ES2908856T3 - Método y sistema para lisis microbiana mediante el uso de peryodatos - Google Patents

Abstract

Uso de una composición para extraer y/o conservar ácido nucleico de un microorganismo o mezcla de microorganismos, en donde la composición comprende un agente oxidante y un tampón, en donde el agente oxidante es ácido peryódico o peryodato, y en donde la composición es una solución acuosa que tiene un pH alcalino.

Description

DESCRIPCIÓN

Método y sistema para lisis microbiana mediante el uso de peryodatos

Campo de la invención

La presente solicitud pertenece al campo de la extracción de ácidos nucleicos. Más particularmente, la presente solicitud se refiere a métodos y sistemas para maximizar o mejorar la extracción de ácidos nucleicos de microorganismos, tales como bacterias, virus y hongos.

Antecedentes

Composición/método para mejorar la liberación de ácidos nucleicos de microorganismos resistentes y virus.

Los microorganismos, que incluye las bacterias, las algas y los hongos, son muy diversos y viven en todas partes de la biosfera. Algunos microorganismos son críticos para el reciclaje de nutrientes y tienen relaciones íntimas y mutuamente beneficiosas con organismos más grandes, mientras que otros son patógenos, infectan y, a veces, destruyen al hospedero, es decir, humanos, otros animales y plantas. Los microorganismos, virus y priones causan enfermedades como la peste, el ántrax, la tuberculosis, la lepra, la malaria, el cólera, la fiebre tifoidea, la enfermedad del sueño, el tétanos, la toxoplasmosis, la histoplasmosis, el botulismo, la difteria, el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), la influenza, la poliomielitis, el sarampión, paperas, rubéola, hepatitis A y B, herpes 1 y 2, fiebre amarilla, dengue, rabia, papilomas/cánceres (causados por el virus del papiloma humano), infección del tracto respiratorio mediada por adenovirus y encefalopatías espongiformes transmisibles (por ejemplo, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob).

Las infecciones asociadas a la atención médica (HAI) o infecciones nosocomiales son infecciones que los pacientes adquieren durante el curso de recibir tratamiento médico para otras afecciones o que se desarrollan entre el personal del hospital. El entorno sanitario puede contaminarse mucho con patógenos nosocomiales que pueden sobrevivir durante largos períodos de tiempo. Estas infecciones prevenibles pueden ser devastadoras y una causa importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo.

La atención médica moderna emplea numerosos tipos de dispositivos y procedimientos invasivos para tratar a los pacientes. Dos tercios de las HAI están asociados con los dispositivos usados en los procedimientos médicos, por ejemplo, infecciones del torrente sanguíneo asociadas a la vía central, infecciones del tracto urinario asociadas al catéter y neumonía asociada al ventilador. Las HAI también pueden ocurrir en sitios de cirugía y heridas abiertas. Además, las superficies contaminadas con la bacteria Clostridium difficile y sus esporas pueden causar infecciones gastrointestinales y enfermedades graves. Otros ejemplos de microorganismos que causan HAI incluyen Acinetobacter, Burkholderia cepacia, Candida albicans, Clostridium Sordellii, Enterobacteriasceae, Escherichia coli, Hepatitis AC, Virus de inmunodeficiencia humana (VIH), Influenza, Klebsiella, Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA), Mycobacterium abscessus, Norovirus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus intermedio y resistente a vancomicina y Stenotrophomonas maltophilia. Las infecciones causadas por estos microorganismos consumen recursos escasos del sector salud al prolongar la estancia del paciente en el hospital.

Las HAI son un problema crítico de salud pública en los países desarrollados. En los Estados Unidos, los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) estimaron aproximadamente 1,7 millones de HAI, de todo tipo de microorganismos, que incluye las bacterias, combinados, que causan o contribuyen a 99000 muertes cada año. Todos los días en los Estados Unidos, aproximadamente 1 de cada 20 pacientes hospitalizados tiene una infección causada por recibir atención médica, según los CDC. Solo en los Estados Unidos, los costos médicos directos anuales generales de HAI para los hospitales (que incluye los servicios hospitalarios para pacientes hospitalizados) son de aproximadamente $ 45 mil millones (en base a datos de 2007 analizados por los CDC; RD Scott II, 2009).

Los hospitales cuentan con protocolos de higienización de uniformes, esterilización de equipos, lavado y otras medidas preventivas. El lavado minucioso de manos y/o el uso de fricciones con alcohol por parte de todo el personal médico antes y después de cada contacto con un paciente es una de las formas más efectivas de combatir algunas HAI. Los microorganismos en equipos y superficies pueden destruirse o esterilizarse mediante la exposición a productos químicos, radiación ionizante, calor seco o vapor a presión. Sin embargo, se sabe que los microorganismos resistentes, como Staphylococcus, MRSA y Enterococcus resistentes a la vancomicina, sobreviven en superficies 'tocables' (por ejemplo, barandas de cama, teléfonos, botones de llamada, pisos, cortinas junto a la cama, inodoros, sillas, manijas de puertas, interruptores de luz, postes intravenosos, mostradores, estetoscopios, controles remotos de TV y mesas), así como también en el aire y en el polvo, durante largos períodos de tiempo. La desinfección de estas superficies es un componente a menudo pasado por alto, pero crítico, para romper el ciclo de infección en entornos de atención médica. Los métodos de desinfección modernos tales como los sistemas de vapor de alcohol no inflamable en dióxido de carbono (NAV-CO²) han sido algo efectivos contra la gastroenteritis, MRSA y los agentes de la influenza. Además, el vapor de peróxido de hidrógeno reduce las tasas de infección, siendo especialmente efectivo contra las bacterias formadoras de endosporas, como Clostridium difficile, donde el alcohol ha demostrado ser inefectivo. Por lo tanto, tanto para evitar como para combatir las HAI, se necesitan desesperadamente agentes antimicrobianos seguros y efectivos en hospitales, centros de salud, residencias de ancianos y centros de atención a largo plazo para desinfectar rutinariamente las superficies de contacto común, los dispositivos médicos reutilizables y el equipo médico/dental.

Los investigadores y los expertos en control de infecciones exigen protocolos y procedimientos de limpieza más rigurosos, así como materiales adaptados a los diferentes patógenos infecciosos. Fawley y otros (2001) encontraron que algunos desinfectantes de uso general a base de detergentes (tensioactivos iónicos y no iónicos), sin una desinfección adecuada, en realidad pueden aumentar la contaminación del medio ambiente. Además, un estudio estadounidense (Martinez y otros, 2003) concluyó que la limpieza de rutina de 20-30 minutos (con desinfectante fenólico) no fue suficiente para erradicar los enterococos resistentes a la vancomicina (VRE) en las habitaciones de los pacientes. Fue necesario un protocolo de limpieza más completo de cuatro horas para eliminar los VRE de la unidad de cuidados intensivos (UCI) médica. Hoy en día, existe una demanda de una forma segura, rápida, efectiva, económica y ecológica de desinfectar equipos, herramientas y superficies de contacto, sin el uso de productos químicos tóxicos o corrosivos. Un desinfectante ideal debe tener un amplio espectro antimicrobiano, producir una destrucción rápida, no tóxico, inodoro, debe dejar una película antimicrobiana en las superficies tratadas, económico, soluble en agua, estable y no debe dañar el medio ambiente.

La mayoría de los dispositivos médicos y quirúrgicos que se utilizan en los centros de salud están hechos de materiales que son estables al calor y, por lo tanto, se esterilizan con calor, principalmente con vapor. Sin embargo, desde 1950 ha habido un aumento en los dispositivos e instrumentos médicos fabricados con materiales que requieren esterilización a baja temperatura. Dentro de los últimos 15 años, se han desarrollado varios sistemas de esterilización a baja temperatura nuevos (por ejemplo, óxido de etileno (ETO), plasma gaseoso de peróxido de hidrógeno, inmersión en ácido peracético, ozono) y se han desarrollado y se usan para esterilizar dispositivos médicos (por ejemplo, instrumental quirúrgico, implantes, tubos de hemocultivo, jeringas hipodérmicas, fórceps de biopsia) e instrumental odontológico, así como también para descontaminar residuos microbiológicos. Las tecnologías en desarrollo para su uso en centros de atención médica, pero no aprobadas por la FDA, incluyen peróxido de hidrógeno vaporizado, ácido peracético en fase de vapor, dióxido de cloro gaseoso, radiación ionizante o luz pulsada. Para proteger a los pacientes de infecciones, al mismo tiempo que se minimizan los riesgos para el personal y se preserva el valor de los artículos que se reprocesan, se necesitan tecnologías de esterilización nuevas, a baja temperatura y respetuosas con el medio ambiente, con excelente actividad microbicida para microorganismos activos y esporas.

La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa líder en humanos causada por miembros del "complejo Mycobacterium tuberculosis", que incluyen, por ejemplo, cepas patógenas de las especies M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti, M. cannetti, M. caprae y M. pinnipedi. Mycobacterium tuberculosis (MT) infecta a aproximadamente un tercio de la población mundial, de los cuales el 90 % pueden permanecer asintomáticos durante años después de la infección. La TB es mortal en > 50 % de la población infectada y la aparición de cepas multirresistentes (MDR) ha hecho que el diagnóstico y el tratamiento de la TB sean de alta prioridad en las poblaciones africanas en desarrollo. MT crece lentamente, lo que significa que el aislamiento, la identificación y las pruebas de susceptibilidad a los medicamentos de este organismo y otras micobacterias clínicamente importantes son difíciles y pueden llevar varias semanas o meses. Si un laboratorio de Bioseguridad de nivel 3 no está disponible en tales ubicaciones remotas, la dificultad en la prueba se confunde con la necesidad de hacer que la muestra no sea infecciosa antes del procesamiento y la prueba molecular para reducir la transmisión y la incidencia de enfermedades. Sin embargo, el diagnóstico temprano y preciso de la infección por MT es fundamental para aislar al paciente, lo que reduce de esta manera la propagación de la enfermedad a los contactos cercanos y asegura el inicio de un tratamiento adecuado y efectivo. La administración temprana de la terapia con antibióticos reduce significativamente la gravedad de la enfermedad, aumenta las tasas de remisión y tiene como objetivo evitar el desarrollo de la TB MDR. Los métodos actuales adolecen de inconvenientes asociados con la dificultad para recolectar, transportar, estabilizar y/o extraer de forma segura muestras "buenas"/representativas (tales como muestras de esputo) de pacientes sospechosos de estar infectados con MT.

Los métodos actuales para el diagnóstico de la infección por MT mediante el uso de esputo involucran recolectar el esputo en un recipiente vacío, enviar la muestra de esputo potencialmente infecciosa a un laboratorio donde se abre el recipiente y la muestra se trata con hidróxido de sodio (NaOH) y N-acetil-L-cisteína (NALC). NaOH/NALC se usa ampliamente para licuar el esputo y reducir el fondo de otros microorganismos, mientras se mantiene la viabilidad de MT. MT es tan resistente que la mayoría sobrevive a este duro tratamiento, lo que permite el cultivo selectivo de este microorganismo. Sin embargo, MT crece muy lentamente in vitro, lo que prolonga el tiempo de detección y diagnóstico. Después del tratamiento con NaOH/NALC, el sedimento que contiene MT puede concentrarse antes de continuar con el procesamiento, lo que incluye a) la tinción de Ziehl-Neelsen para identificar bacterias "resistentes a los ácidos" en frotis, b) métodos de cultivo microbiano convencionales y c) ensayos con bases moleculares para la identificación de especies y perfiles de resistencia a los antibióticos.

En principio, el uso de métodos de diagnóstico molecular evita la necesidad de cultivar MT y, en consecuencia, la necesidad de mantener las bacterias en la muestra original en un estado viable. Además, existe una necesidad mundial de implementar pruebas de diagnóstico molecular más sensibles y rápidas (mediante el uso de ADN y/o ARN) para tuberculosis que las pruebas de laboratorio convencionales para MT para permitir el aislamiento del paciente y el inicio más temprano de una terapia efectiva. Ensayos comercialmente disponibles, aprobados por la FDA para la detección molecular de MT (por ejemplo, Amplicor Mycobacterium Tuberculosis Test de Roche Diagnostic Systems, Basilea, Suiza y "Enhanced Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct (E-MTD) Test" de Gen-Probe, San Diego, CA, Estados Unidos) tienen la ventaja de ser estandarizados y reproducibles, y exhiben una alta sensibilidad (> 95 %) y especificidad en muestras con frotis positivo. Sin embargo, la mitad de todos los casos nuevos de TB pulmonar tienen frotis negativo en el momento del diagnóstico inicial. Desafortunadamente, los ensayos moleculares aprobados por la FDA también demuestran baja sensibilidad (40,0-92,9 %, prueba MTD; 40,0­ 73,1 %, prueba Amplicor) en muestras con frotis negativo y no respiratorias. Además, los altos costos de los equipos y las pruebas limitan su implementación en los entornos remotos y de bajos recursos de los países en desarrollo (“Report of an Expert Consultation on the Uses of Nucleic Acid Amplification Tests for the Diagnosis of Tuberculosis”, Centers for Disease Control and Prevention; “Molecular genetic methods for diagnosis and antibiotic resistance detection of mycobacteria from clinical specimens”, APMIS (2004) 112: 728-752). Un medio para aumentar la sensibilidad de la detección de MT y, por tanto, la precisión de las pruebas de diagnóstico molecular, es aumentar la eficiencia de la extracción de ácido nucleico de una muestra dada, en particular, ADN y ARN de bacterias patógenas en muestras clínicas. Las muestras de pacientes con infección activa y/o latente, especialmente personas coinfectadas con VIH/TB, pueden contener solo una pequeña cantidad de Mycobacterium incrustadas en una mucosidad espesa, a menudo "sólida". Un método de extracción altamente efectivo podría revolucionar el diagnóstico y tratamiento de la TB al aumentar la sensibilidad de detección de MT, lo que permitiría una intervención más temprana.

La pared celular cerosa de las micobacterias contiene ácido micólico, lo que dificulta su interrupción y reduce en gran medida la eficiencia de extracción de ácido nucleico de la mayoría de los procesos de extracción química o enzimática. La robusta pared celular bacteriana dificulta tanto la lisis celular como la extracción eficiente de ADN (Kaser y otros, 2009). Actualmente, el mercado clínico carece de un método efectivo para extraer/aislar ácidos nucleicos de un gran número de muestras en una forma adecuada para la PCR y otros análisis moleculares sofisticados, como los micromatrices. Los métodos físicos para la rotura de microbios/células incluyen la desintegración mecánica de células (batidor de microesferas, trituración y molienda, molienda húmeda, ultrasonidos, cizallamiento hidráulico, presión de congelación), cizallamiento líquido o hidrodinámico (prensa francesa, prensa Chaikoff, homogeneizadores, molinos húmedos, molinos vibratorios, filtros, desintegración ultrasónica) y cizallamiento sólido (molienda, prensa Hughes). Por ejemplo, en la prueba E-MTD, la sonicación se usa para liberar el ARNr micobacteriano de las células diana. La alteración mecánica de bacterias y otros microbios (por ejemplo, hongos) produce una liberación de ADN muy variable, que depende mucho de la técnica específica usada.

En comparación con los medios mecánicos, como el batido de microesferas, algún tipo de lisis química/enzimática de bacterias/esporas resistentes en muestras clínicas sería mucho más fácil y seguro de integrar en flujos de trabajo y sistemas de procesamiento de muestras automatizados de alto rendimiento existentes. Los métodos químicos de desintegración de microbios/células tienen como objetivo modificar la pared celular, de modo que las células se vuelvan permeables o exploten debido a los efectos de la presión de turgencia. Los métodos incluyen ósmosis, secado y extracción, autólisis, inhibición de la síntesis de la pared celular, ataque enzimático a las paredes celulares, bacteriófagos y otros factores líticos y radiación ionizante.

La resistencia a los medicamentos de MT generalmente se determina mediante el uso de los métodos de cultivo en agar y líquido, que requieren de seis a ocho semanas y de cuatro a cinco semanas, respectivamente, para proporcionar resultados. Se espera que la detección confiable de ARN de muestras positivas para MT revolucione el diagnóstico y el tratamiento de la TB, en particular, la tuberculosis multirresistente y extremadamente resistente a los medicamentos (TB MDR/XDR). La detección rápida de la farmacorresistencia mediante métodos moleculares tarda de uno a dos días, lo que puede permitir el inicio más temprano de una terapia efectiva y, de esta manera, reducir los períodos de infecciosidad de los casos de TB MDR hasta en seis semanas y mejorar los resultados de los pacientes a nivel mundial; ambos pueden tener un gran impacto en los esfuerzos para controlar la TB MDR (Referencia: “Report of Expert Consultations on Rapid Molecular Testing to Detect Drug-Resistant Tuberculosis in the United States”, Centers for Disease Control and Prevention).

La medición cuantitativa de los niveles de ADN de MT en muestras de pacientes con TB positiva no es un marcador fiable para el éxito del tratamiento en la mayoría de los pacientes, ya que el ADN de MT puede persistir en el esputo de los pacientes con TB hasta un año después de finalizar el tratamiento. Por el contrario, el ARNm procariótico tiene una vida media corta y, por lo tanto, se predice que se encontrará solo en organismos viables. El ARN ribosómico (ARNr) es una diana de ARN relativamente estable, en comparación con el ARNm, con una vida media sustancialmente más larga que el ARNm y una mayor abundancia que el ARNm, con niveles estimados de 100 veces más que para el grupo total de ARNm. Por lo tanto, la estabilización, la extracción y los análisis de ARN serán especialmente valiosos para diagnosticar y tratar muestras positivas para TB y con frotis negativo previamente pasadas por alto, y para medir rápidamente el margen terapéutico o la efectividad de los nuevos regímenes farmacológicos o las terapias antituberculosas actuales. La rápida desaparición del ARNm de MT del esputo de pacientes con TB positiva sugiere que es un buen indicador de la viabilidad microbiana y un marcador útil para la evaluación rápida de la respuesta a la terapia (LE Desjardin y otros “Measurement of sputum Mycobacterium tuberculosis messenger RNA as a surrogate for response to chemotherapy” (1999) Am J Respir Crit Care Med 160: 203-210).

Los métodos 'no mecánicos' actualmente disponibles para la extracción de ADN incluyen 'Extracción rápida’ (mezclar la muestra con tampón de lisis que incluye Tris, EDTA y Triton X-100, hervir 15 minutos, precipitación de ADN con isopropanol), 'Extracción orgánica' (mezclar la muestra con fenolcloroformo-alcohol isoamílico, ADN precipitado de la capa acuosa), 'Extracción basada en sílice' (mezclar la muestra con tampón de lisis que incluye tiocianato de guanidina, EDTA y Triton X-100, incubar con sílice, lavar, eluir el ADN de sílice) y partículas magnéticas, por ejemplo. 'MagaZorb™' (mezclar la muestra con Proteinasa K y tampón de lisis, incubar, añadir tampón de unión y partículas magnéticas, lavar, eluir el ADN de las partículas). En la actualidad, el ARN puede liberarse de la MT solo mediante disrupción física o mecánica (por ejemplo, batidor de microesferas) y, a menudo, se degrada.

El documento WO2006133701 describe un método rápido de extracción de ADN que extrae ácidos nucleicos de hongos (por ejemplo, dermatófitos y otros hongos patógenos) que puede realizarse directamente en muestras de cabello, uñas o piel de seres humanos, de animales infectados de forma natural o experimental o de colonias fúngicas cultivadas para su uso en ensayos de amplificación y detección por la PCR.

El documento WO2013188740 describe anticuerpos anti-antígeno de membrana específicos de la próstata (alfaPSMA) y conjugados de ligando de receptor nuclear (NRL) de anticuerpo alfa-PSMA que comprenden al menos un aminoácido no codificado de forma natural.

El documento EP0265519 describe ensayos electroquimioluminiscentes cualitativos y cuantitativos para analitos de interés presentes en líquidos multicomponentes.

El documento US2005070109 describe una suspensión para eliminar metales, útil en la fabricación de circuitos integrados en general, y para el pulido químico-mecánico de metales nobles en particular, que puede formarse mediante la combinación de ácido peryódico, un abrasivo y un sistema tampón, en donde el pH de la suspensión es entre aproximadamente 4 y aproximadamente 8.

El documento EP2075824 describe una composición para pulir que logra superficies con alta planaridad y al mismo tiempo proporciona la reducción de la corrosión en la superficie metálica del cableado. Tales composiciones incluyen (A) un agente oxidante; (B) al menos un ácido seleccionado de un aminoácido, un ácido carboxílico de no más de 8 átomos de carbono y un ácido inorgánico; (C) un ácido sulfónico que tiene una concentración de 0,01 % en masa o más y que tiene un grupo alquilo de 8 o más átomos de carbono; (D) un ácido graso que tiene una concentración de 0,001 % en masa o más y que tiene un grupo alquilo de 8 o más átomos de carbono; y (E) al menos un compuesto seleccionado de un compuesto de piridina carbonilo, un polímero soluble en agua no iónico, 2-pirrolidona, N-metilpirrolidona, 1,3-dimetil-2-imidazolidinona, gramina, adenina, N, N'-diisopropiletilendiamina, N,N'-bis(2-hidroxietil)etilendiamina, N,N'-dibenciletilendiamina y N,N'-difeniletilendiamina.

El documento WO0078150 describe composiciones que generan continuamente yodo molecular libre que incluyen una sal de yoduro y una sal de persulfato. Se proporcionan métodos para preparar tales composiciones y para usar tales composiciones para la desinfección.

K. Randerath y otros (1974) Nucleic Acids Research, 1121-1142, describe el análisis de secuencias de fragmentos de ARN no radiactivos mediante digestión con peryodato-fosfatasa y marcaje químico con tritio.

El documento WO0140277 describe glicoproteínas aminadas de carbohidrato (por ejemplo, anticuerpos, factores de crecimiento) que comprenden un resto de diamina que se une covalentemente a un resto de carbohidrato a través de un enlace simple o doble que se forma entre un átomo de nitrógeno de dicho resto de diamina y un átomo de carbono de un resto de carbohidrato oxidado de dicha glicoproteína, y a composiciones farmacéuticas que comprenden las glicoproteínas aminadas con carbohidrato.

Esta información de antecedentes se proporciona con el propósito de dar a conocer información que el solicitante cree que sea relevante para la presente invención. No se pretende admitir necesariamente, ni debe interpretarse, que cualquier información anterior forma parte del estado de la técnica anterior con respecto a la presente invención. Resumen

Un objeto de la presente invención es proporcionar un método y un sistema para la liberación de ADN y ARN de microbios mediante el uso de peryodatos. La presente invención se describe en las reivindicaciones adjuntas. En la presente descripción se describe el uso de una composición que comprende un agente oxidante y un tampón, en el que el agente oxidante es ácido peryódico, peryodato o persulfato.

Se describe un método para extraer ácido nucleico de un microorganismo que comprende mezclar una muestra sospechosa de contener el microorganismo con un agente oxidante y calentar la mezcla resultante, en donde el agente oxidante es ácido peryódico, peryodato o persulfato.

Se describe además un kit para la extracción de ácidos nucleicos, en donde el kit comprende (i) una composición de extracción que comprende peryodato o persulfato en una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 300 mM y un tampón a un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 13; e (ii) instrucciones de uso.

También se describe un método para la cuantificación del ácido nucleico total en una muestra, que comprende (i) tratar la muestra con un ácido y calentar la muestra acidificada; (ii) neutralizar la muestra acidificada; y (iii) someter la muestra neutralizada a HPLC mediante el uso de una columna de fase inversa y monitorear el eluyente por espectroscopía UV para identificar el pico correspondiente a la adenina; (iv) calcular el área bajo las curvas de los picos de adenina como medida del ácido nucleico total en la muestra.

Breve descripción de las figuras

Para una mejor comprensión de la presente invención, así como también de otros aspectos y características adicionales de esta, se hace referencia a la siguiente descripción que se usará junto con las figuras adjuntos, donde:

la Figura 1 representa gráficamente los resultados de un tratamiento con ácido para liberar adenina a partir de ADN puro;

la Figura 2 representa gráficamente los resultados de la liberación de adenina del ADN presente en una suspensión de células intactas de Bacillus subtilis en función de la concentración de ácido;

la Figura 3 representa gráficamente los resultados de una comparación del ADN total detectado por el método de extracción ácida y por el método de batido de microesferas;

la Figura 4 es una fotografía de un gel de agarosa que muestra los ácidos nucleicos liberados de S. cerevisiae mediante el uso de composiciones de la presente solicitud;

la Figura 5 es una fotografía de un gel de agarosa que muestra el ADN y el ARN liberados de Bacillus subtilis mediante el uso de peryodato y calentamiento.

La Figura 6 es una fotografía de un gel de agarosa que muestra el ADN y el ARN liberados de Mycobacterium smegmatis mediante el uso de peryodato y calentamiento.

La Figura 7 representa gráficamente la detección del ADN específico de C. botulinum de esporas extraídas con, en comparación con el kit de aislamiento disponible comercialmente (Roche).

La Figura 8 representa gráficamente la detección de ADN específico de C. difficile de esporas extraídas con peryodato, en comparación con el kit de aislamiento disponible en el mercado (Roche).

La Figura 9 representa gráficamente una comparación del método "Peryodato" y la sensibilidad del método "Estándar de Cuidado" de la rtPCR.

