CN106255754A - 使用高碘酸盐用于微生物细胞溶解的方法和系统 - Google Patents

Abstract

本申请提供了包含高碘酸盐或过硫酸盐的组合物用于从微生物中提取核酸，并且提供了使用该组合物用于核酸提取的相应的方法。该组合物和方法在从抵抗标准核酸提取技术的微生物中提取核酸特别有用，例如，分枝杆菌属(Mycobacterium)的一个或多个物种，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)复合体的一个或多个物种、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的MDR菌株、梭菌属(Clostridium)的一个或多个物种、芽孢杆菌(Bacillus)的一个或多个物种、以及具有顽强的细胞壁的其他微生物。

Description

使用高碘酸盐用于微生物细胞溶解的方法和系统

发明领域

本申请涉及核酸提取领域。更具体地，本申请涉及用于从诸如细菌、病毒和真菌等微生物中最大化或改善核酸提取的方法和系统。

背景

提高核酸从坚韧的微生物和病毒中的释放的组合物/方法。

微生物(包括细菌、藻类和真菌)都是非常多种多样的，并且生活在生物圈中的所有部分。一些微生物对营养循环是关键的并且与较大的生物体具有亲密的、互惠互利的关系，而其他的是致病的，感染且有时杀害宿主，即人类、其他动物和植物。微生物、病毒和朊病毒引起疾病，例如鼠疫、炭疽、结核病、麻风病、疟疾、霍乱、伤寒、昏睡病、破伤风、弓形虫病(toxoplamosis)、组织胞浆菌病、肉毒杆菌、白喉、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、流感、脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎、风疹、甲型和乙型肝炎、1型和2型疱疹、黄热病、登革热、狂犬病、乳头状瘤/癌(由人类乳头状瘤病毒引起)、腺病毒介导的呼吸道感染、和传染性海绵状脑病(例如，克罗伊茨费尔特-雅各布(Creutzfeldt-Jakob)疾病)。

医疗相关的感染(HAI)或医院感染是病人在接受针对其他病症的医疗保健治疗过程中获得的感染或者在医院工作人员之间发展出的一种感染。医疗环境可以被能够长时间生存的医院病原体变成高污染的环境。这些可预防的感染可以是毁灭性的和全世界发病率和死亡率的显著起因。

现代医疗采用许多类型的侵入设备和程序来治疗患者。HAI的三分之二与在医学程序中使用的设备有关，例如中心导管相关血流感染、导尿管相关的尿路感染、和呼吸机相关性肺炎。HAI也可能在手术部位及开放性创伤处发生。此外，受难辨梭菌(Clostridiumdifficile)细菌和孢子污染的表面可引起胃肠道感染和严重的疾病。引起HAI的微生物的其他实例包括不动杆菌(Acinetobacter)、洋葱伯克霍尔德杆菌(Burkholderia cepacia)、白色念珠菌(Candida albicans)、索氏梭菌(Clostridium Sordellii)、肠杆菌科(Enterobacteriasceae)、大肠杆菌、A-C型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感、克雷伯菌属(Klebsiella)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)、诺罗病毒(Norovirus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、万古霉素(Vancomycin)中间体和万古霉素抗性金黄色葡萄球菌、和嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。由这些微生物引起的感染通过延长患者在医院停留占据稀缺的卫生部门资源。

HAI是发达国家中重要的公共健康问题。在美国，疾病控制和预防中心(CDC)估计来自所有类型的微生物(包括细菌)加在一起大约170万HAI每年引起或促成99,000人死亡。根据CDC，在美国每天每20名住院患者中约1名具有通过接受医学治疗引起的感染。仅在美国，对于医院的HAI的整体年度直接医疗费用(包括住院病人服务)大约是$450亿(基于由CDC分析的2007年数据；RD·斯科特II(RD Scott II)，2009)。

医院有关于制服、器械消毒、清洗和其他预防措施的消毒试验方案。所有医务人员在与每位患者接触前后彻底洗手和/或使用酒精涂擦是与一些HAI战斗的最有效的方法之一。在器械和表面上的微生物可以通过暴露于化学品、电离辐射、干热或在压力下的蒸汽被杀死或进行灭菌。然而，顽强的微生物(例如葡萄球菌、MRSA和万古霉素抗性肠球菌)已知在“接触”表面(如床栏、电话、呼叫按钮、地板、床头窗帘、坐便器、椅子、门把手、电灯开关、静脉内磁极、计数器、听诊器、TV遥控器、和桌面)连同在空气和灰尘中生存，持续延长的时间段。

这些表面的消毒经常被忽视、然而还打破医疗环境中的感染周期的关键组成部分。现代消毒方法，例如在二氧化碳中的不可燃酒精蒸气(NAV-CO₂)系统已经针对肠胃炎、MRSA、流感剂稍微有效。而且，过氧化氢蒸气降低感染率，针对内生孢子形成的细菌(例如难辨梭菌)尤其有效，其中酒精已被证明是无效的。因此，为了避免和战胜HAI两者，在医院、医疗机构、疗养院和长期护理设施中极度需要安全和有效的抗菌药剂来常规地消毒常见的接触表面、可重复使用的医疗设备、和医疗/牙科器械。

研究人员和感染控制专家正在提倡更为严格的清洗试验方案和程序，以及针对不同的传染性病原体定制的材料。福利(Fawley)和同事(2001)发现一些通用的、基于清洁剂(离子和非离子表面活性剂)的消毒剂(没有充足的消毒)实际上可能增加对环境的污染。而且，一项美国的研究(马丁内斯(Martinez)等人，2003)推断日常的20-30分钟清洗(使用酚消毒剂)不足以消灭在患者的房间中的万古霉素抗性肠球菌(VRE)。它采取了更彻底的4小时清洗试验方案以从内科重症监护病房(ICU)清除VRE。今天，存在对安全、快速、有效、廉价且对环境无害的消毒器械、工具和接触表面的方式的需求，而不需要使用有毒或腐蚀性化学品。理想的消毒剂应当具有宽的抗菌谱，引起快速的杀灭，无毒，无味，应当在处理的表面上留下经济的、可溶于水的、稳定的抗微生物膜，并且不应当破坏环境。

在医疗设施中使用的大多数医疗和手术设备是由热稳定的材料制成，并且因此经受热(主要是蒸汽)灭菌。然而，自1950年以来，由需要低温灭菌的材料制成的医疗设备和仪器不断增加。在过去的15年中，许多新的低温灭菌系统(例如，环氧乙烷(ETO)、过氧化氢气体等离子、过乙酸浸泡、臭氧)已经被开发且被用来消毒医疗设备(例如，外科手术仪器、移植物、血液培养管、皮下注射器、活检钳)和牙科仪器，以及用来净化微生物废物。正在开发用于在医疗设施中使用而没有被FDA明确的技术包括汽化的过氧化氢、汽相过乙酸、气态二氧化氯、电离辐射、或脉冲光。为了保护患者免受感染，同时对工作人员最小化风险并保留正在被再处理的物品的价值，还需要另外的新的低温环境友好的灭菌技术，该灭菌技术具有对于活性微生物和孢子出色的杀微生物活性。

结核病(TB)是由“结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)复合体”的成员所造成的人类主要的传染病，该“结核分枝杆菌复合体”包括，例如，结核分枝杆菌、牛分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、卡内堤分枝杆菌(M.cannetti)、山羊分枝杆菌(M.caprae)和鳍脚目分枝杆菌(M.pinnipedi)物种的致病性菌株。结核分枝杆菌(MT)感染约三分之一的世界人口，其中的90％在感染后几年能够保持无症状。TB在>50％的感染人群中是致命的，多重耐药(MDR)菌株的出现使得结核病的诊断和治疗在发展中的非洲人群中高度优先。MT生长缓慢，其意味着这种生物体和其他临床上重要的分枝杆菌的分离、鉴定、和药敏试验非常困难并且可能需要数周或数月。如果生物安全3级实验室在这样的远程位置不可用，测试的难度被使样品在处理和分子测试之前不感染以减少传递和发病率的需求所混淆。然而，MT感染的早期和准确诊断对隔离患者，从而减少对密切接触者的疾病传播，并确保适当和有效治疗的开始很关键。抗生素疗法的早期给予显著降低了疾病的严重性，增加了缓解率，并且旨在避免MDR TB的发展。目前的方法具有从怀疑感染MT的患者中安全地收集、运输、稳定和/或提取“好的”/代表性的样本(如痰标本)的困难相关的缺点。

目前使用痰来诊断MT感染的方法涉及将痰收集到空容器中，将可能感染的痰样品递送到实验，在那里将容器打开并用氢氧化钠(NaOH)和N-乙酰基-L-半胱氨酸(NALC)来处理样品。NaOH/NALC被广泛用于液化痰并减少其他微生物的背景，同时保持MT的生存能力。MT是如此顽强以至于大多数在这种严酷的处理下生存，允许这种微生物的选择性培养。然而，MT在体外生长非常缓慢，其延长了检测和诊断的时间。在NaOH/NALC处理之后，包含MT的沉积物在进一步的处理之前可以进行浓缩，该进一步的处理包括a)抗酸染色法，以鉴定在涂片上的“耐酸”细菌，b)常规的微生物培养方法，以及c)基于分子的测定用于物种鉴定和抗生素抗性分析。

在原则上，分子诊断方法的使用避免了培养MT的需要，因此，避免了将原始样品中的细菌维持在存活状态的需要。此外，全世界存在对结核病实施比用于MT的常规的实验室测试更灵敏和快速的分子诊断测试(使用DNA和/或RNA)的需要，以使患者的分离和有效治疗的更早开始成为可能。可商购的、FDA批准的用于MT的分子检测的测定(例如，来自罗氏诊断系统(Roche Diagnostic Systems)(巴塞尔，瑞士)的Amplicor结核分枝杆菌检测(Amplicor Mycobacterium Tuberculosis Test)和来自Gen-Probe公司(圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)的“增强扩增结核分枝杆菌直接(E-MTD)测试(Enhanced AmplifiedMycobacterium Tuberculosis Direct(E-MTD)Test)”)具有被标准化和可再现的优点，并在涂片阳性样品中表现出高灵敏度(>95％)和特异性。然而，所有新的肺TB病例的一半在初步诊断时是涂片阴性的。不幸的是，FDA批准的分子测定法还显示了在涂片阴性和非呼吸样本中的低灵敏度(40.0-92.9％，MTD测试；40.0-73.1％，Amplicor测试)。此外，高器械和测试成本限制了它们在遥远的、低资源配置的发展中国家的实施(“针对用于诊断结核病的核酸扩增的使用的专家咨询报告(Report of an Expert Consultation on the Uses ofNucleic Acid Amplification Tests for the Diagnosis of Tuberculosis)”，疾病控制和预防中心；“用于对来自临床标本的分枝杆菌进行诊断和抗生素抗性检测的分子遗传学方法(Molecular genetic methods for diagnosis and antibiotic resistancedetection of mycobacteria from clinical specimens)”，APMIS(2004)112：728-752)。一种增加MT检测的灵敏度并因此分子诊断测试的准确性的手段是增加从给定的样品中提取核酸(特别是从临床样品中病原菌中提取DNA和RNA)的有效性。来自具有活动和/或休眠感染的患者的样本，特别是具有HIV/TB共同感染的个体，可能只包含少数嵌入厚的(往往是‘实的’)粘液中的分枝杆菌。高效的提取方法可以通过增加检测MT的敏感性，从而允许早期干预来彻底改变结核病的诊断和治疗。

分枝杆菌的蜡状细胞壁中含有霉菌酸，使其难以破坏并且大大减少了大多数化学或酶提取过程的核酸提取效率。强壮的细菌细胞壁阻碍了细胞裂解和DNA的有效提取两者(卡瑟(Kaser)等人，2009)。目前，临床市场缺乏从处于适合PCR和其他复杂的分子分析(例如微阵列)的形式的大量样品中提取/分离核酸的有效的方法。用于微生物/细胞破碎的物理方法包括机械细胞分裂(珠粒打浆、破碎和研磨、湿磨、超声波、液压剪、冻结压力)、液体或流体剪切(弗细胞压碎器(French press)、Chaikoff压碎器、均质器、湿磨碎机、振动磨碎机、过滤器、超声波分解)和固体剪切(研磨、休斯压碎器(Hughes press))。例如，在E-MTD测试中，超声被用于从靶细胞中释放分枝杆菌的rRNA。细菌和其他微生物(如真菌)的机械破碎产生高度可变的DNA释放，很大程度上取决于使用的具体技术。

相比于机械手段(如珠粒打浆)，一些类型的临床样品中顽强的细菌/孢子的化学/酶裂解会更容易和更安全地集成到现有的高通量、自动化的样品处理系统和工作流程中。微生物/细胞分解的化学方法都旨在修改细胞壁，所以由于膨压的影响细胞变成有漏洞的或爆裂。方法包括反渗透、干燥和提取、自溶、细胞壁合成的抑制、酶对细胞壁、噬菌体和其他裂解因素的攻击、和电离辐射。

典型地，使用琼脂和液体培养方法测定MT的耐药性，其分别需要6至8周和4至5周提供结果。对来自MT阳性标本的RNA的可靠检测预期彻底改变TB(特别是和多重耐药和广泛耐药的结核病(MDR/XDR TB))的诊断和治疗。利用分子生物学方法的耐药性快速检测需要一到两天，其能够使有效治疗的早期开始成为可能，从而减少MDR TB病例的传染性的时期多达6周和全面地改善患者的结果；这两者都可能对努力控制MDR TB具有很大的影响(参考文献：“关于在美国检测耐药结核病的迅速分子测试的专家咨询报告(Report of ExpertConsultations on Rapid Molecular Testing to Detect Drug-ResistantTuberculosis in the United States)”，疾病控制和预防中心)。

在TB阳性患者标本中的MT DNA水平的定量测定在大多数患者中不是用于成功治疗的可靠标志，因为MT DNA可在治疗完成后在TB患者的痰中继续存在长达一年。相比之下，原核mRNA具有短的半衰期，因此将被预测仅仅在活生物体中找到。相比mRNA，核糖体RNA(rRNA)是相对稳定的RNA靶标，比mRNA具有基本上更长的半衰期和比mRNA更丰富，具有mRNA的总池的100倍的评估水平。因此，RNA稳定化、提取和分析对于诊断和治疗以前错过的涂片阴性的、TB阳性的样品和快速测量新的用药方案或当前的抗TB治疗的治疗优势或有效性将是特别有价值的。MT mRNA从TB阳性患者的痰中迅速消失表明，它是微生物的生存能力的良好指标和对治疗响应的快速评估的有用标记(LE·加鼎(LE Desjardin)等人，“痰结核分枝杆菌信使RNA作为替代物对化疗响应的测定(Measurement of sputum Mycobacteriumtuberculosis messenger RNA as a surrogate for response to chemotherapy)”(1999)美国呼吸和重症监护医学杂志(Am J Respir Crit Care Med)160：203-210)。

对于DNA提取目前可用的‘非机械’的方法包括‘快速提取’(将样品与包括Tris、EDTA和Triton X-100的裂解缓冲液混合，煮沸15分钟，用异丙醇沉淀DNA)、‘有机提取’(将样品与苯酚-氯仿-异戊醇混合，DNA从水层中沉淀)、‘基于二氧化硅的提取’(将样品与包括硫氰酸胍、EDTA和Triton X-100的裂解缓冲液混合，与二氧化硅一起孵育、洗涤、从二氧化硅中洗脱DNA)以及磁性粒子，例如‘MagaZorb^TM’(将样品与蛋白酶K和裂解缓冲液混合，孵育，添加结合缓冲液和磁性颗粒，洗涤，从颗粒中洗脱DNA)。目前，RNA可以通过仅物理或机械破碎(如珠粒打浆)从MT中释放，并且它通常被降解。

提供此背景信息是出于介绍本申请人认为与本发明可能相关的已知信息的目的。目的不是必须承认，也不应被理解为任何前述信息构成针对本发明的现有技术。

概述

本发明的目的是提供使用高碘酸盐用于从微生物中释放DNA和RNA的方法和系统。依照本发明的一个方面，提供了包含氧化剂和缓冲剂的组合物，其中该氧化剂是高碘酸、高碘酸盐或过硫酸盐。

依照本发明的另一个方面，提供了用于从微生物中提取核酸的方法，该方法包括将怀疑包含该微生物的样品与氧化剂混合并加热所得的混合物，其中该氧化剂是高碘酸、高碘酸盐或过硫酸盐。

依照本发明的另一个方面，提供了用于核酸提取的试剂盒，其中该试剂盒包括(i)提取组合物，该提取组合物包含浓度从约5mM至约300mM的高碘酸盐或过硫酸盐和pH从约7至约13的缓冲液；和(ii)使用的说明。

依照本发明的另一个方面，提供了定量在样品中的总核酸的方法，该方法包括(i)用酸处理样品并加热该酸化样品；(ii)中和该酸化样品；和(iii)用反相柱使该中和的样品经过HPLC并且通过UV光谱法监测洗脱液以鉴定对应于腺嘌呤的峰；(iv)计算该腺嘌呤峰的曲线下的面积作为样品中的总核酸的测量。

附图简要说明

为了更好地理解本发明以及其他方面和其进一步的特征，可参考下面的描述，该描述是与附图结合使用的，其中：

图1图解地描述了从酸处理至从纯的DNA释放腺嘌呤的结果；

图2图解地描述了从存在于完整的枯草杆菌细胞的悬浮液中的DNA释放的腺嘌呤作为酸浓度的函数的结果；

图3图解地描述了通过酸提取方法和通过珠粒打浆方法检测的总DNA的比较的结果；

图4是显示使用本申请的组合物从酿酒酵母(S.cerevisiae)释放核酸的琼脂糖凝胶的照片；

图5是显示从使用高碘酸盐和加热从枯草杆菌(Bacillus subtilis)释放DNA和RNA的琼脂糖凝胶的照片。

图6是显示从使用高碘酸盐和加热从耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)释放DNA和RNA的琼脂糖凝胶的照片。

图7图解地描述了相对于商购的分离试剂盒(罗氏公司(Roche))，使用高碘酸盐提取的来自孢子的肉毒杆菌(C.Botulinum)特定的-DNA的检测。

图8图解地描述了相对于商购的分离试剂盒(罗氏公司(Roche))，使用高碘酸盐提取的来自孢子的梭状芽孢杆菌(C.difficile)特定的-DNA的检测。

图9图解地描述了rtPCR的“高碘酸盐”方法和“护理标准”方法灵敏度的比较。

图10图解地描述了低、中、高TB负荷的痰样品的rtPCR分析。

图11图解地描述了使用不同的提取方法从痰样品中回收的aMTB DNA的百分比。

图12是用高碘酸盐处理的纯的胰核糖核酸酶A的SDS-PAGE的照片。

图13是用高碘酸盐处理的耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)的SDS-PAGE的照片。

图14是显示通过用高碘酸盐预处理的RNA酶A的抑制的琼脂糖凝胶电泳的照片。

图15图解地描述了标准净化和用高碘酸盐处理后炭疽杆菌(B.Anthracis)孢子生存能力。

图16图解地描述了标准净化和用高碘酸盐处理后肉毒杆菌(C.botulinum)孢子生存能力。

图17图解地描述了标准净化和用高碘酸盐处理后难辨梭菌(C.difficile)孢子生存能力。

详细说明

除非另外定义，否则在此所使用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如说明书和权利要求书中使用，单数形式“一个/种(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数指代物，除非上下文另有清楚规定。

如在此所使用的术语“包括”将被理解为意指以下的列表是非详尽的并且在适当情况下可以包括或可以不包括任何其它附加的合适项目，例如一个或多个另外的特征、成分和/或要素。

如在此所使用的术语“样品”将被理解为意指可能含有感兴趣的物质的任何样品，其任选地是核酸、蛋白质或其它感兴趣的生物分子。术语“样品”可涵盖溶液(如水性溶液)、细胞、组织、活组织检查、粉末、或其一个或更多的群体。该样品可以是生物样品，如唾液、痰、颊拭子样品、血清、血浆、血液、血沉棕黄层、咽、鼻腔/鼻咽或窦拭样或分泌物、咽拭样或刮屑、尿、黏液、粪便、直肠拭样、病灶拭样、食糜、呕吐物、胃液、胰液、胃肠液、精液/精子、尿道拭样和分泌物、脑脊髓液、乳产品或月经、蛋黄、羊水、房水、玻璃状液、宫颈分泌物或拭样、阴道液/分泌物/拭样或刮屑、骨髓样本和抽出物、胸膜液体和胸腔积液、汗液、脓、泪、淋巴液、支气管或肺灌洗液或抽出物、腹膜积液、细胞培养物和细胞悬液、结缔组织、上皮细胞、上皮拭子和涂片、粘膜、肌肉组织、胎盘组织、活组织检查、渗出液、器官组织、神经组织、毛发、皮肤、指甲、植物、植物提取物、藻类、土壤样品、污水、废水、食品、肉类加工设备拭样等。样品也可以是稳定化的或保藏的样品，其中包含原始核酸的样本已经与存储溶液混合或以其他方式被存储溶液处理，例如在试剂盒中发现的存储溶液，例如但不限于，·DNA收集试剂盒、·RNA收集试剂盒、·发现感染的疾病收集试剂盒、Performagene^TM·牲畜(LIVESTOCK)DNA收集试剂盒、和·动物DNA收集试剂盒、或组合物，例如描述于美国专利号7,482,116、8,158,357和美国专利公开号2010/0099149，其各自通过引用结合在此。优选地，将在这样的稳定化样品中的核酸保持基本上完整和非降解持续延长的时间段，例如，从样品收集、运输的地点到测试实验室，以及本发明的处理。

