JP2002541439A - レセプタアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、試験化合物が特定の膜レセプタで示す効果を検出するレセプタ／レポータ融合タンパク質基本のアッセイ、並びに、このようなアッセイで使用するためのレセプタ／レポータ融合タンパク質、および興味深い／有用な効果を示すとしてアッセイによって同定される化合物に関する。適切な膜レセプタは、成長因子レセプタ、サイトカインレセプタ、イオンチャネルおよび任意のサブタイプを含むインテグリン、このようなレセプタの突然変異体、相同体、そしてキメラ形態である。アッセイは、Ｇ−タンパク質結合レセプタ（ＧＰＣＲ）を研究するのに特に適している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、試験化合物が特定の膜レセプタに有する効果を検出するレセプタ／
レポータ融合タンパク質基本のアッセイ、並びにそのようなアッセイに使用する
ためのレセプタ／レポータ融合タンパク質、および興味深い／有用な効果を示す
としてアッセイによって同定される化合物に関する。

【０００２】 Ｇタンパク質結合レセプタ（ＧＰＣＲｓ）等のレセプタでのリガンド活性の測
定のための典型的プロトコルは、多数の生化学的技術に依った。これらとしては
、公知放射性リガンドの結合を示す試験化合物の能力が測定される放射性リガン
ド結合分析、および特異的シグナル導入事象を活性化または阻害する試験化合物
の能力が測定される多数の機能性アッセイが挙げられる。

【０００３】 哺乳類細胞で発現されるＧＰＣＲでのリガンド活性の機能的アッセイとしては
、活性化Ｇタンパク質アルファサブユニットでのグアニンヌクレオチド交換の速
度の測定（Ｗｉｓｅら、１９９７）、ｃＡＭＰ、カルシウム、またはリン酸イノ
シトール等の過剰の細胞内の二次伝令代謝物の１つの濃度における変化の測定（
Ｇｕｄｅｒｍａｎら、１９９６）、またはイオンチャネルの活性化または阻害（
Ｗａｌｋｅｒおよびｄｅ Ｍａａｒｄ、１９９８）が挙げられる。最近、これら
のアッセイは、ＧＰＣＲシグナル導入の研究（Ｓｔｒａｔｏｗａら、１９９５；
ＡｌａｍおよびＣｏｏｋ、１９９０）のためのレポータ遺伝子系、並びに他の哺
乳類細胞、酵母またはゼノプスメラニン保有細胞（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｍｅｌａｎ
ｏｐｈｏｒｅ）基本のアッセイの開発によって補足された。

【０００４】 エクオレアビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）光タンパク質
ＧＦＰ（緑色の蛍光性タンパク質）は、４８８ｎｍでの蛍光励起による５０９ｎ
ｍの放出極大を示す緑色の光を放出する２３８個のアミノ酸タンパク質である。
他の生物発光レポータタンパク質と違い、さらなる基質または補助因子が、光放
出のために必要とされるものはない（Ｃｈｅｎら、１９９５）。ＧＦＰ蛍光は、
安定であり、そして哺乳類細胞、ショウジョウバエ、Ｃ．エレガンス(Ｃ．ｅｌ
ｅｇａｎｓ)、酵母および大腸菌を含めた多くの種の生きた細胞中で非逆的に測
定された。ＧＦＰ蛍光は、蛍光光度計により、ＦＡＣＳにより、そして顕微鏡に
より検出できる。アッセイ試薬またはアッセイプロトコルがないので、レポータ
タンパク質としてのＧＦＰの吸引性は、アッセイの速度および簡便さと共に費用
がかかる（ＣｈａｌｆｉｅおよびＫａｉｎ、１９９８）。

【０００５】 ＧＦＰについてのｃＤＮＡ配列の利用可能性は、増強した蛍光放出を示す数種
のＧＦＰ突然変異体の発生および特徴付けを生じた。アミノ酸６５からスレオニ
ンまでにあるセリンの突然変異体は、蛍光放出の強度で６倍の増加を示すタンパ
ク質の発生を生じた（Ｈａａｓら、１９９６）。さらに、Ｓｅｒ６５Ｔｈｒの存
在および位置６４からロイシンまでにあるフェニルアラニン残基の突然変異は、
蛍光強度で３５倍の増加を生じた（Ｈａａｓら、１９９６）。さらに、多数のＧ
ＦＰの新規突然変異体は、交代された励起または発光特徴でも同定された。例え
ば、位置６６からヒスチジンまでにあるチロシン残基の突然変異は、青色蛍光発
光を示すタンパク質、いわゆる４５８ｎｍの励起について、そして４８０ｎｍの
発光についてλ_ｍａｘを示す青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を発生した（Ｃｈａ
ｌｆｉｅおよびＫａｉｎ、１９９８）。ＧＦＰタンパク質のこれらおよび多くの
他の変異体は、現在、市販で入手可能である。

【０００６】 ＧＦＰは、タンパク質交換、および組換えで発現したタンパク質の細胞下局在
を評価するために融合タンパク質で広範に使用されてきた（ＷａｎｇおよびＨａ
ｚｅｌｒｉｇｇ、１９９４）。最近、多数のグループが、レセプタ内部移行を監
視するＧＰＣＲ−ＧＦＰ融合タンパク質の作成および使用、およびアゴニスト処
置に続く再利用を記載した。例えば、β_２−アドレナリンレセプタとＧＦＰとの
間の融合タンパク質は、レセプタ発現、原形質膜での局在化、およびアゴニスト
刺激に続く内部移行を監視するために使用された（Ｂａｒａｋら、１９９７）。

【０００７】 最近、多数の研究には、哺乳類細胞で発現した場合に突然変異体ＧＰＣＲによ
るシグナル導入カスケードのアゴニスト依存性活性化を生じるＧＰＣＲへの特異
的突然変異の導入が記載されている（ＳｃｈｅｅｒおよびＣｏｔｅｃｃｈｉａ、
１９９７、Ｌｅｕｒｓら、１９９８）。

【０００８】 この現象は、構造的活性として記載され、そしてそのような突然変異体レセプ
タは、構造的に活性な突然変異体（ＣＡＭ）レセプタと称された。このような実
験は、一般に、アゴニスト結合により起こり、同族のＧタンパク質の活性、従っ
て、下流エフェクター酵素の活性の制御を生じるＧＰＣＲでの可能な構造的交代
に光を注ぐと考えられた。β_２−アドレナリンレセプタの場合に、例えば、野生
型ＧＰＣＲに結合するアゴニストに関連した構造的修飾の内の１つは、残渣Ｃｙ
ｓ^２８５の位置決めにより測定され得る膜間螺旋６の移動である（Ｇｅｔｈｅｒ
ら、１９９７ａ）ので、このような攻略法は、信頼性を保持するようである。こ
のＧＰＣＲのＣＡＭ形態で、この同じＣｙｓ残基は、リガンド非専有野生型レセ
プタでよりリガンド結合ポケットに近い（Ｊａｖｉｔｃｈら、１９９７）。

【０００９】 おそらく、ＣＡＭ ＧＰＣＲの最大の研究は、第３の細胞内ループのＣ末端領
域の短いセグメントが、α_１Ｂ−アドレナリンレセプタから得られる対応の領域
に置換されたヒトβ_２−アドレナリンレセプタの形態である（Ｓａｍａｍａら、
１９９３、Ｓａｍａｍａら、１９９４）。

【００１０】 本発明は、そのようなレセプタでのリガンド活性についてのアッセイ系として
細胞表面でのレセプタ数における増加を導くＣＡＭ ＧＰＣＲのリガンド安定化
の現象を発展する可能性についての調査に部分的に基づいている。モデル系とし
て、本出願人らは、Ｃ末端でフレーム内に加えられた２７ｋＤａのＧＦＰを有し
たＣＡＭβ_２−アドレナリンレセプタの、一連の発明のアゴニストリガンドによ
り、安定性および制御を記載する。本出願人らは、ＧＰＣＲ−ＧＦＰ融合タンパ
ク質の細胞の分布における変化を引き起こすか、または総細胞の蛍光における交
代を引き起こす各リガンドの能力を測定することによってリガンド効力を測定し
た。さらに、本出願人らは、このレセプタでのアゴニストリガンドについてのス
クリーニング系としてＷＴ β_２−アドレナリンレセプタ／ＧＦＰ融合タンパク
質を発現する細胞の、細胞分布における一連の特異的アゴニストの効果、および
総細胞の蛍光を試験した。

【００１１】 従って、第１の態様で、本発明は、 ａ）上記膜レセプタ／レポータ融合タンパク質を含む細胞に、化合物を添加す
る工程；および ｂ）上記レセプタ／レポータ融合タンパク質のあらゆる変化を検出する工程 を含む、化合物が膜レセプタ／レポータ融合タンパク質に示す効果を検出するた
めのアッセイを提供する。

【００１２】 典型的には、アッセイは、特定の膜レセプタにおけるそれらの効果について化
合物をスクリーニングするために使用され得る。特定の膜レセプタにおける効果
を示すと同定される化合物は、例えば、野生型および／または突然変異体膜レセ
プタの活性を調節する上で有用であり得て；特定の膜レセプタの生物学上の機能
に磨きをかける上で使用され得て；および／または正常な膜レセプタ相互作用を
混乱させる化合物を同定するためにスクリーンに使用され得るか、またはそれら
自身で、このような相互作用を混乱させ得る。

【００１３】 アッセイは、膜レセプタの逆アゴニスト、アンタゴニストまたはアゴニストと
して働く化合物の検出に特に適している。用語逆アゴニストは、それが、レセプ
タに結合するときに、選択的に安定化し、従って、コンフォメーションまたは下
流シグナルを誘導する能力のないコンフォメーションでのレセプタの比率を増す
化合物を意味すると解釈される。アゴニストは、それが、レセプタに結合すると
きに、選択的に安定化し、従って、コンフォメーションまたは下流シグナルを誘
導する能力のあるコンフォメーションでのレセプタの比率を増す化合物を意味す
ると解釈される。アンタゴニストは、それが、レセプタに結合するときに、活性
または不活性のいずれかのコンフォメーションを増す選択的能力を示さず、従っ
て、それらの間の平衡を交代しない化合物を意味すると解釈される。

【００１４】 用語化合物は、化合物並びにペプチドおよび／またはタンパク質を含むと解釈
される。

【００１５】 それゆえ、本発明はまた、本発明によるアッセイを使用して同定されるレセプ
タタンパク質の逆アゴニスト、アンタゴニストまたはアゴニストに、および研究
のレセプタ機能または療法でのこのようなアゴニスト、アンタゴニストまたはア
ゴニストの使用に関する。

【００１６】 アッセイは、成長因子レセプタ、サイトカインレセプタ、イオンチャネルおよ
びインテグリンのような多様な膜レセプタに使用され得る。しかし、そのアッセ
イは、Ｇ−タンパク質結合レセプタ（ＧＣＰＲ）での化合物の効果を研究するの
に特に適する。

【００１７】 ここに使用される場合、用語レセプタは、サブタイプの命名されたレセプタ、
および構造的に活性な突然変異体、その相同体のような突然変異体、およびこの
ようなレセプタをコードする核酸を含むキメラレセプタを含むことが意図される
。ここに使用される場合、キメラレセプタは、様々な源から発見された哺乳類の
レセプタの部分を含むように形成され得るレセプタに該当する。

【００１８】 一般的に言うと、任意のＧタンパク質結合レセプタ、およびこのようなレセプ
タをコードするＤＮＡ配列は、本発明のアッセイに使用され得る。一般的なＧタ
ンパク質結合レセプタは、例えば、ドーパミンレセプタ、ムスカリン性コリン作
動性レセプタ、α−アドレナリン性レセプタ、β−アドレナリン性レセプタ、ア
ヘン剤レセプタ、カンナビノイドレセプタ、およびセロトニンレセプタである。

【００１９】 ここに明記される膜レセプタが、レセプタへのレポータタンパク質の融合によ
って典型的に修飾される。典型的には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等のレポ
ータタンパク質をコードする核酸は、特定のレセプタをコードする遺伝子の５’
または３’末端である末端にフレーム内で融合され得る。この方法で、遺伝子の
発現で、レポータタンパク質は、レセプタのＮ末端またはＣ末端に機能的に発現
され、そして融合される。レセプタの修飾は、膜レセプタの官能性が、レセプタ
へのレポータタンパク質の融合によって実質的に影響されないままであるようで
ある。