La Figura 10 representa gráficamente el análisis de la rtPCR de muestras de esputo cargadas de TB baja, media y alta.

La Figura 11 representa gráficamente el porcentaje de ADN de aMTB recuperado de muestras de saliva mediante el uso de diferentes metodologías de extracción.

La Figura 12 es una fotografía de una SDS-PAGE de ribonucleasa A pancreática pura tratada con peryodato. La Figura 13 es una fotografía de una SDS-PAGE de lisado de M. smegmatis tratado con peryodato.

La Figura 14 es una fotografía de una electroforesis en gel de agarosa que muestra la inhibición de la RNasa A mediante un pretratamiento con peryodato.

La Figura 15 representa gráficamente la viabilidad de las esporas de B. anthracis después de la descontaminación estándar y el tratamiento con peryodato.

La Figura 16 representa gráficamente la viabilidad de las esporas de C. botulinum después de la descontaminación estándar y el tratamiento con peryodato.

La Figura 17 representa gráficamente la viabilidad de las esporas de C. difficile después de la descontaminación estándar y el tratamiento con peryodato.

Descripción detallada

A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.

Como se usa en la especificación y las reivindicaciones, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referencias al plural a menos que el contexto lo indique claramente de cualquier otra manera.

El término "que comprende", como se usa en la presente descripción, se entenderá que significa que la siguiente lista no es exhaustiva y puede incluir o no cualquier otro elemento adicional adecuado, por ejemplo, una o más característica(s), componente(s) y/o ingrediente(s) según sea apropiado.

El término "muestra" como se usa en la presente descripción se entenderá que significa cualquier espécimen que potencialmente contiene una sustancia de interés, que es opcionalmente un ácido nucleico, proteína u otras biomoléculas de interés. El término "muestra" puede abarcar una solución, tal como una solución acuosa, célula, tejido, biopsia, polvo o población de uno o más de los mismos. La muestra puede ser una muestra biológica, tal como saliva, esputo, muestra de exudado bucal, suero, plasma, sangre, capa leucocitaria, exudados o secreciones faríngeas, nasales/nasofaríngeas o sinusal, exudados o raspados de garganta, orina, mucosas, heces, exudados rectales, exudados de lesiones, quimo, vómito, jugos gástricos, jugos pancreáticos, jugos gastrointestinal, semen/esperma, exudados y secreciones uretrales, líquido cefalorraquídeo, productos de la lactancia o la menstruación, yema de huevo, líquido amniótico, humor acuoso, humor vítreo, secreciones o exudados cervicales, líquido/secreciones/exudados o raspados vaginales, muestras y aspirados de médula ósea, líquido y derrames pleurales, sudor, pus, lágrimas, lavados o aspirados linfáticos, bronquiales o pulmonares, derrames peritoneales, cultivos celulares y suspensiones celulares, tejido conjuntivo, epitelio, exudados y frotis epiteliales, membrana mucosa, tejido muscular, tejido placentario, biopsias, exudados, tejido orgánico, tejido nervioso, cabello, piel, uñas, plantas, extractos de plantas, algas, muestras de suelo, raspado de equipos de procesamiento de drenaje, aguas residuales, alimento, carne o similares. La muestra también puede ser una muestra estabilizada o conservada, en la que una muestra original que contiene ácido nucleico se ha mezclado o tratado de cualquier otra manera con una solución de almacenamiento tal como la que se encuentra en kits tales como, pero no se limita a, Oragene®^DNA Collection Kits, Oragene®^RNA Collection Kits, OMNIgene®^Discover Infectious Disease Collection Kits, Performagene™^LIVESTOCK DNA Collection Kits, and Oragene®^Animal DNA Collection Kits, o una composición, tal como se describe en las Patentes de Estados Unidos núms. 7482 116, 8158357 y la Publicación de Patente de Estados Unidos núm. 2010/0099149. Preferentemente, el ácido nucleico dentro de tales muestras estabilizadas se mantiene sustancialmente intacto y no degradado durante períodos de tiempo prolongados, por ejemplo, desde el punto de recolección de la muestra, transporte al laboratorio de análisis y tratamiento.

El término "microorganismo" como se usa en la presente descripción, se entenderá que significa cualquier organismo microscópico y esporas, que incluye todos los procariotas, es decir, las eubacterias y arqueobacterias, y diversas formas de eucariotas, que comprenden los protozoos, hongos (por ejemplo, levadura), algas y animales como rotíferos y planarias.

Se entenderá que el término "quelante" como se usa en la presente descripción significa una sustancia química que formará un complejo soluble y estable con ciertos iones metálicos, lo que secuestra los iones de manera que normalmente no puedan reaccionar con otros componentes. Un quelante puede ser, por ejemplo, ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), ácido(2-hidroxietil)etilendiaminotriacético (HEDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido nitrilotriacético (NTA), ácido etilendiaminotriacético (EDTA), ácido ciclohexanodiaminotetraacético (CDTA), N,N-bis(carboximetil)glicina, citrato anhidro, citrato de sodio, citrato de calcio, citrato de amonio, bicitrato de amonio, ácido cítrico, citrato de diamonio, citrato de amonio férrico, citrato de litio o cualquier combinación de estos.

El término "agente desnaturalizante", tal como se usa en la presente descripción, se entenderá que significa cualquier producto químico que pueda hacer que las proteínas pierdan sus estructuras nativas secundarias y/o terciarias. Un agente desnaturalizante puede ser, por ejemplo, un detergente aniónico (tal como, por ejemplo, dodecilsulfato de sodio (SDS), dodecilsulfato de litio o lauroilsulfato de sodio (SLS)), un detergente catiónico (tal como, por ejemplo, bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), que puede ser adecuado en algunas aplicaciones de ácidos nucleicos; bromuro de cetilpiridinio o cloruro de alquilbencildimetilamonio), o un detergente no iónico (tal como, por ejemplo, Tween, Triton X o Brij).

La presente solicitud proporciona un método, una composición y un sistema para extraer ácido nucleico de microorganismos. El presente método, composición y sistema son capaces de liberar ácidos nucleicos de microorganismos y esporas que generalmente son resistentes a las técnicas estándar de extracción de ácidos nucleicos, como una o más especies del género Mycobacterium, una o más especies del complejo M. tuberculosis, Cepas MDR de M. tuberculosis, una o más especies de Clostridium, una o más especies de Bacillus y otros microorganismos con paredes celulares resistentes.

El presente método de extracción, composición y sistema tienen aplicaciones más allá del mercado de la tuberculosis. El método, la composición y el sistema son útiles en el diagnóstico y la investigación médica humana y animal (por ejemplo, genómica de poblaciones para estudiar la evolución, la virulencia, la resistencia a los fármacos y la epidemiología de los microorganismos). Además, muchos mercados/industrias están buscando formas eficientes de romper insectos y esporas resistentes, que incluye la inocuidad de los alimentos (plantas de procesamiento de alimentos/carne), muestreo de suelo y agua (pruebas ambientales), bioseguridad o biodefensa (esporas de ántrax y otras armas biológicas), pruebas de alimentos para animales, agricultura/ciencia vegetal/industria, producción de alcohol, etc.

Un nuevo enfoque de investigación en rápida expansión es la microbiota intestinal o el microbioma intestinal y el análisis de microbios en las heces de humanos sanos y enfermos. Por razones investigativas y económicas, también existe un interés inmenso en el análisis de los miles de microorganismos diferentes en el rumen de muchos animales de ganado, especialmente aquellos que se crían para carne y productos lácteos.

Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que un químico de laboratorio común, el peryodato, usado a pH ligeramente alcalino y temperatura elevada, puede usarse para liberar rápida y eficientemente ácido nucleico de microorganismos, tanto en estado vegetativo como latente (por ejemplo, endosporas y esporas). La sorprendente liberación de ácido nucleico parece ser específica de peryodatos y, en menor grado, de persulfatos. Los compuestos relacionados, como el yodato, no mejoran significativamente la liberación de ácidos nucleicos de bacterias u hongos.

La composición química y el método presentes tienen el potencial de simplificar y acelerar la preparación o procesamiento de muestras para la detección de microorganismos, sin la necesidad de una cadena de frío o descontaminación y emulsificación de muestras costosas y lentas. La composición química y el método pueden usarse en laboratorios centrales con sistemas de alto rendimiento o en clínicas rurales o móviles con infraestructura y equipo de laboratorio mínimos. Esta utilidad facilita la vigilancia epidemiológica y de brotes, el seguimiento de pandemias y epidemias a partir de muestras de campo en el sitio de recolección, así como la evaluación y el seguimiento rápidos de la respuesta del paciente a la terapia.

La pared celular resistente de Mycobacterium consta de una capa de micolato gruesa, cerosa e hidrófoba y una capa de peptidoglicano unida por polisacáridos. Para determinar si el componente ceroso de la pared celular podía eliminarse, se probaron varios solventes (por ejemplo, Varsol, DMSO y Hemo-De®), pero no se observó una mayor liberación de ADN. De manera similar, se probaron a temperaturas elevadas varios detergentes (por ejemplo, SDS), ácido fórmico y borato. Ninguno de estos compuestos, incluso a 100 °C, liberó más del 10 % del ADN de las micobacterias.

Además de liberar una fracción muy alta de ADN/ARN de los microorganismos, la presente composición y método de extracción no mecánica pueden tener la ventaja adicional de hacer que las muestras no sean infecciosas, lo que sería beneficioso para la seguridad del personal del laboratorio. Sorprendentemente, en condiciones en las que se libera esencialmente todo el ADN, la presente composición y método aún pueden permitir la tinción acidorresistente y la observación microscópica de las micobacterias. Por el contrario, los inventores observaron que la levadura se desintegraba rápidamente tras el tratamiento con la presente composición y método hasta el punto de que no era capaz de realizar análisis adicionales mediante tinción o microscopía.

El método y el sistema son útiles para liberar ADN/ARN de bacterias y esporas. Las bacterias pueden ser, por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis, especies del complejo Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti, Mycobacterium canetti, Mycobacterium caprae, Mycobacterium pinnipedi, Mycobacterium marinum, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium avium-intracellulare, Mycobacterium avium paratuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium gordonae, especies de Bacillus, Bacillus subtilis, Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Toxoplasma gondii, especies de Streptococcus, especies de Staphylococcus, Dientamoeba fragilis, Borrelia burgdorferi y otras especies, especies de Clostridia, Fusobacterium nucleatum, especies de Salmonella, especies de Campylobacter, bacterias Firmicutes, especies de Bartonella, especies de Rickettsia, especies de Yersinia, especies de Francisella, especies de Brucella, especies de Bordetella, especies de Burkholderia, especies de Pseudomonas, especies de Shigella, especies de Chlamydophila, especies de Legionella, especies de Listeria, especies de Corynebacterium, especies de Enterococcus, especies de Escherichia, especies de Haemophilus, especies de Helicobacter, especies de Leptospira, especies de Mycoplasma, especies de Neisseria, especies de Treponema o especies de Vibrio.

El método y sistema de la presente solicitud es útil para liberar ADN/ARN de hongos. El hongo puede ser, por ejemplo, Saccharomyces, Candida, Aspergillus, Histoplasma, Pneumocystis, Stachybotrys o Cryptococcus.

Composiciones de Extracción de Peryodato

Los peryodatos pueden existir en muchas formas, que incluyen meta y ortoperyodato (IO⁴- e IO6-5, respectivamente), que son aniones formados a partir de yodo y oxígeno y se encuentran comúnmente como sales con potasio (por ejemplo, KIO⁴) o sodio (por ejemplo, NaIO4). Se conocen al menos cuatro series de peryodatos en soluciones acuosas, a saber, ácidos ortoperyódicos (H⁵IO⁶), peryódicos (HIO⁴), mesoperyódicos (H³IO⁵) y triperyódicos (H⁷ I³O¹⁴) [NN Greenwood y A. Earnshaw, Chemistry of the Elements, 2a edición, Butterworth Heinemann, Oxford, capítulo 17, págs. 872-875 (1998)]. En solución, los peryodatos pueden ser agentes oxidantes y se utilizan en bioquímica molecular con el fin de abrir anillos sacáridos y marcar el ARN. El peryodato escinde el enlace entre átomos de carbono adyacentes que tienen grupos hidroxilo (cis-glicoles) en polímeros sintéticos y polisacáridos y monosacáridos naturales, lo que crea dos grupos aldehído. Estos aldehídos pueden usarse en dos tipos de reacciones de acoplamiento con etiquetas/etiquetas activadas con amina primaria o hidrazida, soportes de inmovilización y reactivos de reticulación. El ácido peryódico también se usa en la tinción histológica, ácido peryódico de Schiff (PAS), un método de tinción usado para detectar glucógeno y otros polisacáridos en los tejidos. Sin embargo, según el conocimiento de los inventores, el peryodato nunca se ha usado previamente para la extracción de ADN y/o ARN de microorganismos.

Las composiciones de extracción de peryodato son soluciones acuosas de peryodato que pueden comprender de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 100 mM, preferentemente de 5 mM a aproximadamente 30 mM cuando se mezclan con la muestra, que puede ser meta-peryodato, orto-peryodato o cualquier combinación de estos. Las composiciones que tienen peryodato en concentraciones tan bajas como 5 mM de peryodato a pH ligeramente alcalino, junto con calor, liberan una cantidad significativa de ADN de bacterias resistentes y esporas, que incluye, sin limitación, especies de Mycobacterium, Clostridium y Bacillus. Las concentraciones de peryodato de hasta 25-30 mM en una muestra también tienen éxito en la liberación eficiente de ADN de los microorganismos en dicha muestra. Es probable que incluso concentraciones más altas de peryodato tengan éxito, pero pueden ocurrir reacciones secundarias no deseadas. La solubilidad práctica máxima del peryodato de sodio es de aproximadamente 400 mM, lo que dificulta potencialmente la producción de composiciones altamente concentradas o soluciones madre para fines de fabricación.

Para evitar los problemas de solubilidad de los peryodatos en altas concentraciones, pueden añadirse a la composición en forma de ácido peryódico, que puede neutralizarse mediante el uso de una base como NaOH. Alternativamente, el peryodato se introduce en forma de una sal de peryodato, tal como peryodato de sodio (también denominado en la presente descripción como NPI), peryodato de potasio o peryodato de litio. Se prefiere el uso de la sal de sodio de peryodato (NaIO4) sobre las sales de potasio y litio debido a su mayor solubilidad. Alternativamente, puede usarse persulfato de sodio (Na²S²O⁸), persulfato de potasio y persulfato de amonio para liberar ácido nucleico de microorganismos y esporas.

Mientras que una solución simple de peryodato de sodio en agua y mezclada con una muestra extrae ácidos nucleicos de microorganismos, la acción del peryodato depende del pH. A un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 11, se observa la extracción de ADN y ARN, lo que conserva mejor la integridad del ARN a un pH más cercano al neutro. En determinadas modalidades, la composición de extracción de la presente solicitud se tampona a un pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 11, o de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 10,5, o de aproximadamente 9,5 a aproximadamente 10,5. En una modalidad, para determinar el intervalo de pH óptimo, la composición de extracción se tampona mediante el uso de una combinación de agentes tamponantes. Por ejemplo, la composición puede tamponarse mediante el uso de una combinación de ácido fosfórico (pKa 2,15, 7,20, 12,38), ácido acético (pKa 4,76) y ácido bórico (pKa 9,24).

Opcionalmente, las composiciones de extracción de peryodato pueden comprender componentes adicionales, que incluyen sales de litio, detergentes y/o quelantes. En una modalidad específica, la composición de extracción de peryodato comprende adicionalmente LiCl, SDS y/o CDTA. Opcionalmente, la composición comprende adicionalmente glicina o borato como agentes tamponantes. De manera beneficiosa, estos componentes adicionales ayudan a garantizar que los ácidos nucleicos permanezcan intactos durante su extracción de microorganismos y el procesamiento de muestras biológicas para posteriores pruebas moleculares aguas abajo (por ejemplo, PCR, micromatrices). Los componentes adicionales también pueden ayudar a licuar la muestra y estabilizarla durante su manipulación. Si la muestra se recolecta inmediatamente en una composición de peryodato con estos componentes adicionales, los ácidos nucleicos se conservarán de manera óptima desde el punto de recolección, durante el transporte y el almacenamiento de la muestra, lo que permitirá el procesamiento de la muestra para extraer los ácidos nucleicos y culminará en la prueba de interés.

Opcionalmente, la composición de extracción sin peryodato que contiene LiCl, SDS y/o CDTA y/o glicina o borato como agentes tamponadores puede usarse para conservar los ácidos nucleicos en la muestra desde el punto de recogida, durante el transporte y almacenamiento hasta que se requiera la extracción nucleica. En ese momento, puede añadirse peryodato y puede llevarse a cabo el procesamiento de la muestra para extraer ácidos nucleicos, para culminar en la prueba de interés.

Método de Extracción de Ácido Nucleico

La presente solicitud proporciona además un método para extraer ácido nucleico de una muestra que comprende un microorganismo. El método comprende poner en contacto una muestra que contiene un microorganismo con una composición que comprende peryodato y calentar la mezcla resultante.

De acuerdo con modalidades particulares, el método comprende las siguientes etapas:

- Preparar una suspensión de microorganismos: en un ejemplo, cuando los microorganismos son cultivos de bacterias en caldo, las células se recolectan por centrifugación y se lavan (por ejemplo, dos veces con solución salina) para eliminar los contaminantes que interfieren que pueden estar presentes en un medio de cultivo complejo. Las células lavadas (aproximadamente 5-20 x 108) deben suspenderse bien en agua (por ejemplo, aproximadamente 200 pl).

- Añadir composición de extracción de peryodato: normalmente se mezcla un volumen igual de composición de extracción con un volumen igual de suspensión celular (por ejemplo, se mezclan 200 pl de reactivo de extracción con 200 pl de suspensión celular).

- Calentar la suspensión: La etapa de calentamiento suele realizarse con la suspensión de la etapa anterior en un tubo cerrado. Típicamente, la etapa de calentamiento se realiza a una temperatura de 45 °C o superior, o a una temperatura de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 100 °C, y un tiempo de aproximadamente 15 min a aproximadamente 60 minutos. Tiempos más largos y temperaturas más altas pueden ser más efectivos para liberar ADN, pero el ADN liberado puede degradarse parcialmente. Casi el 100 % de la liberación del ADN de Mycobacterium smegmatis tratado con peryodato se produce con el calentamiento a 80 °C durante unos 20 min, con una degradación mínima del ADN.

En una modalidad específica, la muestra se trata primero con una composición de estabilización o pretratamiento antes de la adición de la composición de extracción de peryodato. En un ejemplo de tal método, pueden realizarse las siguientes etapas:

1) recolectar una muestra, como una muestra de esputo (por ejemplo, en un entorno remoto) en un reactivo de estabilización como Oragene® u OMNIgene®, que estabiliza el ácido nucleico en condiciones ambientales; 2) transportar la muestra estabilizada a un laboratorio sin necesidad de cadena de frío (por ejemplo, sin refrigeración);

3) añadir la composición de peryodato a la muestra estabilizada y calentar para liberar rápida y efectivamente prácticamente todos los ácidos nucleicos de los microorganismos duros (por ejemplo, M. tuberculosis) y esporas y hacer que la muestra no sea infecciosa;

4) procesar de manera rápida y rentable la muestra tratada para aislar el ácido nucleico liberado en la etapa 3; y, opcionalmente,

5) realizar una o más pruebas de diagnóstico mediante el uso del ácido nucleico liberado.

Como resultado de la liberación mejorada de ácido nucleico en comparación con las tecnologías existentes, el presente tratamiento con peryodato puede conducir a una mayor sensibilidad de las pruebas de diagnóstico y un diagnóstico o determinación más precisos de la efectividad de los regímenes de tratamiento.

La presente solicitud proporciona además un kit para la extracción de ADN. El kit incluye una composición de extracción que comprende peryodato a una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM y un tampón a un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 13. Como se describió anteriormente, la composición de extracción puede comprender componentes adicionales, que incluyen una sal de litio, un agente desnaturalizante y/o un quelante. El kit puede comprender adicionalmente instrucciones para realizar el método de extracción descrito anteriormente, un recipiente o recipientes de reactivos y/o un recipiente receptor de muestras. Método para Descontaminación/Desinfección

La presente solicitud proporciona además un método para descontaminar o desinfectar una superficie, por ejemplo, de un dispositivo, instrumento o estructura. El método comprende poner en contacto una superficie con una composición que comprende peryodato y calentar la superficie.

Como se ha demostrado en la presente descripción, el método de tratar un microorganismo con una composición que comprende peryodato y calor da como resultado la liberación de ADN del microorganismo. Una consecuencia de esta liberación de ADN es que el microorganismo ya no es viable. El Ejemplo 12 más abajo demuestra la capacidad de la presente composición de peryodato más calor para convertir en no viables a tres bacterias resistentes.

Normalmente, la etapa de calentamiento en el método de descontaminación o desinfección se realiza a una temperatura de 45 °C o superior, o a una temperatura de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 100 °C, y un tiempo de aproximadamente 15 min a aproximadamente 60 minutos. También pueden usarse tiempos más largos y temperaturas más altas en el presente método, ya que pueden ser más efectivos para liberar ADN y descontaminar o desinfectar la superficie. El calor puede aplicarse a la superficie mediante el uso de varios medios, como, pero no se limita a, lámparas de calor, sistemas de calefacción radiante y hornos.

Método para la Cuantificación de ADN Total en una Suspensión Microbiana

La presente solicitud proporciona un método para la cuantificación del ADN total en una muestra, que incluye una muestra microbiológica. Este método se usa para establecer la cantidad total de ADN en una muestra que se usará como referencia para calcular la eficiencia de liberación de ADN por las composiciones descritas en la presente descripción.

Es bien sabido que la exposición a condiciones ácidas relativamente suaves puede causar la degradación del ADN (rupturas en la columna vertebral). La degradación ocurre en dos etapas. En primer lugar, el ácido cataliza la depurinación del ADN, es decir, la liberación de las bases nitrogenadas de purina (adenina y guanina), pero no de las bases nitrogenadas de pirimidina (timina y citosina). El resultado es una estructura bastante estable llamada ácido apurínico. Finalmente, la columna vertebral se rompe en los sitios apurínicos por eliminación p y se libera desoxirribosa y fosfato; este proceso se acelera mediante el tratamiento con álcali o determinados catalizadores [por ejemplo, K. Burton, M.R. Lunt, G.B. Petersen, JC Siebke, Studies of Nucleotide Sequences in Deoxyribonucleic Acid, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, vol. 28, págs. 28-34 (1963)].

Por el contrario, la depurinación de ARN por tratamiento con ácido suave no se ha estudiado previamente en detalle. Generalmente se entiende que las purinas de ARN son más estables que las de ADN, pero no se ha realizado una comparación por pares. Por el contrario, se sabe que el ARN se degrada fácilmente mediante el tratamiento con álcali suave, mientras que la cadena principal del ADN es muy estable en estas condiciones [(por ejemplo, G. Schmidt y S.J. Thannhauser, A method for the determination of deoxyribonucleic acid, ribonucleic acid, and phosphoproteins in animal tissues. Journal of Biological Chemistry vol. 161, pp. 83-89 (1945)]. La descomposición catalizada por álcali de la cadena principal del ARN se produce en dos etapas. Primero, el enlace fosfodiéster que une el hidroxilo 3' de la ribosa de un nucleótido con el hidroxilo 5' del nucleótido vecino se transfiere (no se rompe) al hidroxilo 2' del primer nucleótido. Esto da como resultado la escisión de la cadena sin ruptura hidrolítica de un enlace fosfoéster. El 2',3'-fosfodiéster cíclico resultante es relativamente estable, pero puede escindirse lentamente con un tratamiento adicional con álcali al 2'-fosfomonoéster o al 3'-fosfomonoéster con aproximadamente la misma frecuencia. En estas condiciones, la cadena principal del ADN es muy estable, ya que su azúcar (desoxirribosa) carece de un hidroxilo 2' adyacente al hidroxilo 3', por lo que la sencilla primera etapa, la formación de un 2',3'-fosfodiéster cíclico, no es posible.

Aunque la literatura científica contiene información general sobre las reacciones descritas anteriormente, no se han descrito previamente condiciones detalladas y específicas de tratamiento con ácido que produzcan una depurinación casi cuantitativa del ADN, mientras que causan poca o ninguna depurinación del ARN.

Tener condiciones bien definidas bajo las cuales la adenina y la guanina se liberan cuantitativamente del ADN, pero no del ARN, tiene una gran utilidad. Permite una cuantificación sensible y reproducible de ADN en muestras biológicas complejas y microorganismos, algo que en la actualidad es difícil, sin etapas de amplificación anteriores a la detección. Por ejemplo, la preparación de la muestra y la purificación del ADN son las primeras etapas necesarias antes de que puedan aplicarse métodos de ensayo como la absorbancia UV o los colorantes fluorescentes de unión al ADN. Los métodos químicos basados en difenilamina o DABA (ácido diaminobenzoico) están sujetos a la interferencia de compuestos en muestras biológicas, que incluye los polisacáridos complejos [G. M. Richards, Modifications of the diphenylamine reaction giving increased sensitivity and simplicity in the estimation of DNA. Analyt. Biochem. 57, 369-376 (1974); J.M. Kissane, E. Robins, The fluorometric measurement of deoxyribonucleic acid in animal tissues with special reference to the central nervous system. J. Biol. Chem. 233, 184-188 (1958)]. Sorprendentemente, actualmente no existe un método simple y preciso para determinar la cantidad de ADN (o ARN) presente en una suspensión de microorganismos intactos sin procesar. Tener dicha información es fundamental para determinar la eficiencia con la que cualquier método o composición existente o novedosa libera ADN de una suspensión de organismos. La eficiencia de extracción (E) se define como la cantidad de ADN extraído por un tratamiento (ADNe) dividida por la cantidad total de ADN inicialmente presente en la muestra no tratada (ADNt).

