KR20210037983A - 도파민 d1형 수용체의 활성 측정용 적색 형광 단백질 기반 바이오센서 - Google Patents
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Abstract
도파민 D1형 수용체의 활성 측정용 적색 형광 단백질 기반 바이오센서, 이를 이용한 도파민 D1형 수용체의 활성을 측정하는 방법, 및 도파민 D1형 수용체에 결합하는 리간드의 검출 방법을 제공한다.
Description
도파민 수용체의 활성을 측정용 적색 형광 단백질 기반 바이오센서에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 도파민 D1형 수용체의 활성을 선택적으로 민감하게 측정할 수 있는 적색 형광 단백질 기반 바이오센서, 이를 이용한 도파민 D1형 수용체의 활성 측정 방법, 및 도파민 D1형 수용체에 결합하는 리간드의 검출 방법에 관한 것이다.
도파민은 중추신경계, 호르몬계, 심장혈관계에서 매우 중요한 역할을 한다. 도파민은 가장 많이 알려진 카테콜 아민계의 물질로 생체 내 신경계의 신호전달을 조정하는 신경전달 물질 중 하나일 뿐만 아니라 뉴런에 포함된 도파민이 감소하면 파키슨병, 정신분열증 등 심각한 병을 유발하게 된다.
도파민은 뇌신경 세포들간에 어떠한 신호를 전달하기 위해 분비되는 신경전달물질로서, 다섯 가지로 알려진 도파민 수용체(D1형, D2형, D3형, D4형, D5형) 및 그들의 변종을 활성화한다. 도파민의 농도와 전달에 이상이 생기게 되면 많은 신경 질환들이 발생하므로, 도파민 수용체의 활성을 민감하게 측정할 수 있는 장치 또는 방법을 개발할 필요가 있다. 또한, 도파민 수용체의 아형 또는 변종에 따라 체내 작용기작이 상이하므로, 도파민 수용체 아형을 선택적으로 측정할 수 있는 장치 또는 방법을 개발할 필요가 있다.
특허문헌 1은 전도성 고분자에 금 나노입자가 도포된 도파민 검출 화학 센서를 설명한다. 이와 같은, 기존의 센서들은 높은 민감도를 보이지만 도파민 수용체 아형에 따른 선택성을 갖기 어려우며, 특히 생물학적인 분석물질을 측정함에 있어서 어려움이 있었다.
일 양상은 도파민 D1형 수용체의 활성 측정용 적색 형광 단백질 기반 바이오센서를 제공하는 것이다.
다른 일 양상은 도파민 D1형 수용체의 활성을 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 일 양상은 도파민 D1형 수용체에 결합하는 리간드의 검출 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은
도파민 D1형 수용체 유전자, 및 적색 형광 단백질 또는 변형된 적색 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 유전자;
상기 재조합 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터; 또는
상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체;를 포함하는,
도파민 D1형 수용체의 활성 측정용 적색 형광 단백질 기반 바이오센서를 제공한다.
다른 일 양상은
바이오센서를 세포에 도입하는 단계;
바이오센서가 도입된 세포에 대상 시료를 첨가하는 단계; 및
바이오센서에 대상 시료의 첨가에 따른 도파민 D1형 수용체의 활성을 측정하는 단계;를 포함하는, 상기 바이오센서를 이용한 도파민 D1형 수용체의 활성을 측정하는 방법을 제공한다.
다른 일 양상은 바이오센서를 세포에 도입하는 단계;
바이오센서가 도입된 세포에 대상 시료를 첨가하는 단계;
바이오센서에 대상 시료의 첨가에 따른 도파민 D1형 수용체 결합하는 리간드를 검출하는 단계;를 포함하는, 상기 바이오센서를 이용한 도파민 D1형 수용체에 결합하는 리간드의 검출 방법을 제공한다.
일 양상에 따른 적색 형광 단백질 기반 바이오센서는, 도파민 수용체 아형에 따른 선택성을 갖고, 도파민 D1형 수용체의 활성을 높은 정확도와 해상도로 검출할 수 있다. 적색 형광 단백질 기반 바이오센서는 녹색 형광 단백질 기반 바이오 센서와 달리 여기(excitation) 파장과 겹치지 않으므로 도파민 D1형 수용체의 활성을 높은 정확도로 검출할 수 있다.
또한, 상기 적색 형광 단백질 기반 바이오센서와, 다른 파장대의 형광 센서 (예컨대, 녹색 형광 단백질 바이오 센서)와 조합할 경우 도파민 활성을 두 가지 신호의 변화와 상호 작용을 동시에 측정할 수 있다.
일 양상에 따른 도파민 D1형 수용체의 활성을 측정하는 방법은 살아있는 세포에서의 도파민 수용체 D1형의 활성을 민감하게 측정할 수 있다.
다른 일 양상에 따른 도파민 D1형 수용체에 결합하는 리간드의 검출 방법은 도파민 수용체 D1형에 결합하는 리간드, 예컨대 도파민 또는 도파민 효현제를 효과적이고 가역적으로 검출할 수 있다.
도 1(a)는 도파민 D1형 수용체(DRD1)의 활성을 측정하고, 도파민 D1형 수용체에 결합하는 리간드(예컨대 도파민, DA)를 검출하기 위한 적색 형광 바이오센서의 작동 원리와 기작을 나타내는 모식도이다.
도 1(b)는 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 바이오센서를 최적화하기 위해 도입된 링커 펩타이드(연결 아미노산)의 종류 및 위치 변경에 따른 적색 형광 단백질의 변형을 나타내는 모식도이다. LSSxx는 cpRFP의 N-말단에 결합된 류신(L)-세린(S)-세린(S)의 아미노산과, 이것에 결합된 임의의 2개의 아미노산(x)(x)으로 이루어진 링커 펩타이드의 부분을 나타낸다. xxDDL은 cpRFP의 C-말단에 결합된 아스파르트산(D)-아스파르트산(D)-류신(L)의 아미노산과, 이것에 결합된 임의의 2개의 아미노산(x)(x)으로 이루어진 링커 펩타이드의 부분을 나타낸다.도 2는 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 바이오센서를 제작하기 위한 후보군 플라스미드를 제작하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3(a)는 효현제인 도파민(Dopamine)에 대한 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 바이오센서 후보군들의 형광 강도 변화량(F/F0)을 보여주는 그래프이다. x축은 테스트를 진행한 바이오센서 후보군의 번호(Number of Variants)를 나타낸다. 각 번호에 해당하는 바이오센서 후보군들의 형광 강도를 측정하여, 도파민 D1형 수용체 활성 측정에 대한 효과를 평가하였다.
도 3(b)는 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 바이오센서의 후보군들 중 효율이 좋은 3가지 후보들(DRD1 Red 1.1, 1.2, 1.3)을 이용하여 도파민 첨가에 따른 최대 형광 증가 정도 (y축: 정규화한 최대 형광 강도(Normalized Maximum intensity))를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3(c)는 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 바이오센서의 후보군들 중 효율이 좋은 3가지 후보들(DRD1 Red 1.1, 1.2, 1.3)을 이용한 시간별 형광 강도 (y축: 정규화한 형광 강도(Normalized intensity))의 변화를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4(a)는 도 3에 나타난 결과를 바탕으로 선택한 DRD1 Red 1.3 바이오센서에 도파민(Dopamine)을 10 μM 농도로 처리했을 때 활성화되어 형광이 증가 하는 정도를 색으로 표현한 세포 이미지를 나타낸다(좌: 도파민 처리 전, 우: 도파민 처리 후).