【００２０】 前に明記されるとおり、ＧＦＰは、蛍光励起により緑色光を発生する。この緑
色光の検出は、例えば、蛍光定量法、ＦＡＣＳにより、および当業者によく知ら
れる顕微鏡技術により行われ得る。この方法では、膜レセプタの局在化および／
または定量が、測定され得る。

【００２１】 従って別の態様で、本発明は、構造的に活性なβ_２−アドレノレセプタ／ＧＦ
Ｐ融合タンパク質およびβ_２−アドレノレセプタ／ＧＦＰ遺伝子融合のような、
開示されたアッセイで使用するための新規膜レセプタ／レポータ融合タンパク質
およびそれらの核酸構築物にも関する。ＧＰＣＲのようなレセプタの末端へのＧ
ＦＰ ２７ＫＤａポリペプチドの付着が、レセプタ機能に明らかに干渉し得るこ
とが予測され得るが、この手段で修飾されたＧＰＣＲは、未交代の薬理学を示し
、そして第２の伝令制御を開始するＧタンパク質と相互作用できるままであるこ
とが先に報告された。例えば、レセプタのＣ末端が、レポータタンパク質のＮ末
端に直接的に連結されているレセプタ／レポータ融合タンパク質が提供され得る
。タンパク質配列に対する重要でない修飾が行われ得る。例えば、エピトープタ
グを、レセプタのＮ末端および／または除去されたレポータ遺伝子の末端メチオ
ニンに付加し得る。このような修飾の多くは、習熟した名宛人によって予測され
得て、それによりレセプタ／レポータ融合タンパク質の官能性が、実質的に効果
的でないままであることを提供する。

【００２２】 本発明の核酸構築物は、レポータタンパク質をコードする適切な遺伝子である
、フレーム内で、それに融合する特定のレセプタをコードする核酸、典型的には
ＤＮＡを含む。一般的に、核酸構築物は、発現ベクターの手段によって試験され
るべき細胞内で発現される。典型的には、専有的ではないが、細胞は、哺乳類起
源のものであり、そして選択される発現ベクターは、特定の細胞型での発現に適
しているものである。

【００２３】 発現ベクターは、核酸が、特定の細胞での膜レセプタ／レポータ融合の発現を
効果的にする能力のある適切な対照配列に操作的に連結される複製可能なＤＮＡ
構築物である。典型的には、対照配列としては、転写性プロモータ、転写を制御
する任意のオペレータ配列、適切なｍＲＮＡリボソームの結合部位をコードする
配列、および転写および／または翻訳の終止を制御する配列が挙げられ得る。典
型的な発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、バクテリオファージまたは
ウイルスが挙げられ得て、そしてこのようなベクターは、宿主のゲノムに組込ま
れ得るか、または特定の細胞で自主的に複写できる。

【００２４】 レセプタ／レポータ融合タンパク質を発現する特定の細胞のために、細胞は、
適切な発現ベクターによって形質転換されなければならない。ここに使用される
場合、「形質転換」は、使用される方法に関係なく、宿主細胞への異種ポリヌク
レオチド断片の導入、例えば直接摂取、形質移入または形質導入に該当する。

【００２５】 従って、本発明は、本発明のレセプタ／レポータ融合を含む核酸構築物によっ
て形質転換され、そしてレセプタ／レポータ融合タンパク質を発現する細胞にも
関する。

【００２６】 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に加えて、類似のレセプタ／レポータ融合タン
パク質構築物は、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質またはシアン蛍光タ
ンパク質のようなＧＦＰの他の着色変異体を用いて作製され得る（Ｃｈａｌｆｉ
ｅおよびＫａｉｎ、１９９８）。

【００２７】 類似のレセプタ／レポータ融合は、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉ
ｓ）ルシフェラーゼ等の他のレポータタンパク質を用いても発生され得る（Ａｌ
ａｍおよびＣｏｏｋ、１９９０）。ＧＰＣＲ／ホタルのルシフェラーゼ融合の構
築は、例えば、マイクロプレート閾値計中での検出での読取としてのホタルのル
シフェラーゼ活性を用いるか、またはＣＣＤ画像システムを使用した化合物活性
の検出を可能にする。ホタルルシフェラーゼアッセイは、非常に感受性があり、
そして小型化プレートフォーマットでの、そしてＣＣＤ画像による検出について
アッセイをするのに扱いやすい（ＳｕｔｏおよびＩｇｎａｒ、１９９７）。ＧＦ
Ｐまたはホタルのルシフェラーゼに加えて、類似のレセプタ／レポータ融合は、
Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（海パンジー）ルシフェラーゼ（ＤｅＷ
ｅｔら、１９８７）、分泌胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）（Ｌｏｒ
ｅｎｚら、１９９１）、β−ラクタマーゼ（Ｍｏｏｒｅら、１９９７）およびβ
ガラクトシダーゼ（Ｈｅｎｔｈｏｒｎら、１９８８）を含めた任意のレポータ酵
素を使用して発生され得る。

【００２８】 化合物を添加する結果として前記膜レセプタ／レポータ融合タンパク質のあら
ゆる変化は、例えばレセプタ／レポータ融合タンパク質の細胞の局在化における
変化として、または前記レセプタ／レポータ融合タンパク質の合成または分解に
より半定量的に検出され得る。あらゆる変化の検出は、顕微鏡スライドまたは同
等物の表面に載せられた細胞で容易に行われ得る。しかし、本発明のアッセイは
、従来の９６ウェルプレートのようなマイクロタイタープレートのウェル等に載
せられた細胞上で都合よく行われ得る。

【００２９】 ここに記載されるアッセイに対する別の修飾は、例えば、ＰＡＲ１レセプタの
内部移行および分解の経路を利用することによって達成され得る。プロテアーゼ
活性化レセプタＰＡＲ１は、トロンビンシグナル発生を指向する。可逆的に結合
したリガンドを保持するβ_２−アドレナリンレセプタのような古典的ＧＰＣＲと
違い、ＰＡＲ１（および他のＰＡＲファミリーメンバー）は、トロンビンのよう
なプロテアーゼによるレセプタタンパク質のＮ末端のタンパク質分解性開裂に続
いて活性化されて、「束縛リガンド」として働く新たなアミノ末端を生じ、それ
によりレセプタシグナル発生を開始するレセプタ体と分子内で結合される（Ｖｕ
ら、１９９１ａおよび１９９１ｂ）。リガンド活性化に続いて他のＧＰＣＲを用
いたように、ＰＡＲ１は、迅速にリン酸化およびシグナル発生から連結を解かれ
るようになる。しかし、古典的なＧＰＣＲと異なり、ＰＡＲ１は、主に、タンパ
ク質分解を生じるリソソームに分取される（Ｔｒｅｊｏら、１９９８；Ｓｈａｐ
ｉｒｏおよびＧｏｕｇｈｌｉｎ、１９９８）。エンドソーム区分よりむしろリソ
ソームへの活性化ＰＡＲ１の交換は、ＰＡＲ１のＣ末端尾部によって全体的に指
向されているようである（ＴｒｅｊｏおよびＣｏｕｇｈｌｉｎ、１９９９）。物
質Ｐレセプタ（ＳＰＲ）は、ペプチドリガンド物質Ｐによって活性化され、ＷＴ
β_２−アドレナリンレセプタ融合タンパク質について観察されるとおり原形質膜
に内部移行および再利用される。しかし、ＳＰＲのカルボキシル細胞質尾部をＰ
ＡＲ１レセプタのものに交換することで、ＳＰＲ／ＰＡＲ１融合タンパク質の作
製を生じ、そしてそれは、リガンド物質Ｐによって活性化された場合に、原形質
膜に再利用するためのエンドソームによりも、むしろタンパク質分解性分解につ
いてのリソソームに標的になった（ＴｒｅｊｏおよびＣｏｕｇｈｌｉｎ、１９９
９）。

【００３０】 従って、レセプタの細胞質Ｃ末端尾部が、ＰＡＲ１レセプタの細胞質Ｃ末端尾
部に置換される、物質Ｐレセプタ、β_２−アドレナリンレセプタまたは任意の他
のＧＰＣＲを含む融合タンパク質が、レセプタタンパク質の分解を生じるアゴニ
スト処置に続いてリソソーム中に内部移行されることが予測され得る。この融合
タンパク質が、ＧＦＰ、またはＰＡＲ１レセプタ細胞質Ｃ末端尾部のカルボキシ
ル末端にフレーム内で融合された任意の他のレポータタンパク質をも含んだ場合
、その後アゴニスト処理は、レセプタタンパク質のリソソームの分解の結果とし
てレポータシグナルの損失を生じる。アンタゴニストまたは逆アゴニスト活性を
示す化合物について分析するために、細胞は、アゴニストの添加の前の期間にア
ンタゴニストで作製される。アンタゴニストは、アゴニストがレセプタに結合す
ることを防止し、そしてその結果、アゴニストがレセプタタンパク質の分解を指
向させることを防止する。レポータタンパク質としてＧＦＰを使用して、これは
、個別の、または群の細胞の共焦点顕微鏡検査によるか、適切なマイクロプレー
ト蛍光光度計を用いたマイクロプレートフォーマットでのいずれかで検出され得
る。レポータタンパク質としてホタルのルシフェラーゼを使用して、マイクロプ
レートルミノメトリまたはＣＣＤ画像によるかのいずれかを使用してホタルのル
シフェラーゼ活性のアッセイに続くレセプタ変化が、評価され得る。

【００３１】 本発明は、ここで、例のみとして以下の図面に関してさらに記載され、そして
それは以下を示す： 図１は、イソプレナリンに対応したＷＴβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰ
の原形質膜の位置および内部移行を示す。ＷＴβ_２−アドレナリンレセプタ−Ｇ
ＦＰは、ＨＥＫ２９３細胞で安定に発現され、そして個々のクローンが単離され
た。細胞のパッチは、アゴニスト（Ａ）の不在下で、続いて５分（Ｂ）、１０分
（Ｃ）および３０分（Ｄ）間の１０μＭイソプレナリンの添加で共焦点顕微鏡で
画像化された。

【００３２】 図２は、アルプレノロールの添加に続く原形質膜へのＷＴβ_２−アドレナリン
レセプタ−ＧＦＰの再利用を示す。ＷＴβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰ融
合タンパク質を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞のパッチは、アゴニスト（Ａ）
の不在下で、または２０分間のイソプレナリン（１０μＭ）の添加（Ｂ）に続い
て共焦点顕微鏡で画像作製された。洗浄して、イソプレナリンを除去することに
続いて、アルプレノロール（１０μＭ）を、３０分（Ｃ）または４０分（Ｄ）間
添加した。

【００３３】 図３は、ＣＡＭβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰの発現およびベタキソロ
ールによるアップレギュレーションを示す。ＣＡＭβ_２−アドレナリンレセプタ
−ＧＦＰ構築物は、ＨＥＫ２９３細胞および単離された個々のクローン中で安定
に発現された。（ａ）単独のクローンの細胞は、２４時間、不在（上部パネル）
または存在（下部パネル）下、またはベタキソロール（１０μＭ）でガラス製カ
バースリップ上で育成された。その後、これらの細胞は、可視化された。（ｂ）
処理されていないか、またはベタキソロール（１０μＭ）で処理され、そしてそ
の後洗浄されたこのクローンの細胞は、無傷の細胞での［^３Ｈ］ＤＨＡの特異的
結合を測定するために使用された（［^３Ｈ］ＤＨＡは、原形質膜を越え、従って
、β_２−アドレナリンレセプタ結合部位の総細胞レベルの測定値を提供する脂肪
親油性アンタゴニストである）。

【００３４】 図４は、他のβ_２−アドレナリンレセプタリガンドによるＣＡＭβ_２−アドレ
ナリンレセプタ−ＧＦＰのアップレギュレーションを示す。図３のＣＡＭβ_２−
アドレナリンレセプタ−ＧＦＰ発現細胞を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を、
２４時間、リガンドなし（Ａ）、カルベジロール（Ｂ）、ラベトロール（Ｃ）ま
たはＩＣＩ１１８５５１（Ｄ）（各々１μＭで）に露出させた。その後、細胞を
、共焦点顕微鏡で画像化させた。

