WO2007102507A1 - タンパク質リン酸化インディケーター - Google Patents

タンパク質リン酸化インディケーター Download PDF

Info

Publication number
WO2007102507A1
WO2007102507A1 PCT/JP2007/054333 JP2007054333W WO2007102507A1 WO 2007102507 A1 WO2007102507 A1 WO 2007102507A1 JP 2007054333 W JP2007054333 W JP 2007054333W WO 2007102507 A1 WO2007102507 A1 WO 2007102507A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
indicator
phosphorylation
protein
living cell
test protein
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/054333
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshio Umezawa
Moritoshi Sato
Original Assignee
The University Of Tokyo
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The University Of Tokyo filed Critical The University Of Tokyo
Publication of WO2007102507A1 publication Critical patent/WO2007102507A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to an indicator for detecting phosphorylation of a protein itself. More specifically, the present invention relates to an indicator that can detect the phosphorylation of the protein itself by the presence or absence of a signal or a clear magnitude, and a method for detecting the phosphorylation of a protein using this indicator. And a method for screening for substances that affect protein phosphorylation.
  • Intracellular signal transduction based on protein phosphorylation is involved in various physiological effects and various diseases resulting from the breakdown (for example, Non-Patent Document 1). Therefore, protein phosphorylation is an important target not only in basic life science and medical research, but also in the field of drug discovery.
  • the method using an antibody probe is basically a method of detecting phosphorylation of proteins in fixed cells or detecting phosphorylation of proteins isolated from cells in vitro. Yes, it is not suitable for in vivo detection of functional protein phosphorylation in living cells.
  • Patent Documents 1 and 2 disclose an indicator that can detect phosphorylation or dephosphorylation of a protein itself as a visible signal change.
  • the indicators of Patent Documents 1 and 2 when a phosphorylated protein and its recognition domain are bound, the fluorescent proteins (one donor and one receptor) linked to each other approach each other, and fluorescence resonance energy transfer (FRET) occurs.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • protein phosphorylation is detected as a change in fluorescence spectrum.
  • the publication of Patent Document 1 Akira is due to the inventors of the present application, and the invention of Patent Document 1 and its effects are also reported in Non-Patent Documents 2 to 4 authored by the present inventors.
  • Patent Document 1 International Publication WO 02/077623 A1 Pamphlet
  • Patent Document 2 Japanese Translation of Special Publication 2005-501525
  • Non-patent document 1 Knight, Z.A. et al. Nature Biotechnology 21 (9): 1047-1054, 2003
  • Non-patent document 2 Sato, M. et al. Nature Biotechnology, 20: 281-294, 2002
  • Non-Patent Document 3 Sasaki, K. et al. J. Biol. Chem., 278 (33): 30945-30951, 2003
  • Non-Patent Document 4 Sato, M. and Umezawa, Y. Methods, 32: 451-455 , 2003
  • the indicator for measuring the fluorescence ratio of Patent Documents 1 and 2 contains a protein for detecting phosphorylation, and can directly detect the presence or absence of phosphorylation of the protein. Therefore, it is possible to determine the presence or absence of protein phosphorylation in living cells.
  • an object of the present invention is to provide a new means capable of detecting the presence or absence of phosphorylation of the protein itself more easily and with high accuracy.
  • the present invention provides a new means that can detect the presence or absence of phosphorylation of the protein itself by the presence or absence of a signal (ON / OFF) or the clear magnitude of the signal. provide.
  • the first invention is an indicator for detecting phosphorylation of a test protein in a living cell, comprising a proteolytic signal distribution lj, a phosphorylation recognition domain, a reporter molecule, and a test protein.
  • a proteolytic signal distribution lj a proteolytic signal distribution lj
  • a phosphorylation recognition domain a reporter molecule
  • a test protein a test protein
  • the reporter molecule is separated by binding of ubiquitin to the proteolytic signal sequence. Horned, and
  • living cell refers to a cell (for example, a cultured cell) placed in an artificial environment while retaining at least a part of its original function, or a multicellular organism.
  • a cell that constitutes an individual eg, an animal individual
  • the living cells into which the indicator has been introduced may constitute part or all of an individual multicellular organism.
  • Test protein is a protein to be examined for phosphorylation in a living cell to be introduced.
  • the test protein may be the whole protein or a partial peptide serving as a substrate for phosphatase.