如在此所使用的术语“微生物”将被理解为意指任何微观生物体和孢子，包括所有的原核生物，即真细菌和古细菌，以及各种形式的真核生物，包括原生动物、真菌(如酵母)、藻类和动物(如轮虫和真涡虫)。

如在此所使用的术语“螯合剂”将被理解为意指将与某些金属离子一起形成可溶的稳定的复合体，螯合这些离子以至于它们不能正常与其它组分进行反应的化学品。螯合剂可以是，例如，乙二醇四乙酸(EGTA)、(2-羟乙基)乙二胺三乙酸(HEDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺三乙酸(EDTA)、环己烷二胺四乙酸(CDTA)，N,N-双(羧基甲基)甘氨酸、无水柠檬酸、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、二柠檬酸铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂、或它们的任意组合。

如在此所使用的术语“变性剂”将被理解为意指可以引起蛋白质失去它们的天然二级和/或三级结构的任何化学品。变性剂可以是，例如，阴离子洗涤剂(例如，十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸锂、或月桂硫酸钠(SLS))、阳离子洗涤剂(例如，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，其可以适用于一些核酸应用；十六烷基溴化吡啶或烷基苄二甲基氯化铵)、或非离子型洗涤剂(例如，吐温(Tween)、Triton X、或布里杰(Brij))。

本申请提供了用于从微生物中提取核酸的方法、组合物和系统。本发明的方法、组合物和系统能够从抵抗一般标准核酸提取技术的微生物和孢子中释放核酸，例如，分枝杆菌属的一个或多个物种，结核分枝杆菌复合体的一个或多个物种、结核分枝杆菌的MDR菌株、梭菌属的一个或多个物种、芽孢杆菌的一个或多个物种、以及具有顽强的细胞壁的其他微生物。

本提取方法、组合物和系统具有超出结核病市场的应用。该方法、组合物和系统在人类和动物的医学诊断和研究中是有用的(例如，研究微生物进化、毒性、耐药性、和流行病学的群体基因组学)。另外，许多市场/行业正在寻找有效的方法来破开坚韧的小虫和孢子，包括食品安全(食品/肉类加工厂)、土壤和水样采集(环境测试)、生物安全或生物防御(炭疽孢子和其他生物武器)、动物饲料测试、农业/植物科学/工业、酒精生产等。

新的和迅速扩大的研究焦点是肠道菌群或肠道微生物组和在健康和患病的人类粪便中的微生物分析。出于研究和经济上的原因，对在许多家畜(尤其是为了乳制品和肉被饲养的那些动物)的瘤胃中的数千种不同的微生物的分析也有巨大的兴趣。

本发明人已意外地发现，常见的实验室化学品高碘酸盐在弱碱性pH和升高的温度下使用，可以用来从在生长和休眠(例如，内生孢子和孢子)两种状态中的微生物中快速和有效地释放核酸。核酸的惊人释放似乎是高碘酸盐特异性的并且在较小的程度上是过硫酸盐特异性的。相关的化合物(如碘酸盐)不会显著地提高核酸从细菌或真菌中的释放。

本化学组合物和方法具有简化和加快用于检测微生物的样品制备或加工的潜力，而不需要冷链或昂贵且费时的样品净化和乳化。本发明可以用于具有高通量系统的中心实验室或具有最少的实验基础设施和设备的农村或流动诊所。这种用途有利于流行病学和疫情监测，从田间样本在收集现场的流行性疾病和传染病跟踪，以及用于快速评估和监测患者对治疗的反应。

分枝杆菌顽强的细胞壁由厚的、蜡质的、疏水的、霉菌酸酯层和肽聚糖层通过多糖结合在一起组成。为了确定细胞壁的蜡质组分是否可以剥去，对各种溶剂(例如，瓦索尔(Varsol)、DMSO和Hemo-)进行了尝试，但没有观察到DNA的释放增加。同样地，各种洗涤剂(如SDS)、甲酸、和硼酸盐在升高的温度下进行了测试。这些化合物没有一种甚至在100℃下被发现从分枝杆菌中释放10％以上的DNA。

除了从微生物释放非常高级分的DNA/RNA，本非机械提取组合物和方法可具有使该样品不被感染的另外的优点，这将对实验室工作人员的安全是有利的。惊奇地，在基本上全部DNA被释放的条件下，本发明的组合物和方法仍然可以允许分枝杆菌的抗酸染色和显微镜观察。与此相反，本发明人观察到酵母在使用本发明的组合物和方法处理时即快速分解以至于它们不能够通过染色或显微镜进行进一步的分析。

本申请的方法和系统在从细菌和孢子释放DNA/RNA方面是有用的。该细菌可以是，例如，结核分枝杆菌、结核分枝杆菌复合体的物种、耻垢分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、卡内蒂分枝杆菌、山羊分枝杆菌、鳍脚目分枝杆菌、海鱼分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、弥漫型麻疯分枝杆菌(Mycobacterium Lepromatosis)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)，鸟细胞内分枝杆菌(Mycobacterium avium-intra-cellulare)、鸟类结核分枝杆菌(Mycobacterium aviumparatuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、戈登分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)、芽孢杆菌属物种、枯草杆菌、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、链球菌属物种、葡萄球菌属物种、脆双核阿米巴(Dientamoeba fragilis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)和其他物种、梭状芽胞杆菌物种、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、沙门氏菌物种、弯曲杆菌物种、厚壁菌门(Firmicutes)细菌，巴尔通氏体属(Bartonella)物种，立克次氏体(Rickettsia)物种、耶尔森菌属(Yersinia)物种、弗朗西丝菌属(Francisella)物种、布鲁杆菌属(Brucella)物种、博德特菌属(Bordetella)物种、伯霍尔德杆菌属(Burkholderia)物种、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、志贺菌属(Shigella)物种、衣原体属(Chlamydophila)物种、军团菌属(Legionella)物种，李斯特菌属(Listeria)物种、棒状杆菌属(Corynebacterium)物种、肠球菌(Enterococcus)物种、埃希氏菌属(Escherichia)物种、嗜血杆菌属(Haemophilus)物种、螺杆菌属(Helicobacter)物种、钩端螺旋体属(Leptospira)物种、支原体(Mycoplasma)物种、奈瑟球菌属(Neisseria)物种、密螺旋体属(Treponema)物种、或弧菌属(Vibrio)物种。

本申请的方法和系统在从真菌中释放DNA/RNA是有用的。真菌可以是(例如)酵母菌属、念珠菌属、曲霉属、组织胞浆菌属、肺囊虫属、葡萄穗霉属或隐球菌属。

高碘酸盐提取组合物

高碘酸盐可以许多形式存在，这些形式包括，间-和邻-高碘酸盐(分别是IO₄ ^-和IO₆ ^-5)，其是从碘和氧形成的阴离子并且通常作为具有钾(如KIO₄)或钠(如NaIO₄)的盐被发现。至少四个系列的高碘酸盐已知处于水溶液中，即邻高碘酸(H₅IO₆)、高碘酸(HIO₄)、偏高碘酸盐(H₃IO₅)、和三高碘酸(H₇I₃O₁₄)[N.N.·格林伍德(N.N.Greenwood)和A.·恩肖(A.Earnshaw)，元素的化学(Chemistry of the Elements)，第2版，巴特沃思海涅曼公司(Butterworth Heinemann)，牛津，第17章，第872-875页(1998)]。在溶液中，高碘酸盐可以是氧化剂并且被应用于分子生物化学用于打开糖环和标记的RNA的目的。高碘酸盐切割在合成的聚合物和天然的多糖和单糖中具有羟基基团(顺式乙二醇)的相邻的碳原子之间的键，从而生成两个醛基基团。这些醛可以被用于与伯胺或酰肼活化的标记/标签、固定支撑和交联试剂进行的两种类型的偶联反应。高碘酸也被用于组织学染色(高碘酸-希夫(PAS))，用于检测组织中的糖原和其他多糖的一种染色方法。然而，据本发明人所知，高碘酸盐以前从未被用于从微生物中提取DNA和/或RNA。

高碘酸盐提取组合物是高碘酸盐的水性溶液，当与样品混合时，该水性溶液包括从约0.1mM至约100mM，优选地5mM至约30mM的高碘酸盐，该高碘酸盐可以是间-高碘酸盐、邻-高碘酸盐或其任意组合。具有在弱碱性pH下浓度低至5M高碘酸盐的高碘酸盐的组合物，在加热条件下，从顽强的细菌和孢子中释放大量的DNA，这些细菌和孢子包括但不限于分枝杆菌属、梭菌属和芽孢杆菌属物种。样品中高达25-30mM的高碘酸盐的浓度也成功地从所述样品中的微生物中有效地释放DNA。甚至更高浓度的高碘酸盐可能是成功的，但可能会发生不希望的副反应。高碘酸钠的最大实际溶解度为约400mM，使得可能难以产生高度浓缩的组合物或储备溶液用于制造的目的。

为了规避高浓度的高碘酸盐的溶解度问题，它们可以高碘酸的形式被添加到组合物中，该高碘酸可以用碱(如NaOH)中和。可替代地，高碘酸盐是以高碘酸盐的形式引入，如高碘酸钠(在此也称为NPI)、高碘酸钾或高碘酸锂。因为其较高的溶解度，高碘酸盐的钠盐(NaIO₄)的使用比钾盐和锂盐优选。可替代地，过硫酸钠(Na₂S₂O₈)、过硫酸钾和过硫酸铵可用于从微生物和孢子中释放核酸。

虽然高碘酸钠在水中并与样品混合的简单溶液确实从微生物中提取核酸，但是高碘酸盐的作用是pH依赖性的。在pH从约5至约11，观察到DNA和RNA提取，其中在接近中性的pH值时RNA完整性更好地被保留。在某些实施例中，将本申请的提取组合物缓冲至pH为从约6.5至约11、或从约8.0至约10.5、或约9.5至约10.5。在一个实施例中，为了确定最佳的pH范围，提取组合物是使用缓冲剂的组合来缓冲的。例如，该组合物可使用磷酸(pKa为2.15、7.20、12.38)、乙酸(pKa 4.76)和硼酸的组合(pKa 9.24)进行缓冲。

任选地，高碘酸盐提取组合物可包含附加组分，包括锂盐，洗涤剂和/或螯合剂。在一个具体的实施例中，高碘酸盐提取组合物另外包括LiCl、SDS和/或CDTA。任选地，该组合物另外包括甘氨酸或硼酸作为缓冲剂。有利的是，这些附加组分有助于确保核酸从微生物中提取过程中和生物样品的处理过程中保持完整用于随后的下游分子测试(例如，PCR、微阵列)。这些附加组分也可协助液化样品和在处理过程中赋予稳定性。如果该样品被立即收集到具有这些附加组分的高碘酸盐组合物中，核酸将最佳地得以保存免受收集点、样品的运输和储存过程中的伤害，允许样品的处理以提取核酸，并且以感兴趣的测试结束。

任选地，不含高碘酸盐，含有LiCl、SDS和/或CDTA和/或甘氨酸或硼酸作为缓冲剂的提取组合物可以被用于保存样品中的核酸免受采集点、运输和储存过程的伤害，直到需要核酸提取。在那时，可加入高碘酸盐并且进行样品的处理来提取核酸，最终进行感兴趣的测试。

核酸提取的方法

本申请进一步提供了从含有微生物的样品中提取核酸的方法。该方法包括使含有微生物的样品与包含高碘酸盐的组合物接触和加热所得的混合物。

依据具体的实施例中，该方法包括以下步骤：

-准备微生物的悬浮液：在一个实例中，例如，当微生物是细菌的肉汤培养物时，将细胞通过离心收集并洗涤(例如，用盐水洗两次)以去除可能会存在于复杂培养基中的干扰污染物。洗涤的细胞(约5-20×10⁸)应该被很好地悬浮于水(如约200μL)。

-添加高碘酸盐提取组合物：典型地将等体积的提取组合物与等体积的细胞悬浮液混合(如，200μL的提取试剂与200μL的细胞悬浮液混合)。

-加热该悬浮液：该加热步骤通常用来自前一步骤的悬浮液在封闭管中进行。典型地，该加热步骤是在45℃或更高的温度下或在从约50℃至约100℃的温度下，并在从约15分钟至约60分钟的时间中进行。较长的时间和较高的温度可以在释放DNA中更有效，但释放的DNA可能被部分降解。在80℃下加热约20分钟时，几乎100％DNA从高碘酸盐处理的耻垢分枝杆菌中释放，具有最小的DNA降解。

在一个具体的实施例中，在添加高碘酸盐提取组合物之前，样品首先用稳定或预处理组合物处理。在这种方法的一个实例中，可以执行以下步骤：

1)在稳定试剂(例如或)中收集样品，例如痰样品，(例如，在远程设置中)，该稳定试剂在环境条件下稳定核酸；

2)运送稳定的样品到实验室，不需要冷链(如，无制冷)；

3)添加高碘酸盐组合物至稳定化的样品并且加热以从顽强的微生物(例如，结核分枝杆菌)和孢子中迅速和有效地释放基本上所有核酸并且使样本不被感染；

4)快速地、成本有效地加工处理过的样品以分离在步骤3中释放的核酸；并且任选地

5)使用释放的核酸进行一个或多个诊断测试。

作为与现有的技术相比的核酸释放的改进的结果，本发明的高碘酸盐处理可导致增加的诊断测试的敏感性和更准确的诊断或对治疗方案的有效性的确定。

本申请进一步提供了用于DNA提取的试剂盒。该试剂盒包括提取组合物，该组合物包括浓度为从约5mM至约30mM的高碘酸盐和pH为约7至约13的缓冲液。如上所述，该提取组合物可包括附加组分，包括锂盐、变性剂和/或螯合剂。该试剂盒可以另外包括用于执行上述的提取方法的说明、一个或多个试剂容器和/或样品接收容器。

用于净化/消毒的方法

本申请进一步提供了用于(例如)设备、仪器或结构的表面的净化或消毒的方法。该方法包括使表面与包含高碘酸盐的组合物接触和加热该表面。

如在此已经证明的，用包括高碘酸盐的组合物和加热来处理微生物方法导致DNA从微生物中的释放。DNA的这种释放的后果是微生物不再是有生活力的。以下实例12证明了本发明的高碘酸盐组合物加上加热使三种顽强的细菌无生活力的能力。

典型地，在净化或消毒的方法中的加热步骤是在45℃或更高的温度下或在从约50℃至约100℃的温度下，并在从约15分钟至约60分钟的时间中进行。较长的时间和较高的温度也可以在本方法中使用，因为它们在释放DNA和净化或消毒表面中可以更加有效。加热可以使用各种手段(例如，但不限于，加热灯、辐射加热系统和烘箱)应用于表面。

在微生物悬浮液中定量总DNA的方法

本申请提供用于定量样品中的总DNA的方法，该样品包括微生物的样品。这种方法被用于建立样品中的DNA的总量，以被用作参考来计算通过在此所述组合物释放DNA的效率。

众所周知，暴露于相对温和的酸性条件可以引起DNA降解(骨架断裂)。降解在两个步骤中发生。首先，酸催化DNA的脱嘌呤，即释放嘌呤核碱基(腺嘌呤和鸟嘌呤)，但不释放嘧啶核碱基(胸腺嘧啶和胞嘧啶)。其结果是一种称为无嘌呤酸的相当稳定的结构。最终，骨架在嘌呤位点通过β-消除断裂，释放脱氧核糖和磷酸盐；这个过程通过用碱或某些催化剂处理被加速[例如，K.·伯顿(K.Burton)、M.R.·伦特(M.R.Lunt)、G.B.·彼得森(G.B.Petersen)、J.C.Siebke，对脱氧核糖核酸中的核苷酸序列的研究(Studies ofNucleotide Sequences in Deoxyribonucleic Acid)，冷泉港定量生物学研讨会(ColdSpring Harbor Symposium on Quantitative Biology)，第28卷，第28-34页(1963)]。

与此相反，通过温和酸处理的RNA的脱嘌呤以前没有在任何细节方面被研究过。人们普遍理解的是RNA的嘌呤比DNA的更稳定，但是尚未作出并排比较。相反，已知RNA很容易通过用温和的碱处理降解，而DNA的骨架在这些条件下是非常稳定的[(例如，G.·施密特(G.Schmidt)和S.J.·坦豪泽(S.J.Thannhauser)，用于在动物组织中确定脱氧核糖核酸、核糖核酸和磷蛋白的一种方法(A method for the determination of deoxyribonucleicacid,ribonucleic acid,and phosphoproteins in animal tissues)，生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)第161卷，第83-89页(1945)]。碱催化的RNA骨架的分解在两个步骤中发生。首先，将一个核苷酸的核糖3’-羟基连接到邻近核苷酸的5’-羟基的磷酸二酯键被转移(未断开)到该第一个核苷酸的2’-羟基。这导致断链而未水解裂解磷酸酯键。所得的2’、3’-环状磷酸二酯是相对稳定的，但它在进一步的碱处理中可以以大约相同的频率缓慢的裂解为2’-磷酸单酯或3’-磷酸单酯。在这些条件下，DNA骨架是很稳定的，因为它的糖(脱氧核糖)缺少相邻3’-羟基的2’-羟基，所以容易的第一步骤，形成2’、3’-环磷酸二酯，是不可能的。

虽然科学文献包含有关上述反应的一般背景信息，产生DNA的邻近定量脱嘌呤同时引起很少或没有RNA的脱嘌呤的详细的、具体的酸处理条件以前还没有被描述。

具有腺嘌呤和鸟嘌呤定量地从DNA释放但不能从RNA释放的良好定义的条件具有很大的实用性。它允许对在复杂生物样品和微生物中的DNA的灵敏和可再现的定量(目前这是困难的)，在检测之前无扩增步骤。例如，在测定方法(例如UV吸收或荧光DNA结合染色)可以应用之前，样品制备和DNA纯化是必要的第一步骤。基于二苯胺或DABA(氨基苯甲酸)的化学方法受到生物样品中的化合物(包括复杂的多糖)的干扰[G.M.·理查兹(G.M.Richards)，二苯胺反应的改进在DNA的评估中产生增加的灵敏度和简便性(Modifications of the diphenylamine reaction giving increased sensitivity andsimplicity in the estimation of DNA)，分析生物化学(Analyt.Biochem.)57，369-376(1974)；J.M.Kissane、E.·罗宾斯(E.Robins)，动物组织特别是中枢神经系统中的脱氧核糖核酸的荧光测量(The fluorometric measurement of deoxyribonucleic acid inanimal tissues with special reference to the central nervous system)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)233，184-188(1958)]。意外地，目前没有简单的、精确的方法确定存在于完整的、未处理的微生物的悬浮液中的DNA(或RNA)的量。具有这样的信息对确定任何现有或新的方法或组合物实际上从微生物的悬浮液中释放DNA的效率是至关重要的。提取的效率(E)被定义为通过处理提取的DNA的量(DNAe)除以最初存在于未处理的样品中的DNA的总量(DNAt)。

$E=\frac{DNAe}{DNAt}$

建立了目前描述的酸提取/HPLC方法以允许这样的测定。

因此，本申请提供用于确定在样品中的总DNA的方法。该方法在以下实例1中详细描述。通常，该方法包括使用HCl(“酸水解”步骤)或另一种酸(例如，浓的甲酸)加热含有核酸的样品的步骤，随后在使用反相HPLC柱(如，Gemini-NX柱)进行HPLC分析之前中和该样品。流动相可基于所使用的柱从各种溶剂或溶剂的混合物等选择，选择适当的流动相将是在本领域的技术工人的标准能力范围内。在一个实施例中，流动相为2％甲醇、1mM CDTA、30mM乙酸铵，用单磷酸酸钠调整到pH 6.3。任选地，该方法另外包括允许RNA的定量的步骤。为了确定样品中的RNA的量在用HCl加热样品的步骤之后，添加NaOH至相对所添加的HCl的量0.1N过量，并在100℃下孵育15分钟。

对应于腺嘌呤(代表DNA)和对应于2’或3’单磷酸腺苷(2’-和3’-AMP)(代表RNA)的HPLC峰的曲线下面积(“AUC”)使用TotalChrom Navigator软件(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))来计算。标准曲线可以利用这些纯分析物(来自阿法埃莎公司(Alfa Aesar)的腺嘌呤；来自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)的2’-3’-AMP(混合物))的已知浓度来生成。

