CN112939164B - 海产养殖水体的消毒方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型海产养殖水体的消毒方法，使用UV/PS高级氧化法对含有无乳链球菌的海产养殖水体进行消毒灭活处理。本发明新型海产养殖水体的消毒方法可有效灭活海产养殖水体中的革兰氏阳性菌‑无乳链球菌(S.agalactiae)，且在消毒处理过程不会产生有毒有害物质和二次污染。综上，本发明是一种具有独特优势，且制备技术简易，成本低廉，杀灭微生物速度极快、高效可靠的海产养殖水体消毒方法。

Description

海产养殖水体的消毒方法

技术领域

本发明属于水污染消毒技术领域，尤其涉及一种新型海产养殖水体消毒的方法。

背景技术

海水养殖业是我国沿海地区的传统优势产业，不仅带动了渔区经济社会的发展，也满足了城乡居民膳食营养结构多元化的需求。据统计，2017年中国海水养殖总产量达到2000.70万吨。循环海水养殖系统在每季产品打捞后，对利用过的水进行处理并循环使用，减少了对海水和淡水资源的消耗，已得到了广泛的应用。在循环海水养殖池塘中，海水会带入各种病原菌；另一方面，放养鱼虾以后，经过一段时间的养殖，鱼虾的排泄物、饵料残渣的积蓄，也会使池塘底质和水质恶化，各种病原菌迅速滋生，如鱼类流行范围广、危害大的无乳链球菌等，这些病菌都可引发海产品病害频繁发生，成为制约海水养殖产业的关键因素。因此，每一季海产品出塘后，在对下一批幼苗进行放养之前，除对池塘底泥的清塘消毒外，对养殖水体的消毒也是关系到海水养殖业成败的一项重要工作。

海水养殖清塘及水体消毒常用的药物包括生石灰、高锰酸钾、臭氧及各种含氯消毒剂。其中，生石灰一般用于幼苗放养前的底泥清塘，残留在水体中的高锰酸钾对鱼、虾有中度中毒，一般不应用于此类海产品放养幼苗前及养殖期间的水体消毒。用臭氧对含溴的水体进行消毒时会生成溴酸盐副产物，溴酸盐被国际癌症研究机构定为2B级(具有较高的致癌可能性)潜在致癌物，残留在养殖水体中也会对鱼虾产生危害。因此，含氯消毒剂如漂白粉、次氯酸钠等仍是常用的消毒剂。然而，此类消毒剂在杀死病原菌的同时，难以避免地与水体中其他物质反应生成副产物，称之为消毒副产物(DBPs)。大量研究表明，饮用水消毒过程中产生的三氯甲烷、氯乙酸等DBPs具有三致效应，对人体有极大危害。

高级氧化技术(Advanced Oxidation Technologies，AOT)是利用活性极强的羟基自由基(Hydroxyl Radical，·OH，E₀＝2.5-3.1V)分解水中有害物质的氧化技术。该技术具有广谱杀菌特性，杀灭微生物的速度极快，同时不会产生DBPs和二次污染。近年来，各种高级氧化技术如臭氧催化氧化、光催化氧化等在饮用水消毒处理方面的研究受到了广泛关注。硫酸根自由基(·SO₄ ^-)的氧化还原电位(E₀＝1.9-2.8V)与·OH接近，但与·OH相比，·SO₄ ^-对富含电子基团的生物大分子具有更强的氧化选择性。另有研究证明，·SO₄ ^-的半衰期较·OH 更长，可延长与致病微生物接触时间从而提升消毒效果。·SO₄ ^-通常由活化过硫酸盐(S₂O₈ ^2-，PS)或单过硫酸盐(HSO₅ ^-，PMS)产生。因此，基于PS/PMS活化的新型高级氧化技术在水处理工艺中具有独特的优势，且处理过程中不产生有毒有害的DBPs，是水体消毒领域的一个新的研究方向。

