-32P]dCTP標識後、上記のc
DNAライブラリーからの検出プローブとして使用し、プ
ラークハイブリダイゼーション法にて目的のDNA配列を
確認した。このようにして得られたG因子のαサブユニ
ットのcDNAを鋳型として用い、配列番号４および５に記
載されたプライマーを使用して常法に従ってPCR法によ
り配列番号１に記載された(1→3)-β-D-グルカン結合性
ドメインタンパク質をコードするDNAを調製した。PCR産
物として得られたこのDNAの5'末端にBamHI断片を、3'末
端にEcoRI断片を常法に従って連結し、このDNAをBamHI
及びEcoRIで処理したpGEX-2Tプラスミドベクター（ファ
ルマシアバイオテック社製）のBamHI-EcoRI領域に挿入
した。
【００４３】<2>(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメイン
タンパク質の発現と精製 GST Gene fusion system(ファルマシア バイオテック
社製)のプロトコール記載の方法に従って大腸菌（E. co
li BL21）を宿主として上記<1>で調製したプラスミドを
発現させた。トランスフェクションは常法に従って<1>
で調製したpGEX-2Tプラスミドベクターを用いて行っ
た。トランスフェクションした大腸菌は、抗生物質アン
ピシリンを含む培地で培養した。pGEX-2Tは、アンピシ
リン耐性遺伝子を有するため、形質転換体はアンピシリ
ン耐性を獲得することとなる。従って、アンピシリンを
含む培地で大腸菌を培養するとアンピシリン耐性を有す
る大腸菌（トランスフェクションされた大腸菌）のみを
選択して生育させることができる。培養物（培養上清及
び菌体超音波破砕物）からアフィニティーカラムクロマ
トグラフィーによって(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメ
インタンパク質-GST融合タンパク質を精製した。アフィ
ニティー担体にはグルタチオン-セファロース4B（ファ
ルマシア社製）を使用し、10μg/mlのトロンビンを含む
PBS溶液で溶出した。
タンパク質の発現と精製 GST Gene fusion system(ファルマシア バイオテック
社製)のプロトコール記載の方法に従って大腸菌（E. co
li BL21）を宿主として上記<1>で調製したプラスミドを
発現させた。トランスフェクションは常法に従って<1>
で調製したpGEX-2Tプラスミドベクターを用いて行っ
た。トランスフェクションした大腸菌は、抗生物質アン
ピシリンを含む培地で培養した。pGEX-2Tは、アンピシ
リン耐性遺伝子を有するため、形質転換体はアンピシリ
ン耐性を獲得することとなる。従って、アンピシリンを
含む培地で大腸菌を培養するとアンピシリン耐性を有す
る大腸菌（トランスフェクションされた大腸菌）のみを
選択して生育させることができる。培養物（培養上清及
び菌体超音波破砕物）からアフィニティーカラムクロマ
トグラフィーによって(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメ
インタンパク質-GST融合タンパク質を精製した。アフィ
ニティー担体にはグルタチオン-セファロース4B（ファ
ルマシア社製）を使用し、10μg/mlのトロンビンを含む
PBS溶液で溶出した。
【００４４】溶出した(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメ
インタンパク質をLammliらの方法に従って還元条件下で
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳
動法（SDS-PAGE）によって解析した結果、分子量29kDa
の単一のバンドが観察され、遺伝子組み換えによる(1→
3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質が高度に精
製されたことを確認した。
インタンパク質をLammliらの方法に従って還元条件下で
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳
動法（SDS-PAGE）によって解析した結果、分子量29kDa
の単一のバンドが観察され、遺伝子組み換えによる(1→
3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質が高度に精
製されたことを確認した。
【００４５】（２）蛍光物質による(1→3)-β-D-グルカ
ン結合性ドメインタンパク質の標識 蛍光物質としてのFITC（和光純薬工業製）を10mg/mlで
ジメチルスルホキシドに溶解し、そこに上記（１）で得
られた(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質
を1mg/mlとなるように添加し、この混合液にpH8.5のTBS
を添加して全量を1mLとした。この混液を24℃で4時間遮
光下で反応させた。
ン結合性ドメインタンパク質の標識 蛍光物質としてのFITC（和光純薬工業製）を10mg/mlで
ジメチルスルホキシドに溶解し、そこに上記（１）で得
られた(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質
