JP4981453B2 - シトクロムcタンパク質及びアッセイ - Google Patents
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Description
プログラム細胞死の開始を検出する多数のアッセイが開発されている(Sgone & Wick, Int. Arch. Allergy Immunol., (1994) 105, 327−332;Sgone & Gruber, Exp Gerontol., (1998) 33, 525−533)。これらのアッセイは、細胞死に付随する広範な事象に基づいており、伝統的に生体染色及び核色素を用いた光学及び電子顕微鏡法が用いられてきた。例えば、DNAのラダー化又は分解、DNA末端標識法(例えば、TUNEL末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼdUTPニック端標識法)、ヌクレアーゼ活性及び乳酸脱水素酵素放出に基づいた生化学的方法がしばしば使用される。
シトクロムcは、コードされた核タンパク質であり、ミトコンドリアを標的とし、そのミトコンドリアで電子伝達体として生物学的機能を示す。アポトーシス刺激に応じたミトコンドリアから細胞質へのシトクロムcの移動は、アポトーシスを受ける細胞の関与における初期の決定的な段階である(Li et al., Cell (1997) 91, 479−489)。シトクロムcは、細胞質ゾル中でアポトーシスプロテアーゼ活性化因子−1(Apaf−1)と強く結合する(Zou et al., Cell (1997) 90, 405−413)。コファクターの存在下で、生じたシトクロムc:Apaf−1は集合して多量体の「アポプトソーム」となり、プロテアーゼ酵素前駆体であるプロカスパーゼ−9と結合しこれを活性化する(Srinivasula et al., Mol. Cell (1998) 1, 949−957)。こうして「カスパーゼカスケード」が活性化され、多数の細胞内基質が切断され、重要な細胞過程が不能となり、細胞の構造成分が破壊される(Slee et al., J. Cell. Biol. (1999) 144, 281−292;Skulachev, FEBS Lett., (1998) 423, 275−280)。アポトーシスにおけるミトコンドリアの役割を示した概略図を図1に示す。
オワンクラゲ(Aequorea victoria)由来の緑色蛍光タンパク質(GFP)の使用は、多くの細胞分子生物学的プロセスへの研究で周知である。シトクロムc−GFP融合物がアポトーシスの研究に使用されている。例えば、Heiskanen at al., J. Biol. Chem., (1999) 274, 5654−5658では、ラット褐色細胞腫−6(PC6)細胞中でラットシトクロムcに基づくシトクロムc−GFP融合物を発現させている。スタウロスポリンによってアポトーシスを誘導すると、ミトコンドリアから融合物が放出され、ミトコンドリアの脱分極に伴って起こった。
Vermes et al., J. Immunol. Meth., (2000) 243, 167−190 Haanen & Vermes, Eur. J. Obstetr.Gynecol., (1996) 64, 129−133 Tomlinson & Bodmer, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, (1995) 92, 11130−11134 Sachs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1996) 93, 4742−4749 Pahor et al., Lancet, (1996) 348, 493−497 Meyaard et al., Science (1992) 257, 217−219 Griffith et al., Science, (1995) 270, 1189−1192 Sgone & Wick, Int. Arch. Allergy Immunol., (1994) 105, 327−332 Sgone & Gruber, Exp Gerontol., (1998) 33, 525−533 Li et al., Cell (1997) 91, 479−489 Zou et al., Cell (1997) 90, 405−413 Srinivasula et al., Mol. Cell (1998) 1, 949−957 Slee et al., J. Cell. Biol. (1999) 144, 281−292 Skulachev, FEBS Lett., (1998) 423, 275−280 Kluck et al., J. Biol. Chem., (2000), 275, 16127−16133 Yu et al., J. Biol. Chem., (2001) 276, 13034−13038 Abdullaev et al., Biochem. J. (2002) 362, 749−754 Heiskanen at al., J. Biol. Chem., (1999) 274, 5654−5658 Goldstein et al., Nat. Cell Bio., (2000) 2, 156−160 Goa et al., J. Cell Sci., (2001) 114, 2855−2862 Lim et al., J. Biomed. Sci. (2002); 9,488−506