目前，基于·SO₄ ^-的水体消毒研究报道不多，主要针对饮用水及各种废水水体中的细菌进行灭活效果检测及部分机理研究。但该项技术仍有许多尚需深入探讨并解决的问题，如消毒过程中的操作条件控制、微生物的灭活机理、高效且经济的·SO₄ ^-激活方式的选择等。另外，有关·SO₄ ^-在循环海水养殖放养幼苗前的水体消毒中的应用研究及对该水体内各种致病微生物的灭活机理也尚未见报道。而且，海产养殖水比淡水成分复杂得多，其中存在大量各种阴离子，不同物理化学条件对各种病原微生物的影响、同一病原微生物受不同物理化学条件的影响也缺乏研究。因此，UV/PS高级氧化法是否适合处理含病原菌无乳链球菌的海产养殖水不得而知。

因此，开展基于·SO₄ ^-的新型高级氧化消毒技术在海水养殖水体中的应用及机理研究具有重要的理论意义和实用价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种操作简易、安全稳定、杀灭微生物速度快的新型海产养殖水体的消毒方法，该法可以有效杀灭海产养殖水中的无乳链球菌。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

新型海产养殖水体的消毒方法，使用UV/PS(过硫酸盐)高级氧化法对含有无乳链球菌的海产养殖水体进行消毒灭活处理。

无乳链球菌的初始浓度为10⁷CFU/mL。

UV/PS高级氧化法中所使用的过硫酸盐为过硫酸钠(Na₂S₂O₈)。

过硫酸钠的初始浓度为0.05-0.30mmol/L；海产养殖水的pH在5-9；UV/PS高级氧化法中的UV光的光强为10-50uw/cm²。

过硫酸钠的初始浓度为0.1mmol/L。

海产养殖水的温度为20±1℃，pH在8±0.5。

UV/PS高级氧化法中的UV光来自10W 254nm低压汞灯。

海产养殖水体中还含有Cl^-、HCO₃ ^-、SO₄ ^2-、Br^-。

海产养殖水体中含有的Cl^-、HCO₃ ^-、SO₄ ^2-、Br^-的浓度分别为10.489g/L，65.5mg/L，1.35g/L，27.9mg/L。

传统的海产养殖清塘及水体消毒常用生石灰、高锰酸钾、臭氧及各种含氯消毒剂，其制备反应过程复杂，消毒后的海产养殖水体通常含有残留的副产物等有害物质，可能会导致海产品体内发生生物积累，甚至有可能通过食物链传递，影响人类健康。为此，发明人建立了一种新型海产养殖水体的消毒方法，使用UV/PS高级氧化法对含有无乳链球菌的海产养殖水体进行消毒灭活处理。实验中，发明人就不同PS初始浓度、不同水体pH值、不同UV强度参数下消毒过程无乳链球菌的灭活效率进行了研究。结果表明，使用UV/PS高级氧化法在不同条件下对海产养殖水中无乳链球菌具有高效的灭活效果。通过场发射扫描电镜(SEM)观察细胞表面的形态变化，检测细胞内活性氧化物种的水平，对·SO₄ ^-与病原微生物体内遗传物质DNA/RNA的反应机制进行研究。结果表明，经过UV/PS高级氧化法处理过的无乳链球菌表面出现轻微的褶皱和凹陷，且在琼脂糖凝胶电泳显示UV/PS条件下染色体条带不在明显，是由于·SO₄ ^-攻击细胞表面，细胞结构被破坏致使细胞膜发生破裂，细胞壁和细胞膜发生破裂后细胞内的遗传物质释放到溶液中，·SO₄ ^-对其遗传物质进行破坏，进而导致微生物细胞的死亡达到灭活效果。因此，本发明新型海产养殖水体的消毒方法可有效灭活海产养殖水体中的革兰氏阳性菌-无乳链球菌(S.agalactiae)，且在消毒处理过程不会产生有毒有害物质和二次污染。综上，本发明是一种具有独特优势，且制备技术简易，成本低廉，杀灭微生物速度极快、高效可靠的海产养殖水体消毒方法。

附图说明

图1是UV/PS高级氧化法在不同PS初始浓度下灭活海产养殖水体中无乳链球菌的情况，图中：UV固定光强为30uw/cm²，不调节海产养殖水pH值，PS初始浓度在(0.05mmol/L、0.10mmol/L、0.15mmol/L、0.20mmol/L、0.25mmol/L、0.3mmol/L)的范围内UV/PS高级氧化法对海产养殖水中无乳链球菌反应120S内的灭活情况