도 4(b)는 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 형광 바이오센서에 도파민 D1형 수용체 리간드인 도파민(Dopamine)과, 도파민 D2형 수용체 선택적 리간드인 퀴인피롤(Quinpirole)을 처리했을 때의 시간별 형광 증가 정도 (y축: 정규화 형광 강도(Normalized intensity))를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4(c)는 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 바이오센서에 도파민 D1형 수용체 리간드인 도파민(Dopamine)의 농도를 세포 매질(media) 내 최종 농도 가 100 nM(0.1 μM), 1 μM, 10 μM, 100 μM 이 되도록 첨가한 후 측정한 형광 최대 형광 강도 (y축: 정규화 최대 형광 강도(Normalized maximum intensity))를 나타낸 그래프이다.
도 4(d)는 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 형광센서에 도파민 D1형 수용체 리간드인 도파민(DA)과 DA 저해제(Haloperidol)를 함께 처리했을 때(적색 그래프) 와, 도파민(DA)만을 처리했을 때(청색 그래프)의 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 바이오센서의 형광 강도(y축: 정규화 형광 강도(Normalized intensity))를 시간에 따라 나타낸 그래프이다.
도 5(a)는 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 적색 형광센서(DRD1 Red 1.3)와 비교를 위해 별도 제작된 도파민 수용체 D2형 활성 측정용 녹색 형광센서(GRAB-DA1m)를 이용하여 동시에 형광 이미징을 진행한 결과이다. 먼저 D2 선택적 리간드인 퀴인피롤(Quinpirole)를 처리하고 난 다음에 D1 선택적 리간드인 SKF38393을 순차적으로 처리하여 각각의 형광센서가 각각의 리간드에 선택적으로 반응하여 형광의 증가를 보여준 결과를 나타낸다.
도 5(b)는 도 5(a)에서 설명한 실험에서 리간드를 가하기 이전(Before), D2형 수용체 선택적 리간드인 퀴인피롤(Quinpirole)를 처리하고 5분이 지난 후(+Quinpirole, 5 min), 그리고 D1형 수용체 선택적 리간드인 SKF38393을 처리하고 5분이 지난 후에(+SKF38393, 5 min) 형광 이미징을 진행한 결과이다. 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 적색 형광센서(DRD1 Red 1.3) 또는 D2형 활성 측정용 녹색 형광센서(GRAB-DA1m)를 각각 발현하고 있는 세포의 형광 이미지이다.
도 6은 일 구체예에 따른 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 적색 형광 단백질 기반 바이오센서의 제작에 사용된 아미노산 서열을 나타낸다. 도 6(a)는 도파민 D1형 수용체 아미노산 서열(서열번호 1)을 나타낸다. 도 6(b)는 일 구체예에 따른 변형된 적색 형광 단백질의 아미노산 서열(서열번호 2)을 나타낸다. 도 6(c)는 일 구체예에 따른 시그널 펩타이드의 아미노산 서열(서열번호 3)을 나타낸다. 도 6(d)는 일 구체예에 따른 도파민 D1형 수용체의 아미노산 서열(청색 표시 부분), 변형된 적색 형광 단백질의 아미노산 서열(적색 표시 부분), 및 시그널 펩타이드의 아미노산 서열(황색 표시 부분)을 포함하는 재조합 아미노산 서열(서열번호 4)을 나타낸다. 도 6(e)는 일 구체예에 따른 도파민 D1형 수용체의 cDNA 서열(서열번호 5)을 나타낸다. 도 6(f)는 일 구체예에 따른 cpRFP의 cDNA 서열(서열번호 6)을 나타낸다.
도 1(b)는 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 바이오센서를 최적화하기 위해 도입된 링커 펩타이드(연결 아미노산)의 종류 및 위치 변경에 따른 적색 형광 단백질의 변형을 나타내는 모식도이다. LSSxx는 cpRFP의 N-말단에 결합된 류신(L)-세린(S)-세린(S)의 아미노산과, 이것에 결합된 임의의 2개의 아미노산(x)(x)으로 이루어진 링커 펩타이드의 부분을 나타낸다. xxDDL은 cpRFP의 C-말단에 결합된 아스파르트산(D)-아스파르트산(D)-류신(L)의 아미노산과, 이것에 결합된 임의의 2개의 아미노산(x)(x)으로 이루어진 링커 펩타이드의 부분을 나타낸다.도 2는 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 바이오센서를 제작하기 위한 후보군 플라스미드를 제작하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3(a)는 효현제인 도파민(Dopamine)에 대한 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 바이오센서 후보군들의 형광 강도 변화량(F/F0)을 보여주는 그래프이다. x축은 테스트를 진행한 바이오센서 후보군의 번호(Number of Variants)를 나타낸다. 각 번호에 해당하는 바이오센서 후보군들의 형광 강도를 측정하여, 도파민 D1형 수용체 활성 측정에 대한 효과를 평가하였다.
도 3(b)는 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 바이오센서의 후보군들 중 효율이 좋은 3가지 후보들(DRD1 Red 1.1, 1.2, 1.3)을 이용하여 도파민 첨가에 따른 최대 형광 증가 정도 (y축: 정규화한 최대 형광 강도(Normalized Maximum intensity))를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3(c)는 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 바이오센서의 후보군들 중 효율이 좋은 3가지 후보들(DRD1 Red 1.1, 1.2, 1.3)을 이용한 시간별 형광 강도 (y축: 정규화한 형광 강도(Normalized intensity))의 변화를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4(a)는 도 3에 나타난 결과를 바탕으로 선택한 DRD1 Red 1.3 바이오센서에 도파민(Dopamine)을 10 μM 농도로 처리했을 때 활성화되어 형광이 증가 하는 정도를 색으로 표현한 세포 이미지를 나타낸다(좌: 도파민 처리 전, 우: 도파민 처리 후).
도 4(b)는 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 형광 바이오센서에 도파민 D1형 수용체 리간드인 도파민(Dopamine)과, 도파민 D2형 수용체 선택적 리간드인 퀴인피롤(Quinpirole)을 처리했을 때의 시간별 형광 증가 정도 (y축: 정규화 형광 강도(Normalized intensity))를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4(c)는 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 바이오센서에 도파민 D1형 수용체 리간드인 도파민(Dopamine)의 농도를 세포 매질(media) 내 최종 농도 가 100 nM(0.1 μM), 1 μM, 10 μM, 100 μM 이 되도록 첨가한 후 측정한 형광 최대 형광 강도 (y축: 정규화 최대 형광 강도(Normalized maximum intensity))를 나타낸 그래프이다.
도 4(d)는 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 형광센서에 도파민 D1형 수용체 리간드인 도파민(DA)과 DA 저해제(Haloperidol)를 함께 처리했을 때(적색 그래프) 와, 도파민(DA)만을 처리했을 때(청색 그래프)의 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 바이오센서의 형광 강도(y축: 정규화 형광 강도(Normalized intensity))를 시간에 따라 나타낸 그래프이다.
도 5(a)는 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 적색 형광센서(DRD1 Red 1.3)와 비교를 위해 별도 제작된 도파민 수용체 D2형 활성 측정용 녹색 형광센서(GRAB-DA1m)를 이용하여 동시에 형광 이미징을 진행한 결과이다. 먼저 D2 선택적 리간드인 퀴인피롤(Quinpirole)를 처리하고 난 다음에 D1 선택적 리간드인 SKF38393을 순차적으로 처리하여 각각의 형광센서가 각각의 리간드에 선택적으로 반응하여 형광의 증가를 보여준 결과를 나타낸다.