を1mg/mlとなるように添加し、この混合液にpH8.5のTBS
を添加して全量を1mLとした。この混液を24℃で4時間遮
光下で反応させた。
【００４６】反応後、セファデックスG-25カラム（ファ
ルマシア社製）に反応混液を添加し、pH7.4のPBS9mLに
より溶出した。カラムからの溶出液を回収し、3〜5mLの
画分を回収し、本発明物質を調製した（Lowry法による
定量を行うと0.5〜0.8mgのタンパク質が検出された）。
ルマシア社製）に反応混液を添加し、pH7.4のPBS9mLに
より溶出した。カラムからの溶出液を回収し、3〜5mLの
画分を回収し、本発明物質を調製した（Lowry法による
定量を行うと0.5〜0.8mgのタンパク質が検出された）。
【００４７】（３）本発明物質を用いた本発明測定法
<1>アルカリ土類金属塩の影響
0.1×TBS（pH7.4）1mLをBorocilicateチューブ（Associ
ates of Cape Cod, Inc.製）に入れ、本発明物質を100
μg/μLとなるように0.1×TBS(pH7.4)によって希釈した
溶液を5μL添加して撹拌し、ブランク値として蛍光偏光
度を測定した。アルカリ土類金属塩の影響を確認するた
めに、最終濃度が10mMとなるようにCaCl 2、BaCl2、MgCl
2、SrCl2を添加した実験群、及びこれらの二価アルカリ
土類金属塩を添加しない対照群を作成した。当該金属塩
を添加した後、パキマン（ブクリョウ由来の(1→3)-β-
D-グルカン：生化学工業株式会社製）を1μg添加し、Po
larScan(Associates of Cape Cod, Inc.販売)によりパ
キマンを添加する前後の蛍光偏光度の変化（mP値）を測
定した（図１）。
ates of Cape Cod, Inc.製）に入れ、本発明物質を100
μg/μLとなるように0.1×TBS(pH7.4)によって希釈した
溶液を5μL添加して撹拌し、ブランク値として蛍光偏光
度を測定した。アルカリ土類金属塩の影響を確認するた
めに、最終濃度が10mMとなるようにCaCl 2、BaCl2、MgCl
2、SrCl2を添加した実験群、及びこれらの二価アルカリ
土類金属塩を添加しない対照群を作成した。当該金属塩
を添加した後、パキマン（ブクリョウ由来の(1→3)-β-
D-グルカン：生化学工業株式会社製）を1μg添加し、Po
larScan(Associates of Cape Cod, Inc.販売)によりパ
キマンを添加する前後の蛍光偏光度の変化（mP値）を測
定した（図１）。
【００４８】その結果、カルシウムイオン（CaCl2）を
添加した際に60%程度、対照と比して蛍光偏光度の変化
が増すことが明かとなった。
添加した際に60%程度、対照と比して蛍光偏光度の変化
が増すことが明かとなった。
【００４９】<2>パキマンの濃度と測定値の直線性の検
討 1×TBS(pH7.4)1mLをBorocilicateチューブに入れ、1Mの
CaCl2を10μL添加した。この溶液に100μg/μLに1×TBS
(pH7.4)で希釈した本発明物質を5μL添加してよく混合
し、ブランク値として蛍光偏光度を測定した。その後、
パキマンを添加して、PolarScanによりパキマンを添加
する前後の蛍光偏光度の変化を測定した（図２）。パキ
マンの添加量は10ng、20ng、40ng、60ng、80ng、100n
g、200ng、400ng、600ng、800ng、1000ngで行った。
討 1×TBS(pH7.4)1mLをBorocilicateチューブに入れ、1Mの
CaCl2を10μL添加した。この溶液に100μg/μLに1×TBS
(pH7.4)で希釈した本発明物質を5μL添加してよく混合
し、ブランク値として蛍光偏光度を測定した。その後、
パキマンを添加して、PolarScanによりパキマンを添加
する前後の蛍光偏光度の変化を測定した（図２）。パキ
マンの添加量は10ng、20ng、40ng、60ng、80ng、100n
g、200ng、400ng、600ng、800ng、1000ngで行った。
【００５０】その結果、パキマンを添加しない群から10
0ng添加した群までは、測定値がパキマン添加量にほぼ
比例することが明かとなり、mP値(Y)とパキマンの添加
量(X)の間にはY=0.2941x+0.0592の関係式が成り立つこ
とが判明した（図３）。
0ng添加した群までは、測定値がパキマン添加量にほぼ
比例することが明かとなり、mP値(Y)とパキマンの添加
量(X)の間にはY=0.2941x+0.0592の関係式が成り立つこ
とが判明した（図３）。
【００５１】
【発明の効果】(1→3)-β-D-グルカンの新規な測定法と
それに使用される蛍光標識された(1→3)-β-D-グルカン
結合性タンパク質が提供される。
それに使用される蛍光標識された(1→3)-β-D-グルカン
結合性タンパク質が提供される。
【図１】 アルカリ土類金属イオンが(1→3)-β-D-グル
カンの測定に与える影響を示す図。
カンの測定に与える影響を示す図。
【図２】 検体中の(1→3)-β-D-グルカン量と蛍光偏光
度の変化の関係を示す図。
度の変化の関係を示す図。
【図３】 検体中の(1→3)-β-D-グルカン量と蛍光偏光