图2是UV/PS高级氧化法在海产养殖水体不同pH值中灭活无乳链球菌的情况，图中：紫外强度为30uw/cm²，氧化剂PS初始浓度为0.1mmol/L，调节海产养殖水的初始pH分别为5、6、7、8、9，研究不同pH的海产养殖水体中UV/PS高级氧化法对无乳链球菌反应 120S的灭活情况。

图3是UV/PS高级氧化法在不同UV强度下灭活海产养殖水体中无乳链球菌的情况，图中：氧化剂PS初始浓度为0.1mmol/L，不调节海产养殖水pH值，研究不同UV初始强度在UV/PS高级氧化法对海产养殖水中无乳链球菌反应120S的灭活情况。

图4是UV/PS高级氧化法灭活海产养殖水体中无乳链球菌的机理分析情况，图中：a：紫外强度为30uw/cm²，氧化剂PS初始浓度为0.1mmol/L，不调节海产养殖水pH值，无乳链球菌在单独PS(A)、单独UV(B)、UV/PS(C)技术下灭活扫描电镜情况；b：相同条件下，无乳链球菌在单独PS(A)、单独UV(B)、UV/PS(C)技术下灭活琼脂糖凝胶电泳情况；c：相同条件下，无乳链球菌在单独PS、单独UV、UV/PS技术下灭活过氧化氢(CAT) 酶活情况；d：相同条件下，无乳链球菌在单独PS、单独UV、UV/PS技术下灭活超氧物歧化酶(SOD)酶活情况。

具体实施方式

实施例1

将-80℃冰箱中保存的冰冻无乳链球菌种融化以后在BHI固体营养肉汤培养基中进行画线接种，37℃进行活化培养。待单菌落长好后，用接种环挑取接种于5mL BHI液体营养肉汤培养基中，在37℃、转速为300r/分钟的条件下振荡培养至对数增长期，取出1mL 的菌液以4000r/分钟的转速离心5分钟，然后将沉淀重新悬浮于灭菌生理盐水中，重复两次操作，将沉淀菌团溶于100mL灭菌海产养殖水中制备成10⁷CFU/mL悬浮液。

实施例2

配制含有Cl^-、HCO₃ ^-、SO₄ ^2-、Br^-的浓度分别为10.489g/L，65.5mg/L，1.35g/L，27.9mg/L 的人工海产养殖水来模拟真实的海产养殖水，不调节海产养殖水的pH值。分别配制 0.05mmol/L、0.10mmol/L、0.15mmol/L、0.20mmol/L、0.25mmol/L、0.30mmol/L的过硫酸钠溶液，在紫外强度固定为30uw/cm²，打开10W低压汞灯稳定一段时间后，将分别配制好的10⁷CFU/mL的无乳链球菌悬浮液在无菌状态下移取30mL至透光石英反应管中，放入一颗磁力石，分别加入300uL不同浓度的过硫酸钠溶液，将石英反应管放入紫外光稳定的反应器中，反应不同的时间拿出反应管进行取样，将样品在无菌超净工作台中稀释、在对应的固体培养基划线涂布，放入37℃培养箱中倒置培养24小时，取出后运用平板计数法对培养皿中的单菌落进行计数，计算UV/PS在不同PS初始浓度下对无乳链球菌的灭活率。

如图1所示，实验发现，无乳链球菌的灭活速率随着PS浓度的增加而增大，反应时间逐渐增加灭活速率随着增强。这一现象表明在一定范围内，PS初始浓度的增加能够提高海产养殖水中病原微生物的杀灭效果。这主要是由于PS初始浓度的增加，在UV光活化下反应体系中产生了越来越多的·SO₄ ^-，·SO₄ ^-对微生物具有杀灭作用，因而能有效杀灭海产养殖水中的无乳链球菌。

实施例3

与例2相同配制人工海产养殖水，配制浓度为0.1mmol/L的过硫酸钠溶液，分别调节 pH值为5、6、7、8、9的人工海产养殖水，在紫外强度固定为30uw/cm²，打开10W低压汞灯稳定一段时间后，其余反应步骤与实例2相同，计算UV/PS对不同pH值的人工海产养殖水中的无乳链球菌的灭活率。