为了更好地理解在此所描述的本发明，列出以下实例。应当理解的是，这些实例仅用于说明的目的。因此，它们不应该以任何方式限制本发明的范围。

实例

实例1：用于测量样品中总DNA的酸提取HPLC方法

表1概括了由本发明人发展的酸提取/HPLC方法以精确地测量在未加工的或未处理的微生物/样品中的核酸的总量，以及由本发明的处理引起的从这样的微生物/样品中释放的核酸的详情。

表1.用于使用本发明描述的提取方法从顽强的微生物中释放核酸和用于测量在完整的和处理的微生物中的DNA和RNA的典型试验方案

实例1A：纯的DNA。用于从DNA完全释放腺嘌呤的最佳的酸提取条件

在这个实例中，测量了在不同时间段通过酸处理从纯的基因组中释放的腺嘌呤的量。在60℃下，将460纳克纯的犬齿DNA(Novagen公司)经受酸提取方法持续指示的时间。结果显示于图1中。误差棒表示一式三份样品的SEM。

该结果表明在60℃下孵育60分钟时间足以从DNA释放最大量的腺嘌呤。极大多数的腺嘌呤是在40分钟时释放的，在处理的80分钟时不再释放腺嘌呤，表明在60分钟时腺嘌呤的完全脱嘌呤。

实例1B：用于从完整的细菌细胞中释放腺嘌呤的最佳酸浓度

如图2所示，将枯草杆菌细胞在60℃下与不同浓度(标准)的HCl一起孵育60分钟。误差棒，一式两份的平均值和范围；在没有显示误差棒的地方，范围的值是在符号范围内。

这些结果表明腺嘌呤从完整的枯草杆菌的最大释放发生在约0.20–0.25N的HCl浓度的范围内。

实例1C：与酸提取HPLC方法相比估计DNA含量的CFU方法

这项实验被设计来比较通过计数细菌细胞的数量(如通过菌落形成单位(CFU)估计的)存在于细菌培养物中的DNA的量与使用酸提取HPLC方法从对腺嘌呤的AUC计算的DNA的量。

CFU方法是用于估计样品中有生活力的细菌细胞的数量的经典方法。然而，它很费时并且具有理论局限性。典型地，细菌在小团块中生长。因此，被评分为细菌的有生活力的“菌落”实际上可以从单个细胞或从2个或多个细胞的团块产生。而且，在培养物中的任何无生活力的细胞将包括DNA但不会形成菌落。这两个因素趋于低估悬浮液中细菌细胞的实际数量。从对细胞的估计和每个细胞中DNA的“文献”知识，可以计算在细胞悬浮液中的DNA的总量。

相反，酸提取HPLC方法是估计细胞悬浮液中的DNA的总量的直接的化学的方法。本发明人建立这个方法主要证明本发明对于从顽强的微生物和孢子中释放核酸的有效性。该方法(如上详细概括的)是基于腺嘌呤从DNA的释放和腺嘌呤从细胞的提取，以及然后使用HPLC对腺嘌呤的检测和定量。已知量的腺嘌呤可以从DNA的碱基组成被转换为已知量的DNA。例如，对于具有48％的GC含量的DNA，从腺嘌呤至DNA的转换因子是10。

这项实验对于CFU和酸提取HPLC方法测量在枯草杆菌的悬浮液中DNA的能力进行了比较。为了估计CFU，将对数期细菌(生长于胰蛋白酶大豆液体培养基(TSB))的悬浮液用冷的25mM Tris、150mM NaCl(pH 7.6)的溶液洗涤并且分成2部分。将一个部分在TSB中系列稀释(一式三份)，并且涂抹于胰蛋白酶大豆琼脂板上。在37℃下生长18小时后，计算有生活力的菌落的数量。将另一部分分到3只管中并离心。将沉淀溶解在200μL的0.2N HCl中，在60℃下孵育60分钟，用ADA中和并通过HPLC进行分析。

从公布的基因组序列数据，采取枯草杆菌的基因组大小为4880ng/10⁹个细胞。

表2：标准的CFU方法

表3：酸提取HPLC方法

*AUC，曲线下的面积；**ade，腺嘌呤

CFU和酸提取HPLC方法提供了在枯草杆菌的纯培养物中的细菌计数的非常相似的估计。酸水解HPLC方法提供的估计高出约20％，该估计与通过如上讨论的CFU方法的细胞数的预期低估一致。这个实例支持了酸提取HPLC方法有效地从细胞内的DNA释放腺嘌呤，允许用HPLC检测它的见解。

实例1D：与酸提取HPLC方法相比估计DNA含量的溶菌酶/洗涤剂方法

这项实验被设计来比较通过酶裂解方法从革兰氏阳性(即，溶菌酶敏感)枯草杆菌释放的DNA量与使用酸提取HPLC方法在完整的细胞中测量的DNA量。革兰氏阳性生物体(例如枯草杆菌)已知对通过用溶菌酶处理接着用SDS处理的细胞溶解非常敏感(例如，B.M.·沙西(B.M.Chassy)，用于口腔链球菌的细胞溶解的温和方法(A gentle method for thelysis of oral streptococci)，生物化学生物物理学研究通讯(Biochem Biophys ResCommun)68：603-608(1976))。溶菌酶是通过攻击在细菌(尤其是革兰氏阳性细菌)的细胞壁中发现的肽聚糖而起作用的糖苷水解酶。如果酸提取HPLC方法的确有效，通过全细胞的酸处理释放并通过HPLC检测的腺嘌呤的量应该与通过用溶菌酶加SDS溶解细胞释放的量相似。

溶菌酶试验方案：

-将枯草杆菌在1mL LB液体培养基中生长至对数期并通过离心收获。

-将细胞在冰冷的TE缓冲液(10mM Tris、1mM EDTA、pH 8.0)中洗涤。将沉淀溶解在1mL TE缓冲液中，分为四个等分试样并用TE再洗涤一次。

-将沉淀中的两份重悬于950μL的溶菌酶(1mg/mL于TE中)中，并在37℃下孵育45分钟。

-将50μL的10％SDS添加到0.5％的终浓度。

-通过添加KCl(终浓度0.1M)除去SDS，在0℃下孵育5分钟并且离心5分钟。将上清液转移至新的管；丢弃沉淀。

-使样品经受酸提取HPLC方法。

-将剩下的两份未处理的沉淀溶解在500μL H₂O中并且经受酸提取HPLC方法。

表4：酸提取HPLC方法检测到在完整的枯草杆菌细胞中当溶菌酶/SDS处理相同的细胞后被释放的相同的量的DNA

*重复样品

通过酸处理从完整的枯草杆菌释放的腺嘌呤的量与通过溶菌酶/SDS处理(预计通过细胞的100％溶解释放100％的DNA的过程)释放的腺嘌呤的量基本上相同。这提供了强有力的证据表明，酸提取HPLC方法是用于确定在完整的、革兰氏阳性细菌细胞中的DNA的量的非常有效的工具。

实例1E：与酸提取HPLC方法相比估计来自枯草杆菌的DNA含量的珠粒打浆方法

进行这项研究是为了比较在完整的细菌细胞中DNA的初始量(通过酸提取HPLC法估计)与使用‘珠粒打浆’方法从相同的细菌释放的DNA的量。用于酸提取HPLC的程序如上所描述。用于珠粒打浆方法的程序总结如下：

-将多个2mL等分试样的枯草杆菌稳定期培养物通过离心收集并在25mM Tris、150mM NaCl、pH 7.6(TBS)的冷溶液中通过离心洗涤两次。

-根据制造商的说明在一个微型珠粒打浆机-16(Mini-BeadBeater-16)(BioSpec公司)进行珠粒打浆。简而言之，将洗涤的细菌沉淀悬浮于500μL的TBS中并转移至含有约100μL的100μm的玻璃珠粒(Polyscience公司)的螺旋盖聚丙烯微型管。

-将管固定到仪器，并且在3,450振动/分钟以两个1分钟周期进行剧烈搅拌。在周期之间将样品在冰上冷却1分钟。

-将悬浮液转移至1.5mL微型离心管中，并且在微型离心机中在14,000rpm下通过离心5分钟除去未破裂的细胞和残骸。

-除去上清液，并且添加HCl至0.2N的终浓度。在60℃下孵育样品60分钟。

-为了比较在完整的细胞中的DNA量与通过珠粒打浆产生的细胞裂解物，将完整的枯草杆菌细胞的等分试样在0.2N HCl中在60℃下孵育60分钟(酸提取法)。

-在14,000rpm下将所有样品离心4分钟以除去残骸，并且将40μL的小部分应用于反相Gemini-NX柱(菲罗门公司(Phenomenex))且通过HPLC进行分析。

在图3中提供了这项研究的结果。误差棒代表一式两份分析的范围。

尽管人们普遍假定“珠粒打浆”在破坏细菌细胞和释放DNA方面是高效的，这并不一定如此。这项实验提供了另外的证据表明，酸提取HPLC方法比珠粒打浆提供了在初始细胞悬浮液中的DNA的实际量的更真实和更一致的表现。在其他实验中，通过珠粒打浆释放的DNA的量已经达到100％，即，处于与酸提取方法相等的量。因为它提供了不同的结果，该珠粒打浆方法不是估计存在于完整的细菌细胞的悬浮液中的DNA的量的可靠方法。

实例2：对高碘酸盐与其他过卤化和氧化化合物进行比较

在这项实例中，评估了一系列过全卤化和氧化化合物在从细菌细胞中释放核酸的有效性。(间)高碘酸钠、过硼酸钠四水合物、高氯酸钠、过硫酸钠(各为15mM)被用来处理枯草杆菌营养细胞(即不是孢子)的悬浮液的等分试样。在70℃下孵育20分钟后，有或没有测试化合物的情况下，将每个悬浮液的上清液级分(以及未经处理的细菌细胞)经受酸水解HPLC方法，并且计算了通过每种处理从细菌中释放的DNA的百分比。

实验方法和材料

-制备的BD缓冲液(2％SDS、5mM Li-CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸、pH 10.5)。

-对以下各项测试化合物在蒸馏水中新鲜制备300mM的储备溶液：(间)高碘酸钠(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，目录号S-1878)、过硼酸钠四水合物(西格玛-奥德里奇公司，目录号71840)、高氯酸钠(西格玛-奥德里奇公司，目录号410241)、和过硫酸钠(西格玛-奥德里奇公司，目录号216232)。

-通过将100μL(或对于阴性对照100μL的水)转移到含有0.8mL的BD缓冲器的五个管来制得来自上述步骤的各个储备溶液的10倍稀释液。

-工作测试溶液。将水(100μL)添加到每个管使各储备溶液的终浓度在80％BD缓冲液中达到30mM的终浓度。

-从等体积的稳定期的枯草杆菌悬浮液中制备洗涤的沉淀。

-将每份沉淀悬浮在300μL的水中。

-将等体积(300μL)的每种工作测试溶液(即，在80％BD缓冲液或水(阴性对照)中的30mM(间)高碘酸钠、过硼酸钠四水合物、高氯酸钠、或过硫酸钠)添加到每个细菌悬浮液并混匀。

-将混合物在70℃下加热20分钟。

-加热后，每个混合物在14,000rpm下离心4分钟。保留上清液。丢弃不溶性物质的沉淀。

-将盐酸添加到上清液级分至0.2N的终浓度。

-将混合物在60℃下加热60分钟。

-将每个样品的150μL等分试样用100μL的ADA缓冲液(pH 8.0)中和。

-然后每个样品通过HPLC进行分析来确定腺嘌呤的AUC。使未经处理的细胞(步骤5)的三份洗涤的沉淀直接经受酸水解HPLC方法以确定在每份细菌沉淀中的DNA(腺嘌呤)的总量。

结果

结果总结在如下表5中：

表5.比较由过全卤化和氧化化合物从枯草杆菌释放的DNA。

结论

在单一浓度(15mM)的测试的4种化合物中，只有(间)高碘酸钠和过硫酸钠释放了比对照更多的DNA：分别从枯草杆菌释放了44％和15％的总DNA。相反，其他过全卤化/氧化化合物没有释放比对照更多的DNA(6.7％)。

这项实例证明，过硫酸盐也可以类似于高碘酸盐的方式起到增加核酸释放的作用。

实例3：pH在高碘酸盐提取中的作用

在跨越一系列pH值测试NPI((间)高碘酸钠)的有效性和剂量依赖性中，有必要考虑各种因素，包括(i)NPI与缓冲液本身的可能反应(ⅱ)在不同的pH值可能存在NPI的不同形式(例如，偏高碘酸盐、邻高碘酸盐)和(iii)NPI在升高的pH值下具有降低的溶解度。

对于这些研究，使用了一个缓冲液系统，该缓冲液系统包括3个不同的覆盖一系列pKa值的缓冲弱酸并用单碱调节到所需的pH。酸(pKa值)是磷酸(2.15、7.20、12.38)、醋酸(4.76)和硼酸(9.24)。结合酸的初始溶液(各为20mM)具有pH 1.9(表6)(在此被称为“PAB”缓冲溶液)。PAB缓冲溶液用5N NaOH调节以达到所需的pH值用于实验(表7)。

在pH 3.7、5.5、7.4和9.4的PAB缓冲溶液单独测试和与在三种不同的浓度(最终6、12和18mM)的NPI联合测试。将有或没有NPI的缓冲液添加至洗涤的耻垢分枝杆菌的沉淀。对三种不同浓度的NPI进行了测试以确定在这个浓度范围内对于从细菌细胞中释放DNA是否存在剂量反应。因此，耻垢分枝杆菌细胞用含有不同浓度的NPI的在一定范围的pH值内的PAB缓冲溶液加热以测量使用在此所述的酸提取HPLC方法释放的DNA的量。

PAB缓冲溶液

混合在表6中列出的成分，并且将所得的混合物搅拌过夜以允许硼酸完全溶解。初始pH测量为1.9。

表6.PAB缓冲体系的组成

表7.PAB缓冲系统溶液的最终pH值

制备后，该PAB缓冲溶液储存在4℃。

实验方法

新鲜工作溶液(PAB缓冲溶液±NPI)的制备是通过(分别)添加0、20、40或60μL的300mM NPI储备(在水中)至1,000、980、960或940μL的每个PAB缓冲溶液。工作溶液在制备的3小时内使用。

洗涤的沉淀从耻垢分枝杆菌的均匀分布的、洗涤的悬浮液中制备(其中，水用于最后一次洗涤)。

将每份沉淀悬浮在200μL的PAB缓冲溶液±NPI(最终6、12和18mM)中，一式三份。将所得的混合物在70℃下加热20分钟。

将该混合物在14,000rpm下离心4分钟。保留上清液并丢弃不溶性物质的沉淀。

将HCl添加到上清液级分至0.2N的最终浓度，在60℃下，将酸化级分加热60分钟。

每150μL样品用100μL的ADA缓冲液(N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸)(pH 8.0)中和。然后样品通过HPLC进行分析。

结果

将结果总结于下面的表8和表9中。

表8.在来自用NPI处理的耻垢分枝杆菌的上清液中的作为pH的函数的DNA释放*

*在分析使用在此所述的酸提取HPLC方法释放的DNA之前，用和不用6、12和18mMNPI(最终)在指示的pH和加热下用PAB缓冲溶液处理细菌。显示了每个重复分析的结果。

**对于腺嘌呤的AUC(曲线下面积)是在指定的pH下通过所指示的处理释放的并通过HPLC测量的DNA的量的量度。

***释放的DNA的百分比是从对于在每个pH条件和NPI的浓度下释放到上清液中的腺嘌呤的平均的AUC，除以从未处理的细菌中酸提取的腺嘌呤的平均量计算出的(表9)。

表9.在表8的实验中使用的3个重复的耻垢分枝杆菌细胞的沉淀中的DNA的量。

**对于腺嘌呤的AUC(曲线下面积)，在未处理的细胞的沉淀存在的DNA的量的量度。

结论

使用3组分缓冲系统来证明对NPI介导的从耻垢分枝杆菌释放DNA的pH依赖效应。在没有NPI的情况下，在70℃下在20分钟的孵育过程中从耻垢分枝杆菌释放了2.1-11.5％的DNA。与此相反，向缓冲溶液中添加甚至很低浓度的NPI(6mM)以pH依赖性的方式显著地增加从相同的微生物释放的总DNA约9倍至37.4-59.4％。惊奇地，NPI的浓度从6mM增加至12mM甚至18mM仅导致DNA从细菌适度额外的释放；这仅在中性和碱性pH值下观察到。

实例4：使用高碘酸盐从孢子的核酸释放

枯草杆菌是革兰氏阳性细菌，可从生长的营养状态改变到非常顽强的非分裂孢子，允许生物体在极端的环境条件下生存。通常，孢子非常耐热(能够在100℃下存活几个小时)、干燥、UV辐射和氧化剂。孢子形成基本上是由营养素的缺乏引起的。细菌以不对称的方式分裂导致单个内生孢子的形成，该内生孢子包含由一个非常顽强的外壁包围的细菌的基因组DNA。在这种状态下，细菌可以处于休眠、但有生活力的状态下持续延长的时间，甚至上百年。在有利的环境条件下，内生孢子可以重新被激活并恢复到生长的(营养的)状态。

细菌孢子被认为是在最难破开的细胞类型之中。破坏营养细胞的一般抗菌剂，例如家庭消毒剂(如乙醇、洗涤剂、季铵化合物)不杀死内生孢子。孢子外壳对溶菌酶不敏感。在这个实例中，证明了(间)高碘酸钠对于从枯草杆菌孢子中释放核酸的效力。

孢子的制备

枯草杆菌的单个菌落在轨道平台摇床上以200rpm于37℃下在2mL卢里亚(Luria)液体培养基(LB)中生长过夜。通过以11000rpm离心3分钟收获细菌(1mL)；丢弃上清液。细菌通过在1mL冷的无菌H₂O中离心洗涤两次以除去残留的LB。

为了将营养细胞转换为孢子，将细菌悬浮于200μL H₂O中并添加到100mL的含有0.1mM氯化锰的哥伦比亚液体培养基中[J.A.·莫雷洛(J.A.Morello)和P.D.·艾尔纳(P.D.Ellner)，1969，用于血液培养的新培养基(New medium for blood cultures)，应用微生物学(Appl.Microbiol.)17：68-07]。

将混合物在轨道平台上以160rpm在37℃下振荡72小时以产生大约每毫升10⁸个孢子。孢子通过离心收获并悬浮于15％乙醇的水中。

在使用之前，每个孢子样品用冰冷的水洗涤三次。

为了消除任何剩余的营养细菌，将沉淀物悬浮在1mL冷水中。添加溶菌酶溶液(在Tris(10mM)、EDTA(1mM)中的400μL的5mg/mL储备溶液)，并且将所得混合物在37℃下孵育1小时。孢子通过离心收集，并且丢弃上清液。

将孢子沉淀悬浮于1mL的0.1％SDS中并且在室温下孵育5分钟。孢子沉淀通过以9000rpm离心4分钟收集；丢弃上清液。

为了除去制备中的任何残留的无细胞DNA，将孢子悬浮于含有10μg胰DNA酶的1mL的1X DNA酶缓冲液(10mM Tris-HCl、4mM MgCl₂、1mM CaCl₂)，并在37℃下孵育30分钟。

将孢子悬浮液在9,000rpm离心4分钟并且弃去上清液。将沉淀用水洗涤一次。将高度纯化的孢子沉淀再悬浮于1.2mL H₂O中。这种制备(800μL)的大多数被用于在下面的实验方法的步骤2中；其他三个100μL的等分试样用酸提取HPLC方法(步骤5-8，以下)直接进行处理以估计孢子的总DNA含量；孢子悬浮液的剩余100μL的等分试样用溶菌酶和SDS进行第二次处理(步骤9和10，以上)以确认从孢子释放的DNA不是由于转化成营养状态的细胞。然后进行酸提取/HPLC分析。

DNA提取

用和不用(间)高碘酸钠来制备试剂BA、BB、BC和BD(表10)。

悬浮的枯草杆菌孢子(来自以上步骤)的等分试样(100μL)与等体积的具有或不具有(间)高碘酸钠的BA、BB、BC或BD混合。将该混合物在70℃下加热20分钟，然后在14,000rpm下离心4分钟。保留上清液并丢弃不溶性物质的沉淀。

将盐酸添加到上清液级分至0.2N的终浓度，然后将级分在60℃下加热60分钟。每个样品(150μL)的一小部分用100μL的ADA缓冲液(pH 8.0)中和。该样品通过HPLC进行分析以确定对于腺嘌呤的AUC。

表10.使用的试剂组成

表11.在不同试剂中的高碘酸盐对从在70℃下处理20分钟的孢子的DNA释放的有效性，如使用酸提取HPLC方法测量的*

*在分析使用在此所描述的酸提取HPLC方法释放的DNA之前，用和不用15mM(间)高碘酸钠(终浓度)在指示的pH和加热(70℃，20分钟)下用试剂(表10)处理枯草杆菌孢子。显示了一式三份分析的结果。