【００３５】 図５は、ベタキソロールにより、ＷＴβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰで
ないＣＡＭβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰのアップレギュレーションを示
す。膜分画は、ベタキソロール（１０μＭ）の不在または存在下で２４時間維持
され、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた、ＣＡＭβ_２−アドレナリンレセプ
タ−ＧＦＰまたはＷＴβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰ融合タンパク質のい
ずれかを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞から作製された。ニトロセルロースへ
の移動に続いて、サンプルを、ポリクローナル抗−ＧＦＰ抗体を用いて免疫ブロ
ッティングして、これらの膜中の融合タンパク質の濃度を評価した。

【００３６】 図６は、イソプレナリンによる、アップレギュレートされたＣＡＭβ_２−アド
レナリンレセプタ−ＧＦＰの内部移行を示す。（ａ）ＣＡＭβ_２−アドレナリン
レセプタ−ＧＦＰ発現細胞を、未処理（Ａ）であるか、またはベタキソロール（
１０μＭ、２４時間）（Ｂ−Ｄ）に露出させるかした。ベタキソロール処理に続
いて、細胞を洗浄し、そしてイソプレナリン（１０μＭ）を、０分（Ｂ）、１０
分（Ｃ）または３０分（Ｄ）間添加した。（ｂ）図６ａにあるとおり、細胞を、
未処理にするか、ベタキソロール（１０μＭ、２４時間）に露出されるか、また
はベタキソロールに露出し、続いてイソプレナリンに３０分間露出させた。その
後、無傷の細胞を使用して、［^３Ｈ］ＣＧＰ１２１７７（［^３Ｈ］ＣＧＰ１２１
７７は、原形質膜を貫通せず、そしてこれらの条件で、細胞表面レセプタのみを
記録する親水性リガンドである）の特異的結合を測定した。

【００３７】 図７ａは、マイクロタイタープレート蛍光定量法によって測定されるＣＡＭβ _２ −アドレナリンレセプタ−ＧＦＰ中の蛍光のレベルにおける種々の逆アゴニス
ト／アンタゴニストの効果を示す。蛍光における変化は、９６ウェルプレートに
載せられた細胞を用いて、分光蛍光プラス蛍光光度計で測定された。グラフは、
２２時間薬剤接触の後のイソプレナリン、ベタキソロール、アルプレノロールま
たはソタロールに対する濃度応答を示す。値は、二重±ＳＥＭで行われた少なく
とも３回の実験の基本線の平均含有率である。

【００３８】 図７ｂは、マイクロタイタープレート蛍光定量法によって測定されたベタキソ
ロールによるＣＡＭβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰのアップレギュレーシ
ョンの濃度依存性を示す。蛍光における変化は、９６ウェルプレートに載せられ
た細胞を用いて、分光蛍光プラス蛍光定量法で測定された。グラフは、時間０時
間（●）での、および２２時間後（▲）のベタキソロールに対する用量応答曲線
を示す。値は、二重±ＳＥＭで行われた６回の実験の基本線の平均含有率である
。

【００３９】 図７ｃは、マイクロタイタープレート蛍光定量法によって測定された、イソプ
レナリンによるβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰのダウンレギュレーション
の濃度依存性を示す。グラフは、時間０時間（●）での、および２２時間後（▲
）のイソプレナリンに対する用量応答曲線を示す。値は、二重±ＳＥＭで行われ
た６回の実験の基本線の平均含有率である。

【００４０】 図８は、アルプレノロールによる、ＣＡＭβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦ
Ｐのものによるアップレギュレーションの濃度依存性を示す。結合研究：ＣＡＭ
β_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰ発現細胞を、未処理にするか、または２４
時間、変化する濃度のアルプレノロールに露出させた。それらは順次洗浄され、
そして［^３Ｈ］ＤＨＡまたは［^３Ｈ］ＣＧＰ１２１７７のいずれかの単独濃度の
無傷ノ細胞特異的結合を、それぞれ、総細胞レセプタおよび細胞表面レセプタの
レベルを突き止めるために測定した。

【００４１】 図９は、α_１ｂ−アドレナリンレセプタに対するホスホイノシチダーゼＣ活性
の構造的活性化を吹き込む突然変異の位置である。ハムスターのα_１ｂ−アドレ
ナリンレセプタの一次配列の一次図形のリボン図が示される。ここに使用される
構造的に活性な突然変異体（３ＣＡＭ）は、野生型配列に対する以下の（Ｒ２８
８Ｋ、Ｋ２９０Ｈ、Ａ２９３Ｌ）交代を示す。

【００４２】 図１０は、持続的アンタゴニスト／逆アゴニスト誘発による、野生型ではなく
３ＣＡＭのハムスターのα_１ｂ−アドレナリンレセプタのアップレギュレーショ
ンである。ガラス製カバースリップ上で育成された３ＣＡＭ（１０Ａ）または野
生型（１０Ｂ）ハムスターのα_１ｂ−アドレナリンレセプタを、２４時間、ビヒ
クル（ａ）、フェントラミン（ｂ）、ＷＢ４１０１（ｃ）またはＨＶ７２３（ｄ
）（全て、１μＭで）で処理した。その後、細胞を、共焦点顕微鏡で可視化させ
た。

【００４３】 同等の研究が、細胞のプレート上で行われ、そしてその後、それを、洗浄およ
び収穫した。膜を作製し、そしてその後、［^３Ｈ］プラジシンの単独濃度（２ｎ
Ｍ）の特異的結合の許容量を評価した（図１０Ｃ）。

【００４４】 図１１は、ＨＥＫ２９３細胞での安定な発現に続くＷＴおよびＣＡＭα_１ｂ−
アドレナリンレセプタ／ＧＦＰ融合タンパク質のアップレギュレーションである
。グラフは、（Ａ）フェニレフリン、（Ｂ）フェントラミン、（Ｃ）ＷＢ４１０
１および（Ｄ）ＨＶ７２３を用いた２２時間処理の総細胞の蛍光における効果を
示す。全てのグラフで、▲は、野生型α_１ｂ−アドレナリンレセプタ／ＧＦＰか
ら得られたデータを表し、そして●は、ＨＥＫ２９３細胞でのＣＡＭα_１ｂ−ア
ドレナリンレセプタ／ＧＦＰから得られたデータを表す。全ての値は、基本線の
蛍光の含有率として表され、そして二重±ＳＥＭで行われた少なくとも４回の実
験の平均である。

【００４５】 図１２は、ＮＥＫ２９３細胞でのＣＡＭα_１ｂ−アドレナリンレセプタ／ＧＦ
Ｐのアップレギュレーションの時間経過である。グラフは、（Ａ）フェニレフリ
ン、（Ｂ）ＷＢ４１０１、（Ｃ）ＨＶ７２３および（Ｄ）フェントラミンで引き
起こされた蛍光のアップレギュレーションを示す。データは、二重に行われた１
回の実験を表す。

【００４６】 図１３は、β_２−アドレナリン作動性レセプタ／ルシフェラーゼ融合タンパク
質構築物の概略図である。

【００４７】 図１４は、このレセプタでアンタゴニストを同定するＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎ
ｉｆｏｒｍｉｓのルシフェラーゼに連結した構造的に活性なβ_２−アドレナリン
レセプタの構築および概念的用途である。細胞で発現される構築物を、このレセ
プタに結合するリガンドで処理する。これは、時間に対するタンパク質のアップ
レギュレーションを、従って標準手段によって監視され得る細胞中で高いレベル
のＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍのルシフェラーゼ活性を引き起こす。

【００４８】 図１５は、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍのルシフェラーゼに連結した構
造的に活性なβ_２−アドレナリンレセプタのレベルにおける濃度依存性の増加で
ある。β_２−アドレナリンレセプタに結合する変化する濃度の３個のリガンドを
、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍのルシフェラーゼに連結した構造的に活性
なβ_２−アドレナリンレセプタを安定に発現する細胞を含有する９６穴マイクロ
タイタープレートのウェルに添加した。その後、これらのプレートを、培地を各
ウェルからピペット採取した時間の後に２４時間インキュベートした。

【００４９】 その後、５０ｕｌのフェノールレッド不含培地を、さらに５０ｕｌのｌｕｃ−
ｌｉｔｅ溶液（レニラルシフェラーゼ活性について最適化され、そして温和な細
胞溶解成分をも含有する市販のキット試薬）を、各ウェルに添加した。最後に、
フェノールレッド不含培地中の５０ｕｌの１５ｕＭエレンテラジン（Ｃｏｅｌｅ
ｎｔｒａｚｉｎｅ）を、添加した（そして５ｕＭの最終濃度を得た）。その後、
プレートを、頂上の計数の閾値計ですぐに分析して、相対的光単位での光強度を
測定した。

【００５０】 図１６は、安定に形質移入されて、ＰＡＲ１ｍｕｔ／ＧＦＰ融合タンパク質を
発現するＨＥＫ２９３細胞のレーザー走査共焦点画像である。１０μＭのＴＲＡ
Ｐを用いた４０分間のインキュベーション前（左手画像）および後（右手画像）
で行われた場合、ＡおよびＢは、２つの異なるカバースリップの細胞を表す。

【００５１】 図１７は、ＨＥＫ２９３細胞での安定な発現に続くＰＡＲ１ｍｕｔ／ＧＦＰ融
合タンパク質のアゴニストダウンレギュレーションである。棒グラフは、（Ａ）
ＴＲＡＰまたは（Ｂ）トロンビンのいずれかを用いた４時間の処理の効果を示す
。全ての値は、基本線の蛍光の含有率として表され、そして四重に行われた２回
の実験の平均である。

【００５２】 材料および方法Ｉ ［^３Ｈ］ＤＨＡ（６４Ｃｉ／ミリモル）および［^３Ｈ］ＣＧＰ−１２１７７（
４４Ｃｉ／ミリモル）を、Ａｍｅｒｓｈａｍから購入した（ＵＫ）。［^３Ｈ］ア
デニンおよび［Ｈ^３］ｃＡＭＰを、英国アマシャムのＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入した。細胞培養のための全ての試薬を、Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｓｔｒａｔｈｃｌｙｄｅ、ＵＫ
）から購入した。レセプタリガンドを、ＲＢＩから購入した。全ての他の試薬を
、ＳｉｇｍａまたはＦｉｓｏｎｓから購入し、そして最高の利用可能な純度のも
のであった。

【００５３】 ＧＦＰタグ付形態のβ_２−アドレナリンレセプタの構築 ｐｃＤＮＡ３（ＭａｃＥｗａｎおよびＭｉｌｌｉｇａｎ、１９９６ａ）中のヒ
ト野生型β_２−ＡＲを、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＦＬＡＧ順向プライマー、５’ＡＡＡ
ＡＡＡ ＡＡＧＣＴＴ ＧＣＣＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＡ
Ｃ ＧＡＣ ＧＡＴ ＧＡＴ ＡＡＧ ＧＧＧ ＣＡＡ ＣＣＣ ＧＧＧ ＡＡ
Ｃ ＧＧＣ ３’、およびＢａｍＨＩ逆行プライマー、５’ＡＡＡＡＡ ＧＧＡ
ＴＣＣ ＴＣＣ ＣＧＣ ＣＡＧ ＣＡＧ ＴＧＡ ＧＴＣ ＡＴＴ ＴＧＴ
Ａ ３’を用いたＰＣＲによって増幅させた。これは、Ｎ末端で付加されたＦＬ
ＡＧ^ＴＭエピトープタグ（ＡＴＧ ＧＡＣ ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＡＣ ＧＡＣ
ＧＡＴ ＧＡＴ ＡＡＧ）に存在すべきイニシエータＡＴＧで、β_２−ＷＴ−Ａ
Ｒの停止コドンおよび開始メチオニン（出発コドン）を除去させた。ＰＣＲ産物
を、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍ ＨＩで消化させ、そして生じた断片を、ｐ
ｃＤＮＡ３に連結させて、野生型Ｂ_２−ＡＲ／ＧＦＰ構築物を生じた。ＷＴＢ_２ レセプタのアミノ酸１７２−２９１をコードする配列は、Ｋｐｎ Ｉ／Ｈｐａ
Ｉを用いてこの構築物に制限され、そしてＣＡＭβ_２−ＡＲの等価領域に置換さ
れた（Ｓａｍａｍａら、１９９３、１９９４）。修飾形態のＧＦＰ（Ｚｅｒｎｉ
ｃｋａ−Ｇｏｅｔｚら、１９９７）も、ＢａｍＨＩ順向プライマー、５’ＡＡＡ
ＡＡ ＧＧＡＴＣＣ ＡＧＴ ＡＡＡ ＧＧＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＣＴＴ ＴＴ
Ｃ ３’、およびＸｂａ Ｉ逆プライマー、５’ＴＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＴ
ＴＧＴＡＴＡＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＧＣＣ ３’を用いたＰＣＲによって増幅さ
せた。これは、ＧＦＰの開始メチノニンを除去し、そして生じたＰＣＲ産物は、
消化され、そしてフレーム内に連結されて、ＣＡＭβ_２−ＡＲ−ＧＦＰ構築物を
発生した。