도 5(b)는 도 5(a)에서 설명한 실험에서 리간드를 가하기 이전(Before), D2형 수용체 선택적 리간드인 퀴인피롤(Quinpirole)를 처리하고 5분이 지난 후(+Quinpirole, 5 min), 그리고 D1형 수용체 선택적 리간드인 SKF38393을 처리하고 5분이 지난 후에(+SKF38393, 5 min) 형광 이미징을 진행한 결과이다. 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 적색 형광센서(DRD1 Red 1.3) 또는 D2형 활성 측정용 녹색 형광센서(GRAB-DA1m)를 각각 발현하고 있는 세포의 형광 이미지이다.
도 6은 일 구체예에 따른 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 적색 형광 단백질 기반 바이오센서의 제작에 사용된 아미노산 서열을 나타낸다. 도 6(a)는 도파민 D1형 수용체 아미노산 서열(서열번호 1)을 나타낸다. 도 6(b)는 일 구체예에 따른 변형된 적색 형광 단백질의 아미노산 서열(서열번호 2)을 나타낸다. 도 6(c)는 일 구체예에 따른 시그널 펩타이드의 아미노산 서열(서열번호 3)을 나타낸다. 도 6(d)는 일 구체예에 따른 도파민 D1형 수용체의 아미노산 서열(청색 표시 부분), 변형된 적색 형광 단백질의 아미노산 서열(적색 표시 부분), 및 시그널 펩타이드의 아미노산 서열(황색 표시 부분)을 포함하는 재조합 아미노산 서열(서열번호 4)을 나타낸다. 도 6(e)는 일 구체예에 따른 도파민 D1형 수용체의 cDNA 서열(서열번호 5)을 나타낸다. 도 6(f)는 일 구체예에 따른 cpRFP의 cDNA 서열(서열번호 6)을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 이하 기술된 과정은 본 발명에 따른 하나의 예시에 불과하며, 본 발명에서는 각 단계 중 일부가 생략되거나, 혹은 반복해서 수행될 수 있으며, 경우에 따라서는 각 단계의 순서가 적절히 변경될 수도 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 수치는 명시하지 않아도 "약"의 의미를 포함하는 것으로 간주한다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.
일 양상은
도파민 D1형 수용체 유전자, 및 적색 형광 단백질 또는 변형된 적색 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 유전자;
상기 재조합 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터; 또는
상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체;를 포함하는,
도파민 D1형 수용체의 활성 측정용 적색 형광 단백질 기반 바이오센서를 제공한다.
도 1(a)는 도파민 D1형 수용체(DRD1)의 활성을 측정하고, 도파민 D1형 수용체에 결합하는 리간드(예컨대 도파민, DA)를 검출하기 위한 적색 형광 바이오센서의 작동 원리와 기작을 나타내는 모식도이다.
본 명세서에서 “도파민(dopamine, DA 또는 3,4-dihydroxyphenethylamine, C8H11NO2)”은 카테콜아민 계열의 유기 화합물로, 다양한 동물들의 중추 신경계에서 발견되는 호르몬이나 신경전달물질을 말한다. 도파민은 뇌신경 세포들간에 어떠한 신호를 전달하기 위해 분비되는 신경전달물질 중에 하나이며, 도파민 수용체를 활성화한다.
본 명세서에서 “도파민 수용체”는 G 단백질 결합 수용체(G-protein coupled receptor: GPCR)의 일종이며, 다섯 가지 아형(D1형, D2형, D3형, D4형, D5형)이 알려져 있다. 상기 도파민 수용체의 아형은 다시, D1 유사 (D1-like) 수용체 (D1 또는 D5), D2 유사 (D2-like) 수용체(D2, D3, D4)로 분류할 수 있다. 각 수용체들은 도파민과의 친밀도, G 단백질과의 결합, 신호방법, 특정 신경세포의 분포 등에서 특유성을 가진다. 예를 들어, D1 유사 수용체의 경우, G 단백질 중 Gαs의 분리를 통한 cAMP 경로로 신호를 전달하는데 반해, D2 유사 수용체의 경우, Gαi의 분리를 통해 AC(adenylate cyclase)의 활성을 억제하여 cAMP 레벨을 낮추는 결과를 얻을 수 있다.
일 구체예에서, 도파민 수용체는 도파민 수용체 D1형일 수 있다. 다른 일 구체예에서, 도파민 D1형 수용체 유전자는 서열번호 1에 기재된 아미노산을 코딩하는 것일 수 있다(도 6(a)).
본 명세서에서 “형광 단백질”은 빛에 노출된 경우 형광하는 성질을 가진 단백질을 말한다. 이러한 형광 단백질의 예로는 적색 형광 단백질(RFP), 증강된 적색 형광 단백질(ERFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 청록색(남색) 형광 단백질(CFP), 및 증강된 청록색 형광 단백질(ECFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescent protein; EGFP) 등이 있다.
일 구체예에서, 형광 단백질은 적색 형광 단백질 또는 변형된 적색 형광 단백질일 수 있다. 일 구체예에서, 적색 형광 단백질은 원순열(Circular Permutation) 변이된 적색 형광 단백질(cpRFP)일 수 있다.
본 명세서에서 “원순열(Circular permutation)”은 어느 단백질 내부에 새로운 N 말단과 C 말단을 제작하고(즉 상기 단백질을 내부에서 2분한다), 본래 단백질의 C 말단과 N 말단은 적당한 링커 서열에 의해 연결하여 변이시킨 것을 말한다.
일 구체예에서, 형광 단백질에 원순열 변이를 일으킴으로써, 파장 특성(예컨대 흡수 파장 및/또는 형광 파장)을 변화시킬 수 있다. 일 구체예에 따른 원순열 변이된 형광 단백질에서는, 형광에 필수적인 발색단(chromophore)에 가까운 곳에 새로운 N-과 C-말단을 만들고, 그 곳에 임의의 단백질 x와 y를 결합하여 그 상호작용에 따라 형광의 세기가 민감하게 변하도록 디자인하였고, 이를 기초로 바이오 센서를 개발하였다.
도 1(b)는 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 바이오센서를 최적화하기 위해 도입된 링커 펩타이드(연결 아미노산)의 종류 및 위치 변경에 따른 적색 형광 단백질의 변형을 나타내는 모식도이다. LSSxx는 cpRFP의 N-말단에 결합된 류신(L)-세린(S)-세린(S)의 아미노산과, 이것에 결합된 임의의 2개의 아미노산(x)(x)으로 이루어진 링커 펩타이드의 부분을 나타낸다. xxDDL은 cpRFP의 C-말단에 결합된 아스파르트산(D)-아스파르트산(D)-류신(L)의 아미노산과, 이것에 결합된 임의의 2개의 아미노산(x)(x)으로 이루어진 링커 펩타이드의 부분을 나타낸다.
일 구체예에서, 변형된 적색 형광 단백질을 코딩하는 유전자는 하기 식 1에 따른 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 것일 수 있다.
[식 1]
L1-cpRFP-L2
식 1에서, L1은 cpRFP의 N-말단에 LSS 및 1 내지 5개의 아미노산 잔기를 갖는 링커 펩타이드를 포함한다. L2는 cpRFP의 C-말단에 1 내지 5개의 아미노산 잔기와 DDL을 갖는 링커 펩타이드를 포함한다. 상기 아미노산 잔기는 각각 독립적으로 선택되는 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. 상기 아미노산 잔기는 자연발생적인 아미노산으로부터 선택되는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 식 1에서, L1은 cpRFP의 N-말단에 LSS 및 각각 독립적인 임의의 2개의 아미노산 잔기를 갖는 링커 펩타이드를 포함한다. L2는 cpRFP의 C-말단에 각각 독립적인 임의의 2개의 아미노산 잔기와 DDL을 갖는 링커 펩타이드를 포함한다.