i)位置F64Lでのアミノ酸置換、
ii)位置S175Gでのアミノ酸置換、及び
iii)位置E222Gでのアミノ酸置換
を含む。
i)上述の融合構築物を過剰発現する形質転換細胞を培養する段階と、
ii)細胞内での融合構築物の局在位置を経時的に決定する段階とを含み、細胞内での融合構築物の局在位置の変化がアポトーシスの指標となる、方法を提供する。
i)上述の融合構築物を過剰発現する形質転換細胞を培養する段階と、
ii)細胞内での構築物の局在位置を決定する段階と、
iii)細胞を作用因子で処理し、その細胞内での構築物の局在位置を決定する段階とを含み、作用因子で処理しなかった対照細胞と比較した、その細胞内での構築物の局在位置の差が、アポトーシスの調節に対して作用因子が及ぼす効果の指標となる、方法を提供する。
i)どちらも上述の融合構築物を過剰発現する第1の細胞と第2の細胞を培養する段階と、
ii)第1の細胞を作用因子で処理し、第1の細胞内での構築物の局在位置を決定する段階と、
iii)作用因子で処理しなかった第2の細胞内での構築物の局在位置を決定する段階とを含み、第1の細胞内と第2の細胞内での構築物の局在位置の差が、アポトーシスの調節に対して作用因子が及ぼす効果の指標となる、方法を提供する。
i)上述の融合構築物を過剰発現する形質転換細胞を培養する段階と、
ii)細胞を作用因子で処理し、その細胞内での構築物の局在位置を決定する段階と、
iii)作用因子の存在下での構築物の局在位置を、作用因子の非存在下での構築物の局在位置についての既知の値と比較する段階とを含み、作用因子の存在下での細胞内での構築物の局在位置と、作用因子の非存在下での既知の値との差がアポトーシスの調節に対して作用因子が及ぼす効果の指標となる、方法を提供する。
図1は、Biocarta:(www. biocarta.com/ pathfiles/ h_mitochondriaPathway.asp)の承諾の下で引用したアポトーシスにおけるミトコンドリアの役割を描いた概略図である。
シトクロムc遺伝子の増幅、GFP(F64L−S175G−E222G)への融合及びK73A(APAF−1結合)突然変異の導入
本発明の蛍光シトクロムc突然変異融合タンパク質は、シトクロムcタンパク質をコードする核酸の配列を、蛍光タンパク質をコードする核酸の配列とインフレームで結合させ、次いでK73A(APAF−1結合)突然変異(Kluck et al., J Biol Chem., (2000) 275, 16127−16133)を融合タンパク質の核酸に導入することにより作製した。ヒトシトクロムc遺伝子の好ましい配列は、Zang and Gerstein, Gene, (2003)312, 61−72により記載されている;NCBIアクセッション番号NM_018947。(配列番号1)コードされたタンパク質を配列番号2に示す。代替のヒトシトクロムc配列を使用することができる。さらに、遺伝子の開始コドン及び終止コドン周辺で代替の配列を使用して、タンパク質融合に有用な制限酵素部位をもたらすことができる。そのような変更により、基準配列と比べてアミノ酸の付番が変化する場合、そのような付番は、基準配列とのアミノ酸の整列によって推測されるはずである。蛍光タンパク質をコードする遺伝子の好ましい配列には、Chalfie et al, Science, (1994) 263, 802−5が公表したオワンクラゲに由来するもの、GFP−F64L−S175G−E222G突然変異体(英国特許第2374868号)、Emerald(Aurora biosciences社製)、EGFP及びその関連突然変異体(BD Clontech社(米国カリフォルニア州パロアルト)製)並びに花虫綱の種由来の蛍光タンパク質が挙げられ、総説についてはLabas et al, PNAS, (2002) 99, 4256−4261を参照されたい。
CYCS2;5′−gttgttgtcgaccttactcattagtagcttttttgag(配列番号12)
CYCS3;5′−gttgttgtcgaccctcattagtagcttttttgag(配列番号13)