ADNe

E = -------

ADNt

El método de Extracción Ácida/HPLC descrito actualmente se desarrolló para permitir tal determinación.

En consecuencia, la presente solicitud proporciona un método para la determinación del ADN total en una muestra. El método se describe en detalle en el Ejemplo 1 más abajo. Generalmente, el método comprende la etapa de calentar una muestra que contiene ácido nucleico con HCl (un paso de "hidrólisis ácida") u otro ácido (tal como, por ejemplo, ácido fórmico concentrado), seguido de la neutralización de la muestra antes del análisis por HPLC mediante el uso de una columna de HPLC de fase inversa (por ejemplo, columna Gemini-NX). La fase móvil puede seleccionarse entre varios solventes o mezclas de solventes en función de la columna específica usada, etc. La selección de la fase móvil apropiada estaría dentro de las capacidades estándar de un trabajador experto en la técnica. En una modalidad, la fase móvil es metanol al 2 %, CDTA 1 mM, acetato de amonio 30 mM, ajustado a pH 6,3 con monofosfato de sodio. Opcionalmente, el método comprende adicionalmente un paso para permitir la cuantificación del ARN. Para determinar la cantidad de ARN en una muestra, se añade NaOH, luego de la etapa de calentar la muestra con HCl, hasta un exceso de 0,1 N sobre la cantidad de HCl añadido y se incuba a 100 °C durante 15 minutos.

El área bajo la curva ("AUC") para los picos de HPLC correspondientes a la adenina (que representa el ADN) y al monofosfato de adenosina 2' o 3' (2'- y 3'-AMP) (que representa el ARN) se calculó mediante el uso del software TotalChrom Navigator (Perkin Elmer). Las curvas estándar pueden generarse mediante el uso de concentraciones conocidas de estos analitos puros (adenina de Alfa Aesar; 2'- 3'-AMP (mezcla) de Sigma-Aldrich).

Para obtener una mejor comprensión de la invención descrita en la presente descripción, se exponen los siguientes ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos son solo para fines ilustrativos. Por lo tanto, no deben limitar el alcance de esta invención de ninguna manera.

Ejemplos

Ejemplo 1: Método de Extracción Ácida/HPLC para Medir el ADN total en una muestra

La Tabla 1 describe los detalles del método de Extracción Ácida/HPLC desarrollado por los presentes inventores para medir con precisión la cantidad total de ácido nucleico en microorganismos/muestras vírgenes o sin procesar, así como también los ácidos nucleicos liberados de dichos microorganismos/muestras resultantes del tratamiento con la invención.

Tabla 1. Protocolo típico para la liberación de ácidos nucleicos de microbios resistentes mediante el uso del método de extracción descrito actualmente y para la medición de ADN y ARN en microbios intactos y tratados

Ejemplo 1 A: ADN Puro. Condiciones Óptimas de Extracción de Ácido para la Liberación Completa de Adenina del ADN

En este ejemplo, se midió la cantidad de adenina liberada del ADN genómico puro por tratamiento con ácido durante diferentes períodos de tiempo. Cuatrocientos sesenta nanogramos de ADN canino puro (Novagen) se sometieron al método de extracción ácida durante los tiempos indicados a 60 °C. Los resultados se muestran en la Figura 1. Las barras de error indican el SEM de muestras por triplicado.

Los resultados indican que un período de incubación de 60 minutos a 60 °C es suficiente para liberar la cantidad máxima de adenina del ADN. La gran mayoría de la adenina se libera a los 40 minutos y no se libera más adenina a los 80 minutos de tratamiento, lo que indica una depurinación completa de la adenina a los 60 minutos.

Ejemplo 1B: Concentración de Ácido Óptima para la Liberación de Adenina a partir de Células Bacterianas Intactas Las células de Bacillus subtilis se incubaron durante 60 minutos a 60 °C con diferentes concentraciones (normales) de HCl, como se muestra en la Figura 2. Barras de error, promedio e intervalo de duplicados; donde no se muestran barras de error, el valor de los intervalos está dentro de los símbolos.

Los resultados indican que la liberación máxima de adenina de las células intactas de B. subtilis se produce con una concentración de HCl en el intervalo de aproximadamente 0,20 - 0,25 N.

Ejemplo 1C: Método CFU para estimar el contenido de ADN en comparación con el Método de Extracción Ácida/HPLC

Este experimento fue diseñado para comparar la cantidad de ADN presente en un cultivo bacteriano mediante el conteo del número de células bacterianas (según lo estimado por las Unidades Formadoras de Colonias (CFU)) con la cantidad de ADN calculada a partir del AUC para la adenina mediante el uso del Método de Extracción Ácida/HPLC.

El Método CFU es un método clásico usado para estimar el número de células bacterianas viables en una muestra. Sin embargo, requiere mucho tiempo y tiene limitaciones teóricas. Las bacterias suelen crecer en pequeños grupos. Por lo tanto, lo que se califica como una "colonia" visible de bacterias en realidad puede surgir de una sola célula o de un grupo de 2 o más células. Además, cualquier célula no viable en un cultivo contendrá ADN, pero no formará colonias. Estos dos factores tienden a subestimar el número real de células bacterianas en una suspensión. A partir de las estimaciones del número de células y el conocimiento "bibliográfico" del ADN por célula, puede calcularse la cantidad total de ADN en una suspensión celular.

Por el contrario, el Método de Extracción Ácida/HPLC es un método químico directo para estimar la cantidad total de ADN en una suspensión celular. Los inventores desarrollaron este método principalmente para demostrar la efectividad de la liberación de ácidos nucleicos a partir de esporas y microorganismos resistentes. El método (descrito en detalle anteriormente) se basa en la liberación de purinas del ADN y la extracción de adenina de las células, y luego en la detección y cuantificación de la adenina mediante el uso de la HPLC. Una cantidad conocida de adenina puede convertirse en una cantidad conocida de ADN a partir de la composición de bases del ADN. Por ejemplo, el factor de conversión de adenina a ADN es 10, para ADN que tiene un contenido de GC del 48 %.

Este ejemplo compara los Métodos CFU y de Extracción Ácida/HPLC por su capacidad para medir el ADN en una suspensión de Bacillus subtilis. Para estimar las CFU, se lavó una suspensión de bacterias en fase logarítmica (crecidas en caldo de soja tríptico (TSB)) con una solución fría de Tris 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6 y se dividió en 2 porciones. Una porción se diluyó en serie en TSB, por triplicado, y se extendió sobre la superficie de una placa de agar de soja tríptico. Después de 18 horas de crecimiento a 37 °C, se enumeró el número de colonias visibles. La otra porción se dividió en tres tubos y se centrifugó. Los sedimentos se llevaron a 200 pl de HCl 0,2 N, se incubaron a 60 °C durante 60 minutos, se neutralizaron con ADA y se analizaron mediante HPLC.

A partir de los datos de la secuencia del genoma publicados, se consideró que el tamaño del genoma de Bacillus subtilis era de 4880 ng/109 células.

Tabla 2: Método CFU estándar

Tabla 3: Método de Extracción Ácida/HPLC

Los Métodos CFU y de Extracción Ácida/HPLC proporcionaron estimaciones muy similares de los recuentos bacterianos en un cultivo puro de B. subtilis. El Método de Extracción Ácida/HPLC proporcionó una estimación un 20 % más alta, lo que está en consonancia con la subestimación esperada del número de células por el método CFU discutido anteriormente. Este ejemplo respalda la noción de que el Método de Extracción Ácida/HPLC libera efectivamente adenina del ADN intracelular, lo que permite su detección mediante HPLC.

Ejemplo 1D: Método de Lisozima/Detergente para Estimar el Contenido de ADN en Comparación con el Método de Extracción Ácida/HPLC

Este experimento se diseñó para comparar la cantidad de ADN liberado de B. subtilis Gram positiva (es decir, sensible a la lisozima) mediante un método de lisis enzimática con la cantidad de ADN medida en células intactas mediante el Método de Extracción Ácida/HPLC. Se sabe que los organismos Gram positivos, como B. subtilis, son muy sensibles a la lisis mediante el tratamiento con la enzima lisozima seguido de un tratamiento con SDS (por ejemplo, B.M. Chassy. A gentle method for the lysis of oral streptococci. Biochem Biophys Res Commun 68: 603-608 (1976)). Las lisozimas son glucósidos hidrolasas que funcionan mediante el ataque a los peptidoglucanos que se encuentran en las paredes celulares de las bacterias, especialmente las bacterias Gram positivas. Si el Método de Extracción Ácida/HPLC es realmente efectivo, la cantidad de adenina liberada por el tratamiento ácido de células completas y detectada por HPLC debería ser similar a la cantidad liberada por lisis de células con lisozima más SDS. Protocolo de Lisozima:

- Se cultivó Bacillus subtilis hasta la fase exponencial en 1 ml de caldo LB y se recogió mediante centrifugación. - Las células se lavaron en tampón TE enfriado con hielo (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0). El sedimento se llevó a 1 ml de tampón TE, se dividió en cuatro alícuotas y se lavó una vez más con TE.

- Dos de los sedimentos se resuspendieron en 950 ^l de lisozima (1 mg/ml en TE) y se incubaron 45 minutos a 37 °C.

- Se añadieron 50 ^l de SDS al 10 % hasta una concentración final de 0,5 %.

- El SDS se eliminó mediante la adición de KCl (concentración final 0,1 M), incubación a 0 °C durante 5 minutos y centrifugación durante 5 minutos. Los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos; los sedimentos se desecharon.

- Las muestras se sometieron al Método de Extracción Ácida/HPLC.

- Los dos sedimentos restantes sin tratar se llevaron a 500 ^l de H²O y se sometieron al Método de Extracción Ácida/HPLC.

Tabla 4: El Método de Extracción Ácida/HPLC detecta la misma cantidad de ADN en células intactas de B. subtilis que se libera después del tratamiento con lisozima/SDS de las mismas células

La cantidad de adenina liberada de B. subtilis intacta mediante el tratamiento ácido fue esencialmente idéntica a la cantidad de adenina liberada mediante el tratamiento con lisozima/SDS, un procedimiento que se espera que libere el 100 % del ADN mediante la lisis del 100 % de las células. Esto proporciona una fuerte evidencia de que el Método de Extracción Ácida/HPLC es una herramienta muy efectiva para determinar la cantidad de ADN en células bacterianas Gram positivas intactas.

Ejemplo 1E: Método de Batido de Microesferas para estimar el contenido de ADN en comparación con el Método de Extracción Ácida/HPLC de Bacillus subtilis

Este estudio se realizó para comparar la cantidad inicial de ADN en células bacterianas intactas (estimada por el Método de Extracción Ácida/HPLC) con la cantidad de ADN liberado de la misma bacteria mediante el uso de un método de "batido de microesferas". El procedimiento usado para la Extracción Ácida/HPLC fue como se describió anteriormente. El procedimiento usado para el método Batido de Microesferas se resume más abajo:

- Se recogieron por centrifugación múltiples alícuotas de 2 ml de cultivo en fase estacionaria de B. subtilis y se lavaron dos veces por centrifugación en una solución fría de Tris 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6 (TBS).

- El batido de microesferas se realizó en un Mini-BeadBeater-16 (BioSpec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, los sedimentos bacterianos lavados se suspendieron en 500 pl de TBS y se transfirieron a un microtubo de polipropileno con tapón de rosca que contenía aproximadamente 100 pl de microesferas de vidrio de 100 pm (Polyscience).

- Se fijó el tubo al instrumento y se agitó vigorosamente en dos ciclos de 1 minuto a 3450 oscilaciones/minuto. La muestra se enfrió en hielo durante 1 minuto entre los ciclos.

- La suspensión se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y las células intactas y los desechos se eliminaron mediante centrifugación durante 5 minutos, a 14000 rpm en una microcentrífuga.

- Se eliminó el sobrenadante y se añadió HCl hasta una concentración final de 0,2 N. Las muestras se incubaron durante 60 minutos a 60 °C.

- Para comparar la cantidad de ADN en las células intactas con el lisado celular generado mediante el batido de microesferas, se incubó ûna alícuota de células intactas de B. subtilis en HCl 0,2 N durante 60 minutos a 60 °C (método de Extracción Ácida).

- Todas las muestras se centrifugaron durante 4 minutos, a 14000 rpm para eliminar los residuos y se aplicó una porción de 40 pl a una columna Gemini-NX de fase inversa (Phenomenex) y se analizó mediante HPLC.

Los resultados de este estudio se proporcionan en la Figura 3. Las barras de error representan el intervalo de análisis duplicados.

Aunque comúnmente se asume que el "batido de microesferas" es muy efectivo para romper las células bacterianas y liberar ADN, este no^ es necesariamente el caso. Este experimento proporciona evidencia adicional de que el Método de Extracción Ácida/HPLC proporciona una representación más fiel y consistente que el método de batido de microesferas de la cantidad real de ADN en la suspensión celular inicial. En otros experimentos, la cantidad de ADN liberado mediante el batido de microesferas ha llegado al 100 %, es decir, en una cantidad igual a la del método de extracción ácida. Debido a que proporciona resultados variables, el método de batido de microesferas no es una forma confiable de estimar la cantidad de ADN presente en una suspensión de células bacterianas intactas. Ejemplo 2: Comparación de Peryodato con otros Compuestos Perhalogenados y Oxidantes

En este ejemplo, se evaluó una serie de compuestos perhalogenados y oxidantes por su efectividad en la liberación de ácidos nucleicos de las células bacterianas. Se usaron (meta)peryodato de sodio, perborato de sodio tetrahidratado, perclorato de sodio, persulfato de sodio (cada uno a 15 mM) para tratar alícuotas de una suspensión de células vegetativas de Bacillus subtilis (es decir, no esporas). Después de una incubación de 20 minutos a 70 °C, con o sin los compuestos de prueba, las fracciones sobrenadantes de cada suspensión (así como las células bacterianas no tratadas) se sometieron al Método de Extracción Ácida/HPLC y el porcentaje de ADN liberado de la se calculó la cantidad de bacterias por cada tratamiento.

Método Experimental y Materiales

- Tampón BD preparado (SDS al 2 %, Li-CDTA 5 mM, LiCl 250 mM, glicina 50 mM, pH 10,5).

- Se prepararon recientemente soluciones madre 300 mM de los compuestos de prueba en agua destilada para cada uno de los siguientes: (meta)peryodato de sodio (Sigma-Aldrich, Núm. Cat. S-1878), perborato de sodio tetrahidratado (Sigma-Aldrich, Núm. Cat. 71840), perclorato de sodio (Sigma-Aldrich, Núm. Cat. 410241) y persulfato de sodio (Sigma-Aldrich, Núm. Cat. 216232).

- Se hizo una dilución de 10 veces de cada solución madre de la etapa anterior al transferir 100 pl (o 100 pl de agua para el control negativo) a cinco tubos que contenían 0,8 ml de tampón BD.

- Soluciones de Prueba de Trabajo. Se añadió agua (100 pl) a cada tubo para llevar la concentración final de cada solución madre a 30 mM en tampón BD al 80 %.

- Se prepararon sedimentos lavados a partir de volúmenes iguales de una suspensión de Bacillus subtilis en fase estacionaria.

- Cada sedimento se suspendió en 300 gl de agua.

- Se añadió un volumen igual (300 gl) de cada Solución de Prueba de Trabajo (es decir, (meta)peryodato de sodio 30 mM, perborato de sodio tetrahidratado, perclorato de sodio o persulfato de sodio en tampón BD al 80 % o agua (control negativo)) a cada suspensión bacteriana y se mezcló bien.

- Las mezclas se calentaron a 70 °C durante 20 minutos.

- Después del calentamiento, cada mezcla se centrifugó a 14 000 rpm durante 4 minutos. Se conservó el sobrenadante. Se desechó el sedimento de material insoluble.

- Se añadió ácido clorhídrico a las fracciones sobrenadantes hasta una concentración final de 0,2 N.

- La mezcla se calentó a 60 °C durante 60 minutos.

- Se neutralizó una alícuota de 150 gl de cada muestra con 100 gl de tampón ADA, pH 8,0.

- Luego, cada muestra se analizó mediante HPLC para determinar el AUC de la adenina. Tres sedimentos lavados de células no tratadas (etapa 5) se sometieron directamente al Método de Extracción Ácida/HPLC para determinar la cantidad total de ADN (adenina) en cada sedimento bacteriano.

Resultados

Los resultados se resumen en la Tabla 5, más abajo:

Tabla 5. Comparación de ADN liberado de B. subtilis por compuestos perhalogenados y oxidantes.

Conclusiones

De los 4 compuestos probados a una sola concentración (15 mM), solo el (meta)peryodato de sodio y el persulfato de sodio liberaron más ADN que el control: 44 % y 15 % del ADN total de Bacillus subtilis, respectivamente. Por el contrario, los otros compuestos perhalogenados/oxidantes no liberaron más ADN que el control (6,7 %).

Este ejemplo demuestra que el persulfato también puede funcionar para aumentar la liberación de ácido nucleico de manera similar al peryodato.

Ejemplo 3: Efecto del pH en la Extracción de Peryodato

Al probar la efectividad y la dependencia de la dosis de NPI ((meta)peryodato de sodio) en un intervalo de pH, fue necesario considerar varios factores que incluyen (i) la reacción potencial de NPI con el propio tampón (ii) pueden existir diferentes formas de NPI a diferentes valores de pH (por ejemplo, metaperyodato, ortoperyodato) y (iii) NPI tiene solubilidad reducida a pH elevado.

Para estos estudios, se usó un sistema tampón compuesto por 3 ácidos débiles tamponadores diferentes que cubrían un intervalo de valores de pKa y se ajustó al pH deseado con una sola base. Los ácidos (valores de pKa) fueron ácido fosfórico (2,15, 7,20, 12,38), ácido acético (4,76) y ácido bórico (9,24). La solución inicial de ácidos combinados (20 mM cada uno) tenía un pH de 1,9 (Tabla 6) (denominadas en la presente descripción como soluciones tampón "PAB"). Las soluciones tampón PAB se ajustaron con NaOH 5 N para alcanzar los valores de pH deseados para el experimento (Tabla 7).

Las soluciones tampón PAB a pH 3,7, 5,5, 7,4 y 9,4 se probaron solas y en combinación con NPI a tres concentraciones diferentes (6, 12 y 18 mM final). El tampón, con o sin NPI, se añadió a sedimentos de Mycobacterium smegmatis lavados. Se probaron tres concentraciones diferentes de NPI para determinar si existe una respuesta a la dosis en este intervalo de concentración para la liberación de ADN de las células bacterianas. Por lo tanto, las células de M. smegmatis se calentaron con soluciones tampón PAB que contenían diferentes concentraciones de NPI en un intervalo de valores de pH para medir la cantidad de ADN liberado mediante el uso del Método de Extracción Ácida/HPLC descrito en la presente descripción.

Soluciones Tampón PAB

Los componentes enumerados en la Tabla 6 se mezclaron y la mezcla resultante se agitó durante la noche para permitir que el ácido bórico se disolviera por completo. El pH inicial se midió en 1,9.

Tabla 6. Com osición del Sistema Tam ón PAB

Tabla 7. Valores finales de pH de las Soluciones del Sistema Tampón PAB

Después de la preparación, las soluciones tampón PAB se almacenaron a 4 °C.

Método Experimental

Se prepararon soluciones de trabajo frescas (soluciones tampón PAB ± NPI) mediante la adición de 0, 20, 40 o 60 gl de solución madre NPI 300 mM (en agua) a 1000, 980, 960 o 940 gl (respectivamente) de cada solución tampón PAB. Las soluciones de trabajo se usaron dentro de las 3 horas de preparación.

Se prepararon sedimentos lavados a partir de suspensiones lavadas y distribuidas equitativamente de Mycobacterium smegmatis (donde se usó agua para el último lavado).

Cada sedimento se suspendió en 200 gl de soluciones tampón PAB ± NPI (6, 12 y 18 mM final), por triplicado. La mezcla resultante se calentó a 70 °C durante 20 minutos.

La mezcla se centrifugó a 14000 rpm durante 4 minutos. Se conservó el sobrenadante y se desechó el sedimento de material insoluble.

Se añadió HCl a las fracciones sobrenadantes hasta una concentración final de 0,2 N. Las fracciones acidificadas se calentaron durante 60 minutos a 60 °C.

Cada muestra de 150 gl se neutralizó con 100 gl de tampón ADA (ácido N-(2-acetamido)iminodiacético), pH 8,0. Luego, las muestras se analizaron mediante HPLC.

Resultados

Los resultados se resumen en las Tablas 8 y 9 más abajo.

T l . Li r i n ADN n l r n n l l M. m m i r n NPI m n f n i n l H*

Tabla 9. Cantidad de ADN en 3 sedimentos replicados de células de M. smegmatis usas en el Experimento de la Tabla 8.

Conclusiones

Se empleó un sistema tampón de 3 componentes para demostrar el efecto dependiente del pH sobre la liberación de ADN mediada por NPI de Mycobacterium smegmatis. En ausencia de NPI, se liberó del 2,1 al 11,5 % del ADN de M. smegmatis durante una incubación de 20 minutos a 70 °C. Por el contrario, la adición de incluso una concentración baja de NPI (6 mM) a las soluciones tampón aumentó notablemente el porcentaje de ADN total liberado de los mismos microbios en aproximadamente 9 veces a 37,4-59,4 %, de manera dependiente del pH. Sorprendentemente, el aumento de la concentración de NPI de 6 mM a 12 mM e incluso a 18 mM conduce a solo una modesta liberación adicional de ADN de las bacterias; esto se observó sólo a valores de pH neutro y alcalino.

Ejemplo 4: Liberación de Ácidos Nucleicos de Esporas mediante el uso de Peryodato

Bacillus subtilis es una bacteria Gram positiva que puede cambiar de un estado vegetativo en crecimiento a una espora extremadamente resistente que no se divide, lo que permite que el organismo sobreviva en condiciones ambientales extremas. En general, las esporas son muy resistentes al calor (capaces de sobrevivir a 100 °C durante varias horas), la desecación, la radiación UV y los agentes oxidantes. La esporulación se desencadena esencialmente por la falta de nutrientes. La bacteria se divide de manera asimétrica lo que da como resultado la formación de una única endospora que contiene el ADN genómico de la bacteria rodeada por una pared exterior muy resistente. En este estado, la bacteria puede permanecer inactiva pero viable durante largos períodos de tiempo, incluso siglos. En condiciones ambientales favorables, la endospora puede reactivarse y volver al estado de crecimiento (vegetativo).

Las esporas bacterianas se consideran entre los tipos de células más difíciles de romper. Los agentes antibacterianos comunes que destruyen las células vegetativas, como los desinfectantes domésticos (por ejemplo, alcoholes, detergentes, compuestos de amonio cuaternario) no destruyen las endosporas. La capa de esporas no es sensible a la lisozima. En este ejemplo, se demostró la eficacia del (meta)peryodato de sodio para liberar ácidos nucleicos de las esporas de Bacillus subtilis.

Preparación de Esporas

Se cultivaron colonias individuales de B. subtilis en 2 ml de caldo Luria (LB) durante la noche a 37 °C en un agitador de plataforma orbital a 200 rpm. Las bacterias (1 ml) se recogieron por centrifugación a 11 000 rpm durante 3 minutos; se desechó el sobrenadante. Las bacterias se lavaron dos veces por centrifugación en 1 ml de agua estéril fría para eliminar el LB residual.

Para convertir las células vegetativas en esporas, las bacterias se suspendieron en 200 gl de H²O y se añadieron a 100 ml de caldo Columbia [J. A. Morello y P.D. Ellner. 1969. New medium for blood cultures. Appl. Microbiol. 17: 68­ 07] que contiene cloruro de manganeso 0,1 mM.

La mezcla se agitó en una plataforma orbital a 160 rpm a 37 °C durante 72 horas para producir aproximadamente 108 esporas por ml. Las esporas se recogieron por centrifugación y se suspendieron en etanol al 15 % en agua. Anterior a su uso, cada muestra de esporas se lavó tres veces con agua helada.

Para eliminar cualquier bacteria vegetativa remanente, el sedimento se suspendió en 1 ml de agua fría. Se añadió solución de lisozima (400 gl de una solución madre de 5 mg/ml en Tris (10 mM), EDTA (1 mM)) y la mezcla resultante se incubó a 37 °C durante 1 hora. Las esporas se recogieron por centrifugación y se desechó el sobrenadante.

El sedimento de esporas se suspendió en 1 ml de SDS al 0,1 % y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. El sedimento de esporas se recogió por centrifugación a 9000 rpm durante 4 minutos; se desechó el sobrenadante.