**对于腺嘌呤的AUC(曲线下面积)是通过所指示的处理从孢子释放到上清液中并通过HPLC测量的DNA的量。

***从孢子释放的DNA的百分比是从在每个处理条件下释放到上清液中的腺嘌呤的平均AUC，除以从未处理的孢子中酸提取的腺嘌呤的平均量计算出的。

结论

惊奇地，于BAP和BDP试剂中存在低浓度的(间)高碘酸钠连同适度的加热处理(70℃，20分钟)能分别从孢子(最顽强的生物体)释放多达10％和8.3％的DNA。较高的温度和较长的处理时间预计将释放更多的DNA。在没有释(间)高碘酸钠的情况下，不能检测到DNA的 释放。

实例5：使用高碘酸盐从真菌的核酸释放

酵母是单细胞真核微生物，归类于真菌界。酵母的一个物种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)已被广泛使用了数千年并用于众多应用中。在发酵过程中，酿酒酵母能将简单碳水化合物代谢为CO₂(二氧化碳)和酒精(乙醇)。CO₂被用作烘焙中的发酵剂并且乙醇被用作酒精饮料的主要成分。最近，生物技术行业利用酵母将糖转化为乙醇，用作生物燃料。一些酵母菌株已经被用于生物降解的领域。酿酒酵母是研究最彻底的真核微生物之一，并且它仍然是遗传和细胞生物学研究中的重要有机体。

尽管细菌通常具有由肽聚糖组成的细胞壁，真菌具有包含葡糖胺聚合物、几丁质的细胞壁。大多数真正的真菌具有细胞壁，该细胞壁由三层组成：几丁质、其他多糖(酵母聚糖)和甘露糖蛋白。(http://en.wikipedia.org/wiki/Cell_wall-cite_note-11)在这个实例中，酿酒酵母为发明者担任来自真菌界的模式微生物，以测试NPI((间)高碘酸钠)对于核酸(DNA和RNA两者)的释放的功效。

实验方法

用和不用(间)高碘酸钠来制备试剂BA、BB、BC和BD(参见表10)。

酿酒酵母(弗莱希曼(Fleischmann’s)的面包酵母)的培养物通过在37℃下用具有50mM的葡萄糖胰蛋白酶大豆液体培养基生长过夜来制备。细胞从6mL培养物通过在8,000rpm离心3分钟来收集。细胞沉淀用冷PBS通过离心洗涤一次，悬浮于冷的PBS中，分配到10只管中，离心并将得到的沉淀用冷水再次洗涤。

将每份洗涤的沉淀再悬浮于200μL水中，并与等体积的具有或不具有NPI(最终15mM)的BA、BB、BC和BD试剂混合。将该悬浮液在70℃下加热20分钟，并且然后冷却至室温。将悬浮液在14,000rpm离心4分钟；将澄清的上清液转移至新的管并且丢弃沉淀。

将每种上清液的10μL的一个部分在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，并且用溴化乙锭染色以可视化DNA和RNA。

向上清液级分的剩余部分添加HCl至0.2N的终浓度。将样品在60℃下加热60分钟。然后将150μL的每个样品用100μL的ADA缓冲液(pH 8.0)中和。

中和的样品(40μL)通过HPLC进行分析并且确定腺嘌呤的AUC。

结果与讨论

通过具有或不具有高碘酸盐的不同组合物处理从酿酒酵母释放的DNA

下表12所示的结果证明了本发明的几个特征。

酿酒酵母，一种顽强的单细胞微生物，出乎意料地对通过(间)高碘酸钠的DNA释放敏感。相比在水(BC)中相同的热处理，单独在水中接近中性pH的(间)高碘酸钠(BCP)在70℃下处理20分钟后释放了4倍以上的DNA(表12)。

添加高浓度的SDS(1-2％终浓度)和/或LiCl(125mM)和/或较高pH和/或螯合剂CDTA(2.5-25mM)增加了更多释放的DNA的量(表12)。有趣的是，在相同的条件下在没有(间)高碘酸钠的情况下释放的DNA的量并不受新型试剂的这些次级组份的影响(表12)。

如从文献报导所预期的，相比DNA，酵母含有大量的RNA，其可以通过琼脂糖凝胶电泳看出(图4)。清楚的强烈的核糖体RNA(rRNA)带可以在使用试剂BA和BD没有(间)高碘酸钠处理的样本中可以看出；当添加(间)高碘酸钠时更多的RNA似乎被释放(BAP、BDP)，但RNA被部分降解。在这些实验中没有尝试通过处理条件稳定从酿酒酵母释放的RNA。

采用硼酸盐缓冲的BB以及BBP释放大量的RNA，但在两种情况下RNA明显被降低(图4)。在所有情况下，相比RNA的量，在凝胶上只看到少量的高分子量DNA(图4)。

表12.使用酸提取/HPLC方法来测量腺嘌呤的AUC时含有高碘酸盐的试剂对DNA从酿酒酵母中释放的影响*

*在表10中提供了组合物的详细信息。

结论

这项研究表明，相对于不具有高碘酸盐的相同试剂，DNA和RNA两者从酿酒酵母(具有坚固细胞壁的原始真核微生物)的释放可以通过用含有高碘酸钠的试剂处理来大大增强。在一些含有高碘酸盐的试剂中，提取了高分子量的DNA和RNA，如使用琼脂糖凝胶电泳查看从酿酒酵母释放的DNA和RNA所示。

实例6：在各种试剂正高碘酸盐和加热处理对核酸从枯草杆菌和耻垢分枝杆菌中释放的影响

在这个实例中，温度(室温、50℃、70℃、80℃和100℃)和在几个组合物中的(间)高碘酸钠(15mM终浓度)(表10)的影响，使用两种不同的靶标微生物(枯草杆菌和耻垢分枝杆菌)来进行评估。核酸从这些微生物的释放，使用酸提取HPLC方法、实时PCR和琼脂糖凝胶电泳来进行评估。

枯草杆菌是通常在土壤和植被中发现的一种顽强的细菌；它被广泛用于研究实验室研究。细胞是革兰氏阳性的杆状，并具有由肽聚糖(胞壁质)、糖和氨基酸的聚合物构成的刚性细胞壁。在不利的环境条件下，它可以形成坚韧的、保护性孢子，其能够存活于极端条件。

分枝杆菌是可由染色技术鉴定为抗酸的杆状细菌。在土壤中发现的一些物种被认为是良性的。其他种类对于人类和其他哺乳动物是严重的病原体和肺结核(TB)的致病物，肺结核是在世界的许多地方的毁灭性的疾病。世界卫生组织(WHO)估计，2010年TB感染的发病率在一些非洲国家高达1000/10万人口。TB和HIV的双重感染是特别致命的组合。越来越多的关注的原因是TB的广泛耐药(XDR)菌株，这些菌株构成了重要的人类健康问题。

分枝杆菌物种共享特有的坚韧细胞壁，该细胞壁包含称为霉菌酸的蜡状材料，该材料使得微生物非常疏水。细胞壁由霉菌酸层、肽聚糖层和多糖(阿拉伯半乳聚糖)构成。抗酸染色的性质是由于霉菌酸层。尽管革兰氏阳性细菌通常对溶菌酶是敏感的，并不知攻击分枝杆菌的细胞壁的这样的酶。从这个物种有效地释放DNA的所有目前的方法都需要某种形式的机械破坏。

目前描述的方法，完全避免了复杂的机械破碎的步骤，对其从这些种类的微生物释放DNA的能力进行了评估。

实验方法

将枯草杆菌在胰蛋白酶大豆液体培养基中于37℃下生长过夜。过夜培养物的等分试样(100μL)用于接种40mL的胰蛋白酶大豆液体培养基，并在37℃的摇动平台生长直到对数期。耻垢分枝杆菌在胰蛋白酶大豆琼脂上于37℃下生长3天并且通过刮擦收获至冷的H₂O中。

枯草杆菌和耻垢分枝杆菌各自通过在2,700g离心15分钟来收集；丢弃上清液。细菌沉淀用冷的H₂O通过在2,700g离心15分钟洗涤2次并且丢弃上清液。将洗涤的细菌沉淀重悬浮于15mL冷的H₂O中。

每个细菌悬浮液的3个等分试样(每个300μL)直接用酸提取HPLC方法进行处理以确定在这些细胞中的总核酸含量。

将各细菌悬浮液的剩余部分分成1.5mL样品等分试样，然后与等体积的BA、BB、BC或BD试剂(表10)之一，其中具有和不具有(间)高碘酸钠(在试剂中为30mM，最终为15mM)，混合。

每个3mL等分试样均等地(600μL)分到5只微型离心管，并且在室温、50℃、70℃、80℃或100℃孵育20分钟。将管在14,000rpm下离心5分钟。将澄清的上清液转移到新的管并且丢弃沉淀。将每个上清液的等分试样(190μL)除去用于通过酸提取HPLC方法如下一式三份直接进行分析(表13和表14)：

将盐酸添加到上清液级分至0.2N的终浓度，将级分在60℃下加热60分钟。将每个级分的等分试样(150μL)用100μL的ADA缓冲液(pH 8.0)中和。所得的样品通过HPLC进行分析并且确定腺嘌呤的AUC。

将来自每个剩余的上清液级分的350μL样品除去，并且在50℃下与蛋白酶K(160μg)一起孵育1小时。

将10μL各处理的上清液级分在1.0％琼脂糖凝胶上在100V下电泳40分钟，用1Kb⁺DNA梯度作为标记；将凝胶用溴化乙锭(1μg/μL)染色10分钟，并且将DNA和RNA在UV透照下可视化/拍照(图5和6)。

将氯化钠(0.1M终浓度)添加到具有BC和BCP化学品的管。将两体积的95％冷乙醇添加到所有的管，然后在-20℃下孵育30分钟以沉淀核酸。将管在13,000rpm下离心，并且将沉淀小心地用冷的70％乙醇冲洗一次。

将沉淀风干并溶解于90μL减小的TE(10mM Tris、0.1mM EDTA，pH 8.0)中。将各个溶解的沉淀的2μL部分与‘通用的’细菌16S核糖体DNA引物(BacrRNA173-F5’ATTACCGCGGCTGCTGG3’和BacrRNA173-R5’CCTACGGGAGGCAGCAG3’)一起添加到25μL的PCR反应，以通过定量实时PCR(qPCR)来估计对于每个测试条件的从枯草杆菌和耻垢分枝杆菌释放的DNA的量(表15和16)。每个PCR反应包括2.5μL的1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)、2.5μL的10x PCR缓冲液、1.25μL的50mM MgCl₂、0.5μL的10mMdNTPs、0.5μL的10pMol正向引物、0.5μL的10pMol反向引物、0.5μL的0.5μM Syto9、0.2μL的5U/μL Taq聚合酶、12.3μL的水。来自枯草杆菌和耻垢分枝杆菌的高度纯化的DNA充当PCR分析的参考。阴性对照包括在其中没有添加模板DNA的反应。Ct值是指在扩增曲线穿过检测的阈值的点的部分循环数。转子基因(Rotorgene)仪器软件设定阈值线，并且计算各样品的Ct值。Ct值与样品中的DNA的量成反比；一个Ct值的减小对应于检测出的DNA的量加倍。

结果与讨论

结果显示于表13、14、15和16中，和图5和6中。

表13.在不同试剂中的高碘酸盐对从在增加的温度下处理20分钟的枯草杆菌的DNA释放的影响，如使用酸提取HPLC方法测量的

*从营养的枯草杆菌释放的DNA的百分比是从在每个处理条件下释放到上清液中的腺嘌呤的平均AUC，除以从未处理的细菌中酸提取的腺嘌呤的平均量计算出的。

**超过100％的值表明参考样品(从未经处理的细菌沉淀中经酸提取的腺嘌呤的平均量)稍微低估了存在的DNA的总量。

表14.在不同试剂中的高碘酸盐对从在增加的温度下处理20分钟的耻垢分枝杆菌的DNA释放的影响，如使用酸提取HPLC方法测量的

*从营养的耻垢分枝杆菌释放的DNA的百分比是从在每个处理条件下释放到上清液中的腺嘌呤的平均AUC，除以从未处理的细菌中酸提取的腺嘌呤的平均量计算出的。

关于图5，其显示通过高碘酸盐和80℃(A)或70℃(B)的加热步骤DNA和RNA从枯草杆菌释放到上清液中，高分子量(>23kb)DNA带的强度在所有情况下因为高碘酸盐的存在显著地增加了，除了一种情况，BBP在80℃下(小图A)。后者可能是由于导致DNA在其从细胞释放后在一些点丢失了的误差，因为在70℃下处理的相同样品表现出强烈的DNA带(小图B)。在所有条件下处理后存在完整的或基本完整的核糖体RNA，除了BB和BBP。

参见图6，其显示通过高碘酸盐和70℃的加热步骤DNA和RNA从耻垢分枝杆菌释放到上清液中，高分子量(>23kb)DNA带的强度在所有情况下因为高碘酸盐的存在显著地增加了。相比枯草杆菌，释放的RNA的量较少并且它更广泛地被降解。

表15.使用qPCR定量通过高碘酸盐和增加的温度从枯草杆菌释放到上清液中的DNA

表16.使用实时PCR定量通过高碘酸盐和增加的温度从耻垢分枝杆菌释放到上清液中的DNA

在表15和16中给出的结果显示高碘酸盐降低了Ct值(即，提取更多的DNA)，从用BA、BB、和BD试剂处理的，但不是BC试剂(水)处理的，并在50℃、70℃和80℃下孵育20分钟的营养的枯草杆菌和耻垢分枝杆菌两者。重要的是，用高碘酸盐和加热处理释放的DNA的质量是适合于随后通过实时PCR分析进行的扩增和鉴定。使用在100℃加热重复该研究并证明了成功的DNA提取；然而，qPCR结果被DNA在100℃下变性且不可被荧光染料定量的事实复杂化。

一些样品在高碘酸盐处理后没能显示更低的Ct值，很可能是由于可变的或较差效率的乙醇沉淀步骤。在这些实验中，在qPCR可以进行之前需要该步骤来除去抑制剂。当用乙醇沉淀之前相同的样品通过琼脂糖凝胶电泳进行分析时(图5和6)，在每种情况下可以看到从用高碘酸盐处理的样品释放的DNA的量明显增加。

结论

三种不同的方法(酸提取HPLC、琼脂糖凝胶电泳和qPCR)已经被用于证明由本发明的化学方法从微生物释放核酸的有效性，该微生物包括已知抵抗标准的核酸提取方法的那些。本发明的方法是特别有价值的，因为它不要求样品的机械破碎或沸腾。高碘酸盐以温度依赖的方式明显增加从枯草杆菌和耻垢分枝杆菌中释放的DNA和RNA的量。

实例7：在各种试剂正高碘酸盐和加热处理对核酸从掺入耻垢分枝杆菌的唾液样品中释放的影响

在这个实例中，温度(70℃)和添加至几个组合物(表10)正(偏)高碘酸钠(15mM终浓度)的影响，用被掺入人唾液中的‘活的’耻垢分枝杆菌的已知量来进行评估，以模拟复杂的生物标本的条件。从在复杂的样品中的这个微生物的核酸释放，使用酸提取HPLC方法和采用耻垢分枝杆菌特异性引物的实时PCR来进行评估。

前面的实例处理了纯的培养物并洗涤了细菌和真菌的沉淀。然而，大多数的生物标本或样品的组合物是高度复杂的，并且包含大量的样品特有的、潜在的干扰物质以及宿主细胞和微生物物种。例如，除了大量的水，唾液(和痰)包含许多其他物质，例如，电解质、粘液、许多酶、抗菌化合物和细胞(人类和微生物起源的)。特别地，唾液包含大量的粘蛋白，该蛋白是具有多糖侧链的蛋白质。鉴于高碘酸盐主要攻击和打开糖环，本发明人关注到高碘酸盐(尤其是在发现可有效地从洗涤的微生物沉淀中释放DNA的较低浓度下)，可能通过与存在于唾液中过剩的多糖反应而被消耗，而不是可用来攻击样品中感兴趣的细菌/真菌的细胞壁。这个实例被设计来证明高碘酸盐在从复杂的生物样品中的微生物中释放核酸的有效性。还有，在人DNA和口腔细菌DNA的存在下，对掺入的生物体(耻垢分枝杆菌)的特异性检测进行了评估。

实验方法和材料

-通过交替向15只管子中吐痰来收集六个1mL唾液样品。紧接其后，如下向每只管添加三种不同的缓冲液(1mL)中的一种：2只管包含BA试剂，2只管包含BB试剂，并且其余2只管包含BD试剂(表10)。

-大约10⁹个耻垢分枝杆菌的悬浮液通过离心在1mL冷的PBS(pH 7.4)中洗涤两次，然后悬浮于0.5mL PBS中。

-将100μL的各个细菌悬浮液添加到一组含有BA、BB或BD试剂的管；将100μL的PBS添加到第二组管。样品通过涡旋简单混合。使另一个100μL的细菌悬浮液(一式两份)经受酸提取HPLC方法以准确地定量在具有三种缓冲液中的一种的每个唾液等分试样中掺入的耻垢分枝杆菌DNA的量。使用已知浓度的腺嘌呤标准和已知67.5％GC含量的耻垢分枝杆菌DNA来将腺嘌呤的量转换成DNA的量，已确定100μL的细菌悬浮液含有2366ng的耻垢分枝杆菌DNA。没有预期100％的DNA产率，因为提取步骤随后是纯化步骤，例如，乙醇沉淀(下文描述)，其不是100％有效的。

-将10μL的蛋白酶K(89μg/mL终浓度)添加到每个管并将这些管在50℃下孵育过夜。

-从每个管将一个200μL等分试样转移到新的管，并与10μL的300mM(间)高碘酸钠混合。

-来自每个管的第二个200μL的等分试样转移至新管。

-所有等分试样在70℃下孵育20分钟，然后在室温下冷却3分钟。

-将Tris-HCl(1M，pH 7.1)添加至每个等分试样至100mM的终浓度，并且在室温下孵育15分钟。

-将醋酸钾(3M，pH 5.5)添加至每个等分试样至150mM的终浓度，并且在冰上孵育10分钟。

-将等分试样在14,000rpm离心3.5分钟。将上清液取出并转移到新管；丢弃沉淀。

-将两体积的室温95％乙醇添加至每个等分试样，并在室温下孵育15分钟。

-将等分试样在14,000rpm离心3.5分钟。

-小心地从每个等分试样除去乙醇并且将DNA沉淀溶解于50μL的TE(pH7.5)。将一部分再溶解的沉淀稀释5倍，并且将5μL稀释的等分试样作为模板添加至含有耻垢分枝杆菌基因特异的DNA引物的25μL的qPCR反应[HP-正向：TGCCATCATCAGCGAAGTAG；HP-反向：GCGGCTACAGATTACGAAGC]。预期的产物是编码耻垢分枝杆菌菌株MC2155的‘假定蛋白MSMEI_2098’的基因的250bp的区域。这个引物被用来通过定量PCR(qPCR)评估在将这个微生物掺入唾液样品后从这个微生物释放的DNA的量。具体的条件在表17中列出。qPCR反应也包括2.5μL的1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)、2.5μL的10x PCR缓冲液、1.0μL的50mM MgCl₂、0.5μL的10mM dNTPs以及0.5μL的10pMol正向引物、0.5μL的10pMol如上所述的反向引物、0.5μL的0.5μM Syto 9、0.2μL的5U/μL Taq聚合酶、11.85μL的水。来自耻垢分枝杆菌的高度纯化的DNA充当PCR分析的参考。阴性对照包括在其中没有添加模板DNA的反应。Ct值是指在扩增曲线穿过软件产生的检测阈值的点的部分循环数。转子基因(Rotorgene)软件设定阈值线，并且计算各个样品的Ct值。Ct值与样品中的DNA的量成反比；一个Ct值的减小对应于检测出的DNA的量加倍。

结果与讨论

结果总结在如下表17中：

表17.使用qPCR定量通过高碘酸盐和增加的温度从掺入耻垢分枝杆菌的人唾液释放的DNA

表17的结果显示高碘酸盐显著地增加从细胞中释放的耻垢分枝杆菌DNA，该细胞最初被“掺入”唾液中并且随后用含有高碘酸盐的BB和BD试剂在70℃下处理20分钟。较低的Ct值是耻垢分枝杆菌DNA更大的量的反映。使用含有高碘酸盐的BA试剂观察到提取效率相似但不那么显著的增加。在最惊人的情况下，相比BD加高碘酸盐，在包含单独的BD试剂的样品中DNA的估计量增加了约100倍，每个反应从150pg增加至16,230pg。对于含有BB的样品，添加高碘酸盐也增加了DNA 100倍，每个反应从70pg增加至6,430pg。对于含有BA的样品，添加高碘酸盐也增加了检测的DNA，每个反应从不可检测增加至1,090pg。这些实验证明，从耻垢分枝杆菌释放的DNA的量适合于通过qPCR分析进行的PCR扩增和微生物特异的鉴定，该耻垢分枝杆菌与含有高碘酸盐和其他试剂的唾液混合并且随后被加热，该PCR分析使用耻垢分枝杆菌特异的引物。