일 구체예에서, L1은 LSSX1X2를 포함하고, L2는 X3X4DDL를 포함하고, 여기서 X1, X2, X3, X4는 각각 독립적인 임의의 아미노산일 수 있다. 예컨대 상기 X1, X2, X3, X4는 알라닌(A), 시스테인(C), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 글라이신(G), 히스티딘(H), 아이소류신(I), 라이신(K), 류신(L), 메티오닌(M), 아스파라긴(N), 피롤라이신(O), 프롤린(P), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 세린(S), 트레오닌(T), 셀레노시스테인(U), 발린(V), 트립토판(W), 및 타이로신(Y)으로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택되는 어느 하나의 아미노산일 수 있다.
일 구체예에서, X1X2는 글루탐산-아르기닌(ER), 글루타민-아르기닌(QR), 및 아르기닌-아르기닌(RR)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고, X3X4는 타이로신-아스파르트산(YD), 트레오닌-세린(TS), 및 히스티딘-프롤린(HP)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 구체예에서, X1X2는 글루탐산-아르기닌(ER)이고, X3X4는 타이로신-아스파르트산(YD)일 수 있다. 일 구체예에 따른 바이오센서는 “LSS-ER -cpRFP-YD-DDL" 서열을 포함할 수 있다.
상기 치환된 서열의 cpRFP을 포함하는 D1형 수용체 바이오센서는 도파민 D1형 수용체에 결합하는 리간드에 반응하여 높은 형광 강도를 보이며, 도파민 D1형 수용체의 활성 측정 효과가 우수하다.
일 구체예에서, 변형된 적색 형광 단백질 유전자는 서열번호 2에 기재된 아미노선 서열을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다(도 6(b)).
G 단백질 결합 수용체(GPCR)가 리간드에 의해 활성화 되었을 때 가장 많은 구조적 변화가 있는 곳이 세포내 세 번째 루프(Intracellular loop 3: ICL3)라고 알려져 있다. 일 구체예에서, 적색 형광 단백질 또는 변형된 적색 형광 단백질의 아미노산 서열은 도파민 D1형 수용체의 세포내 세 번째 루프(Intracellular loop 3: ICL3) 부분에 결합될 수 있다.
일 구체예에서, 적색 형광 단백질 또는 변형된 적색 형광 단백질의 아미노산 서열은 도파민 D1형 수용체의 ICL3의 N-말단으로부터 1번째 내지 54번째 아미노산 중 어느 하나의 바로 뒤에 결합되는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 적색 형광 단백질 또는 변형된 적색 형광 단백질의 아미노산 서열은 도파민 D1형 수용체의 ICL3의 N-말단으로부터 9번째 아미노산 바로 뒤에 결합되는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 도파민 D1형 수용체 유전자는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열의 120 내지 140번째 아미노산 중 어느 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열을 코딩하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 도파민 D1형 수용체 유전자는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열의 129번째 아미노산인 페닐알라닌(F)이 알라닌(A)으로 치환된 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 1에서 129번째 아미노산이 알라닌(A)으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 D1형 수용체 바이오센서는 도파민 D1형 수용체에 결합하는 리간드에 반응하여 높은 형광 강도를 보이며, 도파민 D1형 수용체의 활성 측정 효과가 매우 우수하다.
일 구체예에 따른 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 형광 바이오센서는 0.1 μM, 1 μM, 10 μM, 100 μM 농도의 도파민 수용체 리간드에 대한 활성 측정이 가능하다. 일 구체예에 따른 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 형광 바이오센서는 바이오센서는 10 μM 이상의 농도를 갖는 도파민 수용체 리간드를 효과적으로 검출할 수 있다.
일 구체예에서, 재조합 유전자는 시그널 펩타이드를 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 시그널 펩타이드는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다(도 6(c)).
일 구체예에서, 상기 재조합 유전자는 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다(도 6(d)).
도 2는 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 바이오센서를 제작하기 위한 후보군 플라스미드를 제작하는 과정을 나타낸 모식도이다. 도파민 D1형 수용체의 ICL3에 cpRFP의 유전자 서열을 넣기 위해 cpRFP를 기준으로 cpRFP의 N-말단에 연결된 LSS의 뒤와, cpRFP의 C-말단에 연결된 DDL의 앞에 각각 독립적인 임의의 2개의 연결 아미노산을 첨가하였다. 상기 cpRFP의 바로 앞과 뒤의 각각 두 개씩의 아미노산을 무작위 돌연변이(random mutation)를 유발시켜서 도파민 D1형 수용체 바이오센서 후보군 플라스미드를 제작하였다 (도 2).
다른 일 양상은
바이오센서를 세포에 도입하는 단계;
바이오센서가 도입된 세포에 대상 시료를 첨가하는 단계; 및
바이오센서에 대상 시료의 첨가에 따른 도파민 D1형 수용체의 활성을 측정하는 단계;를 포함하는, 상기 적색 형광 단백질 기반 바이오센서를 이용한 도파민 D1형 수용체의 활성을 측정하는 방법을 제공한다.
다른 일 양상은 바이오센서를 세포에 도입하는 단계;
바이오센서가 도입된 세포에 대상 시료를 첨가하는 단계;
바이오센서에 대상 시료의 첨가에 따른 도파민 D1형 수용체 결합하는 리간드를 검출하는 단계;를 포함하는, 상기 적색 형광 단백질 기반 바이오센서를 이용한 도파민 D1형 수용체에 결합하는 리간드의 검출 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 적색 형광 단백질 기반 바이오센서를 이용한 도파민 또는 도파민 효현제의 검출 방법을 제공한다.
본 명세서에서 "유전자"는 단백질 코딩 또는 전사 시에 또는 다른 유전자 발현의 조절 시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 "단백질"은 또한 기준 단백질과 본질적으로 동일한 생물 활성 또는 기능을 보유하는, 단백질의 단편, 유사체 및 유도체를 포함하는 것이다.
본 명세서에서 "형질주입, 형질감염(transfection)"은 세포외부 DNA가, 수반물질이 있고 없는 상태로 숙주 세포로 들어가는 과정을 말한다. 형질감염된 세포 외부 DNA가 세포 내로 도입되어 세포 외부 DNA를 가지고 있는 세포를 가리킨다. DNA는 세포로 도입되어 핵산이 염색체에 삽입되거나 혹은 염색체 외 물질로 복제될 수 있다.
본 명세서에서 "형질도입(transduction)”은 어떤 세균의 DNA가 바이러스를 통해서 다른 세균으로 옮겨가는 현상이다. 바이러스 벡터를 통해 외부 DNA가 다른 세포에 도입되는 경우에도 형질도입이라고 하는데, 이 방법은 분자생물학자들이 외부 유전자를 숙주세포의 게놈에 도입할 때 흔히 사용된다.
본 명세서에서 “형질전환(transformation)”은 원래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 유전자가 있는 DNA사슬 조각 또는 플라스미드가 세포들 사이에 침투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합, 세포의 유전형질이 변화되는 분자생물학적 현상을 말한다. 외부 DNA 등이 도입된 세포 등을 '형질전환체'라고 한다.
본 명세서에서 "벡터" 라는 용어는 숙주 세포에 삽입되어 숙주 세포 게놈과 재조합되고 이에 삽입되거나, 또는 에피좀으로서 자발적으로 복제하는 컴피턴트 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산을 의미한다. 이러한 벡터로는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등이 있다.