度の比例関係を示す図。
度の比例関係を示す図。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> 生化学工業株式会社
<120> (1→3)-β-D-グルカン結合タンパク質、該物質を使用した測定法及び測定
キット
<130> J200102400
<160> 5
<210> 1
<211> 807
<212> DNA
<213> Tachypleus tridentatus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(807)
<400> 1
agt aaa agt tat tct aaa tta att cag gca gaa agt tat ttt gat tcc 48
Ser Lys Ser Tyr Ser Lys Leu Ile Gln Ala Glu Ser Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
tca aaa gta caa ttg gaa gat acc tca gat gta gga ggt ggg aag aat 96
Ser Lys Val Gln Leu Glu Asp Thr Ser Asp Val Gly Gly Gly Lys Asn
20 25 30
gtt aaa tgt gat aat gaa gga gcc tgg atg gct tat aag gat att gat 144
Val Lys Cys Asp Asn Glu Gly Ala Trp Met Ala Tyr Lys Asp Ile Asp
35 40 45
ttc ccc agt tca ggt aat tat cga ata gaa tac aga gta gca agt gaa 192
Phe Pro Ser Ser Gly Asn Tyr Arg Ile Glu Tyr Arg Val Ala Ser Glu
50 55 60
cgt gca gga gga aag ctg tct ctg gat ttg aat gca ggc tct ata gtt 240
Arg Ala Gly Gly Lys Leu Ser Leu Asp Leu Asn Ala Gly Ser Ile Val
65 70 75 80
ctt ggc atg ctg gat gtt cct tca aca gga gga tgg cag aag tgg acc 288
Leu Gly Met Leu Asp Val Pro Ser Thr Gly Gly Trp Gln Lys Trp Thr
85 90 95
acc att tcc cat aca gtg aat gtg gat tca ggt aca tat aac ttg ggg 336
Thr Ile Ser His Thr Val Asn Val Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Leu Gly
100 105 110
atc tat gtt caa cga gcc agc tgg aat atc aac tgg ata aag att aca 384
Ile Tyr Val Gln Arg Ala Ser Trp Asn Ile Asn Trp Ile Lys Ile Thr
115 120 125
aaa ata cct gaa cag tca aat ttg aat caa ggg cgt cgt aat tct aaa 432
Lys Ile Pro Glu Gln Ser Asn Leu Asn Gln Gly Arg Arg Asn Ser Lys
130 135 140
tta att cag gca gaa agt tat ttt agt tac tca gaa gta caa ctg gaa 480
Leu Ile Gln Ala Glu Ser Tyr Phe Ser Tyr Ser Glu Val Gln Leu Glu
145 150 155 160
gat acc tta gat gta gga ggt gga aag aat gtt aaa tgt gat aaa gaa 528
Asp Thr Leu Asp Val Gly Gly Gly Lys Asn Val Lys Cys Asp Lys Glu
165 170 175
ggg gcc tgg atg gct tac aag gat att gat ttc ccc agt tca gga agt 576
Gly Ala Trp Met Ala Tyr Lys Asp Ile Asp Phe Pro Ser Ser Gly Ser
180 185 190
tat cga gta gaa tac aga gtg gca agt gaa cgt gca gga gga aag ctg 624
Tyr Arg Val Glu Tyr Arg Val Ala Ser Glu Arg Ala Gly Gly Lys Leu
195 200 205
tcc cta gat ttg aat gca ggc tct ata gtg ctt ggc atg ctg gat att 672
Ser Leu Asp Leu Asn Ala Gly Ser Ile Val Leu Gly Met Leu Asp Ile