Para eliminar cualquier ADN libre de células residual en la preparación, las esporas se suspendieron en 1 ml de tampón de ADNasa IX (Tris-HCl 10 mM, MgCl²4 mM, CaCl²1 mM) que contenía 10 gg de ADNasa pancreática y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos.

La suspensión de esporas se centrifugó a 9000 rpm durante 4 minutos y se desechó el sobrenadante. El sedimento se lavó una vez con agua. El sedimento de esporas altamente purificadas se resuspendió en 1,2 ml de H²O. La mayor parte de esta preparación (800 gl) se usó en la etapa 2 del siguiente método experimental; otras tres alícuotas de 100 gl se trataron directamente con el Método de Extracción Ácida/HPLC (etapas 5-8, más abajo) para estimar el contenido total de ADN de las esporas; la alícuota restante de 100 gl de la suspensión de esporas se trató por segunda vez con lisozima y SDS (etapas 9 y 10, anteriores) para confirmar que el ADN liberado de las esporas no se debía a células que se convirtieron al estado vegetativo. Luego, se llevó a cabo un análisis de extracción Ácida/HPLC.

Extracción de ADN

Los reactivos BA, BB, BC y BD se prepararon con y sin (meta)peryodato de sodio (Tabla 10).

Se mezclaron alícuotas (100 gl) de esporas de B. subtilis suspendidas (del proceso anterior) con un volumen igual de BA, BB, BC o BD con o sin (meta)peryodato de sodio. La mezcla se calentó a 70 °C durante 20 minutos y luego se centrifugó a 14000 rpm durante 4 minutos. Se conservó el sobrenadante y se desechó el sedimento de material insoluble.

Se añadió ácido clorhídrico a las fracciones sobrenadantes hasta una concentración final de 0,2 N. Luego, las fracciones se calentaron a 60 °C durante 60 minutos. Una porción de cada muestra (150 gl) se neutralizó con 100 gl de tampón ADA, pH 8,0. Las muestras se analizaron mediante HPLC para determinar el AUC de adenina.

Tabla 10. Com osición de los Reactivos Usados

Tabla 11. Efectividad del peryodato en diferentes reactivos sobre la liberación de ADN de las esporas tratadas a 70 °C durante 20 minutos, medida mediante el Método de Extracción Ácida/HPLC*

junio con un naiamienio téimico modelado ^{( / 0 c} , ²⁰ minutos) pudo libeiai hasta un ¹⁰ % y un ^{8 , 3} % del ^{a d n} , respectivamente, de las esporas, el más resistente de los organismos. Se esperaría que temperaturas más altas y tiempos de tratamiento más prolongados liberaran aún más ADN. En ausencia de (meta)peryodato de sodio, no pudo detectarse liberación de ADN.

Ejemplo 5: Liberación de Ácidos Nucleicos de Hongos mediante el uso de Peryodato

Las levaduras son microorganismos eucariotas unicelulares, clasificados en el reino Fungi. Una especie de levadura, Saccharomyces cerevisiae, ha sido ampliamente usada durante miles de años y tiene numerosas aplicaciones. Durante el proceso de fermentación, S. cerevisiae puede metabolizar carbohidratos simples a CO² (dióxido de carbono) y etanol (alcohol etílico). El CO² se usa como agente leudante en la repostería y el alcohol como componente central de las bebidas alcohólicas. La industria de la biotecnología ha aprovechado recientemente la levadura para convertir el azúcar en etanol, usado como biocombustible. Algunas cepas de levadura se han utilizado en el campo de la biorremediación. S. cerevisiae es uno de los microorganismos eucariotas más investigados y sigue siendo un organismo importante para la investigación genética y de biología celular.

Mientras que las bacterias suelen tener paredes celulares compuestas de peptidoglicano, los hongos poseen paredes celulares que contienen el polímero de glucosamina, la quitina. La mayoría de los hongos verdaderos tienen una pared celular que consta de tres capas: quitina, otros polisacáridos (zimosan) y manoproteínas http://en.wikipedia.org/wiki/Cell_wall - cite_note-11. En este ejemplo, S. cerevisiae sirvió como un microorganismo modelo del reino de los hongos para que los inventores probaran la eficacia del NPI ((mefa)peryodato de sodio) para la liberación de ácidos nucleicos, tanto de ADN como de ARN.

Método Experimental

Los reactivos BA, BB, BC y BD se prepararon con y sin (meta)peryodato de sodio (ver Tabla 10).

Se preparó un cultivo de Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadería de Fleischmann) mediante cultivo durante la noche en caldo de soja tríptica con glucosa 50 mM a 37 °C. Las células se recogieron de 6 ml de cultivo mediante centrifugación a 8000 rpm durante 3 minutos. El sedimento celular se lavó una vez con PBS frío mediante centrifugación, se suspendió en PBS frío, se distribuyó en 10 tubos, se centrifugó y los sedimentos resultantes se lavaron de nuevo con agua fría.

Cada sedimento lavado se resuspendió en 200 gl de agua y se mezcló con un volumen igual de reactivos BA, BB, BC y BD con o sin NPI (15 mM final). Las suspensiones se calentaron a 70 °C durante 20 minutos y luego se enfriaron a temperatura ambiente. Las suspensiones se centrifugaron a 14 000 rpm durante 4 minutos; los sobrenadantes clarificados se transfirieron a tubos nuevos y los sedimentos se desecharon.

Se sometió a electroforesis una porción de 10 gl de cada sobrenadante en un gel de agarosa al 0,8 % y se tiñó con bromuro de etidio para visualizar el ADN y el ARN.

Al resto de las fracciones sobrenadantes, se añadió HCl hasta una concentración final de 0,2 N. Las muestras se calentaron durante 60 minutos a 60 °C. Luego, se neutralizaron 150 gl de cada muestra con 100 gl de tampón ADA, pH 8,0.

Las muestras neutralizadas (40 gl) se analizaron mediante HPLC y se determinó el AUC para adenina.

Resultados y Discusión

ADN liberado de S. cerevisiae por tratamiento con diferentes composiciones sin o con peryodato

Los resultados que se muestran en la Tabla 12 a continuación demuestran varias características de la composición química.

Saccharomyces cerevisiae, un resistente microorganismo unicelular, es inesperadamente sensible a la liberación de ADN por (meta)peryodato de sodio. El (meta)peryodato de sodio solo en agua a pH casi neutro (BCP) liberó 4 veces más ADN después de 20 minutos de tratamiento a 70 °C, en comparación con el mismo tratamiento térmico en agua (BC) (Tabla 12).

La adición de una alta concentración de SDS (1-2 % final) y/o LiCl (125 mM) y/o pH más alto y/o el quelante CDTA (2,5-25 mM) aumentó aún más la cantidad de ADN liberado (Tabla 12). Curiosamente, la cantidad de ADN liberado en las mismas condiciones en ausencia de (meta)peryodato de sodio no se vio afectada por estos componentes secundarios de los nuevos reactivos (Tabla 12).

Como se esperaba de los informes de la literatura, la levadura contiene una gran cantidad de ARN en comparación con el ADN, lo que puede verse mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 4). Pueden observarse bandas claras e intensas de ARN ribosómico (ARNr) en las muestras del tratamiento con los reactivos BA y BD en ausencia de (meta)peryodato de sodio; parecía que se liberaba más ARN cuando se añadía (meta)peryodato de sodio (BAP, BDP), pero el ARN se degradaba parcialmente. No se hicieron intentos en estos experimentos para estabilizar el ARN liberado de S. cerevisiae por las condiciones de tratamiento.

Se liberaron grandes cantidades de ARN mediante el uso de BB y BBP tamponadas con borato, pero en ambos casos el ARN se degradó considerablemente (Figura 4). En todos los casos, solo se observaron pequeñas cantidades de ADN de alto peso molecular en el gel, en comparación con las cantidades de ARN (Figura 4).

Tabla 12. Efecto de los reactivos que contienen peryodato en la liberación de ADN de S. cerevisiae mediante el uso del Método de Extracción Ácida/HPLC para medir el AUC de adenina*

Conclusiones

Este estudio demostró que la liberación de ADN y ARN de la levadura S. cerevisiae, un microorganismo eucariota primitivo con una pared celular resistente, puede mejorarse mucho mediante el tratamiento con reactivos que contienen peryodato de sodio, en comparación con los mismos reactivos sin peryodato. En algunos reactivos que contienen peryodato, se extrajo ADN y ARN de alto peso molecular como se muestra mediante el uso de electroforesis en gel de agarosa para ver el ADN y el ARN liberados de S. cerevisiae.

Ejemplo 6: Efecto del Peryodato y el Tratamiento Térmico sobre la Liberación de Ácidos Nucleicos de B. subtilis y M. smegmatis en Varios Reactivos

En este ejemplo, se evaluaron los efectos de la temperatura (temperatura ambiente, 50 °C, 70 °C, 80 °C y 100 °C) y (meta)peryodato de sodio (15 mM final) en varias composiciones (Tabla 10), mediante el uso de dos microorganismos diana diferentes, Bacillus subtilis y Mycobacterium smegmatis. La liberación de ácidos nucleicos de estos microorganismos se evaluó mediante el Método de Extracción Ácida/HPLC, PCR en tiempo real y electroforesis en gel de agarosa.

Bacillus subtilis es una bacteria resistente que se encuentra comúnmente en el suelo y la vegetación; es ampliamente usado para estudios de laboratorio de investigación. Las células son Gram positivas, en forma de bastón y tienen una pared celular rígida compuesta de peptidoglicano (mureína), un polímero de azúcares y aminoácidos. En condiciones ambientales adversas, puede formar esporas protectoras resistentes que son capaces de sobrevivir en condiciones extremas.

Las micobacterias son bacterias con forma de bastón que pueden identificarse como resistentes a los ácidos mediante una técnica de tinción. Algunas especies, que se encuentran en el suelo, se consideran benignas. Otras especies son patógenos graves para humanos y otros mamíferos y el agente causante de la tuberculosis (TB) pulmonar, una enfermedad devastadora en muchas partes del mundo. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que la incidencia de infección por TB en 2010 llegó a 1000 por cada 100000 habitantes en algunos países africanos. La coinfección de TB y VIH es una combinación particularmente letal. Una causa creciente de preocupación es la aparición de cepas de tuberculosis extremadamente resistentes a los medicamentos (XDR), que constituyen un importante problema de salud humana.

Las especies de Mycobacterium comparten una pared celular resistente característica que contiene un material ceroso llamado ácidos micólicos, lo que hace que el microorganismo sea muy hidrófobo. La pared celular consta de una capa de ácido micólico, una capa de peptidoglicano y el polisacárido arabinogalactano. La propiedad de la tinción acidorresistente se debe a la capa de ácido micólico. Si bien las bacterias Gram positivas son generalmente sensibles a la lisozima, no se conoce ninguna enzima que ataque la pared celular de las micobacterias. Todos los métodos actuales para la liberación efectiva de ADN de esta especie requieren alguna forma de interrupción mecánica.

Se evaluó la capacidad del método descrito actualmente, que evita por completo las complejas etapas de alteración mecánica, para liberar ADN de estas especies de microorganismos.

Métodos Experimentales

B. subtilis se cultivó en caldo de soja tríptica a 37 °C durante la noche. Se usó una alícuota (100 pl) del cultivo de la noche a la mañana para inocular 40 ml de caldo de soja tríptica y se cultivó a 37 °C en una plataforma de agitación hasta la fase logarítmica. M. smegmatis se cultivó en agar de soja tríptica durante 3 días a 37 °C y luego se recogió raspando en H²O fría.

B. subtilis y M. smegmatis se recogieron cada uno por centrifugación a 2700 g durante 15 minutos; se desechó el sobrenadante. Los sedimentos bacterianos se lavaron dos veces con H²O fría mediante centrifugación a 2700 g durante 15 minutos y se desecharon los sobrenadantes. Los sedimentos bacterianos lavados se resuspendieron en 15 ml de H²O fría.

Tres alícuotas (300 pl cada una) de cada suspensión bacteriana se trataron directamente con el Método de Extracción Ácida/HPLC para determinar el contenido total de ácido nucleico en estas células.

El resto de cada suspensión bacteriana se dividió en alícuotas de muestra de 1,5 ml y luego se mezcló con un volumen igual de uno de los reactivos BA, BB, BC o BD (Tabla 10), con y sin (meta)peryodato de sodio (30 mM en reactivos, 15 mM finales).

Cada alícuota de 3 ml se dividió por igual (600 pl) en 5 tubos de microcentrífuga y se incubó a temperatura ambiente, 50 °C, 70 °C, 80 °C o 100 °C durante 20 minutos. Los tubos se centrifugaron a 14000 rpm durante 5 minutos. Los sobrenadantes clarificados se transfirieron a tubos nuevos y se desecharon los sedimentos. Se extrajo una alícuota (190 pL) de cada sobrenadante para el análisis directo por triplicado mediante el Método de Extracción Ácida/HPLC (Tablas 13 y 14) de la siguiente manera:

Se añadió ácido clorhídrico a las fracciones sobrenadantes hasta una concentración final de 0,2 N. Las fracciones se calentaron a 60 °C durante 60 minutos. Se neutralizaron alícuotas (150 pl) de cada fracción con 100 pl de tampón ADA, pH 8,0. Las muestras resultantes se analizaron mediante HPLC y se determinó el AUC para adenina.

Se extrajo una muestra de 350 pl de cada una de las fracciones de sobrenadante restantes y se incubó a 50 °C durante 1 hora con proteinasa K (160 pg).

Se sometieron a electroforesis 10 gl de cada fracción sobrenadante tratada en un gel de agarosa al 1,0 % a 100 V durante 40 minutos con una escalera de ADN de 1 Kb+ como marcador; el gel se tiñó con bromuro de etidio (1 gg/gl) durante 10 minutos y el ADN y el ARN se visualizaron/fotografiaron bajo transiluminación UV (Figuras 5 y 6).

Se añadió cloruro de sodio (0,1 M final) a tubos con químicas BC y BCP. Se añadieron dos volúmenes de etanol frío al 95 % a todos los tubos y luego se incubaron a -20 °C durante 30 minutos para precipitar los ácidos nucleicos. Los tubos se centrifugaron a 13000 g y los sedimentos se enjuagaron cuidadosamente una vez con etanol frío al 70 %. Los sedimentos se secaron al aire y se disolvieron en 90 gl de TE reducido (Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 8,0). Se añadió una porción de 2 gl de cada sedimento disuelto a una reacción de PCR de 25 gl con cebadores de ADN ribosómico 16S bacteriano 'universal' (BacrRNA173-F 5'ATTACCGCGGCTGCTGG3' y BacrRNA173-R 5'CCTACGGGAGGCAGCAG3') para estimar mediante PCR cuantitativa (qPCR) en tiempo real la cantidad de ADN liberado de B. subtilis y M. smegmatis para cada condición de prueba (Tabla 15 y 16). Cada reacción de PCR contenía 2,5 gl de albúmina de suero bovino (BSA) de 1 mg/ml, 2,5 gl de tampón de PCR 10x, 1,25 gl de MgCl²50 mM, 0,5 gl de dNTP 10 mM, 0,5 gl de cebador directo de 10 pMol, 0,5 gl de cebador inverso de 10 pMol, 0,5 gl de Syto 9 0,5 gM, 0,2 gl de Taq polimerasa 5U/gl, 12,3 gl de agua. ADN altamente purificado de B. subtilis y M. smegmatis sirvió como referencia para el análisis de la PCR. Los controles negativos incluyeron reacciones en las que no se añadió ADN molde. El valor Ct se refiere al número de ciclo fraccional en el punto donde la curva de amplificación cruza un umbral de detección. El software del instrumento Rotorgene estableció una línea de umbral y calculó los valores de Ct para cada muestra. Los valores de Ct son inversamente proporcionales a la cantidad de ADN en una muestra; una disminución en un valor de Ct corresponde a una duplicación de la cantidad de ADN detectada.

Resultados y Discusión

Los resultados se muestran en las Tablas 13, 14, 15 y 16 y en las Figuras 5 y 6.

Tabla 13. Efecto del peryodato en diferentes reactivos sobre la liberación de ADN de B. subtilis tratado a temperaturas crecientes durante 20 minutos, medido mediante el Método de Extracción Ácida/HPLC

Tabla 14. Efecto del peryodato en diferentes reactivos sobre la liberación de ADN de M. smegmatis tratado a temperaturas crecientes durante 20 minutos, medido mediante el uso del Método de Extracción Ácida/HPLC

Con referencia a la Figura 5, que muestra el ADN y el ARN liberados de Bacillus subtilis en el sobrenadante mediante peryodato y un paso de calentamiento a 80 °C (A) o 70 °C (B), la intensidad de las bandas de ADN de alto peso molecular (> 23 kb) se incrementó notablemente por la presencia de peryodato en todos menos en un caso, BBP a 80 °C (panel A). Esto último probablemente se debió a un error que provocó la pérdida del ADN en algún momento después de su liberación de las células, ya que la misma muestra tratada a 70 °C mostró una fuerte banda de ADN (panel B). El ARN ribosómico intacto o sustancialmente intacto estaba presente en los tratamientos en todas las condiciones, excepto BB y BBP.

Con referencia a la Figura 6, que muestra el ADN y el ARN liberados de Mycobacterium smegmatis en el sobrenadante mediante peryodato y un paso de calentamiento a 70 °C, la intensidad de las bandas de ADN de alto peso molecular (> 23 kb) aumentó notablemente por la presencia de peryodato en todos los casos. En comparación con B. subtilis, la cantidad de ARN liberado fue menor y se degradó más extensamente.

Tabla 15. Cuantificación de ADN liberado de B. subtilis en el sobrenadante mediante peryodato y aumento de la temperatura mediante el uso de la qPCR

Tabla 16. Cuantificación de ADN Liberado de AT. smegmatis en el sobrenadante mediante peryodato y aumento de la temperatura mediante PCR en tiempo real

Los resultados presentados en las Tablas 15 y 16 muestran que el peryodato reduce los valores de Ct (es decir, extrae más ADN), tanto de B. subtilis como de M. smegmatis vegetativos tratados con los reactivos BA, BB y BD, pero no con el reactivo BC (agua), y se incubaron a 50, 70 y 80 °C durante 20 minutos. Es importante destacar que la calidad del ADN liberado con el peryodato y el tratamiento térmico es adecuada para su posterior amplificación e identificación mediante análisis de la PCR en tiempo real. El estudio se repitió mediante el uso de calentamiento a 100 °C y se demostró la extracción exitosa de ADN; sin embargo, los resultados de la qPCR se complicaron por el hecho de que el ADN se desnaturaliza a 100 °C y no era cuantificable con tintes fluorescentes.

El hecho de que algunas muestras no muestren un valor de Ct más bajo después del tratamiento con peryodato probablemente se deba a la eficiencia variable o deficiente de la etapa de precipitación con etanol. En estos experimentos, esta etapa fue necesaria para eliminar los inhibidores antes de poder llevar a cabo la qPCR. Cuando las mismas muestras antes de la precipitación con etanol fueron analizadas mediante electroforesis en gel de agarosa (Figuras 5 y 6), pudieron observarse en todos los casos claros aumentos en la cantidad de ADN liberado de las muestras tratadas con peryodato.

Conclusiones

Se han usado tres métodos diferentes (Extracción Ácida/HPLC, Electroforesis en Gel de Agarosa y qPCR) para demostrar la efectividad mediante la cual el presente método químico libera ácidos nucleicos de microorganismos, que incluye aquellos bien conocidos por ser resistentes a los métodos estándar de extracción de ácidos nucleicos. El presente método es particularmente valioso ya que no requiere ruptura mecánica o ebullición de la muestra. El peryodato aumentó claramente la cantidad de ADN y ARN liberados tanto de B. subtilis como de M. smegmatis en función de la temperatura.

Ejemplo 7: Efecto del Peryodato y el Tratamiento Térmico sobre la Liberación de Ácidos Nucleicos en Muestras de Saliva Enriquecidas con M. smegmatis en Varios Reactivos

En este ejemplo, los efectos de la temperatura (70 °C) y el (meta)peryodato de sodio (15 mM final), añadidos a varias composiciones (Tabla 10), se evaluaron mediante el uso de cantidades conocidas de Mycobacterium smegmatis 'vivas' enriquecida a la saliva humana, para simular las condiciones de un espécimen biológico complejo. La liberación de ácidos nucleicos de este microorganismo en una muestra de saliva compleja se evaluó mediante el Método de Extracción Ácida/HPLC y PCR en tiempo real con cebadores específicos de Mycobacterium smegmatis. Los ejemplos anteriores trataron de cultivos puros y sedimentos lavados de bacterias y hongos. Sin embargo, la composición de la mayoría de los especímenes o muestras biológicas es muy compleja y contiene numerosas sustancias específicas de la muestra y potencialmente interferentes, así como también células hospederas y especies microbianas. Por ejemplo, además de grandes cantidades de agua, la saliva (y el esputo) contiene muchas otras sustancias, tales como electrolitos, moco, numerosas enzimas, compuestos antibacterianos y células, tanto de origen humano como microbiano. En particular, la saliva contiene grandes cantidades de mucina, que son proteínas que tienen cadenas laterales de polisacáridos. Dado que los peryodatos atacan y abren principalmente los anillos de azúcar, a los inventores les preocupaba que los peryodatos (especialmente en concentraciones más bajas que resultaron eficaces para liberar el ADN de los sedimentos microbianos lavados) pudieran consumirse al reaccionar con la sobreabundancia de polisacáridos presentes en la saliva, en lugar de estando disponible para atacar la pared celular de bacterias/hongos de interés en la muestra. Este ejemplo se diseñó para demostrar la eficacia del peryodato en la liberación de ácidos nucleicos de microorganismos en una muestra biológica compleja. Además, se evaluó la detección específica del organismo enriquecido (M. smegmatis) en presencia de ADN humano y ADN bacteriano oral.

Método Experimental y Materiales

- Se recolectaron seis muestras de saliva de 1 ml al escupirlas alternativamente en tubos de 15 ml.

Inmediatamente después, se añadió a cada tubo uno de los tres tampones diferentes (1 ml) de la siguiente manera: 2 tubos contenían reactivo BA, 2 tubos contenían reactivo BB y los 2 tubos restantes contenían reactivo BD (Tabla 10).

- Una suspensión de aproximadamente 109 Mycobacterium smegmatis se lavó dos veces mediante centrifugación en 1 ml de PBS frío, pH 7,4 y luego se suspendió en 0,5 ml de PBS.

- Se añadieron 100 gl de cada suspensión bacteriana a un conjunto de tubos que contenían reactivos BA, BB o BD; se añadieron 100 gl de PBS al segundo juego de tubos. Las muestras se mezclaron brevemente mediante agitación por agitador vorticial. Se sometieron otros 100 gl de suspensión bacteriana (por duplicado) al Método de Extracción Ácida/HPLC para cuantificar con precisión la cantidad de ADN de M. smegmatis enriquecido en cada alícuota de saliva con uno de los tres tampones. Mediante el uso de estándares de adenina de concentración conocida y el contenido de GC del 67,5 % conocido de ADN de M. smegmatis para convertir la cantidad de adenina en cantidad de ADN, se determinó que 100 gl de suspensión bacteriana contenían 2366 ng de ADN de M. smegmatis. No se esperaba un rendimiento del 100 % de ADN, ya que las etapas de extracción fueron seguidas por etapas de purificación, por ejemplo, precipitación con etanol (descrita más abajo), que no son 100 % eficientes.

- Se añadieron 10 gl de proteinasa K (89 gg/ml finales) a cada tubo y los tubos se incubaron a 50 °C durante la noche.

- Se transfirió una alícuota de 200 gl de cada tubo a un tubo nuevo y se mezcló con 10 gl de (meta)peryodato de sodio 300 mM.

- Se transfirió una segunda alícuota de 200 gl de cada tubo a un tubo nuevo.

- Todas las alícuotas se incubaron a 70 °C durante 20 minutos y luego se enfriaron a temperatura ambiente durante 3 minutos.

- Se añadió Tris-HCl (1 M, pH 7,1) a cada alícuota hasta una concentración final de 100 mM y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos.

- Se añadió acetato de potasio (3 M, pH 5,5) a cada alícuota hasta una concentración final de 150 mM y se incubó en hielo durante 10 minutos.

- Las alícuotas se centrifugaron a 14 000 rpm durante 3,5 minutos. Se retiraron los sobrenadantes y se transfirieron a tubos nuevos; los sedimentos se desecharon.

- Se añadieron dos volúmenes de etanol al 95 % a temperatura ambiente a cada alícuota y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos.

- Las alícuotas se centrifugaron a 14000 rpm durante 3,5 minutos.