  • Protein 1J is a molecule (peptide) containing an amino acid sequence to which ubiquitin binds and can degrade a protein having the sequence.
  • the “phosphorylation recognition domain” is a molecule (peptide) that recognizes phosphorylation of a test protein or its substrate peptide and binds to the phosphorylated test protein or its substrate peptide.
  • reporter molecule means a molecule (protein or peptide) that emits a signal that can be recognized by a visual or optical instrument. When the reporter molecule is degraded, the signal disappears, and when the reporter molecule maintains its function, the signal continues.
  • linearly linked means that the entire indicator maintains a linear structure (primary structure) under conditions other than phosphorylation of the test protein, and the indicator Means that the elements constituting the are connected to each other via a linker or the like.
  • Such a linear indicator changes its structure by binding the phosphorylated test protein to the phosphorylation recognition domain (secondary structure), and this structure.
  • the change “inhibits ubiquitin binding to the proteolytic signal sequence”.
  • the reporter molecule continues to be able to generate the signal.
  • the indicator maintains the primary structure, so that ubiquitin binds to the proteolytic signal sequence to form a polyubiquitin chain, which is degraded by the proteasome present in living cells.
  • the indicator molecule of the indicator is also degraded and thus the signal of the reporter molecule disappears.
  • a proteolytic secondary ligand 1J, a test protein, a phosphorylation recognition domain, and a reporter molecule are connected in a linear sequence in the order from the N-terminus to the C-terminus. This is an indicator.
  • the second invention is a vector capable of expressing the indicator of the first invention as a chimeric protein, wherein the expression cassette includes a coding sequence of a proteolytic signal sequence, and a coding sequence of a phosphorylation recognition domain
  • An expression vector comprising a coding sequence for a reporter molecule and further comprising a coding sequence cloning site for a test protein.
  • the expression vector of the second invention is used as a tool for creating the indicator of the first invention by genetic engineering, or for introducing the indicator of the first invention into a living cell. It is a vector as a tool.
  • the “expression cassette” in this expression vector means a polynucleotide that is a part of the vector construct and has elements necessary for expressing the indicator as one protein (chimeric protein).
  • the expression cassette has, for example, a “transcription control sequence (promoter / enhancer)” upstream of the entire coding sequence and a “poly A-attached signal” downstream.
  • Chimeric protein means a complex protein in which each element (peptide or protein) constituting the indicator of the first invention is bound.
  • code arrangement 1 is a nucleotide chain (polynucleotide) that codes each element (peptide or protein) constituting an indicator.
  • One of the preferred embodiments of the second invention is that in the expression cassette, the coding sequence of the protein degradation signal sequence in the 5 'to 3' direction 'J, the coding sequence cloning site of the test protein, the phosphorylation recognition domain The coding sequence of, and the coding sequence of the reporter molecule are linked in this order This is an expression vector.
  • a third invention is a method for detecting phosphorylation of a test protein in a living cell, wherein the indicator of the first invention is introduced into the living cell, and a reporter molecule of this indicator
  • a method for detecting phosphorylation characterized in that a signal produced from the protein is measured, and if the signal increases, it is determined that the test protein is phosphorylated.
  • One of the preferred embodiments of the method of the third invention is that the coding sequence of the test protein is cloned into the expression vector of the second invention and the recombinant expression vector is introduced into a living cell.
  • phosphorylation is detected by introducing a protein into a living cell.
  • a fourth invention is a method for screening a substance that affects phosphorylation of a test protein, wherein the indicator of the first invention is introduced into a living cell, and the reporter molecule of this indicator If the signal increases when the candidate substance is introduced into the living cell, the candidate substance is a substance that promotes phosphorylation of the test protein, and if the signal decreases, the candidate substance It is a screening method characterized by determining that it is a substance that suppresses phosphorylation of a test protein.
  • an indicator is cloned by cloning a coding sequence of a test protein into the expression vector of the second invention and introducing the recombinant expression vector into a living cell. Is a screening method that introduces into a living cell
  • signal increase in calo and “signal decrease” are, for example, increase in calorie and decrease in comparison with measurement control conditions.
  • the control conditions are appropriately set according to the detection target, the characteristics of the candidate substance to be specified in the screening method, or the intracellular introduction mode of the indicator.
  • a fifth invention is a living cell into which the indicator of the first invention has been introduced.
  • an expression vector for expressing the indicator of the first invention may be introduced.