结论

这个实例证明了本发明的从耻垢分枝杆菌释放核酸的化学组合物和方法的有效性，即使该耻垢分枝杆菌被掺入复杂的生物样品。尽管在唾液中发现蛋白质连接的多糖和其他潜在的干扰物质的存在，很小浓度的高碘酸盐在从这个非常顽强的微生物中释放很大比例的核酸非常有效。这证明了通过高碘酸盐实现的DNA从耻垢分枝杆菌释放和检测的100倍的增加，可能增加涂片阴性、MT-阳性样品的检测的敏感性，允许的有效治疗方案早期开始从而减少MDR TB病例的传染性的周期。

实例8：如通过实时PCR确定的，比较通过高碘酸盐和MagNA纯的纯化方法从肉毒梭 菌和难辨梭菌孢子释放的DNA量

梭菌属(Clostridium)是由大约100中革兰氏阳性细菌物种组成的属，属于厚壁菌门(Firmicutes)，其在胁迫下产生顽强的孢子。这些杆状细胞在自然界中普遍存在，并且在土壤中尤其普遍。梭状芽胞杆菌是能动的专性厌氧菌，是引起人类疾病的重要病原体。有五个引起人类疾病的主要物种，即，肉毒梭菌、难辨梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌和索氏梭菌。

由肉毒梭菌产生的孢子是椭圆形的近顶端内生孢子，通常发现于土壤中，并且很难杀死。在海平面，肉毒梭菌孢子可以于沸水温度存活，因此许多食品罐头都是用加压煮沸，该加压煮沸达到甚至更高的温度，足以杀灭孢子。肉毒梭菌在食品和伤口中产生肉毒毒素，其导致肉毒中毒。来自这种细菌的孢子可在蜂蜜中发现，并且在十二个月和更小的孩子中导致婴儿型肉毒中毒。“肉毒杆菌毒素”是一种神经毒素，在美容上用于麻痹面部肌肉减少老化的迹象，以及用于许多治疗应用中。

大约每20位住院患者中有1位将感染医院获得性感染(HAI)。虽然大多数类型的HAI正在下降，由难辨梭菌(一种肠道共生菌)导致的暴发是困扰住院患者和长期的医疗设施的一个日益严重的问题，在这些住院患者和长期的医疗设施中抗生素治疗是常见的。难辨梭菌感染(CDI)通过粪-口途径传播，并且被认为是从胃肠失调(即，正常肠道微生物或菌群的破坏)造成的。抗生素治疗杀死在胃肠道中大多数细菌，这些细菌通常保持难辨梭菌在控制之下。在这种改变的环境中，难辨梭菌复制并产生攻击肠道衬里的毒素，引起从腹泻到威胁生命的炎症和结肠内表的出血的症状。根据疾病控制与预防中心(CDC)，难辨梭菌与美国每年14000人的死亡有关。

在医疗环境中，难辨梭菌通过粪-口途径人对人传播，并且当人类意外从共同的‘接触’表面(如床栏、门把手、坐便器、水槽)吸入孢子时发生疫情。难辨梭菌孢子抵抗热和最常规的表面清洗方法，包括基于酒精的手清洁剂，并且可以在环境中存活数月至数年。针对经常发生的难辨梭菌感染的有效治疗不能普遍获得。矛盾的是，今天，对于难辨梭菌感染的主要治疗是给予更多的抗生素，约20％的患者在一个月内具有复发，而且他们中的许多都反复发作。

许多市场和行业都在寻找有效的方法来消灭有害孢子(和细菌)，包括食品安全(食品/肉类加工厂)、医疗保健、土壤和水样采集(环境测试)、生物安全或生物防御、动物饲料检验、农业/植物科学/工业等。对细菌和/或孢子的致病菌株的检测和特性感兴趣的临床实践和流行病学研究，需要具有优良的敏感性和特异性以及重测信度的更快的替代方法。如今，“黄金标准”测试仍然涉及大便培养，这是一个敏感的检测，但具有很长的周转时间，是资源密集型的，并且需要具有组织培养设施的有经验的实验室。相反，PCR试验测试廉价，具有快速的周转时间、优良的敏感性、特异性和预测值，只要从存在于所收集的生物样品中感兴趣的细菌/孢子提取出足够量的DNA。

本发明人已惊奇地发现，常见的实验室化学品高碘酸盐在弱碱性pH和升高的温度下使用，可以用来从在活跃和休眠两种状态中的微生物中快速和有效地释放核酸。在这个实例中，从肉毒梭菌和难辨梭菌的培养物中制备孢子，并且对两种不同的DNA分离方法的功效进行了比较：1)本发明的高碘酸盐方法和2)可商购的MagNA^TM纯的纯化方法。通过这些方法提取的DNA使用CLIA/CLEP批准的实时PCR(rtPCR)试验来进行定量，该rtPCR对于每个生物体是特异的。

实验方法

[肉毒梭菌和难辨梭菌孢子制备，DNA提取和rtPCR试验是与沃兹沃斯中心生物防御实验室(Wadsworth Center Biodefense Laboratory)(纽约州卫生部门，奥尔巴尼，纽约州，美国)合作进行的。]

肉毒梭菌和难辨梭菌孢子制备

肉毒梭菌B型和难辨梭菌的冷冻储备培养物在具有5％绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂上培养，并在35℃下厌氧孵育24至48小时。初始孵育后，将这些培养物转移到多个(最少10个)脑心浸液琼脂板(Brain Heart Infusion Agar plates)，并在35℃下厌氧孵育长达2周。每3至4天进行孔雀绿孢子染色以监测体外细菌的孢子形成。当孔雀绿染色显示生物体的形成孢子几乎完成时，将孢子收获至5.0mL的PBS(pH 7.4)中，并在室温下保存直到使用。

孢子浓度的确定

将肉毒梭菌和难辨梭菌的每个孢子储备悬浮液在PBS中稀释至10^-2。将这些最终稀释液中的每一个的等分试样(10μL)装入2室的血细胞计数器载玻片的每个清洁的孔中。在40x放大无油下观察血细胞计数器室来进行孢子计数。在血细胞计数器的光场网格上孢子可视化为圆形或椭圆形的黑细胞。肉毒梭菌，检测的极限(LOD)＝30个孢子/反应；难辨梭菌，LOD＝20个孢子/反应。

使用高碘酸盐方法从孢子提取DNA

1.向肉毒梭菌和难辨梭菌的350μL孢子储备悬浮液(上文)添加350μL BD2缓冲液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)。

2.涡旋混合。

3.取出100μL用于培养。

4.添加50μL的300mM(间)高碘酸钠或NPI储备(终浓度30mM)，涡旋混合。

5.在70℃水浴中孵育20分钟。

6.在室温下冷却样品2分钟。

7.取出100μL用于培养。

8.添加20μL的1M Tris pH 7缓冲液(终浓度50mM)。

9.在室温下孵育10分钟。

10.添加20μL的3M醋酸钾(pH 5.5)(终浓度150mM)。

11.在冰上孵育10分钟。

12.以13000rpm离心5分钟。

13.将上清转移到干净的标记的管。丢弃沉淀。

14.加入800μL室温的95％乙醇。

15.反转20次混合。

16.在室温下孵育样品15分钟以沉淀DNA。

17.以15,000rpm离心2分钟以沉淀DNA。

18.轻轻取出并丢弃上清液，小心不要打乱沉淀。

19.将沉淀溶于100μL TE。

20.短暂涡旋以充分重悬DNA。

21.运行CLIA/CLEP批准的对每个生物体特异的rtPCR试验。

使用罗氏公司(Roche)的MagNA ^TM 纯的DNA分离试剂盒从孢子中提取DNA

1.准备10个在每个希望的浓度200μL的肉毒梭菌的和难辨梭菌孢子悬浮液的等分试样(总共30只管)。

2.通过合并38μL蛋白酶K与262μL细菌裂解缓冲液对每个样品制备裂解缓冲液，该262μL细菌裂解缓冲液是来自MagNA纯的LC DNA分离试剂盒III(细菌、真菌)(目录号03264785001，罗氏公司(Roche))。

3.将300μL的裂解缓冲液添加到每个200μL孢子悬浮液。

4.涡旋。

5.在65℃下孵育20分钟。

6.在95℃下孵育10分钟。

7.允许样品在室温下冷却。

8.当冷却时，短暂离心以去除气溶胶。

9.转移500μL每个样品到罗氏MagNA纯的紧凑型样品管。

10.将样品管放置在罗氏MagNA纯的紧凑型仪器上。

11.遵循筛选说明使用DNA血液外部裂解试验方案：样品体积：500μL；流出体积：100μL。

用于肉毒梭菌B型和难辨梭菌的实时PCR

所有rtPCR试验在ABI7500仪器上进行。使用CLIA/CLEP批准的对每个生物体特异的rtPCR试验法(弗罗布莱夫斯基(Wroblewski)等人，2009)单份地分析从每个提取分离的DNA。

结果与讨论

虽然生物样品或细菌/孢子的培养物的机械珠粒打浆可以相当有效地破开微生物，但是它的确会产生气溶胶，该气溶胶增加了传播传染剂的机会并且把实验室人员的健康处于危险之中。因此，非常需要开发非机械的化学方法从顽强的微生物及其孢子中释放总核酸。这个实例证明本发明的“高碘酸盐”方法是快速的、廉价的、简单的化学处理，在肉毒梭菌孢子(图7)和难辨梭菌孢子两者中分离DNA方面，比可商购的来自罗氏公司(Roche)的DNA分离试剂盒(“合作者”的方法)和非常昂贵的自动化系统显著地更加有效(DNA增加8倍)。MagNA^TM纯的试剂盒(“合作者(Collaborator)”，图7和8)利用裂解缓冲液加磁性玻璃颗粒，而本发明的高碘酸盐方法(“高碘酸盐”，图1A和1B)不需要磁珠或具有磁处理能力的复杂的自动化系统甚至从顽强的孢子中分离DNA。

CLIA/CLEP批准的rtPCR试验表明，相比“合作者”的方法，使用“高碘酸盐”方法增加了检测来自肉毒梭菌和难辨梭菌芽孢的DNA的敏感性(Δ3C_t值)，即，高碘酸盐处理的样品导致在rtPCR中在每个LOD始终较低的Ct值。使用高碘酸盐方法对微生物DNA的提取的改善应当解释为用其他CLIA/CLEP批准的从rtPCR试验评估生物样品中的检测敏感性增强。

实例9：如通过对结核分枝杆菌特异的实时PCR确定的，比较通过高碘酸盐方法与 传统的珠粒打浆从结核病阳性的临床痰样品释放的DNA的量。

这个实例提供了通过两种方法纯化的TB阳性痰样品(由FIND惠赠，参见下文)的临床评价的并排比较。具体地，对1)“治疗标准”和2)“高碘酸盐方法”两种不同的DNA提取方法的影响在CLIA/CLEP批准的rtPCR试验的敏感性上进行了比较，该rtPCR试验靶向RD4结核分枝杆菌复合体(MTBC)差异区域(RD)(哈尔斯(Halse)等人，2011)。

与“高碘酸盐方法”相反，“治疗标准”方法包括珠粒打浆、机械方法以破开痰样品中的细菌。虽然机械珠粒打浆可以有效地破开生物体，但是它在实验室的确产生危险的气溶胶。因此，非常希望开发一种有效的、非机械的、化学的方法以安全地从结核分枝杆菌释放DNA，而不会对诊断测试的临床敏感性产生负面影响。

实验方法

结核分枝杆菌阳性痰样品的生活力的确认

样品

对于本实例，来自TB阳性患者的未加工的痰样品由创新诊断基金会(Foundationfor Innovative Diagnostics，FIND)结核病标本库惠赠。一式两份的0.5mL的等分试样从30位患者样品提供并且冷冻储存。利用培养和涂片分析，FIND将这30个样品分类为‘涂片+、培养+(高)’，‘涂片+、培养+(中)’或‘涂片-、培养+(低)’TB阳性。

将等分试样冷冻运到沃兹沃斯中心分枝杆菌学实验室(Wadsworth CenterMycobacteriology Laboratory)(纽约州卫生部门，奥尔巴尼，纽约州，美国)以进行进一步的分析，该实验室是CLIA/CLEP批准的临床实验室。

在抵达沃兹沃斯之后，将来自30个捐赠者的等分试样在冰上解冻，并且在这些10个‘高’，10个‘中’和10个‘低’的TB等分试样中的分枝杆菌的生存能力用培养和涂片镜检来确认。

使用高碘酸盐方法从TB阳性痰中提取DNA

1.将0.5mL BD2缓冲液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)添加到每个0.5mL痰等分试样；涡旋混合。

2.添加蛋白酶K(400μg)，并在50℃水浴中孵育2小时。

3.转移0.4mL至新的管并添加NPI(终浓度30mM)，涡旋混合。

4.在70℃水浴中孵育20分钟。

5.在室温下冷却样品2分钟。

6.添加1M Tris缓冲液(pH 7)至50mM的终浓度。

7.在室温下孵育10分钟。

8.添加3M醋酸钾(pH 5.5)至150mM的终浓度。

9.在冰上孵育10分钟。

10.以13000rpm离心5分钟。

11.将上清转移到干净的标记的管。丢弃沉淀。

12.添加2体积的室温的95％乙醇。

13.反转20次混合。

14.在室温下孵育样品10分钟以沉淀DNA。

15.以15,000rpm离心2分钟以沉淀DNA。

16.轻轻取出并丢弃上清液，小心不要打乱沉淀。

17.将沉淀溶于200μL TE。

18.短暂涡旋以充分重悬DNA。

使用“治疗标准”从TB阳性痰中提取DNA

1.将0.5mL 3.5％NaOH添加到每个0.5mL痰等分试样；涡旋混合。

2.在室温下孵育15分钟。

3.添加无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)使体积至10mL。

4.以5,000rpm离心20分钟以沉淀细菌。丢弃上层清液。

5.在0.5mL无菌PBS中重悬沉淀。

6.预留300μL重悬的细菌用于培养。

7.向剩余200μL重悬的细菌中，加入200mg的105-150微米的玻璃珠粒。

8.珠粒打浆2个周期，每个周期1分钟，随后使用微型珠粒打浆机(BioSpec产品)在冰上进行1分钟。

对结核分枝杆菌进行实时PCR和抗生素抗性焦磷酸测序

使用CLIA/CLEP批准的rtPCR试验，来自每个纯化的痰样品的5μL‘纯的’DNA和5μL稀释的(1:10)DNA的重复反应在ABI7500实时PCR仪上扩增，该rtPCR试验靶向RD4结核分枝杆菌复合体(MTBC)差异区域(RD)(哈尔斯(Halse)等人，2011)。小于37的阈值循环(C_t)值报道为阳性，并且值大于37的样品被重测；如果结果是相同的，结果被报告为阳性，并且如果它们不同，它们被报告为不确定的。

结果与讨论

相比于传统的珠粒打浆方法(“治疗标准”)，本发明的化学“高碘酸盐法”明确导致结核分枝杆菌特异性检测的增加的敏感性，特别是对于通过培养和涂片镜检归类为‘低’和‘中’TB阳性的痰样品。在这个实例中，直到使用“治疗标准”方法提取的DNA被稀释10倍才可以检测到在‘中’和‘高’TB阳性痰样品中的结核分枝杆菌(表18)；然而利用“高碘酸盐方法”分离DNA后87％‘低’TB负荷的痰样品被检测为阳性(表18)。

表18.使用2种不同的方法提取DNA后被检测为TB阳性的痰样品的百分比

*2个数据从低TB样品中排除-任何提取方法或培养后未检测

图9表明相比“治疗标准”或SOC，使用“高碘酸盐方法”提取的所有TB阳性痰样品中结核分枝杆菌的检测极限的显著的改善。例如，‘低’TB阳性痰的C_t值的范围对于“高碘酸盐方法”为31.4-45.0，相比之下对于SOC为38.5-45.0；‘中’TB阳性痰的C_t值的范围对于“高碘酸盐方法”为20.9-32.3，相比之下对于SOC为26.8-45.0；‘高’TB阳性痰的C^t值的范围对于“高碘酸盐方法”为19.8-28.3，相比之下对于SOC为27-2-39.3；图10显示通过DNA提取方法安排的图9的数据。当使用本发明的高碘酸盐方法来提取DNA时，对于所有TB负荷水平C_t值始终较低。这个由改善的DNA提取提供的较低的检测极限，帮助确保对来自患者痰样品的结核分枝杆菌的精确诊断。

实例10：基于高碘酸盐方法比凯杰公司(Qiagen)纯化释放显著更多的结核分枝杆 菌DNA

自1980年以来结核病在发达以及发展中国家的复苏与HIV传染病、耐药菌株的出现、和从疾病流行率很高地区的移民增加相关(科比特(Corbett)等人，2003)。结核病是发病率的最常见的原因之一和在欠发达国家生活的HIV阳性成年人总死亡的最常见的原因，但它是可以预防和治疗的疾病。由于从人到人传播的高风险，结核分枝杆菌的快速检测对疾病管理至关重要。美国疾病控制与预防中心(CDC)建议收到的临床样品同时通过培养、抗酸杆菌(AFB)染色、核酸扩增(NAA)试验方案进行分析(结核病在成人和儿童中的诊断标准与分类(Diagnostic Standards and Classifications of Tuberculosis in Adults andChildren)；美国胸科学会(American Thoracic Society)和CDC，2000)。虽然培养仍然是最后确定的“黄金标准”，它可能需要长达2至8周。AFB染色是快速的，但具有低敏感性和低特异性，因为它不区分来自结核分枝杆菌复合体(MTBC)的成员与非结核分枝杆菌(NTM)。因此，快速鉴定，对结核病的传播至关重要，越来越多地依赖于核酸提取和分子诊断测试。

MTBC成员在毒力属性、耐药模式和宿主偏好方面不同。这些物种的快速区分以确定动物传染的或人类起源的结核疾病或指导治疗可以有益于公众健康和病人管理。哈尔斯(Halse)等人(2010；2011)开发了实时PCR试验用于区分密切相关的生物体，结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛BCG分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、和卡内蒂分枝杆菌。MTBC成员的基因组之间的差别区域(RD)的存在或不存在允许设计一种廉价从、快速、单管、五丛的实时PCR(rtPCR)试验以区分临床样品中的这些物种。

在这样的rtPCR的上游；然而，至关重要的是临床标本以这样的方式处理以便尽可能地回收最大量的DNA。在历史上，定量研究已经显示必须有5000至10000个杆菌/毫升标本以允许在染色涂片中的细菌检测(霍比(Hobby)等人，1973)。相反，需要10至100个生物体用于阳性培养(耶格尔(Yeager)等人，1967)。在含有少至10个杆菌的整体标本中的分枝杆菌的分子检测对诊断测定表现出真正的挑战，尤其是当测试输入量为总标本的一小部分时。与培养和染色涂片相反，分子方法检测来自接受治疗的患者标本中的活的和死亡或濒临死亡的杆菌的DNA，允许治疗前和治疗过程中对MTBC生物体的鉴定。

明显存在对开发优越的提取方法的需求，该提取方法有助于从患者标本中的坚韧的微生物中快速恢复全部或大部分DNA。从复杂样品(像痰)的DNA提取的改善，直接转化为对结核病和其他疾病的基于诊断性(Dx)/DNA测定的增加的敏感性，并且最终用适当的药物治疗来更快地治疗患者。这一需求被在多个国家中的多重耐药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)的出现以及近期在南非的迅速致命的HIV相关的结核病的流行进一步加剧(甘地(Ghandi)等人，2006；拉维格里昂(Raviglione)，2006)。由于差的控制措施，一些国家现在正面临的TB控制的可能最坏的情形之一：HIV感染和高度耐药TB的致命组合(拉维格里昂(Raviglione)，2006)。

实验方法

掺入结核分枝杆菌的生物样品的制备

为了模拟结核病阳性痰，将减毒结核分枝杆菌(aMTB)以5×10⁶菌落形成单位/毫升(cfu/mL)掺入健康人的唾液样品。

使用高碘酸盐方法从结核分枝杆菌阳性唾液中提取DNA[“DNA Genotek最优方法” 或“选项1”]

1.将等体积的掺入aMTB的唾液与BD2缓冲液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)混合。

2.在室温下孵育15分钟。

3.以5,000rpm离心20分钟。丢弃上层清液。

4.将沉淀重悬浮于50％BD2缓冲液中。

5.添加NPI至30mM的终浓度，涡旋混合。

6.在70℃水浴中孵育20分钟。

7.在室温下冷却样品2分钟。

8.添加1M Tris缓冲液(pH 7)至50mM的终浓度。

9.在室温下孵育10分钟。

10.添加3M醋酸钾(pH 5.5)至150mM的终浓度。

11.在冰上孵育10分钟。

12.以13000rpm离心5分钟。

13.将上清转移到干净的标记的管。丢弃沉淀。

14.加入800μL室温的95％乙醇。

15.反转20次混合。

16.在室温下孵育样品15分钟以沉淀DNA。

17.以15,000rpm离心2分钟以沉淀DNA。

18.轻轻取出并丢弃上清液，小心不要打乱沉淀。

19.将沉淀溶于100μL TE。

20.短暂涡旋以充分重悬DNA。

使用高碘酸盐方法从结核分枝杆菌阳性唾液中提取DNA随后是凯杰公司(Qiagen) 纯化[“选项2”]