본 명세서에서 "약 (about)", 또는 대략 (approximately)" 등의 표현은 언급하는 값이 어느 정도 변할 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 상기 값은 10%, 5%, 2%, 또는 1%로 변할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "가진다", "가질 수 있다", "포함한다", 또는 "포함할 수 있다" 등의 표현은 해당 특징(예: 수치, 또는 성분 등의 구성요소)의 존재를 가리키며, 추가적인 특징의 존재를 배제하지 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어 "포함하는" 및 용어 "포함하는"의 형태는 임의의 변형 또는 부가를 배제하도록 본 발명을 제한하지 않는다. "포함하는"이라는 용어로 기술되었지만, 본 명세서에 기재된 방법, 물질 및 조성물은 "본질적으로 이루어진" 또는 "이루어진"으로 기술될 수도 있다. 본 명세서에서, 특별히 문맥상 지시된 것이 아니라면 단수형은 복수형도 또한 포함한다.
[실시예]
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 사용된 용어 "내지"는 범위의 종점 및 이들 사이의 모든 중간점을 포함한다. 이 기술분야의 기술자는 수치적 양의 편차가 가능하다는 것을 이해할 것이다. 그러므로, 명세서 또는 청구의 범위에서 수치가 언급될 때마다, 그러한 수치 또는 대략 이러한 수치에 관한 부가적인 값 또한 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 이해된다.
실시예 1. 도파민 D1형 수용체의 활성 측정용 적색 형광 단백질 기반 바이오센서의 제작
(1) 유전자 재조합 플라스미드 제작
PCR을 하여 증폭시킨 사람 도파민 D1형 수용체의 cDNA를 확보하였다(사람 도파민 D1형 수용체의 cDNA, 서열번호 5). 상기 사람 도파민 D1형 수용체의 유전자는 서열번호 1에 기재된 아미노산을 코딩한다. 얻어진 증폭된 도파민 D1형 수용체의 cDNA를 Cla1/Xho1 제한효소로 자른 pcDNA3.1 플라스미드 벡터에 인퓨젼(infusion) 기술을 이용하여 융합시켰다.
또한, 원순열 변이된 적색 형광 단백질인 cpRFP의 cDNA를 PCR을 이용하여 증폭시켰다(cpRFP의 cDNA, 서열번호 6).
도파민 D1형 수용체 활성 측정용 바이오센서의 최적화를 위해 증폭된 cpRFP을 도파민 수용체 D1형의 세포 내 3번째 루프인 ICL3의 특정 위치(ICL3의 N-말단으로부터 9번째 아미노산 바로 뒤에 결합)에 끼워 넣은 유전자 재조합 플라스미드를 준비하였다(도 1(b)).
도파민 D1형 수용체의 ICL3에 cpRFP의 유전자 서열을 넣기 위해 cpRFP를 기준으로 앞과 뒤에 5개의 링커 펩타이드(연결 아미노산)을 첨가하여, LSSPV-cpRFP-TDDDL이 되도록 도입하였다.
(2) 무작위 돌연변이 유발 및 형질 감염
cpRFP의 N-말단과 C-말단에 각각 결합된 링커 펩타이드를 포함하는 재조합 아미노산 서열(LSSXaXb-cpRFP-XcXdDDL)에서 cpRFP의 바로 앞과 뒤의 각각 두 개씩의 아미노산을 무작위 돌연변이(random mutation)를 유발시켜서 도파민 D1형 수용체 바이오센서 후보군 플라스미드를 제작하였다 (도 2).
링커 펩타이드의 배열에 따라 센서의 밝기 변화량이 달라지는 cpRFP 기반 바이오센서의 원리를 이용하여 다양한 유전자 재조합 도파민 D1형 수용체 플라스미드를 제작하였다. cpRFP의 N-말단과 C-말단에 각각 결합된 링커 펩타이드(LSSXaXb 및 XcXdDDL)에서 cpRFP의 바로 앞과 뒤에서 각각 두 개씩(XaXb 및 XcXd)의 아미노산에 무작위 돌연변이를 유발하여서, XaXb는 글루탐산-아르기닌(ER)로 치환하였고, XcXd는 타이로신-아스파르트산(YD)으로 치환하였다.
(3) 도파민 D1형 수용체 바이오센서 후보군 플라스미드의 선별 및 세포 배양
컴피턴트 세포(competent cell)로 대장균(Escherichia coli)에 형질도입 후 클로닝을 통해 많은 양의 유전자 재조합된 플라스미드를 확보하였다. 이어서, 분리 정제 후 시퀀싱을 통해 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 센서의 플라스미드를 확보하였다.
상기 플라스미드를 동물세포 HEK293A로 형질 감염시키고, 세포를 배양하였다. HEK293A 세포주를 세포배양 접시에 동일한 밀도로 접종하고, 37℃의 온도 및 5% CO2에서 약 16 시간 동안 배양하였다. 그 후, 리포펙타민 (Lipofectamine) 2000 2㎕와 제조된 도파민 D1형 수용체 바이오센서 (1㎍)를 Opti-MEM 배지 (ThermoFisher Scientific)에 20 분간 안정화 시킨 뒤에 계대 배양된 세포에 가하였다.
형질주입(transfection) 6시간 이후, 세포를 피브로넥틴(fibronectin)으로 코팅 되어있는 소형 공초점 접시(mini-confocal dish)에 계대 배양하였으며, 10%(v/v) 우태아혈청(fetal bovine serum: FBS) (Hyclone, SH30084.03) 및 0.5% 페니실린/스트렙토마이신(Corning, 30-002-Cl)을 함유한 DMEM 배지(Hyclone, SH30604.01)에 가하고 밤새 배양하였다. 다음 날, 라이브 형광 현미경으로 관찰하였다. 라이브 형광 현미경을 통해 도파민 수용체 D1형 활성 측정용 바이오센서로 형질주입(transfection) 된 단일 세포 HEK293A를 확인할 수 있었다.
도파민 D1형 수용체의 활성 측정을 위해서는 도파민 D1형 수용체 바이오센서가 동물세포 HEK293A의 세포막에 위치해야 하므로, 형광현미경을 통해 동물세포 HEK293A의 세포막에 위치하는지 확인하였다. 또한, 링커 펩타이드의 배열에 따라 센서의 밝기 변화량이 달라지는 cpRFP 기반 바이오센서의 원리를 이용하여 도파민을 배지에 처리한 후 형광현미경을 통해 발현 효율이 좋은 센서 후보군들을 이미징하였다.
(4) 도파민 D1형 수용체 바이오센서를 이용한 도파민 D1형 수용체 활성 측정
제조된 도파민 D1형 수용체 바이오센서에 도파민 수용체 D1형의
리간드(효현제)를 처리하고, 처리 전후의 형광 강도를 실시간으로 측정하여 강도 변화량을 측정하였다.
먼저, 도파민 D1형수용체의
리간드인
도파민(Dopamine)을 최종 농도가 10 μM이 되도록 만들어 놓은 시스템에 첨가하였다. 광퇴색(photobleaching) 현상을 최대한 줄이기 위해 라이브 형광 현미경을 세팅하였다. 라이브 형광 현미경에서 560nm의 빛 파장으로 자극하였을 때 cpRFP의 형광 파장인 610nm에서의 강도(intensity)를 측정하였다.
실험에 적절한 형광 강도를 내기 위해 50 msec 노출값과 ND16 강도를 유지를 하였다. 형광 빛을 주는 주기는 형광 현미경을 통해 cpRFP의 이미지들을 1분 간, 총 10분 동안 측정하였다.
저장해 놓은 이미지들을 NIS 프로그램(Nikon)을 통해 분석하였다. NIS 프로그램에서 관심 지역(regions of interest: ROI)의 단일 세포 전체의 cpRFP 형광 강도를 분석하였다. 해당하는 형광 강도의 변화는 단일 세포 내 도파민 D1형 수용체의 활성 측정용 바이오센서의 효율을 의미한다. 시간에 따른 형광 강도 변화를 확보한 후, 리간드 도파민(Dopamine) 첨가 전 형광 강도를 평균하여 Fo로 지정하고, 시간에 따른 형광 강도 변화를 F로 지정 후, F/Fo의 데이터를 만들어 정규화시켰다.