  • the sixth invention is an individual of a multicellular organism in which living cells into which the first invention indicator has been introduced constitute part or all of the body.
  • the multicellular organism is an animal, Even if it is a thing, it is not specifically limited.
  • the present invention it is possible to detect the presence or absence of a signal of a reporter molecule attached to a protein, or whether the signal is clearly large or small, in a living cell.
  • This makes it possible to detect protein phosphorylation with high accuracy by an extremely simple procedure, and greatly contributes to the elucidation of the mechanism of intracellular signal transduction and the causes of various diseases as a result of the failure. It can also be an effective tool for developing treatments and drugs for various diseases.
  • FIG. 1 shows a structural example of a phosphorylated indicator of the present invention and the principle of phosphorylation detection by this indicator.
  • A shows that when the test protein (substrate sequence) is not phosphorylated and the indicator is degraded by the ubiquitin / proteasome system and the signal from the reporter molecule disappears
  • (b) shows that the substrate sequence is phosphorylated. In this case, the signal from the reporter molecule is continuously emitted.
  • FIG. 2 shows the luciferase luminescence intensity of the indicator of Example 1. It is expressed as a relative value with the light emission intensity when no insulin is added as 1. If the white bar is the only indicator, the black bar is the control.
  • Fig. 3 is a western blot showing the intracellular expression level of the indicator of Example 1. Result of ting. Since the C5 terminus of the indicator is labeled with a V5 epitope tag, Western blotting with anti-V5 antibody is the total amount of the indicator, and Western blotting with anti-phosphotyrosine antibody (pTyr) is phosphorylated. Show the amount of indicator displayed.
  • FIG. 4 is a photograph of YFP emission of the indicator of Example 2 observed with a fluorescence microscope. The fluorescent signal is shown in white.
  • FIG. 5 shows the luciferase luminescence intensity of the indicator of Example 3. It is expressed as a relative value with the luminescence intensity when EGF is not added as 1.
  • FIG. 6 is a photograph of luminescence observed in a mouse individual transplanted with cells having the indicator of Example 4.
  • FIG. 7 quantifies the luminescence intensity observed in the individual of Example 4, and shows the ratio of the luminescence intensity on the right side of the body (L) to the luminescence on the left side of the body (LA) in each group.
  • the indicator of the first invention comprises a proteolytic signal distribution U, a phosphorylation recognition domain, a reporter molecule and a test protein linked in a straight chain.
  • proteolytic signal sequence a known ubiquitin-containing sequence without particular limitation can be used as long as it is a sequence that is ubiquitinated by ubiquitin ligase.
  • the phosphorylation recognition domain is selected in relation to the test protein. For example, if the test protein is phosphorylated by a serine / threonine kinase, a phosphoamino acid binding domain (eg 14-3-3 domain or forkhead-associated domain) that can bind to phosphoserine and / or phosphothreonine is used. select. If the test protein is phosphorylated by tyrosine kinase, select a phosphoamino acid binding domain that binds to phosphotyrosine (eg Src homology domain-2 (SH2) or PTB domain)
  • SH2 phosphotyrosine
  • Reporter molecules include photoproteins (for example, firefly luciferase, click bilucylluciferase, renilla luciferase and mutants thereof), fluorescent proteins (for example, GFP, CFP, YFP, RFP, etc. Those mutants etc.) ability to do S.
  • photoproteins for example, firefly luciferase, click bilucylluciferase, renilla luciferase and mutants thereof
  • fluorescent proteins for example, GFP, CFP, YFP, RFP, etc. Those mutants etc.
  • each of these elements of the indicator is connected so as to satisfy the following conditions.
  • Reporter molecule is degraded by binding of ubiquitin to protein degradation signal sequence.
  • this indicator must be configured so that the entire indicator (at least the reporter molecule) is degraded by binding of ubiquitin to the proteolytic signal sequence.
  • Phosphorylated test protein force Binding to the S phosphorylation recognition domain prevents ubiquitin binding to the proteolytic signal sequence, but the reporter molecule maintains its function.
  • FIG. 1 is a preferred configuration example that satisfies such a condition.
  • N-terminal force Cj-terminal proteolytic signal sequence lj, test protein, phosphorylation recognition domain, and reporter molecule are linked in a straight chain.
  • the entire indicator takes the primary structure and is subject to degradation by the proteasome due to the binding of ubiquitin (Ub).
  • the ubiquitin binding site (lysine residue) of the degradation signal is also covered by the recognition domain.