プライマーCYCS1は、シトクロムc遺伝子の5′領域と相同性を示し、部分的なKozak配列(Kozak, Cell (1986), 44, 283)と、EcoRI制限酵素部位の両方を含む。プライマーCYCS2は、シトクロムc遺伝子の3′領域と相同性を示し、終止コドン及びSalI制限酵素部位を含む。プライマーCYCS3は、シトクロムc遺伝子の3′領域と相同性を示し、SalI制限酵素部位を含む。CYCS1−CYCS2及びCYCS1−CYCS3のRT−PCR産物を、それぞれGFP−融合ベクターpCORON1000−GFP−C1及びN1(Amersham Biosciences社(英国カーディフ)製)の対応するEcoRI及びSalI部位にクローン化し、自動配列決定によりそれを検証した。これらのベクターは、GFP融合物を発現させるためのCMVプロモーター、及びネオマイシン耐性マーカーの発現を誘発するためのSV40プロモーターを含む。これらのベクター内のGFPはレッドシフトしており、英国特許第2374868号に記載の突然変異F64L−S175G−E222Gを含む。
CYCS5;5′−ttgttccagggatgtacttggcgggattctccaaatactcc(配列番号15)
配列の検証後、制限酵素NheI及びNotIを用いてpCORON1000−GFP−野生型シトクロムc及びK73A突然変異融合構築物をベクターpCORON2100中にサブクローン化した。pCORON2100は、CMVプロモーター、並びにGFP−融合タンパク質及びネオマイシン耐性マーカーのバイシストロニックな発現を駆動するIRESエレメントを含む。
哺乳類細胞でのGFP−融合タンパク質安定細胞系統作製に対するシトクロムc−K73A(APAF−1結合)突然変異の影響
HiSpeedプラスミド精製キット(Qiagen社(オランダ)製)を用いて、トランスフェクションに使用するプラスミドDNAをすべての構築物用に調製した。実施例1での構築物に加えて、pCORON1000−GFP及びpCORON2100−GFPを選択対照として用いた。DNAを18MΩ水(Sigma社(英国ドーセット)製)中で100ng/μlに希釈し、1μgをトランスフェクションに使用した。トランスフェクションを行う日に集密度が50〜80%となるように、6穴プレート中に密度5×104個/穴でHek293細胞を播き、1晩インキュベートした。FuGene6試薬(Roche Diagnostics社(スイス国バーゼル)製)に対するDNAの比は、一過性トランスフェクションの各反応について1:3(1μg:3μl)を用いた。即ち、3μlのFuGene6を無血清DMEM培地(Sigma社製)(ペニシリン/ストレプトマイシン、L−グルタミン[Invitrogen社(米国カリフォルニア州カールスバッド)製]を含有)87μlに添加し、穏やかにたたいて混合し、次いで構築物DNA10μl(1μg)を添加し、再度穏やかに混合した。そのFuGene6:DNA複合体を室温で40分間インキュベートし、1滴づつ穏やかに混合しながら、培地を交換せずに細胞に直接添加した。次いで、均一な分布となるようにプレートを穏やかに旋回した。24時間後及び48時間後に、Nikon Eclipse TE200落射蛍光顕微鏡(Nikon社(米国ニューヨーク州メルヴィル)製)を用いて発現について細胞をモニターした。直径15cmプレート中に細胞を継代し、24時間後ジェネテシン(G418、250ng/μl;Sigma社製)での選択下に置いた。続いての5〜7日にわたってジェネテシンの濃度を500ng/μlまで漸増させた。約10日間、又は模擬トランスフェクトした対照のプレートが死滅するまで選択を継続した。次いで、クローニングリングを使用して、生存しているコロニーを単離し、96穴、24穴及び6穴プレートにより細胞を増殖させた。適当な場合には第2及び第3回のクローン選択にかけた。
IRESエレメントを利用し、安定な細胞系統の作製を促進するために、pCORON2100(Amersham Biosciences社製)で、この突然変異cDNAの発現試験を行った。ジェネテシンG418での選択下で「混合集団」の安定発現細胞系統を3週間継続して培養した。次いで単一クローン細胞系統を15個単離した。
Claims (26)
- (a)配列番号2に示す野生型ヒトシトクロムcに由来する修飾シトクロムcタンパク質と(b)蛍光タンパク質とを含むシトクロムc−レポーター融合タンパク質構築物であって、当該融合タンパク質がミトコンドリアを標的とし、生細胞中でのアポトーシス誘導能が低下しており、上記修飾シトクロムcが、K73A、K73L、K73R、K73G及びK73X(ただし、Xはトリメチル化を表す。)からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、融合タンパク質構築物。
- 前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)及びEmeraldからなる群から選択される、請求項1記載の融合タンパク質構築物。
- 前記蛍光タンパク質が高感度緑色蛍光タンパク質又はEmeraldである、請求項2記載の融合タンパク質構築物。
- 前記GFPが、
i)位置F64Lでのアミノ酸置換、
ii)位置S175Gでのアミノ酸置換、及び
iii)位置E222Gでのアミノ酸置換
を含む、請求項2記載の融合タンパク質構築物。 - 配列番号4及び配列番号6からなる群から選択される、請求項1乃至請求項4のいずれか1項記載の融合タンパク質構築物。
