JP2003516128A - ミトコンドリア成分の相互作用の決定およびこのような相互作用を変更する薬剤を同定するための組成物および方法 - Google Patents

ミトコンドリア成分の相互作用の決定およびこのような相互作用を変更する薬剤を同定するための組成物および方法

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Abstract

(57)【要約】 ミトコンドリア膜透過性変化を変更する薬剤を同定するための組成物および方法を提供する。スクリーニング方法は、一般に、ミトコンドリアアデニンヌクレオチドトランスロケーターとシクロフィリンＤとの間の相互作用を変更する薬剤を同定する。このような薬剤は、例えば、変更されたミトコンドリア機能に関連する種々の状態の処置に使用され得る。１つの局面において、本発明はまた、核酸発現構築物であって、該構築物は、さらなるポリペプチドまたはその改変体に融合されているミトコンドリア透過性変化細孔成分ポリペプチドまたはその改変体をコードするポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドに、発現制御配列が作動可能に連結されている、核酸構築物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、ミトコンドリア膜透過性変化に影響する薬剤を同定するための方法
に一般に関する。より具体的に、本発明は、ミトコンドリアアデニンヌクレオチ
ドトランスロケーターとシクロフィリンＤとの間の相互作用を変更する薬剤を同
定する際に有用な組成物およびスクリーニング方法に関する。
【０００２】 （発明の背景） ミトコンドリアは、高等生物の細胞における主要なエネルギー源であり、そし
て細胞呼吸プロセス、酸化的プロセスおよび代謝プロセスの広範な集団の直接的
および間接的生化学的調節を提供する。このようなプロセスは、電子輸送鎖（Ｅ
ＴＣ）活性を含み、これは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の形態の代謝エネル
ギーを生成するための酸化的リン酸化を駆動し、そしてまた、細胞内カルシウム
ホメオスタシスにおけるミトコンドリアの中心的な役割を強調する。
【０００３】 ミトコンドリアの超構造的特徴は、オルガネラと細胞質ゾルとの間の界面とし
て機能する外部ミトコンドリア膜、複数の部位で外部膜への付着を形成するよう
である高度に折り畳まれた内部ミトコンドリア膜、および２つのミトコンドリア
膜の間の膜間空間の存在を明らかにする。内部ミトコンドリア膜内のサブコンパ
ートメントは、一般に糸粒体基質といわれる。（総説について、例えば、Ｅｒｎ
ｓｔｅｒら、１９８１、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９１：２２７を参照のこと）
。内部ミトコンドリア膜の包囲物（ｉｎｆｏｌｄｉｎｇ）として生じると本来仮
定される、クリスタは、最近、３次元電子断層撮影法を使用して、ネットワーク
を形成し得、そして開口した円形（３０ｎｍの直径）のジャンクションによって
内部膜に接続され得る管状コンジットを含むと特徴付けられている（Ｐｅｒｋｉ
ｎｓら、１９９７、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ １１９：２６０）。外部膜は、約１０ｋＤａ未満の分子量を有するイオン
性基質および非イオン性基質を自由に透過可能であるが、この内部ミトコンドリ
ア膜は、多くの小分子（特定のカチオンを含む）に対して選択的で調節された透
過性を示し、そして大きい（＞〜１０ｋＤａ）分子に対して不透過性である。
【０００４】 改変または不完全なミトコンドリア活性（ＥＴＣの任意のステップにおける不
全を含むが、これに限定されない）は、「透過性変化」（ＰＴ）または「ミトコ
ンドリア透過性変化」（ＭＰＴ）と呼ばれる局破的ミトコンドリア収縮を生じ得
る。ミトコンドリア機能の一般的に受容された理論に従って、適切なＥＴＣ呼吸
活性は、カップルした化学浸透機構によって内部ミトコンドリア膜における電気
化学的ポテンシャル（ΔΨｍ）の維持を必要とする。変更または不完全なミトコ
ンドリア活性は、この膜ポテンシャルを散逸し、それによってＡＴＰ生合成を防
止し、そして重要な生化学的エネルギー源の生成を停止させる。さらに、シトク
ロムｃのようなミトコンドリアタンパク質は、透過性変化の後に、ミトコンドリ
アからしみだし得、そしてアポトーシスまたはプログラムされた細胞死（ＰＣＤ
）として知られる遺伝的にプログラムされた細胞自殺シーケンスを誘導し得る。
【０００５】 ＥＴＣ活性を媒介する５つのマルチ−サブユニットタンパク質複合体（複合体
Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶ、およびＶ）のうちの４つが、内部ミトコンドリア膜に局在化
し、この内部ミトコンドリア膜は、細胞中の生物学的膜のなかでも最もタンパク
質リッチな膜である（７５重量％）；残りのＥＴＣ複合体（複合体ＩＩ）は、マ
トリックスに位置する。ＥＣＴ内で起こることが知られる少なくとも３つの別個
の化学反応において、正電荷のプロトンは、糸粒体基質から、内部膜を横切って
、膜間空間に移動する。荷電種のこの不均衡は、約２２０ｍＶの電気化学ポテン
シャル（「プロトン移動力」とよばれる）を生成し、このポテンシャルは、しば
しば、表記ΔψまたはΔψｍによって表され、そして内部ミトコンドリア膜を横
切る電気的ポテンシャルおよびｐＨ差の合計を表す（例えば、Ｅｒｎｓｔｅｒら
、１９８１ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９１：２２７ｓおよびそこに引用される
参考文献を参照のこと）。
【０００６】 この膜ポテンシャルは、ＥＴＣ複合体ＶによってＡＴＰを得るために、アデノ
シン二リン酸（ＡＤＰ）がリン酸化される（プロトンのマトリックスへの輸送と
化学量論的に「カップルした」プロセス）場合に生成されるリン酸結合に寄与す
るエネルギーを提供する；Δψｍはまた、細胞質ゾルＣａ2+のミトコンドリアへ
の流入のための駆動力である。通常の代謝条件下で、内部膜は、膜間空間からマ
トリックスへのプロトンの移動に対して非常に非透過性であり、ＥＴＣ複合体Ｖ
を主要な手段として残し、それによって、プロトンがマトリックスに戻り得る。
しかし、内部ミトコンドリア膜の整合性が妥協される（変更されたミトコンドリ
ア機能と関連する疾患に付随し得るＭＰＴの間に起こるような）場合、プロトン
は、ＡＴＰを生成することなく複合体Ｖのコンジットを回避し得、これによって
、「カップルしていない」呼吸を回避し得る。なぜなら、電子移動および付随す
るプロトンポンピングは、ＡＴＰを生じないからである。従って、ミトコンドリ
ア透過性変化は、ミトコンドリア膜「細孔」の開口（特に、ＥＴＣおよびΔψｍ
がカップルされないプロセス）に関係し、Δψｍは減少し、そしてミトコンドリ
ア膜は、小さい（例えば、イオン性Ｃａ2+、Ｎａ+、Ｋ+、Ｈ+）および大きい（
例えば、タンパク質）の両方の溶質に対する透過性を選択的に調節する能力を失
う。
【０００７】 ミトコンドリア透過性変化「細孔」は、別個のアセンブリまたはマルチサブユ
ニット複合体でなくてもよく、そしてこの用語は、代わりに、任意のミトコンド
リア分子成分（例えば、ミトコンドリア膜自体を含む）をいい、この成分は、こ
のような調節機能が、ＭＰＴの間に損なわれる内部膜選択的透過性を調節する。
ミトコンドリア分子成分は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸ま
たはそれらの誘導体；脂質、脂肪酸など、またはそれらの誘導体；炭水化物、サ
ッカリドなど、またはそれらの誘導体；核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、プ
リン、ピリミジンまたは関連分子、あるいはそれらの誘導体であり得るか；また
はミトコンドリアの構成要素である任意の他の生物学的分子であり得る。ミトコ
ンドリア透過性変化細孔成分（これはまた、ミトコンドリア細孔成分といわれる
）は、上記のようなミトコンドリア膜の選択的な透過性特徴を調節する任意のミ
トコンドリア分子成分（Δψｍを確立する原因であるものおよびＭＰＴ間に機能
的に改変されたものを含む）であり得る。ミトコンドリア細孔成分はまた、ＭＰ
Ｔを制御する様式で、例えば、他のミトコンドリア細孔成分との一過性または安
定な会合を介して、ミトコンドリアと相互作用する因子を含み得る。このような
因子の例としては、シクロフィリン（以下により詳細に記載される）、カルシウ
ム調節シクロフィリンリガンド（ＣＡＭＬ、例えば、以下の表１、およびそこに
引用される参考文献を参照のこと）、およびＢｃｌ−２（例えば、Ｇｒｅｅｎら
、１９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：１３０９）、Ｂａｘ（Ｍａｒｚｏら、１
９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：２０２７）およびＢａｋ（Ｎａｒｉｔａら、
１９９８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１４６８１）
を含むＢｃｌ−２ファミリーのメンバーが挙げられる。
【０００８】 理論に束縛されることを望まないが、この細孔が、例えば、特定のミトコンド
リアおよび／または細胞質ゾルタンパク質、ならびに可能な他の分子種のアセン
ブルまたは凝集によって、ミトコンドリア膜に形成される物理的に別個のコンジ
ットであるか否か、あるいは「細孔」の開口が、ミトコンドリア膜の多孔性にお
ける一般的な増加を単に表し得るか否かは、未解決である。任意の事象において
、特定のミトコンドリア分子成分がＭＰＴ機構に寄与し得、例えば、本明細書中
に記載されるＥＴＣ成分または他のミトコンドリア成分を含む。例えば、ＭＰＴ
機構に寄与するようであるミトコンドリア透過性変化細孔成分のいくつかの非限
定的な例は、遺伝子産物の以下のファミリーのメンバーを含む（例えば、以下の
表１およびそこに引用される参考文献を参照のこと）：アデニンヌクレオチドト
ランスロケーター（ＡＮＴ）；末梢ベンゾジアゼピンレセプター（ＰＢｚＲ；Ｍ
ｃＥｎｅｒｙら、１９９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｌｔ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ ８９：３
１７０）；ＰＢｚＲ−関連タンパク質（ＰＲＡＸ）；電圧依存性アニオンチャネ
ル（ＶＤＡＣ、ポーリンとしても公知）；シクロフィリン（Ｃｙｐ）；カルシウ
ム調節シクロフィリンリガンド（ＣＡＭＬ）；ミトコンドリアカルシウムユニポ
ーター、ミトコンドリア関連ヘキソキナーゼおよびミトコンドリア膜間クレアチ
ンキナーゼ。
【０００９】 ＭＰＴは、ミトコンドリア遺伝子、遺伝子産物または下流メディエーター分子
および／またはミトコンドリア内遺伝子、遺伝子産物または下流メディエーター
の直接的または間接的効果から生じ得る。ＭＰＴはまた、他の既知また未知の原
因から生じる。ミトコンドリアポテンシャルの損失は、変更されたミトコンドリ
ア機能と関連した疾患（変性疾患を含む）の進行における重要な事象であり得る
。
【００１０】 ミトコンドリア欠損は、変更されたミトコンドリア機能と関連する疾患の病因
に有意に寄与し得る。このような欠損は、ミトコンドリアＤＮＡに存在する別個
のミトコンドリアゲノム（すなわち、ミトコンドリア染色体）および／またはミ
トコンドリア内ゲノム（核染色体ＤＮＡおよび他のミトコンドリア内ＤＮＡを含
む）に関連し得る。例えば、ミトコンドリア成分の構造および／または機能的特
性における変更（遺伝的因子および環境的因子に由来する変更または細胞代償機
構に由来する変更を含む）は、変更されたミトコンドリア機能と関連した任意の
疾患の病原において役割を果たし得る。多くの変性疾患は、ミトコンドリア機能
における変更によって引き起こされるか、またはその変更に関連すると考えられ
る。これらとしては、アルツハイマー病（ＡＤ）；真性糖尿病；パーキンソン病
；ハンティングトン病；失調症；レーバー遺伝性視神経障害；精神分裂病；ミト
コンドリア脳障害、乳酸アシドーシスおよび発作（ＭＥＬＡＳ）；癌；乾癬；過
剰増殖性障害；ミトコンドリア性糖尿病および難聴（ＭＩＤＤ）およびミオクロ
ヌス癲癇ぼろ赤筋線維症候群（ｍｙｏｃｌｏｎｉｃ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ｒａｇ
ｇｅｄ ｒｅｄ ｆｉｂｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）が挙げられる。変更されたミ
トコンドリア機能と関連したさらなる疾患の広範なリストは、広がり続ける。な
ぜなら、異常なミコトンドリア活性またはミト核（ｍｉｔｏｎｕｃｌｅａｒ）活
性が、特定の疾患プロセスにおいて、関連付けられるからである。
【００１１】 ＡＤおよび変更したミトコンドリア機能に関連する潜在的な他の疾患の特徴的
な症状は、病気に冒された特定の組織における選択された細胞集団の死であり、
これは、アポトーシス（これはまた、「プログラムされた死」またはＰＣＤとい
われる）から生じる。ミトコンドリア機能不全は、種々の細胞型におけるアポト
ーシスを導く事象のカスケードにおいて重要であると考えられ（Ｋｒｏｅｍｅｒ
ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１２７７−８７、１９９５）、そしてＡＤ脳の神経細
胞におけるアポトーシス細胞死の原因であり得る。変更されたミトコンドリア的
症状は、ＰＣＤにおける最も初期の事象内であり得（Ｚａｍｚａｍｉら、Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：３６７−７７、１９９５；Ｚａｍｚａｍｉら、Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１８１：１６６１−７２、１９９５）、そしてこのような変更され
たミトコンドリア機能から生じる上昇した反応性酸素種（ＲＯＳ）レベルは、ア
ポトーシスカスケードを開始し得る（Ａｕｓｓｅｒｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．１４：５０３２−４２、１９９４）。
【００１２】 従って、増殖細胞中でのエネルギー生成におけるそれらの役割に加えて、ミト
コンドリア（または、少なくともミトコンドリア成分）は、アポトーシスに関与
する（Ｎｅｗｍｅｙｅｒら、１９９４、Ｃｅｌｌ ７９：３５３−３６４；Ｌｉ
ｕら、１９９６、Ｃｅｌｌ ８６：１４７−１５７）。アポトーシスはまた、明
らかに、特に神経系の正常な発達および免疫系の適切な機能化を必要とする。さ
らに、いくつかの疾患状態は、アポトーシスの不十分なレベル（例えば、癌、自
己免疫疾患）または過剰なレベル（例えば、発作損傷、ＡＤ関連神経変性）のい
ずれかに関連すると考えられる。アポトーシスの一般的な総説およびそこでのミ
トコンドリアの役割について、ＧｒｅｅｎおよびＲｅｅｄ（１９９８、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２８１：１３０９−１３１２）、Ｇｒｅｅｎ（１９９８、Ｃｅｌｌ ９
４：６９５−６９８）、およびＫｒｏｍｅｒ（１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ ３：６１４−６２０）を参照のこと。従って、アポトーシス事象（
ミトコンドリア成分と関連するものを含む）に影響を及ぼす薬剤は、種々の緩和
的用途、予後用途および治療用途を有し得る。
【００１３】 アデニンヌクレオチドトランスロケーター（ＡＮＴ）は、本明細書中に提供さ
れるような１つの特定のミトコンドリア細孔成分の例である。ＡＮＴ（内部ミト
コンドリア膜の主要な成分であるポリペプチドをコードする核）より、内部ミト
コンドリア膜を横切るＡＤＰおよびＡＴＰの輸送を媒介される。例えば、ＡＮＴ
は、内部ミトコンドリア膜を横切る化学量論的ＡＴＰ／プロトン交換または同時
輸送を媒介すると考えられ、そしてＡＮＴインヒビター（例えば、アトラクチロ
シドまたはボンクレキン酸）が、特定の条件下でＭＰＴを誘導する。それらの組
織発現パターンが異なる３つのヒトＡＮＴアイソフォームが記載され、そして他
の哺乳動物ＡＮＴホモログが記載されている（例えば、Ｗａｌｌａｃｅら、１９
９８、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ＆ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎ Ｎ
ｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｂｅａｌ，Ｈｏｗｅｌ
ｌ ａｎｄ Ｂｏｄｉｓ−Ｗｏｌｌｎｅｒ編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，２８３−３０７頁、およびそこに引用される参考文献を参照のこと）
。ＡＮＴはまた、ミトコンドリア透過性変化細孔（上記のようにアポトーシスプ
ロセスにおける重要な調節的役割を演じるＣａ2+調節内部膜チャネル）の重要な
分子成分として関係付けられる。
【００１４】 高度に保存されたタンパク質のシクロフィリンファミリーのメンバーは、本明
細書中に提供されるようなミトコンドリア細孔成分の例を提供し、この成分は、
上記のように、ＭＰＴを調節する様式で、他のミトコンドリア細孔成分と、安定
にまたは一過的に相互作用し得る因子である。シクロフィリン（Ｃｙｐ）は、全
ての生物において発現される遍在的なタンパク質のファミリーである。全てのＣ
ｙｐファミリーメンバーは、約１０９アミノ酸の保存コアを共有するが、オルガ
ネラおよび膜輸送において機能する、固有の伸長において互いに異なる（例えば
、Ｗａｌｓｈら、１９９２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１３１１５−１
８）。少なくとも８個のヒトＣｙｐアイソフォームが知られており、これは、単
一ドメインおよび２ドメインシクロフィリンを含む（例えば、Ｔａｙｌｏｒら、
１９９７ Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６７：１５５−８１
）。別個のアイソフォーム（細胞質アイソフォーム、小胞体（ＲＥ）アイソフォ
ーム、ミトコンドリアアイソフォーム、および細胞表面アイソフォームを含む）
は、異なる細胞コンパートメントに局在する（Ｈａｎｄｌｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ
．６：９４７−５０、１９８７；Ｐｒｉｃｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
ｅ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１９０３−０７、１９９１；Ｂｅｒｇｓｍａら Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２３２０４−１４；Ｃａｃａｌａｎｏら、Ｐｒ
ｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ８９：４３５３−５７、１９９２）
。例えば、以下により詳細に記載されるように、シクロフィリンＤ（ＣｙｐＤ）
は、ミトコンドリア透過性を調節し得る別の分子である。
【００１５】 シクロフィリンは、細胞内の複数の機能を実行すると考えられる。例えば、Ｃ
ｙｐは、ペプチドおよびタンパク質におけるペプチジルプロイル結合のシスおよ
びトランス異性体の相互変換を触媒し、それによって、ペプチジルプロイル結合
の異性体化が速度制限されるタンパク質の折り畳みを容易にする（例えば、Ｇａ
ｌａｔ、Ｅｕｒ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１６：６８９−７０７、１９９３；Ｆ
ｉｓｃｈｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：２２０５−２２１２、１９９０；Ｓｔ
ａｍｎｅｓら、Ｃｅｌｌ ６５：２１９−２７、１９９１を参照のこと）。この
ペプチジルプロイルシス−トランス−イソメラーゼ活性が、免疫抑制剤シクロス
ポリンＡによってブロックされ得る（例えば、Ｆｒｕｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３７４１−４５、１９９２）。Ｃｙｐ
ファミリーメンバーはまた、完全に折り畳まれた機能的タンパク質との複合体を
形成することによって、タンパク質の活性を媒介するようである（例えば、Ｊａ
ｓｃｈｋｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７７：７６３−６９、１９９８；Ｒａ
ｔａｊｃｚｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１３１８７−９２、１９９
３；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４２０９−１９；Ｈｏｌｌｏ
ｗａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６３４６−５０、１９９８；Ｆ
ｒａｎｋｅら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３７４：２１７−２８、１
９９５を参照のこと）。
【００１６】 ＣｙｐＤは、今日まで同定されているＣｙｐファミリーの唯一のミトコンドリ
アのアイソフォームである。ヒトＣｙｐＤポリペプチドは、２０７アミノ酸長で
あり、そしてＣｙｐＤポリペプチドをミトコンドリア膜を通過させてマトリクス
へ輸送する作用を有し得る、ＮＨ2末端の疎水性伸張を有する（Ｂｅｒｇｓｍａ
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２３２０４−１４、１９９１）。Ｃｙｐ
Ｄは、電位依存性アニオンチャンネル（ＶＤＡＣ）およびＡＮＴとの相互作用に
よって、ミトコンドリアの外膜と内膜との間の接触部位において、ミトコンドリ
ア透過性変化細孔（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｐｅｒｍｉａｂｉｌｉｔｙ
ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｐｏｒｅ）の形成に関与すると考えられている（Ｃｒｏ
ｍｐｔｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５８ ７２９−３５、１９９８
；Ｗｏｏｄｆｉｅｌｄら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３３６：２８７−
９０）。ＡＮＴに対するＣｙｐＤの結合はまた、孔複合体を、Ｃａ2+濃度に対し
て感受性にし得る（Ｈａｌｅｓｔｒａｐら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ａｃｔａ．１３６６：７９−９４、１９９８）。インビトロにおいて、比較的高
濃度のＣａ2+は、ミトコンドリア膜の透過性を増加し、低分子溶質の内膜を横切
る自由拡散を生じる（例えば、Ｈａｌｅｓｔｒａｐら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．１７４：１６７−１７２、１９９７；Ｈｕｎｔｅｒら、Ａｒｃｈ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９５：４５３−５９、１９７９）。酸化的
ストレス、アデニンヌクレオチドの枯渇および膜電位の減少もまた、ミトコンド
リアの透過性を増加し得る（例えば、Ｂｅｒｎａｒｄｉら、Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒ
ｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２６：５０９−１７、１９９４；Ｚｏｒａｔｔｉら、Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２４１：１３９−７６、１９９５
）。ミトコンドリア透過性変化細孔の開口は、変更したミトコンドリア機能に関
連する疾患（例えば、上記の疾患）の病因における事象であり得る。例えば、Ｍ
ＰＴは、心臓バイパス外科手術、血栓崩壊、および器官の移植後に生じ得る、脈
管の虚血／再灌流障害後の壊死性の細胞死に寄与し得る（例えば、Ｈａｌｅｓｔ
ｒａｐら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２１：３５３−５８、１９９
３；Ｈａｌｅｓｔｒａｐら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７４：１６
７−１７２、１９９７）。別の例として、ＶＤＡＣ−ＡＮＴ−ＣｙｐＤ複合体は
また、膜間腔からのアポトーゲン性（ａｐｏｐｔｏｇｅｎｉｃ）タンパク質の放
出を生じる、ミトコンドリア外膜の破裂に関与し得る（例えば、Ｐｅｔｉｔら、
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２６：１１１−１６、１９９８；Ｍａｒｚｏら、Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１２６１−７１、１９９８）。
【００１７】 例えば、上記に考察した、変更したミトコンドリア機能に関連する疾患のため
の改善された治療を提供するために、ミトコンドリア透過性変化を変更させる薬
剤は、有益であり得、そしてそのような薬剤を特異的に検出するアッセイが必要
とされる。本発明は、これらの必要性を満たし、さらに他の関連する利点を提供
する。
【００１８】 （発明の要旨） 本発明は、ミトコンドリア透過性変化を変更する薬剤を同定し、そして使用す
るアッセイ、ならびに関連する組成物および方法に関する。１つの局面において
、本発明は、エネルギー移動分子ポリペプチドに融合したミトコンドリア透過性
変化細孔成分ポリペプチド、またはその改変体をコードするポリヌクレオチドに
作動可能に連結したプロモーターを含む核酸発現構築物を提供する。１つの実施
形態において、ミトコンドリア透過性変化細孔成分は、アデニンヌクレオチドト
ランスロケーターであり、特定のさらなる局面において、ミトコンドリア透過性
変化細孔成分は、ヒトＡＮＴ１、ヒトＡＮＴ２またはヒトＡＮＴ３である。１つ
の実施形態において、ミトコンドリア透過性変化細孔成分は、ポーリン、ヘキソ
キナーゼ、クレアチンキナーゼ、ＰＲＡＸ、ＣＡＭＬまたは末梢のベンゾジアゼ
ピンレセプターである。本発明はまた、特定の実施形態において、エネルギー移
動分子ポリペプチドに融合したシクロフィリン（ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）ポリ
ペプチド、またはその改変体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結し
たプロモーターを含む核酸発現構築物を提供する。１つの実施形態において、シ
クロフィリンは、シクロフィリンＤであり、別の実施形態において、シクロフィ
リンは、ヒトシクロフィリンＡ、シクロフィリンＢ、ヒトシクロフィリンＣまた
はヒトＣｙｐ−６０である。特定の実施形態において、発現構築物は、プラスミ
ド、コスミド、シャトルベクター、ウイルスベクターまたは複製の染色体起源を
含むベクターであるベクターを含む。特定の実施形態において、ベクターは、ｐ
ＢＡＤ−Ｈｉｓ、ｐＥＹＦＰ−Ｃ１、またはｐＥＣＦＰ−Ｎ１であるプラスミド
を含む。
【００１９】 本発明の特定の実施形態に従って、プロモーターは外部から制御される。ある
実施形態において、エネルギー移動分子は、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）
、ＦＬＡＳＨ配列、またはエクオリンタンパク質である。特定のさらなる実施形
態において、グリーン蛍光タンパク質は、青色シフトしたＧＦＰ、シアンシフト
したＧＦＰ、赤色シフトしたＧＦＰまたは黄色シフトしたＧＦＰである。特定の
他の実施形態において、エネルギー移動分子は、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦ
Ｐ）、ＦＬＡＳＨ配列またはエクオリンタンパク質である選択されたエネルギー
移動分子の誘導体である。
【００２０】 別の局面において、本発明は、エネルギー移動分子ポリペプチドに融合したミ
トコンドリア透過性変化細孔成分ポリペプチド、またはその改変体を含むポリペ
プチドを提供する。特定の実施形態において、ミトコンドリア透過性変化細孔成
分は、アデニンヌクレオチドトランスロケーターであり、特定のさらなる局面に
おいて、ミトコンドリア透過性変化細孔成分は、ヒトＡＮＴ１、ヒトＡＮＴ２ま
たはヒトＡＮＴ３である。特定の他の実施形態において、ミトコンドリア透過性
変化細孔成分は、ポーリン、ヘキソキナーゼ、クレアチンキナーゼ、ＰＲＡＸ、
ＣＡＭＬまたは末梢のベンゾジアゼピンレセプターである。別の実施形態におい
て、本発明は、エネルギー移動分子ポリペプチドに融合したシクロフィリン（ｃ
ｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）ポリペプチド、またはその改変体を含むポリペプチドを
提供する。特定の実施形態において、シクロフィリンは、シクロフィリンＤであ
り、別の特定の実施形態において、シクロフィリンは、ヒトシクロフィリンＡ、
シクロフィリンＢ、ヒトシクロフィリンＣまたはヒトＣｙｐ−６０である。特定
の実施形態において、エネルギー移動分子は、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ
）、ＦＬＡＳＨ配列またはエクオリンタンパク質である。特定のさらなる実施形
態において、グリーン蛍光タンパク質は、青色シフトしたＧＦＰ、シアンシフト
したＧＦＰ、赤色シフトしたＧＦＰまたは黄色シフトしたＧＦＰである。
【００２１】 別の局面において、本発明は、ミトコンドリア透過性変化を変更する薬剤を同
定するための宿主細胞を提供し、この宿主細胞は：（ａ）第１のエネルギー移動
分子またはその改変体をコードするポリヌクレオチドに融合した、ミトコンドリ
ア透過性変化細孔成分ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に
連結したプロモーターを含む第１の核酸発現構築物；および（ｂ）第２のエネル
ギー移動分子またはその改変体をコードするポリヌクレオチドに融合した、シク
ロフィリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプ
ロモーターを含む第２の核酸発現構築物、を含み、ここで、シクロフィリンポリ
ペプチドに対するミトコンドリア透過性変化細孔成分ポリペプチドの結合は、第
１のエネルギー移動分子と第２のエネルギー移動分子との間の検出可能なエネル
ギー移動を生じる。特定の実施形態において、ミトコンドリア透過性変化細孔成
分は、アデニンヌクレオチドトランスロケーターであり、特定のさらなる実施形
態において、ミトコンドリア透過性変化細孔成分は、ヒトＡＮＴ１、ヒトＡＮＴ
２またはヒトＡＮＴ３である。別の特定の実施形態において、ミトコンドリア透
過性変化細孔成分は、ポーリン、ヘキソキナーゼ、クレアチンキナーゼ、ＰＲＡ
Ｘ、ＣＡＭＬまたは末梢のベンゾジアゼピンレセプターである。特定の実施形態
において、シクロフィリンは、ヒトシクロフィリンＡ、シクロフィリンＢ、ヒト
シクロフィリンＣまたはヒトＣｙｐ−６０である。特定の他の実施形態において
、宿主細胞は、原核生物細胞であり、特定の他の実施形態において、宿主細胞は
、真核生物細胞である。特定のさらなる実施形態において、真核生物細胞は、２
９３細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｓｆ９細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｐ−２細胞、ＭＤＣ
Ｋ細胞またはジャーカット細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞）である。特定の他の実施形
態において、第１および第２のエネルギー移動分子は、グリーン蛍光タンパク質
（ＧＦＰ）、青色シフトしたＧＦＰ、シアンシフトしたＧＦＰ、赤色シフトした
ＧＦＰまたは黄色シフトしたＧＦＰである。特定の別の実施形態において、第１
および第２のエネルギー移動分子は、３００ｎｍ〜６５０ｎｍの範囲の波長にお
いて最大励起を有し、そして３５０ｎｍ〜６７５ｎｍの範囲の波長において最大
発光を有する。特定の他の実施形態において、第１のエネルギー移動分子および
第２のエネルギー移動分子は、異なる波長における最大励起および最大発光を有
する。なお別の特定の実施形態において、少なくとも１つの核酸発現構築物は、
染色体外にあり、一方、他の実施形態において、少なくとも１つの核酸発現構築
物は、宿主細胞染色体に組み込まれている。特定のさらなる実施形態において、
宿主細胞染色体は、ミトコンドリア染色体である。
【００２２】 本発明のなお別の局面において、ミトコンドリア透過性変化（ＭＰＴ）を変更
する薬剤についてのスクリーニング方法を提供し、この方法は、以下の工程：（
ａ）上記の本発明に従って、ミトコンドリアを含む宿主細胞を、候補薬剤および
ＭＰＴのインデューサーと接触させる工程；（ｂ）その細胞を、励起エネルギー
に曝露する工程；（ｃ）第１および第２のエネルギー移動分子間のエネルギー移
動のレベルを検出する工程；（ｄ）エネルギー移動のレベルを、候補薬剤の非存
在下において生成された第１の参照レベルと比較し、それによってＭＰＴを変更
する薬剤を同定する工程、を包含する。１つの実施形態において、宿主細胞を、
さらにＭＴＰのインヒビターと接触させ、第２の参照レベルを生成し、そしてさ
らなる実施形態において、ＭＴＰのインヒビターは、低ｐＨ、ミトコンドリアの
高い膜電位のインデューサー、またはサイクロスポリンＡである。別の実施形態
において、ＭＴＰのインデューサーは、アトラクチロシド（ａｔｒａｃｔｙｌｏ
ｓｉｄｅ）またはボンクレキン酸（ｂｏｎｋｒｅｋｉｃ ａｃｉｄ）である。別
の実施形態において、ＭＴＰのインデューサーは、ミトコンドリア内のＣａ2+濃
度を増加する化合物を含み、そして特定のさらなる実施形態において、この化合
物は、イオノフォア、イオノマイシン、タプシガルギン、アミノ酸神経伝達物質
、グルタメート、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸、カルバコール、アポトーゲ
ン（ａｐｏｐｔｏｇｅｎ）、またはカリウム脱分極のインデューサーである。別
の実施形態において、宿主細胞を、酸化的ストレスのインデューサーにさらに接
触させ、そして特定のさらなる実施形態において、その酸化的ストレスのインデ
ューサーは、エタクリン酸、ブチオニンスルホキシミン（ｂｕｔｈｉｏｎｉｎｅ
ｓｕｌｆｏｘｉｍｉｎｅ）、ジアミド、メナジオン、ｔ−ブチルヒドロペルオ
キシド、フェニル−アルシンオキシドまたは酸化窒素である。特定の他の実施形
態において、候補薬剤は、第１および第２のエネルギー移動分子の間のエネルギ
ー移動を増加し、一方、特定の他の実施形態において、候補薬剤は、第１および
第２のエネルギー移動分子の間のエネルギー移動を減少する。別の実施形態にお
いて、第１および第２のエネルギー移動分子は、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦ
Ｐ）、青色シフトしたＧＦＰ、シアンシフトしたＧＦＰ、赤色シフトしたＧＦＰ
または黄色シフトしたＧＦＰである。いくつかの実施形態において、励起エネル
ギーは、３００ｎｍ〜６５０ｎｍの範囲の波長を有する光である。他の実施形態
において、第１および第２のエネルギー移動分子は、３００ｎｍ〜６５０ｎｍの
範囲の波長において最大励起を有し、そして３５０ｎｍ〜６７５ｎｍの範囲の波
長において最大発光を有する。
【００２３】 特定の他の実施形態において、第１のエネルギー移動分子および第２のエネル
ギー移動分子は、異なる波長における最大励起および最大発光を有する。特定の
他の実施形態において、（ａ）第１のエネルギー移動分子は、４００ｎｍ〜５０
０ｎｍの範囲の波長の最大励起、および４５０ｎｍ〜５２５ｎｍの範囲の波長の
最大発光を有し、そして第２のエネルギー移動分子は、４５０ｎｍ〜５２５ｎｍ
の範囲の波長の最大励起、および５００ｎｍ〜５５０ｎｍの範囲の波長の最大発
光を有するか、または（ｂ）第２のエネルギー移動分子は、４００ｎｍ〜４５０
ｎｍの範囲の波長の最大励起、および４５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲の波長の最
大発光を有し、そして第１のエネルギー移動分子は、５００ｎｍ〜５２５ｎｍの
範囲の波長の最大励起、および５２５ｎｍ〜５５０ｎｍの範囲の波長の最大発光
を有する。特定の他の実施形態において、（ａ）第１のエネルギー移動分子は、
約４３３ｎｍの波長の最大励起、および約４７５ｎｍの波長の最大発光を有し、
そして第２のエネルギー移動分子は、約５１３ｎｍの波長の最大励起、および約
５２７ｎｍの波長の最大発光を有するか、または（ｂ）第２のエネルギー移動分
子は、約４３３ｎｍの波長の最大励起、および約４７５ｎｍの波長の最大発光を
有し、そして第１のエネルギー移動分子は、約５１３ｎｍの波長の最大励起、お
よび約５２７ｎｍの波長の最大発光を有する。
【００２４】 本発明は、別の局面において、ミトコンドリア透過性変化（ＭＰＴ）を変更す
る薬剤を検出するための方法を提供し、この方法は、シクロフィリンＤポリペプ
チドをアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドおよび候補薬剤と
、シクロフィリンＤ、アデニンヌクレオチドトランスロケーター、および候補薬
剤が相互作用するのに十分な条件および時間で接触させる工程；ならびに（ｂ）
候補薬剤の非存在下で検出される結合レベルと比較して、アデニンヌクレオチド
トランスロケーターポリペプチドに対してシクロフィリンＤポリペプチドが結合
するレベルを検出し、それからＭＰＴを変更する薬剤を検出する工程を包含する
。特定の実施形態において、シクロフィリンＤポリペプチドが支持体に固定化さ
れ、特定の実施形態において、シクロフィリンＤポリペプチドが融合タンパク質
である。特定の他の実施形態において、アデニンヌクレオチドトランスロケータ
ーポリペプチドが、支持体に固定され、特定の実施形態において、アデニンヌク
レオチドトランスロケーターポリペプチドが融合タンパク質である。特定のさら
なる実施形態において、融合タンパク質は、プロテアーゼ認識配列を含み、一方
、特定の他のさらなる実施形態において、融合タンパク質は、レセプターに対す
るリガンドを含む。特定の他の実施形態において、候補薬剤は、ペプチド、ポリ
ペプチド、タンパク質、または小分子である。いくつかの実施形態において、候
補薬剤は、コンビナトリアルライブラリー内に存在する小分子である。従って、
本発明はまた、特定の実施形態において、ミトコンドリア透過性変化を変更し得
る薬剤を提供し、ここで、この薬剤は、ちょうど記載された方法よって同定され
る。特定の他の実施形態において、本発明は、ちょうど記載された方法に従って
同定される薬剤と細胞を、細胞生存を調節するのに十分な条件および時間で接触
させる工程を包含する。特定の他の実施形態において、本発明は、ミトコンドリ
ア透過性変化（ＭＰＴ）を変更するための方法を提供し、この方法は、ミトコン
ドリアをちょうど記載された方法に従って同定される薬剤と、ＭＰＴを変更する
のに十分な条件および時間で接触させる工程を包含する。特定のさらなる実施形
態において、ミトコンドリアは、細胞内に存在する。特定のさらなる実施形態に
おいて、細胞は、生きた生物内に存在する。他の実施形態おいて、細胞は、サイ
ブリッド細胞である。
【００２５】 なお別の局面において、本発明は、エネルギー移動分子に融合された、ミトコ
ンドリア透過性変化細孔成分ポリペプチドを調製するための方法を提供し、この
方法は、（ａ）エネルギー移動分子ポリペプチドまたはその誘導体に融合された
アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドまたはその誘導体を含む
融合タンパク質をコードする核酸発現構築物を含む宿主細胞を、この融合タンパ
ク質の発現を可能にする条件下で培養する工程；および（ｂ）この培養物からこ
の融合タンパク質を回収する工程を包含する。特定の実施形態において、ミトコ
ンドリア透過性変化細孔成分がアデニンヌクレオチドトランスロケーターであり
、このアデニンヌクレオチドトランスロケーターは、特定の実施形態において、
ヒトＡＮＴ１、ヒトＡＮＴ２またはヒトＡＮＴ３である。特定の他の実施形態お
いて、ミトコンドリア透過性変化細孔成分は、ポーリン、ヘキソキナーゼ、クレ
アチンキナーゼ、ＰＲＡＸ、ＣＡＭＬまたは末梢ベンゾジアゼピンレセプターで
ある。別の実施形態において、本発明は、エネルギー移動分子に融合されるシク
ロフィリンポリペプチドを調製するための方法を提供し、この方法は、（ａ）エ
ネルギー移動分子ポリペプチドまたはその誘導体に融合されたシクロフィリンポ
リペプチドまたはその誘導体を含む融合タンパク質をコードする核酸発現構築物
を含む宿主細胞を、この融合タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工
程；および（ｂ）この培養物から融合タンパク質を回収する工程を包含する。特
定の実施形態において、シクロフィリンポリペプチドは、シクロフィリンＤポリ
ペプチドであり、そして特定の他の実施形態にいて、シクロフィリンポリペプチ
ドは、ヒトシクロフィリンＡ、シクロフィリンＢ、ヒトシクロフィリンＣまたは
ヒトＣｙｐ−６０である。特定の実施形態において、宿主細胞は、原核生物細胞
であり、特定の他の実施形態において、宿主細胞は、真核生物細胞であり、これ
は、特定のさらなる実施形態において、２９３細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−
７細胞、Ｓｆ９細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｐ−２細胞、ＭＤＣＫ細胞またはジャー
カット細胞である。他の実施形態において、核酸発現構築物は、染色体外である
。他の実施形態において、核酸発現構築物は、宿主細胞染色体に組み込まれ、こ
れは、特定のさらなる実施形態において、ミトコンドリア染色体である。特定の
他の実施形態において、融合タンパク質は、プロテアーゼについての認識配列を
含み、特定の他の実施形態において、融合タンパク質は、レセプターに対するリ
ガンドを含む。
【００２６】 特定の他の実施形態において、本発明は、ミトコンドリア透過性変化を変更す
る薬剤をスクリーニングするためのキットを提供し、これは、（ａ）シクロフィ
リンＤポリペプチドまたはその誘導体；（ｂ）単離されたアデニンヌクレオチド
トランスロケーターポリペプチドまたはその誘導体；および（ｃ）前出のポリペ
プチドの少なくとも１つに特異的に結合する検出試薬を含む。特定の実施形態に
おいて、シクロフィリンＤポリペプチドは、支持体に固定される。特定の他の実
施形態において、アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドは、支
持体に固定される。他の実施形態において、検出試薬は、抗体またはその抗原結
合フラグメントである。別の実施形態において、本発明は、ミトコンドリア透過
性変化（ＭＰＴ）を変更する薬剤をスクリーニングするためのキットを提供し、
これは、（ａ）宿主細胞；（ｂ）第１核酸発現構築物（第１エネルギー移動分子
またはその改変体に融合されるアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーターを含
む）；および（ｃ）第２核酸発現構築物（第２エネルギー移動分子またはその改
変体に融合されるシクロフィリンＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
に作動可能に連結されるプロモーターを含む）を含む。さらなる実施形態におい
て、宿主細胞は、原核生物細胞であり、異なるさらなる実施形態において、宿主
細胞は、真核生物細胞であり、これは、特定のさらなる実施形態において、２９
３細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｓｆ９細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｐ−
２細胞、ＭＤＣＫ細胞またはジャーカット細胞である。特定の他の実施形態にお
いて、第１および第２のエネルギー移動分子は、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦ
ＯＰ）、青色シフトＧＦＰ、シアンシフトＧＦＰ、赤色シフトＧＦＰ、または黄
色シフトＧＦＰである。
【００２７】 本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照
すれば明白である。本明細書中に開示されるすべての参考文献は、それぞれ個別
に援用されるように、その全体において参考として本明細書中に援用される。
【００２８】 （発明の詳細な説明） 上に記載されるように、本発明は、ミトコンドリア透過性変化（ＭＰＴ）を変
更する薬剤を同定する際における使用のための組成物およびアッセイを提供する
。従って、本発明は、一般的に、ミトコンドリア透過性変化の変更が、本明細書
中に記載される、エネルギー移動分子融合ポリペプチドを提供するように改変さ
れたミトコンドリア透過性変化細孔成分の選択された対間の相互作用を検出する
ことによって推定および／または観測され得るという驚くべき発見に関する。従
って、本発明は、このような相互作用の開発を意図し、ここで、任意の対のミト
コンドリア細孔成分ポリペプチドが、本発明の開示に従って、本明細書中で提供
される方法における使用について適切なエネルギー移動分子に融合され得る。本
開示は、種々の実施形態を記載し、ここで、相互作用は、ミトコンドリア透過性
変化細孔成分（特定の実施形態において、アデニンヌクレオチドトランスロケー
ターポリペプチドである）とシクロフィリンポリペプチドとの間で検出され得る
が、本発明は、第１ミトコンドリア細孔成分と第２ミトコンドリア細孔成分との
間の相互作用に限定されることは意図しないが、一般的にこれらに関する。
【００２９】 従って、例えば、本発明は、特定の実施形態においてより詳細には、アデニン
ヌクレオチドトランスロケーター（ＡＮＴ）およびシクロフィリンＤ（ＣｙｐＤ
）ポリペプチド（例えば、融合タンパク質）；このようなポリペプチドをコード
する核酸発現構築物；およびこのようなポリペプチドおよび／またはその複合体
と相互作用する天然または合成の薬剤（例えば、小分子、ＡＮＴリガンドおよび
ＣｙｐＤリガンド）を検出するためのスクリーニング方法に関する。しかし、本
明細書中に開示される種々の実施形態の精神および範囲は、ＡＮＴ−シクロフィ
リン相互作用に限定されることは意図されず、本明細書中に提供される任意のミ
トコンドリア細孔成分間の相互作用を包含することを意図し、これは、例えば、
ＭＰＴを調節する様式で、他のミトコンドリア細孔成分との一過性または安定な
会合によってミトコンドリアと相互作用する因子である多孔性成分に関与する相
互作用を含む。
【００３０】 上に記載されるように、ミトコンドリア内膜の選択的透過性は、膜に沿った電
気化学的電位を維持するためにＥＴＣの適切な機能を必要とする。アデニンヌク
レオチドトランスロケーター（ＡＮＴ）は、ＡＴＰ／プロトン交換を媒介するか
またはミトコンドリア内膜を共輸送し、そして特定の条件下において、ＭＰＴ「
細孔」の形成を増強するためにシクロフィリンＤ（ＣｙｐＤ）に特異的に結合す
ると考えられる。これらおよび他のミトコンドリア分子成分のＭＰＴにおける役
割およびこのような成分に影響する因子は、本明細書中に提供される方法を使用
して調査され得る。特に好ましい局面において、本発明は、ＡＮＴとＣｙｐＤと
の間の相互作用が、ＭＰＴを変更する薬剤をスクリーニングし、同定するために
検出される結合および機能アッセイに関する。
【００３１】 （アデニンヌクレオチドトランスロケーター（ＡＮＴ）およびシクロフィリン
Ｄ（ＣｙｐＤ）ポリペプチド） 本発明は、一般的に、アデニンヌクレオチドトランスロケーター（ＡＮＴ）お
よびシクロフィリンＤ（ＣｙｐＤ）ポリペプチド（例えば、融合タンパク質）に
関する。このようなポリペプチドは、任意のＡＮＴまたはＣｙｐＤのアイソフォ
ームを含み得る。本発明はさらに、ＡＮＴコード核酸発現構築物および／または
ＣｙｐＤコード核酸発現構築物を含む宿主細胞を培養することによって、組換え
ＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチド（融合タンパク質を含む）を産生するための
方法を提供する。本発明はまた、単離された組換えＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペ
プチド（例えば、融合タンパク質）を使用してＭＰＴを変更する薬剤をスクリー
ニングするための方法に関する。
【００３２】 本発明のポリペプチドおよび核酸は、好ましくは、単離された形態で提供され
、そして特定の好ましい実施形態において、均質になるまで精製される。本明細
書中で使用されるように、用語「単離された」は、材料が、そのもともとの環境
（例えば、それが天然に存在する場合には、天然の環境）から取り出されること
を意味する。例えば、生存にしている動物中に存在している天然に存在する核酸
またはポリペプチドは、単離されないが、天然系に同時に存在している材料のい
くつかまたは全てから分離された同じ核酸またはポリペプチドは単離される。こ
のような核酸は、ベクターの一部であり得、そして／あるいは、このような核酸
またはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてなお、このようなベクタ
ーまたは組成物が、その天然の環境の一部ではないように、単離される。
【００３３】 本明細書中に提供されるＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチドは、図１および図
８（配列番号 および ）の一つ以上の推定アミノ酸配列を含み得る。あるいは
、このようなポリペプチドは、本明細書中に提供されるＡＮＴ／ＣｙｐＤ核酸発
現構築物によってコードされる一つ以上のポリペプチド配列を含み得る。このよ
うなポリペプチド配列のフラグメント、アナログおよび誘導体を含むポリペプチ
ドならびに融合タンパク質が、さらに、意図される。本明細書中において使用さ
れるように、用語「フラグメント」「誘導体」および「アナログ」は、ＡＮＴお
よびＣｙｐＤポリペプチドまたは融合タンパク質を参照する場合、このようなポ
リペプチドと本質的に同じ生物学的機能または活性を保有する任意のＡＮＴおよ
びＣｙｐＤポリペプチドまたは融合タンパク質をいう。例えば、アナログは、活
性なＡＮＴおよび／またはＣｙｐＤポリペプチドを産生するように切断によって
活性化され得るプロタンパク質であり得る。本発明のポリペプチドは、組換えポ
リペプチドまたは合成ポリペプチドであり得、好ましくは、組換えポリペプチド
である。
【００３４】 ＡＮＴまたはＣｙｐＤポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログ
（核酸発現構築物によってコードされるＡＮＴおよびＣｙｐＤのポリペプチドお
よび融合タンパク質を含む）は、（ｉ）1つ以上のアミノ酸残基が、保存された
かまたは保存されていないアミノ酸残基（好ましくは、保存されたアミノ酸残基
）と置換されているものであり、そしてそのような置換されたアミノ酸残基は、
その遺伝子コードによってコードされたものであってもなくてもよく、（ｉｉ）
１つ以上のアミノ酸残基が値喚起を含むもの、（ｉｉｉ）ＡＮＴおよび／または
ＣｙｐＤポリペプチドが別の化合物（例えば、そのポリペプチドの半減期を増大
させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール））と融合されているもの、お
よび／または（ｉｖ）さらなるアミノ酸がＡＮＴおよび／またはＣｙｐＤポリペ
プチドに融合したもの（以下により詳細に記載されるＡＮＴおよび／またはＣｙ
ｐＤポリペプチドの検出に用いられる、および／またはＡＮＴ／ＣｙｐＤポリペ
プチドまたはプロタンパク質の配列の精製のために用いられるアミノ酸配列を含
む）であり得る。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細
書の教示から当業者の技術範囲内であると考えられる。
【００３５】 本明細書において提供される特定の方法内において、細菌、昆虫、酵母、およ
び／または哺乳動物の発現系は、検出可能な組換えＡＮＴおよび／またはＣｙｐ
Ｄポリペプチドの顕著な量での信頼性のある産生のために設計され得る。特定の
実施形態において、組換えＡＮＴおよびＣｙｐＤ融合タンパク質を産生するため
の組成物および方法が提供され、ここで、その融合タンパク質は、エネルギー移
動分子ポリペプチド配列を含む。これらおよび他の特定の実施形態内において、
外部的に調節されるプロモーターに由来する検出可能な組換えＡＮＴ融合タンパ
ク質およびＣｙｐＤ融合タンパク質を産生するための組成物および方法が提供さ
れる。特定の好ましい実施形態において、その発現系の設計には、少なくとも１
つのミトコンドリアを含む宿主細胞の使用が含まれる。
【００３６】 ＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチド（例えば、融合タンパク質）は、インタク
トな宿主細胞内で、またはインタクトな細胞小器官（例えば、ミトコンドリア、
細胞膜または細胞内粒子）の調製において、有用であり得る。このようなポリペ
プチドは、さらに、細胞ホモジネートまたは溶解物、亜ミトコンドリア粒子、単
層膜粒子および多層膜粒子、または他の調製物を含むがこれらに限定されない破
壊された細胞調製物において有用であり得る。あるいは、ＡＮＴおよびＣｙｐＤ
ポリペプチドは、組換え細胞培養物から、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽
出、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロ
マトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマ
トグラフィーを含む方法によって、回収および精製され得る。タンパク質のリフ
ォールディング工程は、必要に応じて、機能的タンパク質のコンフィギュレーシ
ョンを完了するにおいて使用され得る。最後に、高速液体クロマトグラフィー（
ＨＰＬＣ）は、最終精製工程のために使用され得る。