  • each element is linked by, for example, a peptide bond via an appropriate linker sequence.
  • Each element is basically a known protein or peptide, and based on the amino acid sequence registered in an existing database, a known peptide synthesis method (Memfield, RBJ solid phase peptide synthesis I. ie synthesis or tetrapeptide. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963; Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Chan, W.C. and White, PD, Oxford University Press, 2000, etc.) I can do it.
  • each coding sequence obtained by probe hybridization or RT-PCR using oligonucleotide probes and primers created based on known sequence information can be transferred to in vitro transcription-translation or host-vector. It can also be obtained by gene recombination techniques that are expressed in the system.
  • the indicator may also be prepared by genetic engineering using the expression vector of the second invention.
  • An expression vector for preparing an indicator by genetic engineering can be constructed by appropriately selecting a known vector according to the expression form of the indicator.
  • an expression vector when preparing an indicator by in vitro transcription and translation, can be constructed based on pKAl, pCDM8, pT3ZT718, pT7 / 319, pBluescriptll, etc., which contain an RNA polymerase promoter.
  • microorganisms such as E. coli
  • pUC When microorganisms (such as E. coli) are used as hosts, use pUC, pBluescriptII, pET vector series, pGEX vector series, etc.
  • vectors such as pKAl, pCDM8, pSVK3, pSVL, pBK_CMV, pBK-RSV, EBV vector, pRS, and pYE82 can be used.
  • an expression vector into a host cell
  • a known method such as electroporation, calcium phosphate method, liposome method, DEAE dextran method or the like can be used.
  • the indicator expressed in the host cell can be isolated and purified by combining known separation procedures. For example, treatment with denaturing agents and surfactants such as urea, ultrasonic treatment, enzyme digestion, salting out solvent precipitation method, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, gel filtration, SDS-PAGE, isoelectric focusing Ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, affinity chromatography (method using tag sequence, etc.).
  • the expression cassette of this expression vector has the ability to incorporate the coding sequence of each element of the indicator in a predetermined order. These coding sequences are linked by a nucleotide chain encoding a linker peptide. Gore. Such linker mononucleotide chains are described, for example, in the literature (Carruthers (1982) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 411-418; Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105: 661; Belousov (1997). ) Nucleic Acid Res. 25: 344 0-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med.
  • an indicator When an indicator is produced by expressing it in a host cell, it is necessary to inhibit the host cell's ubiquitin system so that the indicator is not degraded by ubiquitin present in the host cell.
  • ubiquitin-activating enzyme ubiquitin-binding enzyme
  • ubiquitin ligase enzymes involved in the ubiquitin system
  • the expression vector of the second invention can also be constructed as a viral vector for introducing an indicator into a living cell.
  • retroviral vectors suitable for application to mammalian cells human immunodeficiency virus (HIV) -based vectors, lentiwinores vectors, adenowinoles vectors, adeno-associated winoles vectors, henolepes virus vectors, vaccinia Viral vectors and the like (eg, Miller et al. BioTechniques 7: 980-990, 1992; Anderson et al., Nature 392: 25-30 Suppl., 1998; Verma and Somia, Nature 389: 239-242, 1997 Wilson, New Engl. J. Med. 334: 1185-1187, 1996, etc.).
  • HIV human immunodeficiency virus
  • the phosphorylated indicator as described above is used, for example, in the methods of the third and fourth inventions.
  • a third invention is a method for detecting phosphorylation of a test protein in a living cell, wherein the indicator of the first invention is introduced into the living cell, and a reporter molecule of this indicator
  • a method for detecting phosphorylation characterized in that when a signal increases, a test protein force S is phosphorylated when the signal increases.
  • the increase in signal can be determined by the alternative result of whether the signal from the reporter molecule continues (ON) or disappears (OFF), or by the clear magnitude of the signal. However, it is possible to compare and judge by measuring the signal intensity and digitizing it. When determining whether the signal increases or decreases, for example, if the signal intensity clearly increases, it can be determined that the test protein is phosphorylated at the absolute value of the signal, but the increase in the weak signal The signal intensity of the test protein is observed when, for example, a mutant protein that is not phosphorylated by introducing a mutation at the phosphorylation site is used as a control and the mutant protein is introduced into a living cell. Compared with the intensity of the observed signal.
  • ORTER Gene Therapy Systems, USA
  • Chariot Active Motiff soil, USA
  • etc. can be used.