- Se eliminó cuidadosamente el alcohol de cada alícuota y los sedimentos de ADN se disolvieron en 50 gl de TE, pH 7,5. Una porción del sedimento redisuelto se diluyó 5 veces y se añadieron 5 gl de la alícuota diluida como plantilla a una reacción de qPCR de 25 gl que contenía cebadores de ADN específicos del gen M. smegmatis [HP-Directo: TGCCATCATCAGCGAAGTAG; HP-Inverso: GCGGCTACAGATTACGAAGC]. El producto esperado es una región de 250 pb del gen que codifica la 'proteína hipotética MSMEI_2098' de Mycobacterium smegmatis str. MC2 155. Este par de cebadores se usó para estimar mediante PCR cuantitativa (qPCR) la cantidad de ADN liberado por este microorganismo después de "enriquecer" las muestras de saliva. Las condiciones específicas se enumeran en la Tabla 17. Las reacciones de qPCR también contenían 2,5 gl de albúmina de suero bovino (BSA) de 1 mg/ml, 2,5 gl de tampón de PCR 10x, 1,0 gl de MgCl²50 mM, 0,5 gl de dNTP 10 mM así como también 0,5 gl de cebador directo10 pMol, 0,5 gl de cebador inverso 10 pMol descrito anteriormente, 0,5 gl de Syto 90,5 gM, 0,2 gl de Taq polimerasa 5U/gl, 11,85 gl de agua. El ADN altamente purificado de M. smegmatis sirvió como referencia para el análisis de la qPCR. Los controles negativos incluyeron reacciones en las que no se añadió ADN molde. El valor de Ct se refiere al número de ciclo fraccional en el punto donde la curva de amplificación cruza un umbral de detección generado por un software. El software de Rotorgene establece el umbral y calcula los valores de Ct para cada muestra. Los valores de Ct son inversamente proporcionales a la cantidad de ADN en una muestra; una disminución en un valor de Ct corresponde a una duplicación de la cantidad de ADN detectada.

Resultados y Discusión.

Los resultados se resumen en la Tabla 17, más abajo:

Tabla 17. Cuantificación del ADN liberado de la saliva humana enriquecida con M. smegmatis mediante peryodato y tratamiento térmico mediante la qPCR

Los resultados de la Tabla 17 muestran que el peryodato aumentó drásticamente la cantidad de ADN de M. smegmatis liberado de las células que inicialmente se 'enriquecieron' a la saliva y posteriormente se trataron con los reactivos BB y BD que contenían peryodato a 70 °C durante 20 minutos. Los valores más bajos de Ct son un reflejo de cantidades más grandes de ADN de M. smegmatis. Se observó un aumento similar pero menos dramático en la eficiencia de extracción con el reactivo BA que contenía peryodato. En el caso más llamativo, la cantidad estimada de ADN aumentó unas 100 veces, de 150 pg a 16230 pg por reacción, en muestras que contenían el reactivo BD solo en comparación con BD más peryodato. Para las muestras que contenían BB, la adición de peryodato también aumentó el ADN 100 veces, de 70 pg a 6430 pg por reacción. Para las muestras que contenían ^bA, la adición de peryodato aumentó el ADN detectado de indetectable a 1090 pg por reacción. Estos experimentos demuestran que la calidad del ADN liberado de M. smegmatis mezclado con saliva que contiene peryodato y otros reactivos y posteriormente calentado es adecuado para la amplificación mediante la PCR y la identificación específica de microorganismos mediante análisis de la qPCR mediante el uso de cebadores específicos de M. smegmatis.

Conclusiones

Este ejemplo demuestra la efectividad con la que la composición química y el método presentes liberan ácidos nucleicos de M. smegmatis, incluso cuando se añaden a una muestra biológica compleja. A pesar de la presencia de polisacáridos ligados a proteínas y otras sustancias potencialmente interferentes que se encuentran en la saliva, las pequeñas concentraciones de peryodato fueron muy efectivos para liberar una proporción significativa de ácidos nucleicos de este resistente microorganismo. Este aumento demostrado de 100 veces en la liberación y detección de ADN de M. smegmatis por peryodato puede aumentar la sensibilidad de detección de muestras con frotis negativo y MT positivas, lo que permite el inicio más temprano de regímenes de tratamiento efectivos y, por lo tanto, reduce los períodos de infecciosidad de casos de TB MDR.

Ejemplo 8: Comparación de la Cantidad de ADN Liberado de las Esporas de Clostridium botulinum y Clostridium difficile mediante los Métodos de Purificación con Peryodato y MagNA Pure según lo determinado por la PCR en tiempo real

Clostridium es un género que consta de aproximadamente 100 especies de bacterias Gram positivas, pertenecientes a Firmicutes, que producen esporas resistentes cuando están estresadas. Estas células en forma de varilla son omnipresentes en la naturaleza y especialmente frecuentes en el suelo. Los clostridios son anaerobios obligados móviles que son patógenos importantes que causan enfermedades humanas. Hay cinco especies principales responsables de las enfermedades humanas, a saber, C. botulinum, C. difficile, C. perfringens, C. tetani y C. sordellii.

Las esporas producidas por C. botulinum son endosporas subterminales ovales, que se encuentran comúnmente en el suelo y son muy difíciles de eliminar. Las esporas de C. botulinum pueden sobrevivir a la temperatura del agua hirviendo al nivel del mar, por lo que muchos alimentos se enlatan con un hervor presurizado que logra una temperatura aún más alta, suficiente para matar las esporas. C. botulinum produce una toxina botulínica en alimentos y heridas, lo que puede provocar botulismo. Las esporas de esta bacteria pueden encontrarse en la miel y causan botulismo infantil en niños de doce meses o menos. El "bótox", una neurotoxina, se usa cosméticamente para paralizar los músculos faciales y reducir los signos del envejecimiento, así como en numerosas aplicaciones terapéuticas.

Aproximadamente 1 de cada 20 pacientes hospitalizados contraerá una infección adquirida en el hospital (HAI). Si bien la mayoría de los tipos de HAI están disminuyendo, los brotes provocados por Clostridium difficile, una bacteria comensal del intestino, son un problema creciente que afecta a los pacientes en hospitales y centros de atención médica a largo plazo en donde el tratamiento con antibióticos es habitual. La infección por C. difficile (CDI) se transmite por vía fecal-oral y se cree que es el resultado de una disbiosis gastrointestinal, es decir, la alteración de los microbios o la flora intestinales normales. El tratamiento con antibióticos destruye a la mayoría de las bacterias en el tracto GI que usualmente mantienen a C. difficile bajo control. En este ambiente modificado, C. difficile se replica y produce toxinas que atacan el revestimiento del intestino, lo que causa síntomas que van desde la diarrea hasta la inflamación potencialmente mortal y el sangramiento del revestimiento del colon. De acuerdo con los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC), C. difficile se relaciona con la muerte de 14000 personas al año en los Estados Unidos.

En entornos de atención médica, C. difficile se transmite de persona a persona por vía fecal-oral y se producen brotes cuando los seres humanos ingieren accidentalmente esporas de superficies comunes (por ejemplo, barandillas de cama, pomos de puertas, inodoros, lavabos). Las esporas de C. difficile son resistentes al calor y a la mayoría de los métodos de limpieza de superficies de rutina, que incluye los limpiadores de manos a base de alcohol, y pueden permanecer viables en el entorno durante varios meses o años. No se dispone de un tratamiento efectivo contra la infección recurrente por C. difficile. Paradójicamente, hoy en día, el tratamiento primario para la infección por C. difficile es la administración de más antibióticos, donde aproximadamente el 20 % de los pacientes tienen recaídas en un mes y muchos de ellos tienen crisis repetidas.

Muchos mercados e industrias están buscando formas eficientes de destruir esporas (y bacterias) dañinas, que incluye la seguridad alimentaria (plantas de procesamiento de alimentos/carne), atención médica, muestreo de suelo y agua (pruebas ambientales), bioseguridad o biodefensa, pruebas de alimentos para animales, agricultura/ciencia vegetal/industria, etc. Tanto la práctica clínica como los estudios epidemiológicos, interesados en la detección y caracterización de cepas patógenas de bacterias y/o esporas, necesitan metodologías alternativas más rápidas con excelente sensibilidad y especificidad, así como también la confiabilidad análisis-reanálisis. Hoy en día, la prueba "estándar de oro" aún implica el cultivo de heces, que es un ensayo sensible, pero tiene un tiempo de respuesta prolongado, requiere muchos recursos y requiere laboratorios experimentados con instalaciones de cultivo de tejidos.

Por el contrario, las pruebas de ensayo de la PCR son económicas, tienen un tiempo de respuesta rápido, excelente sensibilidad, especificidad y valor predictivo, al asumir que se haya extraído una cantidad suficiente de ADN de las bacterias/esporas de interés presentes en la muestra biológica recolectada.

Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que un químico de laboratorio común, el peryodato, usado a pH ligeramente alcalino y temperatura elevada, puede usarse para liberar rápida y eficientemente ácido nucleico de microorganismos, tanto en su estado activo como latente. En este ejemplo, se prepararon esporas a partir de cultivos de Clostridium botulinum y Clostridium difficile y se comparó la eficacia de dos metodologías diferentes de aislamiento de ADN, 1) el presente método de peryodato y 2) un método de purificación MagNA™ Pure disponible comercialmente. El ADN extraído mediante estos métodos se cuantificó mediante el uso de un ensayo de la PCR en tiempo real (rtPCR) aprobado por CLIA/CLEP específico para cada organismo.

Método Experimental

[C. botulinum y la preparación de esporas de C. difficile, la extracción de ADN y el ensayo de rtPCR se realizaron en colaboración con el Laboratorio de Biodefensa del Centro Wadsworth, Departamento de Salud del Estado de Nueva York, Albany, Nueva York, Estados Unidos]

Preparación de esporas de C. botulinum y C. difficile

Se cultivaron cultivos madre congelados de C. botulinum tipo B y C. difficile en agar de soja tríptica con 5 % de sangre de oveja y se incubaron anaeróbicamente a 35 °C durante 24 a 48 horas. Después de la incubación inicial, estos cultivos se transfirieron a varias placas de agar de infusión de cerebro y corazón (mínimo de 10) y se incubaron en condiciones anaeróbicas a 35 °C durante un máximo de 2 semanas. La tinción de esporas con verde de malaquita se realizó cada 3 o 4 días para monitorear la esporulación de bacterias in vitro. Cuando las tinciones con verde de malaquita mostraron una esporulación casi completa de organismos, las esporas se recogieron en 5,0 ml de PBS (pH 7,4) y se almacenaron a temperatura ambiente hasta su uso.

Determinación de la Concentración de Esporas

Cada suspensión madre de esporas de C. botulinum y C. difficile se diluyó en PBS a 10-2. Se cargó una alícuota (10 pl) de cada una de estas diluciones finales en cada pocillo limpio de un portaobjetos de hemocitómetro de 2 cámaras. Se observaron cámaras de hemocitómetro con un aumento de 40x sin aceite para el recuento de esporas. Las esporas se visualizaron como células negras redondas u ovaladas en la rejilla de campo de luz del hemocitómetro. C. botulinum, Límite de Detección (LOD) = 30 esporas/reacción; C. difficile, LOD = 20 esporas/reacción.

Extracción de ADN de Esporas mediante el uso del Método de Peryodato

1. A 350 pl de la suspensión madre de esporas de C. botulinum y C. difficile (anterior), añadir 350 pl de tampón BD2 (SDS al 2 %, CDTA 12,5 mM, LiCl 250 mM, glicina 50 mM, pH 10,5).

2. Agitar con agitador vorticial para mezclar.

3. Retirar 100 pl para cultivar.

4. Añadir 50 pl de (meta)peryodato de sodio 300 mM o NPI madre (concentración final 30 mM), agitar con agitador vorticial para mezclar.

5. Incubar a 70 °C en un baño maría durante 20 minutos.

6. Enfriar las muestras a temperatura ambiente durante 2 minutos.

7. Retirar 100 pl para cultivar.

8. Añadir 20 pl de tampón Tris 1 M, pH 7 (concentración final 50 mM).

9. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.

10. Añadir 20 pl de acetato de potasio 3 M, pH 5,5 (concentración final 150 mM).

11. Incubar en hielo durante 10 minutos.

12. Centrifugar a 13000 rpm durante 5 minutos.

13. T ransferir el sobrenadante a un tubo limpio y etiquetado. Deseche el sedimento.

14. Añadir 800 pl de etanol al 95 % a temperatura ambiente.

15. Invertir 20 veces para mezclar.

16. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos para precipitar el ADN.

17. Centrifugar a 15000 rpm durante 2 minutos para sedimentar el ADN.

18. Retirar con cuidado y deseche el sobrenadante con cuidado de no perturbar el sedimento.

19. Disolver el sedimento en 100 pl de TE.

20. Agitar con agitador vorticial brevemente para resuspender completamente el ADN.

21. Realizar un ensayo de rtPCR aprobado por CLIA/CLEP específico para cada organismo.

Extracción de ADN de Esporas con el Kit de Aislamiento de ADN MagNA™ Pure de Roche

1. Preparar 10 alícuotas de 200 pl de suspensiones de esporas de C. botulinum y C. difficile en cada concentración deseada (30 tubos en total).

2. El tampón de lisis se preparó para cada muestra al combinar 38 pl de proteinasa K con 262 pl de tampón de lisis bacteriano del Kit III de Aislamiento de ADN LC MagNA Pure (bacterias, hongos) (Núm. Cat.

03264785001, Roche).

3. Se añadieron 300 pl de tampón de lisis a cada 200 pl de suspensión de esporas.

4. Agitar con agitador vorticial.

5. Incubar a 65 °C durante 20 minutos.

6. Incubar a 95 °C durante 10 minutos.

7. Las muestras se dejaron enfriar a temperatura ambiente.

8. Cuando se enfríe, centrifugar brevemente para eliminar los aerosoles.

9. Transferir 500 pl de cada muestra a los tubos de muestra MagNA Pure Compact de Roche.

10. Coloque los tubos de muestra en el instrumento Roche MagNA Pure Compact.

11. Siga las instrucciones en pantalla mediante el uso del protocolo de lisis externa de sangre de ADN:

Volumen de muestra: 500 pl; Volumen de elución: 100 pl.

PCR en tiempo real para C. botulinum tipo B y C. difficile

Todos los ensayos de rtPCR se realizaron en un instrumento ABI 7500. El ADN aislado de cada extracción se analizó por separado para C. botulinum tipo B y C. difficile mediante el uso de un ensayo de rtPCR aprobado por CLIA/CLEP (Wroblewski y otros, 2009) específico para cada organismo.

Resultados y Discusión

Si bien el batido de microesferas mecánico de muestras biológicas o cultivos de bacterias/esporas puede ser bastante efectivo para abrir microbios, crea aerosoles que aumentan la posibilidad de propagar agentes infecciosos y poner en riesgo la salud del personal de laboratorio. Por lo tanto, es muy deseable desarrollar métodos químicos no mecánicos para liberar el ácido nucleico total de los microbios resistentes y sus esporas. Este ejemplo demuestra que el presente método "Peryodato", un tratamiento químico rápido, económico y fácil, es significativamente más efectivo (aumento de 8 veces en el ADN) para aislar el ADN de las esporas de C. botulinum (Figura 7) y las esporas de C. difficile (Figura 8) que un kit de aislamiento de ADN comercialmente disponible (método "Colaborador") y un sistema automatizado muy costoso de Roche. El kit MagNA™ Pure ("Colaborador", Figuras 7 y 8) utiliza un tampón de lisis más partículas de vidrio magnéticas, mientras que el presente método de peryodato ("Peryodato", Figuras 1A y 1B) no requiere microesferas magnéticas ni un sistema automatizado complejo con capacidades de manejo magnético para aislar ADN incluso de esporas resistentes.

Los ensayos de rtPCR aprobados por CLIA/CLEP indicaron una mayor sensibilidad de detección (valores de A3 Ct) de ADN de esporas de C. botulinum y C. difficile mediante el uso del método "Peryodato", en comparación con el método "Colaborador", es decir, las muestras tratadas con peryodato dan como resultado valores de Ct consistentemente más bajos en cada LOD en rtPCR. La extracción mejorada de ADN microbiano mediante el uso del método de peryodato debería traducirse en una mayor sensibilidad de detección en muestras biológicas evaluadas con otros ensayos de rtPCR aprobados por CLIA/CLEP.

Ejemplo 9: Comparación de la Cantidad de ADN Liberado a partir de Muestras de Esputo Clínico Positivo para Tuberculosis mediante el Método Peryodato frente al Batido de Microesferas Convencional Determinado mediante PCR en tiempo real Específico para M tuberculosis.

Este ejemplo proporciona una comparación por pares de la evaluación clínica de muestras de esputo positivas para TB (donadas amablemente por FIND, ver más abajo) purificadas mediante dos métodos. Específicamente, se comparó el impacto de dos métodos distintos de aislamiento de ADN, 1) el "Estándar de Cuidado" y 2) el "Método de Peryodato" en la sensibilidad de un ensayo de rtPCR aprobado por CLIA/CLEP dirigido al complejo RD4 Mycobacterium tuberculosis (MTBC) región de diferencia (RD) (Halse y otros, 2011).

En contraste con el "Método Peryodato", el método "Estándar de Cuidado" incluye el batido de microesferas, un método mecánico, para abrir bacterias en las muestras de esputo. Si bien el batido de microesferas mecánico puede ser efectivo para abrir organismos, crea aerosoles peligrosos en el entorno del laboratorio. Por lo tanto, es muy deseable desarrollar un método químico no mecánico efectivo para liberar de forma segura el ADN de Mycobacterium tuberculosis, sin afectar negativamente a la sensibilidad clínica de la prueba de diagnóstico.

Métodos Experimentales

Confirmación de Viabilidad de Muestras de Esputo Positivas para Mycobacterium tuberculosis

Para el presente ejemplo, el banco de muestras de tuberculosis de la Fundación para el Diagnóstico Innovador (FIND) donó amablemente muestras de esputo sin procesar de pacientes positivos para la tuberculosis. Se proporcionaron alícuotas duplicadas de 0,5 ml de 30 muestras de pacientes y se almacenaron congeladas. Mediante el uso del análisis de cultivo y frotis, FIND clasificó estas 30 muestras como 'Frotis+, Cultivo+ (alto)', 'Frotis1+, Cultivo+ (medio)' o 'Frotis-, Cultivo+ (bajo)' positivas para TB.

Las alícuotas se enviaron congeladas al Laboratorio de Micobacteriología del Centro Wadsworth (Departamento de Salud del Estado de Nueva York, Albany, Nueva York, Estados Unidos), un Laboratorio Clínico aprobado por CLIA/CLEP para su posterior análisis.

Al llegar a Wadsworth, las alícuotas de 30 donantes se descongelaron en hielo y la viabilidad de Mycobacterium en estas 10 alícuotas de TB 'alta', 10 'media' y 10 'baja' se confirmó con cultivo y microscopía de frotis.

Extracción de ADN de Esputo positivo para TB mediante el uso del Método Peryodato

1. Se añadieron 0,5 ml de tampón BD2 (SDS al 2 %, CDTA 12,5 mM, LiCl 250 mM, glicina 50 mM, pH 10,5) a cada alícuota de esputo de 0,5 ml; agitar con agitador vorticial para mezclar.

2. Se añadió Proteinasa K (400 gg) y se incubó a 50 °C en un baño maría durante 2 horas.

3. Se transfirieron 0,4 ml a un tubo nuevo y se añadió NPI (concentración final 30 mM), agitar con agitador vorticial para mezclar.

4. Se encubaron a 70 °C en baño maría durante 20 minutos.

5. Las muestras se enfriaron a temperatura ambiente durante 2 minutos.

6. Se añadió tampón Tris 1 M (pH 7) hasta una concentración final de 50 mM.

7. Se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos.

8. Se añadió acetato de potasio 3M (pH 5,5) a una concentración final de 150 mM

9. Se incubó en hielo durante 10 minutos.

10. Se centrifugó a 13000 rpm durante 5 minutos.

11. Se transfirió el sobrenadante a un tubo limpio y etiquetado. Se desechó el sedimento.

12. Se añadieron 2 volúmenes de etanol al 95 % a temperatura ambiente.

13. Se invirtió 20 veces para mezclar.

14. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos para precipitar el ADN.

15. Se centrifugó a 15000 rpm durante 2 minutos para sedimentar el ADN.

16. Se retiró con cuidado y desechó el sobrenadante con cuidado de no perturbar el sedimento.

17. Se disolvió el sedimento en 200 gl de TE.

18. Se agitó brevemente para resuspender completamente el ADN.

Extracción de ADN de Esputo Positivo para TB mediante el uso de "Estándar de Cuidado"

1. Se añadieron 0,5 ml de NaOH al 3,5 % a cada alícuota de 0,5 ml de esputo; se agitó con agitador vorticial para mezclar.

2. Se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos.

3. Se añadió solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) para llevar el volumen a 10 ml.

4. Se centrifugó a 5000 rpm durante 20 minutos para sedimentar bacterias. Se desechó el sobrenadante. 5. Se resuspendió el sedimento en 0,5 ml de PBS estéril.

6. Se reservaron 300 pl de bacterias resuspendidas para cultivo.

7. A los 200 pL restantes de bacterias resuspendidas, se le añadieron 200 mg de microesferas de vidrio de 105-150 micras.

8. Se batieron las microesferas durante 2 ciclos de 1 minuto, seguido de 1 minuto en hielo mediante el uso de un Mini-BeadBeater (BioSpec Products).

PCR en tiempo real para M. tuberculosis y Pirosecuenciación para Resistencia a Antibióticos

Las reacciones duplicadas de 5 pL de ADN "puro" y 5 pL de ADN diluido (1:10) de cada muestra de esputo purificado se amplificaron en un instrumento de PCR en tiempo real ABI 7500 mediante el uso de un ensayo de rtPCR aprobado por CLIA/CLEP dirigido a la región de diferencia (RD) del complejo RD4 Mycobacterium tuberculosis (MTBC) (Halse y otros, 2011). Los valores del ciclo umbral (Ct) inferiores a 37 se informaron como positivos y las muestras con valores superiores a 37 se volvieron a analizar; si los resultados eran iguales, el resultado se informaba como positivo, y si no lo eran, se informaba como no concluyente.

Resultados y Discusión

En comparación con el método convencional de batido de microesferas ("Estándar de Cuidado"), el presente "Método Peryodato" químico conduce claramente a una mayor sensibilidad de M. tuberculosis: detección específica, en particular, para muestras de esputo categorizadas como positivas para TB 'baja' y 'media' por cultivo y microscopía de frotis. En este ejemplo, hasta que el ADN extraído con el método "Estándar de Cuidado" se diluye 10 veces, no puede detectarse M. tuberculosis en muestras de esputo positivas para TB 'media' y 'alta' (Tabla 18); mientras que el 87 % de las muestras de esputo con "baja" carga de TB se detectaron como positivas después del aislamiento de ADN mediante el uso del "Método Peryodato" (Tabla 18).

Tabla 18. Porcentaje de muestras de esputo detectadas positivas para TB después de la extracción de ADN mediante el uso de 2 métodos diferentes

La Figura 9 ilustra el límite de detección significativamente mejorado de M. tuberculosis en todas las muestras de esputo positivas para TB extraídas con el "Método Peryodato", en comparación con el "Estándar de Cuidado" o SOC. Por ejemplo, los valores de Ct para el esputo positivo para TB 'bajo' oscilaron entre 31,4-45,0 para el "Método Peryodato", en comparación con 38,5-45,0 para el SOC; los valores de Ct para el esputo positivo para TB "medio" oscilaron entre 20,9-32,3 para el "Método Peryodato", en comparación con 26,8-45,0 para el SOC; los valores de Ct para el esputo positivo para TB 'alto' oscilaron entre 19,8-28,3 para el "Método Peryodato", en comparación con 27­ 2-39,3 para el SOC. La Figura 10 muestra los datos de la Figura 9 ordenados por método de extracción de ADN. Los valores de Ct son consistentemente más bajos, para todos los niveles de carga de TB, cuando el ADN se extrajo mediante el método peryodato. Este límite inferior de detección, proporcionado por la extracción de mejorado ADN, ayuda a garantizar un diagnóstico preciso de M. tuberculosis a partir de muestras de esputo de pacientes.

Ejemplo 10: El método basado en peryodato libera significativamente más ADN de Mycobacterium tuberculosis que la purificación de Qiagen

El resurgimiento de la tuberculosis en los países desarrollados y en desarrollo desde 1980 se ha asociado con la epidemia del VIH, la aparición de cepas resistentes a los medicamentos y el aumento de la emigración de regiones con altas tasas de endemicidad de la enfermedad (Corbett y otros, 2003). La tuberculosis es una de las causas más comunes de morbilidad y la causa más común de muerte en adultos seropositivos que viven en países menos desarrollados, sin embargo, es una enfermedad prevenible y tratable. La detección rápida de M. tuberculosis es fundamental para el manejo de la enfermedad debido al alto riesgo de transmisión de persona a persona. Los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de Estados Unidos recomiendan que las muestras clínicas recibidas se analicen simultáneamente mediante cultivo, tinción con bacilos acidorresistentes (AFB) y protocolos de amplificación de ácido nucleico (NAA) (Diagnostic Standards and Classifications of Tuberculosis in Adults and Children; American Thoracic Society and CDC, 2000). Si bien el cultivo sigue siendo el "estándar de oro" para la determinación final, puede demorar de dos a ocho semanas. La tinción para AFB es rápida, pero tiene baja sensibilidad y baja especificidad, ya que no distingue micobacterias no tuberculosas (NTM) de miembros del complejo Mycobacterium tuberculosis (MTBC). Por lo tanto, la identificación rápida, que es esencial para controlar la propagación de la tuberculosis, se basa cada vez más en la extracción de ácido nucleico y las pruebas de diagnóstico molecular.