【００５４】 ＨＥＫ２９３細胞の一過性でそして安定な形質移入 ＨＥＫ２９３細胞を、３７℃で、５％ＣＯ_２湿潤雰囲気下で、０．２９２ｇ／
ＬのＬ−グルタミン、および１０％新生仔ウシ血清を補足した最小必須培地（Ｍ
ＥＭ、Ｓｉｇｍａ）で維持した。細胞を、一過性形質移入の前に６０−８０％密
集で育成させた。製造業者の指示によって、リポフェクトＡＭＩＮＥ試薬（Ｌｉ
ｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて形質移入を行った。安定
なセルラインを発生するために、形質移入の２日後に、細胞を、種付け／希釈し
、そして１ｍｇ／ｍｌジェネチシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉ
ｎｃ．）で補足したＭＥＭ培地で維持した。培地を、１ｍｇ／ｍｌジェネチシン
を含むＭＥＭ培地に３日毎に交換された。クローンの発現は、ＧＦＰ含有クロー
ンについて蛍光顕微鏡検査によって最初に試験した。ＧＦＰおよび非−ＧＦＰタ
グ付形態のレセプタを発現する選択クローンを、拡張させ、そして［^３Ｈ］リガ
ンド結合研究を行って、レセプタ発現のレベルを評価した。

【００５５】 共焦点のレーザー走査顕微鏡検査 Ｚｅｉｓｓ Ｐｌａｎ−Ａｐｏ ６３×１．４０ＮＡ油浸対物レンズ、３５の
ピンホール、および電子ズーム１または３を使用したレーザー走査共焦点顕微鏡
（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ１００）を用いて、細胞を観察した。４８８ｎ
ｍアルゴン／クリプトンレーザーを用いてＧＦＰを励起させ、そして５１５−５
４０ｎｍバンド通過フィルタで検出した。画像は、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭまたはＭ
ｅｔａＭｏｒｐｈ Ｓｏｆｔｗａｒｅで操作した。細胞の作製のための２個の異
なるプロトコルを使用した。内部移行および再利用の時間経過を試験するときに
、生きた細胞を使用した。細胞を、ガラス製カバースリップ上で育成し、そして
画像チャンバーに載せた。細胞を、ＫＲＨ緩衝液（以下参照）で維持し、そして
温度を３７℃に維持した。他の研究で、固定細胞を使用した。ガラス製カバース
リップ上の細胞を、ＰＢＳで洗浄し、そしてＰＢＳ／５％ショ糖（ｐＨ７．２）
中の４％パラホルムアルデヒドを用いて、室温で２０分間固定させた。ＰＢＳを
用いて１回洗浄した後、カバースリップを、ＰＢＳ中の４０％グリセロールを用
いて顕微鏡スライドに載せた。

【００５６】 ［^３Ｈ］リガンド結合研究 ＣＡＭβ_２−ＡＲ−ＧＦＰ細胞を、６ｃｍ皿で育成し、そして２４時間、１０
μＭベタキソロールまたは種々の濃度のアルプレノロールで、またはそれなしで
処理した。ある場合には、ベタキソロール処理細胞を順次３０分間、１０μＭイ
ソプレナリンに露出させた。処理後、細胞を、３回氷冷リン酸緩衝生理食塩水（
ＰＢＳ；２．７ｍＭ ＫＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ _４ 、８ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．４）で洗浄した。その後、細胞を、ＰＢ
Ｓ／０．５ｍＭ ＥＤＴＡでプレートから剥し、氷冷クレープス−リンガー−ヘ
ペス緩衝（ＫＲＨ；１３０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ Ｍｇ
ＳＯ_４、１．２ｍＭ ＣａＣｌ_２、２０ｍＭ ヘペス、１．２ｍＭ Ｎａ_２ＰＯ _４ 、１０ｍＭグルコース、０．１％ＢＳＡ；ｐＨ７．４）にペレット化し、そし
て緩衝液中に再懸濁させた。血球計中の細胞を計数した後、およそ１００，００
０細胞を、各アッセイ管に添加した。

【００５７】 結合研究については、単独の濃度の［^３Ｈ］ＤＨＡ（２ｎＭ）または［^３Ｈ］
ＣＧＰ−１２７７１（１０ｎＭ）を使用して、それぞれ、総細胞レセプタおよび
細胞表面レセプタを測定した。１０μＭプロパノロールを用いた平行研究は、非
特異的結合の評価を可能にさせた。［^３Ｈ］ＤＨＡ結合アッセイを、４５分間３
０℃で行い、そして［^３Ｈ］ＣＧＰ−１２７７結合を、ＫＲＨ緩衝液中で２．５
時間、１４℃で行った。全ての実験は、ワットマンＧＦ／Ｃフィルタを通して、
高速濾過によって終了され、続いて、氷冷ＴＥ（７５ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ；ｐＨ７．４）緩衝液で３回洗浄した。

【００５８】 無傷の細胞アデニリルサイクラーゼ活性測定 無傷の細胞アデニリルサイクラーゼ活性測定を、基本的に、Ｗｏｎｇ（１９９
４）およびＭｅｒｃｏｕｒｉｓら（１９９７）によって記載されるとおり行った
。細胞を、１２ウェルプレートのウェルに分け、そして細胞を、再付着させた。
その後、細胞を、１６−２４時間、［^３Ｈ］アデニン（１．５μＣｉ／ウェル）
を含有する培地でインキュベートした。その後、種々のリガンドおよび他の試薬
を用いた細胞の処理に応じた［^３Ｈ］ｃＡＭＰの発生を評価した。結果は、［^３ Ｈ］ｃＡＭＰの濃度対総［^３Ｈ］アデニンヌクレオチド（×１０００）の比とし
て表される。

【００５９】 免疫ブロッティング研究 電気泳動および免疫ブロット分析 ホウ酸基本の電気泳動緩衝系［Ｐｏｄｕｓｌｏ，Ｊ．Ｆ．（１９８１）Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１４、１３１−１３９］を、ある程度の修飾をして使用
した。簡潔には、溶解性ポアクリルアミドゲルは、１０％アクリルアミド、０．
０６２５％ビスアクリルアミド、０．１Ｍトリス（ｐＨ８．５）、０．１Ｍホウ
酸、０．００２５Ｍ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、０．００５％ＴＥＭＥＤおよ
び０．１％過硫酸アンモニウムから作製された。重層ゲルは、それが、４％アク
リルアミドを含有すること以外は同じ組成のものであった。ホウ酸電気泳動稼動
用緩衝液は、０．１Ｍトリス、０．１Ｍホウ酸、０．００２５Ｍ ＥＤＴＡおよ
び０．１％ＳＤＳ（ｐＨ８．５）から構成された。標準およびホウ酸電気泳動を
、１時間、２００Ｖおよび１５０Ｖで、それぞれ、Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅａｎ
ＩＩゲルキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｈａｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，Ｕ．Ｋ．
）を用いて稼動させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、タンパク質を、ニトロセルロー
スに電気泳動で移行させた。膜を、１時間、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液（０．１％Ｔｗｅ
ｅｎ２０を含有するＰＢＳ）中の３％脱脂ミルク中で遮断した。ＰＢＳ−Ｔ緩衝
液中の簡潔な洗浄の後、膜を、一晩中４℃で、１％脱脂ミルクを含有するＰＢＳ
−Ｔ緩衝液で希釈された適切な一次抗体を用いてインキュベートした。ＧＦＰポ
リクローナル抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｕ．Ｋ．）
を、構築物の検出のために使用した。その後、一次抗体を除去し、そしてブロッ
トを、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で専有的に洗浄した。二次抗体（ホースラディシュペル
オキシダーゼで接合したロバ抗−ウサギＩｇＧ、Ｓｃｏｔｔｉｓｈ Ａｎｔｉｂ
ｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ、Ｃａｒｌｕｋｅ Ｓｃｏｔｌａｎｄ
）を用いた連続インキュベーションを、室温で２時間進行させ、そしてＰＢＳ−
Ｔ緩衝液中での大量の洗浄の後、ブロットを、増強した化学発光ＥＣＬ（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ）によって可視化させた。画像密度計ＧＳ−６７０（ＢＩＯＲＡＤ）
での走査によって、特異的バンドの定量分析を行った。

【００６０】 マイクロタイタープレートでの研究 細胞を、実験の前の日に、黒色コスター観察プレートに種付けした。実験の日
に、培地を、細胞から除去し、そして薬剤を、１００μｌの最終容量でウェルに
添加した。１０％ＦＣＳを含有するフェノールレッド不含Ｆ１２培地中で、実験
を行った。分光蛍光プラス蛍光光度計を、１００の増加で底からプレートの読み
を読み取るのに使用した。黒色プレートを、蛍光光度計で最初に読み、その後、
細胞のプレートを、３７℃で、薬剤を用いて、時間０で、そして２２時間インキ
ュベーションの後に読み取った。結果は、プレート自己蛍光について制御するた
めに得られた蛍光値から空のプレートを引くことによって計算された。

【００６１】 実施例１−ＧＰＣＲ／ＧＦＰ融合タンパク質の構築 ＰＣＲ基本の攻略法を使用して、野生型β_２−アドレナリンレセプタ、および
第３の細胞内ループの遠位末端の小型セグメントを、ハムスターのα_１Ｂ−アド
レナリンレセプタの等価セグメントに置換することによって発生されたこのＧＰ
ＣＲの構造的に活性な突然変異体形態の両方をコードするｃＤＮＡと、フレーム
内に増強された自己蛍光特性（Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚら、１９９７）を
示すＧＦＰの形態をコードするｃＤＮＡを連結させた。ＧＰＣＲのＣ末端を、Ｇ
ＦＰのＮ末端に直接的に連結される単独の開放読取フレームをコードすという予
測がある。これらの構築物の一過性形質移入、および成功裏の発現および自己蛍
光を確認するたの蛍光顕微鏡での可視化に続いて、これらの構築物および等価の
非−ＧＦＰタグ付形態のＧＰＣＲの両方は、ＨＥＫ２９３細胞で安定に発現され
た。β−アドレナリンレセプタアンタゴニスト［^３Ｈ］ジヒドロアルプレノロー
ル（［^３Ｈ］ＤＨＡ）の適切な自己蛍光および特異的結合の組合せに基づいて、
個々のクローンを同定し、そして順次拡張させた。野生型β_２−アドレナリンレ
セプタ−ＧＦＰ構築物を発現するクローンで、ガラス製カバースリップで育成さ
れた無傷の細胞で行われる共焦点顕微鏡検査は、描写された原形質膜であるべき
ＧＦＰ由来の自己蛍光のバルクを示した（図１）。β−アドレナリンレセプタア
ゴニストイソプレナリン（１０^−５Ｍ）の添加は、このような構築物について先
に報告された（Ｂａｒａｋら、１９９７、Ｋａｌｌａｌら、１９９８）とおり、
連続の細胞内の小胞（図１）への構築物の時間依存性内部移行を生じた。野生型
β_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰ構築物は、イソプレナリンを用いた３０分
間の処理に続いて内部移行させ、そしてイソプレナリンの除去、およびそれ自身
内部移行を促進しないβ−アドレナリンレセプタアンタゴニストアルプレノロー
ル（１０^−５Ｍ）（図２）にそれを置換することに続いて、原形質膜に再利用さ
れ得る。