  • Signal measurement can be performed by an appropriate means such as a noreminometer, a fluorometer, an MRI apparatus, or the like, depending on the type of signal emitted by the reporter molecule. If the reporter molecule needs a substrate to emit a signal, it can be supplied to living cells as appropriate.
  • the method of the third invention it is possible to determine whether or not the test protein is a protein that is phosphorylated in a certain living cell.
  • another determination object in this method is to determine whether or not a living cell into which an indicator has been introduced has a protein phosphorylation function (kinase function). For example, when a phosphorylated target amino acid (e.g., serine, threonine, tyrosin) of a test protein that is known to be phosphorylated in another living cell is introduced into the living cell in a dephosphorylated state, the indicator If the signal increases, it can be determined that the living cell has a kinase function.
  • a phosphorylated target amino acid e.g., serine, threonine, tyrosin
  • dephosphorylation can also be detected by utilizing the reversible binding between the test protein and the phosphorylation recognition domain.
  • a phosphorylated test protein and a recognition domain-bound indicator are introduced into a living cell and the signal continues, the cell does not have a dephosphorylation (phosphatase) function, and the signal is lost. Can be determined as having a dephosphorylation function.
  • One of the preferred embodiments in the method of the third invention is that the coding sequence of the test protein is cloned into the expression vector of the second invention and the recombinant expression vector is transferred into a living cell.
  • the introduction of an indicator into living cells can be expressed in a living cell by infecting a living cell with a virus having the above viral expression vector.
  • an expression vector can be introduced into a living cell by a microinstruction method, or the expression vector can be introduced into a living cell by enclosing the expression vector in a hollow nanoparticle displaying a biorecognition molecule.
  • a living cell is a cell (for example, a cultured cell) placed in an artificial environment while retaining at least a part of its original function, or a multicellular organism (for example, it may be a cell that constitutes an individual animal and retains at least a part of its original function.
  • a multicellular organism for example, it may be a cell that constitutes an individual animal and retains at least a part of its original function.
  • the cells into which the indicator has been introduced may constitute part of the individual by transplantation or the like, or may constitute the entire individual.
  • a fourth invention is a method for screening a substance that affects the phosphorylation of a test protein, wherein the indicator of the first invention is introduced into a living cell, and the reporter molecule of this indicator When the signal increases when a candidate substance is introduced, the candidate substance promotes phosphorylation of the test protein.When the signal decreases, the candidate substance It is a screening method characterized by determining that it is a substance that suppresses phosphorylation.
  • the order of introducing the indicator and the candidate substance can be appropriately determined according to the characteristics of the candidate substance to be specified. For example, both of them can be introduced into a living cell at the same time, or an indicator is introduced first, a candidate substance is introduced into a living cell later, or a candidate substance is introduced first, An indicator may be introduced later.
  • the indicator of the first invention is introduced into a living cell, the signal generated from the reporter molecule of this indicator is measured, and the candidate substance is introduced into the living cell. The signal may be compared before and after the introduction of the candidate substance, or a control experiment in which only an indicator is added is conducted to introduce the candidate substance.
  • the substance specified by this screening method is a substance that promotes or suppresses phosphorylation of the test protein. For example, if a candidate substance is allowed to act in a state in which the kinase function of a living cell is deficient, if the signal from the indicator increases, the candidate substance is determined to have a kinase-like phosphorylation function. be able to. In addition, when a candidate substance is acted on a cell having a kinase function and a strong signal is generated as compared with the control, it can be determined that the candidate substance is a substance that activates the kinase. If the signal becomes weak, this candidate substance can be determined to be a substance that inhibits kinase. Furthermore, for example, the test protein When a signal is observed by a candidate substance when it is phosphorylated by agitation, it can be determined that this candidate substance is the same substance as the phosphorylation stimulating substance or a substance that activates the stimulating substance.
  • a substance that affects the dephosphorylation function can be identified by utilizing the reversible binding between the test protein and the phosphorylation recognition domain.
  • candidate substances used in this screening method include, for example, organic or inorganic compounds (particularly low molecular weight compounds), proteins, peptides and the like. These materials have known functions and structures and may be unknown.
  • the “combinatorial chemical library” is an effective means as a candidate substance group for efficiently specifying the target substance.
  • a combinatorial chemical library is a collection of various chemical compositions generated by combining many chemical “building blocks”, such as reagents, through chemical or biological synthesis.