【００３７】 本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、化学的合成手順の産物、ま
たは原核生物または真核生物の宿主（例えば、培養中の細菌、酵母、高等植物、
昆虫、または哺乳動物細胞を含む）からの組換え技術の産物であり得る。組換え
産生手順に使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドおよび融合タンパ
ク質は、グリコシル化されていてもよいし、グリコシル化されていなくてもよい
。ポリペプチドはまた、開始メチオニンアミノ酸残基を含み得る。
【００３８】 本明細書において提供される組成物および方法は、植物および動物のＡＮＴを
含む任意の原核生物または真核生物ＡＮＴに適合され得、これはさらにアミノ酸
配列および／またはコードする核酸が当業者に公知の例えば、酵母、脊椎動物お
よび哺乳動物ＡＮＴ（げっ歯類、非ヒト霊長類、およびヒトＡＮＴ）を含み得る
。それらの組織発現パターンにおいて異なる３つのヒトＡＮＴ（ｈｕＡＮＴ）ア
イソフォームが記載されている（Ｓｔｅｐｉｅｎら、１９９２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６７：１４５９２を参照のこと；また、Ｗａｌｌａｃｅら、１９９
８ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ＆ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎ Ｎｅ
ｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｂｅａｌ．Ｈｏｗｅｌｌ
ａｎｄ Ｂｏｄｉｓ−Ｗｏｌｌｎｅｒ編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ、２８３−３０７頁、およびそこで引用されている文献も参照のこと）。
ｃＤＮＡの核酸配列（ｈｕＡＮＴ１ ｃＤＮＡについては、Ｎｅｃｋｅｌｍａｎ
ｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７５８０
-７５８４（１９８７）；ｈｕＡＮＴ２ ｃＤＮＡについては、Ｂａｔｔｉｎｉ
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４３５５−４３５９（１９８７）；およ
びｈｕＡＮＴ３ ｃＤＮＡについては、Ｃｏｚｅｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．２０６：２６１−２８０（１９８９））、およびこれらの３つのヒトＡＮＴア
イソフォームについてのアミノ酸配列が報告されている；そしてＡＮＴ遺伝子配
列は、多数の種について決定されている（例えば、ｈｕＡＮＴ１ゲノムＤＮＡに
ついてのＬｉら、１９８９ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１３９９８；ｈ
ｕＡＮＴ２についてのＬｉｅｗら、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｎ８６７１
０；ラットＡＮＴ遺伝子についてのＳｈｉｎｏｈａｒａら、１９９３ Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ．Ｂｉｏｐｙｓ．Ａｃｔａ １１５２：１９２を参照のこと；その他につ
いては、例えば、Ｋｕら、１９９０ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１６０
６０；Ａｄａｍｓら、１９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６５１；およびＷ
Ｏ９８／１９７１４を参照もまたこと）。哺乳動物種の内でＡＮＴ配列は、高度
に保存されている；例えば、アミノ酸レベルにおいて、マウスＡＮＴ１およびＡ
ＮＴ２は、ヒトＡＮＴ２と９８％の配列同一性を示す。少なくとも２９のＡＮＴ
タンパク質の全長アミノ酸配列が、現在までに、種々の動物および植物種から報
告されており、これらのうちのほとんどが核酸配列から推定されている（Ｆｉｏ
ｒｅら、１９９８ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ８０：１３７-１５０）。
【００３９】 同様に、本発明の組成物および方法はまた、任意の原核生物または真核生物Ｃ
ｙｐ（例えば、ＣｙｐＤ（植物および動物のＣｙｐＤを含む）（これはさらに、
そのアミノ酸配列および／またはコードする核酸が当業者に公知である例えば、
酵母、寄生生物、無脊椎動物、げっ歯類、およびヒトのＣｙｐＤを含む（例えば
、前掲の表１を参照のこと）））に適合され得る。３つのヒトＣｙｐＤ（Ｃｙｐ
３としても知られる）アイソフォーム（例えば、Ｂｅｒｇｓｍａら、１９９１、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２３２０４−１４、ヒトＣｙｐ３のｃＤＮＡ
についてはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ８０２５４、および推定アミノ酸
配列についてはＡｃｃ．Ｎｏ．ＡＡＡ５８４３４を参照のこと）の核酸およびア
ミノ酸配列に加えて、他の種由来のＣｙｐＤ配列が報告されている（例えば、ラ
ットＣｙｐＤのｃＤＮＡについてはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｕ６８５４
４、および推定アミノ酸配列についてはＮｏ．ＡＡＢ０８４５３を参照のこと）
。
【００４０】 本発明のポリペプチドには、当該分野で公知の配列と同一または類似のアミノ
酸配列を有するＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチドおよび融合タンパク質が含ま
れる。例えば、例示のためであって限定するものではないが、図１、２、７、お
よび８（配列番号 ）のヒトＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチドは、本発明に
したがって使用されることが意図され、図１、２、７、および８のポリペプチド
およびそのようなポリペプチドの部分に対して少なくとも７０％の類似性（好ま
しくは、７０％の同一性）、そしてより好ましくは、図１、２、７、および８の
ポリペプチドおよびそのようなポリペプチドの部分に対して９０％の類似性（よ
り好ましくは、９０％の同一性）、そしてなおより好ましくは、図１、２、７、
および８のポリペプチドおよびそのようなポリペプチドの部分に対して９５％の
類似性（なおより好ましくは、９５％の同一性）を有するポリペプチドもまた本
発明にしたがって使用されることが意図され、ここで、このようなＡＮＴおよび
ＣｙｐＤポリペプチドの部分は、一般的に、少なくとも８個の連続するアミノ酸
、好ましくは、少なくとも１２個の連続するアミノ酸、より好ましくは、少なく
とも２０個の連続するアミノ酸、より好ましくは、少なくとも３０個の連続する
アミノ酸、そしてより好ましくは、少なくとも５０個の連続するアミノ酸を含有
する。
【００４１】 ２つのポリペプチドの間の「類似性」は、一般に、アミノ酸配列およびそのポ
リペプチドの保存されたアミノ酸置換を、第二のポリペプチドの配列と比較する
ことによって決定される。本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、
ペプチド合成により対応する全長ポリペプチドを産生することによって利用され
得る；したがって、そのフラグメントは、全長ポリペプチドを産生するための中
間体として利用され得る。本発明の核酸のフラグメントまたは部分は、本発明の
全長核酸を合成するために使用され得る。
【００４２】 上記のように、本発明はＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチド（ヒトＡＮＴおよ
びヒトＣｙｐＤポリペプチドならびにＡＮＴ融合タンパク質およびＣｙｐＤ融合
タンパク質を含む）を産生および単離するための方法に一部関する。ＡＮＴポリ
ペプチドは、一般に、ＡＮＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動
可能に連結したプロモーターを有する核酸発現ベクターを使用して、有用な量で
産生され得る。同様に、ＣｙｐＤポリペプチドは、一般に、ＣｙｐＤポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを有する核
酸発現ベクターを使用して有用な量で産生され得る。好ましい実施形態において
、核酸発現構築物は、本発明において提供されるようにエネルギー移動分子ポリ
ペプチドに融合したＡＮＴまたはＣｙｐＤポリペプチドを含む融合タンパク質を
コードする。本明細書に記載されるＡＮＴおよびＣｙｐＤをコードする核酸発現
構築物は別々のベクターであり得るが、本発明はそのように限定されることを意
図せず、当業者は、容易にＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチドおよび／または融
合タンパク質が単一の核酸構築物上に配置され得ることを理解する。例えば、単
一の核酸発現構築物は、単一のプロモーターに作動可能に連結されたＡＮＴおよ
びＣｙｐＤ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有し得、あるい
は融合タンパク質をコードする各ポリヌクレオチド配列は、それ自身の作動可能
に連結したプロモーターを有し得る。いずれかの構築物において、両方の融合タ
ンパク質は、実質的に同時に発現され得る。
【００４３】 特定の実施形態において、例えば、本発明は、本明細書において提供されるよ
うに、組換えＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチドおよび融合タンパク質を、外部
から制御されるプロモーターを使用することによって産生するための組成物およ
び方法を提供する。他の実施形態において、例えば、本発明は、例えば、Ｃｙｐ
Ｄポリペプチドに対してＡＮＴポリペプチドの異なる産生レベルを可能にするた
めに、１つ以上の外部的に制御されるプロモーターを含むように適合され得る。
【００４４】 本発明はまた、全長タンパク質およびポリペプチド、フラグメント、およびそ
の改変体を含み、そしてさらに本明細書において提供されるＡＮＴ融合タンパク
質およびＣｙｐＤ融合タンパク質を含むＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチドの使
用に一部関する。以下により詳細に記載される特定の好ましい実施形態において
、ヒトＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチドは、種々の結合アッセイ、スクリーニ
ングアッセイ、機能的アッセイなどにおいて使用され得る。特定の特に好ましい
実施形態において、ＡＮＴ融合タンパク質は、エネルギー移動分子ポリペプチド
を含む、そしてＣｙｐＤ融合タンパク質は、ＡＮＴ融合タンパク質に存在するも
のとは区別されるエネルギー移動分子ポリペプチドを含み、ここで、適切なエネ
ルギー移動分子ポリペプチドの選択は、本明細書において提供されるように行わ
れる。組換えＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチドの発現は、このようなアッセイ
に老いてＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチド産物の使用を可能にするレベルで達
成され得、そして本発明は、ＡＮＴとＣｙｐＤポリペプチドとの間および／また
は融合タンパク質の間の相互作用を変更する因子（例えば、ＡＮＴリガンドおよ
びＣｙｐＤリガンドを含む）を同定するためのアッセイ（ハイスループットアッ
セイを含む）を提供する。本発明はさらに、ＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチド
の因子およびリガンドに一部関する。このような因子は、例えば、本明細書に記
載されるものを含むがこれらに限定されない当該分野で公知のＡＮＴおよびＣｙ
ｐＤ機能を増強または減弱し得る。
【００４５】 （エネルギー移動分子および融合タンパク質） 上記のように、本発明はまた、ＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチド（ＡＮＴお
よびＣｙｐＤ融合タンパク質を含む）を産生および単離するため、ＡＮＴ、Ｃｙ
ｐＤ、およびＡＮＴ／ＣｙｐＤ複合体と相互作用する因子を同定するための組成
物および方法に一部関する。本発明の特定の局面は、蛍光共鳴エネルギー移動（
ＦＲＥＴ）技術が、ＡＮＴとＣｙｐＤ融合タンパク質との間のＡＮＴ−ＣｙｐＤ
相互作用を検出するために使用され得るという発見に基づいている。ここで、一
方の融合タンパク質は、エネルギー移動分子ポリペプチドに融合したＡＮＴポリ
ペプチド（例えば、適切なエネルギー移動ドナーポリペプチド配列、ドメインま
たは領域）を含み、そして他方の融合タンパク質は、適切なエネルギー移動アク
セプターポリペプチド配列、ドメインまたは領域のようなエネルギー移動分子ポ
リペプチドに融合したＣｙｐＤポリペプチドを含む。別の非限定的な例として、
一方の融合タンパク質が、エネルギー移動分子ポリペプチドに融合したＡＮＴポ
リペプチド（例えば、適切なエネルギー移動アクセプターポリペプチド配列、ド
メイン、または領域）を含み得、そして他方の融合タンパク質が、エネルギー移
動分子ポリペプチドに融合したＣｙｐＤポリペプチド（適切なエネルギー移動ド
ナーポリペプチド配列、ドメイン、または領域）を含み得る。
【００４６】 エネルギー移動ドナー分子（例えば、適切なエネルギードナーであるエネルギ
ー移動分子ポリペプチド）のエネルギー放射スペクトルは、ＦＲＥＴにおいて使
用するにおいて対合されるエネルギー移動アクセプター分子（例えば、適切なエ
ネルギーアクセプターであるエネルギー移動分子ポリペプチド）のエネルギー吸
収スペクトルと少なくとも部分的に重複しているべきであり、そのようにしてド
ナーからアクセプターへのエネルギー移動が生じ得る。代表的には、エネルギー
移動ドナー分子は、エネルギー移動アクセプター分子の励起ピーク波長（ここで
は、「λＡ（ｅｘ）」）の数ｎｍ以内である放射ピーク波長（ここでは、「λＤ
(ｅｍ)」）を有する。すなわち、Ｄ（ｅｍ）とＡ（ｅｘ）との間の差異は、代表
的には、約７０ｎｍから約２０ｎｍ以下までであり、その差 Δ＝λＤ（ｅｍ）-λＡ（ｅｘ） の代表的な値は、６０ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、４０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、
２５ｎｍ以下、２０ｎｍ以下、１５ｎｍ以下、１０ｎｍ以下、５ｎｍ以下、また
は１ｎｍ以下である。
【００４７】 しかし、励起または放射が波長の関数としてプロットされた場合、エネルギー
移動ドナー分子またはエネルギー移動アクセプター分子としての使用のために適
切である特定の化合物は、広範なピークを有し得、それにより、エネルギーが、
上記のＤ（ｅｍ）とＡ（ｅｘ）との間の差よりも大きな差を有する特定の対合さ
れたエネルギー移動ドナーおよびエネルギー移動アクセプター分子間で検出可能
に移動され得る。例えば、特定のドナー−アクセプター対は、それらの間のエネ
ルギー移動が高度に非効率的である場合（すなわち、１つまたは両方のエネルギ
ー移動ドナーおよびアクセプターが、エネルギー移動分子のための励起ピーク波
長および／または放射ピーク波長から離れた波長を有するリガンドとともに使用
され得る場合）でさえも、エネルギー移動ドナーおよびエネルギー移動アクセプ
ターが、検出可能なエネルギー移動が生じるために互いに充分近接領域内にある
限り、本明細書において提供されるエネルギー移動方法論にとって適切であり得
る。当業者は、蛍光共鳴エネルギー移動が存在する場合、適切な（すなわち、適
した）エネルギー移動ドナー−アクセプター対が確立された基準および本明細書
の教示に従って達成されるように、過度の実験を要することなく、容易に決定し
得る。
【００４８】 例えば、慣用のスクリーニングが、検出可能なＦＲＥＴシグナルが生成され得
るか否かを決定するために、試験溶液中で（例えば、本明細書中に提供されるよ
うな宿主細胞の非存在下で）少なくとも候補エネルギー移動ドナー分子および候
補エネルギー移動アクセプター分子（例えば、本明細書中に開示されるようなド
ナーおよびアクセプターエネルギー移動分子ポリペプチド）を組み合わせること
により用いられ得る。特定のエネルギー移動ドナー−アクセプターポリペプチド
組み合わせについて、ＦＲＥＴシグナルの特異的生成は、ドナーポリペプチドお
よびアクセプターポリペプチドの各々が融合される機能的ドメインの結合（例え
ば、本明細書中に提供されるようなＡＮＴポリペプチドとＣｙｐＤポリペプチド
との間の結合相互作用）に依存し得る。溶液中の検出可能なＦＲＥＴシグナルの
それらの容易化について特定のこのようなドナー−アクセプター対をスクリーニ
ングすることは、試験溶液に、機能的ドメインの性質（例えば、ＡＮＴ−Ｃｙｐ
Ｄ結合を好む補因子または他の条件）の精通に基づいて当業者によって選択され
る少なくとも１つの適切な生体分子（例えば、タンパク質またはペプチド含有種
、脂質含有種、核酸含有種、または炭水化物含有種）を添加することをさらに包
含し得る。理論に縛られることを望まないが、ＦＲＥＴシグナルを検出するため
に、このようなパイロット実験において使用されるエネルギー移動ドナー分子お
よびアクセプター分子の濃度は、特定のこのような場合においては、本明細書中
で提供されるような本発明の方法において用いられる濃度を超え得る。しかし、
このようなエネルギー移動分子の同様に検出可能な濃度は、エネルギー移動分子
ポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を調節するプロモーターの誘導後、本
明細書中に記載のような宿主細胞において（例えば、このような宿主細胞の亜細
胞区画（例えば、ミトコンドリア）において）蓄積し得る。当業者はまた、エネ
ルギー移動ドナー分子およびエネルギー移動アクセプター分子（例えば、エネル
ギー移動分子ポリペプチド）の蛍光スペクトル特性が、用いられる溶液およびサ
ンプル条件（例えば、選択される溶媒、溶媒およびイオン強度、ｐＨ、サンプル
の性質など）の関数として変動し得ることを容易に理解する。
【００４９】 本発明に従う使用について適切なエネルギー移動ドナー−アクセプター対（例
えば、対合したエネルギー移動分子ドナーポリペプチドおよびアクセプターポリ
ペプチド）を選択する際に有用な別の基準は、励起エネルギー移動アクセプター
により生成した放射シグナルが、励起エネルギー移動ドナーにより生成した放射
シグナルと区別可能でなければならないことである。励起ドナーからの放射シグ
ナルは、例えば、（１）励起アクセプターからの放射シグナルの波長が、励起ド
ナーからの放射シグナルの波長と十分に異なるか、または（２）アクセプターが
励起ドナーからの放射シグナルを消光する場合、非常に区別され得る。
【００５０】 エネルギー移動ドナーおよびアクセプター分子ポリペプチドとして働き得るタ
ンパク質の例は、「ＦＬＡＳＨ」（フルオレセイン含砒素ヘリックス結合剤）配
列（Ｇｒｉｆｆｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：２６９−２７２，１９９８）
、またはエクオリンタンパク質もしくはグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）配列
（Ｋｅｎｄａｌｌら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６
：２１６−２２４，１９９８、およびその中で引用される文献）を含む融合タン
パク質を含む。本明細書中で使用されるように、用語「グリーン蛍光タンパク質
」は、野生型グリーン蛍光タンパク質（野生型ＧＦＰ）、ならびに野生型ＧＦＰ
の青色シフト、青緑色シフト、赤色シフト、および黄色シフト誘導体（それぞれ
ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＲＦＰおよびＹＦＰと称される；公開ＰＣＴ出願ＷＯ９８／０
６７３７を参照のこと）を包含する。表２（以下の実施例１７を参照のこと）は
、代表的なＧＦＰエネルギー移動分子ポリペプチドドナー−アクセプター対の例
を提供し、そしてアミノ酸の一文字表記を用いて種々のＧＦＰ誘導体において示
した数のアミノ酸配列位置でのアミノ酸置換の記述を包含する。表２は、これら
のＧＦＰの励起および放射のそれぞれのピーク波長もまた示す。
【００５１】 エネルギー移動分子ポリペプチド（例えば、エクオリン、ＧＦＰ、またはＦＬ
ＡＳＨポリペプチド）に融合されたＡＮＴポリペプチドまたはＣｙｐＤポリペプ
チドを含む融合タンパク質をコードする発現構築物を生成するために、遺伝子発
現について適当なポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、（１）本明細書中で
提供されるようなＡＮＴポリペプチドまたはＣｙｐＤポリペプチドをコードする
第一の核酸および（２）エクオリンポリペプチド、ＧＦＰ誘導体またはＦＬＡＳ
Ｈポリペプチドをコードする第二の核酸を含むように操作され得、ここで第一の
核酸および第二の核酸は、両核酸を含む共通読み枠を有するように連結される。
【００５２】 以下で議論するように、このようなポリペプチドは、タンパク質−タンパク質
相互作用（結合事象（Ｍａｈａｊａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ １６：５４７−５６２，１９９８を参照のこと）またはタンパク質開裂
（Ｘｕら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：２０３４−２０３５，１９９
８を参照のこと）を含む）を検出するためにＦＲＥＴアッセイ内で用いられ得る
。このようなアッセイは、例えば、本明細書中に提供されるように、一方のエネ
ルギー移動分子（エネルギードナー発蛍光団）の放射スペクトルが他方のエネル
ギー移動分子（エネルギーアクセプター発蛍光団）の励起スペクトルと重複する
ように選択される２つの蛍光転移分子（例えば、エネルギー移動分子ポリペプチ
ド）を用いる。従って、本明細書中で提供されるＦＲＥＴに基づくスクリーニン
グ方法は、一般に、それらが蛍光エネルギーを転移することにより宿主細胞にお
いて相互作用するような、重複する励起／放射スペクトルを有する２つのエネル
ギー移動分子を用いる。好ましい実施形態においては、エネルギー移動分子は、
蛍光、リン光、生物発光、または化学発光性のタンパク質、ポリペプチド、また
はペプチドであり得、そしてより好ましくは、蛍光性のタンパク質、ポリペプチ
ド、またはペプチドであり得る。エネルギー移動分子（例えば、エネルギー移動
分子ポリペプチド配列）（例えば、ＡＮＴおよび／またはＣｙｐＤポリペプチド
に融合されて、本明細書中に記載のような検出可能なＡＮＴまたはＣｙｐＤ融合
タンパク質を形成し得る）は、それが、物理的（例えば、光子もしくは電子）ま
たは化学的（例えば、酵素もしくはインデューサー）であり得る励起エネルギー
に曝露されたときに検出され得る。好ましい実施形態においては、励起エネルギ
ーは化学的であり、より好ましくは、励起エネルギーは物理的であり、そして最
も好ましくは、励起エネルギーは、約３００ｎｍ〜約６５０ｎｍの範囲の波長を
有する光である。
【００５３】 本明細書中に記載されるように、本発明は、例えば、例示としてであって限定
ではないが、ＡＮＴおよびＣｙｐＤ融合タンパク質の検出、単離および／または
精製を可能にするさらなる機能的もしくは非機能的ポリペプチド配列に融合され
たＡＮＴまたはＣｙｐＤポリペプチドを含むＡＮＴおよびＣｙｐＤ融合タンパク
質を提供する。例えば、さらなる機能的ポリペプチド配列は、本明細書中で提供
されるようなエネルギー移動分子ポリペプチドであり得る。本明細書中で記載さ
れたＡＮＴおよびＣｙｐＤ融合タンパク質は、ＦＲＥＴ、蛍光、リン光、生物発
光、または化学発光によって検出され得、そして、特定の実施形態においては、
タンパク質−タンパク質アフィニティー（例えば、レセプター−リガンド）、金
属アフィニティーまたは電荷アフィニティー方法によって検出、単離、および／
または精製され得る融合タンパク質を含む。特定の他の実施形態においては、本
発明の融合タンパク質は、プロテアーゼ認識配列を含む配列を有する融合タンパ
ク質の特異的プロテアーゼ開裂（これにより、ＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチ
ドが、さらなるポリペプチド配列から分離可能であり得る）によって検出され得
る。特定の好ましい実施形態においては、例えば、各ＡＮＴおよび／またはＣｙ
ｐＤポリペプチド配列は、エネルギー移動分子ポリペプチド配列にインフレーム
に融合される。ＡＮＴおよびＣｙｐＤ融合タンパク質に存在する他のポリペプチ
ド配列は、ＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチドのアフィニティー検出および単離
を容易にし得、そして、例えば、ポリ−Ｈｉｓまたは規定の抗原性ペプチドエピ
トープ（米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら、（１９８８ Ｂｉ
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４）に記載）、またはＸＰＲＥＳＳTMエ
ピトープタグ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含み得る。
アフィニティー配列は、細菌宿主の場合マーカーに融合された成熟ポリペプチド
の精製を提供するために、例えば、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
またはｐＱＥ−９ベクターによって供給されるような、ヘキサ−ヒスチジンタグ
であり得る。あるいは、アフィニティー配列は、哺乳動物宿主細胞（例えば、Ｃ
ＯＳ−７細胞）が用いられる場合、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグであり得る。Ｈ
Ａタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来する抗体規定エピト
ープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８４， Ｃｅｌｌ ３７：７６７）。
【００５４】 ＡＮＴおよびＣｙｐＤ融合タンパク質は、ＡＮＴおよびＣｙｐＤの検出、単離
、および／または局在化を容易にするために、ＡＮＴおよびＣｙｐＤに付加され
た免疫グロブリン定常領域ポリペプチドをさらに含み得る。免疫グロブリン定常
領域ポリペプチドは、好ましくは、ＡＮＴまたはＣｙｐＤポリペプチドのＣ末端
に融合される。抗体由来ポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の種々の部分に融
合された異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の一般的な調製は、例えば、Ａ
ｓｈｋｅｎａｚｉら（１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ
，８８：１０５３５）およびＢｙｒｎら（１９９０ Ｎａｔｕｒｅ，３４４：６
７７）によって記載されている。ＡＮＴ：ＦｃまたはＣｙｐＤ：Ｆｃ融合タンパ
ク質をコードする遺伝子融合は、適当な発現ベクターに挿入される。本発明の特
定の実施形態においては、ＡＮＴ：ＦｃおよびＣｙｐＤ：Ｆｃ融合タンパク質は
、ほとんど抗体分子のように組み立てられ得、そこでは鎖間ジスルフィド結合が
Ｆｃポリペプチド間で形成し、ダイマーＡＮＴ融合タンパク質およびダイマーＣ
ｙｐＤ融合タンパク質を生じる。
【００５５】 ＡＮＴおよびＣｙｐＤをコードする配列にインフレームに連結されたＤＮＡ配
列によりコードされた免疫グロブリンＶ領域ドメインを含む融合ポリペプチドに
よって予め選択された抗原について特異的結合アフィニティーを有するＡＮＴお
よびＣｙｐＤ融合タンパク質もまた、本発明の範囲内であり、これは、本明細書
中に提供されるような、それらの改変体およびフラグメントを含む。免疫グロブ
リンＶ領域融合ポリペプチドを有する融合タンパク質の構築のための一般的なス
トラテジーは、例えば、ＥＰ ０３１８５５４；Ｕ．Ｓ．５，１３２，４０５；
Ｕ．Ｓ．５，０９１，５１３；およびＵ．Ｓ．５，４７６，７８６において開示
される。
【００５６】 融合タンパク質は、特定の実施形態においては、所望のアフィニティー特性（
例えば、レセプター−リガンド）を有する１つ以上の他のポリペプチドに融合さ
れたＡＮＴまたはＣｙｐＤポリペプチドを含む。アフィニティー特性を有するポ
リペプチドのいくつかの特異的な例は、限定なく、酵素（例えば、グルタチオン
−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ））およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓプロテインＡポリペプチドを含む。プロテインＡをコードする核酸
および免疫グロブリン定常領域についてアフィニティーを有する融合タンパク質
の構築におけるそれらの使用は、一般に、例えば、米国特許第５，１００，７８
８号に開示される。ＡＮＴおよびＣｙｐＤ融合タンパク質の構築のための他の有
用なアフィニティーポリペプチドは、ストレプトアビジン融合タンパク質（例え
ば、ＷＯ８９／０３４２２；Ｕ．Ｓ．５，４８９，５２８；Ｕ．Ｓ．５，６７２
，６９１；ＷＯ９３／２４６３１；Ｕ．Ｓ．５，１６８，０４９；Ｕ．Ｓ．５，
２７２，２５４および他に開示されるような）およびアビジン融合タンパク質（
例えば、ＥＰ ５１１，７４７を参照のこと）を含み得る。本明細書中および引
用された文献において提供されるように、ＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチド配
列は、全長融合ポリペプチドであり得る融合ポリペプチド配列、および、あるい
はそれらの改変体またはフラグメントであり得る融合ポリペプチド配列に融合さ
れ得る。
【００５７】 （核酸発現構築物） 本発明の核酸構築物は、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡ
、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）であり得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖
であり得、一本鎖であればコード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得
る。本明細書中で提供されるようなミトコンドリア細孔成分のコード配列は、当
該分野で公知である（例えば、以下の表１を参照のこと）。例えば、例示のため
に（限定ではない）、本発明に従って使用するためのＡＮＴまたはＣｙｐＤポリ
ペプチドをコードするコード配列は、上記のような、ならびに例えば、図１、７
、および８においてヒトＡＮＴ１［配列番号 ］、ヒトＡＮＴ２［配列番号 ］
、ヒトＡＮＴ３［配列番号 ］、ヒトＣｙｐＡ［配列番号 ］およびヒトＣｙｐ
Ｄ［配列番号 ］について示されているような、任意の所定のＡＮＴまたはＣｙ
ｐ（例えば、ＣｙｐＡもしくはＣｙｐＤ）について当該分野で公知のコード配列
に同一であり得るか、あるいは例えば図１、７、または８のｃＤＮＡと、遺伝子
暗号の重複性もしくは同義性の結果として、同じＡＮＴまたはＣｙｐポリペプチ
ドをコードする、異なるコード配列であり得る。
【００５８】 ＡＮＴまたはＣｙｐＤポリペプチドをコードする核酸配列は、以下を含む配列
を包含するが、これらに限定されない：ＡＮＴまたはＣｙｐＤポリペプチドのコ
ード配列のみ；ＡＮＴまたはＣｙｐＤポリペプチドのコード配列およびさらなる
コード配列；ＡＮＴまたはＣｙｐＤポリペプチドのコード配列（および必要に応
じてさらなるコード配列）および非コード配列（例えば、イントロンまたはＡＮ
ＴまたはＣｙｐＤポリペプチドのコード配列の５’および／または３’の非コー
ド配列（例えば、調節され得る調節核酸配列、外部で調節されるかまたは調節可
能なプロモーター、エンハンサー、他の転写調節配列、リプレッサー結合配列、
翻訳調節配列または任意の他の調節核酸配列））。従って、用語「ＡＮＴポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド」および「ＣｙｐＤポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド」は、それぞれのポリペプチドのコード配列のみを含むポ
リヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列および／または非コード配列を含
むポリヌクレオチドを包含する。 本発明はさらに、本明細書中に記載のポリヌクレオチドの改変体に関し、これ
は、ネイティブなＡＮＴポリペプチドおよびＣｙｐＤポリペプチドのフラグメン
ト、アナログ、または誘導体をコードし得る。例えば、図２および８［配列番号 ］の推定アミノ酸配列を有するヒトＡＮＴ１、ＡＮＴ２およびＡＮＴ３ポリペ
プチドならびにヒトＣｙｐＤポリペプチド、または任意のＡＮＴおよびＣｙｐＤ
ポリペプチドが使用され得る。ＡＮＴおよびＣｙｐＤをコードする核酸配列の改
変体は、核酸の天然に生じる対立遺伝子改変体または天然に生じない改変体であ
り得る。当該分野で公知であるように、対立遺伝子改変体は、１つ以上のヌクレ
オチドの少なくとも１つの置換、欠失、もしくは付加（これらのいずれもが、コ
ードされるＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチドの機能を実質的に変更しない）を
有し得る核酸配列の代替の形態である。従って、本発明は、例えば、図２および
８［配列番号 ］に示されるのと同じＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチドをコー
ドする核酸、ならびにこのような核酸の改変体（この改変体は、図２および８［
配列番号 ］のポリペプチドのいずれかのフラグメント、誘導体、またはアナロ
グをコードする）を包含する。
【００５９】 ＡＮＴおよびＣｙｐＤの改変体および誘導体は、それぞれＡＮＴおよびＣｙｐ
Ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の変異により得られ得る。ネイテ
ィブなアミノ酸配列の変更は、多数の従来の方法のいずれかによって達成され得
る。変異は、ネイティブ配列のフラグメントへの連結を可能にする制限部位に隣
接して変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の遺
伝子座で導入され得る。連結後、得られる再構築配列は、所望のアミノ酸挿入、
置換、または欠失を有するアナログをコードする。
【００６０】 あるいは、オリゴヌクレオチドに指向された部位特異的変異誘発手順は、変更
された遺伝子を提供するために使用され得、ここで、所定のコドンは、置換、欠
失、または挿入によって変更され得る。このような変更を作製するための例示的
な方法は、Ｗａｌｄｅｒら（Ｇｅｎｅ ４２：１３３，１９８６）；Ｂａｕｅｒ
ら（Ｇｅｎｅ ３７：７３，１９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ，１９８５年１月，１２−１９）；Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎ
ｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８１）；Ｋｕｎｋｅｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８，１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７，１９８７）；ならびに米国特許第
４，５１８，５８４号および同第４，７３７，４６２によって開示される。
【００６１】 アミノ酸残基または配列の種々の付加または置換、あるいは生物学的活性に必
要でない末端残基または内部残基または配列の欠失をコードする等価なＤＮＡ構
築物はまた、本発明に含まれる。例えば、生物学的活性に必須ではないＣｙｓ残
基をコードする配列は、欠失または他のアミノ酸で置換されるＣｙｓ残基を生じ
るために変更され得、復元の際の不正確または所望でない分子内ジスルフィド架
橋の形成を防止する。他の均等物は、隣接する二塩基性アミノ酸残基の改変によ
って調製され得、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を増
大する。ＥＰ ２１２，９１４は、タンパク質におけるＫＥＸ２プロテアーゼプ
ロセシング部位を不活性化するための部位特異的変異誘発の使用を開示する。Ｋ
ＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位は、残基を欠失、付加または置換し、Ａｒ
ｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、およびＬｙｓ−Ａｒｇ対を変更し、これらの隣接
する塩基性残基の出現を除去することによって不活性化される。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
対形成は、ＫＥＸ２切断に対してほとんど感受性でなく、そしてＡｒｇ−Ｌｙｓ
またはＬｙｓ−Ａｒｇの、Ｌｙｓ−Ｌｙｓへの転化は、ＫＥＸ２部位の不活性化
のための保存的かつ好ましいアプローチを表す。
【００６２】 短縮型分子（例えば、短縮型のＡＮＴまたはＣｙｐＤポリペプチドあるいは核
酸）は、この分子の全長バージョン未満を含む任意の分子であり得る。特定の好
ましい実施形態において、本発明は、短縮型のＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチ
ドを提供し、そして特定の実施形態において、本発明は、このような短縮型ポリ
ペプチドをコードする核酸を提供する。短縮型核酸分子は、全長未満の既知また
は記載される核酸分子のヌクレオチド配列を有し、ここで、このような既知また
は記載される核酸分子は、当業者がこれを全長分子であるとみなす限り、天然に
存在するか、合成核酸分子であるか、または組換え核酸分子であり得る。
【００６３】 従って、例えば、遺伝子配列に対応する短縮型核酸分子は、全長未満の遺伝子
を含み、ここで、この遺伝子は、コード配列および非コード配列、プロモーター
、エンハンサーおよび他の調節配列、隣接配列など、ならびに遺伝子の一部とし
て認識される他の機能的および非機能的配列を含む。別の例において、ｍＲＮＡ
配列に対応する短縮型核酸分子は、全長未満のｍＲＮＡ転写物（これは、種々の
翻訳領域および非翻訳領域、ならびに他の機能的および非機能的配列を含み得る
）を含む。他の好ましい実施形態において、短縮型分子は、特定のタンパク質の
全長未満のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。本明細書中で使用される場
合、「欠失」は、当業者によって理解されるようなその通常の意味を有し、そし
て、対応する全長分子（例えば、本明細書中で提供される短縮型分子の場合）と
比較して、いずれかの末端または非末端領域から配列の１つ以上の部分が欠如し
た分子をいい得る。直鎖状の生物学的ポリマー（例えば、核酸分子またはポリペ
プチド）の短縮型分子は、この分子のいずれかの末端からの欠失、またはこの分
子の非末端領域からの欠失のうちの１つ以上を有し得、ここで、このような欠失
は、１〜１５００個連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基、好ましくは１〜
５００個連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基、そしてより好ましくは１〜
３００個連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基の欠失であり得る。
【００６４】 ＡＮＴおよびＣｙｐＤ短縮化欠失変異体の分析は、本明細書中で提供されるよ
うに、特定の機能的特性（例えば、ＡＮＴ、シクロスポリンＡおよび／またはＶ
ＤＡＣへのＣｙｐＤの結合を媒介し得るポリペプチド領域を含む）の原因である
ＡＮＴおよびＣｙｐＤ構造ドメインの同定を可能にする（Ｃｒｏｍｐｔｏｎら，
１９９８ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５８：７２９）。従って、ＡＮＴお
よびＣｙｐＤ短縮化欠失変異体の使用は、ミトコンドリアの分子成分の間のイン
ビトロ結合相互作用および／またはミトコンドリアのインビボの機能の分子の微
細な調節を可能にする。従って、本発明の特定の実施形態において、ＡＮＴおよ
び／またはＣｙｐＤ短縮化欠失変異体を用いてトランスフェクトされた細胞にお
ける、ＭＰＴの誘導物質に対して直接的に変更された（例えば、増加または減少
した）細胞応答は、特定のミトコンドリア機能（例えば、ＥＴＣ活性、酸素消費
、ＡＴＰ生成、変更したミトコンドリア膜電位、変更したミトコンドリアの透過
性、アポトーシスの誘導など）を有する特定のＡＮＴまたはＣｙｐＤ構造ドメイ
ンの存在の相関関係を可能にする。特定の他の実施形態において、ＡＮＴおよび
ＣｙｐＤの単離された組換え短縮型形態間のインビトロで検出可能に変更された
結合は、分子の相互作用（例えば、認識および結合など）に貢献する特定のＡＮ
ＴおよびＣｙｐＤ構造ドメインの同定を可能にする。また、本明細書中でより詳
細に記載されるように、短縮型のＡＮＴおよび／またはＣｙｐＤポリペプチドな
らびに核酸は、ＡＮＴおよび／またはＣｙｐＤの機能的活性を変更する因子を同
定するために設計されるスクリーニングアッセイにおける使用のための分子標的
を提供する。
【００６５】 本発明はさらに、本明細書中で提供されるＡＮＴまたはＣｙｐＤをコードする
ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸配列に関する。好ましくは、こ
のような配列は、ネイティブのＡＮＴまたはＣｙｐＤ配列に対して、少なくとも
７０％、好ましくは少なくとも９０％、そしてより好ましくは少なくとも９５％
の同一性を示す。より好ましくは、このような核酸配列は、ストリンジェントな
条件下で、ネイティブのＡＮＴまたはＣｙｐＤをコードする核酸配列にハイブリ
ダイズする。本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」は
、少なくとも９５％、および好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存
在する場合のみにハイブリダイゼーションが起こることを意味する。ＡＮＴまた
はＣｙｐＤをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするこの核酸配列は
、好ましい実施形態において、図１または８［配列番号＿］のｃＤＮＡによって
コードされるＡＮＴまたはＣｙｐＤポリペプチドの、生物学的機能または活性を
実質的に保持するポリペプチドをコードする。
【００６６】 本明細書中で使用される場合、２つのヌクレオチド配列は、特定のストリンジ
ェンシー条件下で安定なハイブリッドが形成される場合に「ハイブリダイズ」す
るといわれる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、代表的には、
このようなハイブリッドがアニールおよび洗浄されるイオン強度および温度の条
件において表される。代表的には、「高」、「中程度」、および「低」ストリン
ジェンシーは、以下の条件またはその等価な条件を含む：高ストリンジェンシー
：０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、６５℃；中程度のストリ
ンジェンシー：０．２×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、５０℃：お
よび低ストリンジェンシー：１．０×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ
、５０℃。
【００６７】 本発明はまた、核酸ベクターおよび本発明の核酸配列を含む構築物（特に、上
記に提供されるようなＡＮＴまたはＣｙｐＤポリペプチドをコードする任意のポ
リヌクレオチドを含む「核酸発現構築物」）；本発明のベクターおよび／または
構築物を用いて遺伝子操作された宿主細胞、ならびに生化学的技術および遺伝的
技術によるＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチドの産生およびスクリーニングにお
ける使用に関する。ＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチドは、哺乳動物細胞、酵母
、細菌または他の細胞において適切なプロモーターの制御下で発現され得る。無
細胞翻訳系はまた、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを使用してこのようなタ
ンパク質を生成するために使用され得る。原核生物および真核生物宿主を用いる
使用のための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えば、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８９）によって記載され、そしてプラスミド、コ
スミド、シャトルベクター、ウイルスベクター、および本明細書中で開示される
ような染色体複製起源を含むベクターを含み得る。
【００６８】 本発明の核酸発現構築物は、ＡＮＴおよび／またはＣｙｐＤポリペプチド（例
えば、本明細書中に記載されるような、ＭＰＴを変更する因子についてのスクリ
ーニングにおいて有用な融合タンパク質）をコードし得る。従って、核酸発現構
築物は、エネルギー伝達分子ポリペプチドに融合されたＡＮＴまたはＣｙｐＤポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結するプロモーターを
含み得る。第１のエネルギー伝達分子ポリペプチドに融合されたＡＮＴポリペプ
チドおよび第２のエネルギー伝達分子ポリペプチドに融合されたＣｙｐＤポリペ
プチドの両方を発現する、以下に記載されるような宿主細胞（そしてここで、適
切な第１および第２エネルギー伝達分子ポリペプチドは、本明細書中に記載され
るように選択される）は、例えば、ＭＰＴを変更する因子を同定するためのＦＲ
ＥＴアッセイにおいて使用され得る。一般に、核酸発現ベクターは、宿主細胞の
検出可能な形質転換を可能にする複製起源および選択マーカー（例えば、Ｅ．ｃ
ｏｌｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＲＰ１遺伝子のアンピシリン耐性遺
伝子）、ならびに下流構造配列の転写を指向するための高度に発現された遺伝子
由来のプロモーターを含む。このようなプロモーターは、糖分解酵素（例えば、
とりわけ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α因子、酸ホスファター
ゼ、または熱ショックタンパク質）をコードするオペロン由来であり得る。異種
構造配列は、翻訳開始配列および終結配列を用いて適切な期で構築される。必要
に応じて、この異種配列は、所望の特徴（例えば、発現される組換え産物の安定
化または精製の単純化）を付与するＮ末端（またはＣ末端）同定ペプチドを含む
融合タンパク質をコードし得る。
【００６９】 細菌での使用のための発現構築物は、機能的プロモーターを用いて、作動可能
な読み出し期において、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと一緒
に所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を発現ベクターに挿入すること
によって構築され得る。この構築物は、ベクター構築物の維持を保証するために
、そして所望の場合、この宿主内での増幅を提供するために、１つ以上の表現型
選択マーカーおよび複製起源を含み得る。形質転換のために適切な原核生物宿主
としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの属内の種々の種が
挙げられるが、他のものもまた、選択できるものとして使用され得る。任意の他
のプラスミドまたはベクターは、それらが宿主中で複製可能かつ生存可能である
限り、使用され得る。
【００７０】 代表的であるが非限定的な例として、細菌での使用のための発現ベクターは、
周知のクローニングベクター ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝的
エレメントを含む市販のプラスミド由来の選択マーカーおよび細菌複製起源を含
み得る。このような市販のベクターとしては、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅ
ｎ）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，
ＵＳＡ）が挙げられる。これらのｐＢＲ３２２「幹」部分は、適切なプロモータ
ーおよび発現される構造配列と組み合わされ得る。
【００７１】 他のベクターおよび構築物は、染色体、非染色体、および合成のＤＮＡ配列（
例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイル
ス；酵母プラスミド；酵母人口的染色体（ＹＡＣ）；プラスミドおよびファージ
ＤＮＡの組み合わせ由来のベクター；プラスミドおよびウイルスＤＮＡの組み合
わせ由来のシャトルベクター：ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニア、アデノウ
イルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病）を含む。しかし、任意の他のベクタ
ーは、これが目的の宿主細胞において複製可能かつ生存可能である限り、核酸発
現構築物の調製のために使用され得る。さらに、いくつかの好ましい実施形態に
おいて、ＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチドのためのポリヌクレオチドコード配
列を含む核酸発現構築物、ならびに融合タンパク質は、染色体外のままであり得
、そして別の好ましい実施形態において、発現構築物は、少なくとも１つの宿主
細胞の染色体に組み込まれ得る。
【００７２】 適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によってベクターに挿入され得る。一般に、
ＤＮＡ配列は、当該分野で公知の手順によって、適切な制限エンドヌクレアーゼ
部位に挿入され得る。クローニング、ＤＮＡの単離、増幅および精製、ＤＮＡリ
ガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどに関する酵素反応に
ついての標準的な技術、ならびに種々の分離技術は、当業者に公知でありそして
通常利用される技術である。多くの標準的な技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら
（１９９３ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．＆Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら（１９８９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖ
ｉｅｗ，ＮＹ）；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐ
ｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）；および他の個所に記載される。
【００７３】 発現ベクターにおけるコード配列は、ｍＲＮＡ合成を指向するために、少なく
とも１つの適切な発現制御配列（例えば、プロモーター、制御されたプロモータ
ーおよび／または外部から制御されたプロモーター）に作動可能に連結される。
このような発現制御配列の代表例としては、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター
、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃまたはｔｒｐ、ファージλ ＰLプロモーターおよび原
核生物または真核生物の細胞またはそのウイルスにおいて遺伝子の発現を制御す
ることが公知の他のプロモーターが挙げられる。プロモーター領域は、ＣＡＴ（
クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有す
る他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切
なベクターは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特に有名な細菌プロモ
ーターとしては、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰR、λＰLおよ
びｔｒｐが挙げられる。真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ前初期（例えば
、シャトルベクターｐＥＹＦＰ−Ｃ１およびｐＥＣＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）中に提
供される）、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイル
ス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−１が挙げられる。適切なベク
ターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベル内であり、そしてＡＮ
Ｔおよび／またはＣｙｐＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可
能に連結された少なくとも１つのプロモーターまたは制御されたプロモーターを
含む特定の特に好ましい核酸発現構築物の調製が、本明細書中に記載される。
【００７４】 特定の好ましい実施形態において、発現制御配列は、「外部から制御されるプ
ロモーター」であり、これはさらなるエレメント、因子、分子、成分、補因子な
どによって変更（例えば、増加または減少）され得る活性を有する機能的プロモ