【００６２】 ＣＡＭβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰ構築物を発現するクローンをも単
離されたが、これらは、ＷＴβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰ構築物を発現
するクローンと同じレベルのＧＦＰ自己蛍光を示さなかった。このような観察は
、ＣＡＭβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰ構築物の安定な状態の発現を日常
的に低い濃度に一致した。これは、野生型β_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰ
構築物を発現するクローンに比べて、これらの細胞から単離された膜分画に対す
る低い濃度の［^３Ｈ］ＤＨＡ特異的結合によって確認された。さらに、明確な原
形質膜局在化ＣＡＭβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰは、観察され得るが、
ＷＴβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰについてより細胞内に配置されたＧＦ
Ｐ自己蛍光のより大きな分画であると思われる（図３ａ）。

【００６３】 実施例２−ＧＰＣＲ／ＧＦＰ融合タンパク質に対するリガンド結合 本出願人らは、逆アゴニストベタキソロールでＣＡＭβ_２−アドレナリンレセ
プタを安定に発現するＮＧ１０８−１５細胞の持続的処理が、このＧＰＣＲの安
定な状態のレベルにおける増加を引き起こし得ることを先に仮定した。ＣＡＭβ _２ −アドレナリンレセプタ−ＧＦＰ構築物を発現する細胞を、ベタキソロール（
２４時間、１０^−５Ｍ）で処理し、そしてその後共焦点顕微鏡検査によって可視
化させたとき、描写された原形質膜および細胞内蛍光の両方における際立った増
加が観察された（図３ａ）。細胞の洗浄、続いて［^３Ｈ］ＤＨＡを用いた無傷の
細胞リガンド結合実験は、ベタキソロールに応じたＣＡＭβ_２−アドレナリンレ
セプタ−ＧＦＰのアップレギュレーションを確認した（図３ｂ）。ＩＣＩ１１８
５５１、ラベトロール、カルベジロール、アルプレノロール、およびジヒドロア
ルプレノロール（全て、１０^−５Ｍで）を含めたβ_２−アドレナリンレセプタ逆
アゴニスト／アンタゴニストの範囲を用いた細胞の処理によって、蛍光のアップ
レギュレーションも観察された（図４）。しかし、この効果の薬理学上の選択性
は、それが、α_１−アドレナリンレセプタアンタゴニストプラゾシンまたはα_２ −アドレナリンレセプタアンタゴニストヨヒンビンでの処理によって記録されな
い場合に保存された（データ示さず）。

【００６４】 上に記載されたベタキソロールまたは他のリガンドを用いた、野生型β_２−ア
ドレナリンレセプタ−ＧＦＰを発現する細胞の持続的処理は、蛍光強度として構
築物の明らかなアップレギュレーションを生じることに失敗し、そして分布パタ
ーンは、薬剤処理によってほとんど修飾されなかった（データ示さず）。ベタキ
ソロール処理によるＣＡＭβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰのアップレギュ
レーションは、共焦点顕微鏡検査によって見られる効果を確認する免疫ブロット
実験でも監視され得た。２４時間、ベタキソロール（１０^−５Ｍ）の存在または
不在下での維持に続いて、野生型β_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰまたはＣ
ＡＭβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰ発現細胞のいずれかから単離される膜
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、そしてＧＰＣＲ構築物は、抗−ＧＦＰ
抗体を用いた免疫ブロッティングによって検出された。野生型β_２−アドレナリ
ンレセプタ−ＧＦＰではなくてＣＡＭβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰの明
瞭なアップレギュレーションが観察された（図５）。

【００６５】 ＣＡＭβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰのベタキソロールで誘導されるア
ップレギュレーションに続いて、このリガンドの除去およびイソプレナリン（１
０^−５Ｍ）へのその変換は、野生型β_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰについ
て上に記録されたものから区別不可能な手段で、細胞内斑点状の小胞への構築物
の高速の内部移行を生じた（図６ａ）。［^３Ｈ］ＣＧＰ−１２１７７は、原形質
膜を越えることができない親水性β_２−アドレナリンレセプタアンタゴニストで
ある。従って、無傷の細胞特異的結合実験で、それは、β_２−アドレナリンレセ
プタの細胞表面集団のみを同定する。ＣＡＭβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦ
Ｐを発現する細胞で、このような無傷の細胞結合研究が行われ、その細胞は、ベ
タキソロール（２４時間、１０^−５Ｍ）で予め処理され、そしてそのような細胞
は、その後、３０分間、ベタキソロールをイソプレナリン（１０^−５Ｍ）に置換
された。これらの研究は、細胞表面アップレギュレーションＣＡＭβ_２−アドレ
ナリンレセプタ−ＧＦＰが、アゴニストの処理により主に内部移行されることを
示した（図６ｂ）。

【００６６】 ベタキソロールおよびβ−アドレナリンレセプタアンタゴニスト／逆アゴニス
トリガンドを用いた持続的処置によるＣＡＭβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦ
Ｐのアップレギュレーションは、９６ウェルマイクロタイタープレートへの細胞
の種付けに続いて、分光蛍光プラス蛍光光度計で検出し、そして直接的に定量さ
れ得る。これは、化合物を用いた２２時間のインキュベーションの後、種々の逆
アゴニスト／アンタゴニストを用いたＣＡＭβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦ
Ｐアップレギュレーションの濃度依存の分析を可能にした（図７ａ）。ベタキソ
ロールは、このＧＰＣＲ構築物に結合するベタキソロールの測定されたＫ_１に十
分に従った値（ＭａｃＥｗａｎおよびＭｉｌｌｉｇａｎ、１９９６ａ）である、
１６８（４７−６００）ｎＭのＥＣ_５０を示す構築物のアップレギュレーション
を生む最も明らかな応答（図７ｂ）を示した。ベタキソロールを用いたＷＴβ_２ −アドレナリンレセプタ−ＧＦＰ融合の処理は、１時間または２２時間のいずれ
かの薬剤インキュベーションに続く細胞の蛍光になんら変化を生じなかった。し
かし、２２時間、アゴニストリガンドイソプレナリンを用いたこのような細胞の
インキュベーションは、分光蛍光プラス蛍光光度計での定量により、細胞の蛍光
におけるイソプレナリン指向性変化の濃度依存性の分析を可能にする、細胞の蛍
光の際立った減少を生じた。イソプレナリンは、細胞の蛍光における減少を、１
３（２．５−７０）ｎＭのＩＣ５０にさせた（図７ｃ）。これは、このレセプタ
でのこの薬剤によるｃＡＭＰの刺激についての５ｎＭの報告されたＥＣ_５０と著
しく違う。

【００６７】 要約すると、本実施例は、ＣＡＭβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰ融合構
築物を発現する逆アゴニストまたは中性アンタゴニスト処理は、共焦点顕微鏡検
査により検出されるとおり膜蛍光における増加を、そしてマイクロプレート蛍光
定量法により測定されるとおり総細胞の蛍光における増加を生じる。これらの効
果の濃度依存性は、伝統的な薬理学上の研究から得られるデータと一致し、従っ
てレセプタ機能を効果的にする化合物の特徴付けについてのこのアプローチの使
用の信用性を立証する。ＣＡＭβ_２−ＧＰＣＲ−ＧＦＰ融合を発現する細胞から
得られる細胞の蛍光における増加を引き起こす逆アゴニストまたはアンタゴニス
トリガンドの能力は、同様の活性を示す新たな化合物についてのマイクロプレー
ト基本の蛍光アッセイの用意に対処する。

【００６８】 ＷＴβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰ融合を発現する細胞のアゴニスト処
理は、膜結合蛍光における減少を、そして抗−トランスフェリン抗血清を用いた
同時免疫局在化によって、エンドソームであると示される細胞内の小胞中の蛍光
における増加を生じることが観察された。融合タンパク質の内部移行に続くマイ
クロプレート蛍光定量法により観察される蛍光における減少は、部分的に、レセ
プタ分解による可能性があるが、エンドソーム区分の酸性環境内でレセプタ濃度
の結果として蛍光消光事象による可能性もある。しかし、イソプレナリンのよう
なアゴニストリガンドによって引き起こされる蛍光におけるこの減少は、濃度依
存性があり、そしてこの効果を引き起こすことが必要とされる半極大薬剤濃度は
、伝統的な二次伝令分析研究で得られた値に一致している。

【００６９】 従って、実施例は、化合物活性が、β_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰ融合
タンパク質を発現する細胞の蛍光特性における変化を生じるβ_２−アドレナリン
レセプタで、アゴニスト、中性アンタゴニストまたは逆アゴニスト活性のいずれ
かを示す化合物についての新規スクリーニングシステムを開示する。蛍光特性に
おける変化は、共焦点顕微鏡を使用した細胞の局在化における変化によるか、ま
たは９６−プレース蛍光光度計で測定されるとおり総細胞蛍光における変化によ
り測定され得た。検出系として共焦点顕微鏡検査を用いて、アゴニストリガンド
は、ＣＡＭ ＧＰＣＲ／ＧＦＰ融合タンパク質の細胞表面蛍光における増加を引
き起こす一方で、アンタゴニスト／逆アゴニストリガンドは、ＷＴ ＧＰＣＲ／
ＧＦＰ融合タンパク質の内部移行における増加を引き起こす。検出系逆アゴニス
トまたはアンタゴニストリガンドとしてマイクロプレート蛍光定量法を使用する
ことで、ＣＡＭ ＧＰＣＲ／ＧＦＰ融合タンパク質を発現する細胞中の総細胞蛍
光における増加を引き起こす一方で、アゴニストリガンドは、ＷＴ ＧＰＣＲ／
ＧＦＰ融合タンパク質を発現する細胞中の総細胞蛍光における減少を引き起こす
。

【００７０】 材料および方法ＩＩ ＧＦＰタグ付形態の３ＣＡＭα_１Ｂ−アドレナリンレセプタの構築 Ｃ末端でＧＦＰタグ付形態の野生型および３ＣＡＭ（Ｒ２８８Ｋ、Ｋ２９０Ｈ
、Ａ２９３Ｌ）形態のハムスターα_１Ｂ−アドレナリンレセプタを産生およびサ
ブクローニングすることが、２つの別々の段階で行われた。第１の段階で、修飾
形態のＧＦＰのコーディング配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によ
って修飾させた。アミノ末端プライマー５’−ＧＧＡＡＧＧＴＡＣＣＡＧＴＡＡ
ＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴ−３を用いて、ＧＦＰの開始Ｍｅｔを除去し、そし
てＫｐｎＩ制限部位（下線付き）および２−アミノスペーサー（Ｇｌｙ−Ａｓｎ
）の両方を導入した。カルボキシル末端プライマー５−ＴＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴ
ＡＴＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＧ−３’を使用して、Ｘｂ
ａ Ｉ制限部位（下線付き）を、ＧＦＰの停止コドンの下流に導入した。Ｋｐｎ
ＩおよびＸｂａ Ｉで消化したＧＦＰの増幅断片を、同様に消化したｐｃＤＮＡ
３発現ベクター（インビトロゲン）にサブクローニングした。α_１Ｂ−アドレナ
リンレセプタ−ＧＦＰ融合タンパク質を得るために、各形態のα_１Ｂ−アドレナ
リンレセプタのコーディング配列を、ＰＣＲによって増幅させた。アミノ末端プ
ライマー５’−ＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＣＴＡＡＡＡＴＧＡＡＴＣＣＣＧＡＴ−３
’を使用して、ＫｐｎＩ制限部位（下線付き）を、イニシエータＭｅｔの上流に
導入した。カルボキシ末端プライマー５’−ＧＴＣＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧ
ＴＧＣＣＣＧＧＧＴＧ−３’を用いて、ＫｐｎＩ制限部位（下線付き）を、停止
コドンのすぐ上流に導入した。最終的に、ｐｃＤＮＡ３でのＧＦＰ構築物を、Ｋ
ｐｎＩで消化させ、そしてＫｐｎＩでも消化したα_１Ｂ−アドレナリンレセプタ
増幅のＰＣＲ産物と一緒に連結した。そのように産生された開放読取フレームは
、野生型または３ＣＡＭα_１Ｂ−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰのいずれかのコ
ーディング配列を表す。各々は、その発現および分析の前に十分に配列決定され
た。

【００７１】 ＨＥＫ２９３細胞の一過性および安定な形質移入 材料および方法Ｉで先に記載されたとおりである。

【００７２】 膜の作製 各々のα_１Ｂ−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰ融合タンパク質を安定に発現す
るＨＥＫ２９３細胞は、６ｃｍ皿で密集して育成された。収穫の前に、細胞を、
２回、４ｍｌの氷冷ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
７．５）で洗浄し、その後、１ｍｌの同じ緩衝液中に擦り落とした。細胞の破裂
は、氷上で２５ストロークの手動支持ガラス製Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーで達
成された。懸濁液を、１５分間、１６０００×ｇで遠心分離し、そして生じたペ
レットを、０．０３５−０．１６ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度まで氷冷ＴＥ
緩衝液に再懸濁させた。