210 215 220
cct tca aca gga gga ttg cag aag tgg acc acc att tct cat ata gtg 720
Pro Ser Thr Gly Gly Leu Gln Lys Trp Thr Thr Ile Ser His Ile Val
225 230 235 240
aat gtg gat tta ggt aca tat aac ttg gga att tat gtt caa aaa gcc 768
Asn Val Asp Leu Gly Thr Tyr Asn Leu Gly Ile Tyr Val Gln Lys Ala
245 250 255
agt tgg aat atc aat tgg att aga att aca aaa gtg tag 807
Ser Trp Asn Ile Asn Trp Ile Arg Ile Thr Lys Val
260 265
<210> 2
<211> 268
<212> PRT
<213> Tachypleus tridentatus
<400> 2
Ser Lys Ser Tyr Ser Lys Leu Ile Gln Ala Glu Ser Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Ser Lys Val Gln Leu Glu Asp Thr Ser Asp Val Gly Gly Gly Lys Asn
20 25 30
Val Lys Cys Asp Asn Glu Gly Ala Trp Met Ala Tyr Lys Asp Ile Asp
35 40 45
Phe Pro Ser Ser Gly Asn Tyr Arg Ile Glu Tyr Arg Val Ala Ser Glu
50 55 60
Arg Ala Gly Gly Lys Leu Ser Leu Asp Leu Asn Ala Gly Ser Ile Val
65 70 75 80
Leu Gly Met Leu Asp Val Pro Ser Thr Gly Gly Trp Gln Lys Trp Thr
85 90 95
Thr Ile Ser His Thr Val Asn Val Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Leu Gly
100 105 110
Ile Tyr Val Gln Arg Ala Ser Trp Asn Ile Asn Trp Ile Lys Ile Thr
115 120 125
Lys Ile Pro Glu Gln Ser Asn Leu Asn Gln Gly Arg Arg Asn Ser Lys
130 135 140
Leu Ile Gln Ala Glu Ser Tyr Phe Ser Tyr Ser Glu Val Gln Leu Glu
145 150 155 160
Asp Thr Leu Asp Val Gly Gly Gly Lys Asn Val Lys Cys Asp Lys Glu
165 170 175
Gly Ala Trp Met Ala Tyr Lys Asp Ile Asp Phe Pro Ser Ser Gly Ser
180 185 190
Tyr Arg Val Glu Tyr Arg Val Ala Ser Glu Arg Ala Gly Gly Lys Leu
195 200 205
Ser Leu Asp Leu Asn Ala Gly Ser Ile Val Leu Gly Met Leu Asp Ile
210 215 220
Pro Ser Thr Gly Gly Leu Gln Lys Trp Thr Thr Ile Ser His Ile Val
225 230 235 240
Asn Val Asp Leu Gly Thr Tyr Asn Leu Gly Ile Tyr Val Gln Lys Ala
245 250 255
Ser Trp Asn Ile Asn Trp Ile Arg Ile Thr Lys Val
260 265
<210> 3
<211> 673
<212> PRT
<213> Tachypleus tridentatus
<400> 3
Met Leu Val Leu Leu Cys Cys Val Val Leu His Val Gly Val Ala Arg
1 5 10 15
Ile Cys Cys Ser His Glu Pro Lys Trp Gln Leu Val Trp Ser Asp Glu
20 25 30
Phe Thr Asn Gly Ile Ser Ser Asp Trp Glu Phe Glu Met Gly Asn Gly
35 40 45
Leu Asn Gly Trp Gly Asn Asn Glu Leu Gln Tyr Tyr Arg Arg Glu Asn
50 55 60
Ala Gln Val Glu Gly Gly Lys Leu Val Ile Thr Ala Lys Arg Glu Asp
65 70 75 80
Tyr Asp Gly Phe Lys Tyr Thr Ser Ala Arg Leu Lys Thr Gln Phe Asp
85 90 95