1.将等体积的掺入aMTB的唾液与BD2缓冲液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)混合。

2.在室温下孵育15分钟。

3.以5,000rpm离心20分钟。丢弃上层清液。

4.将沉淀重悬浮于50％BD2缓冲液中。

5.添加NPI至30mM的终浓度，涡旋混合。

6.在70℃水浴中孵育20分钟。

7.在室温下冷却样品2分钟。

8.添加1M Tris缓冲液(pH 7)至50mM的终浓度。

9.在室温下孵育10分钟。

10.添加等体积的凯杰(Qiagen)AL缓冲液。

11.对于凯杰公司(Qiagen)QIAamp DNA微型试剂盒(目录号51304)遵循凯杰QIAMP程序。

使用BD2缓冲液和凯杰(Qiagen)纯化从结核分枝杆菌阳性唾液中提取DNA[“选项 3”]

1.将等体积的掺入aMTB的唾液与BD2缓冲液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)混合。

2.在室温下孵育15分钟。

3.以5,000rpm离心20分钟。丢弃上层清液。

4.将沉淀重悬浮于50％BD2缓冲液中。

5.添加等体积的凯杰(Qiagen)AL缓冲液。

6.对于凯杰公司(Qiagen)QIAamp DNA微型试剂盒(目录号51304)遵循凯杰QIAMP程序。

用标准的氢氧化钠/NALC方法和凯杰(Qiagen)纯化从结核分枝杆菌阳性唾液中提 取DNA[“标准的凯杰方法”或“选项4”]

1.新鲜制备和高压灭菌4％氢氧化钠(NaOH)溶液。

2.新鲜制备和高压灭菌2.9％柠檬酸钠溶液。

3.在使用前，混合等体积的NaOH和柠檬酸钠溶液。

4.添加N-乙酰基-L-半胱氨酸(NALC)粉末以达到0.5％的终浓度。充分混合并在同一天使用。

5.混合等体积的掺入aMTB的唾液和NaOH/NALC/柠檬酸溶液。

6.在室温下孵育15分钟。

7.添加无菌PBS以使总体积为50mL。

8.以5,000rpm离心20分钟。丢弃上清液。

9.将沉淀重悬于PBS中。

10.添加等体积的凯杰(Qiagen)AL缓冲液。

11.对于凯杰公司(Qiagen)QIAamp DNA微型试剂盒(目录号51304)遵循凯杰QIAMP程序。

rtPCR条件

在这个实例中，使从掺入aMTB的唾液样品中分离的DNA(选项1-4，上文)经受特异于分枝杆菌的rtPCR试验，RD4Taqman实时PCR测定。RD4的引物如下：RD4-正向5’-CCA CGACTA TGA CTA GGA CAG CAA-3’和RD4-反向5’-AAG AAC TAT CAA TCG GGC AAG ATC-3’(哈尔斯(Halse)等人(2011))。

图11阐明了通过分子检测基于计算出的基因组当量(GE)回收的aMTB DNA的百分比(回收GE/输入GE*100)。

结果与结论

最近开发的分子测定提供在培养材料的结果可用之前帮助疑似结核病患者的初期管理的可靠结果，并提供在从临床标本收集的短短1-2天内预测结核分枝杆菌阳性标本的抗生素耐药性的能力。然而，结核病诊断和一般基于PCR的系统需要DNA的有效分离和纯化程序，其被痰的物理特点和缺乏同质性以及被分枝杆菌细胞壁的高脂质含量进一步复杂化。因此，所有对分枝杆菌的DNA提取可用的技术需要操纵步骤，该步骤导致起始材料不可预测的损失，其可导致假阴性诊断。

本实例比较了针对生物标本的多种DNA分离和处理方法。具体地，结核病阳性痰通过在健康捐赠者的唾液样品中掺入aMTB来模拟。标本的常规NaOH/NALC净化，接着用可商购的凯杰QIAamp DNA微型试剂盒进行DNA提取(选项4)，导致在仅2.2％的aMTB DNA的回收率。相比之下，本发明的高碘酸盐方法(选项1)导致71.3％aMTB DNA的显著回收率；比选项4回收率增加了70％。选项3证明标本与BD2缓冲液的初始孵育不是选项1的显著结果的原因，因为BD2缓冲液接着凯杰提取回收了aMTB原掺入量的1.6％。当高碘酸盐处理的标本用凯杰的试剂盒进行提取(选项2)时，只有26.4％的aMTB DNA被回收；相比传统的NaOH/NACL/凯杰试剂盒(选项4)，相当于DNA回收率增加24％。

高碘酸盐方法有效地从结核分枝杆菌掺入标本中分离出大多数的DNA，并因此可用于显著增加诊断/分子测定已知的好处，即，高水平的特异性和敏感性，短的周转时间和成本效益。这些改善使医疗保健系统节省多达8周的时间来通过培养区分MTBC的物种，提供信息以实现适当的、快速的药物治疗，具有最小的副作用，以及早期洞察TB传播。

实例11：通过高碘酸盐的蛋白选择性降解

高碘酸盐通常用于溶液中打开连二醇之间的糖环，允许RNA的3’-末端的选择性标记。出人意料的是，本发明人已经确定高碘酸盐在“杀死”或中和特定的酶(如胰核糖核酸酶A(RNA酶A))的活性方面也是非常有效的，并且高碘酸盐也降解某些其他的蛋白质。

在这个实例中，RNA酶A，切割单链RNA的胰核糖核酸酶，被证明是高碘酸盐的靶标。RNA酶的酶活性通过监测其降解RNA底物(从HeLa细胞纯化的RNA)的能力进行评估。如果RNA酶的酶活性被高碘酸盐负面地影响，则HeLa细胞核糖体RNA基本上不会被降解，如通过琼脂糖凝胶电泳所评估。

实验方法和材料

用高碘酸盐处理纯的胰核糖核酸酶A

1.将纯的胰核糖核酸酶A(西格玛公司(Sigma))(0.1-0.2μg/μL)添加到有或没有15mM高碘酸盐的缓冲液(1％SDS、25mM Li-CDTA、125mM LiCl、25mM甘氨酸，pH 10.5)。

2.将混合物在70℃下加热15分钟。

3.将10μL混合物装载到10％SDS-PAGE凝胶上，并在160伏特运行60分钟。

4.SDS-PAGE凝胶用热的考马斯蓝染色30分钟，然后在室温下脱色2小时，并在可见光下拍照(图12)。

用高碘酸盐处理耻垢分枝杆菌裂解物

1.从平板生长的耻垢分枝杆菌的悬浮液制备洗涤的沉淀。

2.根据制造商的说明在一个微型珠粒打浆机-16(Mini-BeadBeater-16)(BioSpec公司)进行珠粒打浆。简而言之，将洗涤的细菌沉淀物悬浮于1000μL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并转移到含有约100μL的100μm的玻璃珠粒(Polyscience公司)的螺旋盖聚丙烯离心管中。

3.将管固定到仪器，并以两个1分钟的周期(3,450振动/分钟)进行剧烈搅拌。在周期之间将样品在冰上冷却1分钟。

4.将悬浮液转移到1.5mL微型离心管中，并且通过在微型离心机中在14,000rpm下离心5分钟除去完整的细胞和残骸。

5.将上清液取出并且均等地分到两个1.5mL微型离心管中。将一个级分用等体积的PBS稀释(对照，参见图13)。将第二级分与等体积的缓冲液(1％SDS、25mM Li-CDTA、125mMLiCl、25mM甘氨酸，pH 10.5)混合，分成3份，加入高碘酸盐至0、7.5mM或15mM的终浓度。

6.将管在70℃下加热15分钟。对照样品不加热。

7.将7.5μL或15μL混合物装载到10％SDS-PAGE凝胶上，并在160伏特运行60分钟。

8.SDS-PAGE凝胶用热的考马斯蓝染色30分钟，然后在室温下脱色2小时，并拍照(图13)。

用胰核糖核酸酶A和高碘酸盐处理纯化的HeLa核酸

1.在50mM甘氨酸(pH 10.5)中制备10μg/mL的纯的胰核糖核酸酶A(西格玛公司)(RNA酶A)溶液。

2.将该溶液在两只管中平分，并且一个等分试样用15mM高碘酸盐处理。

3.两只管在70℃下加热15分钟。

4.处理过的RNA酶A管在50mM ADA缓冲液(pH 6.5)中稀释200-1000倍。

5.将稀释的RNA酶A与HeLa核酸(DNA和RNA)一起在50℃下孵育20分钟。

6.添加SDS至0.5％‘停止’该反应。

7.用1.0％琼脂糖凝胶电泳分析处理的HeLa RNA的完整性(图14)。

结果与结论

图12显示了令人惊奇的结果：全长纯化的RNA酶蛋白质的质量在与高碘酸盐短暂孵育之后降低了；在凝胶中未观察到降解产物(更小的蛋白质片段)。而且，仔细检查图13显示在与高碘酸盐孵育之后在耻垢分枝杆菌的无细胞的裂解液中某些(未知)蛋白质条带的选择性丢失。在增加的浓度的高碘酸盐(7.5mM和15mM)的存在下，一些蛋白质条带选择性地降解或从凝胶完全消失，表明高碘酸盐具有多个蛋白质靶标。

如在图14中所示的数据所证明，如果RNA酶A与RNA接触前与高碘酸盐预孵育一小段时间，核糖体RNA不再被RNA酶A降解。需要添加较大量的RNA酶A(50ng)来检测少量的未能被高碘酸盐灭活的残留活性的RNA酶。因此，除了其对总细胞蛋白的影响，高碘酸盐可以靶向并抑制特定降解酶的酶促作用。

实例12：高碘酸盐处理消除炭疽杆菌、肉毒杆菌和难辨梭菌孢子的生存能力

炭疽热是一种急性的、通常致命的、由棒状革兰氏阳性好氧性细菌炭疽杆菌引起的疾病，该炭疽杆菌通常以内生孢子形式安置在土壤中。像肉毒梭菌和难辨梭菌，炭疽杆菌能形成休眠的内生孢子，其很难根除，在恶劣条件下生存几十年甚至几百年。当孢子被吸入、摄入、或接触到宿主的皮肤损伤时，他们可能成为再活化的并迅速繁殖。炭疽孢子的顽强性以及它们在体外易于生产，使得它们非常适合于用作(以粉末和气溶胶形式)生物武器。

尽管前面的实例证明了高碘酸盐方法相比标准方法对于从孢子释放核酸的有效性，重要的是也理解使用高碘酸盐处理后任何活孢子是否残留。

实验方法

炭疽杆菌、肉毒梭菌、和难辨梭菌孢子的制备

肉毒梭菌B型和难辨梭菌的冷冻储备培养物在具有5％绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂上培养，并在35℃下厌氧孵育24至48小时。初始孵育后，将这些培养物转移到多个(最少10个)脑心浸液琼脂板(Brain Heart Infusion Agar plates)，并在35℃下厌氧孵育长达2周。

炭疽杆菌斯特恩(Sterne)菌株的冷冻储备培养物在具有5％绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂上培养，并在35℃、5％CO₂下孵育24小时。初始孵育后，将这些培养物转移到多个(最少10个)杆菌孢子形成琼脂板(Bacillus Sporulation Agar plates)，并在35℃、CO₂下厌氧孵育长达2周。

每3至4天进行孔雀绿孢子染色以监测体外细菌的孢子形成。当制备的孔雀绿染色显示生物体的形成孢子几乎完成时，将孢子收获至5.0mL的PBS(pH 7.4)中，并在室温下保存直到使用。

孢子浓度的确定

将肉毒梭菌和难辨梭菌的每个孢子储备悬浮液在PBS中稀释至10^-2。将炭疽杆菌斯特恩(Sterne)菌株在PBS中稀释至10^-3。将这些最终稀释液中的每一个的等分试样(10μL)装入2室的血细胞计数器载玻片的每个清洁的孔中。在40x放大无油下观察血细胞计数器室来进行孢子计数。在血细胞计数器的光场网格上孢子可视化为圆形或椭圆形的黑细胞。炭疽杆菌，检测极限(LOD)＝53个孢子/反应；肉毒梭菌，LOD＝30个孢子/反应；难辨梭菌，LOD＝20个孢子/反应。

使用标准和高碘酸盐方法处理孢子

1.为每种生物体以要求的浓度制备700μL的孢子储备悬浮液。

2.将每个样品分成2x 350μL体积。

3. 350μL用于WC BDL标准方法(“合作者”)：

a.取出50μL等分试样以通过涂抹于具有5％绵羊血胰蛋白酶大豆琼脂上确认孢子是有生活力的(参见下文)。

4. 350μL用于高碘酸盐方法：

a.将350μL BD2缓冲液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5添加至炭疽杆菌、肉毒梭菌、难辨梭菌的350μL孢子储备悬浮液。

b.涡旋混合。

c.取出100μL用于培养(“高碘酸盐前”)。

d.添加50μL的300mM(间)高碘酸钠或NPI储备(终浓度30mM)，涡旋混合。

e.在70℃水浴中孵育20分钟。

f.在室温下冷却样品2分钟。

g.取出100μL用于培养(“高碘酸盐后”)。

培养孢子以确定生存能力

炭疽杆菌：将等分试样直接涂抹于具有5％绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂上，并在35℃、5％CO₂下孵育24小时。

肉毒梭菌和难辨梭菌：将等分试样直接涂抹于具有5％绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂上，并在35℃下厌氧孵育24至48小时。

结果与讨论

这个实例证明本发明的“高碘酸盐”方法是在降低来自炭疽杆菌(图15)、肉毒梭菌(图16)、和难辨梭菌(图17)的顽强的孢子的生存能力方面非常有效。高碘酸盐处理(高碘酸盐后)显著地降低了炭疽杆菌孢子的生存能力，但使用一次处理并没有根除存在的所有孢子。相比之下，高碘酸盐处理后通过培养没有肉毒梭菌和难辨梭菌是有生活力的。有趣的是，单独的BD2缓冲液(高碘酸盐前)对肉毒梭菌和难辨梭菌(但不是炭疽杆菌)孢子生存能力具有显著的影响，表明这些微生物比炭疽杆菌更容易溶解。

实例13：使用本发明来检测在唾液和口腔清洗标本中的分枝杆菌

根据世界卫生组织，在2012年，130万人死于TB，860万人患上了结核病，并且估计在全世界有53万<15岁的儿童患上这种传染病。TB是通过细小的呼吸飞沫从被感染的人传播的空中疾病。患有TB的病人是最有可能传播给与他们有密切和长时间接触的人，如家庭成员、朋友和同事。

小儿TB的诊断受获得儿童痰标本的困难和他们的往往需要侵入性操作(如胃抽吸或支气管镜检)的疾病的少菌性质所阻碍。如果TB可以从唾液或口腔样品进行诊断，收集可以很容易在野外或诊所进行。然而，使用传统的DNA提取方法，在TB感染的个体的唾液中丰富的MTB被认为太低的唾液而不被认为是用于活性肺TB的诊断的可靠样本类型。

如今，诊断实验室主要依靠痰标本来进行肺TB的诊断。然而，许多患者(包括婴儿和儿童)都不能咳出痰液，使用于TB诊断性研究的替代的非侵入性样品很有价值。几个研究已经评估了使用口腔清洗标本(戴维斯·JL(Davis Jl)等人，2009)和唾液样本(亚森·G(Yassen G)等人，2012)用于活性TB的检测。在不能产生痰的患者中，相比诱导痰，唾液样品和/或口腔清洗标本可能更容易和更安全地获得，诱导痰对于低氧性患者可能是不舒服的和危险的并且对于工作人员可能是费时和有害的。对于口腔清洗标本的收集，受试者被指示大力咳嗽5次，然后用10mL的无菌盐水漱口60秒。相比咳出痰，使用口腔清洗标本和唾液样本产生较少的感染性气溶胶。

众所周知，PCR诊断疾病的敏感性可以通过优化DNA提取技术来改善。实例9(上文)表明，本发明的高碘酸盐方法比使用珠粒打浆的治疗标准方法从MTB释放显著更多的DNA。此外，实例10表明，基于高碘酸盐方法比凯杰DNA提取方法释放显著更多的MTB DNA在唾液中。因此，可以预料，通过利用本发明来提取MTB DNA获得的增加的检测敏感性将第一次使广泛采用唾液和/或口腔清洗标本在有症状的个体(特别是儿童)中作为肺TB的初步诊断标本成为可能。尽管在活跃感染个体的唾液中MTB的数量很低，预期通过基于高碘酸盐方法获得的检测敏感性的提高将使得使用这种容易收集的样品类型的MTB的更可靠的分子检测成为可能。唾液和/或口腔清洗标本可以很容易地从有症状的个体中收集以快速筛选TB并在较早阶段开始治疗，这反过来将减少与这种感染性疾病相关的传播和发病率。

同样地，可以预期本发明的组合物也可以与支气管肺泡灌洗样品、尿液、粪便和胃抽出物一起用来从MTB提取DNA，导致在分子诊断测试中TB检测的敏感性增加和鉴定的TB病例数增加。

实例14：使用高碘酸盐从广泛的微生物中释放核酸

在这个实例中，用高碘酸盐处理了一组不同的微生物，包括革兰氏阳性细菌(苏云金芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、耻垢分枝杆菌)、革兰氏阴性细菌(卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、小肠结肠炎耶尔森菌、蜃楼弗朗西斯氏菌)和酵母(白色念珠菌)。使用2种不同的方法评估了核酸从这些微生物的释放，即在酸提取HPLC方法和实时PCR(qPCR)。

实验方法

使细菌和酵母在如下推荐的生长培养基中和推荐的温度下生长：YEPD液体培养基(白色念珠菌)、具有0.1％半胱氨酸的胰蛋白酶大豆液体培养基(蜃楼弗朗西斯氏菌)、脑心浸液液体培养基(小肠结肠炎耶尔森菌、卡他莫拉菌)或胰蛋白酶大豆液体培养基(苏云金芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、耻垢分枝杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌)。小肠结肠炎耶尔森菌和白色念珠菌在30℃下生长，而其他微生物在35℃下生长。

过夜后，生长的细胞通过在7,500g离心8分钟来收集；丢弃上清液。细菌沉淀用冷的磷酸盐缓冲盐水通过在7,500g离心6分钟洗涤一次，并且丢弃上清液。洗涤的细菌沉淀重悬浮于1.5mL冷水中。

将180μL的细胞悬浮液与200μL的BD2缓冲液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)混合，并且将20μL的300mM高碘酸盐或无RNA酶/DNA酶的水(对照)加入到未接收高碘酸盐的样品。将样品在35℃，70℃或80℃下孵育20分钟。将样品在14,000rpm离心5分钟。将上清液转移到新的管并且丢弃沉淀。

将所有样品均通过添加16μL TK缓冲液(500mM Tris、1.5M醋酸钾，pH 5.5)纯化，首先在室温下孵育5分钟，然后在冰上孵育15分钟，接着在14,000rpm离心5分钟。每个样品的一半体积用2X体积的冷的95％乙醇在-20℃下沉淀1小时；另一半通过添加盐酸至0.2N的终浓度来进行酸水解，并在60℃下孵育60分钟。向所有酸水解的样品中添加NaOH至过量0.1N，接着在100℃下孵育10分钟。为了中和样品用于反相HPLC，将300μL的500mM ADA pH6.5添加到样品，并且样品持续3分钟在14,000rpm下离心5分钟。上清液通过HPLC分析，而且丢弃任何不溶的物质。

将乙醇中的样品在14,000rpm下离心3分钟，除去上清液，并将沉淀溶解在50μL冷的无RNA酶/DNA酶水中。适用1μL纯化的物质在重复的25μL PCR反应中作为模板。参见实例6使用通用细菌引物的实时PCR的条件。

通用的真菌引物是F:5’-gcatcgatgaagaacgcagc-3’和R:5’-tcctccgcttattgatatgc-3’。每个25μL PCR反应含有2.0mM MgCl₂、0.2mM dNTPs、1.0μMSyto 9、4.0pmole通用真菌引物F、4.0pmole通用真菌引物R、2.0μg牛血清白蛋白(BSA)、1UFastStart Taq DNA聚合酶(罗氏公司(Roche))和1×FastStart PCR预混液。通用真菌引物的循环条件如下：95℃持续2分钟x 1，(95℃持续20秒，56.5℃持续30秒，72℃持续25秒)x38。

结果与讨论

显然，在高碘酸盐的存在下比没有它从广泛的微生物中释放显著更多的DNA，如通过实时PCR(表19-21)和酸提取HPLC方法(表22-30)所示。高碘酸盐的这种效果似乎是温度依赖的，最佳核酸释放发生在70-80℃。高碘酸盐从革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、以及真菌中释放核酸。有趣的是，高碘酸盐从金黄色葡萄球菌释放较少量的核酸，如通过HPLC方法(但不是实时PCR)检测的。

表19：使用通用细菌引物的实时PCR的C_t值。

表20：使用通用细菌引物或通用真菌引物的实时PCR的C_t值。

表21：使用通用细菌引物的实时PCR的C_t值。

表22：如通过酸提取HPLC方法确定的从蜃楼弗朗西斯氏菌中释放的DNA(％)