  • a linear combinatorial chemical library such as a peptide library, combines a set of building blocks (amino acids) in all possible ways for a given compound length (ie peptide size). Is formed.
  • compositions can be synthesized through such combinatorial mixing of chemical building blocks.
  • the preparation and screening of combinatorial chemical libraries is well known in the art (see, eg, US Pat. Nos. 6,004,617; 5,985,365).
  • Various commercially available libraries can also be used.
  • expression vectors that express candidate substances may be used.
  • a fifth invention is a living cell into which the indicator of the first invention has been introduced.
  • the method of introducing the indicator is not particularly limited, and the indicator may be introduced into the living cell by introducing an expression vector that expresses the indicator into the living cell.
  • the living cell has an expression vector that expresses the indicator of the first invention.
  • the expression vector may be outside the genome of the living cell or introduced into the genome.
  • the cell according to the fifth aspect of the invention can be used effectively for the screening of the fourth aspect of the invention.
  • a sixth invention is a multicellular organism individual in which living cells into which the indicator of the first invention has been introduced constitute a part or all of the body.
  • the individual multicellular organism may be a plant or an animal such as a mouse.
  • the method for producing this multicellular animal individual is not particularly limited, and a living cell into which an indicator is introduced may be transplanted into an individual, and a living cell into which an indicator is introduced may be used.
  • a transgenic individual having live cells introduced with an indicator that may be a chimeric individual may be produced.
  • the method for producing the transgenic individual is not particularly limited, and germline produced using ES cells into which an indicator that expresses the indicator can be microinjected into a gamete.
  • Transgenic individuals may be produced from chimeric individuals.
  • a multicellular organism individual who is eager for the sixth invention can be used effectively for the screening of the fourth invention and the like.
  • a vector expressing the phosphorylated indicator whose structure is illustrated in FIG. 1 was constructed as follows.
  • the elements of the indicator are as follows.
  • Reporter molecule firefly luciferase (SEQ ID NO: 1)
  • V5 tag layout IJ (SEQ ID NO: 2)
  • Substrate sequence substrate sequence of insulin receptor for protein kinase (SEQ ID NO: 3)
  • SH2 domain of phosphatidinoreinositol 3-kinase that binds to the above substrate sequence in a phosphorylation-dependent manner SEQ ID NO: 4
  • a fragment containing the coding sequence of the proteolytic signal sequence was prepared by PCR using human ubiquitin cDNA as a saddle and the following primers.
  • Primer 1 (SEQ ID NO: 6)
  • Primer 2 (SEQ ID NO: 7)
  • a fragment containing the spacer / phosphorylation recognition domain / spacer 1 coding sequence was prepared by PCR using the following primers with the cDNA of SH2 domain of ushi PI3K as a saddle.
  • Primer 3 (SEQ ID NO: 8)
  • Primer 4 (SEQ ID NO: 9)
  • a fragment containing the coding sequence of firefly luciferase was prepared by PCR using a commercially available firefly luciferase cDNA (Promega) as a cage and the following primers.
  • Primer 5 (SEQ ID NO: 10)
  • the indicator configured as described above stabilizes and accumulates when phosphorylated by the insulin receptor, and can detect phosphorylation as an increase in the amount of luminescence.
  • the expression vector is introduced into CHO-IR cells (cells expressing insulin receptor), indicator is expressed, and insulin (final concentration 100 nM) is added to the medium to stimulate the cells. did. Insulin stimulation activates the insulin receptor, and the substrate sequence of the indicator is phosphorylated.
  • the indicator is indeed phosphorylated by the insulin receptor. This was confirmed by estan blotting ( Figure 3). It was also confirmed by Western blotting that the indicator was stabilized by phosphorylation and the amount of the indicator increased in the cells (Fig. 3). Specifically, anti-V5 antibody (Invitrogen) for detecting the expression indicator, and the phosphorylated indica on the blots of cell extracts 1, 2, and 4 hours after insulin stimulation. An indicator and a phosphorylated indicator were detected using an anti-PY20 antibody (Santa Cruz Biotechnology), which is an anti-phosphotyrosine antibody (pTyr) for detecting one ter.
  • a yellow fluorescent protein (YFP: SEQ ID NO: 12) was used instead of firefly luciferase as a reporter possessed by the indicator.
  • PCR was carried out using a plasmid containing YFP cDNA as a cage and the following two primers.