【００７３】 ［^３Ｈ］プラゾシン結合実験 ０．７−３．２μｇの膜タンパク質を、［^３Ｈ］プラゾシン（２ｎＭ）を含有
するアッセイ緩衝液（７５ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２（緩衝液Ａ））に添加することによって、結合実
験を開始させた。非特異的結合は、１０μＭフェントラミンの存在下で測定した
。反応液を、３０分間、３０℃でインキュベートし、そして結合リガンドを、Ｇ
Ｆ／Ｂフィルタを通して真空濾過により遊離リガンドから分離した。フィルタを
、２回、緩衝液Ａで洗浄し、そして結合リガンドを、液体シンチレーション分光
分析によって概算した。特異的結合が示された。

【００７４】 共焦点レーザー走査顕微鏡検査 材料および方法Ｉで先に記載されるとおりである。

【００７５】 実施例３−持続的アンタゴニスト／逆アゴニスト誘発による野生型でなく３Ｃ
ＡＭのハムスターα_１ｂ−アドレナリンレセプタのアップレギュレーション 野生型および３ＣＡＭの両方の形態のハムスターα_１ｂ−アドレナリンレセプ
タでフレーム内に連結されたＧＦＰタンパク質をコードする構築物を、上のとお
り作成した（材料および方法ＩＩ）。

【００７６】 種々の形態（Ｒ２８８Ｋ、Ｋ２９０Ｈ、Ａ２９３Ｌ）の構造的に活性な突然変
異体（ＣＡＭ）α_１ｂ−アドレナリンレセプタを生じる野生型α_１ｂ−アドレナ
リンレセプタ一次アミノ酸配列中の突然変異のいっそう詳細な説明は、図９に示
される。このような構築物を使用して、ＨＥＫ２９３細胞を形質移入させ、続い
て前（材料および方法Ｉ−ＨＥＫ２９３細胞の一過性で、そして安定な形質移入
）のとおり３ＣＡＭまたは野生型α_１ｂ−アドレナリンレセプタのいずれかを発
現する形質移入細胞の選択した。このような細胞を、［^３Ｈ］リガンド結合研究
に使用して、レセプタ発現のレベルを評価した。α_１ｂ−アドレナリンレセプタ
逆アゴニスト／アンタゴニストの範囲で３ＣＡＭα_１ｂ−アドレナリンレセプタ
／ＧＦＰ融合構築物を発現する細胞の処理での蛍光のアップレギュレーションが
、観察された（図１０Ａ（ｂ）−（ｄ））。しかし、上の３ＣＡＭについてのも
のと同じリガンドを有する野生型α_１ｂ−アドレナリンレセプタ／ＧＦＰ融合構
築物を発現する細胞の処理は、蛍光強度および分布パターンが、ビヒクル処理の
み（図１０Ｂ（ａ））と比較して薬剤処理によってほとんど修飾されない（図１
０Ｂ（ｂ）−（ｄ））場合、構築物のあらゆる明らかなアップレギュレーション
を生じることに失敗した。

【００７７】 α_１ｂ−アドレナリンレセプタアンタゴニストプラゾシンを用いた３ＣＡＭお
よび野生型α_１ｂ−アドレナリンレセプタの両方における等価の研究は、図１０
Ｃに示される。プラゾシン（ＰＴ）は、野生型α_１ｂ−アドレナリンレセプタに
おける影響をなんら示さないのに対して、それは、突然変異体３ＣＡＭ形態のア
ップレギュレーションの効果を示すことが分かり得た。

【００７８】 実施例４−ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＡＭα_１ｂ−アドレナリンレセプタ／
ＧＦＰ融合タンパク質のリガンドアップレギュレーション 方法 野生型α_１ｂ−アドレナリンレセプタ／ＧＦＰ構築物または構造的に活性な突
然変異体（ＣＡＭ）α_１ｂ−アドレナリンレセプタ／ＧＦＰ融合タンパク質を安
定に発現するＨＥＫ２９３細胞を、材料および方法ＩＩで先に記載されるとおり
産生させた。これらのセルラインを使用して、ＣＡＭα_１ｂ−アドレナリンレセ
プタ／ＧＦＰ融合タンパク質のリガンドアップレギュレーションを調査した。プ
レート基本の蛍光光度計での総細胞の蛍光における増加によって、融合タンパク
質アップレギュレーションを測定した。

【００７９】 細胞を、３７℃で、５％ＣＯ_２および９５％湿度で、１０％ｖ／ｖ胎児仔ウシ
血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１ｍｇ／ｍｌジェネチシン（育
成用培地；全ての試薬は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た）を補
足したダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）に維持させた。実験のために
、細胞を、アッセイの前の日に、黒色９６ウェル観察プレート（Ｃｏｓｔｅｒ）
に種付けした。アッセイの日に、育成用培地を除去し、そして最終容量１００μ
ｌ中の種々の濃度の試験化合物（フェニレフリン、フェントラミン、ＷＢ４１０
１およびＨＶ７２３）の存在下で、５％ｖ／ｖＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グラタミン
を含有するフェノールレッド不含ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地に交換した。
細胞を、３７℃で、２２時間インキュベートした。インキュベーション後、Ｔｅ
ｃａｎの分光蛍光プラス蛍光光度計を使用して、蛍光を検出した。プレートおよ
び培地自己蛍光を制御するために、薬剤処理した細胞で得られる蛍光値から、空
プレート読取を引くことによって、結果を計算した。

【００８０】 結果 野生型α_１ｂ−アドレナリンレセプタ／ＧＦＰ融合タンパク質またはＣＡＭα _１ｂ −アドレナリンレセプタ／ＧＦＰのいずれかを安定に発現するＨＥＫ２９３
細胞を、多様な化合物で処理して、融合タンパク質発現のリガンド安定化を試験
した。アゴニストフェニレフリンおよびこのレセプタで逆アゴニスト活性を示す
ことが先に示された３種の化合物；ＷＢ４１０１、ＨＶ７２３およびフェントラ
ミンである、４つの化合物を、この実験のために選択した。融合タンパク質発現
のレベルは、プレート蛍光定量法によりＧＦＰ発現における変化を検出すること
によって測定した。試験された全ての化合物は、野生型α_１ｂ−アドレナリンレ
セプタ／ＧＦＰ融合タンパク質の発現レベルになんら影響を示さなかった（図１
１）。しかし、これらの化合物を用いたＣＡＭα_１ｂ−アドレナリンレセプタ／
ＧＦＰ融合タンパク質を発現する細胞の長期処理（２２時間）は、フェニレフリ
ンについては４０７（１５−１０４７１）ｎＭの、ＷＢ４１０１については６７
６（１９５−２３４４）ｎＭの、ＨＶ７２３については４１７（７１−２４５５
）ｎＭの、そしてフェントラミンについては１７０（３２−８９１）ｎＭのＥＣ _５０ 値を示す蛍光の用量依存性アップレギュレーション（図１１）を引き起こし
た。

【００８１】 実施例５−ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＡＭα_１ｂ−アドレナリンレセプタ／
ＧＦＰ融合タンパク質のアップレギュレーションの時間経過 方法 ＣＡＭα_１ｂ−アドレナリンレセプタ／ＧＦＰ融合タンパク質のリガンドアッ
プレギュレーションの時間経過も調査した。この研究で、細胞を種付けし、そし
て空プレートでの蛍光以外は先に記載されるとおり薬剤で処理し、そして細胞プ
レートを、薬剤添加の後の２−３１時間の間の種々の時点で読み取った。

【００８２】 結果 試験された全ての化合物について、時間に対して蛍光における徐々の増加があ
った。全ての時点で、この用量に関連した効果についてのＥＣ_５０は、変化しな
かった（図１２）。その応答の規模は、化合物を用いた約２３時間のインキュベ
ーション後極大に達した。この時の後、応答は、比較的一定したままであった。

【００８３】 材料および方法ＩＩＩ β_２−アドレナリン作動性レセプタ／ルシフェラーゼ融合タンパク質の構築 β_２−ＡＲ／ＲＬｕｃおよびβ_２−ＡＲ／ＲＬｕｃ（ＣＡＭ）の両方を、以下
のとおり生成させた。β_２−ＡＲ断片は、ｐｃＤＮＡ３にクローン化された存在
するβ_２−ＡＲ遺伝子のＰＣＲ増幅を介して生成され、β_２−ＡＲ（ＣＡＭ）断
片の生成も、ｐｃＤＮＡ３プラスミドベクターにクローン化されたβ_２−ＡＲの
突然変異バージョンのＰＣＲ増幅を介してなされた。突然変異は、７個の膜貫通
ドメインレセプタの細胞内ループ３中の４個のアミノ酸置換から構成される。β _２ −ＡＲの２種のバージョンの間に唯一の差異があったので、ＰＣＲ手段のため
に生成されたプライマーは、β_２−ＡＲおよびそのＣＡＭ等価物の両方を発生す
るために使用され得た。プライマーは、以下のとおりであった：５’ＨＩＮＤＩ
ＩＩクローニング部位およびコザック配列の両方を組込む５’末端順向プライマ
ー５’−ＡＡＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＧＧ ＣＡＡ
ＣＣＣ ＧＧＧ ＡＡ−３’。３’末端可逆プライマーは、ＸｈｏＩクローニン
グ部位を組込んで、レニラルシフェラーゼ遺伝子に連結することを可能にする配
列５’−ＣＣＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＡＧ ＴＧＡ ＧＴＣ ＡＴＴ−３’を有
する。ＸｈｏＩ部位を導入することで、β_２−ＡＲ遺伝子およびレニラルシフェ
ラーゼの間でグルタメート残渣の挿入を生じる。β_２−ＡＲのアミノ酸コーディ
ング配列における最後のヌクレオチド（Ｇ−−−＞Ｃ）を交代することも生じる
が、これは、新たなコドンＣＴＣが、なおロイシン残渣をコードするので、アミ
ノ酸配列を交代しなかった。

【００８４】 レニラルシフェラーゼは、ｐＲＬＣＭＶ（ｐｒｏｍｅｇａから得た）と称され
るプラスミドベクターにクローン化されたレニラルシフェラーゼ遺伝子のＰＣＲ
増幅を介して同様に生成された。増幅のために使用されたプライマーは、以下の
とおりであった：その遺伝子の５’末端にＸｈｏＩ部位を組込んで、β_２−ＡＲ
またはβ_２−ＡＲ（ＣＡＭ）断片のいずれかに連結することを可能にする５’末
端順向プライマー５’−ＴＣＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＣＴ ＴＣＧ ＡＡＡ Ｇ
ＴＴ ＴＡＴ Ｇ−３’。逆プライマーは、停止コドンのすぐ下流で遺伝子の３
’末端に両方のＸｂａｌ部位を組込む以下の配列５’−ＧＣＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＴＡ ＴＴＧ ＴＴＣ ＡＴＴ ＴＴ−３’を有した。

【００８５】 一旦ＰＣＲ反応が行われると、結果物である断片を、適切な酵素で消化させ、
順次ゲルを精製し、ｐｃＤＮＡ３プラスミドベクターも、ＨｉｎｄＩＩＩおよび
Ｘｂａ Ｉで消化させて、連結断片についての受容体ベクターを提供した。消化
ｐｃＤＮＡ３、β_２−ＡＲ（またはβ_２−ＡＲ（ＣＡＭ））断片およびレニラル
シフェラーゼ断片を混合し、そして一緒に連結された市販のＤＮＡ連結キット（
ＣＡＭＢＩＯ）から得たファースト−リンクＤＮＡライゲーションキット）を用
いて、連結を行った。これは、順次行われ、それによりＰＣＲ断片を最初に連結
させ、そしてその後、消化ベクターを添加して、所望の構築物を得て、そしてそ
れは、図１３に図形で表される。