如图2所示，实验发现，当反应时间相同时，pH为5时无乳链球菌的灭活效率最高，而在pH为9时灭活效率最低，随着pH由9降至5的条件变化下UV/PS对无乳链球菌的灭活效果逐渐增强。在酸性及中性条件下体系中·SO₄ ^-占主导地位，·SO₄ ^-具有更长的半衰期，可延长与致病微生物接触时间从而提升灭活效果。增大pH值可使·SO₄ ^-转化为·OH^-，因此在碱性条件下，以·OH^-为主。碱性条件下·OH^-的电位(1.8V)明显小于酸性条件下·OH^-(2.7V)和·SO₄ ^-(3.1V)的电位，因而导致UV/PS对无乳链球菌的灭活效率降低。

实施例4不同UV强度

与例2相同配制人工海产养殖水，不调节其pH值，配制浓度为0.1mmol/L的过硫酸钠溶液，分别调节UV强度分别为10uw/cm²，20uw/cm²、30uw/cm²、40uw/cm²、50uw/cm²，待UV光强稳定后，其余反应步骤与实例2相同，计算UV/PS对不同pH值的人工海产养殖水中的无乳链球菌的灭活率。

如图3所示，实验发现，在时间相同的情况下，UV的照射强度增强，UV/PS对无乳链球菌的杀灭效率也逐渐增高，UV的强度越大对PS的激活效率越快，产生更多的硫酸根自由基攻击细菌的细胞结构，最终杀灭海产养殖水中的菌体。其中，UV光强为50uw/cm2，反应时间为120S的条件下，无乳链球菌的最高灭活率分别是5.19Log。因此，UV光的强弱对UV/PS处理海产养殖水中的病原微生物具有较大的影响，UV光强越强反应体系对病原微生物的杀灭效果越强，反之，UV光强越弱杀灭效果越弱。

实施例5不同扫描电镜

与例2相同配制人工海产养殖水，不调节其pH值，配制浓度为0.1mmol/L的过硫酸钠溶液，在紫外强度固定为30uw/cm²，打开10W低压汞灯稳定一段时间后，将分别配制好的10⁷CFU/mL的无乳链球菌悬浮液在无菌状态下移取30mL至透光石英反应管中，放入一颗磁力石，分别加入300uL不同浓度的过硫酸钠溶液，将石英反应管放入紫外光稳定的反应器中，反应不同的时间拿出反应管进行取样，离心，弃上清。取菌体。加入约3倍体积的0.1mol/L PBS缓冲液清洗菌体，离心后弃上清。重复三次。加入2.5％新鲜戊二醛悬浮固定24h，PBS清洗三次，放入纸包后进行梯度乙醇脱水，临界点干燥低温冷冻干燥法脱水，通过高分辨场发射扫描电镜观察细胞形态，单独UV、单独PS技术处理作为对照。

如图4(a)所示，实验发现，在UV、UV/PS处理前后的扫描电镜(SEM)图像中显示，空白样中的无乳链球菌细胞表面光滑，形态完整。无乳链球菌细胞在UV光照射下未被破坏，而在UV/PS条件处理下细胞表面出现了轻微的褶皱和凹陷。

实施例6

与例2相同配制人工海产养殖水，不调节其pH值，配制浓度为0.1mmol/L的过硫酸钠溶液，在紫外强度固定为30uw/cm²，打开10W低压汞灯稳定一段时间后，将分别配制好的10⁷CFU/mL的无乳链球菌悬浮液在无菌状态下移取30mL至透光石英反应管中，放入一颗磁力石，分别加入300uL不同浓度的过硫酸钠溶液，将石英反应管放入紫外光稳定的反应器中，反应不同的时间拿出反应管进行取样，以单独UV、单独PS技术处理样品作对照。按照细菌基因组DNA提取试剂盒提取染色体DNA，将配置好的琼脂糖凝胶(0.5g琼脂糖溶解在50mL1×TAE)放入微波炉中加热溶解，冷却至60℃左右，加入5uL核酸荧光染料，混合均匀后倒入制胶板中，待凝胶冷却后凝固，拔出梳子，将其放进电泳池中。将所提取的DNA和核酸染料按5:1混合用移液枪吹打混匀，再取样转移至电泳胶曹中，Marker也等量放入曹中，在100V，1×TAE缓冲液中跑胶30分钟，然后在成像仪中观察。