Lys Ser Trp Lys Tyr Gly Lys Ile Glu Ala Lys Met Ala Ile Pro Ser
100 105 110
Phe Arg Gly Val Trp Val Met Phe Trp Met Ser Gly Asp Asn Thr Asn
115 120 125
Tyr Val Arg Trp Pro Ser Ser Gly Glu Ile Asp Phe Ile Glu His Arg
130 135 140
Asn Thr Asn Asn Glu Lys Val Arg Gly Thr Ile His Trp Ser Thr Pro
145 150 155 160
Asp Gly Ala His Ala His His Asn Arg Glu Ser Asn Thr Asn Gly Ile
165 170 175
Asp Tyr His Ile Tyr Ser Val Glu Trp Asn Ser Ser Ile Val Lys Trp
180 185 190
Phe Val Asn Gly Asn Gln Tyr Phe Glu Val Lys Ile Gln Gly Gly Val
195 200 205
Asn Gly Lys Ser Ala Phe Arg Asn Lys Val Phe Val Ile Leu Asn Met
210 215 220
Ala Ile Gly Gly Asn Trp Pro Gly Phe Asp Val Ala Asp Glu Ala Phe
225 230 235 240
Pro Ala Lys Met Tyr Ile Asp Tyr Val Arg Val Tyr Gln Asp Ala Ser
245 250 255
Thr Ser Ser Pro Val Gly Asp Thr Ser Leu Asp Gly Tyr Tyr Phe Val
260 265 270
Gln Asn Arg His Ser Glu Leu Tyr Leu Asp Val Thr Asp Ala Ser Asn
275 280 285
Glu Asp Gly Ala Phe Leu Gln Gln Trp Ser Tyr Ser Gly Asn Glu Asn
290 295 300
Gln Gln Phe Asp Phe Glu His Leu Glu Asn Asn Val Tyr Lys Ile Thr
305 310 315 320
Asn Lys Lys Ser Gly Lys Ser Leu Asp Val Tyr Asn Phe Gly Thr Glu
325 330 335
Asn Gly Val Arg Ile Gln Gln Trp Ser Tyr Gly Gly Ala Arg Asn Gln
340 345 350
Gln Phe Thr Val Gln Ser Val Gly Asp Gly Tyr Tyr Lys Ile Ile Pro
355 360 365
Arg Gly Ser Gly Lys Leu Val Glu Val Ala Asp Phe Ser Lys Asp Ala
370 375 380
Gly Gly Lys Ile Gln Gln Trp Ser Asp Asn Asn Gln Leu Ser Gly Gln
385 390 395 400
Trp Lys Leu Ile Lys Ser Lys Ser Tyr Ser Lys Leu Ile Gln Ala Glu
405 410 415
Ser Tyr Phe Asp Ser Ser Lys Val Gln Leu Glu Asp Thr Ser Asp Val
420 425 430
Gly Gly Gly Lys Asn Val Lys Cys Asp Asn Glu Gly Ala Trp Met Ala
435 440 445
Tyr Lys Asp Ile Asp Phe Pro Ser Ser Gly Asn Tyr Arg Ile Glu Tyr
450 455 460
Arg Val Ala Ser Glu Arg Ala Gly Gly Lys Leu Ser Leu Asp Leu Asn
465 470 475 480
Ala Gly Ser Ile Val Leu Gly Met Leu Asp Val Pro Ser Thr Gly Gly
485 490 495
Trp Gln Lys Trp Thr Thr Ile Ser His Thr Val Asn Val Asp Ser Gly
500 505 510
Thr Tyr Asn Leu Gly Ile Tyr Val Gln Arg Ala Ser Trp Asn Ile Asn
515 520 525
Trp Ile Lys Ile Thr Lys Ile Pro Glu Gln Ser Asn Leu Asn Gln Gly
530 535 540
Arg Arg Asn Ser Lys Leu Ile Gln Ala Glu Ser Tyr Phe Ser Tyr Ser
545 550 555 560
Glu Val Gln Leu Glu Asp Thr Leu Asp Val Gly Gly Gly Lys Asn Val
565 570 575