ーター配列を含む。外部から制御されるプロモーターは、例えば、リプレッサー
結合部位、アクチベーター結合部位または本明細書中で提供されるポリヌクレオ
チド配列の発現を制御する任意の他の制御配列を含み得る。特定の特に好ましい
実施形態において、この外部から制御されるプロモーターは、当業者に公知であ
り、例えば、Ｇｕｚｍａｎら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９５，１７７：
４１２１）、Ｃａｒｒａら（ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９３，１２：３５）、Ｍａｙ
ｅｒ（Ｇｅｎｅ，１９９５，１６３：４１）、Ｈａｌｄｉｍａｎｎら（Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９８，１８０：１２７７）、Ｌｕｔｚら（Ｎｕｃ．Ａｃ
．Ｒｅｓ．，１９９７，２５：１２０３）、Ａｌｌｇｏｏｄら（Ｃｕｒｒ．Ｏｐ
ｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７，８：４７４）およびＭａｋｒｉｄｅ
ｓ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９６，６０：５１２）に記載されるよ
うに、特異的誘導性であり、誘導シグナルの非存在下でその制御下でポリヌクレ
オチド配列の転写をほとんどまたは全く行わない、厳重に制御されるプロモータ
ーである。本発明の他の好ましい実施形態において、誘導性であるが厳密には制
御され得ない外部から制御されるプロモーターが存在する。特定の他の好ましい
実施形態において、本発明の組換え発現構築物にプロモーターが存在し、これは
制御されるプロモーターではない；このようなプロモーターとしては、例えば、
構成的プロモーター（例えば、昆虫ポリヘドリンプロモーターまたは酵母ホスホ
グリセリン酸キナーゼプロモーター）が挙げられ得る（例えば、Ｇｉｒａｕｄら
，１９９８ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８１：４０９を参照のこと）。核酸発現
構築物はまた、翻訳開始および転写終結のためのリボソーム結合部位を含み得る
。ベクターはまた、発現の増幅のための適切な配列を含み得る。
【００７５】 高等な真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の転写を
、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加させ得る。エンハン
サーは、ＤＮＡのｃｉｓ−活性エレメント（通常、約１０〜３００ｂｐ）であり
、これは、その転写を増加させるためにプロモーター上で作用する。例としては
、複製起点ｂｐ１００〜２７０の後部上のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロ
ウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後部上のポリオーマエンハ
ンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【００７６】 上記のように、特定の実施形態において、このベクターは、レトロウイルスベ
クターのようなウイルスベクターであり得る。例えば、レトロウイルスプラスミ
ドベクターが誘導され得るレトロウイルスには、モロニーマウス白血病ウイルス
、脾臓壊死ウイルス、レトロウイルス、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ
肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫
不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルス
が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】 ウイルスベクターは、一般に、１以上のプロモーターを含む。適切なプロモー
ターには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：レトロウイルスＬＴＲ
；ＳＶ４０プロモーター；およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモー
ター（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０（１
９８９）に記載される）、または任意の他のプロモーター、例えば、真核生物細
胞プロモーターのような細胞プロモーター（ヒストン、ｐｏｌ ＩＩＩ、および
βアクチンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない）。他のウイル
スプロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）プロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターが挙げられるが、
これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本願明細書中に含まれる
技術から当業者に理解され、そして調節プロモーターまたは上記のようなプロモ
ーターのいずれかの中から選択され得る。
【００７８】 レトロウイルスプラスミドベクターを使用して、パッケージング細胞株を形質
導入し、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッケー
ジング細胞株の例としては、その全体が本明細書中で参考として援用される、Ｍ
ｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅａｐｙ、１：５〜１４（１９９０）
にて記載されるようなＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、
Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−
８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これらに限定
されない。このベクターは、当該分野で公知の任意の手段により、パッケージン
グ細胞を形質導入し得る。そのような手段としては、エレクトロポレーション、
リポソームの使用、およびＣａＰＯ4沈殿が挙げられるが、それらに限定されな
い。１つの代替法において、このレトロウイルスプラスミドベクターをリポソー
ムにカプセル化するか、または脂質に結合して、次いで宿主に投与し得る。
【００７９】 このプロデューサー細胞株は、ＡＮＴおよび／またはＣｙｐＤポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド配列を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産
生する。次いで、そのようなレトロウイルスベクター粒子を使用して、インビト
ロまたはインビボのどちらかにおいて、真核生物細胞を形質導入し得る。この形
質導入された真核生物細胞は、一般に、ＡＮＴおよび／またはＣｙｐＤポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド配列を発現する。形質導入され得る真核生物
細胞としては、真核生物幹細胞、真核生物癌細胞、および造血幹細胞、肝細胞、
線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支の上皮細胞が
挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】 ウイルスベクターが、ＡＮＴおよびＣｙｐＤの核酸発現構築物を調製するため
に使用される本発明の実施形態の別の例として、ＡＮＴまたはＣｙｐＤポリペプ
チドの発現に関する組換えウイルス構築物によって形質導入された宿主細胞は、
ウイルスの発芽の間にウイルス粒子によって取り込まれた宿主細胞株の一部から
誘導される、発現したＡＮＴおよび／またはＣｙｐＤポリペプチドを含むウイル
ス粒子を産生し得る。別の好ましい実施形態において、ＡＮＴ−またはＣｙｐＤ
−コードポリペプチド配列は、バキュロウイルスシャトルベクターにクローニン
グされ得、次いで、組換えバキュロウイルス発現構築物を産生するために、バキ
ュロウイルスを用いて組換えし、これを使用して、例えば、Ｓｆ９宿主細胞を感
染する（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３９巻、Ｃ
ｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｄ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｈｕｍａｎ
Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９５；Ｐｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ，
「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅ
ｌｌ Ｕｓｉｎｇ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ」、第ＩＩ節、第１
６章、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２，１６−３２ ｔｏ １６−４
８頁に記載されている）。
【００８１】 適切な宿主株の形質導入および適切な細胞密度に対する宿主細胞の増殖後に、
選択されたプロモーター（それが、外部的に制御されたプロモーターである場合
）は、適切な手段で（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）によって導入され
、そして細胞が、さらなる期間、培養される。代表的に、細胞を遠心分離により
回収して、物理学的手段または化学的手段により壊し、そして得られた粗抽出物
を、さらなる精製のために保持した。タンパク質の発現において使用した微生物
細胞を、任意の従来の方法（凍結乾燥サイクル（ｆｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗ ｃｙ
ｃｌｉｎｇ）、音波破砕、機械的崩壊、または細胞溶解剤（このような方法は、
当業者に周知である））によって壊した。
【００８２】 （宿主細胞） 上記のように、上記のＡＮＴおよびＣｙｐＤ発現構築物を含む宿主細胞ならび
にＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチドを調製するため方法はまた、本発明に包含
される。宿主細胞は、一般に、１以上のベクターおよび／または上記のような発
現構築物を用いて遺伝子操作（形質移入、形質転換、またはトランスフェクト）
される。遺伝子操作された宿主細胞を、プロモーターを活性化するため、形質転
換株を選択するため、または特定の遺伝子（ＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチド
をまたは融合タンパク質をコードする遺伝子）を増幅するために適切なものとし
て、改変された従来の栄養培地中で培養し得る。特定の宿主細胞のために適切な
培養条件は、当業者に容易に理解される。本明細書中で提供されるような、ＡＮ
Ｔおよび／またはＣｙｐＤ融合タンパク質を含む、ＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペ
プチドを調製するために、ＡＮＴまたはＣｙｐＤポリペプチドをコードする核酸
発現構築物を含む宿主細胞が、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養さ
れる。次いで、ＡＮＴまたはＣｙｐＤポリペプチドを培地から回収する。
【００８３】 宿主細胞を、アッセイにおいてさらに使用して、ＡＮＴポリペプチドとＣｙｐ
Ｄポリペプチドとの間の相互作用を検出する。一般に、このような宿主細胞は、
ＡＮＴおよびＣｙｐＤ融合タンパク質（各々、エネルギー伝達分子を含む）を発
現する。好ましくは、このエネルギー伝達分子は、異なる波長において励起およ
び発光最大を有する。最も好ましい実施形態において、ＡＮＴおよびＣｙｐＤポ
リペプチドに融合されたこのエネルギー伝達分子は、緑色の蛍光タンパク質（Ｇ
ＦＰ）および色素シフトしたその誘導体（例えば、ＹＦＰ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、お
よびＲＦＰ（公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９８／０６７３７を参照のこと））であ
り得る。特定の局面において、発現したＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチド内に
存在するこのエネルギー伝達分子は、約３００ｎｍ〜６５０ｎｍの範囲の波長に
励起最大を有し、そして約３５０ｎｍ〜６７５ｎｍの範囲に発光最大を有する。
好ましい実施形態において、１つのエネルギー伝達分子は、約４００ｎｍ〜５０
０ｎｍの範囲に励起最大を有し、そして約４５０ｎｍ〜５２５ｎｍの範囲に発光
最大を有し、そして第２のエネルギー伝達分子は、約４５０ｎｍ〜５２５ｎｍの
範囲に励起最大を有し、そして約５００ｎｍ〜約５５０ｎｍの範囲に発光最大を
有する。より好ましい実施形態において、１つのエネルギー伝達分子は、約４３
３ｎｍに励起最大を有し、そして約４７５ｎｍの波長に発光最大を有し、そして
第２のエネルギー伝達分子は、約５１３ｎｍの波長に励起最大を有し、そして約
５２７ｎｍの波長に発光最大を有する。好ましくは、２つのエネルギー伝達分子
の励起／発光スペクトルが重なり合い、その結果、ＣｙｐＤポリペプチドとＡＮ
Ｔポリペプチドとの結合により、エネルギー伝達分子の間の検出可能なエネルギ
ー伝達が得られる。
【００８４】 例えば、ＭＰＴを変更させる薬剤を同定するための宿主細胞は、野生型ＧＦＰ
のシアンシフト誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合されたヒトＣｙｐＤ
ポリペプチド（ＣＦＰ、すなわち、第１エネルギー伝達分子ポリペプチド）をコ
ードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを有する第１核酸
発現構築物および野生型ＧＦＰの黄色シフト誘導体をコードするポリヌクレオチ
ドに融合されたヒトＡＮＴ３（ｈｕＡＮＴ３）ポリペプチド（ＹＦＰ、すなわち
、第２エネルギー伝達分子ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドに作動
可能に連結したプロモーターを有する第２核酸発現構築物を含み得る。ＣＦＰエ
ネルギー伝達分子は、４３３ｎｍの励起最大を有し、そして４７５ｎｍの発光最
大を有する一方で、ＹＦＰは、５２７ｎｍの発光最大を有する。４３３ｎｍの波
長の光は、ＣＦＰを励起するのに十分であるが、ＹＦＰを励起するのには、十分
でなく、しかし、ＣＦＰによって４７５ｎｍで発光された光は、ＹＦＰを励起し
て、５２７ｎｍの光を発光するのに十分である。従って、このようなｈｕＡＮＴ
３およびＣｙｐＤ融合タンパク質を発現する宿主細胞は、適切な励起エネルギー
（すなわち、４３３ｎｍの光）に曝露され得、そしてこの融合タンパク質が、隣
接する場合、または相互作用する場合、発光スペクトルＣＦＰ（ドナー発蛍光団
）が励起スペクトルＹＦＰ（アクセプター発蛍光団）と重なり合い、その結果と
して、検出可能なエネルギー伝達（すなわち、５２７ｎｍでの蛍光）が得られる
。ｈｕＡＮＴ３およびＣｙｐＤ融合タンパク質は、例えば、相互作用を絶ち切る
薬剤に起因して、隣接しない場合、または相互作用しない場合、４７５ｎｍに発
光が存在し、検出可能なエネルギー伝達の欠如を示す。増加した発光または減少
した（クエンチされた）発光のいずれかが、検出され得る。
【００８５】 宿主細胞は、より高等な真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、もしくはよ
り下等な真核生物細胞（例えば、酵母細胞）であり得、またはこの宿主細胞は、
原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。本発明に従う、適切な宿主細胞
の代表的な例は、微生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｖｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば、酵
母）；昆虫細胞（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓ
ｆ９）；動物細胞（例えば、ＭＤＣＫ、Ｈｅｐ−２、ＣＨＯもしくはＣＯＳ（例
えば、ＣＯＳ−７））；ヒト細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔもしくは２９３細胞）
；アデノウイルス；植物細胞、またはインビトロでの伝播にすでに順応されたか
、または、このように新規に構築された任意の適切な細胞が挙げられるが、これ
らに限定されない。適切な宿主の選択は、本明細書の技術から当業者の範囲内で
あることが理解される。
【００８６】 種々の哺乳動物細胞の培地系をまた使用して、組換えタンパク質を発現し得る
。哺乳動物の発現系の例は、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ ２３：１７５（１９８
１）に記載されるようなサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株、および適合性ベク
ター（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株）を発
現し得る他の細胞株を含む。哺乳動物の発現ベクターは、複製の起点、適切なプ
ロモーターおよびエンハンサーを含み、そしてまた、任意の必要なリボソーム結
合部位、ポリアデニル化部位、スプライシングドナーおよびアクセプター部位、
転写性末端配列、および５’側方非転写性配列（例えば、ＡＮＴおよびＣｙｐＤ
発現構築物の調製に関して、本明細書中に記載される）を含む。ＳＶ４０スプラ
イス由来のＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要な非転写性
遺伝子エレメントを提供する。この構築物を宿主細胞に導入することは、当業者
に公知の種々の方法によって実施され、この方法としては、例えば、カルシウム
ホスフェートトランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、裸
のＤＮＡを用いたトランスフェクション、微粒子銃媒介トランスフェクション、
ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ媒介トランスフェクション、またはエレクトロボレー
ション（例えば、Ｄａｖｉｓら、１９８６ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）が挙げられるが、これらに限定されない
。本発明の開示に従って、および当業者に理解されるように、特定の実施形態に
おいて、少なくとも１個の宿主細胞中の核酸発現構築物は、染色体外であり、一
方で、特定の実施形態において、少なくとも１個の宿主細胞中の核酸発現構築物
は、宿主細胞染色体中に一体化され得る。特定の実施形態において、この宿主細
胞の染色体は、核酸染色体を有し、そして特定の実施形態において、この宿主細
胞染色体は、上記のように、ミトコンドリア染色体を含む。
【００８７】 ある好ましい実施形態において、宿主細胞は、細胞質雑種（例えば、共通の核
酸成分を含むが、異なる個体由来のミトコンドリアを有する細胞質ハイブリット
細胞）であり得る。細胞質雑種を調製するため、および使用するための方法は、
米国特許第５，８８８，４３８号、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９５／２６９７３
およびＷＯ９８／１７８２６、ＫｉｎｇおよびＡｔｔａｒｄｉ（Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４６：５００−５０３、１９８９）、Ｃｈｏｍｙｎら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．１１：２２３６−２２４４、１９９１）、Ｍｉｌｌｅｒら（Ｊ．Ｎｅ
ｕｒｏｃｈｅｍ．６７：１８９７−１９０７、１９９６）、Ｓｗｅｒｄｌｏｗら
（Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４０：６６３−６７１，１９９６
）、Ｃａｓｓａｒｉｎｏら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３
６２：７７−８６，１９９７）、Ｓｗｅｒｄｌｏｗら（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４
９：９１８−９２５、１９９７）、Ｓｈｅｅｈａｎら（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ
．６８：１２２１−１２３３、１９９７）およびＳｈｅｅｈａｎら（Ｊ．Ｎｅｕ
ｒｏｓｃｉ．１７：４６１２−４６２２、１９９７）に記載される。
【００８８】 当業者に理解されるように、特定の状況において、内因性ＡＮＴおよび／また
はＣｙｐＤ発現が妥協して処理される宿主細胞を使用することが所望され得る。
例えば、特定のＡＮＴ−および／またはＣｙｐＤ−コード核酸配列あるいはＡＮ
Ｔおよび／またはＣｙｐＤポリペプチド（これは、宿主細胞ゲノムによってコー
ドされるポリペプチドと高度に類似している）は、宿主細胞ＡＮＴおよび／また
はＣｙｐＤ遺伝子発現を阻害することによって容易にされ得る。別の実施形態に
おいて、内因的に導入された組換えＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチドの機能活
性が宿主細胞中で決定される場合、内因性宿主細胞ＡＮＴおよび／またはＣｙｐ
Ｄ遺伝子発現を阻害することがまた、利点があり得る。
【００８９】 従って、本発明の特定の実施形態において、宿主細胞は、内因性ＡＮＴおよび
／またはＣｙｐＤの少なくとも１個のアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）を欠失
し得、そして特定の好ましい実施形態において、宿主細胞は、内因性ＡＮＴおよ
び／またはＣｙｐＤイソフォームの全てを欠失し得る。例えば、Ｇｉｒａｕｄら
（１９９８ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８１：４０９）によって記載される酵母
系において、全３つの酵母ＡＮＴイソフォームを欠失するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ３重ヌル改変体が記載され、嫌気的条件において成長し得ない。他の好まし
い実施形態において、内因性ＡＮＴおよび／またはＣｙｐＤイソフォームをコー
ドする少なくとも１個の遺伝子の宿主細胞中の発現は、実質的に障害性である。
内因性ＡＮＴおよびＣｙｐＤイソフォームの発現の実質的な障害は、特定の遺伝
子発現を阻害するために、当業者に周知の任意の種々の方法によって達成され得
、この方法としては、上記のような部位特異的または部位直接的突然変異誘発、
遺伝子発現のアンチセンス阻害、遺伝子発現のリボザイム媒介阻害、およびミト
コンドリアＤＮＡ劣化（ρ0）細胞の産生が挙げられる。
【００９０】 アンチセンス剤としての使用のためのオリゴヌクレオチドおよびリボザイムな
らびに遺伝子治療のための標的送達のための遺伝子をコードするＤＮＡを同定す
ることは、当業者に周知の方法を含む。例えば、このようなオリゴヌクレオチド
の記載された特性、長さおよび他の特徴は、周知である。アンチセンスヌクレオ
チドは、代表的に、このような結合を使用することで、内因性核酸酵素による分
解を阻害するように設定されており、このような結合としては、ホスホロチオエ
ート、メチルホスホネート、スルホン、スルフェート、ケチル、ホスホロジチオ
エート、ホスホルアミデート、ホスフェートエステルおよび他のこのような結合
（例えば、Ａｇｒｗａｌら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２８：３５３
９−３５４２（１９８７；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９３
：６６５７−６６６５（１９７１）；Ｓｔｅｃら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌ
ｅｔｔ．２６：２１９１−２１９４（１９８５）；Ｍｏｏｄｙら、Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：４７６９−４７８２（１９８９）；Ｕｚｎａｎｓｋｉ
ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４０：１３７−１４３（１９８４）：Ｅｃｋｓｔｅｉｎ
，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：３６７−４０２（１９８５）；Ｅ
ｃｋｓｔｅｉｎ，Ｔｒｅｎｄ Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１４：９７−１００（１９８
９）；Ｓｔｅｉｎ：Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ａｎｔｉｓ
ｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｃ
ｏｈｅｎ，Ｅｄ，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，９７−１１
７頁（１９８９）；Ｊａｇｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７：７２３７−
７２４６（１９８８）を参照のこと）。
【００９１】 アンチセンスヌクレオチドは、配列特異的様式で核酸（例えば、ｍＲＮＡまた
はＤＮＡ）に結合するオリゴヌクレオチドである。相補配列を有するｍＲＮＡに
結合する場合、アンチセンスは、ｍＲＮＡの翻訳を妨げる（例えば、Ａｌｔｍａ
ｎらに対する米国特許第５，１６８，０５３号；Ｉｎｏｕｙｅに対する米国特許
第５，１９０，９３１号、Ｂｕｒｃｈに対する米国特許第５，１３５，９１７号
；ダンベルアンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されるＳｍｉｔｈおよびＣｌ
ｕｓｅｌら（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：３４０５−３４
１１に対する米国特許第５，０８７，６１７号を参照のこと）。三重らせん分子
は、共直線三重らせん分子を形成し、それにより転写を妨げる二重らせんＤＮＡ
を結合する単一ＤＮＡ鎖を指す（例えば、二重らせんＤＮＡ上の標的部位に結合
する合成オリゴヌクレオチドを作製する方法が記載されるＨｏｇａｎらに対する
米国特許第５，１７６，９９６号を参照のこと）。
【００９２】 本発明のこの実施形態に従って、特に有用なアンチセンスヌクレオチドおよび
三重らせん分子は、ＡＮＴもしくはＣｙｐＤポリペプチドをコードするＤＮＡも
しくはｍＲＮＡのセンス鎖、または内因性のＡＮＴおよび／もしくはＣｙｐＤ遺
伝子の発現に関連する任意の他のプロセスを媒介する他のタンパク質（例えば、
ＡＮＴおよび／またはＣｙｐＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳の阻害
をこうむる）に相補的なあるいは結合する分子である。
【００９３】 リボザイムは、ＲＮＡ基質（例えば、ｍＲＮＡ）を特異的に切断し、その結果
細胞性遺伝子発現を特異的に阻害または干渉するＲＮＡ分子である。ＲＮＡ鎖の
切断および／または結合に関与する少なくとも５つの公知のクラスのリボザイム
がある。リボザイムは、任意のＲＮＡ転写物に対して標的化され得、そしてこの
ような転写物を触媒的に切断し得る（例えば、米国特許第５，２７２，２６２号
；米国特許第５，１４４，０１９号；ならびにＣｅｃｈらに対する米国特許第５
，１６８，０５３号、同第５，１８０，８１８号、同第５，１１６，７４２号お
よび同第５，０９３，２４６号を参照のこと）。本発明の特定の実施形態に従っ
て、任意のこのようなＡＮＴもしくはＣｙｐＤ ｍＲＮＡ特異的リボザイム、ま
たはこのようなリボザイムをコードする核酸は、宿主細胞へ送達され、ＡＮＴお
よび／またはＣｙｐＤ遺伝子発現の阻害をもたらし得る。従ってリボザイムなど
は、真核生物のプロモーター（例えば、真核生物ウイルスプロモーター）に連結
されたリボザイムをコードするＤＮＡによって宿主細胞へ送達され得、それによ
り核へ導入され、このリボザイムは、直接転写される。
【００９４】 本明細書で使用される場合、内因性ＡＮＴまたはＣｙｐＤアイソフォームをコ
ードする遺伝子の発現は、任意の上の阻害の方法によって実質的に減損される。
これは、細胞が実質的にしかし必然的に完全ではなく内因性ＡＮＴおよびＣｙｐ
Ｄアイソフォームをコードする機能的ＤＮＡもしくは機能的ｍＲＮＡ、または関
連したＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチドを奪われる場合である。ＡＮＴおよび
ＣｙｐＤアイソフォーム発現は、細胞が好ましくは内因性ＡＮＴおよびＣｙｐＤ
をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの少なくとも５０％が奪われる（上に記載さ
れるように高いストリンジェンシーハイブリダイゼーションを使用して測定され
る）か、またはＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチドが奪われる（本明細書に記載
されるようなウエスタン免疫ブロットによって測定される、例えば、Ｇｉｒａｕ
ｄら、１９９８ Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２８１：４０９をまた参照のこと）；
そしてより好ましくは内因性ＡＮＴおよびＣｙｐＤ ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはポ
リペプチドの少なくとも７５％が奪われる場合、実質的に減損される。最も好ま
しくは、細胞が、その内因性ＡＮＴおよびＣｙｐＤ ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または
ポリペプチドの＞９０％が奪われる場合、ＡＮＴおよびＣｙｐＤアイソフォーム
発現が、実質的に減損される。
【００９５】 あるいは、内因性ＡＮＴおよび／またはＣｙｐＤアイソフォームをコードする
遺伝子の発現は、ミトコンドリアＤＮＡ減損ρ0細胞の使用を介して実質的に減
損され得る。この細胞は、ミトコンドリア複製ができず、それにより機能的ＡＮ
ＴおよびＣｙｐＤポリペプチドを発現し続け得ない。ρ0細胞を生成する方法は
、公知であり、そして例えば、参考として援用されるＰＣＴ／ＵＣ９５／０４０
６３で見出され得る。
【００９６】 （スクリーニングアッセイおよびキット） 本発明は、ミトコンドリア透過性移行（ＭＰＴ）を変更する薬剤を同定する使
用のための組成物、方法およびキットを提供する。このようなスクリーニングお
よびアッセイは、ＡＮＴとＣｙｐＤポリペプチドとの間の結合（例えば、融合タ
ンパク質）に対する候補薬剤の効果を検出するために設計される。理論によって
結合させることを望まない場合、上に記載のようにＭＰＴを一部分調節し得るＡ
ＮＴとＣｙｐＤとの間の装置相互作用を考慮して、インビボ（例えば、インタク
ト宿主細胞において）およびインビボ（例えば、単離されたＡＮＴおよびＣｙｐ
Ｄの直接結合）におけるＡＮＴ−ＣｙｐＤ結合に基づくアッセイは、ＭＰＴの測
定を提供し得る。
【００９７】 本明細書で使用される場合、用語「スクリーニング」は、ＭＰＴを変化する（
例えば、増加するまたは減少する）薬剤を同定するために設計されたアッセイの
使用をいう。簡単には、ＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチドは、候補薬剤と接触
し、そしてＡＮＴとＣｙｐＤとの間の相互作用に対するこの薬剤の効果が、決定
される。このようなアッセイは、ＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチドを発現する
宿主細胞中で、または単離されたＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチドを使用して
実施され得る。ついで、ＡＮＴ−ＣｙｐＤ結合または相互作用に対する効果は、
モニターされ、候補薬剤の非存在下でコントロールアッセイと比較される（例え
ば、薬剤を送達するために使用されるビヒクルで処理された）。検出は、直接（
例えば、競合結合アッセイによって）または非直接（例えば、ミトコンドリア機
能またはＣｙｐＤポリペプチドに結合するＡＮＴポリペプチドの検出によって）
であり得る。
【００９８】 候補薬剤は、ＭＰＴを直接的（例えば、ＡＮＴ、ＣｙｐＤ、および／またはＡ
ＮＴ−ＣｙｐＤ複合体との物理的接触によって）または非直接的（例えば、１つ
以上の付加分子成分との相互作用によって（例えば、ミトコンドリア分子成分が
宿主細胞中に存在し、そこでこのような付加成分が薬剤との接触に応答してＡＮ
Ｔ−ＣｙｐＤ相互作用を変化する））に変化し得る。いくつかの実施形態におい
て、候補薬剤は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または低分子であり得る
。代表的に、そしてより好ましい実施形態（例えば、高いスループットスクリー
ニングについて）において、候補薬剤は、「ライブラリー」または化合物、組成
物もしくは分子のコレクションとして提供される。このような分子は、代表的に
「低分子」として当該分野で公知の化合物を含み、そして１０5ダルトン未満、
好ましくは１０4ダルトン未満およびさらにより好ましくは１０3ダルトン未満の
分子量を有する。例えば、試験化合物のライブラリーのメンバーは、多数のサン
プルに投与され得、各メンバーは、本明細書において提供されるような少なくと
も１つのＡＮＴポリペプチドまたは融合タンパク質および少なくとも１つのＣｙ
ｐＤポリペプチドまたは融合タンパク質を含み、ついで細胞ベースアッセイにお
いてＭＰＴを変化するまたは非細胞ベース（例えば、インビトロ）アッセイにお
いてＡＮＴ−ＣｙｐＤ結合を高めるまたは阻害する能力についてアッセイされる
。
【００９９】 さらに、候補薬剤は、無作為配列ライブラリーのメンバーとして提供され得る
。好ましくは、このライブラリーが、多数の反応容器内で実施される多数の前も
って決定された化学反応に従って調整された合成薬剤を含む。例えば、種々の開
始化合物は、１つ以上の固相合成、記録されたランダム混合方法論および所定の
成分が追跡可能に多数の反応条件の順列および／または組み合わせをこうむり得
る記録された反応分離技術を使用して調整され得る。生じた産物は、反復選択お
よび合成手順に続いてスクリーニングされ得るライブラリー（例えば、ペプチド
（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０８６９４およびＰＣＴ／ＵＳ９１／０４６６６
を参照のこと）または本明細書中に提供されるような低分子を含み得る他の組成
物（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０８５４２、欧州特許第０７７４４６４号、米
国特許第５，７９８，０３５号、米国特許第５，７８９，１７２号、米国特許第
５，７５１，６２９号を参照のこと）の合成組み合わせライブラリー）を含む。
当業者は、このようなライブラリーの多様な組み合わせが、確立された手順に従
って調整され、そしてＣＳＰ標的（例えば、ｐ９５．６／ＹＮ５２ポリペプチド
）または本開示に従うホモログを使用して試験され得ることを理解する。
【０１００】 特定の局面において、スクリーニング方法は、ＡＮＴのＣｙｐＤへの検出可能
な結合を可能にするのに十分な条件下および時間において、ＡＮＴおよびＣｙｐ
Ｄポリペプチドを接触させる工程を包含する。このアッセイは、候補薬剤の存在
および非存在下で行われ、候補薬剤のＡＮＴ−ＣｙｐＤ結合に及ぼす影響は、こ
の薬剤の存在および非存在下におけるＣｙｐＤのＡＮＴへの結合のレベルを比較
することによって評価される。
【０１０１】 ポリペプチド間の結合相互作用を検出ための、当該分野で公知の種々のアッセ
イフォーマットが存在する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。１実施形態
において、１つのポリペプチドが、ビーズ、マトリクス、細胞、オルガネラ（例
えば、以下でより詳細に記載されるようなミトコンドリア粒子またはサブミトコ
ンドリア粒子）またはリポソームのような膜ベシクル、タンパクリポソーム、天
然もしくは人工の単層膜ベシクルもしくは多層膜ベシクルなどのような粒子の成
分として提供される。従って、特定の好ましい実施形態において、このような結
合相互作用に関与する１つのポリペプチドは、ミトコンドリアまたはサブミトコ
ンドリア粒子と結合され、特定の他の好ましい実施形態において、このようなポ
リペプチドは、リポソームまたはタンパクリポソームと結合される。他の好まし
い実施形態において、このようなポリペプチドは、固相マトリクスと結合される
。例えば、１つの実施形態において、少なくとも１つのポリペプチドは、他のポ
リペプチドとの接触の前に、固体支持体上に固定化される。次いで、ポリペプチ
ド結合は、相互作用するポリペプチド（例えば、抗体またはそのフラグメント）
の一方または両方に特異的に結合する検出試薬を使用して、またはこのポリペプ
チドの一方または両方の検出可能な部分を使用して、検出され得る（例えば、色
素の直接検出、または２つの分子間のエネルギー移動の検出）。
【０１０２】 固体支持体は、当業者に公知の任意の材料であり得る。例えば、固体支持体は
、マイクロタイタープレート中の試験ウエルまたはニトロセルロースまたは他の
適切な膜であり得る。あるいは、この支持体は、ビーズまたはディスクであり得
、例えば、ガラス、ガラス繊維、ラテックスもしくはプラスチック材料（例えば
、ポリスチレンもしくはポリ塩化ビニル）であり得る。ポリペプチドは、当業者
に公知の種々の技術を使用して、固体支持体上に固定化され得、これは、特許文
献および科学文献に十分に記載される。本発明の状況において、用語「固定化」
は、例えば、吸着のような非共有結合および共有結合（薬剤と固体支持体上の官
能基との間の直接結合であり得るか、または架橋剤による結合であり得る）の両
方をいう。マイクロタイター中のウエルまたは膜への吸着による固定化が、好ま
しい。このような場合、吸着は、適切な緩衝液中の結合剤を、適切な時間で、固
体支持体と接触させることによって達成され得る。
【０１０３】 結合は、一般に、結合ポリペプチドを検出するのに十分な時間量で起こること
が許容される。適切な量の時間は、一般に、期間にわたって起こる結合のレベル
をアッセイすることによって決定され得る。ＣｙｐＤ、ＡＮＴ、および候補薬剤
の相互作用を可能にするのに十分な条件下および時間、インキュベートした後、
ＣｙｐＤ−ＡＮＴ結合のレベルが検出され、薬剤の非存在下における結合のレベ
ルと比較される。幾つかの好ましい実施形態において、ＡＮＴおよびＣｙｐＤポ
リペプチドは、ＧＳＴ、ヘキサ−ヒスチジン、およびＦＬＡＧ（登録商標）ポリ
ペプチドのような、本明細書中で提供されるさらなるポリペプチド配列に融合さ
れる。従って、好ましい実施形態において、ＡＮＴおよびＣｙｐＤに融合された
さらなるポリペプチドは、本明細書中に記載されるように、レセプター（例えば
、抗体またはストレプトアビジン／アビジン）によって結合されるリガンド（例
えば、抗原またはビオチン）である。他の実施形態において、ＡＮＴおよびＣｙ
ｐＤ融合タンパク質は、ＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチドが、本明細書中に記
載されるように、さらなるポリペプチド配列からタンパク質分解的に分離され得
るように、プロテアーゼ認識配列を含み得る。なお別の実施形態において、ＡＮ
ＴおよびＣｙｐＤは、ＧＦＰまたは関連した変異ＧＦＰ（ＷＯ９８／０６７３７
）（例えば、ＹＥＰ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、またはＲＦＰ）に融合され得、これが使
用され、例えば、ミトコンドリアに対する亜細胞性位置を変更し得るか、あるい
は本発明に従う核酸発現構築物によってコードされた発現ＡＮＴまたはＣｙｐＤ
融合タンパク質の改変されたＭＰＴを検出し得る。本発明のこのような実施形態
は、高スループットスクリーニングアッセイとして有用である。
【０１０４】 次いで、結合していないポリペプチドは除去され、結合したポリペプチドは、
連結されたレポーター基、またはレポーター基を含む個別の検出可能なマーカー
を使用して検出される。結合を検出するために使用される方法は、使用されるレ
ポーター基の性質に依存する。エネルギー移動が検出される際、本明細書中に記
載されるようなＦＲＥＴ技術が使用され得る。放射性基の場合、シンチレーショ
ンカウンティングまたはオートラジオグラフィー法が、一般に適切である。分光
学的方法は、色素、発光基および蛍光基を検出するために使用され得る。ビオチ
ンは、異なるレポーター基（通常は、放射性基もしくは蛍光基または酵素）に結
合したアビジンを使用して検出され得る。酵素レポーター基は、一般に、基質の
添加によって検出され得（一般に、特定の時間において）、次いで、反応生成物
の分光学的または他の分析によって検出され得る。
【０１０５】 ＡＮＴ、ＣｙｐＤ、および／またはＡＮＴ−ＣｙｐＤ複合体に結合する薬剤は
、ＡＮＴ−ＣｙｐＤ結合における検出可能な減少または増加を生じ得る。ＡＮＴ
−ＣｙｐＤ結合タンパク質のこのような改変したレベルは、モニターされるポリ
ペプチドまたは融合タンパク質、および特定の試薬、機器および選択される方法
に依存して定量的に変更し得る、容易に検出可能な増加または減少に関する。好
ましくは、ＡＮＴ−ＣｙｐＤ結合の改変したレベルは、統計学的に重要な増加ま
たは減少をいう。
【０１０６】 ＭＰＴを変更する薬剤についてスクリーニングするための他の方法は、ミトコ
ンドリアを有する宿主細胞におけるＦＲＥＴに関し、これは、ＡＮＴ融合タンパ
ク質およびＣｙｐＤ融合タンパク質を発現し、ここで、各融合タンパク質は、適
切なエネルギー移動分子ポリペプチドを含む。簡略すると、このような細胞は、
候補薬剤およびＭＰＴの誘導因子と接触される。次いで、この細胞は、励起エネ
ルギーに対して曝露され、エネルギー移動分子間のエネルギー移動のレベルが検
出され、本明細書中に提供される参照シグナルのような参照レベルと比較され、
この参照レベルは、候補薬剤の非存在下で発生され得る。非限定的な理論により
、ＡＮＴ、ＣｙｐＤ、ＡＮＴ−ＣｙｐＤ複合体に結合し、および／または他に、
ＡＮＴ−ＣｙｐＤ相互作用を妨害する薬剤は、例えば、本明細書中に記載される
ＡＮＴ−ＣｙｐＤ結合を改変することによって、ＦＲＥＴシグナルの検出可能な
改変（例えば、減少または増加）を生じ得る。
【０１０７】 このようなアッセイにおいて、宿主細胞は、一般的に、ＭＰＴの誘導因子と接
触される。このような誘導因子は、例えば、本明細書中に記載されるような、Ａ
ＮＴ融合タンパク質とＣｙｐＤ融合タンパク質との間のエネルギー移動のレベル
を測定することによって、または当該分野で公知の任意の他の適切な方法によっ
て決定される場合、ＭＰＴを誘導するのに十分な量および時間で、使用され得る
。「ＭＰＴの誘導因子」は、ミトコンドリア膜浸透性を向上することが公知の任
意の化合物であり得る。ＭＰＴの誘導因子は、例えば、アトラクチロシド、ｂｏ
ｎｇｋｒｅｋｉｃ ａｃｉｄ、タプシガルジン、アミノ酸神経伝達物質、グルタ
メート、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸、カルバコール、イオノフォア、イノ
マイシン、カリウム脱分極の誘導因子、およびプログラムされた細胞死、すなわ
ち「アポトーシス」を誘導する「アポプトゲン（ａｐｏｐｔｏｇｅｎ）」（Ｇｒ
ｅｅｎら、１９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：１３０９）のような、ミトコン
ドリアのＣａ+2濃度を増加する化合物が挙げられる。ＭＰＴを改変する薬剤は、
ＭＰＴの誘導因子の存在下および／または非存在下においてＡＮＴ−ＣｙｐＤ結
合に及ぼす影響を発揮し得る。別の実施形態において、宿主細胞は、ｍＰＴの第
２誘導因子、好ましくは、酸化性応力の誘導因子と接触され、最も好ましくは、
この誘導因子は、エタクリン酸、ブチオニンスルホキイミン、ジアミド、メナジ
オン、ｔ−ブチル過酸化水素、フェニル−アルシン酸化物および酸化窒素から選
択される。当業者は、過度の実験なしに決定し得、ＭＰＴの誘導因子の組み合わ
せは、ＡＮＴおよびＣｙｐＤ融合タンパク質からの最も検出可能なシグナルを生
じる。
【０１０８】 特定の好ましい実施形態において、本発明の方法に従って検出されるシグナル
を、少なくとも１つの参照シグナルと比較することが所望され得る。幾つかの実
施形態において、参照シグナル（単数または複数）は、特定の条件下で、適切な
エネルギー移動分子（例えば、本明細書中に提供されるようなエネルギー移動分
子ポリペプチド）間で検出可能であるエネルギー移動の１つ以上のレベルであり
得る。このような適切な参照シグナルの選択は、当業者に精通された基準に従い
、特定のアッセイ条件（例えば、宿主細胞、ＭＰＴの誘導因子、速度論、ＭＰＴ
のインヒビター、励起エネルギー、候補薬剤）および使用される特定のエネルギ
ー移動分子ドナー−アクセプター対に依存して変化し得る。例えば、参照シグナ
ルは、エネルギー移動分子ドナーポリペプチドまたはエネルギー移動分子アクセ
プターポリペプチドまたは本明細書中で提供されるようなインジケータである個
別のレポーター分子のような参照化合物によって発生され得、サンプルの非存在
下または存在下でさらに発生され得る。このようなレポーター分子またはインジ
ケータは、一種以上の一定量の検出可能な成分の指標または検出可能な成分の位
置などとして検出され得る検出可能な化合物を含み得る。例えば、例示のために
、限定することなく、参照シグナルは、存在する細胞の番号に従って検出される
エネルギー移動シグナルの規格化を可能にするレポーター分子によって発生され
得る（例えば、このレポーターは、細胞核についての選択的染色（例えば、ヨウ
化プロピジウムまたは臭化エチジウム）のような細胞番号の多数の公知のインジ
ケータのいずれかであり得る）。
【０１０９】 特定の他の実施形態において、参照シグナルは、存在するミトコンドリア量、
ミトコンドリア数またはミトコンドリア容量のインジケータによって発生される
。例えば、ミトコンドリア量のインジケータが選択される場合、ノニルアクリジ
ンオレンジのようなレポーター分子が使用され得る。ミトコンドリア量、容量、
および／またはミトコンドリア数を定量するための方法は、当該分野で公知であ
り、例えば、代表的な生物学的サンプルの定量的な染色を含み得る。代表的には
、ミトコンドリアの定量的染色は、オルガネラ選択性プローブまたは色素を使用
して行われ得、これには、ミトコンドリア分子成分（例えば、ノニルアクリジン
オレンジ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒｓTM）に結合する蛍光色素またはミトコンド
リア内側膜電気化学的電位の関数としてミトコンドリア内に蓄積する電位差測定
色素（ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｄｙｅ）のようなミトコンドリア選択性
試薬が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ，１９
９６ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎ
ｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ−第６編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐ
ｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）。別の例として、ミトコンドリア量、容量お
よび／または数は、形態計測学的分析によって定量され得る（例えば、Ｃｒｕｚ
−Ｏｒｉｖｅら、１９９０ Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５８：Ｌ１４８；Ｓ
ｃｈｗｅｒｚｍａｎｎら、１９８６ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０２：９７）
。サンプル中のミトコンドリア量、容量および／またはミトコンドリア数を定量
するための当該分野で公知のこれらの手段または任意の他の手段は、本発明の考
慮された範囲内にある。例えば、ミトコンドリア密度を計算するためのこのよう
な定量的決定の使用が考えられ、限定することを意図しない。特定の非常に好ま
しい実施形態において、サンプル中のミトコンドリアタンパク質の量は、周知の
手順を使用して決定される。例えば、当業者は、確立された細胞分別技術を使用
して、生物学的サンプルから単離されたミトコンドリア画分を容易に調製し得、
それより、当業者に周知の多数のタンパク質定量法のうちのいずれかを使用して
タンパク質含量を決定し得る。
【０１１０】 他の実施形態において、参照シグナルは、存在するタンパク質の量に従って検
出されるエネルギー移動シグナルの規格化を可能にするレポーター分子（例えば
、ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ、フルオレスカミン、ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎ
ｉｃ ａｃｉｄ）または存在する核酸の量に従って検出されるエネルギー移動シ
グナルの規格化を可能にするレポーター分子（例えば、臭化エチジウム、アクリ
ジンオレンジ、メチレンブルー）によって発生され得る。別の例として、参照シ
グナルは、サンプルを含む液体媒体中に可溶である検出可能なレポーター分子に
よって発生され得るが、これは、細胞膜を横断し得ず、従って、細胞外媒体のマ
ーカーとして、例えば、流体体積のインジケータとして作用する。例えば、特別
な感度の機器（例えば、以下を参照のこと）がＦＲＥＴシグナルを検出するため
に使用され得る場合、このようなインジケータは、サンプル容量の較正／規格化
によって、改善された定量精度を可能にし得る。このような参照シグナルとして
の使用に適切である多くの化合物は、当業者に公知であり、彼らは、特に、特定
のアッセイ条件（例えば、宿主細胞、ＭＰＴの誘導因子、速度論、ＭＰＴのイン
ヒビター、励起エネルギー、候補薬剤）および使用される特定のエネルギー移動
分子ドナー−アクセプター対に依存する様式で、参照シグナルの供給源としてこ
のような化合物を選択し得る。
【０１１１】 本明細書中で使用される場合、シグナルの「相対量」を検出することは、上に
提供されるように、参照シグナルに対してシグナルを比較する目的のためにシグ
ナルを検出することが挙げられるが、これに限定されない。従って、シグナルの
相対量を検出するとは、シグナルの一部のみを検出すること（例えば、１００％
未満の効率でシグナルを検出すること）、またはエネルギー移動によって発生さ
れるシグナルの一部のみを検出すること、またはコントロールサンプルのような
別のサンプルから検出されるシグナルに対してシグナルの一部を検出することを
言及し得る。これは、本明細書中に提供されるように、このような検出される他
のシグナルのいずれかが参照シグナルであるかどうかに関わらない。本明細書中
に開示される方法に従うシグナルの検出は、通常通りまたは任意に割り当てた尺
度の単位によるエネルギー移動の定量を含み得る。特定の実施形態において、シ
グナルは、シグナルの１つ以上の挙動が時間の関数として分析され得るような時
間にわたって検出され得る。例えば、本明細書中に記載される幾つかの実施形態
において、シグナルは、ある一定時間にわたって検出され得、これは、シグナル
検出事象より多くを提供する様式でサンプルを検出する任意の方法をいい、その
結果、検出シグナルの別々の時間点との相関が確立され得る。従って、例えば、
特定の実施形態において、シグナルの量の変化は、２つ以上の点にわたって検出
され得、シグナルのレベルにおける変化の割合が決定される（例えば、シグナル
レベルが時間の関数としてプロットされる場合、一次導関数のような傾きまたは
傾きの割合変化が決定される）。別の例として、特定の他の実施形態において、
シグナルの量は、別々の時間間隔にわたって累積的に決定され得、合計されたシ
グナルを提供する（例えば、積分されたシグナル）。定量データを分析するため
の、特に、時間成分を有するこのようなデータを分析するための、当該分野で公
知のこれらおよび他の技術は、考慮された本発明の範囲内にある。
【０１１２】 従って、本発明によって提供される方法のいずれも、例えば、細胞数の標準化
、細胞性タンパク質または細胞性核酸の定量、ミトコンドリアの質量、ミトコン
ドリアタンパク質またはミトコンドリア核酸の定量、液量の表示などの目的のた
めに、目的の参照パラメーターと相関する参照シグナルをまた含むように改変さ
れ得る。内部標準として使用され得るこの参照シグナルは、エネルギー移動から
の結果である必要はなく、そして所望の参照パラメーターと相関し得るが、試験
／アッセイシグナルの検出を妨害しない任意のシグナルを含み得る。本発明の文
脈において、参照化合物は、これが、試験／アッセイシグナルから分離され得な
いシグナルを生成する場合、またはこれが、エネルギー移動供与体分子ポリペプ
チドおよびエネルギー移動受容体分子ポリペプチドとして同一の亜細胞区画に局
在化し、そしてそれ自体が、エネルギー移動受容体またはエネルギー移動供与体
として作用する場合、試験／アッセイシグナルを妨害し得る。
【０１１３】 ＦＬＩＰＲTMのような機器をセットし、約１秒の周期時間を有する２つの異な
る波長におけるリーディングシグナル間で交互になり得る；この様式において、
参照シグナルおよび試験／アッセイシグナル（例えば、ＦＲＥＴ、ΔΨ）は、同
一の時間経過にわたって読まれ得る。しかし、この参照は、試験／アッセイシグ
ナルと同一の時間に読まれることを必要としない。例えば、本発明のいくつかの
局面において、参照シグナルを検出するために細胞を破壊する必要があり、そし
てこれは、代表的に、この参照シグナルが、試験またはアッセイが完了した後に