도 3(a)는 효현제인 도파민(Dopamine)에 대한 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 바이오센서 후보군들의 형광 강도 변화량(F/F0)을 보여주는 그래프이다. x축은 테스트를 진행한 바이오센서 후보군의 번호(Number of Variants)를 나타낸다. 각 번호에 해당하는 바이오센서 후보군들의 형광 강도를 측정하여, 도파민 D1형 수용체 활성 측정에 대한 효과를 평가하였다. 도 3(b)는 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 바이오센서의 후보군들 중 효율이 좋은 3가지 후보들(DRD1 Red 1.1, 1.2, 1.3)을 이용하여 도파민 10 μM 첨가에 따른 최대 형광 증가 정도 (y축: 정규화 최대 형광 강도(Normalized Maximum intensity))를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
DRD1 Red 1.1은 도파민 D1형 수용체 유전자와 본래의 적색 형광 단백질을 이용하여 클로닝하여 제조한 프로토타입(prototype) 센서를 나타낸다. DRD1 Red 1.2와 DRD1 Red 1.3은 도 2에서와 같이, cpRFP의 바로 앞과 뒤의 각각 두 개씩의 아미노산을 무작위 돌연변이(random mutation)를 유발시켜서 제작한 도파민 D1형 수용체 바이오센서 후보군 플라스미드를 이용하여 바이오 센서의 효과 측정 시 높은 형광 강도를 보인 2 가지 후보군을 나타낸다. DRD1 Red 1.2와 DRD1 Red 1.3은 공통적으로 cpRFP의 N-말단과 C-말단에 각각 결합된 링커 펩타이드(LSSXaXb 및 XcXdDDL)에서 cpRFP의 바로 앞과 뒤에서 두 개씩 아미노산을 각각 글루탐산-아르기닌(ER)과, 타이로신-아스파르트산(YD)으로 치환한, "LSS-ER -cpRFP-YD-DDL" 서열을 포함한다. 도 3(b) 및 도 3(c)에서와 같이, DRD1 Red 1.2 및 DRD1 Red 1.3은 DRD1 Red 1.1 보다 높은 형광 강도를 보이며, 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 적색 형광센서로서 우수하다.
DRD1 Red 1.3은, DRD1 Red 1.2에서 도파민 D1형 수용체의 아미노산 서열(서열번호 1)의 129번째 아미노산인 페닐알라닌(F)을 알라닌(A)으로 치환한 서열을 포함한다.
도 3(b) 및 도 3(c)에서와 같이, DRD1 Red 1.3은 가장 높은 형광 강도를 보이며, 도파민 D1형 수용체의 활성 측정을 위해, 가장 효과적인 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 적색 형광센서임을 알 수 있다.
도 3(c)는 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 바이오센서의 후보군들 중 효율이 좋은 3가지 후보들(DRD1 Red 1.1, 1.2, 1.3)을 이용한 시간별 형광 강도 (y축: 정규화 형광 강도(Normalized intensity))의 변화를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3(c)에서와 같이, 실시간 형광 밝기 변화량을 측정한 결과, 변이(Mutation)가 진행되고 더 많은 후보군을 테스트하여 형광 변화량의 증가가 커지고, 반응속도 또한 빨라지는 후보를 선별할 수 있었다.
실시예 2. 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 적색 형광 바이오센서의 특징 분석
실시예 1에서 제작한 도파민 D1형 수용체 적색 형광 바이오센서를 실시예 1에서와 같이 HEK293A 세포주에 형질주입시킨 뒤 발현시키고, 라이브 형광 현미경을 통해 도파민 D1형 수용체 바이오센서가 HEK293A 세포 막에 발현되어 있는 상태를 확인하였다.
도 4(a)는 도파민 D1형 수용체 리간드인 도파민(Dopamine)을 10 μM 농도로 처리했을 때 바이오센서가 활성화되는 정도를 색으로 표현한 세포 이미지를 나타낸다(좌: 도파민 처리 전, 우: 도파민 처리 후).
도 4(b)는 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 형광 바이오센서에 도파민 D1형 수용체 효현제인 도파민(Dopamine)과, 도파민 2 수용체 선택적 리간드인 퀴인피롤(Quinpirole)을 처리했을 때의 표준화 강도(Normalized intensity)를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 4(b)에서는 도파민 D1형 수용체 형광 바이오센서가 도파민 D2형 수용체 선택적 리간드인 퀴인피롤(Quinpirole)에는 반응하지 않음을 보여준다.
도 4(c)는 도파민 D1형 수용체 리간드인 도파민(Dopamine)의 농도를 세포 매질(media) 내 최종 농도 가 100 nM(0.1 μM), 1 μM, 10 μM, 100 μM 이 되도록 첨가한 후 측정한 도파민 D1형 수용체활성 측정용 바이오센서의 형광 강도(y축: 표준화 강도(Normalized intensity)를 나타낸 그래프이다. 실시예 1에서 실시한 NIS 프로그램(Nikon)을 통해서 ROI를 지정한 red channel의 강도를 측정하고 분석하였다.
도 4(c)에서와 같이, 일 구체예에 따른 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 형광 바이오센서는 0.1 μM, 1 μM, 10 μM, 100 μM 농도의 도파민 수용체 리간드에 대한 활성 측정이 가능하다. 또한, 상기 바이오센서는 10 μM 이상의 농도를 갖는 도파민 수용체 리간드를 효과적으로 검출할 수 있다.
도 4(d)는 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 형광 바이오센서에 도파민 D1형 수용체 리간드인 도파민(DA)와 저해제(Haloperidol)를 함께 처리했을 때와(적색 그래프), 도파민(DA)만을 처리했을 때(청색 그래프)의 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 바이오센서의 형광 강도(y축: 표준화 강도(Normalized intensity)를 시간에 따라 나타낸 그래프이다.