Lys Cys Asp Lys Glu Gly Ala Trp Met Ala Tyr Lys Asp Ile Asp Phe
580 585 590
Pro Ser Ser Gly Ser Tyr Arg Val Glu Tyr Arg Val Ala Ser Glu Arg
595 600 605
Ala Gly Gly Lys Leu Ser Leu Asp Leu Asn Ala Gly Ser Ile Val Leu
610 615 620
Gly Met Leu Asp Ile Pro Ser Thr Gly Gly Leu Gln Lys Trp Thr Thr
625 630 635 640
Ile Ser His Ile Val Asn Val Asp Leu Gly Thr Tyr Asn Leu Gly Ile
645 650 655
Tyr Val Gln Lys Ala Ser Trp Asn Ile Asn Trp Ile Arg Ile Thr Lys
660 665 670
Val
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer for PCR
reaction
<400> 4
agtaaaagtt attctaaatt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer for PCR
reaction
<400> 5
ctacactttt gtaattctaa 20
─────────────────────────────────────────────────────
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/579 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 DA02 DA06 EA01
EA17 FA03 NA01 NA06
2G054 AA07 AA10 BA04 CA20 EA03
JA09
4B024 AA11 CA04 DA06 HA01
4H045 AA10 AA30 BA10 BA70 CA50
EA50 HA05
Claims (10)
- 【請求項１】 配列番号２記載のアミノ酸配列からなる
タンパク質又は配列番号２にアミノ酸の置換、欠失、挿
入、又は転位を有するアミノ酸配列からなり、(１→３)
-β-D-グルカンへの結合性を有する分子量20k〜40kDaタ
ンパク質に、蛍光物質が結合してなる、蛍光標識した(1
→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質。 - 【請求項２】 配列番号１記載の塩基配列からなる核酸
がコードするタンパク質、又は配列番号１記載の塩基配
列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件
下でハイブリダイズする塩基配列からなる核酸がコード
し、(１→３)-β-D-グルカンへの結合性を有する分子量
20k〜40kDaのタンパク質に、蛍光物質が結合してなる、
蛍光標識した(1→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタン
パク質。 - 【請求項３】 検体中の(1→3)-β-D-グルカンとを結合
させ、当該結合による蛍光偏光度の変化を検出し、蛍光
偏光度の変化量と検体中の(1→3)-β-D-グルカンの濃度
とを関連づけて(1→3)-β-D-グルカンを測定するため
の、請求項１又は２記載の蛍光標識した(1→3)-β-D-グ
ルカン結合性ドメインタンパク質を含む、(1→3)-β-D-
グルカン測定剤。 - 【請求項４】 更に二価陽イオンを含む、請求項３記載
の(1→3)-β-D-グルカン測定剤。 - 【請求項５】 二価陽イオンがアルカリ土類金属イオン
であることを特徴とする請求項４記載の(1→3)-β-D-グ
ルカン測定剤。 - 【請求項６】 請求項１又は２記載の蛍光標識した(1→
3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質と検体中の
(1→3)-β-D-グルカンとを結合させ、当該結合による蛍
光偏光度の変化を検出し、蛍光偏光度の変化量と検体中
の(1→3)-β-D-グルカンの濃度とを関連づけることを特
徴とする(1→3)-β-D-グルカンの測定方法。 - 【請求項７】 二価陽イオン共存下で蛍光標識した(1→
3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質と(1→3)-
β-D-グルカンとを結合させることを特徴とする請求項
５記載の(1→3)-β-D-グルカンの測定方法。 - 【請求項８】 請求項１又は２記載の蛍光標識された(1
→3)-β-D-グルカン結合性ドメインタンパク質を含む(1
→3)-β-D-グルカン測定キット。 - 【請求項９】 更に二価陽イオンを含む請求項８記載の
(1→3)-β-D-グルカン測定キット。 - 【請求項１０】 二価陽イオンがアルカリ土類金属イオ
ンであることを特徴とする請求項９記載の(1→3)-β-D-
グルカン測定キット。
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