読まれることを必要とする。
【０１１４】 参照シグナルのいくつかの非限定的な例としては、以下が挙げられる。試験ま
たはアッセイの後に、当該分野で公知のように、細胞性タンパク質（ミトコンド
リアタンパク質を含む）は、ＢｒａｄｆｏｒｄアッセイまたはＬｏｗｒｙアッセ
イのような方法を用いて測定され得、そして核酸は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ
）のような蛍光色素の使用を介して測定され得る。核酸はまた、生存細胞におい
て測定され得る。例えば、ジギトニン透過性細胞において、ヨウ化プロピジウム
（ＰＩ；核酸に結合した場合、励起ピーク、５３６ｎｍ；発光ピーク、６１７ｎ
ｍ）は、核および細胞質核酸に結合するが、ミトコンドリアマトリックスおよび
その中に含まれるミトコンドリア核酸に到達し得ない；従って、ＰＩは、細胞性
核酸の量についての参照シグナルを提供する。浸透化合物アクリジンオレンジ（
ＡＯ）は、生存細胞において使用され、ＲＮＡおよびＤＮＡを識別する。これは
、アクリジンオレンジが結合する核酸の型に依存して異なる励起／発光スペクト
ルを有するためである（ＡＯ：ＤＮＡ、励起ピーク、５００ｎｍ；発光ピーク、
５２６ｎｍ；ＡＯ：ＲＮＡ、励起ピーク、４６０ｎｍ；発光ピーク、６５０ｎｍ
）。ＳＹＴＯ染色をまた使用し、生存細胞における核酸を検出し得る；このＳＹ
ＴＯ染色の製造業者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅ
ｎｅ，ＯＲ）は、ＳＹＴＯ染色の全てが、核性核酸および細胞性核酸に到達し、
そしていくつかがまた、ミトコンドリア核酸に到達し得ることを示す；当業者は
、例えば、蛍光顕微鏡のような技術を適用し、どの型の核酸が特定のＳＹＴＯ染
色の使用によって決定されるかを決定し得る。ＪＣ−１緑蛍光およびＮＡＯ蛍光
を使用して、生存細胞におけるミトコンドリアの質量を測定し得る（それぞれ、
Ｍａｎｃｉｎｉら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．５：２８７−２９５，１９
９８；Ｖａｙｓｓｉｅｒｅら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ
．２８Ａ：７６３−７７２，１９９２）。
【０１１５】 このアッセイの他の実施形態において、ＭＰＴ細孔は、シクロスポリンＡによ
って選択的に阻害され得、これは、シクロフィリンＤペプチジル−プロリルイソ
メラーゼ活性を阻害することによって、そしてそれによりそのＡＮＴとの相互作
用を阻害することによってＭＰＴを遮断し得る（Ｍｕｒｐｈｙら、１９９８ Ｍ
ｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ＆ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏ
ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｂｅａｌ，Ｈｏｗｅｌｌおよび
Ｂｏｄｉｓ−Ｗｏｌｌｎｅｒ編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第
１５９頁〜第１８６頁；ＷｈｉｔｅおよびＲｅｙｎｏｌｄｓ，１９９６ Ｊ．Ｎ
ｅｕｒｏｓｃｉ．１６：５６８８）。好ましくは、本発明は、第２の参照レベル
を生成する方法として、ＭＰＴのインヒビターを添加することを提供し；ＭＰＴ
の他のインヒビターとしては、低ｐＨおよび高いミトコンドリア膜電位のインデ
ューサーが挙げられる。
【０１１６】 アポトーシスを調節する因子の能力もまた評価され得る。一般的に、細胞は、
候補因子の存在下および非存在下で、アポトーゲン（ａｐｏｐｔｏｇｅｎ）で処
理され、そしてアポトーシスに対する影響を評価される。種々のアポトーゲンが
当業者に公知であり、そして例えば以下のアポトーゲンが例示として挙げられ得
るがこれらに限定されない：当業者がよく知っている適切な条件下で細胞に対し
て添加される場合には、腫瘍壊死因子、ＦａｓＬ、グルタメート、ＮＭＤＡ、Ｉ
Ｌ−３、コルチコステロン、ミネラルコルチコイド、またはグルココルチコイド
レセプター（単数または複数）のような特異的なレセプターを必要とするアポト
ーゲン。アポトーゲンとしてさらに、以下が挙げられ得る：ヘルビマイシンＡ、
（Ｍａｎｃｉｎｉら、１９９７、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３８：４４９−４
６９）；パラコート（Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉら、１９９５、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇ
ｙ ９９：１−２）、エチレングリコール類；プロテインキナーゼインヒビター
（例えば、スタウロスポリン、カスホスチンＣ、カフェー酸フェネチルエステル
、キレリチン（ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎｅ）クロライド、ゲニステイン）；１
−（５−イソキノリンスルホニル）−２−メチルピペラジン；Ｎ−［２−（（ｐ
−ブロモシンナミル）アミ）エチル］−５−５−イソキノリンスルホンアミド；
ＫＮ−９３；クエリシチン（ｑｕｅｒｃｉｔｉｎ）；ｄ−エリスロ−スフィンゴ
シン誘導体；ＵＶ照射；イオノフォア（例えば、イオノマイシン、バリノマイシ
ン、および当該分野で公知の他のイオノフォア）；ＭＡＰキナーゼインデューサ
ー（例えば、アニソマイシンおよびアナンダミン）；細胞周期ブロッカー（例え
ば、アフィジコリン（ａｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ）、コルセミド、５−フルオロウ
ラシル、およびホモハリングトニン）；アセチルコリンエステラーゼインヒビタ
ー（例えば、ベルベリン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；酸化
促進剤（例えば、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド、過酸化水素；フリーラジカル
（例えば、一酸化二窒素）；無機金属イオン（例えば、カドミウム）；ＤＮＡ合
成インヒビター（例えば、アクチノマイシンＤ）；ＤＮＡインターカレーター（
例えば、ドキソルビシン、硫酸ベロマイシン、ヒドロキシ尿素、メトトレキセー
ト、マイトマイシンＣ、カンプトセシン、およびダウノルビシン：タンパク質合
成インヒビター（例えば、シクロヘキシミド、プロマイシン、およびラパマイシ
ン）；微小管の形成または安定性をもたらす因子（例えば、ビンブラスチン、ビ
ンクリスチン、コルヒチン、４−ヒドロキシフェニルレチナミド、およびパクリ
タキセルなど）；ならびに他のＭＰＴインデューサー（例えば、Ｂａｘタンパク
質（Ｊｕｒｇｅｎｍｅｉｅｒら、１９９８ ＰＮＡＳ ９５：４９９７−５００
２）、カルシウムおよび無機リン酸塩（Ｋｒｏｅｍｅｒら、１９９８ Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６０：６１９）。
【０１１７】 候補因子のアポトーシスの開始を阻害するかまたは遅らせる能力は、当該分野
で公知の任意の方法を使用して評価され得る。例えば、細胞は、形態学的変化、
浸透性の変化、またはアポトーシスの状態の指標である他の変化について試験さ
れ得る。このような変化としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない
：変更された形態学的な外観（例えば、原形質膜の気泡、細胞の形状の変化、基
質の接着特性の欠失、または光学顕微鏡を使用することによって当業者によって
容易に検出され得る他の形態学的変化）；染色体の断片化および崩壊（これは、
顕微鏡によって、そして／または当該分野で公知であるＤＮＡ特異的色素もしく
はクロマチン特異的色素（蛍光色素を含む）の使用により、明らかであり得る）
；および／または変更された原形質膜の浸透性の特性（生命体の色素（例えば、
ヨウ化プロピジウム、トリパンブルー）の使用により、または細胞外環境への乳
酸デヒドロゲナーゼの漏出の検出によって、容易に検出され得る）。別のアポト
ーシスアッセイにおいては、原形質膜の内のリーフレットから外のリーフレット
への細胞膜のホスファチジルセリン（ＰＳ）のトランスロケーションについては
、ＰＳ特異的タンパク質アネキシンによる外部のリーフレットへの結合を測定す
ることによって評価され得る。（Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２
：１５４５、１９９５；Ｆａｄｏｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２２０７
、１９９２）。
【０１１８】 本発明のなお別のアポトーシスアッセイにおいては、アポトーシス誘導因子に
対する細胞性の応答が、カスパーゼとして公知のアポトーシスによって活性化さ
れるプロテアーゼのファミリーにおける特異的なプロテアーゼ活性の誘導は、例
えば、特異的に認識されるタンパク質基質のカスパーゼ媒介切断の決定により、
測定され得る。このような基質として、例えば、当該分野で公知であるカスパー
ゼによって切断される、ポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）
または他の天然に存在するかもしくは合成のペプチドおよびタンパク質が挙げら
れ得る（例えば、Ｅｌｌｅｒｂｙら、１９９７ Ｊ．Ｎｕｅｒｏｓｃｉ．１７：
６１６５を参照のこと）。合成のペプチド Ｚ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＡＦＣ ［配列番号 ］、 （ここで、「Ｚ」は、ベンゾイルカルボニル部分を示し、そしてＡＦＣは７−ア
ミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（Ｋｌｕｃｋら、１９９７ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２７５：１１３２；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、１９９５ Ｎａｔｕｒｅ ３
７６：３７）を示す）がこのような基質１つである。他の基質として、Ｕ１−７
０ｋＤａおよびＤＮＡ−ＰＫｃｓのような核タンパク質が挙げられる（Ｒｏｓｅ
ｎおよびＣａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎ、１９９７、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．６４：５０；Ｃｏｈｅｎ，１９９７ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２６：１）
。
【０１１９】 さらなるアポトーシスアッセイは、アポトーシス細胞においてミトコンドリア
により放出されたミトコンドリアタンパク質シトクロムｃの検出に基づく（Ｌｉ
ｕら、Ｃｅｌｌ ８６：１４７、１９９６）。シトクロムｃのこのような検出は
、分光測光的に、免疫化学的に行われ得るか、または特定のタンパク質の存在を
決定するための十分に確立された方法によって行われ得る。親和性による捕捉と
組合せたマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯ
Ｆ）質量スペクトル分析は、アポ−シトクロムｃおよびハロ−シトクロムｃがそ
れらの特有の分子量に基づいて区別され得るので、このような分析に特に適切で
あり得る。例えば、表面増感レーザー脱離／イオン化（Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈ
ａｎｃｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（Ｓ
ＥＬＤＩTM）システム（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ
ｏｒｎｉａ）は、アポトーシス刺激物質（ｓｔｉｍｕｌｕｓ）（例えば、イオノ
マイシン、周知のカルシウムイオノフォア）で処理された細胞中のミトコンドリ
アからのシトクロムｃの放出に対する因子の影響を決定するために利用され得る
。このアプローチにおいては、固体支持体上に固定されたシトクロムｃ特異的抗
体が、可溶性の細胞抽出物中に存在する、放出されたシトクロムｃを捕捉するた
めに使用される。捕捉されたタンパク質は、次いで、エネルギー吸収分子（ＥＡ
Ｍ）のマトリックス中に入れられ、そしてパルスレーザ励起を使用して固体支持
体の表面から脱離させられる。タンパク質の分子量は、ＳＥＬＤＩTM質量分析計
の検出器へのその飛行時間によって決定される。
【０１２０】 本発明はさらに、ＭＰＴを変更する因子についてのスクリーニングのためのキ
ットを提供する。このようなキットは、一般的に、単離されたＣｙｐＤポリペプ
チド、単離されたＡＮＴポリペプチドおよび、必要に応じて、ＣｙｐＤまたはＡ
ＮＴの少なくとも１つに特異的に結合する検出試薬を含む。好ましくは、Ｃｙｐ
ＤポリペプチドまたはＡＮＴポリペプチドは、固体支持体上に固定化され、そし
て必要に応じた検出試薬は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【０１２１】 本発明はまた、細胞ベースのアッセイにおいてＭＰＴを変更する因子について
のスクリーニングのためのキットを提供する。このキットは、本明細書中に記載
されるように、宿主細胞、第１のエネルギー移動分子に融合されたＡＮＴポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを有
する第１の核酸発現構築物、および第２のエネルギー移動分子に融合されたＣｙ
ｐＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモ
ーターを有する第２の核酸発現構築物を含み得る。この宿主細胞は、原核生物細
胞でも真核生物細胞でもよい。第１および第２のエネルギー移動分子は、本明細
書中に記載されるように、好ましくは、ＧＦＰ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＲＦＰまたは
ＹＦＰである。
【０１２２】 （治療方法） ＭＰＴを変更し、かつまた好ましくはアポトーシスの開始を阻害するかまたは
遅らせる因子は、種々の目的のために使用され得る。例えば、このような因子は
、ミトコンドリアにおけるＭＰＴを変更するために使用され得る。ミトコンドリ
アは、単離され得るか、または細胞内に存在し得る。簡潔には、ミトコンドリア
は、上記のような因子とＭＰＴを変更するために十分な条件および時間で接触さ
れる。種々の標準的な技術のいずれかを使用して、ミトコンドリアにおけるＭＰ
Ｔの変化を検出し得る。
【０１２３】 代表的には、ミトコンドリアの膜電位は、当業者に容易に知られている方法に
従って決定され得る。これらには、以下が含まれるが、これらに限定されない：
蛍光指標のような検出可能な化合物の検出および／または測定、光学的なプロー
ブ、および／または感受性のｐＨ、ならびにイオン選択性電極（例えば、Ｅｒｎ
ｓｔｅｒら、１９８１ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９１：２２７ｓおよび引用さ
れる参考文献を参照のこと、Ｈａｕｇｌａｎｄ、１９９６ Ｈａｎｄｂｏｏｋ
ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ 第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ
，ＯＲ、２６６−２７４頁および５８９−５９４頁をもまた参照のこと）。例え
ば、例示であって限定的ではないが、蛍光プローブである、２，４−ジメチルア
ミノスチリル−Ｎ−メチルピリジニウム（ＤＡＳＰＭＩ）およびテトラメチルロ
ーダミンエステル（例えば、テトラメチルローダミンメチルエステル、ＴＭＲＭ
；テトラメチルローダミンエチルエステル、ＴＭＲＥ）、または関連する化合物
（例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ、１９９６、前出）が、ミトコンドリア膜電位に依
存しそしてそれに対して比例するプロセスであるミトコンドリア中での蓄積の後
に定量し得る（例えば、Ｍｕｒｐｈｙら、１９９８、Ｍｉｔｃｈｏｎｄｒｉａ
＆ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｒａｔｉｖｅ Ｄ
ｉｓｅａｓｅ、Ｂｅａｌ，ＨｏｗｅｌｌおよびＢｏｄｉｓ−Ｗｏｌｌｎｅｒ編、
Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１５９−１８６頁およびその中で引
用されている参考文献；ならびに、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｏｎ−
ｌｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ
ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒ
ｏｂｅｓ．ｃｏｍ／ｈａｎｄｂｏｏｋ／ｔｏｃ．ｈｔｍｌを参照のこと）。本発
明において使用され得る他の蛍光検出可能な化合物として、以下が挙げられるが
これらに限定されない：ローダミン１２３、ローダミンＢヘキシルエステル、Ｄ
ｉＯＣ6（３）、ＪＣ−１［５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３
，３’−テトラエチルベンズイミダゾール−カルボシアニンヨーダイド］（Ｃｏ
ｓｓａｒｉｚｚａら、１９９３ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃ
ｏｍｍ．１９７：４０；Ｒｅｅｒｓら、１９９５ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．
２６０：４０６）、ｒｈｏｄ−２（米国特許第５，０４９，６７３号を参照のこ
と；上記の化合物の全てが、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ
，Ｏｒｅｇｏｎから入手可能である）およびローダミン８００（Ｌａｍｂｄａ
Ｐｈｙｓｉｋ，ＧｍｂＨ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｓａｋａｎ
ｏｕｅら、１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１：２９）。
【０１２４】 ミトコンドリアの膜電位はまた、蛍光ではない手段によって、例えば、ＴＴＰ
（テトラフェニルホスホニウムイオン）およびＴＴＰ−感受性電極を使用するこ
とによって、測定され得る（Ｋａｍｏら、１９７９ Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂ
ｉｏｌ．４９：１０５；ＰｏｒｔｅｒおよびＢｒａｎｄ，１９９５ Ａｍ．Ｊ．
Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６９：Ｒ１２１３）。当業者は、ΔΨｍを測定するための、
適切な検出可能な化合物または他の適切な手段を選択することが可能である。例
示であって、限定的ではないが、ＴＭＲＭはＴＭＲＥよりもいくらか好ましい。
なぜなら、ミトコンドリアからの流出後に、ＴＭＲＥは、ＴＭＲＭよりも、小胞
体および細胞質中にわずかにより残存しているシグナルを生じるからである。
【０１２５】 別の限定的ではない例として、膜電位は、分光測光的な定量または蛍光による
定量と組み合わせた、マトリックスの容積および／またはピリジンヌクレオチド
の酸化還元の決定を使用して、検出可能に荷電した溶質に対する、ミトコンドリ
アの浸透性の間接の測定から、さらにまたは代替的に計算され得る。ミトコンド
リア内膜を横切る膜電位依存性の基質交換拡散の測定もまた、膜電位の間接的な
測定を提供し得る。（例えば、Ｑｕｉｎｎ、１９７６、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、２０
０−２１７頁、およびその中で引用されている参考文献を参照のこと）。
【０１２６】 従って、本明細書中で提供されるように、例えば以下を含む、ＭＰＴを受けた
ミトコンドリアを含む細胞についての任意の実験的に測定可能な結果が用いられ
得る：ΔΨの散逸の測定、ミトコンドリア膜間空間タンパク質（例えば、シトク
ロムｃ）の細胞質への損失の検出、アポトーシスシグナル伝達カスケード（以下
を参照のこと）における下流の事象としての１つ以上のカスパーゼの活性化、細
胞死および任意の他の表現型パラメーター、生化学的パラメーター、生物物理学
的パラメーター、代謝パラメーター、呼吸パラメーターまたはその変化がＭＰＴ
に依存し得る他の有用なパラメーター。変化したミトコンドリア機能に関連した
疾患の処置に適切である、本発明の方法に従って同定された因子は、ＭＰＴおよ
び／またはＭＰＴ関連調節機構の頻度および／または発生を増強し得るか、損な
い得るかまたは変更し得る。特に好ましいのは、ＭＰＴの１以上の上記のインジ
ケータの出現を阻害する因子である。
【０１２７】 またこのような薬剤を使用して細胞の生存度を変化させ得る。簡単には、細胞
の生存度を調節するための条件下で、細胞の生存度を調節するのに十分な時間、
細胞を薬剤と接触させる。次に生存細胞が、当業者にとって慣習的な標準技術を
使用してアッセイされ得る。例えば、細胞の生存度および／またはアポトーシス
に入る細胞を生存細胞の指標として使用し得、これらはさらに、変更したミトコ
ンドリアの機能（例えば、ＭＰＴ）についての１以上の指標を反映し得る（Ｇｒ
ｅｅｎおよびＲｅｅｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：１３０９〜１３２１、１９９
８；Ｓｕｓｉｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３６
６：１５１〜１６５、１９９８）。アポトーシスを起こすと思われる細胞は、ア
ポトーシスの状態を示す形態学的変化、浸透性の変化または他の変化に対して調
べられ得る。例示であって限定を意図しない例として、多くの細胞型におけるア
ポトーシスは、形態学的外観の変化（例えば、細胞膜小疱形成、細胞形状の変化
、基質の付着特性の喪失または光学顕微鏡を使用して当業者により容易に検出さ
れ得る他の形態学的変化）を引き起こし得る。別の例として、アポトーシスが進
行している細胞は、染色体の断片化および崩壊を示し得、このことは光学顕微鏡
により、および／または当該分野で公知のＤＮＡ特異的またはクロマチン特異的
色素（蛍光色素を含む）の使用を介して明らかにされ得る。このような細胞はま
た、生体染色（例えば、ヨウ化プロピジウム、トリパンブルー）の使用または細
胞外環境への乳酸デヒドロゲナーゼの漏出の検出により容易に検出され得る膜透
過性の変化を示す。ＤＮＡの損傷はまた、電気泳動技術を用いてアッセイされ得
る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２６：２８２−２
８９、１９９９を参照のこと）。形態学的変化、浸透性の変化、および関連する
変化によりアポトーシス細胞を検出するこれらの手段および他の手段が、当業者
に明らかである。
【０１２８】 このアポトーシスアッセイの別の局面において、ホスファチジルセリン（ＰＳ
）特異的タンパク質であるアネキシンによる外側のリーフレットとの結合を測定
することによって形質膜リーフレットの内側から外側への細胞膜ＰＳのトランス
ロケーションが定量化される（Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：
１５４５、１９９５；Ｆａｄｏｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２２０７、
１９９２）。好ましい形式において、形質膜ＰＳの外面化は、標識されたアネキ
シン誘導体（例えば、アネキシン−フルオレセインイソチオシアネート複合体（
ａｎｎｅｘｉｎ−ＦＩＴＣ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕ
ｃｔｓ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ））を使用して９６ウエルプレート上で評価
される。
【０１２９】 アポトーシスアッセイの別の局面において、ミトコンドリアタンパク質である
シトクロムｃ（アポトーシスの細胞ではミトコンドリアの外に漏出している）の
定量化は、容易に検出され得るアポトーシスの標識を提供し得る（Ｌｉｕら、Ｃ
ｅｌｌ ８６：１４７〜１５７、１９９６）。シトクロムｃのこのような定量化
は、分光光度法により免疫化学的に、または特定のタンパク質の存在を検出する
十分に確立された他の方法により行われ得る。アポトーシス刺激物質（例えば、
カルシウムイオノフォアとして周知のイオノマイシン）を用いて試みられる細胞
内ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出の次に種々の免疫学的方法がなされ
得る。アポシトクロムｃとホロシトクロムｃはそれらの固有の分子量に基づいて
区別され得るので、親和性捕捉因子に結合させてのマトリックスアシスティドレ
ーザーデソープションイオン化飛行時間型（ＭＳＬＤＩ ＴＯＦ）質量分析が、
このような分析に特に適している。例えば、ＳＥＬＤＩシステム（Ｃｉｐｈｅｒ
ｇｅｎ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＵＳＡ）を使用して、イオノマイシン処置した細
胞中のミトコンドリアからのシトクロムｃ放出に対するミトコンドリア保護剤に
よる阻害を追跡し得る。このアプローチにおいて、固体支持体上に固定されたシ
トクロムｃ特異的抗体を使用して可溶性細胞抽出物中に存在する放出されたシト
クロムｃが捕捉される。捕捉されたタンパク質は次に、エネルギー吸収分子（Ｅ
ＡＭ）のマトリックスに混入され、そしてパルスレーザーエキサイテーションを
使用して固体支持体表面から脱離される。タンパク質の分子量は、ＳＥＬＤＩ質
量分析検出器でその飛行時間により検出される。
【０１３０】 アポトーシスアッセイの別の局面において、カスパーゼ（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒ
ｙおよびＬａｚｅｂｎｉｋ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：１３１２〜１３１６、１
９９８）として公知のアポトーシス活性化プロテアーゼファミリーに含まれる特
定のプロテアーゼ活性の誘導が、例えば、特異的に認識されたタンパク質基質の
カスパーゼ媒介切断の検出により測定される。これらの基質として、例えば、ポ
リ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）または他の天然に存在する
ペプチドまたは合成ペプチドおよび当該分野で公知であるカスパーゼにより切断
されたタンパク質が挙げられ得る（例えば、Ｅｌｌｅｒｂｙら、１９９７ Ｊ．
Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：６１６５）。標識された合成ペプチドＺ−Ｔｙｒ−Ｖ
ａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＡＦＣ（ここで「Ｚ」は、ベンゾイルカルボニル部分を
示し、そしてＡＦＣは、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（Ｋｌｕ
ｃｋら、１９９７ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：１１３２；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら
、１９９５ Ｎａｔｕｒｅ ３７６：３７）を示す）は、このような基質の１つ
である。カスパーゼ−３に対する標識された別の合成ペプチド基質は、プロテア
ーゼに対する認識／切断部位を含むペプチドリンカーを介して相互に結合された
２つのフルオレセインタンパク質から成る（Ｘｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．２６：２０３４〜２０３５、１９９８）。他の基質として、核タン
パク質（例えば、Ｕ１−７０ｋＤａおよびＤＮＡ−ＰＫｃｓ）が挙げられる（Ｒ
ｏｓｅｎおよびＣａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎ、１９９７ Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．６４：５０；Ｃｏｈｅｎ、１９９７ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２６
：１）。
【０１３１】 アポトーシスアッセイの別の局面において、アポトーゲン（ａｐｏｐｔｏｇｅ
ｎ）にさらされた細胞集団中の死滅細胞に対する生存細胞の比、または死滅細胞
の割合は、アポトーシスの最終的な結果を測定して決定される。生存細胞は、当
業者に公知の多くの任意の技術を使用して死滅細胞と区別され得る。非限定的な
例として、ヨウ化プロピジウムまたはトリパンブルーのような生体色素を使用し
てアポトーゲンおよび本発明による化合物で処置された細胞集団中の死滅細胞の
割合を決定し得る（実施例７を参照のこと）。
【０１３２】 当業者は、細胞の生存および／またはアポトーシスを定量化する他の適切な技
術があり得ること、および細胞の生存、またはアポトーシスの誘発および反応速
度に対するＭＰＴを変化される薬剤の影響を決定する目的のためのこのような技
術は、本明細書中で開示されるアッセイの範囲内であることを容易に理解する。
【０１３３】 他の局面において、薬剤は変更したミトコンドリアの機能に関する疾患の処置
または予防のために患者に投与され得る。このような使用のための好ましい薬剤
は、ＭＰＴの喪失を阻害する。変更したミトコンドリア機能に関する疾患として
、ＡＤ、真性糖尿病；パーキンソン病：ハンチントン病；失調症；レーバー遺伝
性視神経萎縮；精神分裂病；ミトコンドリア脳障害、乳酸アシドーシス、および
発作（ＭＥＬＡＳ）；癌；乾癬；過剰増殖障害；ミトコンドリア糖尿病ならびに
難聴（ＭＩＤＤ）および不整赤色線維を伴うミオクローヌスてんかん、が挙げら
れるがこれらに限定されない。このような疾患は、当該分野で周知の標準的な臨
床基準を使用して診断され得る。
【０１３４】 ＭＰＴ変更薬剤は、ＡＮＴおよびＣｙｐＤポリペプチドの結合または活性に関
する疾患の処置を可能にするので、一般的に、ＭＰＴ変更薬剤は、治療目的のた
めに有益である。ＡＮＴ−ＣｙｐＤ結合を直接的に増強するかまたは弱めること
によってもしくはＡＮＴ−ＣｙｐＤ結合に影響を及ぼすミトコンドリアの分子成
分に間接的に影響することによって、ＭＰＴを変更するこの薬剤は、本発明の方
法で使用される場合、好ましくは薬学的組成物の一部である。薬学的組成物は、
１以上のＭＰＴ変更薬剤に加えて、少なくとも１つの薬学的に受容可能なキャリ
ア、希釈剤または賦形剤、および必要に応じて他の成分を含む。
【０１３５】 治療的な使用のための「薬学的に受容可能なキャリア」は薬学的分野で周知で
あり、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎ
ｎａｒｏ編、１９８５）に記載される。例えば、滅菌生理食塩水およびリン酸緩
衝生理食塩水が生理的ｐＨで使用され得る。保存剤、安定化剤、色素、さらに香
味剤が薬学的組成物に提供され得る。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸
およびｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルは、保存剤として添加され得る。さらに
、抗酸化剤および懸濁剤が使用され得る。
【０１３６】 「薬学的に受容可能な塩」は、このような化合物と有機酸もしくは無機酸との
組み合わせ（酸付加塩）、またはこの化合物と有機塩基もしくは無機塩基の組み
合わせ（塩基付加塩）から誘導された本発明の化合物の塩を言う。本発明の化合
物は、遊離塩基または塩の形態のいずれかにおいて使用され得、両形態は、本発
明の範囲内であると考えられる。
【０１３７】 １以上のＭＰＴ変更薬剤を含む薬学的組成物は、この組成物が患者に投与され
得る任意の形態であり得る。例えば、組成物は固体、液体または気体（エアロゾ
ール）の形態であり得る。局所投与経路として、経口、局所、非経口（例えば、
舌下、頬）、舌下、直腸、膣、および鼻腔内が挙げられるが、限定ではない。本
明細書中で使用される用語非経口は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨下、硬膜
下腔内、海綿体動脈内、道内、尿管間注射または注入技術を含む。薬学的組成物
は、その中に含まれる活性成分が、患者への組成物の投与において生物的に利用
可能であるように処方される。患者に投与される組成物は、１以上の投薬単位の
形態を取り、ここで例えば、錠剤は１の投薬単位であり得、そしてエアロゾル形
態中の本発明の１以上の化合物の容器は複数の投薬単位を保持し得る。
【０１３８】 経口投与のために、賦形剤および／または結合剤が存在し得る。例として、ス
クロース、カオリン、グリセリン、デンプン、デキストリン、アルギン酸ナトリ
ウム、カルボキシメチルセルロース、およびエチルセルロースが挙げられる。着
色剤および／または芳香剤が存在し得る。コーティング殻が使用され得る。
【０１３９】 この組成物は液体の形態（例えば、エリキシル、シロップ、溶液、エマルジョ
ン、または懸濁液）であり得る。液体は、２つの例として、経口投与または注射
による送達のためであり得る。経口投与が企図される場合、好ましい組成物は、
１以上のＭＰＴ変更剤に加えて、１以上の甘味剤、保存剤、色素／着色料および
芳香増強剤を含む。注射による投与が企図される組成物において、１以上の界面
活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝剤、安定化剤および等張剤が含
まれ得る。
【０１４０】 本明細書中で使用される液体の薬学的組成物は、溶液、懸濁液、または他の類
似形態のいずれであっても、１以上の次のアジュバンドを含み得る：注射用水の
ような滅菌希釈物、生理食塩水溶液、好ましくは生理学的食塩水、リンガー溶液
、等張性塩化ナトリウム、溶媒または懸濁媒体として役に立ち得る合成モノグリ
セリドまたは合成ジグリセリドのような不揮発性油、ポリエチレングリコール、
グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒；ベンジルアルコールまたは
メチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸、または亜硫酸水素ナトリウム
のような抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸のようなキレート剤；酢酸、ク
エン酸またはリン酸のようなバッファーおよび塩化ナトリウムまたはデキストロ
ースのような張度の調整のための薬剤。非経口の調製物は、アンプル、使い捨て
シリンジもしくはガラスまたはプラスチックの複数投薬バイアルに封入され得る
。生理学的生理食塩水は、好ましいアジュバントである。注射可能な薬学的組成
物は、好ましくは無菌である。
【０１４１】 非経口または経口投与のいずれかが企図される液体組成物は、適切な投薬量が
得られるＭＰＴ変更剤量を含むべきである。代表的には、この量は、組成物中に
少なくとも０．０１ｗｔ％のＭＰＴ変更剤である。経口投与が企図される場合、
この量は組成物の０．１〜約７０重量％の間で変化しうる。好ましい経口組成物
は、約４％〜約５０％の間のＭＰＴ変更剤を含む。好ましい組成物および調製物
は、非経口投薬単位が活性化合物の０．０１〜１重量％の間で含むように調整さ
れる。
【０１４２】 この薬学的組成物は局所投与が企図され得、このような場合、キャリアは溶液
、エマルジョン、オイントメントまたはゲル基材を適切に含み得る。例えば、ゲ
ル基材として、以下の１以上を含み得る：ペトロラタム、ラノリン、ポリエチレ
ングリコール、蜜蝋、鉱油、水およびアルコールのような希釈物、および乳化剤
および安定化剤。濃化剤が局所投与のための薬学的組成物中に存在し得る。経皮
投与が企図される場合、この組成物として経皮パッチまたはイオン導入デバイス
が挙げられる。局所的な処方物は、約０．１〜約１０％ｗ／ｖ（重量／単位容量
）の濃度のＭＰＴ変更剤を含み得る。
【０１４３】 組成物は、例えば、直腸で溶解し、薬物を放出する坐剤の形態で、直腸投与を
企図され得る。直腸投与のための組成物は、適切な非刺激性の賦形剤として油性
基材を含み得る。このような基材として、ラノリン、ココアバターおよびポリエ
チレングリコールが挙げられるが、限定ではない。
【０１４４】 本発明の方法において、ＭＰＴ変更剤は、挿入物、ビーズ、徐放性処方物、パ
ッチまたは高速放出処方物であり得る。ＭＰＴ変更剤の最適な投薬量が、以下に
依存し得ることは当業者には明白である；患者の体重および物理状態；処置され
る物理的状態の重症度および寿命；活性成分の特定の形態；使用される投与手段
および組成物。化学療法におけるＭＰＴ変更剤の使用として、別の化合物に結合
する薬剤、例えば、この化合物の送達を補助するモノクローナル抗体またはポリ
クローナル抗体、タンパク質またはリポソームが挙げられ得ることが理解される
。
【０１４５】 以下の実施例は、限定目的でなく例示目的で提供される。
【０１４６】 （実施例） （実施例１：細菌におけるＨｉｓタグ化ヒトＡＮＴ（６×Ｈｉｓ−ＡＮＴ）タ
ンパク質のクローニングおよび発現） （Ａ．ＡＮＴ ｃＤＮＡのＰＣＲによる増幅） ヒトの脳全体から調製された細胞の総ＲＮＡを、市販の供給源物質から得た（
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）。このＲＮＡを、３７℃で３０
分間ＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、以前はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）（緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、６ｍＭ 塩化マグネシウム、および２ｍＭ 塩化カルシウムを含有する）中の１μｇのＤＮａｓｅ Ｉ（１０Ｕ／μｌ）を
用いた）処理により精製した。この処理の後に、２回のフェノール／クロロホル
ム抽出、１回のクロロホルム抽出、および酢酸ナトリウムの存在下でエタノール
沈殿を行った。ＲＮＡのペレットを遠心分離により収集し、７０％エタノールで
洗浄し、風乾し、そしてＲＮａｓｅフリー滅菌水に再縣濁した。ＲＮａｓｅ Ｈ
欠損逆転写酵素（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴTM；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ．Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を用いてｃＤＮＡを生成するために、このＲ
ＮＡを逆転写した。
【０１４７】 ＡＮＴ ｃＤＮＡを、製造者の説明書に従って、以下のプライマー、ＡＭＰＬ
ＩＴＡＱTM ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ならびにＧＥＮＥＡＭＰTM ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔキット
（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に供給された試薬および緩衝液を用いてサーマル
サイクラーでのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。以下に記載の
プライマーにおいて、下線が引かれたヌクレオチドは、ＡＮＴ ｃＤＮＡの５’
末端および３’末端と相補的な配列を示し、二重線が引かれたヌクレオチドは、
制限酵素ＸｈｏＩ（認識配列；５’−ＣＴＣＧＡＧ）および制限酵素Ａｓｐ７１
８（認識配列；５’−ＧＧＴＡＣＣ）の認識配列を示し、そしてＡＮＴ開始コド
ン（ＡＴＧ）およびＡＮＴ終止コドンの逆方向の相補鎖（ＴＡＡ）は、太字で示
される。
【０１４８】 ヒトＡＮＴ１（ｈｕＡＮＴ１；配列番号１）に対して、次のヌクレオチド配列
を有するプライマーを用いた： 正方向（センス）：
【０１４９】
【化１】 （配列番号４）、および 逆方向（アンチセンス）
【０１５０】
【化２】 （配列番号５）。
【０１５１】 ヒトＡＮＴ２（ｈｕＡＮＴ２；配列番号２）に対して、次のヌクレオチド配列
を有するプライマーを用いた： 正方向（センス）：
【０１５２】
【化３】 （配列番号６）、および 逆方向（アンチセンス）
【０１５３】
【化４】 （配列番号７）。
【０１５４】 ヒトＡＮＴ３（ｈｕＡＮＴ３；配列番号３）に対して、次のヌクレオチド配列
を有するプライマーを用いた： 正方向（センス）：
【０１５５】
【化５】 （配列番号８）、および 逆方向（アンチセンス）
【０１５６】
【化６】 （配列番号９）。
【０１５７】 （Ｂ．ＡＮＴ発現構築物の作製） ＰＣＲ産物を、製造者の推奨に従い、製造者の提供する反応緩衝液を用いて、
制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＡｓｐ７１８で消化した（両酵素は、Ｒ
ｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した）。制
限処理したＤＮＡを、水平方向のアガロースゲル電気泳動およびＵｌｔｒａＣｌ
ｅａｎTM ＧｅｌＳｐｉｎキット（Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
Ｉｎｃ．、Ｓｏｌａｎａ Ｂｅａｃｈ、ＣＡ）を用いたバンドの抽出により精製
した。
【０１５８】 発現ベクターｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（「Ｂ」誘導体；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａ
ｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いた。このベクターは、５’から３’方向に作動可能
に連結された以下のエレメントを含有する：誘導性であるが、厳密に調節可能な
ａｒａＢＡＤプロモーター；Ｅ．ｃｏｌｉに最適化された翻訳開始シグナル；ア
ミノ末端ポリヒスチジン（６×Ｈｉｓ）をコードする配列（「Ｈｉｓタグ」とも
呼ばれる）；ＸＰＲＥＳＳTMエピトープをコードする配列；エンテロキナーゼ切
断部位（タンパク質精製後に前述のＮ末端アミノ酸を除去するために使用され得
るこのような方法が所望される場合）；マルチクローニングサイト；およびイン
フレームの終止コドン。
【０１５９】 プラスミドｐＢＡＤ／ＨｉｓのＤＮＡを、製造者の説明書に従い、制限エンド
ヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＡｓｐ７１８で消化することにより調製し、そして
水平方向のアガロースゲル電気泳動およびＵｌｔｒａＣｌｅａｎTM ＧｅｌＳｐ
ｉｎキット（Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いたバンドの抽出
に供した。制限処理したＡＮＴのｃＤＮＡを、製造者の反応緩衝液を使用しそし
て製造者の説明書に従って、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｒｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いて、制限処理した発現ベクタ
ーのＤＮＡに連結した。製造者の説明書に従って、コンピテントなｒｅｃＡ１
ｈｓｄＲ ｅｎｄＡ１ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ＴＯＰ１０Ｆ’株；Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ）を、この原核生物用ベクター構築物を含有するライゲーション混合物で
形質転換した。単一のコロニーを選択し、そして５０μｇ／ｍｌのアンピシリン
（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含有する３
〜５ｍｌのＬＢブロス（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．、
およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、
ＮＹ、１９８９）中で培養した。プラスミドＤＮＡを、ＷＩＺＡＲＤTMＰｌｕｓ
Ｓｅｒｉｅｓ ９６００ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｓｙｓｔｅ
ｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、細菌培養物から単離し
た。
【０１６０】 発現構築物中に存在する組み換えｈｕＡＮＴヌクレオチド配列を決定し、ＰＲ
ＩＳＭTM Ｒｅａｄｙ ＢＩＧ ＤＹＥTM Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｈｅ Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒ
ｐ．、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）および以下の配列決定用プライマーを用いたＤＮ
Ａ配列決定により、公開されているＡＮＴ配列（ｈｕＡＮＴ１については、図１
；Ｎｅｃｋｅｌｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．８４：７５８０〜７５８４（１９８７）；ｈｕＡＮＴ２につては、Ｂａｔｔ
ｉｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４３５５〜４３５９（１９８７）
、およびｈｕＡＮＴ３については、Ｃｏｚｅｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２
０６：２６１〜２８０（１９８９）を参照のこと）と比較してその信頼性を確認
した。
【０１６１】
【化７】 それぞれのヒトｈｕＡＮＴ配列について、両方のプライマーは、挿入されたＤＮ
Ａに隣接するベクター配列の内側に位置付けされる。配列データを、ＳＥＱＵＥ
ＮＣＥ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲTM分析ソフトウェアパッケージ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ
ｌｍｅｒ）を用いて分析した。このヒトｈｕＡＮＴ３発現構築物を、ｐＭＫ３Ａ
−ｈｕＡＮＴ３と命名した。
【０１６２】 Ｈｉｓタグ化ヒトＡＮＴ１、ＡＮＴ２、およびＡＮＴ３をコードするこの発現
プラスミドは、本明細書中で次のように呼ばれる：ヒトＡＮＴ１については、「
ｐＭＫ１（Ｈｉｓタグ化ｈｕＡＮＴ１）」または「ｐＭＫ１」；ヒトＡＮＴ２に
ついては、「ｐＭＫ２（Ｈｉｓタグ化ｈｕＡＮＴ２）」または「ｐＭＫ２」；ヒ
トＡＮＴ３については、「ｐＭＫ３Ａ（Ｈｉｓタグ化ｈｕＡＮＴ３）」または「
ｐＭＫ３Ａ」；以下に詳述されるように、外側リンカーＮ末端アミノ酸が欠損さ
れているヒトＡＮＴ３については、「ｐＭＫ３Ｂ（エピトープリンカーを短縮さ
れた、Ｈｉｓタグ化ｈｕＡＮＴ３）」または「ｐＭＫ３Ｂ」。プラスミドｐＭＫ
１、ｐＭＫ２、およびｐＭＫ３Ａは、１９９８年１１月３日にアメリカンタイプ
カルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に寄託され、そ
してそれぞれ受託番号ＡＴＣＣ９８９６９、ＡＴＣＣ９８９７０、およびＡＴＣ
Ｃ９８９７１が付与されている。
【０１６３】 ヒトＡＮＴ１（ｐＭＫ１−ｈｕＡＮＴ１）およびヒトＡＮＴ２（ｐＭＫ２−ｈ
ｕＡＮＴ２）をコードするヌクレオチド配列を含有する発現構築物を制限マップ
化し、これらの構造を確認した。プラスミドｐＭＫ１−ｈｕＡＮＴ１およびｐＭ
Ｋ２−ｈｕＡＮＴ２のヌクレオチド配列を、上述の方法およびプライマー（配列
番号１０および配列番号１１）を用いて決定する。
【０１６４】 ｐＭＫ３Ａ−ｈｕＡＮＴ３から発現した組換えｈｕＡＮＴ３タンパク質のエン
テロキナーゼ処理により、ｈｕＡＮＴ３タンパク質からＨｉｓ−Ｔａｇ／ＸＰＲ
ＥＳＳTMエピトープポリペプチドを遊離させた；しかし、生じたｈｕＡＮＴ３タ
ンパク質は、いくらかの外側Ｎ末端アミノ酸（すなわち、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅ
ｒ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ、「Ｍｅｔ」はｈｕＡＮＴ３の翻訳開始コドンによりコード
されたアミノ酸を示す）を含有した。この外側アミノ酸はおそらく、組換えｈｕ
ＡＮＴ３タンパク質に対して、ほとんど影響がないか、あるいは全く影響がない
が、この外側アミノ酸をコードするヌクレオチド配列が欠損された誘導体発現構
築物を、以下の様式で調製した。
【０１６５】 ＱＵＩＫ−ＣＨＡＮＧＥTM Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅ
ｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）は、本質的
に製造者の説明書に従って使用した。簡単に言うと、製造者の提供する反応緩衝
液中に精製されたプラスミドｐＭＫ３Ａ−ｈｕＡＮＴ３ ＤＮＡ、変異誘導性オ
リゴヌクレオチドプライマー
【０１６６】
【化８】 （配列番号１２） （下線が引かれた配列は、ｈｕＡＮＴ３のリーディングフレームの５’末端に対
して逆方向の相補である）、および
【０１６７】
【化９】 （配列番号１３）（下線が引かれた配列は、ｈｕＡＮＴ３のリーディングフレー
ムの５’末端に対応する）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰを含有
する反応混合物を調製した。この変異誘導性オリゴヌクレオチドプライマーを過
剰に存在させ、そして製造者のプロトコルに従って、ＤＮＡ合成のサイクルを、
サーマルサイクラーにおいて実行した。この反応産物を制限酵素ＤｐｎＩ（この
酵素は、メチル化したＤＮＡおよび半メチル化したＤＮＡを切断するが、メチル
化していないＤＮＡ（すなわち、アニーリングした反応産物）はインタクトなま
ま残す）で処理し、これを用いてＥＰＩＣＵＲＥＡＮ ＣＯＬＩTM ＸＬ−１−
Ｂｌｕｅ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌ
ｌａ、ＣＡ）を形質転換した。プラスミドＤＮＡを無作為に選択した１２個の形
質転換体から調製し、そして上述の方法に従って、マルチクローニングサイトの
カセットを含む領域のヌクレオチド配列を決定した。１２個のうちわずか１つの
プラスミドが、ｐＭＫ−ｈｕＡＮＴ３で見出される本来の配列を保持しており、
そして３個のプラスミドが、望ましくない点変異を含んでいた。８個の「正確な
」プラスミドのうちの１個を選択し、そしてｐＭＫ３Ｂ−ｈｕＡＮＴ３と命名し
た。
【０１６８】 （Ｃ．Ｈｉｓタグ化ｈｕＡＮＴ３の発現） ｐＭＫ３Ａ−ｈｕＡＮＴ３を含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞の培養物を、５０μｇ
／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地で、対数増殖中期（ＯＤ600約０．５
）まで増殖し、そして漸増量のＬ−アラビノース（すなわち、０．００００２％
、０．０００２％、０．００２％、０．０２％および０．２％）を用いて３〜４
時間誘導した。１ｍｌの各培養物を５，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し
、細胞をペレットにした。細胞のペレットを、１％ コール酸塩、１％ ｎ−ド
デシルマルトシド、および０．１％ ２−メルカプトエタノールを含有する１０
０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）を加えることにより再縣
濁し、そして溶解した（前述のテキストにおいて、および本明細書を通して、別
途特定されない限り、全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ
から購入した）。この溶解物に含まれる総タンパク質を、ＢＣＡ（ビシンコニッ
ク（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ）酸；Ｓｍｉｔｈら、１９８５、Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．１５０：７６−８５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキット（Ｐｉ
ｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて決定
した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上のレーンごとに、１０μｇの総タンパク
質をロードし、電気泳動し、そしてニトロセルロースメンブレン（ＨＹＢＯＮＤ TM ＥＣＬ Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、以前はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆ
ｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に転写した。ヒトＡＮＴ
３融合タンパク質を、製造者の説明書に従い、ＡＮＴＩ−ＸＰＲＥＳＳTM Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合
体化抗マウス二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ）を用いたウエスタンブロットで検出した。
【０１６９】 この結果を図３に示す。図の左から右に、次のサンプルが示される：レーン「
Ｍ」、分子量マーカー；レーン「０」、形質転換されていないＥ．ｃｏｌｉ細胞
；レーン「ｏ／ｎ」、誘導せずに一晩培養したｐＭＫ３Ａ−ｈｕＡＮＴ３を含有
するＥ．ｃｏｌｉ；レーン「１」〜「５」、漸増量のＬ−アラビノース（それぞ
れ、０．００００２％、０．０００２％、０．００２％、０．０２％および０．