如图4(b)所示，实验发现，无乳链球菌细胞未被UV光照射的情况下染色体DNA条带清晰，相比之下，在UV、UV/PS的处理下细胞的染色体DNA条带不再清晰，几乎没有。紫外线的照射不是通过破坏细胞壁来灭活微生物而是通过破坏细胞的DNA和RNA的分子结构。·SO₄ ^-是通过破坏微生物的遗传物质来灭活微生物可能的。本研究中在UV/PS处理后无乳链球菌表面出现轻微破损，是由于·SO₄ ^-攻击细胞表面，细胞结构被破坏致使细胞膜发生破裂，细胞壁和细胞膜发生破裂后细胞内的遗传物质释放到溶液中，·SO₄ ^-对其遗传物质进行破坏，进而导致微生物细胞的死亡达到灭活效果。

实施例7

与实例6制备样品相同，按照细菌蛋白提取试剂盒提取活性蛋白，然后分别用总SOD 活性检测试剂盒检测细菌细胞内的SOD酶活性；过氧化氢酶提取试剂盒检测细菌保内过氧化氢酶表达，然后使用酶标仪分别在吸收波长为550nm，405nm测定吸光度。

如图4(c)和图4(d)所示，实验发现，在反应开始的60S，在UV/PS消毒体系中 SOD和CAT的活性随着时间的增加而急剧上升，表明体系中有大量的活性氧化物在攻击大细菌，细菌的氧化应激系统表现出SOD和CAT活性升高清除自由基，以保证细菌活性。这个现象与无乳链球菌的灭活曲线相吻合，在反应开始初期，由于细菌的氧化应激系统SOD 和CAT酶活性表达上升细菌的杀灭效果开始增长缓慢，在细菌酶活的60S之后，SOD和CAT 酶活性的表达都逐渐降低，这说明产生大量的活性氧化物种已经超过细菌应激系统的负荷，造成细菌损伤，进一步降低细胞防御机制，从而使细菌死亡，这也对应在UV/PS体系中从60S-120S反应时间对细菌的杀灭效果达逐渐提升并达到灭活率最大值。在UV消毒体系中SOD和CAT的活性随着时间的增加而缓慢增加，单独PS技术下只有轻微的表达。这也进一步证明在UV/PS高级氧化法中产生了活性氧化物杀灭无乳链球菌。

Claims (9)

1.一种海产养殖水体的消毒方法，其特征在于使用UV/PS高级氧化法对含有无乳链球菌的海产养殖水体进行消毒灭活处理。

2.根据权利要求1所述的海产养殖水体的消毒方法，其特征在于：所述无乳链球菌的初始浓度为10⁷CFU/mL。

3.根据权利要求1所述的海产养殖水体的消毒方法，其特征在于：所述UV/PS高级氧化法中所使用的过硫酸盐为过硫酸钠。

4.根据权利要求3所述的海产养殖水体的消毒方法，其特征在于：所述过硫酸钠的初始浓度为0.05-0.30mmol/L；所述海产养殖水的pH在5-9；所述UV/PS高级氧化法中的UV光的光强为10-50μW/cm²。

5.根据权利要求4所述的海产养殖水体的消毒方法，其特征在于：所述过硫酸钠的初始浓度为0.1mmol/L。

6.根据权利要求4所述的海产养殖水体的消毒方法，其特征在于：所述海产养殖水的温度为20±1℃，pH在8±0.5。

7.根据权利要求4所述的海产养殖水体的消毒方法，其特征在于：所述UV/PS高级氧化法中的UV光来自10W 254nm低压汞灯。

8.根据权利要求1所述的海产养殖水体的消毒方法，其特征在于：所述海产养殖水体中还含有Cl^-、HCO₃ ^-、SO₄ ^2-、Br^-。

9.根据权利要求5所述的海产养殖水体的消毒方法，其特征在于：所述海产养殖水体中含有的Cl^-、HCO₃ ^-、SO₄ ^2-、Br^-的浓度分别为10.489g/L，65.5mg/L，1.35g/L，27.9mg/L。

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