  • a vector that expresses the Sall / EcoRI DNA fragment obtained by restriction enzyme treatment of the coding sequence of YFP thus obtained with Sall / EcoRI and the indicator that has the firefly luciferase prepared in Example 1 is Hindlll / Sall.
  • Hindlll / Sall DNA fragment obtained by restriction enzyme treatment in Step 1 By inserting the Hindlll / Sall DNA fragment obtained by restriction enzyme treatment in Step 1, into a pcDNA3.1 / V5_His A vector treated with Hindlll / EcoRI, an indicator containing YFP was prepared. This indicator was introduced into CHO-IR cells as in Example 1, and the cells were stimulated with insulin (final concentration 100 nM). The time course of YFP fluorescence (535 nm) generated during this process was observed with a fluorescence microscope (Fig. 4).
  • Firefly luciferase is composed of 544 amino acids, whereas YFP is less than half that of 238 amino acids. It functions as a reporter even though the structures of both are completely different. Therefore, the reporter possessed by the indicator of the present invention is not particularly limited, and a wide general reporter can be used.
  • phosphorylation by protein kinase Akt was detected using the following sequences as substrate sequences and phosphorylation recognition domains.
  • Substrate sequence substrate sequence of protein kinase Akt (SEQ ID NO: 15)
  • 'Phosphorylation recognition domain 14-3-3 domain of phosphorylated serine binding domain that binds to the substrate sequence in a phosphorylation-dependent manner (SEQ ID NO: 16)
  • a fragment containing the coding sequence of the proteolytic signal sequence was prepared by PCR using human ubiquitin cDNA as a saddle and the following primers.
  • the 14-3-3 domain was prepared by PCR using the cDNA of the ushi 14-3-3eta gene as a saddle and using the following primers.
  • the indicator prepared in this way is introduced into CH ⁇ -EGFR cells using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) and expressed, and then epidermal growth factor cells (EGF) (final concentration 50 ng / mL) are added to the medium.
  • EGF epidermal growth factor cells
  • the cells were stimulated to activate Akt in the cells.
  • the substrate was added to the medium 4 hours after stimulation and the luminescence intensity of the indicator was measured, an increase in luminescence intensity of about 2.5 times was observed as shown in Fig. 5.
  • the indicator of the present invention also functions for different substrate sequences. Therefore, the indicator of the present invention can detect a wide general phosphorylation reaction, and is not particularly limited with respect to the phosphorylation reaction to be detected.
  • the expression vector encoding the indicator prepared in Example 1 was introduced into CHO-IR cells by ribofunction using Lipofectamine 2000, and selected at G418 (final concentration 0.8 mg / mL). The resulting colonies were cloned. In this way, a stable transformant (L) into which the indicator cDNA was introduced was prepared.
  • a stable transformant (LA) in which a cDNA encoding a control indicator in which the tyrosine of the phosphate accepting amino acid is altered to the alanine of the non-phosphate accepting amino acid was introduced into CHO-IR cells was similarly used. Produced.
  • group A and B PBS and insulin (1.0 IU / kg body weight) was injected intraperitoneally.
  • group C glucose (2 g / kg body weight) was injected intraperitoneally, and the reaction of the indicator by insulin secreted from the mouse spleen by the glucose was examined. After standing for 4 hours, imaging was performed using a luminescence imaging apparatus IVIS (Xenogen). The result is shown in Fig. 6.
  • the indicator of the present invention can also detect phosphorylation in cells within an animal individual.