Los miembros del MTBC difieren en atributos de virulencia, patrones de resistencia a fármacos y preferencias de hospedero. La rápida diferenciación de estas especies para determinar las fuentes zoonóticas o humanas de la enfermedad tuberculosis o para dirigir el tratamiento puede beneficiar tanto a la salud pública como al tratamiento de los pacientes. Halse y otros (2010; 2011) desarrollaron un ensayo de PCR en tiempo real para la diferenciación de organismos estrechamente relacionados, M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti y M. canettii. La presencia o ausencia de regiones de diferencia (RD) entre los genomas de los miembros del MTBC permitió el diseño de un ensayo de PCR en tiempo real (rtPCR) de cinco complejos, rápido, económico y de un solo tubo para diferenciar estas especies en especímenes clínicos.

Aguas arriba de tales ensayos de rtPCR; sin embargo, es fundamental que la muestra clínica se trate de tal forma que se recupere la máxima cantidad de ADN posible. Históricamente, los estudios cuantitativos han demostrado que debe haber de 5000 a 10000 bacilos por mililitro de muestra para permitir la detección de bacterias en frotis teñidos (Hobby y otros, 1973). Por el contrario, se necesitan de 10 a 100 organismos para un cultivo positivo (Yeager y otros, 1967). La detección molecular de Mycobacterium en una muestra completa que contiene tan solo 10 bacilos representa un verdadero desafío para los ensayos de diagnóstico, especialmente cuando el volumen de entrada del ensayo es una pequeña fracción de la muestra total. A diferencia de los frotis de cultivo y tinción, los métodos moleculares detectan el ADN de bacilos tanto vivos como muertos o moribundos en muestras de pacientes que reciben tratamiento, lo que permite la identificación de organismos del MTBC antes y durante el tratamiento.

Claramente existe una demanda para el desarrollo de metodologías de extracción superiores que faciliten la recuperación rápida de todo o la mayoría del ADN de microbios resistentes en muestras de pacientes. La extracción mejorada de ADN de muestras complejas, como el esputo, se traduce directamente en una mayor sensibilidad de los ensayos de diagnóstico (Dx)/basados en ADN para la tuberculosis y otras enfermedades y, en última instancia, en un tratamiento más rápido del paciente con la terapia farmacológica adecuada. Esta necesidad se ve agravada aún más por la aparición de la tuberculosis multirresistente (MDR-TB) y la tuberculosis extremadamente resistente a los fármacos (XDR-TB) en varios países, así como también por la reciente epidemia de tuberculosis asociada al VIH rápidamente letal en Sudáfrica (Ghandi y otros, 2006; Raviglione 2006). Como resultado de prácticas de control deficientes, algunos países ahora enfrentan uno de los peores escenarios posibles en el control de la TB: la combinación letal de infección por VIH y TB altamente resistente a los fármacos (Raviglione 2006).

Métodos Experimentales

Preparación de Muestras Biológicas Enriquecidas con Mycobacterium tuberculosis

Para simular esputo positivo para tuberculosis, las muestras de saliva de donantes sanos se enriquecieron con M. tuberculosis atenuada (aMTB) a 5 x 106 unidades formadoras de colonias/ml (cfu/ml).

Extracción de ADN de Saliva Positiva para M. tuberculosis mediante el uso del Método Peryodato ["Método Óptimo de ADN Genotek" u "Opción 1"]

1. Se mezcló un volumen igual de aMTB enriquecido con saliva con tampón BD2 (SDS al 2 %, CDTA 12,5 mM, LiCl 250 mM, glicina 50 mM, pH 10,5).

2. Se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos.

3. Se centrifugó a 5000 rpm durante 20 minutos. Se desechó el sobrenadante.

4. Se resuspendió el sedimento en tampón BD2 al 50 %.

5. Se añadió NPI a una concentración final de 30 mM, se agitó con agitador vorticial para mezclar

6. Se incubó a 70 °C en baño maría durante 20 minutos

7. Las muestras se enfriaron a temperatura ambiente durante 2 minutos

8. Se añadió tampón Tris 1 M (pH 7) a una concentración final de 50 mM

9. Se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos

10. Se añadió acetato de potasio 3M (pH 5,5) a una concentración final de 150 mM

11. Se incubó en hielo durante 10 minutos.

12. Se centrifugó a 13000 rpm durante 5 minutos

13. Se transfirió el sobrenadante a un tubo limpio y etiquetado. Se desechó el sedimento.

14. Se añadieron 800 gl de etanol al 95 % a temperatura ambiente

15. Se invirtió 20 veces para mezclar

16. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos para precipitar el ADN

17. Se centrifugó a 15000 rpm durante 2 minutos para sedimentar el ADN

18. Se retiró con cuidado y se desechó el sobrenadante con cuidado de no perturbar el sedimento.

19. Se disolvió el sedimento en 100 gL de TE

20. Se agitó con agitador vorticial brevemente para resuspender completamente el ADN

Extracción de ADN de Saliva Positiva para M. tuberculosis mediante el uso del Método Peryodato seguido de Purificación de Qiagen ["Opción 2"]

1. Se mezcló un volumen igual de aMTB enriquecido con saliva con tampón BD2 (SDS al 2 %, CDTA 12,5 mM, LiCl 250 mM, glicina 50 mM, pH 10,5).

2. Se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos.

3. Se centrifugó a 5000 rpm durante 20 minutos. Se desechó el sobrenadante.

4. Se resuspendió el sedimento en tampón BD2 al 50 %.

5. Se añadió NPI a una concentración final de 30 mM, se agitó con agitador vorticial para mezclar

6. Se incubó a 70 °C en baño maría durante 20 minutos

7. Las muestras se enfriaron a temperatura ambiente durante 2 minutos

8. Se añadió tampón Tris 1 M (pH 7) a una concentración final de 50 mM

9. Se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos

10. Se añadió un volumen igual de tampón Qiagen AL

11. Se siguió el procedimiento QIAMP de Qiagen para el minikit de ADN QlAamp de Qiagen (Núm. Cat. 51304).

Extracción de ADN de Saliva Positiva para M. tuberculosis mediante el uso del Tampón BD2 y Purificación de Qiagen ["Opción 3"]

1. Se mezcló un volumen igual de aMTB enriquecido con saliva con tampón BD2 (SDS al 2 %, CDTA 12,5 mM, LiCl 250 mM, glicina 50 mM, pH 10,5).

2. Se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos.

3. Se centrifugó a 5000 rpm durante 20 minutos. Se desechó el sobrenadante.

4. Se resuspendió el sedimento en tampón BD2 al 50 %.

5. Se añadió un volumen igual de búfer Qiagen AL

6. Se siguió el procedimiento QIAMP de Qiagen para el minikit de ADN QlAamp de Qiagen (Núm. Cat. 51304).

Extracción de ADN de Saliva Positiva para M. tuberculosis mediante el uso del método estándar de hidróxido de sodio/NALC y la Purificación de Qiagen ["Método Estándar de Qiagen" u "Opción 4"1123456

1. Se preparó una solución al 4 % de hidróxido de sodio (NaOH) fresca y se esterilizó en autoclave.

2. Se preparó una solución de citrato de sodio al 2,9 % fresca y se esterilizó en autoclave.

3. Antes de usar, se mezclaron volúmenes iguales de NaOH y solución de citrato de sodio.

4. Se añadió polvo de N-acetil-L-cisteína (NALC) para lograr una concentración final de 0,5 %. Se mezcló bien y se usó el mismo día.

5. Se mezcló un volumen igual de aMTB enriquecido con saliva con solución de NaOH/NALC/citrato.

6. Se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos.

7. Se añadió PBS estéril para llevar el volumen total a 50 ml.

8. Se centrifugó a 5000 rpm durante 20 minutos. Se desechó el sobrenadante.

9. Se resuspendió el sedimento en PBS.

10. Se añadió un volumen igual de tampón Qiagen AL

11. Se siguió el procedimiento QIAMP de Qiagen para el minikit de ADN QIAamp de Qiagen (Núm. Cat. 51304).

Condiciones de la rtPCR

En este ejemplo, el ADN aislado de muestras de aMTB enriquecidas con saliva (Opciones 1-4, anteriores) se sometió a un ensayo de rtPCR específico para Mycobacterium, el ensayo de la PCR en tiempo real de RD4Taqman. Los cebadores para RD4 son los siguientes: RD4-directo 5'-CCA CGA CTA TGA CTA g Ga CAG CAA-3' y RD4-inverso 5'-AAG AAC TAT CAA TCG GGC AAG ATC-3' (Halse y otros (2011)).

La Figura 11 ilustra el porcentaje de ADN de aMTB recuperado mediante pruebas moleculares en función de los equivalentes del genoma (GE) calculados (GE recuperado/GE de entrada * 100).

Resultados y Conclusiones

Los ensayos moleculares desarrollados recientemente brindan resultados confiables que ayudan con el manejo inicial de pacientes con sospecha de tuberculosis, antes de la disponibilidad de resultados para material cultivado, y brindan la capacidad de predecir la resistencia a los antibióticos en muestras positivas de Mycobacterium tuberculosis en tan solo 1- 2 días desde la recogida de las muestras clínicas. Sin embargo, el diagnóstico de la tuberculosis y los sistemas basados en la PCR en general requieren un procedimiento eficiente de aislamiento y purificación del ADN, lo que se complica aún más por la peculiaridad física y la falta de homogeneidad del esputo, así como también por el alto contenido de lípidos de la pared celular micobacteriana. Por lo tanto, todas las técnicas disponibles para la extracción de ADN de micobacterias requieren etapas de manipulación, lo que da como resultado una pérdida impredecible de material de partida que puede conducir a diagnósticos falsos negativos.

El presente ejemplo comparó múltiples metodologías de procesamiento y aislamiento de ADN para especímenes biológicos. Específicamente, el esputo positivo para tuberculosis se simuló mediante el enriquecimiento de muestras de saliva de donantes sanos con aMTB. La descontaminación convencional de las muestras con NaOH/NALC, seguida de la extracción de ADN con un mini kit de ADN Qiagen QIAamp comercialmente disponible (Opción 4), dio como resultado la recuperación de solo el 2,2 % del ADN de aMTB. Por el contrario, el presente método peryodato (Opción 1) condujo a la notable recuperación del 71,3 % del ADN de aMTB; un aumento del 70 % en la recuperación en comparación con la Opción 4. La Opción 3 demuestra que la incubación inicial de la muestra con el tampón BD2 no fue responsable del espectacular resultado de la Opción 1, ya que el tampón BD2 seguido de la extracción con Qiagen recuperó el 1,6 % de la cantidad original de aMTB enriquecida. Cuando las muestras tratadas con peryodato se extrajeron con el kit de Qiagen (Opción 2), solo se recuperó el 26,4 % del ADN de aMTB; equivalente a un aumento del 24 % en la recuperación de ADN en comparación con el kit convencional de NaOH/NACL/Qiagen (Opción 4).

El método peryodato aisló de manera eficiente la mayoría del ADN de las muestras enriquecidas con Mycobacterium tuberculosis y, en consecuencia, puede usarse para mejorar significativamente los beneficios ya bien conocidos de los ensayos diagnósticos/moleculares, es decir, un alto nivel de especificidad y sensibilidad, un tiempo de respuesta y una relación costo-efectividad bajos. Estas mejoras permiten que los sistemas de atención médica ahorren hasta 8 semanas de tiempo para diferenciar las especies de MTBC por cultivo, brindan información para lograr una terapia farmacológica rápida y adecuada con efectos secundarios mínimos, así como también una visión temprana de la transmisión de la TB.

Ejemplo 11: Degradación Selectiva de Proteína por Peryodato

El peryodato se usa comúnmente en solución para abrir anillos sacáridos entre dioles vecinos, lo que permite el marcaje selectivo del extremo 3' del ARN. Sorprendentemente, los inventores han determinado que el peryodato también es muy efectivo para "destruir" o neutralizar la actividad de enzimas específicas, como la ribonucleasa A pancreática (RNasa A) y que también degrada otras determinadas proteínas.

En este ejemplo, se demostró que la RNasa A, una ribonucleasa pancreática que escinde el ARN monocatenario, es una diana para el peryodato. La actividad enzimática de la RNasa se evaluó mediante el control de su capacidad para degradar un sustrato de ARN, ARN purificado de células HeLa. Si la actividad enzimática de la RNasa se viera afectada negativamente por el peryodato, entonces el ARN ribosómico de las células HeLa no se degradaría sustancialmente según lo evaluado por electroforesis en gel de agarosa.

Método Experimental y Materiales

Tratamiento de la ribonucleasa A pancreática pura con peryodato

1. Se añadió ribonucleasa A pancreática pura (Sigma) (0,1-0,2 pg/pl) a un tampón (SDS al 1 %, Li-CDTA 25 mM, LiCl 125 mM, glicina 25 mM, pH 10,5), con o sin peryodato 15 mM.

2. La mezcla se calentó a 70 °C durante 15 minutos.

3. Se cargaron 10 pl de la mezcla en un gel SDS-PAGE al 10 % y se corrieron a 160 voltios durante 60 minutos.

4. El gel SDS-PAGE se tiñó con azul de Coomassie caliente durante 30 minutos, luego se destiñó durante 2 horas a temperatura ambiente y se fotografió bajo luz visible (Figura 12).

Tratamiento del lisado de Mycobacterium smegmatis con peryodato

1. Se preparó un sedimento lavado a partir de una suspensión de Mycobacterium smegmatis cultivada en placa.

2. El batido de microesferas se realizó en un Mini-BeadBeater-16 (BioSpec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, el sedimento bacteriano lavado se suspendió en 1000 pl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se transfirió a un tubo de microcentrífuga de polipropileno con tapón de rosca que contenía aproximadamente 100 pl de microesferas de vidrio de 100 pm (Polyscience).

3. Se fijó el tubo al instrumento y se agitó vigorosamente en dos ciclos de 1 minuto (3450 oscilaciones/minuto).

La muestra se enfrió en hielo durante 1 minuto entre ciclos.

4. La suspensión se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y las células intactas y los desechos se eliminaron mediante centrifugación durante 5 minutos a 14000 rpm en una microcentrífuga.

5. Se eliminó el sobrenadante y se dividió en partes iguales entre dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Una fracción se diluyó con un volumen igual de PBS (control, ver Figura 13). La segunda fracción se mezcló con un volumen igual de tampón (SDS al 1 %, LÍ-C^dT^a 25 mM, LiCl 125 mM, glicina 25 mM, pH 10,5), se dividió en 3 porciones y se añadió peryodato, hasta una concentración final de 0, 7,5 mM o 15 mM.

6. Los tubos se calentaron a 70 °C durante 15 minutos. La muestra control no se calentó.

7. Se cargaron 7,5 o 15 pl de la mezcla en un gel de SDS-PAGE al 10 % y se procesó a 160 voltios durante 60 minutos.

8. El gel SDS-PAGE se tiñó con azul de Coomassie caliente durante 30 minutos y luego se destiñó durante 2 horas a temperatura ambiente y se fotografió (Figura 13).

Ácido nucleico HeLa purificado tratado con ribonucleasa A pancreática y peryodato

1. Se preparó una solución de ribonucleasa A pancreática pura (Sigma) (RNasa A) a 10 pg/ml en glicina 50 mM, pH 10,5.

2. La solución se dividió en partes iguales entre dos tubos y una de las alícuotas se trató con peryodato 15 mM.

3. Ambos tubos se incubaron a 70 °C durante 15 minutos.

4. El tubo de RNasa A tratado se diluyó 200-1000 veces en tampón ADA 50 mM, pH 6,5.

5. La RNasa A diluida se incubó con ácido nucleico HeLa (ADN y ARN) durante 20 minutos a 50 °C.

6. La reacción se 'detuvo' con la adición de SDS al 0,5 %.

7. La integridad del ARN de HeLa tratado se analizó mediante el uso de electroforesis en gel de agarosa al 1,0 % (Figura 14).

Resultados y Conclusiones

La Figura 12 muestra el sorprendente resultado de que la cantidad de proteína RNasa purificada de longitud completa disminuyó después de una breve incubación con peryodato; no se observaron productos de degradación (fragmentos de proteína más pequeños) en el gel. Además, una inspección cuidadosa de la Figura 13 muestra la pérdida selectiva de ciertas bandas de proteínas (desconocidas) en un lisado libre de células de M. smegmatis después de la incubación con peryodato. En presencia de concentraciones crecientes (7,5 y 15 mM) de peryodato, algunas bandas de proteínas disminuyeron selectivamente o desaparecieron por completo del gel, lo que indica que el peryodato tiene múltiples dianas proteicas.

Como demuestran los datos que se muestran en la Figura 14, la RNasa A ya no degradaba el ARN ribosómico si la RNasa A se incubaba previamente con peryodato durante un breve período de tiempo antes del contacto con el ARN. Se necesitó la adición de una cantidad relativamente grande de RNasa A (50 ng) para detectar una pequeña cantidad de RNasa activa residual que no pudo ser inactivada por peryodato. Por lo tanto, además de sus efectos sobre las proteínas celulares totales, el peryodato puede atacar e inhibir la acción enzimática de enzimas degradantes específicas.

Ejemplo 12: El Tratamiento con Peryodato Elimina la Viabilidad de las Esporas de Bacillus anthracis, Clostridium botulinum y Clostridium difficile

El ántrax es una enfermedad aguda, a menudo letal, causada por la bacteria aerobia Gram positiva en forma de bastón Bacillus anthracis que normalmente se encuentra en forma de endospora en el suelo. Al igual que C. botulinum y C. difficile, B. anthracis puede formar endosporas latentes, que son muy difíciles de erradicar y sobreviven en condiciones adversas durante décadas o incluso siglos. Cuando las esporas se inhalan, se ingieren o entran en contacto con una lesión en la piel de un hospedero, pueden reactivarse y multiplicarse rápidamente. La resistencia de las esporas de ántrax y su facilidad de producción in vitro las hace extraordinariamente adecuadas para su uso (en forma de polvo y aerosol) como armas biológicas.

Si bien los ejemplos anteriores demuestran la efectividad del método peryodato, en comparación con el método estándar, para liberar ácido nucleico de las esporas, también es importante comprender si quedan esporas viables después del tratamiento con peryodato.

Método Experimental

Preparación de esporas de Bacillus anthracis, Clostridium botulinum y Clostridium difficile

Se cultivaron cultivos madre congelados de C. botulinum tipo B y C. difficile en agar de soja tríptica con sangre de oveja al 5 % y se incubaron anaeróbicamente a 35 °C durante 24 a 48 horas. Después de la incubación inicial, estos cultivos se transfirieron a varias placas de agar de infusión de cerebro y corazón (mínimo de 10) y se incubaron en condiciones anaeróbicas a 35 °C durante un máximo de 2 semanas.

El cultivo madre congelado de la cepa Sterne de B. anthracis se cultivó en agar de soja tríptica con sangre de oveja al 5 % y se incubó a 35 °C con CO² al 5 % durante 24 horas. Después de la incubación inicial, este cultivo se transfirió a varias placas de agar de esporulación de Bacillus (mínimo de 10) y se incubó aeróbicamente a 35 °C con CO² durante un máximo de 2 semanas.

La tinción de esporas con verde de malaquita se realizó cada 3 a 4 días para monitorear la esporulación de bacterias in vitro. Cuando las tinciones de verde de malaquita preparadas mostraron una esporulación casi completa de organismos, las esporas se recogieron en 5,0 ml de PBS (pH 7,4) y se almacenaron a temperatura ambiente hasta su uso.

Determinación de la Concentración de Esporas

Cada suspensión madre de esporas de C. botulinum y C. difficile se diluyó en PBS a 10-2. La cepa Sterne de B. anthracis se diluyó a 10-3 en PBS. Se cargó una alícuota (10 pl) de cada una de estas diluciones finales en cada pocillo limpio de un portaobjetos de hemocitómetro de 2 cámaras. Se observaron cámaras de hemocitómetro con un aumento de 40x sin aceite para el recuento de esporas. Las esporas se visualizaron como células negras redondas u ovaladas en la rejilla de campo de luz del hemocitómetro. Bacillus anthracis, límite de detección (LOD) = 53 esporas/reacción; C. botulinum, LOD = 30 esporas/reacción; C. difficile, LOD = 20 esporas/reacción.

Tratamiento de Esporas mediante el uso de los Métodos Estándar y Peryodato

1. Se prepararon 700 pl de suspensión madre de esporas para cada organismo a la concentración requerida.

2. Se dividió cada muestra en 2 volúmenes de 350 pl.

3. 350 pl para WC BDL Método Estándar ("Colaborador"):

a. Se extrajo una alícuota de 50 pl para confirmar que las esporas eran viables al sembrar en placa sobre agar de soja tríptico con sangre de oveja al 5 % (ver más abajo).

4. 350 pl para Método Peryodato:

a. Se añadieron 350 gl de tampón BD2 (SDS al 2 %, CDTA 12,5 mM, LiCl 250 mM, glicina 50 mM, pH 10,5) a la suspensión madre de esporas de 350 gl de B. anthracis, C. botulinum y C. difícil. b. Se agitó con agitador vorticial para mezclar.

c. Se extrajeron 100 gl para cultivo ("Preperyodato").

d. Se añadieron 50 gl de (meta)peryodato de sodio 300 mM o reserva de NPI (concentración final 30 mM), se agitó con agitador vorticial para mezclar.

e. Se incubó a 70 °C en baño maría durante 20 minutos.

f. Las muestras se enfriaron a temperatura ambiente durante 2 minutos.

g. Se eliminaron 100 gl para cultivo ("Posperyodato").

Cultivo de Esporas para Determinar la Viabilidad

B. anthracis: Se sembraron alícuotas directamente en agar de soja tríptico con sangre de oveja al 5 % y se incubaron a 35 °C con CO² al 5 % durante 24 horas.

C. botulinum y C. difficile: Se sembraron alícuotas directamente en agar de soja tríptico con sangre de oveja al 5 % y se incubaron anaeróbicamente a 35 °C durante 24 a 48 horas.

Resultados y Discusión

Este ejemplo demuestra que el presente método "Peryodato" es muy efectivo para reducir la viabilidad de las esporas resistentes de B. anthracis (Figura 15), C. botulinum (Figura 16) y C. difficile (Figura 17). El tratamiento con peryodato (Posperyodato) redujo drásticamente la viabilidad de las esporas de B. anthracis, pero no erradicó todas las esporas presentes con un solo tratamiento. Por el contrario, ninguna espora de C. botulinum o C. difficile fue viable por cultivo después de un tratamiento con peryodato. Curiosamente, el tampón BD2 solo (Preperyodato) tuvo un impacto significativo en la viabilidad de las esporas de C. botulinum y C. difficile, pero no en B. anthracis, lo que sugiere que estos microorganismos son más fáciles de lisar que B. anthracis.

Ejemplo 13: Uso de la Presente Invención para Detectar Micobacterias en muestras de Saliva y Lavado Oral

De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud, en 2012, 1,3 millones de personas murieron a causa de la TB, 8,6 millones de personas enfermaron de TB y aproximadamente 530000 niños menores de 15 años contrajeron esta enfermedad infecciosa en todo el mundo. La TB es una enfermedad transmitida por el aire que se transmite a través de finas gotitas respiratorias de una persona infectada. Las personas con TB tienen más probabilidades de transmitirla a las personas que tienen un contacto cercano y prolongado con ellas, como familiares, amigos y compañeros de trabajo.

El diagnóstico de la TB pediátrica se ve obstaculizado por la dificultad para obtener muestras de esputo en niños y la naturaleza paucibacilar de su enfermedad que a menudo requiere procedimientos invasivos como la aspiración gástrica o la broncoscopía. Si la TB pudiera diagnosticarse a partir de saliva o muestras orales, la recolección podría realizarse fácilmente en el campo o en clínicas. Sin embargo, con los métodos convencionales de extracción de ADN, la abundancia de MTB en la saliva de las personas infectadas con TB se considera demasiado baja para que la saliva se considere un tipo de muestra confiable para el diagnóstico de la TB pulmonar activa.

Hoy en día, los laboratorios de diagnóstico dependen en gran medida de muestras de esputo para hacer un diagnóstico de tuberculosis pulmonar. Sin embargo, muchos pacientes, incluidos bebés y niños, no pueden expectorar esputo, lo que hace valiosa una muestra alternativa no invasiva para las investigaciones de diagnóstico de la TB. Varios estudios han evaluado el uso de muestras de lavado oral (Davis JL y otros, 2009) y muestras de saliva (Yassen G y otros, 2012) para la detección de la TB activa. En pacientes que no pueden producir esputo, las muestras de saliva y/o las muestras de lavado oral pueden ser más fáciles y seguras de obtener, en comparación con la inducción de esputo, que puede ser incómoda y peligrosa para los pacientes hipóxicos y que consume mucho tiempo y es peligrosa para el personal. Para la recolección de muestras de lavado oral, se instruye a los sujetos para que tosan vigorosamente 5 veces y luego hagan gárgaras con 10 ml de solución salina estéril durante 60 segundos. Se generan menos aerosoles infecciosos con muestras de lavado oral y muestras de saliva, en comparación con el esputo expectorado.