도 5(a)는 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 적색 형광센서(DRD1 Red 1.3)와 비교를 위해 별도 제작된 도파민 수용체 D2형 활성 측정용 녹색 형광센서(GRAB-DA1m) 를 이용하여 동시에 형광 이미징을 진행한 결과이다. 먼저 D2 선택적 리간드인 퀴인피롤(Quinpirole)를 처리하고 난 다음에 D1 선택적 리간드인 SKF38393을 순차적으로 처리하여 각각의 형광센서가 각각의 리간드에 선택적으로 반응하여 형광의 증가를 보여준 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5(b)는 도 5(a)에서 설명한 실험에서 리간드를 가하기 이전(Before), D2 선택적 리간드인 퀴인피롤(Quinpirole)를 처리하고 5분이 지난 후(+Quinpirole, 5 min), 그리고 D1 선택적 리간드인 SKF38393을 처리하고 5분이 지난 후에(+SKF38393, 5 min) 형광 이미징을 진행한 결과이다. 도파민 D1형 수용체 활성 측정용 적색 형광센서(DRD1 Red 1.3) 또는 D2형 활성 측정용 녹색 형광센서(GRAB-DA1m)를 각각 발현하고 있는 세포의 형광 이미지이다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 상기 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
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<120> Red fluorescent protein-based dopamine biosensor for detection of
activity of dopamine receptor D1
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The amino acid sequence of dopamine receptor D1 type
<400> 1
Met Arg Thr Leu Asn Thr Ser Ala Met Asp Gly Thr Gly Leu Val Val
1 5 10 15
Glu Arg Asp Phe Ser Val Arg Ile Leu Thr Ala Cys Phe Leu Ser Leu
20 25 30
Leu Ile Leu Ser Thr Leu Leu Gly Asn Thr Leu Val Cys Ala Ala Val
35 40 45
Ile Arg Phe Arg His Leu Arg Ser Lys Val Thr Asn Phe Phe Val Ile
50 55 60
Ser Leu Ala Val Ser Asp Leu Leu Val Ala Val Leu Val Met Pro Trp
65 70 75 80
Lys Ala Val Ala Glu Ile Ala Gly Phe Trp Pro Phe Gly Ser Phe Cys
85 90 95
Asn Ile Trp Val Ala Phe Asp Ile Met Cys Ser Thr Ala Ser Ile Leu
100 105 110
Asn Leu Cys Val Ile Ser Val Asp Arg Tyr Trp Ala Ile Ser Ser Pro
115 120 125
Phe Arg Tyr Glu Arg Lys Met Thr Pro Lys Ala Ala Phe Ile Leu Ile
130 135 140
Ser Val Ala Trp Thr Leu Ser Val Leu Ile Ser Phe Ile Pro Val Gln
145 150 155 160
Leu Ser Trp His Lys Ala Lys Pro Thr Ser Pro Ser Asp Gly Asn Ala
165 170 175
Thr Ser Leu Ala Glu Thr Ile Asp Asn Cys Asp Ser Ser Leu Ser Arg
180 185 190
Thr Tyr Ala Ile Ser Ser Ser Val Ile Ser Phe Tyr Ile Pro Val Ala
195 200 205
Ile Met Ile Val Thr Tyr Thr Arg Ile Tyr Arg Ile Ala Gln Lys Gln
210 215 220
Ile Arg Arg Ile Ala Ala Leu Glu Arg Ala Ala Val His Ala Lys Asn
225 230 235 240
Cys Gln Thr Thr Thr Gly Asn Gly Lys Pro Val Glu Cys Ser Gln Pro
245 250 255
Glu Ser Ser Phe Lys Met Ser Phe Lys Arg Glu Thr Lys Val Leu Lys
260 265 270
Thr Leu Ser Val Ile Met Gly Val Phe Val Cys Cys Trp Leu Pro Phe
275 280 285
Phe Ile Leu Asn Cys Ile Leu Pro Phe Cys Gly Ser Gly Glu Thr Gln
290 295 300
Pro Phe Cys Ile Asp Ser Asn Thr Phe Asp Val Phe Val Trp Phe Gly
305 310 315 320
Trp Ala Asn Ser Ser Leu Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Asn Ala Asp
325 330 335
Phe Arg Lys Ala Phe Ser Thr Leu Leu Gly Cys Tyr Arg Leu Cys Pro
340 345 350
Ala Thr Asn Asn Ala Ile Glu Thr Val Ser Ile Asn Asn Asn Gly Ala
355 360 365
Ala Met Phe Ser Ser His His Glu Pro Arg Gly Ser Ile Ser Lys Glu
370 375 380
Cys Asn Leu Val Tyr Leu Ile Pro His Ala Val Gly Ser Ser Glu Asp
385 390 395 400
Leu Lys Lys Glu Glu Ala Ala Gly Ile Ala Arg Pro Leu Glu Lys Leu
405 410 415
Ser Pro Ala Leu Ser Val Ile Leu Asp Tyr Asp Thr Asp Val Ser Leu
420 425 430
Glu Lys Ile Gln Pro Ile Thr Gln Asn Gly Gln His Pro Thr ***
435 440 445
<210> 2
<211> 252
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The amino acid sequence of the modified red fluorescent protein
<400> 2
Leu Ser Ser Glu Arg Val Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala
1 5 10 15
Leu Lys Ser Glu Ile Lys Lys Gly Leu Arg Leu Lys Asp Gly Gly His
20 25 30
Tyr Ala Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln
35 40 45
Leu Pro Gly Ala Tyr Ile Val Asp Ile Lys Leu Asp Ile Val Ser His
50 55 60
Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Cys Glu Arg Ala Glu Gly Arg
65 70 75 80
His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Thr Gly Gly
85 90 95
Ser Leu Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu
100 105 110
Phe Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu
115 120 125
Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Ala Phe Gln
130 135 140
Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp
145 150 155 160
Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Ile Lys
165 170 175
His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Phe Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly
180 185 190
Phe Arg Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Ile Ile His
195 200 205
Val Asn Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val Phe Ile Tyr Lys Val
210 215 220
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225 230 235 240
Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Tyr Asp Asp Asp Leu
245 250
<210> 3
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The amino acid sequence of the signal peptide
<400> 3
Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Phe Cys Leu Val Phe Ala
1 5 10 15
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Ala Ser
20 25
<210> 4
<211> 686
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant amino acid sequence comprising the amino acid
sequence of dopamine receptor D1 type, the amino acid sequence of
the modified red fluorescent protein, and the amino acid sequence
of the signal peptide
<400> 4
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1 5 10 15
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Leu Arg Ser Lys Val Thr Asn Phe Phe Val Ile Ser Leu Ala Val Ser
85 90 95
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100 105 110
Ile Ala Gly Phe Trp Pro Phe Gly Ser Phe Cys Asn Ile Trp Val Ala
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Phe Asp Ile Met Cys Ser Thr Ala Ser Ile Leu Asn Leu Cys Val Ile
130 135 140
Ser Val Asp Arg Tyr Trp Ala Ile Ser Ser Pro Ala Arg Tyr Glu Arg
145 150 155 160
Lys Met Thr Pro Lys Ala Ala Phe Ile Leu Ile Ser Val Ala Trp Thr
165 170 175
Leu Ser Val Leu Ile Ser Phe Ile Pro Val Gln Leu Ser Trp His Lys
180 185 190
Ala Lys Pro Thr Ser Pro Ser Asp Gly Asn Ala Thr Ser Leu Ala Glu
195 200 205
Thr Ile Asp Asn Cys Asp Ser Ser Leu Ser Arg Thr Tyr Ala Ile Ser
210 215 220
Ser Ser Val Ile Ser Phe Tyr Ile Pro Val Ala Ile Met Ile Val Thr
225 230 235 240
Tyr Thr Arg Ile Tyr Arg Ile Ala Gln Lys Gln Leu Ser Ser Glu Arg