２％）で誘導培養したｐＭＫ３Ａ−ｈｕＡＮＴ３を含有するＥ．ｃｏｌｉ。予想
した通り、形質転換されていないＥ．ｃｏｌｉ（レーン０）および誘導されてい
ないＥ．ｃｏｌｉ（レーンｏ／ｎ）は、ＸＰＲＥＳＳTM−ｈｕＡＮＴ３物質を示
さなかった。しかし、分子量３６．６ｋＤの組換えＡＮＴ３融合タンパク質の発
現が、レーン３およびレーン４（それぞれ、０．００２％および０．０２％のＬ
−アラビノース）で観察された。ＸＰＲＥＳＳTM−ｈｕＡＮＴ３物質は、レーン
１およびレーン２（それぞれ、０．００００２％および０．０００２％のＬ−ア
ラビノース）で検出されなかった。このことから、これらの条件下では誘導の程
度が不十分であったことが示される。
【０１７０】 最も高い濃度のＬ−アラビノース（０．２％、レーン５）の存在下で培養した
細胞は、集菌の時より前に溶解し始め、そして死滅した；結果的に、組換えタン
パク質が、検出されなかった。このことから、Ｅ．ｃｏｌｉにおける、非常に高
い組換えｈｕＡＮＴの発現が、細胞死を引き起こしたことが示された。同様のこ
とは、細菌における異種タンパク質の過剰発現の間のケースでもときどき起こる
。
【０１７１】 （Ｄ．組換えｈｕＡＮＴ３は細菌の膜に局在化する） Ｅ．ｃｏｌｉ細胞内で発現されたヒトＡＮＴ３を局在化するために、細胞を培
地中で培養し、上述のようにＬ−アラビノースで誘導し、そして異なる区画に細
分化した（例えば、膜、封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｉｅｓ）およびサ
イトゾル）。細菌を、５，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離することでペレ
ットにした。細胞のペレットを、１／１０量の細胞緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌ リゾチー
ムおよび０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で再縣濁し、そして３０℃で１５
分間、旋回性シェーカー内でインキュベートした。この細胞混合物を、２分間超
音波破砕し、そして膜を、１２，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離すること
によりペレットにした。サイトゾルを示すこの上清を、分析のために回収し（図
４、レーン４）、膜および封入体を含有するペレットの一部を同様に回収した（
図４、レーン３）。ペレットの残りの部分を、細胞緩衝液Ｂ（１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１ｍＭ ＤＴＴ）
で二度洗浄し、１２，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。このペレット
を、細胞緩衝液Ｃ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、６ｍＭ 塩酸グアニジウム）で再縣濁し、そして室温で１時
間インキュベートした。次いでこの溶液を、１２，０００×ｇ、４℃で１５分間
遠心分離した。この上清（可溶性封入体を含有する；図４、レーン１）およびこ
のペレット（不溶性封入体を含有する；図４、レーン２）を、上述のウエスタン
ブロットにより分析した。
【０１７２】 結果を図４に示す。組換えｈｕＡＮＴ３（分子量３６．６ｋＤ）は、レーン２
、３、および４、ならびにポジティブコントロールレーン（＋）（上記のように
ウエスタン免疫ブロット分析によってＡＮＴ３タンパク質の存在について以前に
試験された総細胞溶解物）において検出した。最大量の組換えｈｕＡＮＴ３をレ
ーン３において検出し、これは膜画分を示す。このことは、ｈｕＡＮＴ３融合タ
ンパク質の大多数が、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞膜に組み込まれたことを意味する。より
小さいタンパク質シグナルが、レーン２および４において可視であり、組み込ま
れたＡＮＴ３といくつかの膜を含んでいたかもしれない不溶性の封入体画分、お
よびタンパク質合成が生じる細胞質画分を示す。レーン１の可溶性封入体画分に
おいて検出可能なタンパク質は存在せず、細菌中のＡＮＴ３の発現制御は、封入
体の形成において生じなかったことを示し、これは、細菌中のいくつかの異種タ
ンパク質の過剰発現の望ましくない結果である。
【０１７３】 （Ｅ．ＡＮＴタンパク質の精製） 本明細書中に記載される発現系によって産生されるＡＮＴタンパク質、および
ＡＮＴ融合タンパク質は、種々の方法を使用して精製されてきた。ＡＮＴタンパ
ク質の精製、特にヒトＡＮＴタンパク質が、この実施例において記載される。
【０１７４】 以下のタンパク質精製方法のいずれが使用されるか、または、本開示に由来し
得る他の方法が使用されるかにも関わらず、細菌細胞が溶解されている場合（ま
たはそのすぐ後に）、いくつかの細菌溶解物（代表的には、１０μｇ／ｍＬの各
酵素；共にＲｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより）に関連した粘性を除去
するのに、十分な量のＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅを添加することが重要である
。粘性が除去され、そして、ＡＮＴ溶解性が最適化される代替的なまたは付加的
な手段は、標準的な超音波処理と反対に、溶解物の激しい超音波処理である。用
語「激しい超音波処理」は、例えば、テーパー状の先端が平らのプローブを使用
する（カップアンドホーン（ｃｕｐ ａｎｄ ｈｏｒｎ）装置を用いる超音波処
理と反対に）５０％の義務サイクルおよび８０％の出力で、２回の（各回３０秒
）、Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（Ｍｏｄｅｌ ４５０）を使用する超音
波処理をいう。超音波処理のいずれかのタイプが十分であるが、激しい超音波処
理が使用される場合、代表的により優れた収率が観察される。
【０１７５】 さらに、使用される種々のＡＮＴ精製方法において、最大の可能な量のＡＮＴ
タンパク質を可溶化するために、少なくとも１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで、溶解物を
作製することがしばしば所望であり、その後、不溶性物質を高速（すなわち、約
１００，０００ｇ）遠心分離によって除去した。代表的には、例えば、ペプスタ
チン、ロイペプチン、フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）およ
び／またはアプロチニン（全てＳｉｇｍａより）が、調製の間に、効果的なレベ
ル（代表的には１０μｇ／ｍＬ）で存在する。単離される特定のＡＮＴタンパク
質またはＡＮＴ融合タンパク質に依存して、４つ全てのプロテアーゼインヒビタ
ーまたは効果的なその任意の組み合わせが使用される。例えば、ＧＳＴ−ｈｕＡ
ＮＴ３融合タンパク質の調製において、ロイペプシンおよびペプスタチンのみが
使用される場合、許容範囲の結果が得られるが、４つ全てのプロテアーゼインヒ
ビターが使用される場合、もっとも優れた結果が観察される。
【０１７６】 １つの方法は、非ヒト哺乳動物（すなわち、ウシ心臓組織およびラット）由来
のＡＮＴタンパク質を精製するためだけに以前使用された、いくつかの技術と新
規の方法を組み入れる（Ａｑｕｉｌａら、１９８２．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ
’ｓ Ｚ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６３：３４５−３４９；およびＳｔ
ｅｒｌｉｎｇ，１９８６，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １１９：２９２−２９
５）。手短に言うと、ＧＳＴ−ＡＮＴ３融合タンパク質を発現する細菌細胞をリ
ゾチ−ム処理によって溶解し、そして、Ｅ．ｃｏｌｉの１グラム当り５０ｎｍｏ
ｌの濃度で、14Ｃ−パルミチル−ＣｏＡ（Ｓｉｇｍａ）を添加した。それは、Ａ
ＮＴタンパク質と会合するので、14Ｃ−パルミチル−ＣｏＡは、引き続く精製工
程におけるＡＮＴタンパク質に伴うように使用され得る放射性標識トレーサーと
して作用する。次いで、溶解物を超音波処理し、６％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０（Ｓｉｇｍａ）を作製し、４℃で１時間インキュベートして物質を可溶化した
。高速遠心分離を使用して、不溶性物質を除去し、そして、基本的に製造業者の
指示に従って、得られた溶質を（１）小規模調製のために、ヒドロキシアパタイ
トビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃ
Ａ）か、または（２）大規模の調製の場合（すなわち、１リットルを超える細菌
培養物）、ヒドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のいずれかに適用し
た。他の膜内のミトコンドリアタンパク質とは異なり、ＡＮＴは、ヒドロキシア
パタイトについて低い親和性を有する（Ｋｌｉｎｇｅｎｂｅｒｇら、１９７８、
Ｂｉｏｃｈｉｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５０３：１９３−２１０）
。ヒドロキシアパタイトカラムをＣｏｌｕｍｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ａ（１０ｍＭ
ＭＯＰＳ，ｐＨ ７．２，１００ｍＭ ＮａＣｌ，９．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
１００）を使用して溶出し、そして、Ｃｏｌｕｍｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ（１０ｍ
Ｍ ＭＯＰＳ，ｐＨ ７．２，１００ｍＭ ＮａＣｌ，４００ｍＭ リン酸ナト
リウム）を使用して洗浄した。非ヒト種由来の非組換えＡＮＴタンパク質を、Ｃ
ｏｌｕｍｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ａを使用して空間（ｖｏｉｄ）容量で溶出し、そし
て、ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３融合タンパク質が、空間容量にも同様に存在すること
が予想される；Ｃｏｌｕｍｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂを使用して、ＧＳＴ−ｈｕＡＮ
Ｔ３融合タンパク質が異なって挙動する事象においてカラムを洗浄する。最終濃
度３０ｍＭ オクチルグリコシド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（活性に対する最小
の効果を有するＡＮＴタンパク質を可溶化するのを助ける非イオン性界面活性剤
）を有するような様式で、サンプルを収集した（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，１９８６，
Ｅｎｄｒｏｃｒｉｎｏｌ．１１９：２９２−２９５）。ビーズ抽出された上清ま
たはカラム溶出液を収集し、そして、基本的に製造業者の指示に従って、ＥＸＴ
ＲＡＣＴＩ−ＧＥＬTMアフィニティーマトリックス（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して
、そこからＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を除去した（また、Ｂｅｒｍａｎら、１９
８５、Ｂｉｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４：７１４０−７１４７を参照のこと）。
【０１７７】 上記方法で調製された種々の量のＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３をＰＡＧＥに供し、そ
して、ゲルを、コロイド性青色タンパク質染色（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ，ＣＡ）を使用して染色した。この染色されたゲルは、融合タンパク質につい
て推定された分子量に対応する分子量を有する単一バンドを示した。種々の容量
のサンプル由来のバンド強度、そして、公知の調製物の容量および染色の最小感
受性に基づいて、１００ｍＬの細菌培養物由来の収量は、約５０μｇであると推
定される。ゲルの１つのレーンにおいて、約５００ｎｇのタンパク質をロードし
、そして、混入したバンドは検出されなかった；このことは、ＧＳＴ−ｈｕＡＮ
Ｔ３タンパク質が、少なくとも約９０％純粋〜少なくとも約９５％純粋であるこ
とを示す。
【０１７８】 ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３融合タンパク質（前述の実施例を参照のこと）は、この
方法によって精製され、そして他のＡＮＴ融合タンパク質（Ｈｉｓタグ化ｈｕＡ
ＮＴ３および他のＨｉｓタグ化ＡＮＴタンパク質を含む）が同様の様式で精製さ
れる。精製されたｈｕＡＮＴ３融合タンパク質を使用して、以下のように精製さ
れたヒトＡＮＴタンパク質を産生する。
【０１７９】 ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３融合タンパク質は、基本的に製造業者の指示に従って、
グルタチオン−アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）を介してさらに精製される。手
短に言うと、ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ融合タンパク質を含む溶液をグルタチオン−ア
ガロースビーズと接触させ、そして、ビーズを洗浄して所望でない混入物を放出
する。次に、［樹脂：ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ］複合体を適切な酵素（すなわち、融
合タンパク質の残りに由来するｈｕＡＮＴポリペプチドを分離する酵素）で処理
する。本明細書中で記載されるＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３融合タンパク質（すなわち
、ｐＭＫ３Ｃによってコードされる）の場合、トロンビン（Ｓｉｇｍａ）は、２
つのポリペプチド：ＧＳＴ部分に対応する第１のポリペプチド、および６つのさ
らなるアミノ酸（すなわち、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ
）がそのＮ末端に存在するヒトＡＮＴ３に対応する第２のポリペプチド、を産生
するような方法で、融合タンパク質を切断する。
【０１８０】 Ｈｉｓタグ化ｈｕＡＮＴ融合タンパク質を、基本的に製造業者の指示に従って
、ニッケルコーティング樹脂（例えば、ＰＲＯＢＯＵＮＤTMＮｉ2+電荷アガロー
ス樹脂；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎなど）を介してさらに精製した。手短に言うと、
Ｈｉｓタグ化ｈｕＡＮＴ融合タンパク質を含む溶液をニッケルコーティング樹脂
と接触させ、そして、この樹脂を洗浄して所望でない混入物を放出した。次に、
［樹脂：Ｈｉｓタグ化−ｈｕＡＮＴ］複合体を適切な酵素（すなわち、融合タン
パク質の残りに由来するｈｕＡＮＴポリペプチドを分離する酵素）で処理する。
本明細書中で記載されるＨｉｓタグ化−ｈｕＡＮＴ３融合タンパク質の場合、エ
ンテロキナーゼ（Ｓｉｇｍａ、またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎｎからのＥＫＭＡＸ TM も使用され得る）は、２つのポリペプチド：Ｈｉｓタグ化およびＸＰＲＥＳＳ TM エピトープ部分を含む第１のポリペプチド、およびヒトＡＮＴ３に対応する第
２のポリペプチド、を産生するような方法で、融合タンパク質を切断する。使用
される発現構築物がｐＭＫ３Ａである場合、得られた精製されたヒトＡＮＴ３タ
ンパク質は、そのＮ末端に４つのさらなるアミノ酸（すなわち、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ
−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）を有する。ｐＭＫ３Ｂが、Ｈｉｓタグ化ｈｕＡＮＴ３が単離
される細胞中に存在する発現構築物である場合、得られた精製されたヒトＡＮＴ
３タンパク質は、ネイティブなｈｕＡＮＴ３の配列（すなわち、配列番号３）を
有する。
【０１８１】 前述の両方の精製工程において、固体支持体に結合されたＡＮＴ融合タンパク
質を、融合タンパク質の残り（これは固体支持体に結合されたままである）から
ＡＮＴタンパク質を遊離酵素（すなわち、トロンビンまたはエンテロキナーゼ）
で処理する。ＡＮＴタンパク質は液相に放出され、次いで、収集されて、ＡＮＴ
タンパク質を含む溶液およびいくらかの量の遊離酵素を産生する。必要とされる
遊離酵素の量は最小である。なぜなら、この処理は、天然で触媒性であるためで
ある；それにも関わらず、いくつかの酵素は、調製物中に残ったままである。所
望であれば、酵素分子は、当該分野で公知の種々の手段のいずれかを使用して、
調製物中から除去され得る。例えば、酵素は、その酵素について高い親和性を有
するリガンドに結合体化した樹脂を使用して、溶液と接触させることによって溶
液から除去され得る。エンテロキナーゼの場合では、このような樹脂の１つは、
エンテロキナーゼについて高い親和性を有するダイズトリプシンインヒビターを
含む、ＥＫ−ＡＷＡＹTM樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。トロンビンでＧ
ＳＴ融合タンパク質を処置する方法および所望の組換えタンパク質を精製する方
法が以前に記載されている（例えば、ＳｍｉｔｈおよびＣｏｒｃｏｒａｎ，Ｓｈ
ｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第
２版、１６章、ユニット１６．７、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２、１６−２８〜１
６−３１頁）。しかし、一般的に、任意の所定のＡＮＴタンパク質から遊離酵素
を分離するための任意の適した方法が使用され得る。
【０１８２】 （実施例２：） （ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３融合タンパク質の発現） （Ａ．ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３発現構築物の作製） 以下のプライマーを使用するが、実施例１のように、ＰＣＲによって、ｐＭＫ
３Ａ−ｈｕＡＮＴ３からヒトＡＮＴ３を増幅した。ＰＣＲプライマーの以下の提
示において、下線部のヌクレオチドは、ＡＮＴ ｃＤＮＡの５’末端および３’
末端に相補的な配列を示し、そして、二重下線部のヌクレオチドは、制限酵素Ｘ
ｈｏＩ（認識配列：５’−ＣＴＣＧＡＧ）またはＥｃｏＲＩ（認識配列：５’−
ＧＡＡＴＴＣ）についての認識配列を示す。
【０１８３】 ＰＣＲ増幅について使用されるプライマーは：
【０１８４】
【化１０】 発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、酵素ポリペプチドおよびＡＮＴポリペプチドを含
むｈｕＡＮＴ３融合タンパク質を産生した。このベクターは、Ｓｃｈｉｓｔｏｓ
ｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ由来のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）遺伝子に作動可能に連結されたｔａｃプロモーターｌａｃＩq（リプレッサ
ー）遺伝子を含む（Ｓｍｉｔｈら、１９８８、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）。
このコード配列は、多数のクローニング部位のすぐ５’側のトロンビン切断部位
をコードするヌクレオチド配列を含むように改変されている。ＧＳＴ融合タンパ
ク質は、抗ＧＳＴを用いるウエスタンブロットによってかまたは比色定量アッセ
イを使用することによって検出され得る；後者のアッセイは、ＧＳＴの基質とし
て、グルタチオンおよび１−クロロ−２−４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）を
利用し、そして、３４０ｎｍで検出可能な黄色産物を生じる（Ｈａｂｉｇら、１
９７４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：７１３０−７１３９）。この発現ベ
クター由来の発現構築物から産生されたＧＳＴ融合タンパク質は、例えば、グル
タチオン親和性クロマトグラフィーによって精製され得、そして、所望のポリペ
プチドが、トロンビンによる融合産物から放出され得る。従って、この発現ベク
ターは、融合タンパク質の迅速な精製、および比較的小数の異種Ｎ末端アミノ酸
を有するタンパク質の放出を提供するが、得られた組換え的に産生されたタンパ
ク質は、アミノ末端に２つのさらなるアミノ酸（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を含む。この
ｔａｃプロモーターは、例えば、１〜５ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トピラノシド（ＩＰＴＧ；Ｆｌｕｋａ，Ｍｉｌｕｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）の培養さ
れた細胞への添加によって誘導され得、そして、高レベルの発現を提供する。
【０１８５】 プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−２を、製造業者の指示に従って、制限エンドヌク
レアーゼＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを用いて消化することによって調製し、そし
て、水平アガロースゲル電気泳動およびＵｌｔｒａＣｌｅａｎ ＧｅｌＳｐｉｎ
ｋｉｔ（Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するバンド抽出に
供した。制限されたＡＮＴ ｃＤＮＡを、前述の実施例に記載されるように、制
限された発現ベクターを用いて連結した。単一コロニーを５０μｇ／ｍｌアンピ
シリン（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む
３〜５ｍｌのＬＢブロース中での増殖のために選択し、そして、ＷＩＺＡＲＤTM Ｐｌｕｓ Ｓｅｒｉｅｓ ９６００ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔｓ
Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細菌培養物からプラスミドＤＮＡ
を単離した。これらの確実性を確かめるために、ｐＧＥＸ誘導体プラスミド中に
存在する組換えｈｕＡＮＴヌクレオチド配列を、以前に記載されたオリゴヌクレ
オチドプライマーおよび５’および３’ＰＧＥＸ配列決定プライマー（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、前述の実施例に
記載されるように決定した。
【０１８６】 得られたＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３発現構築物をｐＭＫ３Ｃ−ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ
３と命名した（また本明細書中でｐＭＫ３Ｃともいう）。プラスミドｐＭＫ３Ｃ
を１９９８年１１月３日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に寄託し、そして、登
録番号ＡＴＣＣ９８９７３を与えられた。ｐＭＫ３Ｃ−ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３発
現構築物から産生されたトロンビン処理組換えｈｕＡＮＴ３タンパク質は、いく
つかの異種Ｎ末端アミノ酸（すなわちＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ
−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ）を含み、ここで、「Ｍｅｔ」は、ｈｕＡＮＴ３の翻訳開始コ
ドンによってコードされたアミノ酸を示す。しかし、６つの異種アミノ末端アミ
ノ酸が、得られた組換えｈｕＡＮＴ３タンパク質に対する何らかの効果を有する
証拠はない。
【０１８７】 ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３融合タンパク質の発現を確認するために、以下の実験を
行った。８個の独立して単離したｐＭＫ３Ｃ−ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３形質転換体
および１つのコントロール（ベクター形質転換）単離体を、ＬＢ−アンピシリン
中で一晩増殖し、次いで、２ｍｌの新鮮な培養液で１：２０に希釈した。３７℃
で３時間増殖した後、ＩＰＴＧを、０．１ｍＭの最終濃度まで添加した。細胞増
殖を２時間続け、この後、１．５の細胞をミクロチューブに移し、ペレット化し
、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む冷却したＰＢＳ３００μＬに再懸
濁し、そして８秒間、２回超音波処理した。超音波処理器を４°で５分間回転さ
せ、懸濁液を新しいミクロチューブに移し、そして５０μＬのグルタチオン−ア
ガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）を添加して、５０％スラリーを生成した。周囲温
度で５分間インキュベートした後、このビーズを回転させ、そして１ｍｌのＰＢ
Ｓで３回洗浄した。この洗浄したペレットをＳＤＳｓｐｌ緩衝液（６２．５ｍＭ
Ｔｒｉｓ、ｐＨ ６．８、２％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール、５％ β−
メルカプトエタノール、および可視の呈色を与えるのに十分なブロモフェノール
ブルー）に再懸濁し、そして各々３０μＬの調製物（１５μＬの培養液に等しい
）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲルを、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｏｏｍａｓｓ
ｉｅ（Ｇ−２５０）Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｎｏｖｅｘ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ、ＤＡ）を使用して染色した。ｐＭＫ３Ｃ−ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３形質転換体
由来の８種の調製物の各々において、同じ強度を有する予測分子量のＧＳＴ−ｈ
ｕＡＮＴ３融合タンパク質のバンドは容易に明らかであり；このバンドはコント
ロール調製物においては存在しなかった。
【０１８８】 （Ｂ．ｈｕＡＮＴ３融合タンパク質の発現のウエスタンブロット分析） （１）ｐＭＫ３Ａ−ｈｕＡＮＴ３（ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ−ｈｕＡＮＴ３発現構築
物）または（２）ｐＭＫ３Ｃ−ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３（ｐＧＥＸ／ＧＳＴ−ｈｕ
ＡＮＴ３発現構築物）のいずれかで形質転換したＥ．ｃｏｌｉを、室温で２０分
間のリゾチーム（１００μｇ／μｌ；Ｓｉｇｍａ）の添加、続く１回の凍結／解
凍サイクルにより溶解した。前者の形質転換体の陰性コントロールは、アラビノ
ース誘導を受けなかった形質転換細胞の並行培養物であった。後者の形質転換体
のコントロールは、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２ベクターのみで形質転換したＥ．ｃｏｌ
ｉの並行培養物であった。
【０１８９】 各溶解物の全タンパク質濃度を、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキット
（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を使用して決定し、そして、等量
の各溶解調製物由来の全タンパク質を、等量の２×Ｌａｅｍｍｉｌｉ電気泳動緩
衝液と混合し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。このタンパク質を、ニトロセ
ルロースに電形動的に移動させ、次いでこのニトロセルロースを、各ベクターに
含まれる適切なエピトープに対する抗体（すなわち、ｐＭＫ３Ａ−ｈｕＡＮＴ３
について、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＡＮＴＩ−ＸＰＲＥＳＳTM、およびｐＭＫ
３Ｃ−ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３について、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ（以前は、Ｎｙｃｏｍｅｄ Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｌｃ ａｎｄ
Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ ＵｐＪｏｈｎ Ｉｎｃ．）製のポリクローナルヤギ
抗ＧＳＴ）と接触させた。
【０１９０】 別個の実験において、ｐＭＫ３Ｃ−ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３形質転換体由来の細
菌溶解物を、メーカーの説明書に従って、アガロース−グルタチオンビーズ（Ｓ
ｉｇｍａ）と共にインキュベートした（前の章、およびＳｍｉｔｈら、Ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｕｔａｔｈｉｏ
ｎｅ Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，チャプ
ター１６の第１６．７部：Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２，１６−２８
〜１６−３１頁を参照のこと）。このビーズをＬｅａｍｍｌｉサンプル緩衝液に
懸濁し、そして上記のようにして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット
分析に供した。ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３の収率は低かったが、おそらく、融合タン
パク質が細菌膜に挿入されるため、この実験に十分な量の材料が回収された。
【０１９１】 この結果（図５）は、予測分子量（Ｈｉｓ−Ｔａｇ＋エンテロキナーゼ部位＋
抗原性部位＋ｈｕＡＮＴ３＝３８キロダルトン）の特定のバンドは、ｐＢＡＤ／
ｈｉｓ−ｈｕＡＮＴ３ベクターで形質転換したアラビノース誘導性Ｅ．ｃｏｌｉ
において観察されたが、非誘導性コントロール培養物においては存在しなかった
ことを示す。同様に、ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３に対応するバンドは、ｐＭＫ３Ｃ−
ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３で形質転換したＥ．ｃｏｌｉにおいて観察され、一方、変
化のないＧＳＴバンドのみが、発現ベクターで形質転換したコントロールＥ．ｃ
ｏｌｉにおいて観察された。アガロース−ＧＳＨビーズを使用するＧＳＴ−ｈｕ
ＡＮＴ融合タンパク質の精製により、ｐＭＫ３Ｃ−ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３形質転
換細菌の粗溶解物において観察されるものと同じサイズのバンドが生じた。
【０１９２】 （実施例３） （昆虫細胞におけるＡＮＴ３の発現） （Ａ．バキュロウイルス発現構築物の生成） ｈｕＡＮＴ３をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡを、以下のプライマ
ーを使用して、全ヒト脳ｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲに
よって増幅した。以下のＰＣＲプライマーの表示において、下線付きのヌクレオ
チドは、ＡＮＴ ｃＤＮＡの５’末端および３’末端に対して相補的な配列を示
し、そして二重線付きのヌクレオチドは、制限酵素ＢａｍＨＩ（認識配列：５’
−ＧＧＡＴＣＣ）またはＥｃｏＲＩ（認識配列：５’−ＧＡＡＴＴＣ）に対する
認識配列を示す。
【０１９３】 使用されたＰＣＲプライマーは、以下である： 前方（センス）：
【０１９４】
【化１１】 （配列番号１６）および 逆方向（アンチセンス）：
【０１９５】
【化１２】 （配列番号１７）。
【０１９６】 ＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼのＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ）で、製造者の使用書に従って消化した。続いて、水平アガロースゲル電気
泳動およびＵｌｔｒａＣｌｅａｎTMＧａｌＳｐｉｎキット（ＭｏＢｉｏ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用するバンド抽出によって、精製を行った
。
【０１９７】 バキュロウイルス転移ベクターのｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２（Ｂバージョン、
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、５’から３’の方向で、以下の（１）〜（４）をコ
ードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された構成的な多核プロモーターを
含む：（１）翻訳開始配列、（２）Ｎ末端ポリヒスチジン配列（「Ｈｉｓタグ」
）、（３）組換えタンパク質の検出および精製のためのＸＰＲＥＳＳTMエピトー
プタグ、および（４）エンテロキナーゼ切断部位、続いてｃＤＮＡが挿入され得
る多クローニング部位。
【０１９８】 転移ベクターｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２を、製造者の使用書に従って、制限エ
ンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化することによって調製し、
そして制限ＤＮＡを水平アガロースゲル電気泳動、およびＵｌｔｒａＣｌｅａｎ TM ＧｅｌＳｐｉｎキット（Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．
）を使用するバンド抽出に供した。制限ＰＣＲ産物を、上記の実施例におけるよ
うに、制限発現ベクターＤＮＡにライゲーションした。
【０１９９】 Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０Ｆ’コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を
、製造者の説明書に従って、ライゲーション反応物で形質転換した。５０μｇ／
ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢブロス３〜５ｍｌ中での増殖のための単一の
コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを、ＷＩＺＡＴＤTMＰｌｕｓ Ｓｅｒｉ
ｅｓ ９６００ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ）を使用して、細菌培養物から単離した。
【０２００】 組換えＡＮＴ遺伝子配列を決定し、そしてそれらの信頼性を、Ｐｒｉｓｍ Ｒ
ｅａｄｙ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｃｔａｌｏｇ ＃４０２０８０）および
以下のプライマーを使用するＤＮＡ配列決定によって確認した（配列番号１、２
および３は、ぞれぞれ、ヒトＡＮＴ１、２および３に対応する）：Ｐｏｌｙｈｅ
ｄｒｉｎ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｒｉｍｉｎｇ Ｓｉｔｅ
、５’−ＡＡＡＴＧＡＴＡＡＣＣＡＴＣＴＣＧＣ（配列番号１８）；Ｂａｃｕｌ
ｏｖｉｒｕｓ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｒｉｍｉｎｇ Ｓｉ
ｔｅ、５’−ＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＴＴＣＣ（配列番号１９）；ＡＮＴ
３コード配列の内部のプライマー（センス鎖）、５’−ＡＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣ
ＡＣＧＧＡＴＡ（配列番号２０）；および５’−ＴＡＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＡ
ＴＴＣＴ（配列番号２１）；ＡＮＴ３コード配列の内部のプライマー（アンチセ
ンス鎖）、５’−ＴＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴ（配列番号２２）；お
よび５’−ＡＴＧＣＣＧＧＴＴＣＣＣＧＴＡＣＧＡ（配列番号２３）。配列デー
タは、ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲTM分析ソフトウエアパッケージ（
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して分析した。正確な配列を有する単離した
プラスミドを、ｐＭＫ４Ａ−ｈｕＡＮＴ３と命名した。
【０２０１】 ｐＭＫ４Ａ−ｈｕＡＮＴ３は、信頼性のあるｈｕＡＮＴ３コード配列を含むが
、ＡＮＴ３リーディングフレームは、発現ベクターのＨｉｓ−Ｔａｇ／ＥＰＲＥ
ＳＳTMエピトープのリーディングフレームと同調ではない。従って、ｐＭＫ４Ａ
−ｈｕＡＮＴ３は、組換えＡＮＴタンパク質を産生すると期待されないが、これ
を含む細胞はコントロールとして使用され得る。
【０２０２】 ｐＭＫ４Ａ−ｈｕＡＮＴ３のインフレームの誘導体を生成するために、使用し
た変異原性オリゴヌクレオチドプライマーが、５’−ＧＧＣＣＴＧＴＴＣＣＧＴ ＣＡＴ ＣＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧ（配列番号２４；下線付きの配列は、
ｈｕＡＮＴ３リーディングフレームの５’末端の逆相補体である）および５’−
ＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＡＧＡＴＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧＧＣＣ（配列番号
２５；下線付きの配列は、ｈｕＡＮＴ３リーディングフレームの５’末端に対応
する）であること以外は、実施例１のようにして、プラスミドを、ＱＵＩＫ−Ｃ
ＨＡＮＧＥTM Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して変異誘発した。いくつかの形質転換体を単
離し、そしてそれからプラスミドＤＮＡを精製した。プラスミドＤＮＡのヌクレ
オチド配列を決定し、そして「正確な」配列を有するものを同定し、ｐＭＫ４Ｂ
−ｈｕＡＮＴ３と命名した。
【０２０３】 ヒトＡＮＴ３をコードするバキュロウイルス発現プラスミドを、「ｐＭＫ４Ａ
（バキュロウイルスシャトル、アウトオブフレームのｈｕ ＡＮＴ３）」または
「ｐＭＫ４Ａ」；および「ｐＭＫ４Ｂ（バキュロウイルスシャトル、インフレー
ムのｈｕＡＮＴ３）」または「ｐＭＫ４Ｂ」と称する。プラスミドｐＭ４Ｂは、
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣ
Ｃ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に、１９９８年１１月３日に寄託され、受託番号
ＡＴＣＣ ９８９７２を与えられた。
【０２０４】 ｈｕＡＮＴ３タンパク質（および関連の調節配列）をコードする配列をバキュ
ロウイルスゲノムに挿入するために、昆虫細胞（ＭＡＸＢＡＣTM Ｓｐｏｄａｐ
ｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ９細胞、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒ
ｌｓｂａｄ，ＣＡ；またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞、ＰｈａｒＭｉ
ｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、メーカーの使用書に従い、ＢＡＣ−
Ｎ−ＢＬＵＥTM Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
を使用して、バキュロウイルス転移構築物ｐＭＫ４Ｂ−ｈｕＡＮＴ３、およびｌ
ａｃＺ遺伝子（ＢＡＣ−Ｎ−ＢＬＵＥTM，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロモータ
ーを含まない３’フラグメントを含むように操作された線状バキュロウイルスＤ
ＮＡ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ 多核ウイルス、ＡｃＭ
ＮＰＶ）と同時トランスフェクトした。組換えバキュロウイルスプラークは、機
能的β−ガラクトシダーゼを発現し、そしてＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）の存在下で青色のプラークと
して同定された。これらの組換えウイルスは、以下の実験により示されるように
、昆虫細胞においてヒトＡＮＴ３ポリペプチドを発現する発現構築物である。
【０２０５】 （Ｂ．バキュロウイルス発現系のウエスタンブロット分析） 高力価のウイルスストックを生成し、そして、メーカーの使用書に従って、組
換えタンパク質を感染性ＳＦ９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ
，ＣＡ）またはＴ．ｎｉ細胞（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ
Ａ）において発現させた（Ｐｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｂ
ａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ，チャプタ１６の第ＩＩ章、Ｓｈｏｒｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版、
Ａｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２，１６−３２〜１６−４８頁、Ｋｉｔｔｓ，チャプ
タ７、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３９巻、Ｃ．
Ｒ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔａｗａ，ＮＪ
，１９９５，１２９〜１４２頁もまた参照のこと）。
【０２０６】 形質転換したＳｆ９細胞を遠心分離によってペレット化し、そして１００μｌ
のＭＳＢ緩衝液（２１０ｍＭ マンニトール（Ｓｉｇｍａ）、７０ｍＭ スクロ
ース（Ｆｌｕｋａ）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ）を添加することによって溶解し、そして３回の凍結−解凍サイクルを行
った。全細胞画分、サイトゾル画分、亜ミトコンドリア粒子（ＳＭＰ）画分、ミ
トコンドリア画分および形質膜画分を以下のように調製した。細胞溶解物を、４
℃で１０分間、６００ｇで遠心分離し、形質膜ペレットを調製した。上清を除去
し、そして取りのけた。この形質膜ペレットを１００μｌのＭＳＢで洗浄し、４
℃で、１０分間６００ｇで遠心分離し、そして分析のために使用した。上清を除
去し、第１の上清と合わせ、そして混合した。この上清の半分を使用して、４℃
で１５分間、１４，０００ｇで遠心分離することによって、ミトコンドリア画分
およびサイトゾル画分を調製した；このペレットは、ミトコンドリア画分を提示
し、そして上清はサイトゾルを提示する。この上清のもう半分を４℃で１５分間
、１４，０００ｇで遠心分離して、ミトコンドリア含有ペレットを生成し、これ
をＭＳＢに再懸濁し、０．２５ｍｇ／ｍｌのジギトニン（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、以前は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）と共に、２分間インキュベー
トし、そして、カップホーン（ｃｕｐ−ｈｏｒｎ）ソニケーターにおいて、５０
％のデューティーサイクルで３分間超音波処理して、亜ミトコンドリア粒子（Ｓ
ＭＰ）を生成した。
【０２０７】 各画分のタンパク質含有量を、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキット（
Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を使用して決定し、そして１レーン
につき８μｇの全タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲルに充填し、電気泳
動し、そしてＨＹＢＯＮＤTM ＥＣＬ Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｍｅｍ
ｂｒａｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に移した。融合タ
ンパク質を、メーカーの使用書に従って、ＡＮＴＩ−ＸＰＲＥＳＳTM Ａｎｔｉ
ｂｏｄｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ ＃Ｒ９１０−２５）および
セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗マウス二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌ
ｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、ウエスタンブロットで検出した。
【０２０８】 ウエスタン分析の結果を図６に示す。組換えＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３融合タンパ
ク質（分子量３６．６ｋＤ）が、全細胞、ミトコンドリア、亜ミトコンドリア粒
子および形質膜において検出された。シグナルは、ミトコンドリア粒子および亜
ミトコンドリア粒子において最も強く、一方、サイトゾル画分においては、バン
ドは検出されなかった。これらのデータは、ヒト組換えｈｕＡＮＴ３融合タンパ
ク質は、形質膜に組み込まれるよりもより効果的にミトコンドリア膜に取り込ま
れることを示唆する。さらに、全ての組換えタンパク質がタンパク質の組み込ま
れるわけではない。なぜなら、サイトゾル画分においてシグナルは検出されなか
ったからである。最終のレーンのオートラジオグラムは、磁性アガロースビーズ
を使用して細胞溶解物から単離したＨｉｓタグ化ｈｕＡＮＴ３が、メーカーの使
用書（Ｑｉａｇｅｎ；Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って、Ｎｉに結合し
たことを示す。
【０２０９】 従って、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるように、ｈｕＡＮＴ３は、バキュロウイルス／
Ｓｆ９系において発現される。さらに、組換え生成した６×Ｈｉｓおよびエピト
ープタグ化ｈｕＡＮＴ３融合タンパク質は、３５を越える異種Ｎ末端アミノ酸の
存在にもかかわらず、Ｓｆ９細胞中のミトコンドリアに適切に局在化し、そして
金属（例えば、ニッケル）に対するＨｉｓ−Ｔａｇ部分の親和性を使用すること
によって細胞画分から単離され得る。
【０２１０】 （実施例４：） （酵母におけるＡＮＴ３の発現） （Ａ．発現構築物および宿主細胞） ヒトＡＮＴ３ ｃＤＮＡを、実施例１におけるように、しかし、以下のプライ
マーを用いてＰＣＲによって増幅した。以下の代表的なＰＣＲプライマーにおい
て、一本下線のヌクレオチドは、ＡＮＴ ｃＤＮＡの５’末端および３’末端に
相補的な配列を示し、そして二重下線のヌクレオチドは、制限酵素ＸｈｏＩ（認
識配列：５’−ＣＴＣＧＡＧ）またはＡｓｐ７１８（認識配列：５’−ＧＧＴＡ
ＣＣ）に対する認識配列を示す。
【０２１１】 ＰＣＲ増幅のために使用されたプライマーは以下である： 順方向（センス）：
【０２１２】
【化１３】 逆方向（アンチセンス）：
【０２１３】
【化１４】 ＰＣＲ産物、および発現ベクターＤＮＡを、製造者によって供給される反応緩
衝液を用いて、製造者の勧告に従って、制限エンドヌクレオチドレアーゼＸｈｏ
ＩおよびＡｓｐ７１８（両方ともＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓからの酵素）で消化した。発現ベクターｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ） を使用した。このベクターは、誘発性ＧＡＬ１プロモーターから
すぐ下流に位置する多重クローニング部位、ならびにｕｒａ３酵母細胞における
高い複製保持および選択のために、２ｕ複製起点およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ ＵＲＡ３遺伝子をそれぞれ含む。
【０２１４】 制限されたＤＮＡを、先述の実施例におけるように、水平アガロースゲル電気
泳動法およびＵｌｔｒａＣｌｅａｎ ＧｅｌＳｐｉｎ ｋｉｔ（Ｍｏ ＢｉｏＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてバンド抽出によって精製し、お互いに連結し
、そしてＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換するために使用した。プラスミドＤＮＡを
いくつからの形質転換株から単離し、そして挿入ＤＮＡのヌクレオチド配列を決
定し、そしてｈｕＡＮＴ３のものであることを確認した。１つの確認されたプラ
スミドを選択し、さらなる研究のために使用し、そしてｐＭＫ５Ａ（ｈｕＡＮＴ
３）と命名した。
【０２１５】 第２の酵母ｈｕＡＮＴ３発現ベクター、ｐＭＫ５Ｂを以下のように構築した。
プラスミドｐＭＫ５ＡおよびｐＹＥＳＴｒｐ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、制
限酵素ＢｇｌＩおよびＰｖｕＩＩ（両方ともＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ
ａｂｓから）で消化し、そしてゲル精製を行い、連結し、そして上記のようにＥ
．ｃｏｌｉを形質転換するために使用した。発現ベクターｐＹＥＳ２Ｔｒｐは、
ｐＹＥＳ２に類似しているが、ＴＲＰ１選択可能マーカーを含む。プラスミドＤ
ＮＡをいくつかの形質転換株から単離し、そして制限マッピングを行い、予期さ
れる発現構築物の構造を確認した。１つの確認されたプラスミドを選択し、さら
なる研究のために使用し、そしてｐＭＫ５Ｂ（ｈｕＡＮＴ３）と命名した。
【０２１６】 第３の酵母ｈｕＡＮＴ３発現ベクター、ｐＭＫ５Ｃを、発現ベクターｐＹＧＥ
２ （これは、ＴＲＰ１選択可能マーカー、および多重クローニング部位からの
強力なＰＧＫプロモーター上流を含む（ＢｒｕｎｅｌｌｉおよびＰａｌｌ、１９
９３ Ｙｅａｓｔ ９：１２９９−１３０８））を用いて構築した。プラスミド
ｐＹＰＧＥ２ ＤＮＡを、ＸｈｏＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、ゲル精製を行
い、そしてＸｈｏＩ−およびＡｓｐ７１８−制限された実施例１のｈｕＡＮＴ３ ＰＣＲ産物を用いて連結した。連結混合物を使用してＥ．ｃｏｌｉを形質転換
し、そしてプラスミドＤＮＡをいくつかの形質転換株から単離し、そして制限マ
ッピングを行い、予期される発現ベクターの構造を確認した。１つの確認したプ
ラスミドを選択し、さらなる研究のために使用し、そしてｐＭＫ５Ｃ（ｈｕＡＮ
Ｔ３）と命名した。
【０２１７】 酵母発現系を形成するために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＩＮＶＳｃｌ（Ｍ
ＡＴα、ｈｉｓ３Δｌ、ｌｅｕ２、ｔｒｐｌ−２８９、ｕｒａ３−５２）を、Ｓ
．ｃ．ＥＡＳＹＣＯＭＰＴＭ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｌ Ｋｉｔ（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、精製したｐＭＫ５Ａ、ｐＭＫ５ＢおよびｐＭＫ５
Ｃ ＤＮＡで形質転換した。第２のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株、ＪΔ１Δ３（
ＭＡＴα、ａｄｅ２−１、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｈｉｓ３−１１、
ｈｉｓ３−１５、ｔｒｐｌ−１、ｕｒａ３−１、ｃａｎｌ−１００、ＡＡＣＩ：
：ＬＥＵ２、ＡＡＣ２：：ＨＩＳ３、ＡＡＣ３：：ＵＲＡ３）もまた発現構築物
で形質転換した。ＡＣＣ遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるミトコン
ドリアＡＤＰ／ＡＴＰトランスロケーターの３つのアイソフォームをコードし、
株ＪΔ１Δ３において中断される（Ｇｉｒａｕｄら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２
８１：４０９−４１８（１９９８））。従って、ＪΔ１Δ３形質転換株（これは
、内因性ＡＮＴ（ＡＡＣ）タンパク質を発現し得ない）は、発現構築物（この発
現構築物によって、ＪΔ１Δの形質転換株は形質転換された）によってコードさ
れるヒトＡＮＴタンパク質を発現するのみであることが予期される。