- 請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の融合タンパク質構築物をコードするヌクレオチド配列からなる核酸。
- 配列番号3及び配列番号5からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる核酸。
- 調節領域と請求項6又は請求項7記載のヌクレオチド配列とを含む核酸構築物であって、上記配列が調節領域の調節下にある核酸構築物。
- 天然のシトクロムcプロモーター、哺乳類の構成型プロモーター、哺乳類の制御プロモーター、ヒトユビキチンCプロモーター、ウイルスプロモーター、SV40プロモーター、CMVプロモーター、酵母プロモーター、糸状菌プロモーター及び細菌プロモーターからなる群から選択されるプロモーターの調節下にある、請求項8記載の核酸構築物。
- 前記ウイルスプロモーターがCMVプロモーター又はSV40プロモーターである、請求項9記載の核酸構築物。
- 前記プロモーターがヒトユビキチンCプロモーターである、請求項9記載の核酸構築物。
- 請求項8乃至請求項11のいずれか1項記載の核酸構築物を含む複製可能なベクター。
- 前記ベクターがプラスミドベクターである、請求項12記載の複製可能なベクター。
- 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項12記載の複製可能なベクター。
- 前記ウイルスベクターが、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス、サルウイルス40、ウシパピローマウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス及びバキュロウイルスのベクターからなる群から選択される、請求項14記載の複製可能なベクター。
- 請求項8乃至請求項11のいずれか1項記載の核酸構築物で安定に形質転換された宿主細胞。
- 請求項8乃至請求項11のいずれか1項記載の核酸構築物で一過性に形質転換された宿主細胞。
- 植物、昆虫、線虫、鳥類、魚及び哺乳類の細胞からなる群から選択される、請求項16又は請求項17記載の宿主細胞。
- 前記哺乳類の細胞がヒト細胞である、請求項18記載の宿主細胞。
- 前記ヒト細胞が、Hek、HeLa、U2OS及びMCF−7からなる群から選択される、請求項19記載の宿主細胞。
- 前記Hek細胞がHek293である、請求項20記載の宿主細胞。
- 請求項1乃至請求項8のいずれか1項記載の融合タンパク質を発現できる、請求項16乃至請求項21のいずれか1項記載の宿主細胞。
- 生細胞中でのアポトーシスの検出方法であって、
i)請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の融合タンパク質構築物を過剰発現する形質転換細胞を培養する段階と、
ii)細胞内での融合タンパク質構築物の局在位置を経時的に決定する段階と
を含み、細胞内での融合タンパク質構築物の局在位置の変化がアポトーシスの指標となる、方法。 - 生細胞中でのアポトーシスの調節に作用因子が及ぼす効果を測定する方法であって、
i)請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の融合構築物を過剰発現する形質転換細胞を培養する段階と、
ii)細胞内での構築物の局在位置を決定する段階と、
iii)細胞を作用因子で処理し、細胞内での構築物の局在位置を決定する段階と
を含み、作用因子で処理していない対照細胞との対比における細胞内での構築物の局在位置の差がアポトーシスの調節に作用因子が及ぼす効果の指標となる、方法。 - 生細胞中でのアポトーシスの調節に作用因子が及ぼす効果を測定する方法であって、
i)請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の融合構築物を共に過剰発現する第1の細胞と第2の細胞を培養する段階と、
ii)第1の細胞を作用因子で処理し、第1の細胞内での構築物の局在位置を決定する段階と、
iii)作用因子で処理しなかった第2の細胞内での構築物の局在位置を決定する段階と
を含み、第1の細胞内と第2の細胞内での構築物の局在位置の差がアポトーシスの調節に作用因子が及ぼす効果の指標となる、方法。 - 生細胞中でのアポトーシスの調節に作用因子が及ぼす効果を測定する方法であって、
i)請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の融合構築物を過剰発現する形質転換細胞を培養する段階と、
ii)細胞を作用因子で処理し、細胞内での構築物の局在位置を決定する段階と、
iii)作用因子の存在下での構築物の局在位置を、作用因子の非存在下での構築物の局在位置についての既知の値と比較する段階と
を含み、作用因子の存在下での細胞内での構築物の局在位置と、作用因子の非存在下での既知の値との差がアポトーシスの調節に作用因子が及ぼす効果の指標となる、方法。
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