Es bien sabido que la sensibilidad de la PCR para diagnosticar enfermedades puede mejorarse al optimizar la técnica de extracción de ADN. El Ejemplo 9 (anterior) demuestra que el método peryodato de la presente invención libera significativamente más ADN de MTB en el esputo que los métodos estándar de cuidado que utilizan el batido de microesferas. Además, el Ejemplo 10 indica que el método basado en peryodato libera significativamente más ADN de MTB en la saliva que el método de extracción de ADN de Qiagen. Por lo tanto, se prevé que la mayor sensibilidad en la detección obtenida al utilizar la presente invención para extraer el ADN de MTB permitirá, por primera vez, el uso generalizado de muestras de saliva y/o lavado oral como muestras de diagnóstico preliminar para la TB pulmonar en individuos sintomáticos, especialmente los niños. Si bien la cantidad de MTB en la saliva de las personas infectadas activamente es baja, se anticipa que la mayor sensibilidad de detección obtenida por el método basado en peryodato permitirá una detección molecular más confiable de MTB mediante el uso de este tipo de muestra fácil de recolectar. Las muestras de saliva y/o lavado oral podrían recolectarse fácilmente de individuos sintomáticos para detectar rápidamente la TB e iniciar el tratamiento en una etapa más temprana que, a su vez, reducirá la transmisión y la morbilidad asociada con esta enfermedad infecciosa.

De manera similar, se anticipa que la composición de la presente invención también puede usarse con muestras de lavado broncoalveolar, orina, heces y aspirados gástricos para extraer ADN de MTB, lo que resulta en una mayor sensibilidad de detección de la TB en pruebas de diagnóstico molecular y un aumento en el número de casos de tuberculosis identificados.

Ejemplo 14: Uso de Peryodato para Liberar Ácidos Nucleicos de una Amplia Variedad de Microorganismos

En este ejemplo, un panel de varios microorganismos, que incluye bacterias Gram positivas (Bacillus thuringiensis, Staphylococcus aureus, Mycobacterium smegmatis), bacterias Gram negativas (Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumonía, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica, Francisella philomiragia) y levaduras (Candida albicans), fueron tratados con peryodato. La liberación de ácidos nucleicos de estos microorganismos se evaluó mediante dos métodos distintos, a saber, el método de extracción ácida/HPLC y la PCR en tiempo real (qPCR). Métodos Experimentales

Las bacterias y la levadura se cultivaron en los medios de crecimiento recomendados y a la temperatura recomendada de la siguiente manera: en caldo YEPD (C. albicans), caldo de soja tríptica con cisteína al 0,1 % (F. philomiragia), caldo de infusión de cerebro y corazón (Y. enterocolitica, M. catarrhalis) o caldo de soja tríptico (B. thuringiensis, S. aureus, M. smegmatis, K. pneumonia, P. aeruginosa). Y. enterocolitica y C. albicans se cultivaron a 30 °C, mientras que otros microorganismos se cultivaron a 35 °C.

Después del crecimiento de la noche a la mañana, las células se recogieron por centrifugación a 7500 g durante 8 minutos; se desechó el sobrenadante. Los sedimentos bacterianos se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato fría mediante centrifugación a 7500 g durante 6 minutos y se desecharon los sobrenadantes. Los sedimentos bacterianos lavados se resuspendieron en 1,5 ml de agua fría.

Se mezclaron 180 gl de suspensión celular con 200 gl de tampón BD2 (SDS al 2 %, CDTA 12,5 mM, LiCl 250 mM, glicina 50 mM, pH 10,5) y se añadieron 20 gl de peryodato 300 mM o agua libre de RNasa/DNasa (control) a las muestras que no recibieron peryodato. Las muestras se incubaron durante 20 minutos a 35 °C, 70 °C u 80 °C. Las muestras se centrifugaron a 14000 rpm durante 5 minutos. Los sobrenadantes se transfirieron a un tubo nuevo y los sedimentos se desecharon.

Todas las muestras se purificaron con la adición de 16 gl de tampón TK (500 mM Tris, acetato de potasio 1,5 M, pH 5,5), se incubaron primero durante 5 minutos a temperatura ambiente, luego durante 15 minutos en hielo, seguido de centrifugación durante 5 minutos a 14000 rpm. La mitad del volumen de cada muestra se precipitó con 2X volumen de etanol al 95 % frío durante 1 hora a -20 °C; la otra mitad se sometió a hidrólisis ácida mediante la adición de HCl a una concentración final de 0,2 N y se incubó a 60 °C durante 60 minutos. Se añadió NaOH en un exceso de 0,1 N a todas las muestras hidrolizadas con ácido, seguido de incubación a 100 °C durante 10 minutos. Para neutralizar las muestras para HPLC de fase inversa, se añadieron a las muestras 300 gl de ADA 500 mM, pH 6,5 y las muestras se centrifugaron durante 3 minutos a 14000 rpm durante 5 minutos. Los sobrenadantes se analizaron mediante HPLC y se desechó cualquier material insoluble.

Las muestras en etanol se centrifugaron durante 3 minutos a 14000 rpm, se desecharon los sobrenadantes y los sedimentos se disolvieron en 50 gl de agua fría libre de RNasa/DNasa. Se usó 1 gl de material purificado como molde en reacciones de PCR de 25 gl por duplicado. Ver el Ejemplo 6 para conocer las condiciones de la PCR en tiempo real con cebadores bacterianos universales.

Los cebadores fúngicos universales fueron F: 5'-gcatcgatgaagaacgcagc-3' y R: 5'-tcctccgcttattgatatgc-3'. Cada reacción de la PCR de 25 gl contenía MgCl²2,0 mM, dNTP 0,2 mM, Syto 91,0 gM, cebador fúngico universal F 4,0 pmol, cebador fúngico universal R 4,0 pmol, albúmina sérica bovina (BSA) 2,0 gg, ADN polimerasa FastStart Taq 1U (Roche) y 1 mezcla maestra FastStart PCR. Las condiciones de ciclo para los cebadores fúngicos universales fueron las siguientes: 95 °C durante 2 minutos x 1 (95 °C durante 20 segundos, 56,5 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 25 segundos) x 38.

Resultados y Discusión

Claramente, se liberó significativamente más ADN de una amplia gama de microorganismos en presencia de peryodato que sin él, como se muestra tanto en la PCR en tiempo real (Tablas 19-21) como en el Método de Extracción Ácida/HPLC (Tablas 22-30). Este efecto del peryodato parecía depender de la temperatura con una liberación óptima de ácido nucleico a 70-80 °C. El peryodato liberó ácidos nucleicos de bacterias Gram positivas y Gram negativas, así como de hongos. Curiosamente, el peryodato liberó cantidades relativamente pequeñas de ácido nucleico de S. aureus según lo detectado por el método HPLC, pero no por la PCR en tiempo real.

Tabla 19: Valores de Ct de la PCR en tiempo real mediante el uso de cebadores bacterianos universales.

Tabla 20: Valores de Ct de la PCR en tiempo real mediante el uso de cebadores bacterianos universales o cebadores fúngicos universales.

Tabla 21: Valores de Ct de la PCR en tiempo real mediante el uso de cebadores bacterianos universales.

Tabla 22: % de ADN Liberado de F. philomiragia según lo Determinado por el Método de Extracción Ácida/HPLC.

Tabla 23: % de ADN Liberado de S. aureus según lo Determinado por el Método de Extracción Ácida/HPLC.

Tabla 24: % de ADN Liberado de M. smegmatis según lo Determinado por el Método de Extracción Ácida/HPLC.

Tabla 25: % de ADN Liberado de B. thuringiensis según lo Determinado por el Método de Extracción Ácida/HPLC

Tabla 26: % de ADN Liberado de Y. enterocolitica según lo Determinado por el Método de Extracción Ácida/HPLC.

Tabla 27: % de ADN Liberado de C. albicans según lo Determinado por el Método de Extracción Ácida/HPLC.

Tabla 28: % de ADN Liberado de M. catarrhalis según lo Determinado por el Método de Extracción Ácida/HPLC.

Tabla 29: % de ADN Liberado de K. pneumoniae según lo Determinado por el Método de Extracción Ácida/HPLC.

Tabla 30: % de ADN Liberado de P. aeruginosa según lo Determinado por el Método de Extracción Ácida/HPLC.

Ejemplo 15: Uso de Peryodato para Liberar ADN de M. tuberculosis Presente en Tipos de Muestras Biológicas Variadas

Es posible encontrar microorganismos en una variedad de entornos naturales, organismos hospederos y muestras biológicas. Este ejemplo muestra que el presente "Método Peryodato" químico de extracción de ADN es adecuado para detectar organismos resistentes, tales como M. tuberculosis a partir de muestras biológicas de diversa complejidad. Específicamente, el ADN de M. tuberculosis se recuperó de muestras de orina y heces humanas. Métodos Experimentales

Preparación de Muestras Biológicas Enriquecidas con Mycobacterium tuberculosis

Para simular muestras positivas para tuberculosis, se enriquecieron muestras de donantes sanos de 1 ml de orina o heces (de una preparación de ~400 mg de heces recolectadas en 2 ml de tampón de homogeneización de heces (Núm. de Serie de Estados Unidos 61/949,692)) con M. tuberculosis atenuada (aMTB) hasta una concentración final de aproximadamente 3 x 106 ufc/ml.

Extracción de ADN de Orina y Heces M Tuberculosis positivo mediante el uso del "Método Peryodato"

1. Se mezclaron 200 gl de orina o heces enriquecidas con aMTB con un volumen igual de tampón BD2 2. Se añadieron 40 gl de NPI (concentración final de 30 mM), se agitó con agitador vorticial para mezclar y se incubaron a 70 °C durante 20 minutos

3. Las muestras se enfriaron a temperatura ambiente durante 2 minutos.

4. Se añadió tampón Tris 1 M (pH 7) hasta una concentración final de 50 mM

5. Se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos

6. Se añadió acetato de potasio 3 M (pH 5,5) hasta una concentración final de 150 mM

7. Se incubó en hielo durante 10 minutos.

8. Se centrifugó a 15000 x g durante 5 minutos

9. Se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo y se desechó el precipitado.

10. Se añadieron 800 pl de etanol al 95 % a temperatura ambiente y se invirtió 20 veces para mezclar 11. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos para precipitar el ADN.

12. Se centrifugó a 15000 x g durante 2 minutos para sedimentar el ADN

13. Se retiró con cuidado y se desechó el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el precipitado.

14. Se añadieron 100 pL de TE para rehidratar el sedimento

PCR en tiempo real

El ADN aislado de orina o heces enriquecido con aMTB se usó en el ensayo de la PCR en tiempo real RD4 Taqman como se describió en los Ejemplos 9 y 10. El ADN se diluyó en 1:100 para heces antes del ensayo y se usaron 5 pl en cada caso.

Resultados y Conclusiones

En este ejemplo, el ADN extraído mediante el uso del "Método Peryodato" se detecta como TB positivo en el 100 % de los casos analizados (Tabla 31), lo que demuestra que la presente invención es efectiva para liberar ADN funcional de muestras que van desde baja complejidad (principalmente acuosas, soluciones homogéneas de pH neutro) a una mayor complejidad (compuestos semisólidos, heterogéneos, de pH variable).

Tabla 31: Porcentaje de muestras de Orina y Heces detectadas como positivas para TB después de la extracción de ADN mediante el uso del "Método Peryodato".

Ejemplo 16: Uso de Peryodato para la Bioseguridad de Muestras Infecciosas.

El continuo aumento de las infecciones de TB en todo el mundo requiere una respuesta médica sólida que involucre detección, tratamiento y prevención. Tal marco depende de una gran red de laboratorios y personal científico asociado que participa activamente en el manejo de muestras altamente infecciosas. Dada la facilidad con la que se transmite la TB, se requieren gabinetes de seguridad biológica (BSC) sofisticados y de alto nivel para su manejo. Además, estos trabajadores tienen un riesgo potencialmente mayor de infección. Una composición con la capacidad de convertir rápidamente estas muestras en "bioseguras", es decir, ya no viables y, por lo tanto, seguras para su traslado a un laboratorio más básico para análisis posteriores es una clara ventaja en este campo.

En este ejemplo, los sedimentos bacterianos obtenidos siguiendo los protocolos de tratamiento con y sin peryodato se evaluaron desde una perspectiva de bioseguridad para garantizar que el material pueda eliminarse de forma segura de un BSL-3 (Nivel de seguridad biológica 3) para su análisis en un conjunto molecular de un laboratorio BSL-2.

Métodos Experimentales

Preparación de Muestras Biológicas Enriquecidas con Mycobacterium tuberculosis

Para simular esputo positivo para tuberculosis, las muestras de saliva de donantes sanos se enriquecieron con M. tuberculosis atenuada (aMTB) con las siguientes concentraciones madre aproximadas:

1.7,5 x 109 cfu/ml (carga alta)

2. 7,5 x 107 cfu/ml (carga media)

Las muestras de saliva enriquecida se prepararon de acuerdo con los siguientes grupos, y cada grupo se preparó mediante el uso de la concentración madre de carga alta o la concentración madre de carga media:

A. 1,0 ml de saliva 1,0 ml de tampón BD2 100 pl de aMTB madre: sin tratamiento con NPI

B. 2,0 ml de saliva 100 pl de aMTB madre: sin tratamiento con NPI

C. 2,0 ml de saliva 100 pl de aMTB madre: tratamiento NPI

D. 1,0 ml de saliva 1,0 ml de tampón BD2 100 pl de aMTB madre: tratamiento NPI

La concentración final de aMTB en cada grupo fue ~3,75 x 108 ufc/ml (muestras de alta carga) o ~3,75 x 106 ufc/ml (muestras de carga media). Cada tubo se agitó brevemente para mezclar y las muestras se procesaron de la siguiente manera:

Protocolo para muestras del Grupo A y del Grupo B

1. Alícuota de cada muestra en tres tubos de centrífuga nuevos de 1,5 ml a 500 pl por tubo

2. Centrifugar los tubos durante 20 minutos a 3500 x g

3. Retire y deseche el sobrenadante

4. Resuspender el sedimento en 50 pl de PBS estéril

5. Aplique la mezcla de sedimento de PBS con cuidado en el borde superior de un tubo de medio de cultivo Lowenstein-Jansen (inclinación LJ) y agite suavemente de lado a lado para distribuir la muestra

6. Incubar a 35 °C durante 42 días y evaluar el crecimiento

Protocolo para las muestras del Grupo C y el Grupo D

1. Alícuota de cada muestra en tres tubos de centrífuga nuevos de 1,5 ml a 500 pl por tubo

2. Centrifugar los tubos durante 20 minutos a 3500 x g

3. Retire y deseche el sobrenadante

4. Vuelva a suspender el sedimento en 500 pl de tampón BD2 al 50 %.

5. Añada 50 pl de NPI (concentración final 30 mM), agite para mezclar e incube a 70 °C durante 20 minutos 6. Enfríe las muestras a temperatura ambiente durante 2 minutos.

7. Añadir tampón Tris 1 M (pH 7) hasta una concentración final de 50 mM

8. Centrifugar los tubos durante 20 minutos a 3500 x g

9. Retire y deseche el sobrenadante.

10. Lavar el sedimento en 500 pl de PBS estéril

11. Centrifugar los tubos durante 20 minutos a 3500 x g

12. Retire y deseche el sobrenadante

13. Vuelva a suspender el sedimento en 50 pL de PBS estéril

14. Aplique la mezcla de sedimento de PBS con cuidado en el borde superior de un tubo de medio de cultivo Lowenstein-Jansen (inclinación LJ) y agite suavemente de lado a lado para distribuir la muestra

15. Incubar a 35 °C durante 42 días y evaluar el crecimiento

Resultados y Conclusiones

Tabla 32: Resumen del crecimiento de aMTB en inclinaciones LJ en presencia o ausencia de NPI Grupos A B C D BD2 + - - Composición de la Muestra aMTB + NPI - - Carga alta ++ * + NEG NEG Crecimiento (hasta 42 días)

Carga media + * + NEG NEG Carga alta 8 1* > 42 > 42 Tiempo para Positivo (d)

Carga media 10 1* > 42 > 42 * La ausencia de un tampón de lisis inicial (BD2) para eliminar la flora de fondo resultó en un rápido crecimiento de estos organismos contaminantes

La Tabla 32 demuestra la prevención de la viabilidad de la TB en presencia de NPI. En los grupos A y B, donde NPI no está presente, las colonias de TB comenzaron a aparecer después de 8-10 días (Grupo A), y la flora de fondo contaminante abrumó el medio LJ en un día (Grupo B). En contraste, en los grupos C y D, donde se añadió NPI, no se observó crecimiento de ningún microorganismo, incluso después de 42 días de incubación, que es el estándar de cultivo actual para determinar el estado negativo de TB. Esto demuestra que la NPI es necesaria para la prevención de la viabilidad de la TB. Este efecto también se observa incluso en ausencia de un tampón de lisis inicial para la eliminación de la flora de fondo (BD2; Grupo C), lo que indica que la NPI sola es suficiente para prevenir la viabilidad de la TB. Se trata de una clara mejoría con respecto al estado actual de la técnica, ya que permite que las personas que manipulan muestras positivas para TB las conviertan en bioseguras de forma rápida y efectiva. Por lo tanto, se reduce el riesgo para el individuo, y estas muestras tratadas con NPI pueden retirarse del entorno BSL3 restrictivo a un laboratorio BSL2 para su posterior análisis, que incluye la extracción de ADN y la PCR en tiempo real (ver Ejemplo 9).

Ejemplo 17: Actividad de Prueba de ML Directamente en Muestra de Esputo de NaOH-NALC

NaOH/NALC se usa ampliamente para licuar el esputo. Este ejemplo demuestra que el peryodato permanece activo, es decir, libera ácidos nucleicos de MTB, en muestras de esputo tratadas con NaOH/NALC.

Métodos experimentales

Preparación de muestras de esputo enriquecidas con Mycobacterium tuberculosis

Para simular un esputo positivo para tuberculosis, una muestra de esputo (comprada en Tissue Solutions Ltd., Glasgow, Escocia) se enriqueció con aproximadamente 9 x 106 CFU/ml de M. tuberculosis H37Ra atenuado (aMTB) y se dividió en dos porciones. Una porción se trató con un volumen igual de NaOH/NALC durante 15 minutos a temperatura ambiente, mientras que la segunda porción se mezcló con un volumen igual de tampón BD2 (glicina 50 mM, LiCl 250 mM, Li-CDTA 12,5 mM, SDS al 2 %, pH 10,5). El esputo tratado con tampón BD se centrifugó a 5000 rpm durante 20 minutos y el precipitado se resuspendió en 1 ml de PBS al que se le añadió 1 ml de tampón BD2.

Extracción de ADN de Esputo Positivo para aMTB en Tampón NaOH/NALC o BD mediante el uso del Método Peryodato Óptimo

1. Tres alícuotas de 200 gl de esputo tratado con NaOH/NALC o esputo tratado con tampón BD2 (arriba) se trataron con NPI hasta una concentración final de 30 mM, se agitaron con agitador vorticial para mezclar.

2. Se incubó a 70 °C en baño maría durante 20 minutos.

3. Las alícuotas se enfriaron a temperatura ambiente durante 2 minutos.

4. Se añadió tampón Tris 1 M (pH 7) hasta una concentración final de 50 mM.

5. Se añadió acetato de potasio 3M (pH 5,5) a una concentración final de 150 mM.

6. Se incubó en hielo durante 10 minutos.

7. Se centrifugó a 13200 rpm durante 5 minutos.

8. Se transfirió el sobrenadante a un tubo limpio. Se desechó el sedimento.

9. Se añadieron 400 gl de etanol al 95 % a temperatura ambiente. Se invirtió 20 veces para mezclar.

10. Se incubaron las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos para precipitar el ADN.

11. Se centrifugó a 15000 rpm durante 2 minutos para sedimentar el ADN.

12. Se retiró con cuidado y se desechó el sobrenadante con cuidado de no perturbar el precipitado.

13. Se desechó el sedimento en 200 gl de TE. Se agitó brevemente para resuspender completamente el ADN.

Extracción de ADN de Esputo Positivo para aMTB en NaOH/NALC mediante el uso del Método Peryodato Acortado

1. Tres alícuotas de 200 gl de esputo tratado con NaOH/NALC (arriba) se trataron con NPI hasta una contracción final de 30 mM, se agitó con agitador vorticial para mezclar.

2. Se incubó a 70 °C en baño maría durante 20 minutos.

3. Las alícuotas se enfriaron a temperatura ambiente durante 2 minutos.

4. Se añadió tampón Tris 1 M (pH 7) hasta una concentración final de 50 mM.

5. Se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos.

6. Se añadieron 2 volúmenes de etanol al 95 % a temperatura ambiente. Se invirtió 20 veces para mezclar. 7. Se incubaron las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos para precipitar el ADN.

8. Se centrifugó a 15000 rpm durante 2 minutos para sedimentar el ADN.

9. Se retiró con cuidado y se desechó el sobrenadante con cuidado de no perturbar el precipitado.

10. Se disolvió el sedimento en 200 gl de TE. Se agitó con agitador vorticial brevemente para resuspender completamente el ADN.

Condiciones de la rtPCR

En este ejemplo, el ADN aislado de muestras de aMTB enriquecidas con esputo (anterior) se sometió a un ensayo de la rtPCR específico para Mycobacterium, el ensayo de la PCR en tiempo real RD4 Taqman (ver Ejemplo 10). Resultados y Conclusiones

Como se describió anteriormente, el protocolo de extracción para el esputo tratado con NaOH/NALC puede acortarse al eliminar el acetato de potasio y las etapas de centrifugación necesarios para precipitar el SDS de las muestras tratadas con tampón BD2. El presente ejemplo usa un ensayo de la PCR en tiempo real específico para M. tuberculosis para demostrar que el peryodato es capaz de liberar ácido nucleico de aMTB en el esputo después del tratamiento con NaOH/NALC (Tabla 33). En comparación con el método de la presente invención, el tratamiento con tampón BD2 seguido de la extracción de ADN mediante el uso de peryodato, los valores de Ct fueron solo 2 ciclos más altos cuando el esputo se trató con NaOH/NALC antes de la extracción de ADN mediante el uso de peryodato.

Tabla 33: Cuantificación del ADN liberado del esputo enriquecido con aMTB.

Ejemplo 18: Método Peryodato en Comparación con el Método de Estándar de Cuidado para la Detección Molecular de Mycobacterium tuberculosis

El CDC recomienda que las muestras clínicas se analicen simultáneamente mediante cultivo, tinción de bacilos acidorresistentes (AFB) y protocolos de amplificación de ácidos nucleicos (Anónimo, 2009). El cultivo es el "estándar de oro" para la determinación final de la positividad de la TB, pero es lento y puede demorar hasta 8 semanas. La tinción de AFB es rápida, pero tiene baja sensibilidad y baja especificidad, ya que no distingue las micobacterias no tuberculosas (NTM) de los miembros del complejo M. tuberculosis (MTBC). Por lo tanto, la identificación rápida, que es esencial para controlar la propagación de la enfermedad, se basa en protocolos de amplificación de ácidos nucleicos, como la PCR en tiempo real (qPCR) y la secuenciación.

La evaluación de la resistencia a los antibióticos en pacientes infectados con M. tuberculosis es de vital importancia para el manejo del paciente y el control de la propagación de la enfermedad. Los métodos estándar para las pruebas de susceptibilidad a los medicamentos (DST) de M. tuberculosis pueden tardar semanas o meses en proporcionar resultados. Debido a la aparición de la tuberculosis multirresistente (MDR-TB) y la tuberculosis extremadamente resistente a los medicamentos (XDR-TB), se han desarrollado enfoques moleculares rápidos. Las mutaciones dentro del gen rpoB están asociadas con la resistencia a la rifampicina (RIF), mientras que las mutaciones con los genes katG e inhA están asociadas con la resistencia a la isoniazida. Halse y otros (2010) desarrollaron un enfoque molecular de dos pasos que utilizó análisis de pirosecuenciación de genes de resistencia a antibióticos directamente con muestras clínicas positivas para el complejo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) mediante la PCR en tiempo real.

En este ejemplo, se realizó una comparación lado a lado de la evaluación clínica de muestras de esputo positivas para la TB (amablemente donadas por el Banco de muestras de tuberculosis de la Fundación para Diagnósticos Innovadores (FIND)) tratadas con dos métodos distintos. Específicamente, 1) el método "Estándar de Cuidado", que consiste en un tratamiento con hidróxido de sodio seguido de un batido de microesferas, y 2) la presente invención se comparó en términos de sensibilidad en un ensayo de la qPCR aprobado por CLIA/CLEP (dirigido a la región RD4 MTBC de (RD)) (Halse y otros, 2011) y ensayo de pirosecuenciación de genes de resistencia a antibióticos (Halse y otros, 2010). En el presente método, las muestras de esputo positivas para la TB se trataron con tampón BD2 y peryodato para facilitar la lisis química de las células en la muestra, antes del aislamiento del ADN y las pruebas de ensayo.

En contraste con la presente invención, el "Estándar de Cuidado" incluye el batido de microesferas, un método mecánico, para abrir bacterias en muestras de esputo. Si bien el batido de microesferas mecánico puede ser efectivo para abrir organismos, crea aerosoles peligrosos en el entorno del laboratorio. Por lo tanto, es muy deseable desarrollar un método químico, no mecánico, efectivo para liberar de forma segura el ADN de Mycobacterium tuberculosis, sin afectar negativamente a la sensibilidad clínica de las pruebas de diagnóstico.