【０２１８】 （Ｂ．酵母発現系のノーザンブロット分析） 株ＪΔ１Δ３におけるｈｕＡＮＴ３ ｍＲＮＡ産生のレベルを調べるために、
ｐＭＫ５ＢおよびｐＭＫ５Ｃで形質転換された細胞のノーザンブロット分析を、
当該分野において公知の方法に従って実施した。簡潔に言うと、対数期の中間ま
で形質転換された細胞およびコントロール（形質転換されていない）細胞を収集
し、そして溶解させた。ＲＮＡを溶解産物から抽出し、電気泳動し、そしてニト
ロセルロースフィルターへ移動させた（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、
第２版、Ａｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２）、１３：４４−４６のＳｈｏｒｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓの第１３章１３．１２部、Ｔｒｅｃｏ、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｙｅａｓｔ ＲＮＡ、、および前出の４：２３−２５の第４章４．９部、
Ｓｅｌｄｏｎ、Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ ｂｙ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｈ
ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを参照のこと。）ＸｈｏＩ−およびＡｓｐ７１８−制
限された実施例１のｈｕＡＮＴ３ ＰＣＲ産物を放射性標識し、そしてプローブ
として使用し、そしてヒト脾臓組織由来のＲＮＡ調製物をポジティブコントロー
ルとして使用した。
【０２１９】 結果（図１０）は、適切なサイズのＡＮＴ３特異的ＲＮＡが、ヒト脾臓および
いずれかの発現ベクターで形質転換された酵母細胞において産生されるが、形質
転換されない酵母細胞において産生されないことを示す。ｐＹＰＧＥ２由来発現
構築物ｐＭＫ５Ｃは、ＰＧＫプロモーターからＡＮＴ３発現を指向するが、ｐＹ
ＥＳ２Ｔ由来構築物ｐＭＫ５Ｂ（これにおいて、ＡＮＴ発現はＧＡＬ１プロモー
ターによって駆動される）より多いＡＮＴ３ ＲＮＡを明らかに生じる。しかし
、いずれの場合も、有意なレベルのｈｕＡＮＴ特異的ＲＮＡは、任意の内因性ア
デノシンヌクレオチドトランスロケータータンパク質を欠失している酵母バック
グラウンドにおいて産生された。
【０２２０】 （実施例５） （哺乳動物細胞におけるＡＮＴ３の発現） 先述の実施例は、ＡＮＴおよびＡＮＴ融合タンパク質が、種々の系において組
換え的に産生され得る種々の手段を記載する。このようなＡＮＴタンパク質は、
種々のアッセイにおいて使用され得るが（下を参照）、哺乳動物細胞から大量の
ネイティブＡＮＴタンパク質を単離するのに望ましくあり得る。具体的には、こ
の実施例に記載されるように、組換えウイルス粒子（ここでは、ＡＮＴタンパク
質がウイルスエンベロープに表示される）を産生する望ましくあり得る。このよ
うなＡＮＴ表示ウイルス粒子は、非常に安定であり、そして種々のアッセイ（例
えば、ＡＮＴタンパク質に結合する化合物がスクリーニングおよび同定されるア
ッセイを含む）において有用であることが予期される。
【０２２１】 哺乳動物発現系の別の有用な成果は、ヒトミトコンドリアの生成および単離で
あり、このミトコンドリアにおいて、特定のＡＮＴアイソフォームが、このよう
なアイソフォームの特定の生物学的役割を決定するために過剰発現する。例えば
、ＡＮＴ３は、明らかに、ヒト組織において偏在的に発現し、一方、ＡＮＴ１は
、主に、心臓および骨格筋において発現する（Ｓｔｅｐｉｅｎら、１９９２、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４５９２−１４５９７）。培養された心臓ま
たは筋肉細胞におけるｈｕＡＮＴ３の指向される過剰発現は、主にＡＮＴ１アイ
ソフォームを含むミトコンドリアにおいて生じることが予期される。このような
「ＡＮＴアイソフォームに富む」ミトコンドリアは、単離され得、そして種々の
ミトコンドリアの機能について試験され得る。
【０２２２】 哺乳動物細胞においてＡＮＴタンパク質を発現するための構築物は、段階的な
プロセスにおいて調製される。まず、ＡＮＴタンパク質をコードするヌクレオチ
ド配列に作動可能に連結したプロモーター（および関連調節配列）を含む発現カ
セットを、細菌性プラスミドベースの系において構築し；これらの発現カセット
を含む構築物を評価し、そして哺乳動物細胞（これは、この構築物によって一過
性にトランスフェクトされる）においてＡＮＴを産生するそれらの能力について
最適化する。第２に、ＡＮＴ発現カセットを、ウイルス系に移し、このウイルス
系は、ウイルス（例えば、ＳＶ４０、ＢＰＶ、ＥＢＶ、アデノウイルス；以下を
参照）の溶菌増殖の間、組換えタンパク質を産生するか、または哺乳動物細胞ゲ
ノムへと安定に組込まれそして哺乳動物細胞ゲノムを形質導入し得るウイルス（
例えば、レトロウイルス発現構築物）を形成する。
【０２２３】 （Ａ．一過性発現） 第１工程に関して、市販の「シャトル」（すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉと哺乳動物
の両方の細胞で複製が可能である）ベクター（これは、哺乳動物細胞において機
能し、そしてＡＮＴをコードする配列に作動可能に連結し得るプロモーターを含
む）としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＳＶ４０後期プロ
モーター発現ベクター（例えば、ｐＳＶＬ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、糖質コルチ
コイド−誘導プロモーター発現ベクター（例えば、ｐＭＳＧ、Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）、ラウス肉腫エンハンサー−プロモーター発現ベクター（例えば、ｐＲｃ／
ＲＳＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＣＭＶ初期プロモーター発現ベクター（
ネオマイシン、ハイグロマイシンまたはＺＥＯＣＩＮTMのような因子に対して選
択可能なマーカーを有するそれらの誘導体を含む）（例えば、ｐＲｃ／ＣＭＶ２
、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．
１、ｐｃＤＮＡ３．１／ＺｅｏおよびｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ、Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）。概して、ＡＮＴのための好ましいシャトルベクターは、（形質
転換された細胞の単離および保持を容易にするために）選択可能なマーカー、お
よび（ＡＮＴ遺伝子の過剰発現が有毒効果を有し得る場合に）誘発性、従って、
調節性のプロモーターを有するベクターである。
【０２２４】 哺乳動物細胞をトランスフェクトするための方法は、当該分野において公知で
ある（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｓｕｂｅｌら編、Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９
９２、頁９−３〜頁９−１６のＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓの第９章Ｉ節、
Ｋｉｎｇｓｔｏｎら、「Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎｔｏ
Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ，」を参照のこと）。コントロールプラスミ
ド（例えば、ｐＣ１１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）は、試験されるＡＮＴ発現構築
物で同時トランスフェクトされ得、その結果、ＡＮＴのレベルは、コントロール
プラスミドから発現された遺伝子産物に対して正規化され得る。
【０２２５】 哺乳動物発現系のウエスタン分析は、細菌、昆虫または酵母の細胞に対立する
ものとして、哺乳動物細胞由来のタンパク質調製物の調製のために、異なる方法
が使用される点以外は、先述の実施例に記載されるように基本的に実施される。
酵母からタンパク質を単離するこのような方法は、当該分野において公知である
（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｓｕｂｅｌら編、
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、
１９９２、頁９−１７〜頁９−２３のＳｈｏｒｔ ＰｒｏｔｏｃｏｌｓのＫｉｎ
ｇｓｔｏｎおよびＳｈｅｅｎ、第９章９．６Ａ節ならびにＢｒａｓｉｅｒ、第９
章９．６Ｂ）を参照のこと）。好ましい発現カセットは、基本的に、プロモータ
ー、および目的のＡＮＴ遺伝子に作動可能に連結した関連調節配列からなるが、
ＡＮＴタンパク質を発現するように誘発される場合、所定のＡＮＴ発現カセット
を含むベクターで一過性に形質転換した細胞の高レベルのＡＮＴタンパク質を発
現する能力によって同定され；これらの発現カセットは、ウイルス発現ベクター
に組込まれる。
【０２２６】 （Ｂ．ウイルス発現） 好ましい発現カセットを含む核酸、好ましくは、ＤＮＡは、これらが調製され
、特徴付けられそして最適化された一過性発現構築物から単離される（先述の節
を参照）。このような発現カセットを単離する好ましい方法は、ＰＣＲによる増
幅によるが、他の方法（例えば、適切な制限酵素での消化）が使用され得る。好
ましい発現カセットは、以下の形態で、ウイルス発現ベクター、好ましくはレト
ロウイルス発現ベクターに導入される。
【０２２７】 好ましい発現カセットを含むＤＮＡ分子は、連結によってレトロウイルストラ
ンスファーベクターに導入される（先述の実施例を参照）。２つの型のレトロウ
イルストランスファーベクターが、当該分野において公知である：複製不能と複
製可能。複製不能のベクターは、感染粒子を産生するのに必要なウイルス遺伝子
を欠失するが、ウイルス転移のために必要なｃｉｓ作用性ウイルス配列を保持す
る。このようなｃｉｓ作用性配列は、Ψパッキング配列、逆方向転写および取込
みのためのシグナル、ならびにウイルスのプロモーター配列、エンハンサー配列
、ポリアデニル化配列および他の調節配列を含む。複製可能なベクターは、これ
ら全ての要素、およびビリオン構造タンパク質をコードする遺伝子（典型的には
、命名された遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖによってコードされる遺伝子）
を保持し、従って、種々の細胞株において、感染粒子を形成し得る。対照的に、
これらの機能は、イントランスで、パッキング細胞株（すなわち、ｇａｇ、ｐｏ
ｌおよびｅｎｖ遺伝子をコードするが、Ψパッキング配列を欠失しているｍＲＮ
Ａを産生する細胞株）において複製不能なベクターに供給される。通常、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２、頁９−
３０〜頁９−３５のＳｈｏｒｔ ＰｒｏｔｏｃｏｌｓのＣｅｐｋｏ、第９章９．
１０節： を参照のこと。
【０２２８】 ＡＮＴ発現カセットを含むレトロウイルス構築物は、カセット配列およびプサ
イパッケージング配列を含むＲＮＡ分子を産生する。これらのＲＮＡ分子は、適
切な細胞株にウイルス構造タンパク質によってキャプシド形成されるウイルスゲ
ノムに対応する（「適切な」とは、例えば、パッケージング細胞株が、複製不能
なレトロウイルスベクターに基づく構築物のために使用されなければならないこ
とを意味する）。次いで、感染ウイルス粒子が産生され、そして細胞膜から出芽
することによって、培養液上清へと放出される。感染粒子は、ＡＮＴ発現カセッ
トを含むウイルスＲＮＡゲノムを含むが、公知の方法に従って調製および濃縮さ
れる。所望されないヘルパーウイルス（すなわち、ＡＮＴ発現カセットを含まな
いウイルス粒子）をモニターすることが望ましくあり得る。通常、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｓｕｂｅｌら編、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２、頁９−３６〜頁
９−４５のＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第９章の９．１１部、９．１２部
および９．１３部、Ｃｅｐｋｏを参照のこと。
【０２２９】 ＡＮＴ発現カセットを含むウイルス粒子は、インビトロ（例えば、培養された
細胞）で、またはインビボ（例えば、げっ歯類の細胞、または鳥類の細胞（これ
らは全動物の一部である）で感染させるために使用される。組織外植片または培
養胚はまた、当該分野において公知の方法に従って感染させ得る。通常、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｓｕｂｅｌら編、ＪｏｈｎＷｉｌｅ
ｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２、頁９−４
５〜頁９−４８のＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第９章の９．１４部、Ｃｅ
ｐｋｏを参照のこと。使用されるこの型の細胞に関わりなく、ＡＮＴタンパク質
の産生は、組換えウイルスゲノムによって指向される。
【０２３０】 好ましい実施例において、組換え的に産生されたＡＮＴタンパク質は、培養細
胞の細胞膜へ挿入される。レトロウイルス発現構築物は、細胞膜の出芽によって
ウイルス粒子を産生するので、培養液上清へ送達された得られるウイルス粒子は
、それらの被膜へ組み込まれたＡＮＴタンパク質を、好ましくは粒子の表面上に
有する。このようなＡＮＴ表示ウイルス粒子は、ＡＮＴタンパク質に対して安定
な構成を提供すること、そして、従って、直接的にか、またはＡＮＴがさらに精
製され得る供給源材料としてのいずれかで、ＡＮＴタンパク質を使用するアッセ
イにおいて有用であることが予期される。ミトコンドリアの膜に挿入されるＡＮ
Ｔタンパク質の量を最小にすることが望ましい場合、ρ0細胞（これは、ミトコ
ンドリアがほとんどないかまたは全くないような形態で処理されている）が宿主
細胞として使用される。
【０２３１】 （Ｃ．ｐＣＤＮＡ−ＡＮＴ３発現構築物の調製および発現） 製造業者の指示に従って、以下のプライマー、ＡＭＰＬＩＴＡＱTMＤＮＡポリ
メラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、ならびにＧＥＮＥＡＭＰTM ＰＣＲ
Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に供給された試薬および
緩衝液を用いて、サーマルサイクラーでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によっ
て、ＡＮＴ３ ｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲプライマーの以下の表示においては
、下線を付したヌクレオチドは、ＡＮＴ３ ｃＤＮＡの５’末端および３’末端
に相補的な配列を示し、二重下線を付したヌクレオチドは、制限酵素ＸｈｏＩ（
認識配列：５’−ＣＴＣＧＡＧ）およびＡｓｐ７１８（認識配列：５’ＧＧＴＡ
ＣＣ）の認識配列を示す。そしてＡＮＴ３開始コドン（ＡＴＧ）および終止コド
ン（ＴＡＡ）の逆相補配列を太字にしている。
【０２３２】 ＡＮＴ３発現構築物（ｐＭＫ３Ａ−ｈｕＡＮＴ３，ａ．ｋ．ａ．ｐＢＡＤ／Ｈ
ｉｓ−ＡＮＴ３）からヒトＡＮＴ３（ｈｕＡＮＴ３；配列番号３）を増幅するた
めに用いたプライマーは以下であった：
【０２３３】
【化１５】 製造業者の供給した反応緩衝液を用い、製造業者の推奨に従って、制限エンド
ヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＡｓｐ７１８（両方の酵素ともＲｏｃｈｅ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手）を用いて、ＰＣＲ産物を消
化した。水平方向アガロースゲル電気泳動およびＵｌｔｒａＣｌｅａｎTMＧｅｌ
Ｓｐｉｎキット（Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｌ
ａｎａ Ｂｅａｃｈ，ＣＡ）を用いたバンド抽出によって、制限ＤＮＡを精製し
た。
【０２３４】 発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ
）を用いた。このベクターは、５’〜３’方向に作動可能に連結された以下のエ
レメントを含む：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーター
（ＰCMV）；いくつかの制限酵素の認識配列を含むマルチクローニングサイト（
ＭＣＳ）；およびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転
写終止配列（ｍＲＮＡの安定性を増強するため）。この発現ベクターはまた、原
核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）における形質転換体のポジティブ選択用のアン
ピシリン耐性遺伝子、ならびに哺乳動物細胞における形質転換体のポジティブ選
択用のネオマイシン耐性遺伝子、そして細菌および哺乳動物細胞用の複製起点（
それぞれ、ＣｏｌＥ１由来およびＳＶ４０由来）を含む。ＳＶ４０の複製起点は
、発現構築物のエピソーム複製、およびＳＶ４０のラージＴ抗原を発現する細胞
（すなわち、ＣＯＳ−１またはＣＯＳ−７細胞、それぞれ、ＡＴＣＣ登録番号Ｃ
ＲＬ−１６５０およびＣＲＬ−１６５１）における簡易なベクターレスキューを
可能にする。
【０２３５】 製造業者の指示に従って、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＡｓｐ７１
８を用いた消化、そして水平方向アガロースゲル電気泳動に供し、そしてＵｌｔ
ｒａＣｌｅａｎTMＧｅｌＳｐｉｎキット（Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）を用いたバンド抽出によって、プラスミドｐｃＤＮＡ３を調製した。製造
業者の反応緩衝液を用い、製造業者の指示に従って、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて、制限
酵素消化したＡＮＴ ｃＤＮＡを、同様に消化したｐｃＤＮＡ３発現ベクターＤ
ＮＡにライゲーションした。製造業者の指示に従って、ライゲーション混合液を
用いて、コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞（ＤＨ５α株；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．｛Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ｝，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ
、ＭＤ）を形質転換した。単一のコロニーを選択し、５０μｇ／ｍｌのアンピシ
リン（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含有す
る３〜５ｍｌのＬＢブロス中で増殖した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓ
ｃｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）。ＷＩＺＡＲＤTMＰｌｕｓ Ｓｅｒｉｅｓ
９６００ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて細菌培養物からプラスミドＤＮＡを単離し
た。ｐｃＤＮＡ３−由来ＡＮＴ３発現構築物のいくつかの単離体を制限マッピン
グして、その構築物を確認した。さらなる実験用に、予想された制限マッピング
を有するｐｃＤＮＡ３−ＡＮＴ３発現構築物の単離体の１つを選択して、「ｐＭ
Ｋ６−ＡＮＴ３」と名づけた。
【０２３６】 （実施例６：ＡＮＴ−グリーン蛍光（緑色蛍光）タンパク質（ＡＮＴ−ＧＦＰ
）融合タンパク質のクローニングおよび発現） 本実施例において、２つの異なるＡＮＴ−ＧＦＰ融合タンパク質発現構築物の
調製および構築を記載する。グリーン（緑色）蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、天
然に存在する蛍光タンパク質であり、シフトした発光スペクトル、および／また
はネイティブのタンパク質よりも強度に蛍光を発する能力を有するＧＦＰ誘導体
を生成するため大きく遺伝子操作されたタンパク質である（ＧＦＰの概説につい
ては、Ｋｅｎｄａｌｌら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１６：２１６〜２２４，１９９８、およびそれに引用された参考文献を参照のこ
と；ＧＦＰでの論文については、Ｃｈａｌｆｉｅ，Ｍ．，およびＫａｉｎ，Ｓ編
、Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅ
ｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９８，およびそこに
引用されている参考文献を参照のこと）。本明細書において用いる場合、用語「
グリーン蛍光タンパク質」は、野生型グリーン蛍光タンパク質（野生型ＧＦＰ）
、ならびに青色シフトした野生型ＧＦＰの誘導体、シアン色シフトした野生型Ｇ
ＦＰの誘導体、赤色シフトした野生型ＧＦＰの誘導体、および黄色シフトした野
生型ＧＦＰの誘導体（それぞれ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＲＦＰおよびＹＦＰと名づけ
られる；ＰＣＴ公開出願ＷＯ９８／０６７３７を参照のこと）、ならびにさらな
る機能的ポリペプチド配列を含む他のＧＦＰ誘導体を包含する。
【０２３７】 （Ａ．アミノ末端融合（ＥＹＦＰ−ＡＮＴ）タンパク質の調製） 実施例２において詳細に記載されるように、ｐＭＫ３Ｃ−ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ
３（本明細書ではｐＭＫ３Ｃとも呼ばれる）は、コード配列を含むｐＧＥＸ−４
Ｔ−２由来の発現構築物であり、ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３融合タンパク質（ＧＳＴ
，グルタチオンＳトランスフェラーゼ）の発現を指向する。プラスミドｐＭＫ３
Ｃを、制限酵素ＢＡＭＨＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＡＮＴ３コード配列を含む
がＧＳＴをコードする配列を欠く制限フラグメント、またはｐＭＫ３Ｃ中でＧＳ
ＴをＡＮＴ３に結合するトロンビン切断部位を遊離させる。
【０２３８】 発現ベクターｐＥＹＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を、ＢｇｌＩＩおよびＳａｌＩを用
いて制限酵素消化した。ＢｇｌＩＩ（ｐＥＹＦＰ−Ｃ１ベクター中の）およびＢ
ａｍＨＩ（ＡＮＴ３フラグメント中の）は、同一の制限配列を有さないが、これ
らの制限酵素は、配列５’−ＧＡＴＣを有する適合性の粘着性の末端を生成する
。同様に、ＳａｌＩ（ｐＥＹＦＰ−Ｃ１ベクター中の）およびＸｈｏＩ（ＡＮＴ
３フラグメント中の）は、同一の制限配列を有さないが、これらの制限酵素は、
配列５’−ＴＣＧＡを有する適合性の粘着性の末端を生成する。前述の制限フラ
グメントから形成される所望の連結産物において、ｐＥＹＦＰ−Ｃ１中のＢｇｌ
ＩＩは、ＡＮＴ３コードフラグメント中のＢａｍＨＩ部位に連結され、そしてＡ
ＮＴ３コードフラグメント中のＸｈｏＩ部位は、ｐＥＹＦＰ−Ｃ１中のＳａｌＩ
部位に連結され、そして得られたプラスミドは、ＹＦＰ−ＡＮＴ３融合タンパク
質をコードする。用語「ＥＹＦＰ−ＡＮＴ３融合タンパク質」は、（１）５１３
ｎｍで最大励起をそして５２７ｎｍで発光ピークを有する、強化された黄色蛍光
タンパク質（ＥＹＦＰ）に対応するアミノ末端ポリペプチド、および（２）ｈｕ
ＡＮＴ３に対応するカルボキシ末端ポリペプチド部分、を有する単一の連続する
ポリペプチド鎖を示す。
【０２３９】 当該分野で公知の標準的条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、制限酵素消化
したＤＮＡを、互いに連結した。製造業者の指示に従って、ライゲーション混合
液を用いて、コンピテントなｒｅｃＡ１ ｈｓｄＲ ｅｎｄＡ１Ｅ．ｃｏｌｉ細
胞（ＴＯＰ１０Ｆ’株；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を形
質転換した。単一のコロニーを選択し、３〜５ｍｌのＬＢブロス中で増殖し、そ
してＷＩＺＡＲＤTMＰｌｕｓ Ｓｅｒｉｅｓ ９６００ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｒ
ｅａｇｅｎｔｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用
いてプラスミドＤＮＡを細菌培養物から単離し、そして制限マッピングした。推
定される制限マッピングを有するＥＹＦＰ−ＡＮＴ３発現構築物の単離体の１つ
をさらなる実験用に選択し、そして「ｐＭＫ７−ＥＹＦＰ（Ｎ）−ＡＮＴ３」と
名づけた。
【０２４０】 （Ｂ．カルボキシ末端融合（ＡＮＴ−ＥＹＦＰ）タンパク質の調製） プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｈｕＡＮＴ３（ｐＭＫ６−ＡＮＴ３）は、ＸｈｏＩ
（ｈｕＡＮＴ３インサートの３’末端で）およびＸｂａＩ（ＭＣＳにおいてＸｈ
ｏＩ部位から３’）で消化した制限酵素である。ＥＹＦＰをコードする配列を含
むインフレームのＸｈｏＩ−ＸｂａＩ制限フラグメントを以下の通り調製した。
製造業者の指示に従って、以下のプライマー、基質としてプラスミドｐＥＹＦＰ
−Ｃ１、ＡＭＰＬＩＴＡＱTM ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎ−
Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ならびにＧＥＮＥＡＭＰTM Ｐ
ＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に供給された試薬
および緩衝液を用いて、サーマルサイクラーでのＰＣＲによりＤＮＡを増幅した
。以下に提示するＰＣＲプライマーにおいて、一本線で下線を付したヌクレオチ
ドは、ＥＹＦＰコードＤＮＡの５’末端および３’末端に相補的な配列を示し、
二本線で下線を付したヌクレオチドは、制限酵素ＸｈｏＩ（制限配列：５’−Ｃ
ＴＣＧＡＧ）およびＸｂａＩ（制限配列：５’−ＴＣＴＡＧＡ）の制限配列を示
しており、そしてＥＹＦＰ開始コドン（ＡＴＧ）およびＹＦＰ停止コドン（ＴＡ
Ｇ）の逆相補配列を太字で示している。
【０２４１】 用いたプライマーは以下のヌクレオチド配列を有する：
【０２４２】
【化１６】 制限酵素消化したＰＣＲ ＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡを、水平方向アガロ
ースゲル電気泳動、およびＵｌｔｒａＣｌｅａｎTMＧｅｌＳｐｉｎキット（Ｍｏ
Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いるバンド抽出によって、精製した
。精製したＤＮＡをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて共に連結し、そしてこれを用
いて、製造業者の指示に従って、コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞（ＤＨ５α株
；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ
、ＭＤ）を形質転換した。単一のコロニーを選択し、そして５０μｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含有する３〜５ｍｌのＬＢブロス中で増殖した。プラスミドＤＮＡ
を前述の実施例のように細菌培養物から単離し、そして制限マッピングした。予
想される制限マッピングを有するＡＮＴ３−ＹＦＰ発現構築物の単離体の一つを
、さらなる実験用に選択し、そして「ｐＭＫ８−ＡＮＴ３−ＥＹＦＰ（Ｃ）」と
名づけた。標準的な方法を用いて、ｐＭＫ８−ＡＮＴ３−ＥＹＦＰ（Ｃ）中のＡ
ＮＴ３−ＹＦＰコード領域のヌクレオチド配列を、確認した。ｐＭＫ８−ＡＮＴ
３−ＥＹＦＰ（Ｃ）の構築に依って、この発現構築物は、（１）アミノ末端ｈｕ
ＡＮＴ３ポリペプチド、および（２）５１３ｎｍで最大励起を、そして５２７ｎ
ｍでピーク発光を有するカルボキシ末端強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）を
有するタンパク質の産生を指向する。
【０２４３】 （Ｃ．ＡＮＴ３−ＥＹＦＰ融合タンパク質の発現および細胞内局在化） すぐ直前の節に記載された、２つのＡＮＴ−ＧＦＰ融合タンパク質の発現およ
び細胞内局在化をいくつかの方法で試験した。第一に、蛍光顕微鏡を用いて、ｐ
ＭＫ７−ＥＹＦＰ（Ｎ）−ＡＮＴ３またはｐＭＫ８−ＡＮＴ３−ＥＹＦＰ（Ｃ）
のいずれかを用いて形質転換した２９３細胞を可視化した。ｐＭＫ７−ＥＹＦＰ
（Ｎ）−ＡＮＴ３の場合、観察された免疫蛍光は、細胞質全体にわたって拡散さ
れ広がった。対照的に、ｐＭＫ８−ＡＮＴ３−ＥＹＦＰ（Ｃ）で形質転換された
細胞において見られた免疫蛍光は、ミトコンドリアに対して限定されるものであ
る。ＡＮＴ３−ＧＦＰ発現構築物で形質転換した他の細胞型（すなわち、ＣＯＳ
−１およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ）で、類似の結果を見出した。
【０２４４】 ＡＮＴ３−ＥＹＦＰ融合タンパク質のミトコンドリア局在化をさらに試験する
ために、細胞内画分のウエスタン分析を以下の通り実行した。形質転換した２９
３細胞を遠心分離によってペレット化し、そして１００μｌのＭＳＢ緩衝液（２
１０ｍＭマンニトール（Ｓｉｇｍａ），７０ｍＭスクロース（Ｆｌｕｋａ）、５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、そし
て３回の凍結乾燥サイクルを実施することにより溶解した。総細胞画分、細胞質
画分、ミトコンドリア内粒子画分、ミトコンドリア画分および原形質膜画分を以
下の通り調製した。細胞溶解物を、４℃で１０分間、６００ｇで遠心分離して原
形質膜ペレットを調製した。上清を、取り除けておいた。原形質膜ペレットを、
１００μｌのＭＳＢを用いて洗浄し、４℃で１０分間、６００ｇで遠心分離し、
そして分析用に用いた。上清を取り出し、最初の上清とあわせて、混合して、そ
してこれを用いて、４℃での１５分間の１２，０００〜１４，０００ｇの遠心分
離によって、ミトコンドリア画分および細胞質画分を調製した；このペレットは
、ミトコンドリア画分を示し、そして上清は細胞質を示す。
【０２４５】 ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて各画分についてのタンパク質含
量を決定し、そしてＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に１レーンあたりに等量（
１０μｇ）の総タンパク質をロードし、電気泳動し、そしてＨＹＢＯＮＤTMＥＣ
Ｌニトロセルロースメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ
，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）に転写した。本質的に製造業者
の指示に従って、すべてのＧＦＰ誘導体を認識し、そして西洋ワサビペルオキシ
ダーゼへの結合を介して検出可能に標識されている抗体（ｔｈｅ Ｌｉｖｉｎｇ
Ｃｏｌｏｒｓ（登録商標）ペプチド抗体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌ
ｔｏ、ＣＡ）を用いて、ＡＮＴ３−ＥＹＦＰ融合タンパク質を、ウエスタンブロ
ット中で検出した。ウエスタンブロット分析の結果により、ｐＭＫ８−ＡＮＴ３
−ＥＹＦＰ（Ｃ）（ここで、ＹＦＰコード配列は、ＡＮＴ３−ＧＦＰ融合タンパ
ク質のカルボキシ末端側である）から発現したタンパク質が、ミトコンドリアに
独占的に局在していることが確認される。
【０２４６】 （実施例７：細菌中のＨＩＳタグ化サイクロフィリンＡ（ＨＩＳ６Ｘ−ＣＹＰ
Ａ）融合タンパク質のクローニングおよび発現） ＡＮＴと相互作用する（Ｗｏｏｄｆｉｅｌｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３３６
：２８７〜２９０，１９９８）サイクロフィリンＤ（ＣｙｐＤ）とは異なり、構
造的に関連するタンパク質であるサイクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）は、少なくと
も正常の生理学的な条件下では、ＡＮＴと相互作用しないようである。従って、
ＣｙｐＡは、ＣｙｐＤ：ＡＮＴ相互作用に影響する因子のアッセイのための比コ
ントロールとして調製された。ＣｙｐＡ融合タンパク質を含む大量のＣｙｐＡタ
ンパク質を産生するために、組み換えＤＮＡ技術を用いた。
【０２４７】 （Ａ．ＣｙｐＡ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅） ヒト胎盤より調製した総細胞性ＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーを、商業的
供給元より得た（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）。ＲＮＡを、
４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、６ｍＭ 塩化マグネシウムおよび
２ｍＭ 塩化カルシウムを含む緩衝液中に１ｕｌのＤＮａｓｅＩ（１０ｕ／ｕｌ
）を使用する、ＲＮＡを含まないＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ｆｏｒｍｅｒｌｙ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ
）で、３７℃にて３０分間の処理によって精製した。この処理に続いて、フェノ
ール／クロロホルム抽出を２回、クロロホルム抽出を１回および酢酸ナトリウム
の存在下でエタノール沈殿を行った。ＲＮＡペレットを遠心分離によって回収し
、７０％エタノールで洗浄し、風乾し、そしてＲＮａｓｅ Ｈを含まない滅菌水
中に再懸濁した。ＲＮａｓｅ Ｈ欠損逆転写酵素（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴTM，
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して
このＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを作製した。
【０２４８】 サーマルサイクラーにて、ＣｙｐＡ ｃＤＮＡを、以下のプライマー、ＡＭＰ
ＬＩＴＡＱTM ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、ならびにＧ
ＥＮＥＡＭＰTM ＰＣＲ試薬キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）中に供給され
る試薬および緩衝液を製造業者の指示書に従って使用して、ポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）によって増幅した。以下に示されるＰＣＲプライマーにおいて、下
線を付したヌクレオチドは、ＣｙｐＡ ｃＤＮＡの５’末端および３’末端に相
補的な配列を示し、二重下線を付したヌクレオチドは、制限酵素ＸｈｏＩ（認識
配列：５’−ＣＴＣＧＡＧ）およびＡｓｐ７１８（認識配列：５’−ＧＧＴＡＣ
Ｃ）についての認識配列を示し、そしてｈｕＣｙｐＡ開始コドン（ＡＴＧ）およ
び終止コドン（ＴＡＡ）の逆相補を太字にした。
【０２４９】 ヒトＣｙｐＡ（ｈｕＣｙｐＡ；配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）２６）につ
いて、以下のヌクレオチド配列を有するプライマーを使用した： 順方向（センス）：
【０２５０】
【化１７】 （配列番号３５）、および 逆方向（アンチセンス）
【０２５１】
【化１８】 （配列番号３６）。
【０２５２】 （Ｂ．６×Ｈｉｓ−ＣｙｐＡ発現構築物の作製） 発現ベクターｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（「Ｂ」誘導体；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使
用した。このベクターは、５’から３’の方向に作動可能に連結された以下のエ
レメントを含む：誘導性であるが、強度に調節可能であるａｒａＢＡＤプロモー
ター；最適化されたＥ．ｃｏｌｉ翻訳開始シグナル；アミノ末端ポリヒスチジン
（６×Ｈｉｓ）コード配列（「Ｈｉｓタグ」としても呼ばれる）；ＸＰＲＥＳＳ TM エピトープコード配列；所望される場合、タンパク質精製後にＮ末端の前にあ
るアミノ酸を除去するために使用され得るエンテロキナーゼ切断部位；多重クロ
ーニング部位；および、インフレームでの終止コドン。
【０２５３】 プラスミドｐＢＡＤ／Ｈｉｓ ＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩお
よびＡｓｐ７１８で製造業者の指示書に従って消化することによって調製し、そ
して垂直アガロースゲル電気泳動、およびＵｌｔｒａＣｌｅａｎ ＧｅｌＳｐｉ
ｎキット（Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するバンド抽出に
供した。制限酵素消化したＣｙｐＡ ｃＤＮＡを、製造業者の反応緩衝液を使用
するＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖ
ｅｒｌｙ，ＭＡ）を製造業者の指示書に従って使用して、制限（消化）した発現
ベクターＤＮＡと連結した。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（ＴＯＰ１０Ｆ’株
：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造業者の指示書に従って、原核生物ベクター構
築物を含む連結混合物で形質転換した。単一のコロニーを選択しかつ３〜５ｍｌ
のＬＢブロス中で増殖し、そしてプラスミドＤＮＡを、ＷＩＺＡＲＤTMＰｌｕｓ
シリーズ９６００ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）を使用して細菌培養物から単離した。予想される制限地図（発現ベ
クターおよびヒトＣｙｐＡのヌクレオチド配列に基づく（図７を参照のこと）（
配列番号２６））を有する６×Ｈｉｓ−ｈｕＣｙｐＡ発現構築物の単離物を、さ
らなる実験のために選択し、そして「ｐＭＫ９−６×Ｈｉｓ−ｈｕＣｙｐＡ」と
名付けた。
【０２５４】 （実施例８：細菌におけるグルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ−シクロフ
ィリンＡ（ＧＳＴ−ＣｙｐＡ）融合タンパク質のクローニングおよび発現） （Ａ．ＣｙｐＡ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅） サーマルサイクラーにて、ＣｙｐＡ ｃＤＮＡを、以下のプライマー、ＡＭＰ
ＬＩＴＡＱTM ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、ならびにＧ
ＥＮＥＡＭＰTM ＰＣＲ試薬キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）中に供給され
る試薬および緩衝液を製造業者の指示書に従って使用して、ｐＭＫ９−６Ｈｉｓ
−ｈｕＣｙｐＡよりＰＣＲによって増幅した。以下に示されるＰＣＲプライマー
において、下線を付したヌクレオチドは、ＣｙｐＡ ｃＤＮＡの５’末端および
３’末端に相補的な配列を示し、二重下線を付したヌクレオチドは、制限酵素Ｘ
ｈｏＩ（認識配列：５’−ＣＴＣＧＡＧ）およびＢａｍＨＩ（認識配列：５’−
ＧＧＡＴＣＣ）についての認識配列を示し、そしてｈｕＣｙｐＡ開始コドン（Ａ
ＴＧ）および終止コドン（ＴＡＡ）の逆相補を太字にした。
【０２５５】 ｈｕＣｙｐＡについて、以下のプライマーを使用した： 順方向（センス）：
【０２５６】
【化１９】 （配列番号３７）、および 逆方向（アンチセンス）
【０２５７】
【化２０】 （配列番号３８）。
【０２５８】 （Ｂ．ＧＳＴ−ＣｙｐＡ発現構築物の作製） ＣｙｐＡ ＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ
（両酵素ともＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で
製造業者の供給する反応緩衝液を使用して製造業者の指示書に従って消化した。
制限（消化）したＤＮＡを、垂直アガロースゲル電気泳動、およびＵｌｔｒａＣ
ｌｅａｎTM ＧｅｌＳｐｉｎキット（Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
，Ｉｎｃ．）を使用するバンド抽出によって精製した。
【０２５９】 発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、酵素的ポリペプチドおよびＣｙｐＤポリペプチド
を含むｈｕＣｙｐＤ融合タンパク質を作製した。このベクターは、Ｓｃｈｉｓｔ
ｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ由来のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（
ＧＳＴ）遺伝子（Ｓｍｉｔｈら、１９８８、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）に作
動可能に連結されたｌａｃＩq（レプレッサー）遺伝子、ｔａｃプロモーター、
多重クローニング部位からすぐ５’側のトロンビン切断部位コードヌクレオチド
配列を含むように改変されたコード配列を含む。ＧＳＴ融合タンパク質を、抗Ｇ
ＳＴでのウエスタンブロットまたは比色アッセイを使用することによって検出し
得る。後者のアッセイは、グルタチオンおよびＧＳＴについての基質として１−
クロロ−２−４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）を利用し、そして３４０ｎｍで
検出可能な黄色の産物を得る（Ｈａｂｉｇら、１９７４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２４９：７１３０−７１３９）。この発現ベクター由来の発現構築物から
産生されたＧＳＴ融合タンパク質を、例えば、グルタチオンアフィニティクロマ
トグラフィーによって精製し得、そして所望のポリペプチドをトロンビンによっ
て融合産物から放出し得る。従って、この発現ベクターは、融合タンパク質の迅
速な精製を提供し、そして比較的少ない余分なＮ末端アミノ酸を有するタンパク
質を放出するが、生じた組換え的に産生されたタンパク質は、２つのさらなるア
ミノ酸（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）をアミノ末端に含む。ｔａｃプロモーターは、例えば
、１〜５ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；Ｆｌｕ
ｋａ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）の培養される細胞への添加によって誘導され
得、そして高レベルの発現を提供する。
【０２６０】 プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−２を、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよび
ＸｈｏＩで製造業者の指示書に従って消化することによって調製し、そして垂直
アガロースゲル電気泳動、およびＵｌｔｒａＣｌｅａｎTM ＧｅｌＳｐｉｎキッ
ト（Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するバンド抽出に供した
。制限酵素消化したＡＮＴ ｃＤＮＡを、前述の実施例に記載したように制限（
消化）した発現ベクターＤＮＡと連結した。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（Ｔ
ＯＰ１０Ｆ’株：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示書に従って、原核生
物ベクター構築物を含む連結混合物で形質転換した。単一のコロニーを、５０ｕ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する３〜５ｍｌのＬＢブロス中での増殖について
選択し、そしてプラスミドＤＮＡを、ＷＩＺＡＲＤTMＰｌｕｓシリーズ９６００ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使
用して細菌培養物から単離し、そして制限地図を作製した。予想される制限地図
（発現ベクターおよびヒトＣｙｐＡのヌクレオチド配列に基づく）を有するＧＳ
Ｔ−ｈｕＣｙｐＡ発現構築物の単離物を、さらなる実験のために選択し、そして
「ｐＭＫ１０−ＧＳＴ−ｈｕＣｙｐＡ」と名付けた。
【０２６１】 （実施例９：細菌におけるＨｉｓタグ化シクロフィリンＤ（Ｈｉｓ６×−Ｃｙ
ｐＤ）融合タンパク質のクローニングおよび発現） （Ａ．ＣｙｐＤ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅） ヒト心臓より調製した総細胞性ＲＮＡより調製したｃＤＮＡライブラリーを、
商業的供給元（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）より得た。サー
マルサイクラーにて、ＣｙｐＤ ｃＤＮＡを、以下のプライマー、ＡＭＰＬＩＴ
ＡＱTM ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、ならびにＧＥＮＥ
ＡＭＰTM ＰＣＲ試薬キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）中に供給される試薬
および緩衝液を製造業者の指示書に従って使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）によってｃＤＮＡライブラリーより増幅した。以下に示されるＰＣＲプラ
イマーにおいて、下線を付したヌクレオチドは、ＣｙｐＤ ｃＤＮＡの５’末端
および３’末端に相補的な配列を示し、二重下線を付したヌクレオチドは、制限
酵素ＸｈｏＩ（認識配列：５’−ＣＴＣＧＡＧ）およびＡｓｐ７１８（認識配列
：５’−ＧＧＴＡＣＣ）についての認識配列を示し、そしてｈｕＣｙｐＤ開始コ
ドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＡ）の逆相補を太字にした。
【０２６２】 ヒトＣｙｐＤ（ｈｕＣｙｐＤ；配列番号３９）について、以下のヌクレオチド
配列を有するプライマーを使用した： 順方向（センス）：
【０２６３】
【化２１】 （配列番号４１）、および 逆方向（アンチセンス）
【０２６４】
【化２２】 （配列番号４２）。
【０２６５】 （Ｂ．６×Ｈｉｓ−ＣｙｐＤ発現構築物の作製） 発現ベクターｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（「Ｂ」誘導体；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使
用した。このベクターは、５’から３’の方向に作動可能に連結された以下のエ
レメントを含む：誘導性であるが、強度に調節可能であるａｒａＢＡＤプロモー
ター；最適化されたＥ．ｃｏｌｉ翻訳開始シグナル；アミノ末端ポリヒスチジン
（６×Ｈｉｓ）コード配列（「Ｈｉｓタグ」としても呼ばれる）；ＸＰＲＥＳＳ TM エピトープコード配列；所望される場合、タンパク質精製後にＮ末端の前にあ
るアミノ酸を除去するために使用され得るエンテロキナーゼ切断部位；多重クロ
ーニング部位；および、インフレームでの終止コドン。
【０２６６】 プラスミドｐＢＡＤ／Ｈｉｓ ＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩお
よびＡｓｐ７１８で製造業者の指示書に従って消化することによって調製し、そ
して垂直アガロースゲル電気泳動、およびＵｌｔｒａＣｌｅａｎ ＧｅｌＳｐｉ
ｎキット（Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するバンド抽出に
供した。制限酵素消化したＣｙｐＤ ｃＤＮＡを、製造業者の反応緩衝液を使用
するＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖ
ｅｒｌｙ，ＭＡ）を製造業者の指示書に従って、制限（消化）した発現ベクター
ＤＮＡと連結した。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（ＴＯＰ１０Ｆ’株：Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示書に従って使用して、原核生物ベクター構築
物を含む連結混合物で形質転換した。単一のコロニーを選択しかつ３〜５ｍｌの
ＬＢブロス中で増殖し、そしてプラスミドＤＮＡを、ＷＩＺＡＲＤTMＰｌｕｓシ
リーズ９６００ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ）を使用して細菌培養物から単離した。予想される制限地図（発現ベク
ターおよびヒトＣｙｐＤのヌクレオチド配列に基づく（配列番号３９））を有す
る６×Ｈｉｓ−ｈｕＣｙｐＤ発現構築物ベクターの単離物を、さらなる実験のた
めに選択し、そして「ｐＭＫ１１−６×Ｈｉｓ−ｈｕＣｙｐＤ」と名付けた。
【０２６７】 （実施例１０：細菌におけるグルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ−シクロ
フィリンＤ（ＧＳＴ−ＣｙｐＤ）融合タンパク質のクローニングおよび発現） （Ａ．ＣｙｐＤ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅） サーマルサイクラーにて、ＣｙｐＤ ｃＤＮＡを、以下のプライマー、ＡＭＰ
ＬＩＴＡＱTM ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、ならびにＧ
ＥＮＥＡＭＰTM ＰＣＲ試薬キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）中に供給され
る試薬および緩衝液を製造業者の指示書に従って使用して、総細胞性ｍＲＮＡ（
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）よりＰＣＲによって調製したｃ
ＤＮＡライブラリーより増幅した。以下に示されるＰＣＲプライマーにおいて、
下線を付したヌクレオチドは、ＣｙｐＤ ｃＤＮＡの５’末端および３’末端に
相補的な配列を示し、二重下線を付したヌクレオチドは、制限酵素ＸｈｏＩ（認
識配列：５’−ＣＴＣＧＡＧ）およびＢａｍＨＩ（認識配列：５’−ＧＧＡＴＣ
Ｃ）についての認識配列を示し、そしてｈｕＣｙｐＤ開始コドン（ＡＴＧ）およ
び終止コドン（ＴＡＡ）の逆相補を太字にした。
【０２６８】 ｈｕＣｙｐＤについて、以下のヌクレオチド配列を有するプライマーを使用し
た： 順方向（センス）：
【０２６９】
【化２３】 （配列番号４３）、および 逆方向（アンチセンス）
【０２７０】
【化２４】 （配列番号４４）。
【０２７１】 （Ｂ．ＧＳＴ−ＣｙｐＤ発現構築物の作製） ＣｙｐＤ ＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ
（両酵素ともＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより
）で製造業者の供給する反応緩衝液を使用して製造業者の指示書に従って消化し
た。制限（消化）したＤＮＡを、垂直アガロースゲル電気泳動、およびＵｌｔｒ
ａＣｌｅａｎTM ＧｅｌＳｐｉｎキット（Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ，Ｉｎｃ）を使用するバンド抽出によって精製した。
【０２７２】 発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、酵素的ポリペプチドおよびＣｙｐＤポリペプチド
を含むｈｕＣｙｐＤ融合タンパク質を作製した。このベクターは、Ｓｃｈｉｓｔ
ｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ由来のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（
ＧＳＴ）遺伝子（Ｓｍｉｔｈら、１９８８、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）に作
動可能に連結されたｌａｃＩq（レプレッサー）遺伝子、ｔａｃプロモーター、
多重クローニング部位からすぐ５’側のトロンビン切断部位コードヌクレオチド
配列を含むように改変されたコード配列を含む。ＧＳＴ融合タンパク質を、抗Ｇ
ＳＴでのウエスタンブロットまたは比色アッセイを使用することによって検出し
得る。後者のアッセイは、グルタチオンおよびＧＳＴについての基質として１−
クロロ−２−４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）を利用し、そして３４０ｎｍで
検出可能な黄色の産物を得る（Ｈａｂｉｇら、１９７４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２４９：７１３０−７１３９）。この発現ベクター由来の発現構築物から
産生されたＧＳＴ融合タンパク質を、例えば、グルタチオンアフィニティクロマ
トグラフィーによって精製し得、そして所望のポリペプチドをトロンビンによっ