表23：如通过酸提取HPLC方法确定的从金黄色葡萄球菌中释放的DNA(％)

表24：如通过酸提取HPLC方法确定的从耻垢分枝杆菌中释放的DNA(％)

表25：如通过酸提取HPLC方法确定的从苏云金芽孢杆菌中释放的DNA(％)

表26：如通过酸提取HPLC方法确定的从小肠结肠炎耶尔森菌中释放的DNA(％)

表27：如通过酸提取HPLC方法确定的从白色念珠菌中释放的DNA(％)

表28：如通过酸提取HPLC方法确定的从卡他莫拉菌中释放的DNA(％)

表29：如通过酸提取HPLC方法确定的从肺炎克雷佰菌中释放的DNA(％)

表30：如通过酸提取HPLC方法确定的从铜绿假单胞菌中释放的DNA(％)

实例15：使用高碘酸盐用于从存在于不同生物样品类型中的结核分枝杆菌释放 DNA

可能在各种天然的环境中找到微生物，宿主生物体和生物样品。这个实例显示，DNA提取的本发明的化学“高碘酸盐方法”是适合于检测顽强的生物体，例如，来自不同复杂程度的生物样品的结核分枝杆菌。具体地，结核分枝杆菌DNA是从人类尿液和粪便样品中回收。

实验方法

掺入结核分枝杆菌的生物样品的制备

为了模拟结核阳性样品，将来自健康供体的1mL的尿液或粪便(从收集到2mL粪便匀浆缓冲液中的约400mg粪便的制备(美国系列号61/949,692))样品掺入减毒结核分枝杆菌(aMTB)至大约3×10⁶cfu/mL的终浓度。

使用“高碘酸盐方法”从结核分枝杆菌阳性尿液和粪便中提取DNA

1.将200μL的掺入aMTB的尿液或粪便和等体积的BD2缓冲液混合

2.添加40μL NPI(终浓度30mM)，涡旋混合，并在70℃下孵育20分钟

3.在室温下冷却样品2分钟。

4.添加1M Tris缓冲液(pH 7)至50mM的终浓度

5.在室温下孵育10分钟

6.添加3M醋酸钾(pH 5.5)至150mM的终浓度

7.在冰上孵育10分钟

8.在15,000x g下离心5分钟

9.将上清转移到新的管，并丢弃沉淀

10.添加800μL室温95％乙醇并反转20次混合

11.在室温下孵育样品15分钟以沉淀DNA

12.在15,000x g下离心2分钟以沉淀DNA

13.小心取出并丢弃上清液，小心不要打乱沉淀

14.添加100μL TE以再水化沉淀。

实时PCR

将从掺有aMTB的尿或粪便中分离的DNA用于在实例9和10中所描述的RD4Taqman实时PCR试验。在试验之前对粪便的DNA稀释1:100，并且在每种情况下使用5μL。

结果与结论

在这个实例中，在100％测试的情况下使用“高碘酸盐方法”提取的DNA被检测为TB阳性(表31)，表明本发明在释放从低复杂性(主要是水性的、均质的、pH值中性溶液)到更高复杂性(半固体、不均匀的、pH值可变的复合材料)范围的样品释放功能性DNA是有效的。

表31：使用“高碘酸盐方法”提取DNA后，检测出TB阳性的尿液和粪便样品的百分比。

实例16：使用高碘酸盐用于传染病样品的生物安全性。

持续上升的全世界TB感染需要涉及检测、治疗和预防的健康的医学响应。这种框架取决于积极参与具有高度传染性样品的处理的实验室以及相关的科研人员的大型网络。鉴于TB很容易传播，需要复杂的、高级别生物安全柜(BSC)来处理。而且，这些工人处于感染的潜在较高风险中。具有迅速使这些样本“生物安全”(即，不再有生活力)并且因此搬迁至更加基础的实验室用于下游分析的能力的组合物是在这一领域中明显的优势。

在这个实例中，在用和不用高碘酸盐的处理试验方案之后获得的细菌沉淀从生物安全性的视角来进行评估，以确保材料可以安全地从BSL-3(生物安全3级)搬迁至BSL-2实验室的生物套房用于分析。

实验方法

掺入结核分枝杆菌的生物样品的制备

为了模拟结核病阳性痰，将具有如下大概储备浓度的减毒结核分枝杆菌(aMTB)掺入来自健康捐赠者的唾液样品。

1. 7.5x 10⁹cfu/mL(高负载)

2. 7.5x 10⁷cfu/mL(中负载)

根据以下组来制备掺入的唾液样品，并且使用高负载储备浓度或中负载储备浓度来制备每个组：

A.1.0mL唾液+1.0mL BD2缓冲液+100μL aMTB储备液：无NPI处理

B.2.0mL唾液+100μL aMTB储备液：无NPI处理

C.2.0mL唾液+100μL aMTB储备液：NPI处理

D.1.0mL唾液+1.0mL BD2缓冲液+100μL aMTB储备液：NPI处理

在各组中aMTB的终浓度为约3.75×10⁸cfu/mL(高负载样品)或约3.75×10⁶cfu/mL(中负载样品)。每只管短暂地涡旋混合，并且将样品处理如下：

用于组A和组B样品的试验方案

1.将每个样品等分至3只新的1.5mL离心管，每管500μL

2.将管在3500x g下离心20分钟

3.取出并丢弃悬浮液

4.将沉淀重悬浮于50μL的无菌PBS中

5.仔细地将PBS沉淀混合物应用到Lowenstein-Jansen培养基管(LJ斜面)的顶边，并轻轻左右摇摆来分配样品。

6.在35℃下孵育42天并对生长进行评分

用于组C和组D样品的试验方案

1.将每个样品等分至3只新的1.5mL离心管，每管500μL

2.将管在3500x g下离心20分钟

3.取出并丢弃悬浮液

4.将沉淀重悬浮于500μL的50％BD2缓冲液中

5.添加50μL NPI(终浓度30mM)，涡旋混合，并在70℃下孵育20分钟

6.在室温下冷却样品2分钟。

7.添加1M Tris缓冲液(pH 7)至50mM的终浓度

8.将管在3500x g下离心20分钟

9.取出并丢弃悬浮液

10.在500μL的无菌PBS中洗涤沉淀

11.将管在3500x g下离心20分钟

12.取出并丢弃悬浮液

13.将沉淀重悬浮于50μL的无菌PBS中

14.仔细地将PBS沉淀混合物应用到Lowenstein-Jansen培养基管(LJ倾斜)的顶边，并轻轻左右摇摆来分配样品。

15.在35℃下孵育42天并对生长进行评分

结果与结论

表32：在NPI存在或不存在下在LJ斜面上的aMTB生长的总结

*缺乏初始裂解缓冲液(BD2)以消除背景菌群造成这些污染微生物的快速生长

表32说明了在NPI存在下TB生存能力的阻止。在不存在NPI的A和B组中，8-10天后TB菌落开始出现(A组)，并污染的背景菌群在一天内淹没了LJ培养基(B组)。相反，在添加了NPI的C和D组中，甚至在孵育42天后(其是用于确定TB阴性状态的目前的培养标准)，没有观察到任何微生物的生长。这表明TB生存能力的阻止需要NPI。即使用于去除背景菌群的初始裂解缓冲液不存在(BD2；C组)，这种效果也可见，表明单独的NPI足以阻止TB生存能力。这对本领域的当前状态是明显的改善，因为它允许个别操作的TB阳性样品迅速和有效地提供样品生物安全性。从而降低对个体的风险，并且这些NPI处理的样品可以从限制性BSL3环境迁至BSL2实验室用于进一步分析，包括DNA提取和实时PCR(参见实例9)。

实例17：在NaOH-NALC痰样品中直接测试ML的活性

NaOH/NALC被广泛用于液化痰。这个实例证明高碘酸盐仍然有效，即，从用NaOH/NALC处理的痰样品中的MTB释放核酸。

实验方法

掺入结核分枝杆菌的痰样品的制备

为了模拟结核病阳性痰，将痰样品(购买自组织溶液有限公司(Tissue SolutionsLtd.)，格拉斯哥，苏格兰)掺入约9x106CFU/mL减毒结核分枝杆菌H37Ra(aMTB)，并且分成两个部分。一个部分用等体积的NaOH/NALC在室温下处理15分钟，而第二部分与等体积BD2缓冲液(50mM甘氨酸、250mM LiCl、12.5mM Li-CDTA、2％SDS，pH 10.5)混合。将BD缓冲器处理的痰在5,000rpm下离心20分钟，并且将沉淀再悬浮于1mL PBS中，向该PBS中添加1mL BD2缓冲液。

使用最佳的高碘酸盐方法从在NaOH/NALC或BD缓冲液中的aMTB阳性痰提取DNA

1.将三个200μL等分试样的NaOH/NALC处理的痰或BD2缓冲液处理的痰(上文)用NPI处理至30mM的终浓度，涡旋混合。

2.在70℃水浴中孵育20分钟。

3.将等分试样在室温下冷却2分钟。

4.添加1M Tris缓冲液(pH 7)至50mM的终浓度。

5.添加3M醋酸钾(pH 5.5)至150mM的终浓度。

6.在冰上孵育10分钟。

7.以13,200rpm离心5分钟。

8.将上清转移到干净的管。丢弃沉淀。

9.添加400μL室温的95％乙醇。反转20次混合。

10.在室温下孵育样品15分钟以沉淀DNA。

11.以15,000rpm离心2分钟以沉淀DNA。

12.轻轻取出并丢弃上清液，小心不要打乱沉淀。

13.将沉淀溶于200μL TE。短暂涡旋以充分重悬DNA。

使用缩短的高碘酸盐方法从在NaOH/NALC中的aMTB阳性痰提取DNA

1.将三个200μL等分试样的NaOH/NALC处理的痰(上文)用NPI处理至30mM的终浓度，涡旋混合。

2.在70℃水浴中孵育20分钟。

3.将等分试样在室温下冷却2分钟。

4.添加1M Tris缓冲液(pH 7)至50mM的终浓度。

5.在室温下孵育10分钟。

6.添加2体积的室温的95％乙醇。反转20次混合。

7.在室温下孵育样品15分钟以沉淀DNA。

8.以15,000rpm离心2分钟以沉淀DNA。

9.轻轻取出并丢弃上清液，小心不要打乱沉淀。

10.将沉淀溶于200μL TE。短暂涡旋以充分重悬DNA。

rtPCR条件

在这个实例中，使从掺有aMTB的痰样品(上文)中分离的DNA经受特异于分枝杆菌的rtPCR试验，RD4Taqman实时PCR测定(参见实例10)。

结果与结论

如上文概述的，用于NaOH/NALC处理的痰的提取试验方案可以通过去除从BD2缓冲液处理的样品沉淀SDS需要的醋酸钾和离心步骤来缩短。本实例使用对结核分枝杆菌特异的实时PCR试验来证明高碘酸盐能够在用NaOH/NALC处理后从痰中的aMTB释放核酸(表33)。相比本发明的方法，BD2缓冲液处理接着用高碘酸盐提取DNA，当在使用高碘酸盐进行DNA提取之间用NaOH/NALC处理痰时Ct值仅高出2个循环。

表33：对从掺有aMTB的痰中释放的DNA的定量

实例18：高碘酸盐方法与治疗标准相比用于结核分枝杆菌的分子检测

CDC建议临床标本同时通过培养、抗酸杆菌(AFB)染色、和核酸扩增试验方案来进行分析(匿名，2009)。培养是TB阳性的最终确定的“黄金标准”，但它是缓慢的并可能需要长达8周。AFB染色是快速的，但具有低敏感性和低特异性，因为它不区分来自结核分枝杆菌复合体(MTBC)的成员与非结核分枝杆菌(NTM)。因此，对控制疾病的传播至关重要的快速鉴定依赖于核酸扩增试验方案，例如实时PCR(qPCR)和测序。

在结核分枝杆菌感染的患者中抗生素耐药性的评估是对患者管理和控制疾病的传播至关重要的。结核分枝杆菌的药物敏感试验(DST)的标准方法可能需要几周到几个月来提供结果。由于多重耐药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)的出现，已经发展出快速的分子办法。rpoB基因内突变与利福平(RIF)耐药性相关，而katG基因和inhA基因的突变与异烟肼耐药性相关。哈尔斯(Halse)等人(2010)开发了两步分子方法，该方法直接用对结核分枝杆菌复合体(MTBC)阳性的临床标本通过实时PCR利用抗生素抗性基因焦磷酸测序分析。

在这个实例中，对通过两种不同的方法处理的TB阳性痰样品(由创新诊断基金会(FIND)结核标本库惠赠)的临床评估进行了并排比较。具体地，1)“治疗标准”方法，包括氢氧化钠处理，接着是珠粒打浆，和2)本发明在CLIA/CLEP批准的qPCR试验(靶向RD4MTBC差异区域(RD))(哈尔斯(Halse)等人，2011)和抗生素抗性基因焦磷酸测序试验(哈尔斯(Halse)等人，2010)的敏感性方面进行了比较。在本发明的方法中，在DNA的分离和试验检测之前，TB阳性痰样品用BD2缓冲液和高碘酸盐进行处理以促进标本中的细胞的化学细胞溶解。

与本发明相反，“治疗标准”方法包括珠粒打浆、机械方法以破开痰样品中的细菌。虽然机械珠粒打浆可以有效地破开生物体，但是它在实验室的确产生危险的气溶胶。因此，非常希望开发一种有效的、非机械的、化学的方法以安全地从结核分枝杆菌释放DNA，而不会对诊断测试的临床敏感性产生负面影响。

实验方法

结核分枝杆菌阳性痰样品

对于本实例，来自确认的TB阳性患者的未加工的痰样品由创新诊断基金会(FIND)结核病标本库惠赠。使用涂片和培养分析，FIND将这些样品归类为‘低’、‘中’和‘高’TB阳性标本。一式两份的0.5mL的等分试样从30位患者样品提供并且冷冻储存。将等分试样冷冻运到沃兹沃斯中心分枝杆菌学实验室(Wadsworth Center Mycobacteriology Laboratory)(纽约州卫生部门，奥尔巴尼，纽约州，美国)以进行进一步的分析，该实验室是CLIA/CLEP批准的临床实验室。

将来自30为供体的一式两份的等分试样在冰上解冻；在DNA的分离之前，一组等分试样使用“治疗标准”方法(合作者)来处理并且第二组用BD2缓冲液和高碘酸盐来处理。

使用“治疗标准”方法处理TB阳性痰

1.将0.5mL 3.5％NaOH添加到每个0.5mL痰等分试样(n＝6)；涡旋混合。

2.在室温下孵育15分钟。

3.用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)升至10mL。

4.以5,000rpm离心20分钟以沉淀细菌。丢弃上层清液。

5.在0.5mL无菌PBS中重悬沉淀。

6.预留300μL的重悬浮的细菌用于培养以确认结核分枝杆菌的生存能力。

7.通过将200mg的105-150微米的玻璃珠添加至剩余的200μL的再悬浮细菌来裂解细菌。

8.珠粒打浆2个周期，每个周期1分钟，随后使用微型珠粒打浆机(BioSpec产品)在冰上进行1分钟。

使用碘酸试验方法处理TB-阳性痰

1.将0.5mL BD2缓冲液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)添加到每个0.5mL痰等分试样(n＝6)；涡旋混合。

2.添加蛋白酶K(400μg)，并在50℃水浴中孵育2小时。

3.添加NPI至30mM的终浓度，涡旋混合。

4.在70℃水浴中孵育20分钟。

5.在室温下冷却样品2分钟。

6.添加1M Tris缓冲液(pH 7)至50mM的终浓度。

7.在室温下孵育10分钟。

8.添加3M醋酸钾(pH 5.5)至150mM的终浓度。

9.在冰上孵育10分钟。

10.以13,000rpm离心5分钟。

11.将上清转移到干净的标记的管。丢弃沉淀。

12.添加2体积的室温的95％乙醇；反转20次以混合。

13.在室温下孵育样品15分钟以沉淀DNA。

14.以15,000rpm离心2分钟以沉淀DNA。

15.轻轻取出并丢弃上清液，小心不要打乱沉淀。

16.将沉淀溶于200μL TE。

17.短暂地涡旋以充分重悬DNA并且在室温下静置至少30分钟。

对结核分枝杆菌进行实时PCR和抗生素抗性焦磷酸测序

使用CLIA/CLEP批准的qPCR试验，来自每个纯化的痰样品(上文)的5μL‘纯的’DNA和5μL稀释的(1:10)DNA的重复反应在ABI7500实时PCR仪上扩增，该qPCR试验靶向RD4MTBC差异区域(RD)(哈尔斯(Halse)等人，2011)。小于37的阈值循环(C_t)值报道为阳性，并且值大于37的样品被重测；如果结果是相同的，结果被报告为阳性，并且如果它们不同，它们被报告为不确定的。

对于利福平耐药性用先前公布的焦磷酸测序法(rpoB)(哈尔斯(Halse)等人，2010)和对于异烟肼耐药性用另外的靶标(inhA和katG)来进行抗生素耐药性分析。从两种方法获得的DNA被用于单独的PCR反应以扩增rpoB、inhA和katG基因的特异性区域。在这些区域中的突变表明对利福平和/或异烟肼抗生素的可能的耐药性。

结果与讨论

现在，治疗标准方法涉及用氢氧化钠(或NaOH/NALC)液化痰，接着是使用机械珠粒打浆从细菌分离DNA。本发明的方法与那样一种简单的化学处理不同，包括高碘酸盐，有效地裂解细菌。重要的是，如果本发明的组合物和方法在引起对结核分枝杆菌特异的DNA和抗生素抗性标记的后续检测方面不是更加有效，本发明的组合物和方法似乎也与治疗标准方法一样有效。

表34：在结核分枝杆菌中对三种抗生素抗性标记的焦磷酸测序结果。

相比传统的方法(“合作者”，表34)，本发明的化学方法(“高碘酸盐法”，表34)通过qPCR在由培养和涂片镜检归类为‘低’和‘中’TB阳性的痰样品中导致结核分枝杆菌特异性检测的临床敏感性增加。在这个实例中，直到使用“治疗标准”方法提取的DNA被稀释10倍才通过qPCR检测到在‘中’和‘高’TB阳性痰样品中的结核分枝杆菌(表34)。对于所有TB负载的水平，表1阐明了相比治疗标准方法(合作者)，使用本发明的方法(高碘酸盐法)处理的所有TB阳性痰样品中结核分枝杆菌的显著改善的检测极限(通过qPCR的较低的C_t值)。这个较低的检测极限，帮助确保对来自患者痰样品的结核分枝杆菌的精确诊断。

类似地，本发明的组合物和方法是与工业标准测试兼容来预测在结核分枝杆菌阳性标本中的抗生素抗性。对于测试的6个临床的TB阳性痰标本，用治疗标准方法和高碘酸盐方法获得的焦磷酸测序法结果是100％一致的。重要的是，从这6个患者痰样品中，本发明的高碘酸盐方法，但不是治疗标准方法，检测到2名患者(FIND 01 012072和FIND 01 012137)具有抗生素抗性标记(inhA和ropB基因)(表34)。甚至黄金标准培养测试在体外52天后没能显示这2个患者的样品中的分枝杆菌的生长。

在测试时分枝杆菌DNA的回收率增加带来的影响最好使用焦磷酸测序数据高亮显示。用高碘酸盐处理的样品具有足够数量可用的DNA以在测试的第0天对抗生素抗性标记进行测试。相比之下，治疗标准方法在焦磷酸测序前需要平均14天用于MGIT培养来变成阳性，该方法可以在第0天被PCR测试为阴性样品上重复。患者的抗生素特征曲线对病例管理至关重要，并且使用适当的抗生素治疗的较早期干预将减少传播率和增加恢复的几率。因此，本发明对通过实时PCR的MTBC的快速的当天的鉴定有价值，并且足够灵敏以检测用于结核分枝杆菌的抗生素抗性标记，无需等待通过培养来检测分枝杆菌。

实例19：从痰拭子样品中检测MTB

对于结核病的最优控制，早期诊断是至关重要的。若干研究人员已经开发出实时PCR试验，该实时PCR试验提供对患者样品中结核分枝杆菌复合体(MTBC)的各种靶序列和药物抗性基因的快速检测。这些试验检测临床样品中的MTBC的能力取决于所选的靶序列和DNA提取程序的效率。前面的实例已经证明，本发明大幅改善了从微生物(如MTB)的核酸提取，增加了在人类痰中结核分枝杆菌检测的敏感性。

代替处理全部痰标本，通过直接从处于未加工的或未处理的状态(即，用氢氧化钠和/或NALC净化之前)的每个标本的一小部分提取核酸可以获得进一步的效率。这个实例证明可商购的拭子可以用来成功地捕获和转移未处理的痰的小等分试样(每个拭子大约100-200微升)。结合用本发明所获得的提取效率，处理全部样品的一小部分可以极大地改善标本在实验室中的处理，以及诊断的时间。