Método Experimental

Muestras de Esputo Positivas para Mycobacterium tuberculosis

Para el presente ejemplo, el banco de muestras de tuberculosis de la Fundación para el Diagnósticos Innovadores (FIND) donó amablemente muestras de esputo sin procesar de pacientes confirmados con TB positiva. Mediante el uso de análisis de frotis y cultivos, FIND clasificó estas muestras como muestras positivas para TB 'baja', 'mediana' y 'alta'. Se proporcionaron alícuotas duplicadas de 0,5 ml de 30 muestras de pacientes y se almacenaron congeladas. Las alícuotas se enviaron congeladas al Laboratorio de Micobacteriología del Centro Wadsworth (Departamento de Salud del Estado de Nueva York, Albany, Nueva York, Estados Unidos), un Laboratorio Clínico aprobado por CLIA/CLEP para su análisis posterior.

Se descongelaron en hielo alícuotas duplicadas de 30 donantes; un conjunto de alícuotas se procesó mediante el uso del método "Estándar de Cuidado" (Colaborador) y el segundo conjunto se trató con tampón BD2 y peryodato (Peryodato), antes del aislamiento del ADN.

Tratamiento de esputo positivo para TB utilizando el método "Estándar de Cuidado"

1. Se añadieron 0,5 ml de NaOH al 3,5 % a cada alícuota de 0,5 ml de esputo (n = 6); se agitó con agitador vorticial para mezclar.

2. Se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos.

3. Se llevó hasta 10 ml con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).

4. Se centrifugó a 5000 rpm durante 20 minutos para sedimentar bacterias. Se desechó el sobrenadante. 5. Se resuspendió el sedimento en 0,5 ml de PBS estéril.

6. Se reservaron 300 gl de bacterias resuspendidas para cultivo para confirmar la viabilidad de M. tuberculosis.

7. Se lisaron las bacterias al añadir 200 mg de microesferas de vidrio de 105-150 micras a los 200 gl restantes de bacterias resuspendidas.

8. Se batieron las microesferas durante 2 ciclos de 1 minuto, seguido de 1 minuto en hielo mediante el uso de un Mini-BeadBeater (BioSpec Products).

Tratamiento de Esputo Positivo para TB mediante el uso del Método Peryodato

1. Se añadieron 0,5 ml de tampón BD2 (SDS al 2 %, CDTA 12,5 mM, LiCl 250 mM, glicina 50 mM, pH 10,5) a cada alícuota de esputo de 0,5 ml (n = 6); se agitó con agitador vorticial para mezclar.

2. Se añadió la proteinasa K (400 gg) y se incubó a 50 °C en un baño maría durante 2 horas.

3. Se añadió NPI a una concentración final de 30 mM, se agitó con agitador vorticial para mezclar.

4. Se incubó a 70 °C en baño maría durante 20 minutos.

5. Las muestras se enfriaron a temperatura ambiente durante 2 minutos.

6. Se añadió tampón Tris 1 M (pH 7) a una concentración final de 50 mM.

7. Se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos.

8. Se añadió acetato de potasio 3M (pH 5.5) a una concentración final de 150 mM.

9. Se incubó en hielo durante 10 minutos.

10. Se centrifugó a 13000 rpm durante 5 minutos.

11. Se transfirió el sobrenadante a un tubo limpio y etiquetado. Se desechó el sedimento.

12. Se añadieron 2 volúmenes de etanol al 95 % a temperatura ambiente; se invirtió 20 veces para mezclar. 13. Se incubaron las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos para precipitar el ADN.

14. Se centrifugó a 15000 rpm durante 2 minutos para sedimentar el ADN.

15. Se retiró con cuidado y se desechó el sobrenadante con cuidado de no perturbar el sedimento.

16. Se disolvió el sedimento en 200 gl de TE.

17. Se agitó brevemente para resuspender completamente el ADN y se dejó reposar a temperatura ambiente durante un mínimo de 30 minutos.

PCR en tiempo real para M. tuberculosis y Pirosecuenciación para Resistencia a Antibióticos

Las reacciones duplicadas de 5 gl de ADN 'puro' y 5 gl de ADN diluido (1:10) de cada muestra de esputo purificada (anterior) se amplificaron en un instrumento de la PCR en tiempo real ABI 7500 mediante el uso de un ensayo de la qPCR aprobado por CLIA/CLEP dirigido al RD4 MTBC región de diferencia (RD) (Halse y otros, 2011). Los valores del ciclo umbral (Ct) inferiores a 37 se informaron como positivos y las muestras con valores superiores a 37 se volvieron a analizar; si los resultados eran iguales, el resultado se informaba como positivo, y si no lo eran, se informaba como no concluyente.

El perfil de resistencia a los antibióticos se realizó mediante el uso del método de pirosecuenciación publicado anteriormente para la resistencia a la rifampcina (rpoB) (Halse y otros, 2010) y objetivos adicionales para la resistencia a la isonazida (inhA y katG). El ADN obtenido con ambos métodos se usó en reacciones de la PCR separadas para amplificar regiones específicas de los genes rpoB, inhA y katG. Las mutaciones en estas regiones indican probable resistencia a los antibióticos rifampicina y/o isonazida.

Resultados y discusión

Hoy en día, el método estándar de cuidado implica la licuefacción del esputo con hidróxido de sodio (o NaOH/NALC), seguida del aislamiento del ADN de las bacterias mediante el batido de microesferas mecánico. El presente método es diferente en que un tratamiento químico simple, que incluye peryodato, lisa efectivamente las bacterias. Es importante destacar que la composición y el método presentes parecen ser tan efectivos, si no más efectivos, en comparación con la metodología estándar de atención, para conducir a la posterior detección de marcadores de resistencia a antibióticos y ADN específicos de M. tuberculosis.

Tabla 34: Resultados de pirosecuenciación para tres marcadores de resistencia a antibióticos en M. tuberculosis.

En comparación con el método convencional ("Colaborador", Tabla 34), el presente método químico ("Peryodato", Tabla 34) condujo a una mayor sensibilidad clínica de la detección específica de M. tuberculosis mediante la qPCR en muestras de esputo duplicadas clasificadas anteriormente como TB positiva 'baja' y 'media' mediante cultivo y microscopía de frotis. En este ejemplo, hasta que el ADN extraído con el método "Estándar de Cuidado" se diluyó 10 veces, no se detectó M. tuberculosis mediante la qPCR en muestras de esputo positivas para TB "medias" y "altas" (Tabla 34). Para todos los niveles de carga de la TB, la Tabla 1 ilustra el límite de detección significativamente mejorado (valores de Ct más bajos por la qPCR) de M. tuberculosis en todas las muestras de esputo positivas para la TB tratadas con el presente método (Peryodato), en comparación con el método estándar de cuidado (Colaborador). Este límite inferior de detección ayuda a garantizar un diagnóstico preciso de M. tuberculosis a partir de muestras de esputo de pacientes.

De manera similar, la composición y el método presentes son compatibles con las pruebas estándar de la industria para predecir la resistencia a los antibióticos en muestras positivas para M. tuberculosis. Los resultados del ensayo de pirosecuenciación obtenidos con el método de atención estándar y el método de peryodato fueron 100 % concordantes para las 6 muestras de esputo clínicamente positivas para TB analizadas. Es importante destacar que, de estas muestras de esputo de 6 pacientes, el presente método peryodato, pero no el método estándar de cuidado, detectó 2 pacientes (FIND 0101 2072 y FIND 01 01 2137) con marcadores de resistencia a antibióticos (genes inhA y ropB) (Tabla 34). Incluso la prueba de cultivo estándar de oro no pudo mostrar el crecimiento de micobacterias en las muestras de estos 2 pacientes después de 52 días in vitro.

El impacto de la mayor recuperación de ADN de micobacterias en el momento de la prueba se destaca mejor con los datos de pirosecuenciación. Las muestras tratadas con peryodato tenían ADN disponible en cantidades suficientes para analizar los marcadores de resistencia a los antibióticos el día 0 de la prueba. Por el contrario, el método estándar de atención requirió un promedio de 14 días para que los cultivos de MGIT se volvieran positivos antes de que pudiera repetirse la pirosecuenciación en muestras que dieron negativo mediante la PCR en el día 0. El perfil antibiótico de un paciente es crítico para el manejo de casos y la intervención temprana con la terapia antibiótica adecuada disminuirá las tasas de transmisión y aumentará las posibilidades de recuperación. Por lo tanto, la presente invención es valiosa para la identificación rápida, en el mismo día, de MTBC mediante la PCR en tiempo real y lo suficientemente sensible como para detectar marcadores de resistencia a antibióticos para M. tuberculosis, sin esperar a la detección de Micobacterias por cultivo.

Ejemplo 19: Detección de MTB a partir de Muestras de Hisopo de Esputo

Para un control óptimo de la tuberculosis, el diagnóstico temprano es fundamental. Varios investigadores han desarrollado ensayos de la PCR en tiempo real que proporcionan una detección rápida de varias secuencias diana del complejo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) y genes de resistencia a fármacos en muestras de pacientes. La capacidad de estos ensayos para detectar el MTBC en muestras clínicas depende tanto de la secuencia diana seleccionada como de la eficiencia del procedimiento de extracción de ADN. Los ejemplos anteriores han demostrado que la presente invención mejora sustancialmente la extracción de ácidos nucleicos de microorganismos, tal como MTB, mediante el aumento de la sensibilidad de detección de M. tuberculosis en el esputo humano.

En lugar de procesar muestras enteras de esputo, pueden obtenerse mayores eficiencias al extraer ácidos nucleicos directamente de una pequeña fracción de cada muestra en su estado crudo o sin tratar, es decir, antes de la descontaminación con hidróxido de sodio y/o NALC. Este ejemplo demuestra que pueden usarse hisopos disponibles en el mercado para capturar y transferir con éxito pequeñas alícuotas (aproximadamente 100-200 microlitros por hisopo) de esputo no tratado. Combinado con la eficiencia de extracción obtenida con la presente invención, el procesamiento de una pequeña fracción de la muestra completa puede mejorar en gran medida el manejo de la muestra en el laboratorio, así como también el tiempo de diagnóstico.

Materiales y Métodos

Se descongeló una muestra de esputo sin tratar congelada de 3 ml (Tissue Solutions Ltd.) y se le añadió 9 x 107 CFU/ml de MTB H37Ra atenuado (aMTB). Uno a la vez, 8 FLOQ (Copan Diagnostics Inc.; Núm. Cat. 502CS01) y 8 Hydra Flock (Puritan Medical Products Co., LLC; Núm. Cat. 25-3406-H) se sumergieron hisopos en esputo enriquecido con MTBB, se agitaron durante 10 segundos y luego se transfirieron a tubos que contenían 500 pl de tampón BD2 (glicina 50 mM, LiCl 250 mM, Li-CDTA 12,5 mM, 2 % SDS, pH 10,5). Después de 2 horas a temperatura ambiente, se retiraron los hisopos, los tubos se centrifugaron a 3500 g durante 20 minutos y los sedimentos se resuspendieron en 100 pl de PBS. Dos muestras resuspendidas por hisopo se sembraron en placas de agar M7H10 y se incubaron a 35 °C durante 21 días para confirmar la viabilidad de aMTB; se mezclaron seis muestras resuspendidas por hisopo con 100 pl de tampón BD2 antes de la extracción de ácido nucleico con y sin peryodato (ver más abajo).

Extracción de ADN de esputo positivo para aMTB mediante el uso del método de peryodato

1. Se trataron cinco alícuotas de 200 pl (hisopos 1-5; anterior) con NPI hasta una concentración final de 30 mM, se agitaron con agitador vorticial para mezclar; una alícuota de 200 pl (hisopo 6) no se trató con NPI.

2. Se incubaron a 70 °C en baño maría durante 20 minutos.

3. Las alícuotas se enfriaron a temperatura ambiente durante 2 minutos.

4. Se añadió tampón Tris 1 M (pH 7) a una concentración final de 50 mM.

5. Se añadió acetato de potasio 3M (pH 5,5) a una concentración final de 150 mM.

6. Se incubó en hielo durante 10 minutos.

7. Se centrifugó a 13200 rpm durante 5 minutos.

8. Se transfirió el sobrenadante a un tubo limpio. Se desechó el sedimento.

9. Se añadieron 400 pl de etanol al 95 % a temperatura ambiente. Se invirtió 20 veces para mezclar.

10. Se incubaron las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos para precipitar el ADN.

11. Se centrifugó a 15000 rpm durante 2 minutos para sedimentar el ADN.

12. Se retiró con cuidado y se desechó el sobrenadante con cuidado de no perturbar el precipitado.

13. Se disolvió el sedimento en 200 pl de TE. Se agitó brevemente para resuspender completamente el ADN. Condiciones de rtPCR

En este ejemplo, el ADN aislado de muestras de esputo enriquecidas con aMTB (anterior) se sometió a un ensayo de rtPCR específico para Mycobacterium, el ensayo de la PCR en tiempo real RD4 Taqman (ver Ejemplo 10).

Resultados y Conclusiones

El esputo enriquecido con MTB recolectado con hisopos fue viable en cultivo. Después de 21 días de cultivo, la aMTB aislada de los hisopos de Copan produjo una capa de bacterias, mientras que la aMTB aislada de los hisopos de Puritan produjo aproximadamente 200 colonias por placa.

La cantidad de ADN de aMTB recolectada con un solo hisopo de Copan o Puritan se detectó fácilmente mediante el uso de la rtPCR específica para MTB (hisopo 6; ver Tabla 35). Cuando se incluyó peryodato en el protocolo de extracción de ADN (hisopos 1-5; Tabla 35), los valores de Ct disminuyeron en más de 3 ciclos de 27,75 a 24,02 para los hisopos de Copan y de 27,62 a 23,69 para los hisopos de Puritan, lo que corresponde a un aumento de más de 10 veces en la cantidad de ADN específico de aMTB recuperado por hisopo. Además, la rtPCR mediante el uso de ADN puro versus diluido (1:10) demostró la diferencia esperada de 3 ciclos, lo que indica que el ADN extraído contenía pocos o ningún inhibidor de la PCR.

Por lo tanto, sumergir un hisopo en una muestra de esputo sin tratar puede proporcionar una muestra suficiente (100-200 pl) para diagnosticar rápidamente la presencia de M. tuberculosis en especímenes con positividad media a alta. Es importante destacar que la inclusión de peryodato en el protocolo de extracción de ADN aumentó la sensibilidad de esta detección en al menos 10 veces, lo que tiene ramificaciones importantes para las muestras positivas de bajo a medio.

Tabla 35: Análisis de la PCR en tiempo real de ADN aislado de esputo mediante el uso de hisopos y peryodato.

Referencias Adicionales

"Report of an Expert Consultation on the Uses of Nucleic Acid Amplification Tests for the Diagnosis of Tuberculosis," Centers for Disease Control and Prevention.

"Molecular genetic methods for diagnosis and antibiotic resistance detection of mycobacterial from clinical specimens," I.C. Shamputa, L. Rigouts, F. Portaels, APMIS (2004) 112: 728-752.

"Measurement of sputum Mycobacterium tuberculosis messenger RNA as a surrogate for response to chemotherapy" L.E. Desjardin, M.D. Perkins, K. Wolski, S. Haun, L. Teixeira, Y. Chen, J.L. Johnson, J.J. Ellner, R. Dietze, J. Bates, M.D. Cave, K.D. Eisenach (1999) Am J Respir Crit Care Med 160: 203-210.

N.N. Greenwood and A. Earnshaw, Chemistry of the Elements, 2a Edición, Butterworth Heinemann, Oxford, Cap. 17, págs. 872-875 (1998).

Afkhami, T. Madrakian, A.R. Zarei, "Spectrophotometric determination of periodate, iodate and bromate mixtures based on their reaction with iodide, Analytical Sciences (2001) 17: 1199-1202.

Wroblewski D, Hannett GE, Bopp DJ, Dumyati GK, Halse TA, Dumas NB, Musser KS (2009) Rapid molecular characterization of Clostridium difficile and assessment of populations of C. difficile in stool specimens. J Clin Microbiol 47(7): 242-2148.

Halse TA, Escuyer VE, Musser KA (2011) Evaluation of a Single-Tube Multiplex Real-time PCR for the Differentiation of Members of the Mycobacterium tuberculosis Complex in Clinical Specimens. J Clin Microbiol 49(7): 2562-5267.

Halse T A, Edwards J, Cunningham PL, Wolfgang WJ, Dumas NB, Escuyer VE, Musser KA (2010) Combined real-time PCR and rpoB gene pyrosequencing for rapid identification of Mycobacterium tuberculosis and determination of rifampin resistance directly in clinical specimens. J Clin Microbiol 48: 1182-1188.

Corbett EL, Watt C J, Walker N, Maher D, Williams BG, Raviglione MC, Dye C (2003) The growing burden of tuberculosis: global trends and interactions with the HIV epidemic. Arch Intern Med 163: 1009-1021.

Diagnostic Standards and Classification of Tuberculosis in Adults and Children; American Thoracic Society and the Centers for Disease Control and Prevention (2000) Am J Respir Crit Care Med 161: 1376-1395.

Hobby GL, Holman AP, Iseman MD, Jones J (1973) Enumeration of tubercle bacilli in sputum of patients with pulmonary tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother 4: 94-104.

Yeager HJ Jr, Lacy J, Smith L, LeMaistre C (1967) Quantitative studies of mycobacterial populations in sputum and saliva. Am Rev Respir Dis 95: 998-1004.

Ghandi NR, Moll A, Pawinski R, y otros. (agosto de 2006) High prevalence and mortality from extensively-drug resistant (XDR) TB in TB/HIV coinfected patients in rural South Africa. Toronto, Canada: Late Breaker Session, XVI International AIDS Conference, 13-18 [Abstract THLB0210].

Raviglione M (2006) XDR-TB: entering the post-antibiotic era? Int J Tuberc Lung Dis 10(11): 1185-1187.

Davis JL, Huang L, Kovacs JA, Masur H, Murray P, Havlir DV, Worodria WO, Charlebois ED, Srikantiah P, Cattamanchi A, Huber C, Shea YR, Chow Y, Fischer SH (2009) Polymerase chain reaction of secA1 on sputum or oral wash samples for the diagnosis of pulmonary tuberculosis. Clinical Infectious Diseases 48: 725-732.

Yassen G, Noori J, Yas NS (2012) Detection of acid fast bacilli in the saliva of patients having pulmonary tuberculosis. J Bagh College Dentistry 24(3): 59-62.

Anónimo (2009) Updated guidelines for the use of nucleic acid amplification tests in the diagnosis of tuberculosis. ^m M^w R Morb Mortal Wkly Rep 58: 7-10.

Halse TA, Edwards J, Cunningham PL, Wolfgang WJ, Dumas NB, Escuyer VE, Musser KA (2010) Combined real-time PCR and rpoB gene pyrosequencing for rapid identification of Mycobacterium tuberculosis and determination of rifampin resistance directly in clinical specimens. J Clin Microbiol 48(4): 1182-1188.

Halse TA, Escuyer VE, Musser KA (2011) Evaluation of a single-tube multiplex real-time PCR for differentiation of members of the Mycobacterium tuberculosis complex in clinical specimens. J Clin Microbiol 49(7): 2562-2567. Scott II RD (2009) The Direct Medical Costs of Healthcare-associated Infections in U.S. Hospitals and the Benefits of Prevention. Centers for Disease Control and Prevention.

Fawley WN, Wilcox MH (2001) Molecular epidemiology of endemic Clostridium difficile infection. Epidemiology and Infection 126(3): 343-350. ISSN 0950-2688.

Martinez, J.A., Ruthazer, R., Hansjosten, K., Barefoot, L., and Snydman, D.R. (septiembre de 2003). "Role of environmental contamination as a risk factor for acquisition of vancomycin-resistant enterococci in patients treated in a medical intensive care unit." Archives of Internal Medicine Vol. 163(16): 1905-12.

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Uso de una composición para extraer y/o conservar ácido nucleico de un microorganismo o mezcla de microorganismos, en donde la composición comprende un agente oxidante y un tampón, en donde el agente oxidante es ácido peryódico o peryodato, y en donde la composición es una solución acuosa que tiene un pH alcalino.

2. El uso de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una sal de litio, un quelante y un agente desnaturalizante.

3. El uso de la reivindicación 2, en donde la sal de litio es LiCl;

el agente desnaturalizante es: un detergente aniónico, preferentemente dodecilsulfato de sodio (SDS), dodecilsulfato de litio (LDS) o lauroilsulfato de sodio (SLS); un detergente catiónico, preferentemente bromuro de cetiltrimetilamonio, bromuro de cetilpiridinio o cloruro de alquilbencildimetilamonio; o un detergente no iónico, preferentemente Tween, Triton X o Brij;

y el quelante es ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), ácido(2-hidroxietil)etilendiaminotriacético (HEDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido nitrilotriacético (NTA), ácido etilendiaminotriacético (EDTA), ácido ciclohexanodiaminotetraacético (CDTA), N,N-bis(carboximetil)glicina, citrato anhidro, citrato de sodio, citrato de calcio, citrato de amonio, bicitrato de amonio, ácido cítrico, citrato de diamonio, citrato de amonio férrico, citrato de litio y cualquier combinación de estos.

4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la composición tiene un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 10,5.

5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el peryodato comprende metaperyodato, ortoperyodato o una mezcla de estos.

6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el peryodato es peryodato de sodio, peryodato de potasio o peryodato de litio y el tampón es glicina.

7. Un método para extraer ácido nucleico de un microorganismo que comprende mezclar una muestra sospechosa de contener el microorganismo con una composición que comprende un agente oxidante y calentar la mezcla resultante, en donde el agente oxidante es ácido peryódico o peryodato, y en donde la composición es una solución acuosa que tiene un pH alcalino.

8. El método de la reivindicación 7, en donde la composición comprende un tampón tal que la composición tiene un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 10,5.

9. El método de la reivindicación 7 u 8, en donde la mezcla se calienta a una temperatura de aproximadamente 50 °C o mayor, o de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 100 °C, o de aproximadamente 70 °C a aproximadamente 80 °C.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde la mezcla se calienta durante al menos 10 minutos, al menos 15 minutos, al menos 20 minutos, de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 60 minutos, o de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 20 minutos.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde el peryodato comprende metaperyodato, ortoperyodato o una mezcla de estos.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en donde el peryodato es peryodato de sodio, peryodato de potasio o peryodato de litio; y en donde la concentración de peryodato en la mezcla final es de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 300 mM, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM o aproximadamente 15 mM.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, que adicionalmente comprende añadir una sal de litio, preferentemente LiCl, a la muestra.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, que adicionalmente comprende añadir un agente desnaturalizante a la muestra.

15. El método de la reivindicación 14, en donde el agente desnaturalizante es un detergente aniónico, preferentemente dodecilsulfato de sodio (SDS), dodecilsulfato de litio (LDS) o lauroilsulfato de sodio (SLS); un detergente catiónico, preferentemente bromuro de cetiltrimetilamonio, bromuro de cetilpiridinio o cloruro de alquilbencildimetilamonio; o un detergente no iónico, preferentemente Tween, Triton X o Brij.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, en donde el microorganismo es una bacteria o un hongo.

17. El método de la reivindicación 16 en donde la bacteria es Mycobacterium tuberculosis, especies del complejo Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti, Mycobacterium canetti, Mycobacterium caprae, Mycobacterium pinnipedi, Mycobacterium marinum, Mycobacterium leprae, Mycobacterium Lepromatosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium avium-intracellulare, Mycobacterium avium paratuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium gordonae, especies de Bacillus, Bacillus subtilis, Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Toxoplasma gondii, especies de Streptococcus, especies de Staphylococcus, Dientamoeba fragilis, Borrelia burgdorferi y otras especies, especies de Clostridia, Fusobacterium nucleatum, especies de Salmonella, especies de Campylobacter, bacterias Firmicutes, especies de Bartonella, especies de Rickettsia, especies de Yersinia, especies de Francisella, especies de Brucella, especies de Bordetella, especies de Burkholderia, especies de Pseudomonas, especies de Shigella, especies de Chlamydophila, especies de Legionella, especies de Listeria, especies de Corynebacterium, especies de Enterococcus, especies de Escherichia, especies de Haemophilus, especies de Helicobacter, especies de Leptospira, especies de Mycoplasma, especies de Neisseria, especies de Treponema o especies de Vibrio, o en donde el hongo es los géneros Saccharomyces, Candida, Aspergillus, Histoplasma, Pneumocystis, Stachybotrys o Cryptococcus.

18. Uso de un kit para extraer y/o conservar ácido nucleico de un microorganismo o mezcla de microorganismos, en donde el kit comprende (i) una composición para extraer y/o conservar ácido nucleico, en donde la composición es una solución acuosa que comprende peryodato a una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 300 mM y un tampón a un pH alcalino, preferentemente un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 10,5; e (ii) instrucciones de uso.

19. El uso de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la composición comprende además una sal de litio, un agente desnaturalizante y/o un quelante.

20. El uso de acuerdo con la reivindicación 18 o 19, en donde el kit comprende además un recipiente de reactivos y/o un recipiente receptor de muestras, y en donde el recipiente de reactivos y/o el recipiente receptor de muestras incluyen un depósito para recibir la composición y una porción receptora de muestras.