て融合産物から放出し得る。従って、この発現ベクターは、融合タンパク質の迅
速な精製を提供し、そして比較的少ない余分なＮ末端アミノ酸を有するタンパク
質を放出するが、生じた組換え的に産生されたタンパク質は、２つのさらなるア
ミノ酸（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）をアミノ末端に含む。ｔａｃプロモーターは、例えば
、１〜５ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；Ｆｌｕ
ｋａ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）の培養される細胞への添加によって誘導され
得、そして高レベルの発現を提供する。
【０２７３】 プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−２を、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよび
ＸｈｏＩで製造業者の指示書に従って消化することによって調製し、そして垂直
アガロースゲル電気泳動、およびＵｌｔｒａＣｌｅａｎTM ＧｅｌＳｐｉｎキッ
ト（Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するバンド抽出に供した
。制限酵素消化したＡＮＴ ｃＤＮＡを、前述の実施例に記載したように制限（
消化）した発現ベクターＤＮＡと連結した。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（Ｔ
ＯＰ１０Ｆ’株：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示書に従って、原核生
物ベクター構築物を含む連結混合物で形質転換した。単一のコロニーを、５０ｕ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する３〜５ｍｌのＬＢブロス中での増殖について
選択し、そしてプラスミドＤＮＡを、ＷＩＺＡＲＤTMＰｌｕｓシリーズ９６００ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使
用して細菌培養物から単離し、そして制限地図を作製した。予想される制限地図
（発現ベクターおよびヒトＣｙｐＤのヌクレオチド配列に基づく）を有するＧＳ
Ｔ−ｈｕＣｙｐＤ発現構築物の単離物を、さらなる実験のために選択し、そして
「ｐＭＫ１２−ＧＳＴ−ｈｕＣｙｐＤ」と名付けた。
【０２７４】 （実施例１１：シクロフィリンＤ−グリーン蛍光タンパク質（ＣｙｐＤ−ＧＦ
Ｐ）融合タンパク質のクローニングおよび発現） （Ａ．ＣｙｐＤ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅） ＣｙｐＤ ｃＤＮＡを、以下のプライマー、ＡＭＰＬＩＴＡＱTM ＤＮＡポリ
メラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、およびＧＥＮＥＡＭＰTM ＰＣＲ Ｒ
ｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に提供される試薬および緩
衝液を製造業者の指導書に従って使用して、サーマルサイクラーでのＰＣＲによ
って、ヒト心臓より調製した総細胞性ｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡライブラリ
ー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から増幅した。以下に示す
ＰＣＲプライマーにおいて、下線を付したヌクレオチドは、ｃｙｐＤのリーディ
ングフレームに相補的な配列を示し、二重下線を付したヌクレオチドは、制限酵
素ＸｈｏＩ（認識配列：５’−ＣＴＣＧＡＧ）およびＢａｍＨＩ（認識配列：５
’−ＧＧＡＴＣＣ）についての認識配列を示し、そしてｈｕＣｙｐＤ開始コドン
（ＡＴＧ）は太字で示す。
【０２７５】 以下のヌクレオチド配列を有するプライマーを使用した： 順方向（センス）：
【０２７６】
【化２５】 （配列番号４５）、および
【０２７７】
【化２６】 （配列番号４６） 直前に記したプライマーにおけるＢａｍＨＩ部位は、増幅産物がｃｙｐＤについ
ての正常な終止コドンを欠き、そしてｃｙｐＤリーディングフレーム（コドンの
間でハイホンを付されることによって上述の表示において示した）がｐＥＣＦＰ
−Ｎ１（先述）中の増強されたシアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）ＤＮＡと融合
されるように位置される。
【０２７８】 （Ｂ．ＣｙｐＤ−ＥＣＦＰ発現構築物の作製） 発現ベクターｐＥＣＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｉｎｃ．）を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで制限酵素消化した。先述の制限
フラグメントから形成される所望の連結産物において、ｐＥＣＦＰ−Ｎ１中のＢ
ａｍＨＩ部位を、ＡＮＴ３コードフラグメント中のＢａｍＨＩ部位と連結し、そ
してＣｙｐＤコードフラグメント中のＸｈｏＩ部位を、ｐＥＣＦＰ−Ｎ１中のＸ
ｈｏＩ部位と連結して、そして生じたプラスミドは、ＣｙｐＤ−ＣＦＰ融合タン
パク質をコードする。用語「ＣｙｐＤ−ＥＣＦＰ融合タンパク質」は、以下を有
する単一の連続するポリメラーゼ鎖を示す：（１）ヒトＣｙｐＤに対応する、ア
ミノ末端ポリペプチド部分、および（２）増強されたシアン蛍光タンパク質（Ｅ
ＣＦＰ）に対応する、カルボキシ末端ポリペプチド部分（４３３ｎｍでの最大励
起（４５３ｎｍでの副次的なピーク）および４７５ｎｍでの放射ピーク（５０１
ｎｍでの副次的なピーク））。
【０２７９】 制限酵素消化したＤＮＡを、当該分野において公知の標準的条件下でＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼを使用して互いに連結した。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（ＤＨ
５α株；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を、製造業者の手引
書に従って連結混合物で形質転換した。単一のコロニーを選択しかつ３〜５ｍｌ
のＬＢブロスにて増殖し、そしてプラスミドＤＮＡを、ＷＩＺＡＲＤTM Ｐｌｕ
ｓ Ｓｅｒｉｅｓ ９６００ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｓｙｓｔ
ｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細菌培養物から単離し、そして制限地図を作
製した。予想された制限地図（発現ベクターおよびヒトＣｙｐＤのヌクレオチド
配列に基づいた）を有するｈｕＣｙｐＤ−ＥＣＦＰ発現構築物の１つの単離物を
、さらなる実験のために選択し、そして「ｐＭＫ１３−ｈｕＣｙｐＤ−ＥＣＦＰ
」と名付けた。
【０２８０】 （Ｃ．ＣｙｐＤ−ＥＣＦＰ融合タンパク質の発現および細胞内局在） 直前の項に記載されたＣｙｐＤ−ＥＣＦＰ融合タンパク質の発現および細胞内
局在を、蛍光顕微鏡によって試験した。ＣＯＳ−１細胞または２９３細胞を、コ
ンフルエントにまで増殖し、そして細胞の１ｍｌを、１ｍｌの低血清培地のＯｐ
ｔｉ−ＭＥＭTM Ｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、０．
２、１．０、または２．０μｇのＤＮＡ（ｐＥＣＦＰ−Ｎ１、ｐＭＫ１３−Ｃｙ
ｐＤ−ＣＦＰ、またはベクターなしのコントロール）を含む溶液、および３〜４
μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥTM（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
Ｉｎｃ．）と混合した。５時間のインキュベート後、２０％の胎児ウシ血清を含
む１ｍｌの培地を添加し、そしてインキュベートの総時間が約４８時間になるよ
うに、細胞を、さらなる期間にわたって２４時間ごとに培地を交換してインキュ
ベートした。
【０２８１】 次いで、形質転換したＣＯＳ−１細胞および２９３細胞を、ＧＦＰフィルター
（励起側（ｅｘｃｉｔａｔｏｒ）、４５０±２５ｎｍ；二色性（ｄｉｃｈｒｏｉ
ｃ）、４８０ｎｍ；エミッター、４８５ｎｍ、長経路；Ｎｉｋｏｎ，Ｉｎｃ．，
Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用する蛍光顕微鏡によって試験した。０．２また
は１．０μｇのｐＭＫ１３−ＣｔｐＤ−ＥＣＦＰ ＤＮＡで形質転換した細胞は
、ＣｙｐＤ−ＥＣＦＰ融合タンパク質のミトコンドリア送達を示す斑点の蛍光を
示した。より高い量（２．０μｇ）のｐＭＫ１３−ＣｔｐＤ−ＥＣＦＰ ＤＮＡ
で形質転換した細胞は、いくらか低いレベルの細胞質の蛍光を有したが、ほとん
どの細胞が斑点の蛍光を示した。ＣＯＳ−１細胞は、一般に２９３細胞より高程
度の蛍光を発し、このことはおそらく、高程度の形質転換および／または発現を
示す。発現ベクターｐＥＣＦＰ−Ｎ１で形質転換した細胞は、低レベルの細胞質
の蛍光のみを示し、そしてコントロール（ｍｏｃｋ形質転換）細胞は、検出可能
な蛍光を示さなかった。蛍光顕微鏡の結果は、ＣｙｐＤ−ＥＣＦＰ融合タンパク
質がもっぱらミトコンドリアに局在することを示す。
【０２８２】 （実施例１２：Ｈｉｓタグ化ヒトＣｙｐＤタンパク質の精製） 前出の実施例に記載されるシクロフィリン発現構築物を使用して、以下の実施
例に記載されるアッセイにおけるリガンドとして使用されるシクロフィリンタン
パク質および融合タンパク質を産生し得た。
【０２８３】 例えば、実施例９に記載される（６×Ｈｉｓ）−（ＸＰＲＥＳＳTMエピトープ
）−（ヒトシクロフィリンＤ）についての発現構築物を使用して、Ｈｉｓタグ化
ＣｙｐＤ融合タンパク質を産生した。ｐＭＫ１１−６×Ｈｉｓ−ｈｕＣｙｐＤを
保有するＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５α株）細胞を、アンピシリン（００μｇ／ｍｌ）
を含むＴＢ培地またはＬＢ培地にて３７℃で攪拌しながら一晩培養した。一晩の
培養物を、新鮮培地でＯＤ600＝０．１まで希釈し、次いで、約２時間攪拌しな
がら３７℃でインキュベートした（すなわち、ＯＤ600が約０．５になるまで）
。発現を誘導するために、Ｌ−アラビノースを貯蔵２０％溶液から最終濃度０．
０１％にまで添加した。次いで、Ｈｉｓタグ化ＣｙｐＤ融合タンパク質の最大産
生を可能にするために、培養物を、約４時間より長くなる前までインキュベート
した。
【０２８４】 細菌細胞を、遠心分離によって回収した（乾燥ペレットを凍結し得、そして所
望の場合、この時点で、−８０℃で貯蔵し得る）。ペレットを、イミダゾール（
３ｍＭ）および効果的なレベル（典型的には１０μｇ／ｍｌ）で存在するプロテ
アーゼインヒビター（ペプスタチン、ロイペプチン、フェニルメチルスルホニル
フルオリド（ＰＭＳＦ）および／またはアプロチニン（全てＳｉｇｍａから））
を含む適切な容量のＰＢＳに再懸濁した。再懸濁した細胞を、２０秒間超音波処
理し、そして溶解物を１４，０００×ｇで４℃にて２０分間遠心分離することに
よって清澄化した。
【０２８５】 次いで、清澄化した溶解物質を使用して、当業者に公知の種々の方法でＨｉｓ
タグ化ｈｕＣｙｐＤを調製した。典型的には、溶解物を、Ｎｉｃｋｅｌビーズ（
アガロースまたは磁気性であるが、アガロースＮｉｃｋｅｌビーズはタンパク質
のよりよい特異的収量を提供するようである）に添加した。約５０μｌのＮｉｃ
ｋｅｌアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を、５００μｌの溶解物に添加して、
そして２〜４８時間、４℃で攪拌しながらインキュベートした。ビーズを簡単に
洗浄して、そしてＨｉｓタグ化ｈｕＣｙｐＤをイミダゾール（５０〜５００ｍＭ
、好ましくは２５０ｍＭ、約４〜約６のｐＨ）またはＥＤＴＡ（１０〜５００ｍ
Ｍ、好ましくは１００ｍＭ、約４〜約８のｐＨ）で処理することによってそこか
ら放出した；記載した実験においては１００ｍＭのＥＤＴＡを使用した。
【０２８６】 （６×Ｈｉｓ）−（ＸＰＲＥＳＳTMエピトープ）−（ヒトシクロフィリンＤ）
融合タンパク質は、可溶性であり、そして以下の実施例に記載されるアッセイに
直接使用され得る。しかし、所望される場合、ｐＭＫ１１−６×Ｈｉｓ−ｈｕＣ
ｙｐＤから発現した組換えｈｕＣｙｐＤタンパク質をエンテロキナーゼで処理し
て、Ｈｉｓ−Ｔａｇ／ＸＰＲＥＳＳTMエピトープポリペプチドをｈｕＣｙｐＤタ
ンパク質から遊離し得る。このことを、（６×Ｈｉｓ）−（ＸＰＲＥＳＳTMエピ
トープ）−（ヒトシクロフィリンＤ）融合タンパク質がＮｉｃｋｅｌビーズに結
合した後に実施し得る。この場合、Ｈｉｓ−Ｔａｇ／ＸＰＲＥＳＳTMエピトープ
ポリペプチドは、Ｎｉｃｋｅｌビーズ上に残り、そしてｈｕＣｙｐＤタンパク質
を、単にビーズを抽出しそして抽出物質を回収することにより調製し得る。
【０２８７】 シクロフィリンＡ、またはＣｙｐＡ融合タンパク質を、（６×Ｈｉｓ）−（Ｘ
ＰＲＥＳＳTMエピトープ）−（ヒトシクロフィリンＡ）についての発現構築物で
あるｐＭＫ９−６×Ｈｉｓ−ｈｕＣｙｐＡ（実施例７）を保有する細胞を使用す
る同様の様式において調製する。ＡＮＴ−ＧＦＰ融合タンパク質、ＣｙｐＡ−Ｇ
ＦＰ融合タンパク質およびＣｙｐＤ−ＧＦＰ融合タンパク質（それぞれ、実施例
、および ）を、精製の簡便化のためのＨｉｓタグまたはＧＳＴポリペプチド
をさらに含むように操作し得るか、または適切な発現構築物を保有する細菌細胞
より精製し得る（このようなプロトコールの１つについて、Ｇｏｎｚａｅｌｅｚ
およびＷａｒｄ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｉ．Ｅ，「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏ
ｆ ＧＦＰ」：Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｐｒｏ
ｐｅｒｔｉｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，
Ｃｈａｌｆｉｅ，Ｍ．およびＫａｉｎ，Ｓ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ
ｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９８，２８９−２９４頁）を参照のこと
。
【０２８８】 （実施例１３：他のミトコンドリア因子由来の融合タンパク質についての発現
構築物の調製） 本明細書の技術を使用して、当業者は、他のミトコンドリア因子の融合タンパ
ク質誘導体を調製し得る。このミトコンドリア因子は、ミトコンドリア透過性移
動（ＭＰＴ）細孔の一部であると考えられるかまたは推測されるタンパク質、お
よびＭＰＴ細孔の１以上の成分と相互作用すると考えられるかまたは推測される
他のタンパク質を含む。このような融合タンパク質は、Ｈｉｓタグ化タンパク質
、エピトープタグ化タンパク質、ＧＳＴ融合タンパク質およびＧＦＰ融合タンパ
ク質を含み得、これらは、例示の目的であって限定の目的ではない。
【０２８９】 表１は、以下を列挙する：（１）ミトコンドリア透過性移動（ＭＰＴ）細孔の
一部であると考えられるかまたは推測されるミトコンドリア因子、および（２）
ＭＰＴ細孔の１以上の成分と相互作用すると考えられるかまたは推測される他の
タンパク質。表１はさらに、これらのミトコンドリア因子をコードする遺伝子に
ついての利用可能なヌクレオチド配列情報を記載し、これらから、当業者は、オ
リゴヌクレオチドプライマーを設計してＤＮＡフラグメントを増幅するようにＰ
ＣＲ反応において使用し得、このＤＮＡフラグメントは、（ａ）表１に記載され
る因子の１つについてのタンパク質コード配列、および（ｂ）所望の発現ベクタ
ーにクローニングするために適した、増幅したＤＮＡの末端での制限酵素部位、
を有する。
【０２９０】 （表１：ミトコンドリア細孔成分および配列）
【０２９１】
【表１】 （実施例１４） （抗体） 本発明の方法のアッセイに有用な抗体は、公知の方法と組み合わせて本開示の
教示を使用して、当業者によって調製され得る。ヒトＡＮＴ３に対する抗体の調
製を、本実施例に記載し、同様に、いくつかの有用な市販の補足的な抗体も記載
する。
【０２９２】 （Ａ．ヒトＡＮＴ３に対して特異的な抗体の調製） ｈｕＡＮＴ３に特異的な一重特異的（抗ペプチド）抗体を、以下のように調製
した。カルボキシ末端付近に位置し、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ指数（Ｗｏｌｆ
ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１８７−１９１（１９８８）
）に従って高い抗原性を有することが推定されるｈｕＡＮＴ３の部分に対応する
合成ペプチドを、Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ（Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ）による公知の手段を用いて合成し、そし
てＨＰＬＣ分析およびＭＳ分析によって、少なくとも約７０％純粋、好ましくは
少なくとも約９０％純粋であると決定した。合成ポリペプチドの配列（配列番号
３０）は： Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ である。
【０２９３】 合成ポリペプチドを、キャリア分子であるキーホールリンペットヘモシアニン
（ＫＬＨ）に、ＭＳＢ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，
Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を用いて結合体化し、そしてこの結合体化物質を使用して、
公知の手段（ＣｏｌｌａｗｎおよびＰａｔｅｒｓｏｎ，第１１章のユニット１１
．１４および１１．１５：Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｓｕｂｅｌら、編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）１１：３
７−４１）に従って数匹のウサギを免疫した。このウサギを、接種後の０週（免
疫前、２ｍＬ）、７週、９週、１１週、１３週（各採血について１５ｍＬ）また
は１５週（５０ｍＬ）に採血した。アジ化ナトリウム（０．１％）を、保存剤と
してこれらの採血に添加した。
【０２９４】 （Ｂ．有用な市販の一次抗体） ＧＳＴ融合タンパク質を検出するため、またはＧＳＴ融合タンパク質を固体支
持体に連結させるために有用な、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）に対する抗体は、記載され、そして市販される（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅ
ｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ
；Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆ
ｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏ
ｕｉｓ，ＭＯ；およびＯｘｉｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｐｏ
ｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）。
【０２９５】 Ｈｉｓタグ融合タンパク質を検出するため、またはＨｉｓタグ融合タンパク質
を固体支持体に連結させるために有用な、アミノ末端またはカルボキシ末端の６
×Ｈｉｓタグに対する抗体は、記載され、そして市販される（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；およびＢｅｒｋｌｅｙ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）。各検出に関して、抗（Ｈ
ｉｓタグ）は、検出可能な物質および／または生成物が利用可能である種々の酵
素のうちの１つ（西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む）に
連結された結合体として利用可能である。
【０２９６】 ＧＦＰ融合タンパク質を検出するため、またはＧＦＰ融合タンパク質を固体支
持体に連結させるために有用な、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対する抗
体は、記載され、そして市販される（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｂｅｒｋｌｅｙ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ Ｃｏ．；Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ａｕｒｏｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｓａ
ｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。検出の容易さのために、抗ＧＦＰは、検出可能な物質
および／または生成物が利用可能である種々の酵素のうちの１つ（西洋ワサビペ
ルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼ（両方ともＣｌｏｎｔｅｃｈから
）を含む）に連結された結合体として利用可能である。
【０２９７】 ＸＰＲＥＳＳTMエピトープを含む融合タンパク質を検出するため、またはＸＰ
ＲＥＳＳTMエピトープを含む融合タンパク質を固体支持体に連結させるために有
用なＸＰＲＥＳＳTMエピトープに対する抗体は、記載され、そして市販される（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【０２９８】 （実施例１５） （ｈｕＡＮＴ３−ｈｕＣｙｐＤ相互作用のアッセイ） 前出の実施例に記載される試薬を、ミトコンドリア透過性変化細孔（ＭＰＴ）
の成分間の相互作用を測定するために設計された種々のアッセイに使用し得る。
本実施例は、ミトコンドリアアデニンヌクレオチドトランスロケーターのアイソ
フォーム（ｈｕＡＮＴ３）とシクロフィリンＤ（ｈｕＣｙｐＤ）との間の相互作
用を測定するために設計されたイムノアッセイを記載する。
【０２９９】 （Ａ．ニッケルビーズ：ＨＩＳ−タグｈｕＡＮＴ３複合体の調製） 未感染のＴ．ｎｉ細胞またはＨｉｓ−タグ−ｈｕＡＮＴ３を発現するバキュロ
ウイルスで感染されたＴ．ｎｉ細胞（実施例３を参照のこと）由来のペレットに
するミトコンドリアを、以下のように調製した。Ｔ．ｎｉ細胞を、１チューブあ
たり約２５０ｍｇの細胞の部分としてサブコントラクター（ＰｈａｒＭｉｎｇｅ
ｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって調製した。各部分を、プロテアーゼイ
ンヒビター（ロイペプチン、終濃度１０μｇ／ｍｌ；ペプスタチン、終濃度１０
μｇ／ｍｌ；アプロチニン、終濃度２μｇ／ｍｌ；フェニルメチルスルホニルフ
ルオライド｛ＰＭＳＦ｝、終濃度１００μＭ；全てＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯより）を有する１ｍｌのＭＳＢ中に再懸濁
した。再懸濁した細胞懸濁物を、２回凍結融解し、次いで、回転するテフロン（
登録商標）コートされたプローブおよび近接して適合したガラス容器を用いてホ
モジナイズした（１０回のパス）。細胞ホモジェネートを４℃で５分間遠心分離
し（３，７００ｒｐｍ、約１，５００×ｇ）；この最初の回転からの上清を取っ
た。このペレットを、プロテアーゼインヒビターを有する約５００μｌのＭＳＢ
を用いて洗浄し、４℃で５分間（３，８００ｒｐｍ、約１，６００×ｇ）遠心分
離し、そしてこの回転からの上清を、最初の回転からの上清と合わせた。この合
わせた上清を４℃で１５分間（１４，０００ｒｐｍ、約２０，８００×ｇ）遠心
分離し、そしてペレットを、３００μｌの、（ａ）２０ｍＭ ＭＯＰＳおよび（
ｂ）ＭＳＢの１：１の溶液中に再懸濁し、ここで、（ａ）および（ｂ）の両方は
、前記のプロテアーゼインヒビターを含む。生じる懸濁液を３回凍結融解した。
【０３００】 １００μｌのＴ．ｎｉミトコンドリア（９．８３μｇ／ｍｌ）を氷上でゆっく
りと融解し、次いで、４℃で１５分間遠心分離して、ミトコンドリアをペレット
にした。このペレットを、１ｍＭ ２−メルカプトエタノールであるように新し
く作製された１００μｌの可溶化緩衝液（２０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．３Ｍ
ＮａＣｌ、２０μＭ イミダゾール、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中で可溶化し、そしてこの緩衝液には、周囲温度
で２分間かまたは４℃で３分間、以下のプロテアーゼインヒビターが効果的なレ
ベルで（代表的に１０μｇ／ｍＬ）新しく添加されていた：ペプスタチン、ロイ
ペプチン、フェニルメチルスルホニルフルオライドおよびアプロチニン（全てＳ
ｉｇｍａより）。次いで、この溶液を、希釈緩衝液（２０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、２
０ｍＭ イミダゾール、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００、ｐＨ７．２）を用いて３００μｌの最終溶液に希釈した。
【０３０１】 （Ｂ．ｈｕＡＮＴ３：ｈｕＣｙｐＤ相互作用のアッセイ） ６０μｌのＴ．ｎｉミトコンドリアのアリコートを、洗浄緩衝液（２０ｍＭ
ＫＨ2ＰＯ4、２０ｍＭ イミダゾール、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．３％ Ｔｒｉ
ｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ７．２）で１回、前洗浄されたニッケルプレート化ア
ガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）の７５μｌのアリコートのスラリーに添加した
。このビーズを、適切な期間（代表的に、約５〜１５分間であるが、インキュベ
ーションは、結局可視の変化を伴わずに、２〜３０分間進行され得る）、周囲温
度で、連続した混合を提供するために回転試験管スタンドにおいてインキュベー
トする。いくつかのサンプルにおいて、ＧＳＴ−ＣｙｐＤ融合タンパク質（実施
例１０）を、ｈｕＡＮＴ３に対するリガンドとして添加した（１チューブあたり
１２μｇ）；これらのいくつかのサンプルにおいて、ＣｙｐＤの作用を特異的に
阻害するシクロスポリンＡ（終濃度、１０μＭ；エタノール中の２μＭストック
溶液より）をまた、添加した。
【０３０２】 このインキュベーション中に形成された複合体を、以下のように図解し得る（
ここで、「−」は、化学結合を示し、そして「：」は、２分子間の相互作用を示
す） （ビーズ）−ニッケル：６×Ｈｉｓ−ＡＮＴ３：ＣｙｐＤ−ＧＳＴ。
【０３０３】 インキュベーションを、過剰（１ｍｌ）の冷（すなわち、氷上で保存）洗浄緩
衝液を添加することによって停止した。このビーズを、３０秒間、低速度の遠心
分離によってペレットにし、１ｍｌの冷洗浄緩衝液で１回洗浄し、そして多数の
方法によって即座に抽出した。総結合リガンド（ＧＳＴ−ＣｙｐＤ）を決定する
ために、８０μｌの１×ＮｕＰＡＧＥ ＳＤＳサンプル緩衝液（Ｎｏｖｅｘ，Ｓ
ａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）をビーズに添加し、これを次いで、約５〜１０分間、
沸騰水浴中においた。ＡＮＴに対するリガンド（ＧＳＴ−ＣｙｐＤ）結合の量を
決定するために、６０μｌの溶出緩衝液（５０〜５００ｍＭ、好ましくは、２５
０ｍＭのイミダゾール、ｐＨは、約４〜約６；または１０〜５００ｍＭ、好まし
くは１００ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨは、約４〜約８；記載される実験においては、
１００ｍＭ ＥＤＴＡを使用した）を、第２セットの別の方法で同一に処理した
ビーズに添加した。ＥＤＴＡは、Ｈｉｓ−タグｈｕＡＮＴ３のＨｉｓ−タグ（６
×Ｈｉｓ）部分が結合するニッケルイオンをキレートするので、後者の実体は、
ＥＤＴＡの添加によってニッケルビーズから置換される。Ｈｉｓ−タグＡＮＴ３
タンパク質がニッケルビーズから溶出される場合、ＡＮＴ３ポリペプチドに特異
的に結合するＧＳＴ−ＣｙｐＤタンパク質がまた、溶出される。理論に束縛され
ることを望まないが、これは、（１）ＧＳＴ−ＣｙｐＤ融合タンパク質ＣｙｐＤ
部分がＡＮＴポリペプチド配列に結合したままであり、そしてＨｉｓ−タグＡＮ
Ｔ３タンパク質と一緒に運ばれること、または（２）全ＡＮＴ３：ＣｙｐＤ複合
体の不安定化および分離を引き起こすニッケルビーズからのＨｉｓ−タグＡＮＴ
タンパク質の置換、あるいはこれらの機構および／または他の機構のいくつかの
組み合わせに起因して生じると考えられる。
【０３０４】 抽出物を、ウエスタンブロット分析によって評価した。簡単に言うと、ローデ
ィング色素を、必要である場合この抽出物に添加し、このサンプルを、約５〜１
０分間、沸騰水中に配置し、次いで、成形済みのポリアクリルアミドゲル（Ｎｏ
ｖｅｘ）上で電気泳動し、そしてニトロセルロースフィルターに電気的にブロッ
トした。ＣｙｐＤ−ＧＳＴ融合タンパク質のＧＳＴ部分に特異的な抗体を、フィ
ルターをプローブする際の一次抗体として使用し、そして結果として、内因性シ
クロフィリンＤタンパク質は、このアッセイにおいて示されない。このフィルタ
ーを、まず１：１０，０００希釈されたマウス抗ＧＳＴ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎ
ｇｅｎ）を用いて６０分間インキュベートし、次いで、１：５，０００希釈され
た西洋ワサビペルオキシダーゼと結合体化されたヒツジ抗マウスＩｇ抗体（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈ
ｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を用いて約３０分間〜約６０分間インキュベートした（両
インキュベーションは、周囲温度で実施した）。西洋ワサビペルオキシダーゼに
関してアクリダン（ａｃｒｉｄａｎ）ベースの物質を用いたインキュベーション
によってフィルターを開発し、この生成物は、高レベルの徐放出力の光を放出す
る（ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏ
ｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
。このフィルターを、適切な曝露時間、フィルムに曝露し（代表的に１〜２分間
）、次いで、分離し、ヒトＡＮＴ３に特異的な抗体を用いて再プローブした（実
施例１４）。
【０３０５】 代表的な実験の結果を、図９に示す。最も右において、０．５μｇの精製Ｃｙ
ｐＤ−ＧＳＴ融合タンパク質を、抗ＧＳＴとのその反応を介して明らかにする。
ＥＤＴＡ溶出によって明らかにされたタンパク質を、レーン１’〜５’に可視化
する。レーン１’において、非ＨｉｓタグｈｕＡＮＴ３がサンプル中に存在し、
そしてニッケルコートされたアガロースビーズへのＣｙｐＤ−ＧＳＴ結合はわず
かな量のみ非特異的様式で存在した。レーン２’および３’において、Ｈｉｓ−
タグｈｕＡＮＴ３は、サンプル中に存在し、そして保持されたＣｙｐＤ−ＧＳＴ
の量は、おおよそ１０倍までの範囲で可視的に増加する。
【０３０６】 通常の成分に加えて、レーン３’中のサンプル（ならびにレーン３中のサンプ
ル）を、シクロスポリンＡ（Ｓｉｇｍａ）（これは、エタノールベースの保存溶
液として調製される）が添加されるサンプルに対するコントロールとして０．５
％エタノールで作製した。図７のレーン２’および３’を比較することによって
見出され得るように、０．５％ エタノールの存在は、このアッセイの結果に対
して可視的な効果を有さなかった。レーン４’において、ＣｙｐＤ−ＧＳＴ融合
タンパク質を、ニッケルビーズ：Ｈｉｓ−タグＡＮＴ３混合物と接触させる前に
１０μＭ シクロスポリンＡを用いてプレインキュベートし；予想したように、
シクロスポリンＡの存在は、ＡＮＴ媒介ＣｙｐＤ−ＧＳＴ保持を排除した。
【０３０７】 レーン５’において、ニッケルビーズ：Ｈｉｓ−タグＡＮＴ３：ＣｙｐＤ−Ｇ
ＳＴ複合体を、１０μＭ シクロスポリンＡの添加前に、実施した。これらの条
件下において、添加の順序は、結果に識別可能な影響を有さなかった。ローディ
ングおよび回復が実験を介して初めから終わりのチューブまで一貫していたとい
う事実を、レーン２’、３’、４’および５’中のＡＮＴ３の一貫した回復によ
って示す。
【０３０８】 レーン１〜５は、結合タンパク質のＥＤＴＡ媒介溶出後に結合タンパク質が剥
離される（１×ＮｕＰＡＧＥ ＳＤＳサンプル緩衝液の添加および沸騰水浴中に
１０分間配置することによる）レーン１’〜５’のサンプルに対応する、ＥＤＴ
Ａ溶出サンプルを示す。図９に見出され得るように、ＥＤＴＡを用いた溶出後に
ニッケルコートしたビーズに結合したままである検出可能なＣｙｐＤ−ＧＳＴま
たはＨｉｓ−タグＡＮＴ３はない。
【０３０９】 これらの結果は、このアッセイが、ヒトＣｙｐＤおよびＡＮＴの公知のパラメ
ーターを反映することを実証する。すなわち、ＣｙｐＤ−ＧＳＴ融合タンパク質
は、固体支持体上のＨｉｓ−タグＡＮＴ３に特異的に結合し、そしてこの結合は
、シクロスポリンＡによって阻害される。
【０３１０】 （実施例１６） （ＡＮＴ３−ＣｙｐＤ相互作用の他のインビトロアッセイ） 本明細書中に記載される試薬および系を、ＭＰＴ細孔成分と他の各ミトコンド
リア因子および／または他のミトコンドリア因子との相互作用の種々のインビト
ロアッセイにおいて使用し得る。例としてＡＮＴおよびＣｙｐＤを使用して、本
実施例は、このような他の用途ならびに本明細書中に開示される組成物および方
法の実施形態を記載する。
【０３１１】 例えば、１つの関連する実施形態において、結合アッセイに添加されるＣｙｐ
Ｄリガンドは、エピトープ−タグＣｙｐＤ融合タンパク質であり、ここで、この
エピトープは、例えば、６×Ｈｉｓ「タグ」またはＸＰＲＥＳＳTMエピトープで
ある（実施例９）。この様式において、各サンプルに存在するＣｙｐＤリガンド
の量を、エピトープに特異的に結合する抗体または他の検出可能な試薬を用いて
測定する。
【０３１２】 別の関連する実施形態において、この結合アッセイに添加されるＣｙｐＤリガ
ンドは、ＣｙｐＤ−ＧＦＰ融合タンパク質である（実施例１１）。この様式にお
いて、各サンプルに存在するＣｙｐＤリガンドの量を、蛍光計を用いて測定する
。
【０３１３】 さらに関連する実施形態において、このアッセイに使用されるＡＮＴ融合タン
パク質は、グルタチオンコートされたビーズ（Ｓｉｇｍａ）に結合されるＡＮＴ
−ＧＳＴ融合タンパク質であり（実施例２）、そしてＣｙｐＤリガンドは、例え
ば、エピトープ−タグＣｙｐＤ融合タンパク質（ここで、このエピトープは、６
×Ｈｉｓ「タグ」もしくはＸＰＲＥＳＳTMエピトープでである）（実施例９）で
あるか、またはＣｙｐＤ−ＧＦＰ融合タンパク質である（実施例１１）。種々の
ビーズおよび他の支持体が使用され得るが；このようなアッセイに使用されるＣ
ｙｐＤリガンドがグルタチオンビーズまたは他の選択支持体に結合しないことを
確実にするための注意がなされなければならない。この様式において、各サンプ
ルに存在するＣｙｐＤリガンドの量を、エピトープに特異的に結合する抗体また
は他の検出可能な試薬を用いて、あるいは蛍光計（選択したＣｙｐＤリガンドに
適切であるどちらでも）を用いて測定する。
【０３１４】 さらなる関連した実施形態において、アッセイにおいて使用されるＡＴＮ融合
タンパク質は、Ｈｉｓタグまたは他の官能基（例えば、ＧＴＳポリペプチド）を
さらに含む、ＡＮＴ−ＥＹＦＰ融合タンパク質（実施例５）であり、これは、支
持体（すなわち、Ｈｉｓタグ化ＡＮＴ−ＥＹＦＰ融合タンパク質を使用する場合
は、Ｎｉｃｋｅｌビーズ）へのＡＮＴ−ＥＹＦＰ融合タンパク質の付着の目的の
ためのリンカーとして機能し、そしてＣｙｐＤリガンドは、ＣｙｐＤ−ＥＣＦＰ
融合タンパク質である（実施例１１）。この様式では、ＡＮＴ−ＥＹＦＰおよび
ＣｙｐＤ−ＥＣＦＰ融合タンパク質が密に近位である場合に生じるＦＲＥＴを測
定するために蛍光光度計が使用される（次の実施例を参照のこと）。
【０３１５】 本発明のアッセイのこれらおよび他の実施形態を、当業者により適応される自
動化アッセイシステムへ組み込み得る。このような自動化システムは、ＣｙｐＤ
：ＡＮＴ相互作用（またはＭＰＴ有孔成分の相互の相互作用および／または他の
ミトコンドリアの因子との相互作用）に影響する候補化合物、またはそのような
化合物を含む化学的ライブラリーの高処理能力スクリーニング（ＨＴＳ）のため
に有用である。このような化合物は、１以上のＡＮＴ、シクロフィリンもしくは
シクロスポリンタンパク質の過剰発現もしくは機能不全、または１以上のＡＮＴ
、シクロフィリンもしくはシクロスポリンタンパク質の、正に調節するかもしく
は刺激する因子の過剰発現もしくは機能不全から生じる疾患もしくは障害を予防
、処置もしくは治療するために有用な薬物候補物および薬物としてさらに特徴付
け、そして開発し得る。
【０３１６】 多くの自動化アッセイシステムの好ましい要素は、９６ウェルプレートへの標
的分子の組み込みである。このフォーマットは、種々の自動化標識検出システム
における使用のために容易に適用可能である。ＨＴＳアッセイについては、ロボ
ット化標識検出システムが好ましい。蛍光ＣｙｐＤリガンドが、このようなＨＴ
Ｓアッセイにおいて使用される場合、自動化蛍光計数器が使用され、そして例え
ば、それはＦＬＵＯＲＯＣＯＮＴTMＣｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）であり得る。
【０３１７】 （実施例１７） （ＭＰＴ有孔成分とミトコンドリア因子との間の相互作用のＦＲＥＴベースの
アッセイ：全体的な考慮） 前述の実施例は、密に物理的に近位の２つの分子の間の共鳴蛍光エネルギー移
動（ＦＲＥＴ）に基づくアッセイにおいて使用され得る例示的な試薬の生成およ
びシステムを記載する。インビトロまたはインビボで行なわれ得るこのようなア
ッセイ、およびこれらアッセイのための設計的考慮は、本実施例に一般的に記載
され、具体的には、引き続く実施例において、ヒトＡＮＴ３：ＣｙｐＤ相互作用
について記載される。
【０３１８】 （Ａ．ＦＲＥＴベースのアッセイの一般的な記載） 一般に、エネルギー移動（ＥＴ）は、２つの分子（エネルギー供与性「ドナー
」分子およびエネルギー受容性「アクセプター」分子）間の共鳴相互作用から生
じる。エネルギー移動は、以下の場合に生じ得る：（１）ドナーの放出スペクト
ルがアクセプターの吸収スペクトルと重複する場合、および（２）ドナーおよび
アクセプターが互いから特定の距離内にある場合（例えば、約１０ｎｍ未満）。
エネルギー移動の効率は、ドナーおよびアクセプターの接近によりほとんど決定
され、そして距離の６乗に従って減少する。従って、ＥＴの測定は、アクセプタ
ー化合物およびドナー化合物の接近を強く反映し、そしてＥＴにおける変化は、
化合物の接近における変化（例えば、ドナーおよびアクセプターの会合または解
離）を感受的に反映する。
【０３１９】 本発明において、ドナー化合物およびアクセプター化合物は、典型的には両方
とも、ＭＰＴ有孔成分および／またはミトコンドリア因子由来の融合タンパク質
である。本発明のアッセイでは、ドナー化合物およびアクセプター化合物（融合
タンパク質）は、生じる特定の型のエネルギー移動について、特定の条件下で、
互いに十分な接近を達成するような様式で互いに相互作用する。本発明の特定の
局面では、このような相互作用は、１以上の化学的因子により影響され（例えば
、増強されるか、調節されるか、阻害されるか、またはブロックされる）、モニ
ターされ得るエネルギー移動の増加（増強された相互作用）または減少（減少さ
れた相互作用）を生じる。従って、ドナー融合タンパク質とアクセプター融合タ
ンパク質との間のエネルギー移動の程度または速度の測定は、融合タンパク質が
由来する２つの内在性（ミトコンドリア性および／または細胞性）タンパク質の
間の相互作用についてのアッセイの一部として機能する。
【０３２０】 本発明では必要としないが、ドナー分子およびアクセプター分子は両方とも、
測定の簡易性のために、励起光により励起される場合に光を発光する、光放出分
子（例えば蛍光性分子、りん光分子および化学発酵分子）であり得る。本発明に
使用され得る好ましいドナー−アクセプターの組み合わせは、蛍光性ドナーとり
ん光性アクセプターとの組み合わせ、またはりん光性ドナーとりん光性もしくは
蛍光生アクセプターとの組み合わせである。「蛍光（性）」とは、通常異なる波
長で、１つの波長（「励起」）における放射の吸収次いで即座の再放射（「放出
」）により引き起こされ、これは、入射放射が止んだときにほとんど一度に生じ
る。分子レベルでは、蛍光は、蛍光団として知られる特定の化合物が光エネルギ
ーにより、基底状態から励起のより高い状態へ持ち上げられる場合；それらの基
底状態へ分子が戻る場合に、典型的には異なる波長でこれらが光を放出する場合
に生じる。「りん光」は、対照的に、１つの波長での放射の吸収、それに続く異
なる波長で生じそして入射放射が止んだ後のそれと分かる時間の間続く遅い放射
により引き起こされる発光をいう。「化学発光」は、化学反応から生じる発光を
いい、そして「生物発光」は、生体もしくは生細胞、細胞小器官またはそれらに
由来する抽出物からの光の放出をいう。
【０３２１】 例示の目的で、そして限定の目的ではなく、１つの例示的なクラスのエネルギ
ー移動が、共鳴蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）として公知である。ＦＲＥＴは
、励起されたドナー蛍光団が、直接アクセプター蛍光団へ移動される場合に、１
つの分子内、または２つの異なる型の分子間で生じる（概説について、Ｗｕら，
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：１〜１３，１９９４を参照の
こと）。一般に、励起された蛍光団（ドナー）から吸収体（アクセプター）への
エネルギー移動は、以下により測定される：（１）ドナーおよびアクセプターか
らの蛍光のスペクトル（スペクトルの変化を含む）を測定すること；（２）パル
ス−レーザー誘起後にドナーの蛍光強度が減少する速度（すなわち、蛍光寿命）
を測定すること；または（３）ドナー化合物からの蛍光の強度の減少（ＦＲＥＴ
の間接的測定）、もしくはアクセプター化合物からの蛍光強度の増加（ＦＲＥＴ
の直接的測定）を測定すること。エネルギー移動の直接的な測定は、励起された
アクセプター化合物からのシグナルをモニターすることを含み、これは、これら
の化合物が互いに近位になるにつれて増加し、一方、エネルギー移動の間接的な
測定は、化合物が近位になるほど減少する（すなわち、クエンチされる）、励起
されたドナー化合物からのシグナルをモニターすることを含む。
【０３２２】 （Ｂ．ＧＲＥＴベースのアッセイのための、ドナーポリペプチドモチーフ:ア
クセプターポリペプチドモチーフの対） 本発明のＦＲＥＴベースのアッセイのために受容可能なエネルギードナー化合
物（ドナー）およびエネルギー受容化合物（アクセプター）の組み合わせを決定
するために、多くの基準が一般的に使用される。１つの基準は、ドナー化合物の
放出スペクトルが、アクセプター化合物の吸収スペクトルに少なくとも部分的に
重複し、その結果ドナーからアクセプターへのエネルギー移動が生じることであ
る。代表的に、ドナー化合物は、放出ピーク波長（本明細書中、「λＤ（ｅｍ）
」）を有し、これは、アクセプター化合物の励起ピーク波長（本明細書中、「λ
Ａ（ｅｘ）」）の数ｎｍ内である。換言すると、Ｄ（ｅｍ）とＡ（ｅｘ）との間
の差は、典型的には、約７０ｎｍ〜約２０ｎｍ未満であり、λＤ（ｅｍ）−λＡ
（ｅｘ）についての典型的な値は、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、
２５ｎｍ、２０ｎｍ、１５ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍまたは１ｎｍである。
【０３２３】 別の基準は、励起されたアクセプター化合物からの放出シグナルが、励起され
たドナー化合物からの放出シグナルとは異なり得なければならないことである。
励起されたドナーからの放出シグナルは、例えば、以下の場合にそのように異な
り得る：（１）励起されたアクセプターからの放出シグナルの波長が、励起され
たアクセプターからの放出シグナルの波長と十分に異なっている場合、または（
２）アクセプターが、励起されたアクセプターからの放出シグナルをクエンチす
る場合。
【０３２４】 種々のクラスの化合物が、アクセプターおよびドナーとして機能し得、そして
アクセプターおよびドナーは、同じクラスの化合物に属し得るがその必要はない
。任意の適切なシグナル放出（好ましくは光放出（蛍光性、りん光性または化学
発光性））ポリペプチドモチーフまたは化学部分は、本発明における検出可能な
標識として使用され得る。化学的部分は、当該分野で公知の方法に従ってポリペ
プチドに結合体化され得る。
【０３２５】 以下を含む融合タンパク質の組換え産物は、本発明のアッセイにおいて有用で
ある蛍光性リガンドとして機能するタンパク質の相同性バッチを生成するための
簡単な方法である：（１）目的のミトコンドリア因子に対応するかまたはそれに
由来するポリペプチド配列、および（２）蛍光性ポリペプチド。表２は、蛍光性
ポリペプチドモチーフの適切に重複した（ドナー放出およびアクセプター励起ス
ペクトルについて）対を列挙する。グリーン蛍光タンパク質が上に記載される（
実施例６）。「ＦＬＡＳＨ」（フルオレセイン砒素ヘリックスバインダー）配列
を含む融合タンパク質が、記載されている（Ｇｒｉｆｆｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２８１：２６９〜２７２，１９９８）。
【０３２６】 （表２：ＦＲＥＴベースのアッセイのための、エネルギー移動分子ドナー−ア
クセプター対）
【０３２７】
【表２】 （Ｃ．エネルギー移動を検出するための装置） 種々の装置を、エネルギー移動ドナー化合物であるエネルギー移動分子を誘起
するため、およびエネルギー移動アクセプター化合物であるエネルギー移動分子
からの放出を測定するために、本発明の方法において使用し得る。どの装置が特
定のドナー−アクセプター対について適用可能であるのかは、例えば、以下のよ
うな因子に依存する：（１）ドナー化合物を励起する波長（好ましくは、λＤ（
ｅｘ）であるかまたはそれに近い）のエネルギーをサンプルに適用する必要性；
（２）アクセプター化合物の放出スペクトル（好ましくは、λＡ（ｅｍ）である
かそれに近い）内のエネルギーを測定する必要性；（３）所定のプログラム内で
アッセイされるサンプルの型；ならびに（４）所定のプログラム内でアッセイさ
れるサンプルの数。
【０３２８】 因子（１）および（２）に関して、ドナー化合物を励起するためにサンプルに
適用されるエネルギーのスペクトル、および励起されたアクセプター化合物によ
り放射されそしてサンプルにおいて測定されるエネルギーのスペクトルは、一般
に、どの型の装置が使用されるかを決定する。例えば、λＤ（ｅｍ）は、λＡ（
ｅｍ）と同一であるはずがないが、これら２つの値の間の差異の受容可能な最小
量は、数ある因子の中でも、使用される装置により影響される。すなわち、λＤ
（ｅｍ）がλＡ（ｅｍ）に近づくにつれ、近接した間隔の波長を分解できる装置
が必要であり、そしてλＤ（ｅｍ）とλＡ（ｅｍ）との間の差異が約３〜約５ｎ
ｍ未満であるドナー−アクセプター対を使用するアッセイは、高分解装置を必要
とする。逆に、λＤ（ｅｍ）とλＡ（ｅｍ）との間の差異が約５０〜約７５ｎｍ
を超えるドナー−アクセプター対を使用するアッセイは、中〜低分解の装置を必
要とする。
【０３２９】 特に因子（２）に関して、励起されたアクセプター化合物により放射されそし
てサンプルにおいて測定されるエネルギーの型は、一般に、どの型の装置が使用
されるかを決定する。定義により、蛍光測定器は、蛍光エネルギーを測定するデ
バイスであり、そのためこの装置の一部であるべきである。蛍光測定器は、一回
に２〜３個のサンプルチューブのみしか適応しない比較的単純な手動操作される
装置から、例えば、９６ウェルマイクロプレート（例えば、ｆｍａｘTM蛍光プレ
ートリーダー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｓｕｎｎｙ
ｖａｌｅ、ＣＡ；またはＣｙｔｏｆｌｕｏｒ蛍光プレートリーダー、モデル番号
２３５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）のような
形態でより多数のサンプルに適応するいくらかより複雑な手動操作される装置ま
たはロボット装置、あるいは９６ウェルマイクロプレートのような種々の形態で
多数のサンプルに適応する複雑なロボット装置（例えば、ＦＬＩＰＲTM装置；前
出を参照のこと）までの何でもであり得る。
【０３３０】 因子（３）（所定のプログラムにおいてアッセイされるサンプルの型）は、種
々の形態が、種々の型のサンプルに適切である。例えば、９６ウェルマイクロプ
レートが、目的の細胞もしくは単離されたオルガネラがそのマイクロプレートの
材料に付着するかまたはそのマイクロプレートのウェルに適用されたいくつかの
材料に付着する場合に適切であるが、プラスチック蛍光は、約４００ｎｍより低
い励起波長でより大きなバックグラウンド成分を生じる。非接着細胞もしくはオ
ルガネラまたはそれらから調製された可溶性抽出物を含む測定のために、ガラス
またはポリマー性のチューブまたはチュービングにおける蛍光シグナルを読み取
ることができる装置が、好ましい。どの型の形式が使用されるかに関わらず、ド
ナー化合物およびアクセプター化合物ならびにコントロール試薬および評価され
る化合物を適時に適切な点でサンプルに導入することを可能にすべきである。
【０３３１】 因子（４）（所定のプログラムにおいてアッセイされるサンプルの数）は、そ
の装置がどのように自動化されるかに影響する。例えば、多数のサンプルの高ス
ループット（ＨＴＳ）アッセイが所望される場合、ロボット装置もしくは半ロボ
ット装置が、好ましい。しかし、特に、多くのサンプル数に適応する形態（例え
ば、９６ウェルマイクロプレート）が使用される場合、かなり多数のサンプルを
手動で処理し得る。
【０３３２】 そのアッセイに依存して、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｐｌ
ａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＦＬＩＰＲTM）装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃ
ｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）が、しばしば、本発明のＥＴベースのアッセ
イのための選り抜きの装置である。ＦＬＩＰＲTMシステム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗ
ｗ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｖｉｃｅｓ．ｃｏｍ／ｐａｇｅｓ／ｆｌｉｐｒ．ｈ
ｔｍｌを参照のこと）は、以下の所望の特徴を有する。このシステムは、水冷ア
ルゴンイオンレーザー照明と、画像に曝露され結果としてそのシグナル対ノイズ
特徴が従来の画像化オプティクスよりも一般的に大きい期間にわたってシグナル
を蓄積する積算検出器としての冷却式ＣＣＤカメラとの組み合わせを使用する。
このシステムはまた、細胞単層上のシグナル識別を可能にする特許細胞層分離オ
プティクスを利用し、それにより望ましくない細胞外バックグラウンド蛍光を減
少する。このシステムは、リアルタイムでデータを提供し、そしてまた、動力学
的データ（すなわち、多くの時点での読取り）を提供し得る。このシステムは、
９６ウェルマイクロプレートの９６ウェルすべてを同時に刺激しそして読み取る
能力を有する。このシステムは、分析の間のサンプルの温度および湿度の正確な
制御を提供する。このシステムは、一体型の最新の９６ウェルピペッターを備え
、このピペッターは、実験の間の持ち越しを排除するために使い捨てチップを使
用し、マイクロプレートから正確な体積の流体を吸引、分配および混合するため
に使用され得る。そしてＦＬＩＰＲ384装置の場合、このシステムは、ロボット
様式または半ロボット様式でサンプルアッセイを実行するように適合され得、そ
れにより、最短時間での多数のサンプルの分析（例えば、１日に約１００個の９
６ウェルマイクロプレートまで）を提供する。
【０３３３】 （実施例１８） （ＡＮＴ３：ＣｙｐＤ相互作用のＦＲＥＴベースアッセイ） 実施例１〜１２に記載される試薬およびシステムを、ＣｙｐＤ：ＡＮＴ相互作
用（特に、ｈｕＡＮＴ３：ｈｕＣｙｐＤ）のＦＲＥＴベースアッセイにて使用し
得る。このようなアッセイ（インビトロでもインビボでも実行し得る）を実施す
るための手順が、この実施例に記載される。
【０３３４】 （Ａ．ＣｙｐＤ：ＡＮＴ相互作用のインビボＦＲＥＴベースのアッセイ） 細胞を、互いとのエネルギー移動ドナー：アクセプター対として作用し得る２
つ以上の蛍光（または他の方法で検出可能に標識された）ミトコンドリア融合タ
ンパク質の産生を指令する発現構築物で、（一過性または永続的に）形質転換す
る。あるいは、細胞を、少なくとも１つのエネルギー移動ドナー：アクセプター
対を構成する２つ以上の蛍光（または他の方法で検出可能に標識された）ミトコ
ンドリア融合タンパク質の産生を指令する単一の発現構築物で、形質転換する。
この融合タンパク質の形質転換および適切な局在化を、例えば、ＧＦＰ融合タン
パク質について蛍光顕微鏡および／または蛍光検出によって、確認する。
【０３３５】 ｈｕＡＮＴ３およびｈｕＣｙｐＤの場合、これらのミトコンドリア因子のＧＦ
Ｔ融合タンパク質誘導体を、その相互作用のＦＲＥＴベースのアッセイにおいて
使用する。詳細には、そのドナー分子はｈｕＣｙｐＤ−ＥＣＦＰ（λｅｘ、４３
３ｎｍ、マイナーピーク４５３ｎｍ；λｅｍ、４７５ｎｍ、マイナーピーク５０
１ｎｍ：実施例１１）であり、そしてアクセプター分子はｈｕＡＮＴ３−ＥＹＦ
Ｐ（Ｃ）（λｅｘ、５１３ｎｍ；λｅｍ、５２７ｎｍ）であり、ここでＥＹＦＰ
ポリペプチドは、融合タンパク質のカルボキシ末端側にある（実施例６）。これ