材料与方法

将一个3mL冷冻的、未处理的痰样品(组织溶液有限公司(Tissue SolutionsLtd.))解冻，并被掺入9x10⁷CFU/mL减毒的MTB H37Ra(aMTB)。一次一个地将8个FLOQ(科潘诊断公司(Copan Diagnostics Inc.)；目录号502CS01)和8个Hydra Flock(清教徒医疗产品有限公司(Puritan Medical Products Co.,LLC)；目录号25-3406-H)拭子浸入掺有aMTB的痰中，盘绕10秒，然后转移到含有500μL的BD2缓冲液(50mM甘氨酸、250mM LiCl、12.5mMLi-CDTA、2％SDS，pH 10.5)的管中。在室温下放置2小时后，将拭子取出，将管在3,500rpm下离心20分钟，并将沉淀再悬浮于100μL PBS中。将每个拭子两个重悬样品涂抹到M7H10琼脂平板上，并且在35℃下孵育21天以确认aMTB的生存能力；将每个拭子6个再悬浮样品在用和不用高碘酸盐提取核酸之前与100μL BD2缓冲液混合(参见下文)。

使用高碘酸盐方法从aMTB阳性痰中提取DNA

1.将五个200μL的等分试样(拭子1-5；上文)用NPI处理至30mM的终浓度，涡旋混合；一个200μL的等分试样(拭子6)不用NPI处理。

2.在70℃水浴中孵育20分钟。

3.将等分试样在室温下冷却2分钟。

4.添加1M Tris缓冲液(pH 7)至50mM的终浓度。

5.添加3M醋酸钾(pH 5.5)至150mM的终浓度。

6.在冰上孵育10分钟。

7.以13,200rpm离心5分钟。

8.将上清转移到干净的管。丢弃沉淀。

9.添加400μL室温的95％乙醇。反转20次混合。

10.在室温下孵育样品15分钟以沉淀DNA。

11.以15,000rpm离心2分钟以沉淀DNA。

12.轻轻取出并丢弃上清液，小心不要打乱沉淀。

13.将沉淀溶于200μL TE。短暂涡旋以充分重悬DNA。

rtPCR条件

在这个实例中，使从掺有aMTB的痰样品(上文)中分离的DNA经受特异于分枝杆菌的rtPCR试验，RD4Taqman实时PCR测定(参见实例10)。

结果与结论

用拭子收集的掺有aMTB的痰在培养基中是有生活力的。在培养基中21天后，从科潘(Copan)拭子分离出的aMTB产生了一菌苔的细菌，而从清教徒(Puritan)拭子回收的aMTB产生了大约200个菌落/平板。

使用MTB特异的rtPCR很容易地检测从单个科潘或清教徒拭子收集的aMTB DNA的量(拭子6；参见表35)。当高碘酸盐包含在DNA提取试验方案中时(拭子1-5；表35)，C_t值下降超过3个周期，对于科潘拭子从27.75下降到24.02，对于清教徒拭子从27.62下降到23.69，相当于在每个拭子回收的aMTB特异DNA的量超过10倍的增加。此外，使用纯的对比稀释的DNA(1:10)的rtPCR证明了预期的3个循环的差异，表明提取的DNA包含很少或几乎没有PCR抑制剂。

因此，将拭子浸入未处理的痰标本可以提供足够的样本(100-200μL)来迅速诊断在中至高阳性标本终的结核分枝杆菌的存在。重要的是，在DNA提取试验方案中包含高碘酸盐增加了这项检测的敏感性至少10倍，其对于低至中阳性标本具有重要的影响。

表35：使用拭子和高碘酸盐从痰中分离的DNA的实时PCR分析。

其他参考文献

·“关于核酸扩增试验对结核病的诊断的用途的专家磋商会报告(Report of anExpert Consultation on the Uses of Nucleic Acid Amplification Tests for theDiagnosis of Tuberculosis)，”疾病控制与预防中心(Centers for Disease Controland Prevention)。

·“对来自临床标本的分枝杆菌的诊断和耐药性检测的分子遗传学方法(Molecular genetic methods for diagnosis and antibiotic resistance detectionof mycobacterial from clinical specimens)，”I.C.Shamputa、L.Rigouts、F.·波塔尔(F.Portaels)，APMIS(2004)112：728-752。

·“痰结核分枝杆菌信使RNA作为替代物对化疗响应的测定(Measurement ofsputum Mycobacterium tuberculosis messenger RNA as a surrogate for responseto chemotherapy)”L.E.·加鼎(L.E.Desjardin)、M.D.·帕金斯(M.D.Perkins)、K.·沃尔斯基(K.Wolski)、S.·豪恩(S.Haun)、L.·特谢拉(L.Teixeira)、Y.·陈(Y.Chen)、J.L·约翰逊(J.L.Johnson)、J.J.·艾尔纳(J.J.Ellner)、R.·迪雅兹(R.Dietze)、J.·贝茨(J.Bates)、M.D.·凯夫(M.D.Cave)、K.D.·爱森纳赫(K.D.Eisenach)(1999)美国呼吸和重症监护医学杂志(Am J Respir Crit Care Med)160：203-210。

·N.N.·格林伍德(N.N.Greenwood)和A.·恩肖(A.Earnshaw)，元素的化学(Chemistry of the Elements)，第2版，巴特沃思海涅曼出版社(ButterworthHeinemann)，牛津，第17章，第872-875页(1998)。

·A.·艾法卡米(A.Afkhami)、T.Madrakian、A.R.·萨雷(A.R.Zarei)，“基于它们与碘化物的反应对高碘酸盐、碘酸和溴酸盐混合物的分光光度法测定(Spectrophotometric determination of periodate,iodate and bromate mixturesbased on their reaction with iodide)”，分析科学(Analytical Sciences)(2001)17：1199-1202。

·弗罗布莱夫斯基·D(Wroblewski D)、汉内特·GE(Hannett GE)、博普·DJ(Bopp DJ)、杜姆亚特·GK(Dumyati GK)、哈尔斯·TA(Halse TA)、大仲马·NB(Dumas NB)、马瑟·KS(Musser KS)(2009)在粪便标本中的难辨梭菌的快速分子表征和难辨梭菌的种群评估(Rapid molecular characterization of Clostridium difficile and assessmentof populations of C.difficile in stool specimens)，临床微生物学杂志(J ClinMicrobiol)47(7)：242-2148。

·哈尔斯·TA(Halse TA)、Escuyer VE、马瑟·KA(Musser KA)(2011)对在临床标本中结核分枝杆菌复合体成员分化的单管多重实时PCR的评价(Evaluation of a Single-Tube Multiplex Real-time PCR for the Differentiation of Members of theMycobacterium tuberculosis Complex in Clinical Specimens)，临床微生物学杂志(JClin Microbiol)49(7)：2562-5267。

·哈尔斯·TA(Halse TA)、爱德华兹·J()、坎宁安·PL(Cunningham PL)、沃尔夫冈·WJ(Wolfgang WJ)、大仲马·NB(Dumas NB)、Escuyer VE、马瑟·KA(Musser KA)(2010)结合的实时PCR和rpoB基因的焦磷酸测序法用于直接在临床标本中快速鉴定结核分枝杆菌和确定利福平耐药性(Combined real-time PCR and rpoB gene pyrosequencing forrapid identification of Mycobacterium tuberculosis and determination ofrifampin resistance directly in clinical specimens)，临床微生物学杂志(J ClinMicrobiol)48:1182–1188。

·科贝特·EL(Corbett EL)、瓦特·CJ(Watt CJ)、沃克·N(Walker N)、马赫·D(Maher D)、威廉姆斯·BG(Williams BG)、Raviglione MC、戴伊·C(Dye C)(2003)日益增长的结核病负担：全球趋势和与HIV传染病的相互作用(The growing burden oftuberculosis:global trends and interactions with the HIV epidemic)，内科医学档案(Arch Intern Med)163:1009–1021。

·成人和儿童中结核病的诊断标准与分类(Diagnostic Standards andClassification of Tuberculosis in Adults and Children)；美国胸科协会和疾病控制与预防中心(2000)美国呼吸和重症监护医学杂志(Am J Respir Crit Care Med)161:1376-1395。

·霍比·GL(Hobby GL)、霍尔曼·AP(Holman AP)、Iseman MD、琼斯·J(Jones J)(1973)肺结核患者痰中结核杆菌的计数(Enumeration of tubercle bacilli in sputumof patients with pulmonary tuberculosis)，抗微生物药剂和化疗(Antimicrob AgentsChemother)4：94-104。

·耶格尔·HJ(Yeager HJ Jr)、拉齐·J(Lacy J)、史密斯·L(Smith L)、勒麦斯切·C(LeMaistre C)(1967)痰和唾液中分枝杆菌种群的定量研究(Quantitative studiesof mycobacterial populations in sputum and saliva)，美国呼吸系统疾病评论(AmRev Respir Dis)95：998-1004。

·甘地·NR(Ghandi NR)、莫尔·A(Moll A)、Pawinski R等人(2006年8月)在南非农村TB/HIV双重感染患者的广泛耐药(XDR)TB的高患病率和死亡率(High prevalence andmortality from extensively-drug resistant(XDR)TB in TB/HIV coinfectedpatients in rural South Africa)。加拿大多伦多：近期破冰会议，第十六届国际AIDS大会，13-18[摘要THLB0210]。

·拉维格里昂·M(Raviglione M)(2006)XDR-TB：进入后抗生素时代？(XDR-TB:entering the post-antibiotic era？)国际肺结核与肺部疾病杂志(Int J Tuberc LungDis)10(11):1185-1187。

·戴维斯·JL(Davis JL)、黄·L(Huang L)、科瓦奇·JA(Kovacs JA)、马祖尔·H(Masur H)、穆雷·P(Murray P)、哈夫利尔·DV(Havlir DV)、Worodria WO、沙尔勒布瓦·ED(Charlebois ED)、Srikantiah P、Cattamanchi A、胡贝尔·C(Huber C)、谢伊·YR(SheaYR)、周·Y(Chow Y)、菲舍尔·SH(Fischer SH)(2009)痰或口腔清洗样品中secA1的聚合酶链反应用于肺结核的诊断(Polymerase chain reaction of secA1on sputum or oralwash samples for the diagnosis of pulmonary tuberculosis)，临床传染疾病(Clinical Infectious Diseases)48：725-732。

·亚森·G(Yassen G)、努里·J(Noori J)、亚斯·NS(Yas NS)(2012)具有肺结核患者的唾液中抗酸杆菌检测(Detection of acid fast bacilli in the saliva ofpatients having pulmonary tuberculosis)巴格学院牙科杂志(J Bagh CollegeDentistry)24(3)：59-62。

·匿名(2009)，在结核病的诊断中使用的核酸扩增试验的更新指南(Updatedguidelines for the use of nucleic acid amplification tests in the diagnosisof tuberculosis)。MMWR发病率和死亡率周报(Morb Mortal Wkly Rep)58:7-10。

·哈尔斯·TA(Halse TA)、爱德华兹·J()、坎宁安·PL(Cunningham PL)、沃尔夫冈·WJ(Wolfgang WJ)、大仲马·NB(Dumas NB)、Escuyer VE、马瑟·KA(Musser KA)(2010)结合的实时PCR和rpoB基因的焦磷酸测序法用于直接在临床标本中快速鉴定结核分枝杆菌和确定利福平耐药性(Combined real-time PCR and rpoB gene pyrosequencing forrapid identification of Mycobacterium tuberculosis and determination ofrifampin resistance directly in clinical specimens)，临床微生物学杂志(J ClinMicrobiol)48:1182–1188。

·哈尔斯·TA(Halse TA)、Escuyer VE、马瑟·KA(Musser KA)(2011)对在临床标本中结核分枝杆菌复合体成员分化的单管多重实时PCR的评价(Evaluation of a Single-Tube Multiplex Real-time PCR for the Differentiation of Members of theMycobacterium tuberculosis Complex in Clinical Specimens)，临床微生物学杂志(JClin Microbiol)49(7)：2562-2567。

·斯科特II·RD(Scott II RD)(2009)在美国医院中医疗保健相关感染的直接医疗费用和预防的好处(The Direct Medical Costs of Healthcare-associatedInfections in U.S.Hospitals and the Benefits of Prevention)。疾病控制与预防中心。

·福利·WN(Fawley WN)、威尔考克斯·MH(Wilcox MH)(2001)地方性难辨梭菌感染的分子流行病学(Molecular epidemiology of endemic Clostridium difficileinfection)，流行病学和感染(Epidemiology and Infection)126(3):343-350。ISSN0950-2688。

·马丁内斯·J.A.(Martínez,J.A.)、Ruthazer，R.、Hansjosten，K.、贝尔富特·L.(Barefoot,L.)、和Snydman，D.R(2003年9月)“环境污染作为风险因子在医疗重症监护病房中治疗的患者中获得万古霉素抗性肠球菌中的作用(Role of environmentalcontamination as a risk factor for acquisition of vancomycin-resistantenterococci in patients treated in a medical intensive care unit)”，内科医学档案(Archives of Internal Medicine)Vol.163(16)：1905-12。

在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请表示本发明所属的技术领域的技术人员的水平，并且以与如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地说明通过引用并入本文相同的程度通过引用结合在此。

如此描述了本发明，但显而易见的是它可以以许多方式变化。这些变化不被视为违背本发明的精神和范围，并且所有这样的修改，如将对本领域技术人员而言是显而易见的，旨在被包括在以下权利要求的范围之内。

Claims (43)

1.一种包含氧化剂和缓冲剂的组合物，其中该氧化剂是高碘酸、高碘酸盐或过硫酸盐。

2.如权利要求1所述的组合物，其另外包括锂盐、螯合剂和变性剂。

3.如权利要求2所述的组合物，其中该锂盐是LiCl。

4.如权利要求2或3所述的组合物，其中该变性剂是阴离子洗涤剂、阳离子洗涤剂、或非离子洗涤剂。

5.如权利要求4所述的组合物，其中该阴离子洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸锂(LDS)或月桂酰硫酸钠(SLS)。

6.如权利要求4所述的组合物，其中该阳离子洗涤剂是十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基溴化吡啶或烷基苄二甲基氯化铵。

7.如权利要求4所述的组合物，其中该非离子洗涤剂是吐温(Tween)、Triton X、或布里杰(Brij)。

8.如权利要求2至7中任一项所述的组合物，其中该螯合剂是乙二醇四乙酸(EGTA)、(2-羟乙基)乙二胺三乙酸(HEDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺三乙酸(EDTA)、环己烷二胺四乙酸(CDTA)，N,N-双(羧基甲基)甘氨酸、无水柠檬酸、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、二柠檬酸铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂、或它们的任意组合。

9.如权利要求1至8中任一项所述的组合物，该组合物是用于从微生物或微生物的混合物中提取和/或保存核酸。

10.如权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中该组合物具有从约6.5至约13或从约8至约10.5的pH。

11.如权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中该高碘酸盐包括偏高碘酸盐、邻高碘酸盐或它们的混合物。

12.如权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中该高碘酸盐包括高碘酸钠、高碘酸钾或高碘酸锂。

13.如权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中该过硫酸盐包括过硫酸钠、过硫酸钾或过硫酸铵。

14.如权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中该缓冲液是甘氨酸。

15.一种用于从微生物中提取核酸的方法，该方法包括将疑似包含该微生物的样品与氧化剂混合并加热所得的混合物，其中该氧化剂是高碘酸、高碘酸盐或过硫酸盐。

16.如权利要求15所述的方法，其中该高碘酸盐或过硫酸盐是以一种组合物，该组合物包括缓冲液使得该组合物具有从约6.5至约13、或从约8至约10.5的pH。

17.如权利要求15或16所述的方法，其中将该混合物加热至约50℃或更高的温度、或从约50℃加热至约100℃的温度、或从约70℃加热至约80℃的温度。

18.如权利要求15至17中任一项所述的方法，其中将该混合物加热至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、从约15分钟至约60分钟、或从约15分钟至约20分钟。

19.如权利要求15至18中任一项所述的方法，其中该高碘酸盐包括偏高碘酸盐、邻高碘酸盐或它们的混合物。

20.如权利要求15至19中任一项所述的方法，其中该高碘酸盐包括高碘酸钠、高碘酸钾或高碘酸锂。

21.如权利要求15至20中任一项所述的方法，其中该过硫酸盐包括过硫酸钠、过硫酸钾或过硫酸铵。

22.如权利要求15至21中任一项所述的方法，其正高碘酸盐或过硫酸盐在最终混合物中的浓度是从约0.1mM至约300mM、约5mM至约30mM、或约15mM。

23.如权利要求15至22中任一项所述的方法，其另外包括将锂盐添加至该样品。

24.如权利要求23所述的方法，其中该锂盐是LiCl。

25.如权利要求15至24中任一项所述的方法，其另外包括将变性剂添加至该样品。

26.如权利要求25所述的方法，其中该变性剂是阴离子洗涤剂、阳离子洗涤剂、或非离子洗涤剂。

27.如权利要求26所述的方法，其中该阴离子洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸锂(LDS)或月桂酰硫酸钠(SLS)。

28.如权利要求26所述的方法，其中该阳离子洗涤剂是十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基溴化吡啶或烷基苄二甲基氯化铵。

29.如权利要求26所述的方法，其中该非离子洗涤剂是吐温(Tween)、Triton X、或布里杰(Brij)。

30.如权利要求15至29中任一项所述的方法，其中该微生物是细菌或真菌。

31.如权利要求30所述的方法，其中该微生物是细菌。

32.如权利要求31所述的方法，其中该细菌是结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)复合体的物种、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)、卡内蒂分枝杆菌(Mycobacterium canetti)、山羊分枝杆菌(Mycobacterium caprae)、鳍脚目分枝杆菌(Mycobacterium pinnipedi)、海鱼分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、弥漫型麻疯分枝杆菌(Mycobacterium Lepromatosis)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)，鸟细胞内分枝杆菌(Mycobacteriumavium-intra-cellulare)、鸟类结核分枝杆菌(Mycobacterium avium paratuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、戈登分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)、芽孢杆菌属(Bacillus)物种、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、链球菌属(Streptococcus)物种、葡萄球菌属(Staphylococcus)物种、脆双核阿米巴(Dientamoeba fragilis)、伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)和其他物种、梭状芽胞杆菌(Clostridia)物种、具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、沙门氏菌(Salmonella)物种、弯曲杆菌(Campylobacter)物种、厚壁菌门(Firmicutes)细菌，巴尔通氏体属(Bartonella)物种，立克次氏体(Rickettsia)物种、耶尔森菌属(Yersinia)物种、弗朗西丝菌属(Francisella)物种、布鲁杆菌属(Brucella)物种、博德特菌属(Bordetella)物种、伯霍尔德杆菌属(Burkholderia)物种、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、志贺菌属(Shigella)物种、衣原体属(Chlamydophila)物种、军团菌属(Legionella)物种，李斯特菌属(Listeria)物种、棒状杆菌属(Corynebacterium)物种、肠球菌(Enterococcus)物种、埃希氏菌属(Escherichia)物种、嗜血杆菌属(Haemophilus)物种、螺杆菌属(Helicobacter)物种、钩端螺旋体属(Leptospira)物种、支原体(Mycoplasma)物种、奈瑟球菌属(Neisseria)物种、密螺旋体属(Treponema)物种、或弧菌属(Vibrio)物种。

33.如权利要求30所述的方法，其中该微生物是真菌。

34.如权利要求33所述的方法，其中该真菌是酵母菌属(Saccharomyces)、念珠菌属(Candida)、曲霉属(Aspergillus)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、肺囊虫属(Pneumocystis)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)或隐球菌属(Cryptococcus)。

35.一种用于核酸提取的试剂盒，其中该试剂盒包括(i)提取组合物，该提取组合物包含浓度从约5mM至约300mM的高碘酸盐或过硫酸盐和pH从约7至约13的缓冲液；和(ii)使用的说明。

36.根据权利要求35所述的试剂盒，其中该提取组合物另外包括锂盐、变性剂和/或螯合剂。

37.根据权利要求35或36所述的试剂盒，其中该试剂盒进一步包括试剂容器和/或样品接收容器。

38.根据权利要求37所述的试剂盒，其中该试剂容器和/或样品接收容器包括用于接收提取组合物的池和样品接收部分。

39.一种用于对样品中的总核酸进行定量的方法，该方法包括

(i)用酸处理该样品并且加热该酸化样品；

(ii)中和该酸化样品；并且

(iii)用反相柱使该中和的样品经受HPLC并且通过UV光谱学监测该洗脱物以鉴定对应于腺嘌呤的峰；

(iv)计算腺嘌呤峰的曲线下面积作为该样品中总核酸的量度。

40.如权利要求39所述的方法，其中在步骤(i)中，使用HCl来酸化该样品。

41.如权利要求39或40所述的方法，其中在步骤(ii)中，使用NaOH来中和该酸化样品。

42.如权利要求39至41中任一项所述的方法，该方法另外包括计算对应于2’-和3’-AMP的峰的曲线下面积。

43.如权利要求39至42中任一项所述的方法，其中该样品包含微生物或怀疑包含微生物。