245 250 255
Val Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Ser Glu Ile
260 265 270
Lys Lys Gly Leu Arg Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Ala Ala Glu Val
275 280 285
Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr
290 295 300
Ile Val Asp Ile Lys Leu Asp Ile Val Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr
305 310 315 320
Ile Val Glu Gln Cys Glu Arg Ala Glu Gly Arg His Ser Thr Gly Gly
325 330 335
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340 345 350
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<210> 5
<211> 1329
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDNA sequence of dopamine receptor D1 type
<400> 5
atggaccctc tgaatctgtc atggtatgac gatgatctgg aaaggcaaaa ctggtcccgg 60
ccgtttaatg gatcagatgg taaagcagat cggcctcact acaattacta cgccacactg 120
ctcaccctcc tcattgcagt tattgtgttc gggaacgtgc tggtttgcat ggcagtaagc 180
cgggaaaagg ctctccagac aactaccaac tacctcatcg tctcacttgc ggtagcagac 240
ttgctggtgg ctaccctggt catgccttgg gtggtttact tggaggttgt tggcgagtgg 300
aagttctcaa ggatacattg cgatatcttt gtaaccctgg atgttatgat gtgtacggct 360
tcaatattga acctctgtgc catctccatc gaccgctata ctgccgtagc aatgcctatg 420
ctttacaata cccgatattc aagcaagcgg agggtgacgg ttatgatttc catcgtttgg 480
gtgctgtcct ttacgattag ttgccctctg ctgttcgggc tgaacaacgc agaccaaaat 540
gagtgtatta ttgccaatcc cgcctttgtg gtgtattcat caattgtgag cttttacgtc 600
ccatttattg ttacattgtt ggtgtacatt aaaatataca ttgtcctcag gcggcggaga 660
aaacgggtga acaccaagcg gtcatctaga gctttccgcg ctcatctgag agctccactg 720
aagggcaact gtacccaccc ggaagacatg aaactgtgta ccgtcatcat gaaatccaat 780
gggagcttcc ccgttaatag gcggagagtg gaagccgcaa ggcgcgcaca ggagctggag 840
atggagatgc tcagcagcac cagcccccct gagcgcaccc ggtacagccc cattccgccc 900
tcacatcacc aactcacact gcccgacccc tcacatcatg gactccactc taccccggac 960
tcaccggcca agcctgaaaa gaacgggcac gcgaaagatc acccgaaaat cgctaagatt 1020
ttcgagatcc aaactatgcc taacggcaaa actcgcacct ctctgaaaac aatgagtcgg 1080
agaaaacttt cacagcaaaa ggagaagaag gccacccaaa tgctggccat tgtactcggg 1140
gtgttcatca tttgttggct gccctttttt atcacccaca tcctgaacat tcattgtgat 1200
tgcaacattc caccagtgct ctatagcgcc tttacttggc tgggttatgt gaatagtgcg 1260
gtaaacccca taatctacac cacattcaat atcgaatttc gaaaagcatt tctgaagatt 1320
ctccactgt 1329
<210> 6
<211> 756
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA sequence of cpRFP
<400> 6
ctgagctcac ccgtggtttc cgagcggatg taccccgagg acggcgccct gaagagcgag 60
atcaagaagg ggctgaggct gaaggacggc ggccactacg ccgccgaggt caagaccacc 120
tacaaggcca agaagcccgt gcagctgccc ggcgcctaca tcgtggacat caagttggac 180
atcgtgtccc acaacgagga ctacaccatc gtggaacagt gcgaacgcgc cgagggccgc 240
cactccaccg gcggcatgga cgagctgtac aagggaggta caggcgggag tctggtgagc 300
aagggcgagg aggataacat ggccatcatc aaggagttca tgcgcttcaa ggtgcacatg 360
gagggctccg tgaacggcca cgagttcgag atcgagggcg agggcgaggg ccgcccctac 420
gaggcctttc agaccgctaa gctgaaggtg accaagggtg gccccctgcc cttcgcctgg 480
gacatcctgt cccctcagtt catgtacggc tccaaggcct acattaagca cccagccgac 540
atccccgact acttcaagct gtccttcccc gagggcttca ggtgggagcg cgtgatgaac 600
ttcgaggacg gcggcattat tcacgtgaac caggactcct ccctgcagga cggcgtattc 660
atctacaagg tgaagctgcg cggcaccaac ttcccccccg acggccccgt aatgcagaag 720
aagaccatgg gctgggaggc tacgcgtgac gacctg 756
Claims (17)
- 도파민 D1형 수용체 유전자, 및 적색 형광 단백질 또는 변형된 적색 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 유전자;
상기 재조합 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터; 또는
상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체;를 포함하는,
도파민 D1형 수용체의 활성 측정용 적색 형광 단백질 기반 바이오센서. - 청구항 1에 있어서, 적색 형광 단백질 또는 변형된 적색 형광 단백질은 원순열(Circular Permutation) 변이된 적색 형광 단백질(cpRFP)인 것인, 바이오센서.
- 청구항 1에 있어서, 도파민 D1형 수용체의 유전자는 서열번호 1에 기재된 아미노산을 코딩하는 것인, 바이오센서.
- 청구항 1에 있어서, 변형된 적색 형광 단백질을 코딩하는 유전자는 하기 식 1에 따른 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 것인, 바이오센서
[식 1]
L1-cpRFP-L2
(식 1에서, L1은 cpRFP의 N-말단에 결합되는 LSS 및 각각 독립적인 임의의 2개의 아미노산 잔기를 갖는 링커 펩타이드를 포함한다. L2는 cpRFP의 C-말단에 결합되는 DDL 및 각각 독립적인 임의의 2개의 아미노산 잔기를 갖는 링커 펩타이드를 포함한다.) - 청구항 4에 있어서, L1은 LSSX1X2를 포함하고, L2는 X3X4DDL를 포함하고, 여기서 X1, X2, X3, X4는 각각 독립적인 임의의 아미노산인 것인, 바이오센서.
- 청구항 5에 있어서, X1X2는 글루탐산-아르기닌(ER), 글루타민-아르기닌(QR), 및 아르기닌-아르기닌(RR)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고, X3X4는 타이로신-아스파르트산(YD), 트레오닌-세린(TS), 및 히스티딘-프롤린(HP)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 바이오센서.
- 청구항 5에 있어서, X1X2는 글루탐산-아르기닌(ER)이고, X3X4는 타이로신-아스파르트산(YD)인 것인, 바이오센서.
- 청구항 1에 있어서, 변형된 적색 형광 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 것인, 바이오 센서.
- 청구항 1에 있어서, 적색 형광 단백질 또는 변형된 적색 형광 단백질의 아미노산 서열은 도파민 D1형 수용체의 세포내 세 번째루프(Intracellular loop 3: ICL3) 부분에 결합되는 것인, 바이오센서.
- 청구항 1에 있어서, 적색 형광 단백질 또는 변형된 적색 형광 단백질의 아미노산 서열은 도파민 D1형 수용체의 ICL3의 N-말단으로부터 1번째 내지 54번째 아미노산 중 어느 하나의 바로 뒤에 결합되는 것인, 바이오센서.
- 청구항 1에 있어서, 적색 형광 단백질 또는 변형된 적색 형광 단백질의 아미노산 서열은 도파민 D1형 수용체의 ICL3의 N-말단으로부터 9번째 아미노산 바로 뒤에 결합되는 것인, 바이오센서.
- 청구항 1에 있어서, 도파민 D1형 수용체 유전자는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열의 129번째 아미노산인 페닐알라닌(F)이 알라닌(A)으로 치환된 아미노산 서열을 코딩하는 것인, 바이오센서.
- 청구항 1에 있어서, 재조합 유전자는 시그널 펩타이드를 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것인, 바이오센서.
- 청구항 13에 있어서, 시그널 펩타이드는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 바이오센서.
- 청구항 13에 있어서, 재조합 유전자는 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 바이오센서.
- 바이오센서를 세포에 도입하는 단계;
바이오센서가 도입된 세포에 대상 시료를 첨가하는 단계; 및
바이오센서에 대상 시료의 첨가에 따른 도파민 D1형 수용체의 활성을 측정하는 단계;를 포함하는
청구항 1의 바이오센서를 이용한 도파민 D1형 수용체의 활성을 측정하는 방법. - 바이오센서를 세포에 도입하는 단계;
바이오센서가 도입된 세포에 대상 시료를 첨가하는 단계;
바이오센서에 대상 시료의 첨가에 따른 도파민 D1형 수용체 결합하는 리간드를 검출하는 단계;를 포함하는
청구항 1의 바이오센서를 이용한 도파민 D1형 수용체에 결합하는 리간드의 검출 방법.
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|---|---|---|---|
| KR1020190120561A KR102329302B1 (ko) | 2019-09-30 | 2019-09-30 | 도파민 d1형 수용체의 활성 측정용 적색 형광 단백질 기반 바이오센서 |
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| KR1020190120561A KR102329302B1 (ko) | 2019-09-30 | 2019-09-30 | 도파민 d1형 수용체의 활성 측정용 적색 형광 단백질 기반 바이오센서 |
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|---|
| Patriarchi et al., Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science. 29 June, 2018, Vol. 360, eaat4422 1부.* * |
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