【００８６】 （ＣＡＭ）β_２−ＡＲ／Ｒｌｕｃの薬剤指向性アップレギュレーションを測定
するためのプロトコル （生物発光アッセイ） 海パンジーＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍから得たルシフェラーゼに連結
させた構造的に活性な（ＣＡＭ）β_２−アドレナリンレセプタを発現するＨＥＫ
２９３細胞の安定に形質移入されたセルラインを、９６穴マイクロタイタープレ
ートに種付けするために使用した。その後、９６ウェルプレートを、一晩中イン
キュベートし、そして続く日に、細胞は、約８０％集密であった。その後、薬剤
希釈物を作成した：イソプレナリン、ベタキソロール、ソタロールおよびＩＣＩ
１１８５５１は、全て、実験の日に新たに秤量されたのに対して、プロプラナロ
ール、サルメテロールおよびサルブタモールは、１０ｅ−２の予め秤量した保存
液（ＤＭＳＯに溶解した）を使用して作製された。その後、１０点曲線のための
保存溶液は、使用される薬剤の型によって頂上濃度点として１０ｅ−２または１
０ｅ−３のいずれかを使用して作製されたが、そのような希釈のものは、フェノ
ールレッド不含培地で行われた。

【００８７】 その後、１０点保存溶液の各々から得た１０ｕｌを、薬剤を１０の内１に希釈
する９６ウェルプレートのウェルに添加し、その結果薬剤の最高の最終濃度が、
使用される型によって１０ｅ−３または１０ｅ−４のいずれかであった。その後
、培地を、各ウェルからピペット採取した時の後、２４時間、これらのプレート
をインキュベートした。

【００８８】 その後、５０ｕｌのフェノールレッド不含培地を、５０ｕｌのｌｕｃ−ｌｉｔ
ｅ溶液（レニラルシフェラーゼ活性について最適化され、そして穏やかな細胞溶
解の成分をも含有する市販のキット試薬）を加えた各ウェルに添加した。最終的
に、フェニルレッド不含培地中の１５ｕＮセレンテラジンの５０ｕｌを添加した
（それで５ｕＭの最終濃度を得た）。その後、プレートを、頂上計測閾値計上で
直ぐに分析して、相対的光単位で光強度を測定した。

【００８９】 実施例６−海パンジーレニラフェニフォルミスから得られるルシフェラーゼに
連結した構造的に活性な突然変異体形態のβ_２−アドレナリンレセプタの細胞の
レベルでのリガンド誘導制御の分析 Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍのルシフェラーゼタンパク質に連結した突
然変異体（ＣＡＭ）形態のβ_２−アドレナリンレセプタ（β_２−ＡＲ）の構築物
を、先に記載（材料および方法ＩＩＩ；図１３）されるとおり構築した。このよ
うな構築物は、別の用途のために選択された所望のタンパク質を発現する形質移
入細胞と、ＨＥＫ２９３細胞を形質移入するために使用された。選択細胞を、上
に記載されるとおり種々のリガンドで処理した（材料および方法ＩＩＩ−（ＣＡ
Ｍ）β_２−アドレナリン作動性レセプタ／Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍの
ルシフェラーゼ融合構築物の薬剤指向性アップレギュレーションのためのプロト
コル）。図１４は、このレセプタに結合するリガンドで処理した細胞でのＣＡＭ
β_２−アドレナリンレセプタのアップレギュレーションの模式図を示す。図１５
は、リガンドを用いたＣＡＭβ_２−アドレナリンレセプタ／Ｒｅｎｉｌｌａ ｒ
ｅｎｉｆｏｒｍのルシフェラーゼ融合構築物を発現する細胞の処理で得られる結
果を示す。リガンドであるイソプレナリン、ベタキソロールおよびソタロールが
、濃度依存性手段でＣＡＭ−β_２−アドレナリンレセプタの発現をアップレギュ
レーションすることが分かり得た。

【００９０】 材料および方法ＩＶ ＧＦＰに融合した突然変異ＰＡＲ１レセプタの構築 融合タンパク質は、ヒトＰＡＲ１（プロテアーゼ活性化レセプタ１）の突然変
異体およびＧＦＰの間で生成された。ＰＡＲ１レセプタ内部移行は、２つの機構
を通して起こる。レセプタは、構造的に内部移行し、そしてリガンドの不在下で
細胞膜に再利用される。トロンビン開裂、およびレセプタ活性化に続いて、レセ
プタを、内部移行し、そしてリソソームの分解について標的にする（Ｓｈａｐｉ
ｒｏ、ＭＪおよびＣｏｕｇｈｌｉｎ，ＳＲ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７３
、２９００９−２９０１４、１９９８）。この研究に使用される突然変異体ＰＡ
Ｒ１レセプタは、構造的レセプタ内部移行を無効にし、そして膜に再利用させる
レセプタの細胞内のＣ末端尾部内に特異的突然変異を含む。この突然変異は、野
生型レセプタ中のアミノ酸残渣３９７−４０６を、配列ＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌ
ｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＧｌｙＡｌａ（ＳｈａｐｉｒｏおよびＣｏｕｇｈｌ
ｉｎ、１９９８）に置換する。従って、トロンビン開裂に続いて、突然変異体Ｐ
ＡＲ１／ＧＦＰ融合タンパク質は、細胞蛍光での減少を引き起こすリソソームに
標的にされる。

【００９１】 ヒトＰＡＲ１レセプタは、Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ６２４２４に対応して先にクロ
ーン化された（Ｖｕ，Ｔ．ら、（１９９１）Ｃｅｌｌ、６４、１０５７−１０６
８）。ＰＡＲ１／ＧＦＰ融合の構築での第１段階として、センスプライマーＮＢ
１００、およびＢａｍＨＩ制限部位（表１；下線付き）を含むアンチセンスプラ
イマーＮＢ１０１を用いて、レセプタをＰＣＲ増幅させた。ＰＣＲの間に、停止
コドンを除去し、そしてＢａｍＨＩ部位は、ＰＡＲ１開放読取フレームの３’末
端で導入される。ＰＣＲ産物を、製造業者の指示（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）に従っ
てｐＣＲ平滑部に連結させて、ｐＣＲ／ＰＡＲ１−ＢａｍＨＩおよびその認証さ
れた配列を発生させた。制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ１およびＢａｍＨＩを
用いて、このプラスミドを消化させて、その後同様に消化したｐＥＧＦＰ−Ｎ１
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に連結されてＷＴＰＡＲ１／ＧＦＰ融合タンパク質を発生
するレセプタ配列を放出させた（プラスミド消化ｐＰＡＲ１／ＧＦＰ）。

【００９２】 ＰＡＲ１レセプタのアミノ酸残渣３９７から４０６までを、配列ＡｌａＧｌｙ
ＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＧｌｙＡｌａに置換するために、ＰＣＲ
テンプレートとしてｐＣＲ／ＰＡＲ１−ＢａｍＨＩ中のＷＴ ＰＡＲ１レセプタ
を用いて、２つのＰＣＲ反応を行った。後半のクローニング工程で使用されるＰ
ｓｔＩ制限部位に５’ですぐにヒトＰＡＲ１開放読取フレームのヌクレオチド残
渣５０４−５２６に対応するセンスプライマーＮＢ１０２（表１）、およびアミ
ノ酸ＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙ（表１で太字）をコードする１３個のヌクレオチ
ド尾部を含有するヌクレオチド１１６７から１１８７までに対応するアンチセン
スプライマーＮＢ１０３を、第１のＰＣＲに使用した。第２のＰＣＲは、アミノ
酸ＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＧｌｙＡｌａ（表１で太字）をコードする追加の１
７個のヌクレオチド３’尾部を含むヒトＰＡＲ１開放読取フレームのヌクレオチ
ド残渣１２１７−１２４１に対応するセンスＰＣＲプライマーＮＢ１０４（表１
）およびアンチセンスプライマーＮＢ１０５を使用した。ＰＣＲの前に、プライ
マーＮＢ１０３および１０４は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて３’リ
ン酸化された。ＰＣＲ増幅に続いて、２つのＰＣＲ産物を、一緒に連結させた。
ライゲーションの結果として生じたＤＮＡ断片を、プライマーＮＢ１０２および
ＮＢ１０１を用いたさらなるＰＣＲ反応でテンプレートとして使用して、前と同
様にＰＡＲ１開放読取フレームの３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入した。ＰＣＲ
産物を、ｐＣＲ平滑部（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングさせた。この断
片を、突然変異が、成功裏に導入されたことを確かめるために配列決定した。

【００９３】 突然変異断片を、制限酵素ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩでの消化に続いてｐＣＲ
／平滑部から切除し、そして同様に消化したｐＰＡＲ１／ＧＦＰにサブクローニ
ングさせて、ｐＰＡＲ１／ｍｕｔ／ＧＦＰを発生させた。その後、ＰＡＲ１ｍｕ
ｔＧＦＰを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを用いた消化に続きｐＰＡＲ１
／ｍｕｔ／ＧＦＰから切除し、そして安定な哺乳類発現のために同様に消化した
ｐＣＩＮにサブクローニングした（Ｒｅｅｓ，Ｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ ２０、１０２−１１０；１９９６）。

【００９４】 安定なセルライン構築 ＣＨＯ（チャイニーズハムスターの卵巣）細胞を、製造業者の指示に従ってリ
ポフェクタミン試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたｐＣＩＮ
／ＰＡＲ１ｍｕｔ／ＧＦＰで形質移入させた。形質移入細胞を、５％ｖ／ｖＦＣ
Ｓ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１ｍｇ／ｍｌのジェネチシン（全ての試薬は
、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得られた）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ
１２（１：１）培地中で選択した。２週後に、細胞を、希釈クローン化させて、
単独のクローナル単離物を同定した。クローナル単離物を、継代越えて拡張させ
、そして蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）により蛍光強度を試験することによ
って、ＰＡＲ１／ＧＦＰ融合タンパク質を発現するクローンを、同定した。

【００９５】 ＰＡＲ１ｍｕｔ／ＧＦＰ融合タンパク質のアゴニスト指向性内部移行の共焦点
画像 細胞を、細胞外培地（１２５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ
ＣａＣｌ_２、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、５ｍＭ Ｎａ
ＨＣＯ_３、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭグルコース、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ
７．４）中で２４ｍｍカバースリップ上で育成した。カバースリップを、Ｌｅｃ
ｉａのＴＣＳ ＮＴレーザー走査共焦点顕微鏡（Ｌｅｃｉａ ＵＫ Ｌｔｄ）の
画像チャンバーに載せた。細胞を、６３×ＮＡ１．２Ｐｌａｎ Ａｐｏ水浸対物
レンズで観察した。４８８ｎｍアルゴン／クリプトンレーザーを用いてＧＦＰを
切除し、蛍光発光を、５２５＋／−２５バンド通過フィルタで検出した。画像は
、ＰＡＲ１アゴニストリガンドＴＲＡＰ（１０μＭ）の添加の前、および４０分
後に記録された。Ｌｅｃｉａ ＮＴ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、画像を操作し
た。

【００９６】 プレート蛍光光度計で検出されたＰＡＲ１ｍｕｔ／ＧＦＰ融合タンパク質のア
ゴニスト指向性ダウンレギュレーション 実験の前の日に、細胞を、黒色９６ウェル観察プレート（コスター）に種付け
した。育成培地を、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、およびＴＲＡＰ（１０μＭ−１ｎ
Ｍ）またはトロンビン（１−０．０００１単位／ｍｌ）のいずれかを含むフェノ
ールレッド不含ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地に交換した。培地は、任意の培
地関連自己蛍光を吸収する０．５ｍＭブリリアントブラック染料をも含有する。
細胞を、４時間、３７℃で化合物でインキュベートし、そして蛍光を、Ｔｅｃａ
ｎ分光蛍光プラス蛍光光度計で検出させた。プレートおよび培地について制御す
るために、薬剤処理細胞で得られた蛍光値から空プレート読取を引くことによっ
て、自己蛍光の結果を計算した。

【００９７】 実施例７−ＧＦＰに融合した突然変異ＰＡＲ１レセプタの構築、およびそれの
細胞の局在化におけるＰＡＲ１アゴニストリガンドの効果 結果 ＰＡＲ１／ｍｕｔ／ＧＦＰ融合タンパク質を発現するために安定に形質移入さ
れたＨＥＫ２９３細胞で、ＧＦＰ蛍光は、細胞膜に主に局在化させる（図１６）
。ある程度の細胞内の発現も見られ、そしてそれは、小胞体およびゴルジ体を通
したタンパク質合成および交換を表し得た。細胞へのＴＲＡＰ添加の後、融合タ
ンパク質は、細胞膜から細胞内領域にゆっくりと移動する。全てではない蛍光を
内部移行させ、そして小さな比率のみが分解される。