らの融合タンパク質の結合（正の相互作用）を、種々の様式で検出および測定し
得る。第１に、ｈｕＣｙｐＤ−ＥＣＦＰからｈｕＡＮＴ３−ＥＹＦＰ（Ｃ）への
エネルギーの転移を、励起したアクセプター分子からの蛍光の増加として（すな
わち、ｈｕＡＮＴ３−ＥＹＦＰ（Ｃ）についてのピーク放射波長（５２７ｎｍ）
付近の蛍光の増加として）直接検出し得る。第２に、ｈｕＣｙｐＤ−ＥＣＦＰか
らｈｕＡＮＴ３−ＥＹＦＰ（Ｃ）へのエネルギーの転移を、励起したドナー分子
からの蛍光の減少（クエンチング）として（すなわち、ｈｕＣｙｐＤ−ＥＣＦＰ
についてのピーク放射波長（４７５ｎｍ、マイナーピーク５０１ｎｍ）付近の蛍
光の減少により）、間接的に検出し得る。逆に、これらの融合タンパク質の分子
相互作用の阻害および／または反発（負の相互作用）の促進を、直接（すなわち
、ｈｕＡＮＴ３−ＥＹＦＰ（Ｃ）についてのピーク放射波長（５２７ｎｍ）付近
での、ｈｕＣｙｐＤ−ＥＣＦＰからｈｕＡＮＴ３−ＥＹＦＰ（Ｃ）へのエネルギ
ー移動の減少から生じる、蛍光の減少として）検出および測定し得るか、あるい
は間接的に（すなわち、励起したドナー分子からの蛍光の増加として）（すなわ
ち、ｈｕＣｙｐＤ−ＥＣＦＰについてのピーク放射波長（４７５ｎｍ、マイナー
ピーク５０１ｎｍ）付近の蛍光の減少により）検出および測定し得る。
【０３３６】 形質転換した細胞を、候補化合物および候補組成物と接触させる。用語「候補
の化合物および候補組成物」は、有機低分子、ポリペプチド、タンパク質、オリ
ゴヌクレオチド（リボザイムおよび他のアンチセンスオリゴヌクレオチド、遺伝
子治療構築物およびアンチセンス構築物を含む核酸）、ならびに天然の生物学的
供給源由来の抽出物（特定の植物組織もしくは動物組織由来の抽出物を含む）を
含む、化合物を包含することが意図される。検出可能なシグナル（例えば、サン
プルの相互作用から生じる蛍光）を、例えば、経時的に（候補化合物および／ま
たは候補組成物の添加前および後を含む）かまたは適切なインキュベーション期
間の後の単一時点で、測定する。その結果を、ＡＮＴ３とＣｙｐＤとの相互作用
に対する候補化合物および／または候補組成物の効果（正、中性、または負）を
評価するために、試験する。
【０３３７】 細胞を、インビボでのＣｙｐＤ：ＡＮＴ相互作用に影響する能力について試験
する化合物の侵入を容易にするために必要なように可溶化する。当該分野で公知
の方法および／または本開示の方法を使用して、当業者は、変化したミトコンド
リア状態を誘導するために特定の薬剤および／または状態を利用するアッセイの
ために、適切な用量、状態およびサンプル（例えば、細胞全体または透過性細胞
、および適切な細胞型もしくは細胞株）を決定することができる。限定のためで
なく例示として、細胞を、透過性化薬剤（例えば、ジギトニン、ストレプトリジ
ンＯ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ α−毒素（α−溶血素）
、サポニン（すべて、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ、ＭＯ；Ｓｉｇｍａカタログ「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｒｅａｇ
ｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」Ａｎｏｎ．
１９９９およびその中で引用される参考文献を、これら透過性化薬剤について参
照のこと）の添加によってか、あるいは物理的操作（例えば、エレクトロポレー
ション）によって、透過性化し得る。
【０３３８】 関連実施形態において、ミトコンドリアを、エネルギー移動ドナー：アクセプ
ター対として作用し得る２つ以上の蛍光（または他の方法で検出可能に標識され
た）ミトコンドリア融合タンパク質の産生を指令する発現構築物で形質転換され
た細胞から、調製する。候補化合物および候補組成物を、融合タンパク質のＥＲ
ＥＴドナー：アクセプター対を含む単離されたミトコンドリアに直接添加し、そ
してサンプル中の蛍光を、例えば、経時的に（候補化合物および／または候補組
成物の添加前および後を含む）かまたは適切なインキュベーション期間の後の単
一時点で、測定する。
【０３３９】 （Ｂ．ＣｙｐＤ：ＡＮＴ相互作用のインビトロＦＲＥＴベースアッセイ） ＣｙｐＤ：ＡＮＴ相互作用のインビトロＦＲＥＴベースアッセイを、本実施例
および実施例１５に記載される方法に従って実行する。マルチウェルプレートを
、ＡＮＴ−ＥＹＦＰ融合タンパク質またはＣｙｐＤ−ＥＣＦＰ融合タンパク質の
いずれかでコーティングし得、次いで、それぞれ、ＣｙｐＤ−ＥＣＦＰ融合タン
パク質またはＡＮＴ−ＥＹＦＰ融合タンパク質のいずれかと、候補化合物の存在
下もしくは非存在下で接触させ、そして各ウェル中の蛍光シグナル（互いに近接
するＡＮＴ分子とＣｙｐＤ分子の数に直接対応する）を、自動蛍光測定器もしく
は半自動蛍光測定器により読取り得る。
【０３４０】 インビトロアッセイは、ＡＮＴ融合タンパク質およびＣｙｐＤ融合タンパク質
が同じ亜細胞区画に同時局在化する必要がないので、本明細書中に記載されるＡ
ＮＴ−ＥＹＦＰ融合タンパク質のいずれか（すなわち、ＥＹＦＰポリペプチドが
融合タンパク質のカルボキシ末端に位置する、ＡＮＴ−ＥＹＦＰ、またはＥＹＦ
Ｐポリペプチドがアミノ末端に位置する、ＥＹＦＰ−ＡＮＴのいずれか）を、こ
のようなアッセイにおいて使用し得る。
【０３４１】 （実施例１９：亜ミトコンドリア粒子を用いたＣＹＰＤ−ＡＮＴ結合相互作用
のアッセイ） この実施例では、ヒト組換えＡＮＴ３発現細胞由来のミトコンドリアから調製
された亜ミトコンドリア粒子（ＳＭＰ）とのＣｙｐＤの結合についてのアッセイ
のための組成物および方法について記載する。上記実施例３に記載されるＨｉｓ
タグ化ヒト組換えＡＮＴ３を発現するトランスフェクトしたＴ．ｎｉ昆虫細胞を
ＳＭＰの供給源とした。
【０３４２】 ＳＭＰの調製は、Ｈａｌｅｓｔｒａｐら（１９９８ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３６６：７９−９４）の改変に従い、すべての工程を４
℃で実施した。出発物質は、１×１０9個のＴ．ｎｉ細胞に対応する１リットル
の細胞培養物であった。細胞を遠心分離してペレットにし、そして−２０℃で凍
結保存した。ミトコンドリアの単離のために、この細胞ペレットを、１５ｍｌの
ミトコンドリア単離緩衝液（ＭＩＢ、他に示されない限り、すべての試薬はＳｉ
ｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから購入した：０．２２Ｍ マンニトール、７
０ｍＭ スクロース、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍ
Ｍ ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、ｐＨ７．２、および標準プロテア
ーゼインヒビター混液（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ））中で融解および懸濁した。この懸
濁液を、ドライアイス／エタノール槽中で容器をシェル−凍結（ｓｈｅｌｌ−ｆ
ｒｅｅｓｅｉｎｇ）することによって、２回の凍結融解サイクルに供し、次いで
この懸濁液を室温で解凍し、次いで２０ｍｌのＭＩＢで希釈した。次に、Ｐｏｔ
ｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザー（ｒｈｅｏｓｔａｔ ｓｅｔｔｉｎｇ
２８）における１０回のストロークでこの懸濁液をホモジナイズした。生じた
ホモジネートをさらにＭＩＢで希釈して、約２００ｍｌの容量にし、そして６０
０×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。上清液を回収し、そしてペレットを２０
ｍｌのＭＩＢに懸濁して上記のようにホモジナイズし、ＭＩＢで希釈して最終容
量１００ｍｌにし、再度６００×ｇで１０分間遠心分離した。上清をプールし、
そして遠心分離後の上清液が清澄になるまで、ペレットをさらに３回、上記のよ
うにホモジナイズした。プールした上清液を、再度６００×ｇで１０分間遠心分
離し、混入している核を除去した。ここで核は、遠心分離後に白色の外見を有す
るペレット形態で堆積した。核除去後の上清を、次いで１２，０００×ｇで１５
分間遠心分離し、桃色のミトコンドリアペレットを回収した。このペレットを、
プロテアーゼインヒビターを補充した８ｍｌのＭＩＢに再懸濁した。タンパク質
の濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、
Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて、製造者の説明書に従って測定した。
【０３４３】 単離されたＴ．ｎｉミトコンドリアからのＳＭＰの調製を、改変されたＮｉｃ
ｏｌｌｉらの方法（１９９６ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１（４）：２１８
５−９２）により実施した。簡単にいうと、氷／水槽中に固定した２５ｍｌガラ
スビーカー中で、ミトコンドリアをＭｉｔｏ Ｂ緩衝液（０．２５Ｍ スクロー
ス、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ−Ｔｒ
ｉｓ）に、（タンパク質濃度に基づいて）３０ｍｇ／ｍｌで懸濁し、Ｓｏｎｏｆ
ｉｅｒTMモデル４５０プローブチップソニケーター（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｕｌｔｒ
ａｓｏｎｉｃｓ、Ｉｎｃ．Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ）を用いてアルゴン気流下で超
音波破砕した（サイクルを６０％およびパワーセッティング（Ｂｒｉｎｋｍａｎ
ｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｗｅｓｔｂｕｒｙ ＮＹ）を２０に設定し、３回
の超音波破砕を、それぞれ連続３分間ずつ行った）。次いで、破砕されなかった
ミトコンドリアを、８，０００×ｇで１０分間遠心分離により除去し、その後上
清を、１００，０００×ｇで６０分間高速遠心分離し、ＳＭＰをペレットにした
。上清をデカンテーションし、ＳＭＰペレットをＭｉｔｏ Ｂ緩衝液でリンスし
、次いで同じ緩衝液に再懸濁した。
【０３４４】 ＳＭＰ中に存在するＡＮＴとのシクロフィリンの結合を、可溶性組換えＧＳＴ
−シクロフィリンＤ（上記の実施例１０を参照のこと）を用いて決定した。ＧＳ
Ｔ−ＣｙｐＤ調製物のロータマーゼ（ペプチジルプロリルシス−トランスイソメ
ラーゼ）活性を、Ｋｏｆｒｏｎらの「ソルベントジャンプ」法（１９９１ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：６１２７−６１３４）に従い決定した。簡単にい
うと、Ａｌａ−Ａｌａ−cis/trans−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮａをロータマーゼ基
質として用い、α−キモトリプシンによるすべてのトランス−Ｐｒｏ含有ペプチ
ドの切断と組み合わせて、ｐ−ニトロアニリドを産生し、これを３９０ｎｍでの
吸光度により検出した。図１２（左パネル）に示されるように、添加したＧＳＴ
−ＣｙｐＤの非存在下で実施した基質ペプチドの非酵素的なシスからトランスへ
の異性化を決定する目的の試験反応と比較して、ＧＳＴ−ＣｙｐＤは、直ちにに
ロータマーゼ活性の存在を示した。シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、投薬用量に
依存する様式で（図１２右パネル）ＣｙｐＤのロータマーゼ活性を阻害した（図
１２）。これより、組換えＧＳＴ−ＣｙｐＤ融合タンパク質の活性をさらに確認
した。同じ方法論を用いて、ポリＨｉｓタグ化組換えＣｙｐＤ融合タンパク質（
上記のようにニッケルカラムでアフィニティー精製されたＨｉｓ−ＣｙｐＤ、高
速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣTM、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉ
ｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）により精製されたＨｉｓ−ＣｙｐＤ、およびエンテロ
キナーゼ切断後の、ポリＨｉｓ融合タグから遊離したＣｙｐＤ（Ｅｋ−ＣｙｐＤ
）を含む；これらのデータを図１３に示す）についてもまた、ロータマーゼ活性
を実証した（図９を参照のこと）。
【０３４５】 Ｔ．ｎｉ細胞から調製されたＳＭＰとのシクロフィリンの結合をアッセイする
ために、最終容量１ｍｌの結合緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ；２０ｍＭ イミダ
ゾール；１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）；１０ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4；１ｍＭ ＥＤＴＡ）に１ｍｇ ＳＭＰおよび２．６μＭ ＧＳＴ−シクロフィリンＤ（
実施例１０）を含む結合反応をポリカーボネート遠心チューブに準備した。特定
の反応のために、１０μＭ シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）もまた存在させた。こ
の反応成分の安定性を評価するために、ＧＳＴ−ＣｙｐＤおよびＳＭＰを、（ｉ
）ＳＭＰの調製後に直ちに結合させる（図１１、０時間）か、または（ｉｉ）４
℃で３〜６時間静置した後に結合アッセイを開始させる（図１１、３時間および
６時間）かの、いずれかを行った。結合反応混合液を、室温で２０分間インキュ
ベートし、１５℃に予備冷却された遠心分離ローターに設置し、次いで１００，
０００×ｇで６０分間遠心分離してＳＭＰをペレットにした。ペレットをＳＤＳ
−ＰＡＧＥサンプルバッファー中で、３７℃で一晩溶解し、溶解したペレットの
アリコートおよび上清のアリコートに対して、上記のようにタンパク質決定を行
った。等価濃度のリガンド（ＧＳＴ−ＣｙｐＤ）に対応するペレットサンプルお
よび上清サンプルをＳＤＳポリアクリルアミド上で電気泳動し、そして標準的手
順に従ってブロットをニトロセルロースに転写した。ペレットに存在するＳＭＰ
に結合したＣｙｐＤおよび上清に存在する結合していない（遊離の）ＣｙｐＤを
、上記のようなウエスタンブロット分析により決定した。ただし、Ｂｅｒｇｓｍ
ａら（１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２３２０４）の方法に従う
ＣｙｐＤペプチドによる免疫化により生成した、ＣｙｐＤ特異的抗体を含有する
ウサギ抗血清を一次抗体の供給源として用いた。図１１は、このウエスタンブロ
ット分析の結果を示す。ここで、ＳＭＰを添加しなかったコントロールサンプル
のペレット（ｐ）フラクションからＣｙｐＤは検出されなかったが、このコント
ロールサンプルの上清（ｓ）フラクションからＣｙｐＤは容易に検出された。Ｇ
ＳＴ−ＣｙｐＤ調製後直ちにＳＭＰを加えた場合（０時間）、または３〜６時間
後に加えた場合（３時間、６時間）、ＧＳＴ−ＣｙｐＤは、ＣｓＡにより阻害さ
れる様式で、ＳＭＰペレットフラクションから容易に検出可能であった。
【０３４６】 （実施例２０：プロテオリポソームを用いたＣｙｐＤ−ＡＮＴ結合相互作用の
アッセイ） この実施例では、バクテリオロドプシン（ＢＲ）および／またはＨｉｓタグ化
組換えヒトＡＮＴ３を発現するＴ．ｎｉ細胞由来の組換えヒトＡＮＴ３ミトコン
ドリアを用いて再構成された脂質から調製したプロテオリポソーム（ＰＬＳ）へ
のＣｙｐＤの結合をアッセイするための、組成物および方法について記載する（
上記実施例３および１５を参照のこと）。再構成されたリポソーム中のＢＲの封
入は、プロテオリポソームの単離を容易にする密度および可視的な色の供給源を
提供し、そしてタンパク質−タンパク質の結合に対する非特異的コントロールも
また提供した。
【０３４７】 精製されたＡＮＴのリポソームへの再構成を、吸着ビーズを用いて素早く界面
活性剤を除去する方法（Ｋｒａｍｅｒら、１９８６、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ、８６３、２８６−２８９）、および非イオン性界面活性剤を
用いた比較的大きい単層リポソーム形成のための方法（Ｕｅｎｏら、１９８４
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３、３０７０−３０７６）に基づいて実施した。
ここで、これらの方法は、プロテオリポソーム形成プロセスを加速するために、
そしてビーズへの吸着による脂質の損失を最小化するために改変した。生成した
リポソームを、凍結／解凍／超音波処理の手順により調製した。簡単にいうと、
卵黄レクチン（２４０ｍｇ）を、３ｍｌの再構成緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、
１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））で懸濁した。この懸濁液を、アルゴン気
流をパルスして酸素を除去し、容器をドライアイス／エタノール槽に接触させる
ことにより部分的に凍結させ、そして（超音波処理時間が１分間であることを除
いて）上記のＳＭＰについての記載のように超音波破砕した。脂質懸濁液の清澄
度が達成されるまで、この解凍／超音波処理工程を、少なくとも３〜４回繰り返
した。
【０３４８】 Ｓｍａｌｌ ＥｃｏｎｏＣｏｌｕｍｎｓTM（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ
、ＣＡ）を、１．７ｍｇのＳＭ−２ ＢｉｏＢｅａｄｓTM（ＢｉｏＲａｄ）で満
たし、メタノールで洗浄し、その後に水で洗浄し、そして再構成緩衝液で平衡化
した。アフィニティー精製されたＨｉｓタグ化組換えヒトＡＮＴ３を含む溶出緩
衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１．３
％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００TM、０．５ｍｌ）を、２００μｌの生成したリポソ
ームと混合し、次いで、ＡＴＰ（５０ｍＭ）またはメチルウンベリフェロンホス
フェート（ＭＵＰ、５ｍＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅ
ｕｇｅｎｅ、ＯＲ）のいずれかを加えた。２００μｌのリポソーム懸濁液に、０
．５ｍｌの溶出緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｈ
ｅｐｅｓ、１．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００TM）を加えることにより、コント
ロール（タンパク質フリー）リポソームを並行して調製した。それぞれの混合液
をボルテックスし、ＢｉｏＢｅａｄｓTM ＳＭ−２カラムに供し、そして５〜６
回カラムを通した。プロテオリポソームの形成は、溶液の外見上の濁度により可
視化された。捕捉されなかったＭＵＰまたはＡＴＰを、遠心分離によるプロテオ
リポソームのペレット化工程の間か、またはＳｅｐｈａｄｅｘTM Ｇ−５０（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）カラムでプロテオリポソーム
懸濁液を濾過することによるかのいずれかで除去した。
【０３４９】 バクテリオロドプシン（ＢＲ）を、次のようにＡＮＴリポソーム中に同時再構
成させた。バクテリオロドプシン（５ｍｇ、Ｓｉｇｍａ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍ
Ｏ）を、２００μｌの溶出緩衝液（１．３％のＴｒｉｔｏｎを含有する）中で、
ローター上での６時間のプレインキュベーションによりモノマー化した。上記の
ようにＡＴＰまたはＭＵＰの添加の前ではなく、ＡＮＴを脂質に加えた後に、モ
ノマータンパク質をこのＡＮＴ−脂質混合液に加えた。
【０３５０】 リポソームおよびプロテオリポソームの完全性を、供給者の説明書に従って、
封入されたＭＵＰ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の保持率を決定するこ
とにより評価した。簡単にいうと、アルカリホスファターゼに曝した一定量のリ
ポソームおよびプロテオリポソーム中のメチルウンベリフェリルアニオン（ＭＵ
Ｐのアルカリホスファターゼ切断産物）の蛍光検出をモニターした。リポソーム
およびプロテオリポソームの完全性を、ＮＡＤＰＨの蛍光定量的な検出に関して
記載されるのと同様に（Ｓｔｒｅｉｃｈｅｒ−Ｓｃｏｔｔら、１９９３、Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１０、６９−７６）ヘキソキナーゼおよびグルコース−
６−ホスフェートデハイドロゲナーゼを組み合わせた系を用いて、捕捉されたＡ
ＴＰの流出として検出可能なリポソームの透過性を決定することによっても評価
した。これらの手順を用いて、捕捉された指標のリポソームまたはプロテオリポ
ソームからの喪失は、検出されなかった。
【０３５１】 ＧＳＴ−ＣｙｐＤのリポソームまたはプロテオリポソームとの結合を検出する
ためのアッセイを、ＳＭＰをリポソーム（ＬＳ）またはプロテオリポソーム（Ｐ
ＬＳ）で置換し、次のさらなる改変を加えることを除き、本質的には上記の図１
９のように実施した：この結合アッセイのための反応緩衝液は、５ｍＭ Ｋ2Ｈ
ＰＯ4、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）であり、それぞれの結合反応には
、上記のように調製された２００μｌのＬＳまたはＰＬＳ懸濁液を含み、そして
ＬＳおよびＰＬＳのペレット化には１４０，０００×ｇでの遠心分離を必要とし
た。
【０３５２】 図１４は、ウエスタンブロット分析を示す。ここでは、ヒトＡＮＴ３およびバ
クテリオロドプシンの両方を用いて再構成さしたＰＬＳへのＧＳＴ−ＣｙｐＤの
結合が、容易に目視され得る。図１４の上パネルは、前述の実施例のように抗ヒ
トＣｙｐＤ抗体を用いて実施したウエスタンブロットを示す。ここで、ＰＬＳが
加えられなかった場合、ＣｙｐＤは、上清に残存した（最も左のレーン）が、Ｐ
ＬＳが加えられた場合、ＡＮＴ／ＢＲ ＰＬＳペレットに明らかなＣｙｐＤシグ
ナルが表れ、対応する上清フラクションには検出可能なシグナルが存在しなかっ
た。図１４にまた示されるように、ＣｓＡの存在下でＣｙｐＤの分布が変化した
。ここで、容易に検出可能なシグナルは、上清に残存したままだった。図１４の
下パネルは、上記のようにｈｕＡＮＴ３構築物中へと操作されたＥＸＰＲＥＳＳ TM エピトープタグに対して特異的なモノクローナル抗体を用いて実施した、同様
のウエスタンブロットを示す。ＣｙｐＤ−ＡＮＴ３結合相互作用に対するＣｓＡ
阻害の特異性をさらに特徴付けるために、結合アッセイを実施し、ＢＲのみでか
またはＢＲおよびＡＮＴの両方で再構成したＰＬＳへのＣｙｐＤの結合と比較し
た。図１５に示されるように、ＡＮＴ／ＢＲ ＰＬＳへのＧＳＴ−ＣｙｐＤの結
合は、容易に検出可能であり、そしてＣｓＡにより阻害された。ＣｓＡは、ＡＮ
Ｔ／ＢＲ ＰＬＳペレットにおいて検出可能なＣｙｐＤの明らかな減少をもたら
すが（図１５右から４つのレーン）、ＢＲ ＰＬＳペレットからそのような減少
は見られなかった（図１５左から４番目のレーン）。
【０３５３】 上記のＡＮＴ／ＣｙｐＤ結合アッセイの代替法として、結合相互作用を同定す
るためにＰＬＳを遠心分離することを特徴とする「回転透析（ｓｐｉｎ ｄｉａ
ｌｙｓｉｓ）」方法もまた開発した。このアッセイは、タンパク質フリーのリポ
ソーム（ＬＳ）ならびにＰＬＳとの結合相互作用の決定を可能にする。なぜなら
、上記のように、超遠心分離によりＰＬＳの回収を容易にした、タンパク質を用
いる再構成による、ＰＬＳに付与される余分な密度を必要としないからである。
ＣｙｐＤ−ＡＮＴ結合を決定するためのこの回転透析アッセイ方法は、以下のよ
うに実施された。
【０３５４】 上記のように調製されたそれぞれのリポソーム調製物（例えばＬＳ、ＢＲ Ｐ
ＬＳ、ＡＮＴ／ＢＲ、ＰＬＳ）のアリコート（１００μｌ）を、１０μｇのＧＳ
Ｔ−ＣｙｐＤと混合し、そして４００μｌの標準緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、
１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）で希釈した。コントロール（リポソームフ
レー）サンプルは、５００μｌの緩衝液および１０μｇのＧＳＴ−ＣｙｐＤを含
有した。全てのサンプルを室温で２０分間、ローター上でインキュベートし、次
いで、それぞれ、１００ｋＤａ分子量カットオフフィルター付きのＡｍｉｃｏｎ
（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）マイクロンセントレーター（ｍｉｃｒｏｎｃｅｎｔｒ
ａｔｏｒ）チューブに移した。製造者に提供された説明書に従い、このチューブ
を、４℃で（バケットローターを用いて）遠心分離した。遠心時間は、滞留容量
が、各チューブで約４０μｌになるように調製し、サンプル間で変化させた。コ
ントロールサンプルを、手短に遠心分離し（４分間）、タンパク質フリーリポソ
ーム、ＢＲリポソーム、およびＡＮＴ／ＢＲリポソームを含むサンプルを、それ
ぞれ、５５分間、６５分間、７５分間遠心分離した。フロースルーの溶液（遊離
ＣｙｐＤリガンドを含有する）および濃縮されたリポソーム（例えば、結合リガ
ンドを有する）を含む滞留物の両方、または緩衝液のみ（コントロール）を、上
記の抗ＣｙｐＤ抗体を用いたウエスタンブロット分析によって、ＣｙｐＤの内容
物について試験した。濃縮フィルターへの吸着によってＣｙｐＤがサンプルから
損失している可能性を排除するために、このフィルターを９０μｌの希釈された
ＳＤＳサンプル緩衝液で洗浄し、この洗浄液を、ウエスタンブロットによりＣｙ
ｐＤについて分析した。この洗浄液からは、ＣｙｐＤが検出されなかった。この
ことは、このフィルターへのＣｙｐＤの結合が明らかに存在しないことを示す。
【０３５５】 前述のことから、本発明の特定の実施形態は、例示の目的で本明細書中に記載
されているが、本発明の意図および範囲から外れることなく、種々の改変が成さ
れ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲による以外
は限定されない。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ヒトＡＮＴ１（「ＡＮＴ１ｍ」）、ヒトＡＮＴ２（「ＡＮＴ２ｍ」）
、およびヒトＡＮＴ３（「ＡＮＴ３ｍ」）のコード領域のヌクレオチド配列を示
す。
【図２】 図２は、ヒトＡＮＴ１（「ＡＮＴ１ｐ」）、ヒトＡＮＴ２（「ＡＮＴ２ｐ」）
、およびヒトＡＮＴ３（「ＡＮＴ３ｐ」）のポリペプチド配列を示す。
【図３】 図３は、ウエスタン分析によって決定される、Ｅ．ｃｏｌｉ中のＨｉｓタグ化
ＸＰＲＥＳＳTMエピトープ含有ｈｕＡＮＴ３タンパク質の誘導を示す。
【図４】 図４は、ウエスタン分析によって決定される、Ｅ．ｃｏｌｉ中のＨｉｓタグ化
ＸＰＲＥＳＳTMエピトープ含有ｈｕＡＮＴ３タンパク質の局在を示す。
【図５】 図５は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系におけるヒトＡＮＴ３（ｈｕＡＮＴ３）の発現を
示す。
【図６】 図６は、バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞におけるｈｕＡＮＴ３の発現を示す
。
【図７】 図７は、ヒトシクロフィリンＡ（ｈｕＣｙｐＡ）のヌクレオチド配列（配列番
号２６）およびアミノ酸配列（配列番号２７）を示す。
【図８】 図８は、ヒトシクロフィリンＤ（ｈｕＣｙｐＤ）のヌクレオチド配列（配列番
号３９）およびアミノ酸配列（配列番号４０）を示す。
【図９】 図９は、ヒトＡＮＴ３とヒトＣｙｐＤとの間の相互作用を測定するアッセイの
結果を示す。
【図１０】 図１０は、酵母発現系において検出されるｈｕＡＮＴ３転写物のノーザンブロ
ット分析を示す。レーン内容：レーン「Ｍ」、分子量マーカー（１．４、２．４
、４．４、７．５および９．５キロベースのマーカーの位置が示される）；レー
ン１〜３、擬形質転換ＡＡＣ-酵母の３つの独立単離物由来の１０μｇのＲＮＡ
；レーン４〜６、ｐＭＫ５Ｃ（ｐＹＰＧＥ２−ｈｕＡＮＴ３）で形質転換された
ＡＡＣ-酵母の３つの独立単離物由来の１０μｇのＲＮＡ；レーン７〜９、ｐＭ
Ｋ５Ｂ（ｐＹＥＳＴｒｐ２−ｈｕＡＮＴ３）で形質転換されたＡＡＣ-酵母の３
つの独立単離物由来の１０μｇのＲＮＡ；レーン１０および１１、ヒト脾臓のサ
ンプルから調製される０．２μｇ（レーン１０）および０．８μｇ（レーン１１
）のＲＮＡ。
【図１１】 図１１は、検出のために抗ＣｙｐＤ抗体を使用して、ｈｕＡＮＴ３含有Ｔ．ｎ
ｉ細胞亜ミトコンドリア粒子に結合するＧＳＴ−ＣｙｐＤの安定性のウエスタン
免疫ブロット分析を示す。ＣｓＡ、シクロスポリンＡ；ｓ、上清；ｐ、ペレット
。
【図１２】 図１２は、ＧＳＴ−ＣｙｐＤ融合タンパク質のロータマーゼ活性を示す。
【図１３】 図１３は、ＧＳＴ−ＣｙｐおよびＨｉｓ−ＣｙｐＤ融合タンパク質、およびま
たはＣｙｐＤ融合タンパク質のエンテロキナーゼ（Ｅｋ）切断に続いて回収され
る組換えＣｙｐＤのロータマーゼ活性を示す。
【図１４】 図１４は、ｈｕＡＮＴ３およびバクテリオロドプシンで再構築されるプロテオ
リポソームに結合するＧＳＴ−ＣｙｐＤのウエスタン免疫ブロット分析を示す。
【図１５】 図１５は、バクテリオロドプシン（ＢＲ ＰＬＳ）またはｈｕＡＮＴ３および
バクテリオロドプシン（ＡＮＴ／ＢＲ）で再構成されるプロテオリポソームに結
合するＧＳＴ−ＣｙｐＤのウエスタン免疫ブロット分析を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ４Ｈ０４５ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｍ 33/53 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ウィリー， サンドラ イー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 92122， サン ディエゴ， ギャロウェイ ドラ イブ 3195 (72)発明者 アンドレイェフ， アレクサンドル ワ イ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 92128， サン ディエゴ， カミニト ピネロ 179， アパートメント 163 (72)発明者 フライゲリ， ルチアーノ ジー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 92122， サン ディエゴ， ハッギンズ ウェイ 4669 (72)発明者 ベリセレビ， ゴヌル アメリカ合衆国 カリフォルニア 92130， サン ディエゴ， タランテラ レーン 4688 (72)発明者 デイビス， ロバート イー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 92130， サン ディエゴ， グレンクリフ ウェ イ 13272 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA11 BB50 DA12 DA13 DA14 DA36 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 DA03 DA06 DA12 FA15 HA17 4B063 QA18 QQ08 QQ79 QR48 QR74 QR82 QX02 4B064 AG01 BH09 CA19 CC24 CE02 CE09 CE12 DA01 4B065 AA93Y AB01 CA24 CA44 4H045 AA10 AA20 BA10 BA41 BA60 CA45 EA20 FA74

Claims (48)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 シクロフィリンポリペプチドへのアデニンヌクレオチドトラ
    ンスロケーターポリペプチドの結合を変更する薬剤を同定する方法であって、以
    下： （ａ）候補薬剤の非存在下および存在下で、シクロフィリンポリペプチドまた
    はその改変体を含む第１の単離された組換えポリペプチド（ｉ）に、組換えヒト
    アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドまたはその改変体を含む
    第２の単離された組換えポリペプチドを含むサンプル（ｉｉ）を接触させる工程
    であって、該工程は、該シクロフィリンポリペプチド、該アデニンヌクレオチド
    トランスロケーターポリペプチドおよび該候補薬剤が相互作用するのを可能にす
    るのに十分な条件下かつ時間で行われる、工程；および （ｂ）該候補薬剤の非存在下での該第２の単離された組換えポリペプチドへの
    該第１の単離された組換えポリペプチドの結合のレベルを、該候補薬剤の存在下
    での該第２の単離された組換えポリペプチドへの該第１の単離された組換えポリ
    ペプチドの結合のレベルと比較する工程であって、ここで、該薬剤の存在下での
    結合のレベルの減少は、該薬剤が、シクロフィリンポリペプチドへのアデニンヌ
    クレオチドトランスロケーターポリペプチドの結合を阻害することを示し、そし
    て、該薬剤の存在下での結合のレベルの増加は、該薬剤が、シクロフィリンポリ
    ペプチドへのアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドの結合を増
    強することを示し、そしてそれから、シクロフィリンポリペプチドへのアデニン
    ヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドの結合を変更する薬剤を同定する
    、工程 を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 前記第１および第２の単離された組換えポリペプチドの少な
    くとも一方が、融合ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記第１の単離された組換えポリペプチドが、さらなるポリ
    ペプチドに融合されているヒトシクロフィリンＤポリペプチドを含み、ここで、
    該さらなるポリペプチドは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ以外である
    、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記シクロフィリンポリペプチドが、ヒトシクロフィリンＡ
    、ヒトシクロフィリンＢ、ヒトシクロフィリンＣおよびヒトＣｙｐ−６０からな
    る群より選択される、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記第１の単離さ
    れた組換えポリペプチドが、さらなるポリペプチドに融合されているシクロフィ
    リンポリペプチドを含み、該さらなるポリペプチドは、ポリヒスチジン、ポリリ
    ジン、赤血球凝集素エピトープタグ、ＸＰＲＥＳＳTMエピトープタグ、ＦＬＡＧ
    （登録商標）エピトープタグ、Ｍｙｃエピトープポリペプチド、ＦＬＡＳＨペプ
    チド、免疫グロブリン定常領域ポリペプチド、ストレプトアビジン、グリーン蛍
    光タンパク質ポリペプチド、エクオリンポリペプチド、グルタチオン−Ｓ−トラ
    ンスフェラーゼポリペプチドおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕ
    ｓプロテインＡポリペプチドからなる群より選択される、方法。
  6. 【請求項６】 前記第１の単離された組換えポリペプチドが、連結されたレ
    ポーター基で検出可能に標識されている、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記第１の単離された組換えポリペプチドが、さらなるポリ
    ペプチドに融合されているシクロフィリンポリペプチドを含み、該さらなるポリ
    ペプチドが、ポリリジンであり、かつ前記第２の単離された組換えポリペプチド
    が、ＸＰＲＥＳＳTMエピトープタグに融合されている組換えヒトアデニンヌクレ
    オチドトランスロケーターポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記第１の単離された組換えポリペプチドが、連結されたレ
    ポーター基で検出可能に標識されている、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記連結されたレポーター基が、放射性レポーター基、色素
    、酵素、リガンド、レセプター、プロテアーゼ認識配列、発光レポーター基およ
    び蛍光レポーター基からなる群より選択される、請求項６または８のいずれか１
    項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記第２の単離された組換えポリペプチドを含む前記サン
    プルが、少なくとも１つの単離されたミトコンドリアを含む、請求項１に記載の
    方法。
  11. 【請求項１１】 前記第２の単離された組換えポリペプチドを含む前記サン
    プルが、少なくとも１つの亜ミトコンドリア粒子を含む、請求項１に記載の方法
    。
  12. 【請求項１２】 前記第２の単離された組換えポリペプチドを含む前記サン
    プルが、固体支持体に固定されている、請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記第２の単離
    された組換えポリペプチドが、さらなるポリペプチドに融合されているヒトアデ
    ニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドまたはその改変体を含み、該
    さらなるポリペプチドは、ポリヒスチジン、ポリリジン、赤血球凝集素エピトー
    プタグ、ＸＰＲＥＳＳTMエピトープタグ、ＦＬＡＧ（登録商標）エピトープタグ
    、Ｍｙｃエピトープポリペプチド、ＦＬＡＳＨペプチド、免疫グロブリン定常領
    域ポリペプチド、ストレプトアビジン、グリーン蛍光タンパク質ポリペプチド、
    エクオリンポリペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼポリペプチド
    およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓプロテインＡポリペプチド
    からなる群より選択される、方法。
  14. 【請求項１４】 結合レベルを比較する前記工程が、前記第１の単離された
    組換えポリペプチドおよび前記第２の単離された組換えポリペプチドからなる群
    より選択される前記ポリペプチドの少なくとも一方に特異的に結合する検出試薬
    を検出することを包含する、請求項１に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記検出試薬が、抗体である、請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法であって、ここで、前記第２の単
    離された組換えポリペプチドが、ＸＰＲＥＳＳTMエピトープタグおよびＦＬＡＧ
    （登録商標）エピトープタグからなる群より選択されるポリペプチドに融合され
    ている、ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターまたはその改変体を含み
    、かつ前記抗体が、該ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチ
    ド、該ＸＰＲＥＳＳTMエピトープタグおよび該ＦＬＡＧ（登録商標）エピトープ
    タグからなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドに特異的に結合す
    る、方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１に記載の方法であって、前記第１の単離された組
    換えポリペプチドが、ヒトシクロフィリンＤを含み、そして前記第２の単離され
    た組換えポリペプチドを含む前記サンプルが、ＸＰＲＥＳＳTMエピトープタグに
    融合されている組換えヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーター−３ポリペ
    プチドを発現するＴ．ｎｉ細胞から単離された、少なくとも１つの亜ミトコンド
    リア粒子を含む、方法。
  18. 【請求項１８】 核酸発現構築物であって、該構築物は、さらなるポリペプ
    チドまたはその改変体に融合されているミトコンドリア透過性変化細孔成分ポリ
    ペプチドまたはその改変体をコードするポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレ
    オチドに、発現制御配列が作動可能に連結されており、ここで、該ミトコンドリ
    ア透過性変化細孔成分は、ヒトＡＮＴ１、ヒトＡＮＴ２およびヒトＡＮＴ３から
    なる群より選択されるアデニンヌクレオチドトランスロケーターであり、そして
    該発現制御配列は、調節されるプロモーターおよび外因的に調節されるプロモー
    ターからなる群より選択される、核酸発現構築物。
  19. 【請求項１９】 前記外因的に調節されるプロモーターが、厳密に調節され
    るプロモーターである、請求項１８に記載の発現構築物。
  20. 【請求項２０】 前記融合されているさらなるポリペプチドが、ポリヒスチ
    ジン、ポリリジン、赤血球凝集素エピトープタグ、ＦＬＡＧ（登録商標）エピト
    ープタグおよびＸＰＲＥＳＳTMエピトープタグからなる群より選択される、請求
    項１８に記載の発現構築物。
  21. 【請求項２１】 前記融合されているさらなるポリペプチドが、Ｍｙｃポリ
    ペプチド、ＦＬＡＳＨペプチド、免疫グロブリン定常領域ポリペプチド、ストレ
    プトアビジン、グリーン蛍光タンパク質ポリペプチド、エクオリンポリペプチド
    、ストレプトアビジン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼポリペプチドお
    よびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓプロテインＡポリペプチドか
    らなる群より選択される、請求項１８に記載の発現構築物。
  22. 【請求項２２】 核酸発現構築物であって、該構築物は、さらなるポリペプ
    チドまたはその改変体に融合されているシクロフィリンポリペプチドまたはその
    改変体をコードするポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドに、発現制御
    配列が作動可能に連結されており、ここで、該シクロフィリンが、シクロフィリ
    ンＤであり、そして該さらなるポリペプチドが、グルタチオン−Ｓ−トランスフ
    ェラーゼ以外である、核酸発現構築物。
  23. 【請求項２３】 前記融合されているさらなるポリペプチドが、ポリヒスチ
    ジン、ポリリジン、赤血球凝集素エピトープタグ、ＦＬＡＧ（登録商標）エピト
    ープタグおよびＸＰＲＥＳＳTMエピトープタグからなる群より選択される、請求
    項２２に記載の発現構築物。
  24. 【請求項２４】 前記融合されているさらなるポリペプチドが、Ｍｙｃポリ
    ペプチド、ＦＬＡＳＨペプチド、免疫グロブリン定常領域ポリペプチド、グリー
    ン蛍光タンパク質ポリペプチド、エクオリンポリペプチド、ストレプトアビジン
    およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓプロテインＡポリペプチド
    からなる群より選択される、請求項２２に記載の発現構築物。
  25. 【請求項２５】 核酸発現構築物であって、該構築物は、さらなるポリペプ
    チドまたはその改変体に融合されているシクロフィリンポリペプチドまたはその
    改変体をコードするポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドに、発現制御
    配列が作動可能に連結されており、ここで、該シクロフィリンポリペプチドが、
    ヒトシクロフィリンＡ、シクロフィリンＢ、ヒトシクロフィリンＣおよびヒトＣ
    ｙｐ−６０からなる群より選択される、核酸発現構築物。
  26. 【請求項２６】 前記融合されているさらなるポリペプチドが、ポリヒスチ
    ジン、ポリリジン、赤血球凝集素エピトープタグ、ＸＰＲＥＳＳTMエピトープタ
    グ、ＦＬＡＧ（登録商標）エピトープタグ、Ｍｙｃエピトープポリペプチド、Ｆ
    ＬＡＳＨペプチド、免疫グロブリン定常領域ポリペプチド、ストレプトアビジン
    、グリーン蛍光タンパク質ポリペプチド、エクオリンポリペプチド、グルタチオ
    ン−Ｓ−トランスフェラーゼポリペプチドおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
    ａｕｒｅｕｓプロテインＡポリペプチドからなる群より選択される、請求項２
    ５に記載の発現構築物。
  27. 【請求項２７】 請求項１８、２１または２５のいずれか１項に記載の発現
    構築物であって、該構築物は、プラスミド、コスミド、シャトルベクター、ウイ
    ルスベクター、および染色体複製起点を含むベクターからなる群より選択される
    ベクターを含む、構築物。
  28. 【請求項２８】 前記ベクターが、ｐＢＡＤ−Ｈｉｓ、ｐＥＹＦＰ−Ｃ１お
    よびｐＥＣＦＰ−Ｎ１からなる群より選択される、請求項２７に記載の発現構築
    物。
  29. 【請求項２９】 単離されたポリペプチドであって、該単離されたポリペプ
    チドは、ミトコンドリア透過性変化細孔成分ポリペプチドまたはその改変体を含
    み、該ミトコンドリア透過性変化細孔成分ポリペプチドまたはその改変体は、さ
    らなるポリペプチドまたはその誘導体に融合されており、ここで、該ミトコンド
    リア透過性変化コア成分は、ヒトＡＮＴ１、ヒトＡＮＴ２およびヒトＡＮＴ３か
    らなる群より選択される、アデニンヌクレオチドトランスロケーターである、単
    離されたポリペプチド。
  30. 【請求項３０】 前記融合されているさらなるポリペプチドが、ポリヒスチ
    ジン、ポリリジン、赤血球凝集素エピトープタグ、ＦＬＡＧ（登録商標）エピト
    ープタグおよびＸＰＲＥＳＳTMエピトープタグからなる群より選択される、請求
    項２９に記載のポリペプチド。
  31. 【請求項３１】 前記融合されているさらなるポリペプチドが、Ｍｙｃエピ
    トープポリペプチド、ＦＬＡＳＨペプチド、免疫グロブリン定常領域ポリペプチ
    ド、ストレプトアビジン、グリーン蛍光タンパク質ポリペプチド、エクオリンポ
    リペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼポリペプチドおよびＳｔａ
    ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓプロテインＡポリペプチドからなる群よ
    り選択される、請求項２９に記載のポリペプチド。
  32. 【請求項３２】 単離されたポリペプチドであって、該単離されたポリペプ
    チドは、ミトコンドリア透過性変化細孔成分ポリペプチドまたはその改変体を含
    み、該ミトコンドリア透過性変化細孔成分ポリペプチドまたはその改変体は、さ
    らなるポリペプチドまたはその誘導体に融合されており、ここで、該ミトコンド
    リア透過性変化コア成分は、ポーリン、ヘキソキナーゼ、クレアチンキナーゼ、
    ＰＲＡＸ、ＣＡＭＬおよび末梢ベンゾジアゼピンレセプターからなる群より選択
    される、単離されたポリペプチド。
  33. 【請求項３３】 前記融合されているさらなるポリペプチドが、ポリヒスチ
    ジン、ポリリジン、赤血球凝集素エピトープタグ、ＦＬＡＧ（登録商標）エピト
    ープタグおよびＸＰＲＥＳＳTMエピトープタグからなる群より選択される、請求
    項３２に記載のポリペプチド。
  34. 【請求項３４】 前記融合されているさらなるポリペプチドが、Ｍｙｃエピ
    トープポリペプチド、ＦＬＡＳＨペプチド、免疫グロブリン定常領域ポリペプチ
    ド、ストレプトアビジン、グリーン蛍光タンパク質ポリペプチド、エクオリンポ
    リペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼポリペプチドおよびＳｔａ
    ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓプロテインＡポリペプチドからなる群よ
    り選択される、請求項３２に記載のポリペプチド。
  35. 【請求項３５】 単離されたポリペプチドであって、該単離されたポリペプ
    チドは、シクロフィリンまたはその改変体を含み、該シクロフィリンまたはその
    改変体は、さらなるポリペプチドまたはその改変体に融合されており、ここで、
    該シクロフィリンは、シクロフィリンＤであり、そして該さらなるポリペプチド
    は、ポリヒスチジン、ポリリジン、赤血球凝集素エピトープタグ、ＦＬＡＧ（登
    録商標）エピトープタグおよびＸＰＲＥＳＳTMエピトープタグからなる群より選
    択される、単離されたポリペプチド。
  36. 【請求項３６】 単離されたポリペプチドであって、該単離されたポリペプ
    チドは、シクロフィリンまたはその改変体を含み、該シクロフィリンまたはその
    改変体は、さらなるポリペプチドまたはその改変体に融合されており、ここで、
    該シクロフィリンは、ヒトシクロフィリンＡ、ヒトシクロフィリンＢ、ヒトシク
    ロフィリンＣおよびヒトＣｙｐ−６０からなる群より選択される、単離されたポ
    リペプチド。
  37. 【請求項３７】 前記融合されているさらなるポリペプチドが、ポリヒスチ
    ジン、ポリリジン、赤血球凝集素エピトープタグ、ＦＬＡＧ（登録商標）エピト
    ープタグおよびＸＰＲＥＳＳTMエピトープタグからなる群より選択される、請求
    項３６に記載のポリペプチド。
  38. 【請求項３８】 前記融合されているさらなるポリペプチドが、Ｍｙｃエピ
    トープポリペプチド、ＦＬＡＳＨペプチド、免疫グロブリン定常領域ポリペプチ
    ド、ストレプトアビジン、グリーン蛍光タンパク質ポリペプチド、エクオリンポ
    リペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼポリペプチドおよびＳｔａ
    ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓプロテインＡポリペプチドからなる群よ
    り選択される、請求項３６に記載のポリペプチド。
  39. 【請求項３９】 前記グリーン蛍光タンパク質が、青色シフトＧＦＰ、シア
    ン色シフトＧＦＰ、赤色シフトＧＦＰおよび黄色シフトＧＦＰからなる群より選
    択される、請求項３１、３４および３８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  40. 【請求項４０】 ミトコンドリア透過性変化を変更する薬剤を同定するため
    の宿主細胞であって、少なくとも１つのミトコンドリアおよび請求項１８〜２７
    のいずれか１項に記載の核酸発現構築物を含む、宿主細胞。
  41. 【請求項４１】 前記宿主細胞が、原核生物細胞である、請求項４０に記載
    の宿主細胞。
  42. 【請求項４２】 前記宿主細胞が、真核生物細胞である、請求項４０に記載
    の宿主細胞。
  43. 【請求項４３】 前記真核生物細胞が、２９３、ＣＯＳ−７、Ｓｆ９、ＣＨ
    Ｏ、Ｈｅｐ−２、ＭＤＣＫ、ＳＨ−ＳＹ５ＹおよびＪｕｒｋａｔからなる群より
    選択される細胞株に由来する、請求項４２に記載の宿主細胞。
  44. 【請求項４４】 前記真核生物細胞が、Ｔ．ｎｉ細胞である、請求項４２に
    記載の宿主細胞。
  45. 【請求項４５】 前記組換え発現構築物が、染色体外にある、請求項４０に
    記載の宿主細胞。
  46. 【請求項４６】 前記核酸発現構築物が、宿主細胞染色体内に組み込まれて
    いる、請求項４０に記載の宿主細胞。
  47. 【請求項４７】 前記宿主細胞染色体が、ミトコンドリア染色体である、請
    求項４６に記載の宿主細胞。
  48. 【請求項４８】 さらなるポリペプチドに融合されているシクロフィリンポ
    リペプチドを調製するための方法であって、以下の工程： （ａ）融合タンパク質の発現を可能にする条件下で、核酸発現構築物を含む宿
    主細胞を培養する工程であって、該核酸発現構築物は、以下： （ｉ）さらなるポリペプチドまたはその改変体に融合されたシクロフィリン
    ポリペプチドまたはその改変体をコードするポリヌクレオチドを含み、該ポリヌ
    クレオチドに、発現制御配列が作動可能に連結されている、核酸発現構築物であ
    って、該シクロフィリンは、シクロフィリンＤであり、そして該さらなるポリペ
    プチドは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ以外である、核酸発現構築物
    ；および （ｉｉ）さらなるポリペプチドまたはその改変体に融合されたシクロフィリ
    ンポリペプチドまたはその改変体をコードするポリヌクレオチドを含み、該ポリ
    ヌクレオチドに、発現制御配列が作動可能に連結されている、核酸発現構築物で
    あって、該シクロフィリンポリペプチドは、ヒトシクロフィリンＡ、シクロフィ
    リンＢ、ヒトシクロフィリンＣおよびヒトＣｙｐ−６０からなる群より選択され
    る、核酸発現構築物 からなる群より選択され、 エネルギー移動分子ポリペプチドまたはその誘導体に融合されたシクロフィリ
    ンポリペプチドまたはその誘導体を含む融合タンパク質をコードする、 工程；ならびに （ｂ）該培養物から融合タンパク質を回収する工程 を包含する、方法。
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