【００９８】 実施例８−ＰＡＲ１ｍｕｔ／ＧＦＰ融合タンパク質のアゴニストダウンレギュ
レーション 結果 ４時間のインキュベーションの後にプレート蛍光光度計によって測定した場合
、ＴＲＡＰおよびトロンビンの両方が、ＰＡＲ１ｍｕｔ／ＧＦＰ構築物の小さな
ダウンレギュレーションを引き起こした（図１７）。ＴＲＡＰは、蛍光、従って
発現における約２０％損失の極大に達した蛍光における用量に関連した減少を引
き起こした。トロンビンの効果は、いっそう少なく、それにより約５％の極大減
少のみが引き起こされた。

【００９９】

【表１】

【０１００】 参照

【表２】

【表３】

【表４】

【図面の簡単な説明】

【図１】 イソプレナリンに対応したＷＴβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰの原形質
膜の位置および内部移行を示す。

【図２】 アルプレノロールの添加に続く原形質膜へのＷＴβ_２−アドレナリンレセプタ
−ＧＦＰの再利用を示す。

【図３】 ＣＡＭβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰの発現およびベタキソロールによ
るアップレギュレーションを示す。

【図４】 他のβ_２−アドレナリンレセプタリガンドによるＣＡＭβ_２−アドレナリンレ
セプタ−ＧＦＰのアップレギュレーションを示す。

【図５】 ベタキソロールにより、ＷＴβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰでないＣＡ
Ｍβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰのアップレギュレーションを示す。

【図６】 イソプレナリンによる、アップレギュレーションされたＣＡＭβ_２−アドレナ
リンレセプタ−ＧＦＰの内部移行を示す。

【図７ａ】 マイクロタイタープレート蛍光定量法によって測定されるＣＡＭβ_２−アドレ
ナリンレセプタ−ＧＦＰ中の蛍光のレベルにおける種々の逆アゴニスト／アンタ
ゴニストの効果を示す。

【図７ｂ】 マイクロタイタープレート蛍光定量法によって測定されたベタキソロールによ
るＣＡＭβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰのアップレギュレーションの濃度
依存性を示す。

【図７ｃ】 マイクロタイタープレート蛍光定量法によって測定された、イソプレナリンに
よるβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰのダウンレギュレーションの濃度依存
性を示す。

【図８】 アルプレノロールによる、ＣＡＭβ_２−アドレナリンレセプタ−ＧＦＰのもの
によるアップレギュレーションの濃度依存性を示す。

【図９】 α_１ｂ−アドレナリンレセプタに対するホスホイノシチダーゼＣ活性の構造的
活性化を吹き込む突然変異の位置である。

【図１０】 持続的アンタゴニスト／逆アゴニスト誘発による、野生型ではなく３ＣＡＭの
ハムスターのα_１ｂ−アドレナリンレセプタのアップレギュレーションである。

【図１１】 ＨＥＫ２９３細胞での安定な発現に続くＷＴおよびＣＡＭα_１ｂ−アドレナリ
ンレセプタ／ＧＦＰ融合タンパク質のアップレギュレーションである。

【図１２】 ＮＥＫ２９３細胞でのＣＡＭα_１ｂ−アドレナリンレセプタ／ＧＦＰのアップ
レギュレーションの時間経過である。

【図１３】 β_２−アドレナリン作動性レセプタ／ルシフェラーゼ融合タンパク質構築物の
概略図である。

【図１４】 このレセプタでアンタゴニストを同定するＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍ
のルシフェラーゼに連結した構造的に活性なβ_２−アドレナリンレセプタの構築
および概念的用途である。

【図１５】 Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍのルシフェラーゼに連結した構造的に活性
なβ_２−アドレナリンレセプタのレベルにおける濃度依存性の増加である。

【図１６】 安定に形質移入されて、ＰＡＲ１ｍｕｔ／ＧＦＰ融合タンパク質を発現するＨ
ＥＫ２９３細胞のレーザー走査共焦点画像である。

【図１７】 ＨＥＫ２９３細胞での安定な発現に続くＰＡＲ１ｍｕｔ／ＧＦＰ融合タンパク
質のアゴニストダウンレギュレーションである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/34 Ｃ１２Ｑ 1/34 1/42 1/42 1/66 1/66 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｚ 33/68 33/68 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 リース、 エドワード スティーヴン イギリス国 エイエル８ ６アールユー ハーツ ウエルウィン ガーデン シティ ヤングス ライズ 30 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 DA20 DA36 FA16 FA19 FB02 FB07 FB11 FB12 HA16 4B024 AA11 BA63 CA04 CA07 DA03 FA10 GA11 4B063 QA01 QA06 QA18 QQ08 QQ13 QQ20 QQ22 QQ33 QQ79 QQ91 QR80 QS36 QS38 QS39 QX02 4H045 AA10 AA30 BA10 BA41 BA70 CA40 CA50 DA50 DA89 EA50 FA72 FA74

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）膜レセプタ／レポータ融合タンパク質を含む細胞に、化
   合物を添加する工程；および ｂ）上記レセプタ／レポータ融合タンパク質のあらゆる変化を検出する工程 を含む、化合物が膜レセプタ／レポータ融合タンパク質に示す効果を検出するた
   めのアッセイ。
2. 【請求項２】 前記アッセイが、膜レセプタでのそれらの効果について化合
   物をスクリーニングするために使用される、請求項１に記載のアッセイ。
3. 【請求項３】 野生型および／または突然変異体膜レセプタの活性を調節す
   る化合物をスクリーニングするための請求項２に記載のアッセイ。
4. 【請求項４】 前記膜レセプタが野生型レセプタであり、そしてあらゆる変
   化が、レセプタ／レポータ融合タンパク質の活性における減少として検出される
   、請求項３に記載のアッセイ。
5. 【請求項５】 前記膜レポータが、構造的に活性な突然異性体レセプタであ
   り、そしてあらゆる変化が、レセプタ／レポータ融合タンパク質の活性における
   増加として検出される、請求項３に記載のアッセイ。
6. 【請求項６】 前記アッセイが、正常な膜レセプタ相互作用を混乱させる化
   合物を同定するために使用されるか、またはそれら自体で、このような相互作用
   を混乱させ得る上記いずれかの請求項に記載のアッセイ。
7. 【請求項７】 前記膜レセプタの逆アゴニスト、アンタゴニストまたはアゴ
   ニストとして働く化合物を検出するための上記いずれかの請求項に記載のアッセ
   イ。
8. 【請求項８】 前記膜レセプタの逆アゴニスト、アンタゴニストまたはアゴ
   ニストが、レセプタ機能の研究または治療で使用される、請求項７に記載のアッ
   セイ。
9. 【請求項９】 前記膜レセプタが、成長因子レセプタ、サイトカインレセプ
   タ、イオンチャネル、インテグリン、またはＧ−タンパク質レセプタである上記
   いずれかの請求項に記載のアッセイ。
10. 【請求項１０】 前記膜レセプタが、野生型レセプタのサブタイプ、突然変
    異体、相同体、またはキメラ形態である請求項９に記載のアッセイ。
11. 【請求項１１】 前記突然変異体が、構造的に活性な突然変異体である請求
    項１０に記載のアッセイ。
12. 【請求項１２】 構造的に活性な突然変異体レセプタ／レポータ融合タンパ
    ク質は、レポータ活性が基本線のレベルで検出されるように当初は不安定であり
    、そしてレセプタ／レポータ融合タンパク質への化合物の結合後に安定化され、
    かつレポータ活性における増加が観察される請求項１１に記載のアッセイ。
13. 【請求項１３】 前記Ｇ−タンパク質結合レセプタが、ドーパミンレセプタ
    、ムスカリン性コリン作動性レセプタ、α−アドレナリン性レセプタ、β−アド
    レナリン性レセプタ、アヘン剤レセプタ、カンナビノイドレセプタ、セロトニン
    レセプタまたはプロテアーゼ活性化レセプタである、請求項９から１２のいずれ
    か１項に記載のアッセイ。
14. 【請求項１４】 前記レセプタ／レポータ融合タンパク質が、前記膜レセプ
    タをコードする遺伝子の５’または３’末端にフレーム内で融合される前記レポ
    ータタンパク質をコードする遺伝子を含む核酸構築物から発現される上記いずれ
    かの請求項に記載のアッセイ。
15. 【請求項１５】 前記膜レセプタ／レポータ融合タンパク質の官能性が、レ
    セプタへのレポータタンパク質の融合によって実質的に影響されない上記いずれ
    かの請求項に記載のアッセイ。
16. 【請求項１６】 前記レポータタンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ
    ）、またはその活性変異体である上記いずれかの請求項に記載のアッセイ。
17. 【請求項１７】 前記ＧＦＰタンパク質によって放出される光が、蛍光光度
    計、ＦＡＣＳまたは顕微鏡技術によって検出される請求項１６に記載のアッセイ
    。
18. 【請求項１８】 前記レポータタンパク質が、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆ
    ｏｒｍｉｓ（海パンジー）ルシフェラーゼタンパク質、分泌胎盤アルカリ性ホス
    ファターゼ（ＳＥＡＰ）、β−ラクタマーゼ、ガラクトシダーゼ、ホタル（Ｐｈ
    ｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ、青色蛍光タンパク質、黄色蛍
    光タンパク質、シアン蛍光タンパク質である、請求項１から１５のいずれか１項
    に記載のアッセイ。
19. 【請求項１９】 前記レポータタンパク質は、マイクロプレート閾値計中で
    、またはＣＣＤ画像システムを使用して検出されるルシフェラーゼである、請求
    項１８に記載のアッセイ。
20. 【請求項２０】 前記レポータタンパク質が、膜レセプタを局在化および／
    または定量化するために使用される上記いずれかの請求項に記載のアッセイ。
21. 【請求項２１】 前記膜レセプタ／レポータ融合タンパク質のあらゆる変化
    が、レセプタ／レポータ融合タンパク質の細胞の局在化における変化として、ま
    たは前記レセプタ／レポータ融合タンパク質の合成または分解によって半定量的
    に検出される上記いずれかの請求項に記載のアッセイ。
22. 【請求項２２】 前記膜レセプタ／レポータ融合タンパク質のあらゆる変化
    の検出が、顕微鏡スライド等の表面に載せられた細胞で行われる上記いずれかの
    請求項に記載のアッセイ。
23. 【請求項２３】 前記膜レセプタ／レポータ融合タンパク質のあらゆる変化
    の検出が、９６ウェルプレート等のマイクロタイタープレートのウェル等に載せ
    られた細胞上で行われる上記いずれかの請求項に記載のアッセイ。
24. 【請求項２４】 ａ）細胞中の膜レセプタ／レポータ融合タンパク質を発現
    する工程； ｂ）レポータ活性の基礎レベルを検出する工程； ｃ）試験化合物を細胞に添加する工程；および ｄ）レポータタンパク質の生じた活性を検出する工程を含み、基礎レベルに関
    するレポータ活性の交代が膜複合体での効果を示す試験化合物による、膜レセプ
    タにおける効果を示す化合物を検出するアッセイ。
25. 【請求項２５】 前記膜レセプタが、野生型レポータであり、そして交代が
    レポータ活性における減少である、請求項２４に記載のアッセイ。
26. 【請求項２６】 前記膜レセプタが、構造的に活性な突然変異体レセプタで
    あり、そして交代はレポータ活性における増加である、請求項２４に記載のアッ
    セイ。
27. 【請求項２７】 Ｃ末端でフレーム内に加えられたレポータを有する構造的
    に活性な突然変異体レセプタを含む、膜レセプタ／レポータ融合タンパク質。
28. 【請求項２８】 前記構造的に活性な突然変異体レセプタがＧＰＣＲである
    、請求項２７に記載の膜レセプタ／レポータ融合タンパク質。
29. 【請求項２９】 前記レポータタンパク質が、ＧＦＰまたはルシフェラーゼ
    である、請求項２７または２８のいずれかに記載の膜レセプタ／レポータ融合タ
    ンパク質。
30. 【請求項３０】 請求項１から２６のいずれか１項に記載のアッセイによっ
    て同定される化合物。
31. 【請求項３１】 治療中での請求項１から２６のいずれか１項に記載のアッ
    セイによって同定される化合物の使用。