  • the invention of the present application can be used in the basic life science field, the medical research field, the drug discovery research field, etc. related to the elucidation of the mechanisms of intracellular signal transduction and the causes of various diseases as a result of the failure.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　生細胞内における被験タンパク質のリン酸化を簡便かつ高確度で検出するためのインディケーターであって、タンパク質分解シグナル配列、リン酸化認識ドメイン、レポーター分子および被験タンパク質が、(1)タンパク質分解シグナル配列へのユビキチンの結合によってレポーター分子が分解され、かつ(2)リン酸化された被験タンパク質がリン酸化認識ドメインと結合することによってタンパク質分解シグナル配列へのユビキチン結合は阻害されるが、レポーター分子はその機能を維持するように直鎖状に連結しているタンパク質リン酸化インディケーター。

Description

明 細 書
タンパク質リン酸化インディケ一ター
技術分野
[0001] 本願発明は、タンパク質それ自体のリン酸化を検出するためのインディケ一ターに 関するものである。さらに詳しくは、本願発明は、タンパク質それ自体のリン酸化をシ グナルの有無または明瞭な大小によって検出することのできるインディケ一ターと、こ のインディケ一ターを用いてタンパク質のリン酸化を検出する方法、およびタンパク質 のリン酸化に影響を及ぼす物質をスクリーニングする方法に関するものである。
背景技術
[0002] タンパク質のリン酸化に基づく細胞内シグナル伝達は、多様な生理作用と、その破 綻の結果である様々な疾患に関与している（例えば、非特許文献 1)。従って、基礎 生命科学、医学研究はもちろんのこと、創薬の分野においてもタンパク質のリン酸化 は重要なターゲットとなっている。
[0003] タンパク質のリン酸化を検出する手段としては、リン酸化タンパク質またはリン酸化 アミノ酸残基を特異的に認識する抗体プローブを利用した方法が知られている。
[0004] し力、しながら、この抗体プローブを用いた免疫化学的方法では、タンパク質のリン酸 化は抗体との結合を介して検出されるのであり、生細胞内においてタンパク質のリン 酸化を直接検出することは困難である。そのため、抗体プローブを用いた方法は、基 本的には、固定した細胞でタンパク質のリン酸化を検出したり、細胞から単離したタン パク質のリン酸化を in vitroで検出したりする方法であり、生細胞内における機能性タ ンパク質のリン酸化を in vivoで検出するには適していない。
[0005] これに対して、特許文献 1、 2は、タンパク質それ自体のリン酸化または脱リン酸化を 可視的なシグナルの変化として検出することのできるインディケ一ターを開示している 。この特許文献 1、 2のインディケ一ターは、リン酸化したタンパク質とその認識ドメイン が結合すると、両者にそれぞれ連結された蛍光タンパク質（ドナーおよびァクセプタ 一）が接近して蛍光共鳴エネルギー移動（FRET)が生じ、これによつてタンパク質のリ ン酸化を蛍光スペクトルの変化として検出するというものである。なお特許文献 1の発 明は、本願発明者らによるものであり、特許文献 1の発明やその効果等については 本願発明者らが著者である非特許文献 2— 4でも報告されている。
特許文献 1：国際公開 WO 02/077623 A1号パンフレット
特許文献 2：特表 2005-501525号公報
非特許文献 1 : Knight, Z.A. et al. Nature Biotechnology 21(9): 1047- 1054, 2003 非特許文献 2 : Sato, M. et al. Nature Biotechnology, 20:281-294, 2002
非特許文献 3 : Sasaki, K. et al. J. Biol. Chem., 278(33):30945- 30951, 2003 非特許文献 4 : Sato, M. and Umezawa, Y. Methods, 32:451-455, 2003
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 特許文献 1、 2の蛍光比を測定するインディケ一ターは、リン酸化を検出するための タンパク質を含んでおり、そのタンパク質のリン酸化の有無を直接的に検出すること ができる。このため、生細胞内におけるタンパク質のリン酸化の有無を判定することが 可能である。
[0007] し力 ながら、この蛍光比測定インディケ一ターの場合には、 2つの蛍光タンパク質 がそれぞれに光シグナルを持続的に発しており、リン酸化の有無は蛍光スペクトルの 変化しとして検出する必要がある。このため、蛍光シグナルの微細な変化を高精度で 測定するための機器が必要であり、また、そのような微細なシグナル変化を測定する ことによる感度の向上も注意が必要である。
[0008] そこで本願発明は、タンパク質それ自体のリン酸化の有無を、より簡便かつ高精度 に検出することのできる新しい手段を提供することを課題としている。
[0009] 本願発明は、前記の課題を解決するものとして、タンパク質それ自体のリン酸化の 有無を、シグナルの有無（ON/OFF)、あるいはシグナルの明瞭な大小によって検出 することのできる新しい手段を提供する。
[0010] すなわち、第 1の発明は、生細胞内における被験タンパク質のリン酸化を検出する ためのインディケ一ターであって、タンパク質分解シグナル配歹 lj、リン酸化認識ドメイ ン、レポーター分子および被験タンパク質力 以下の条件：
(1)タンパク質分解シグナル配列へのュビキチンの結合によってレポーター分子が分 角军されること、および
(2)リン酸化された被験タンパク質力 Sリン酸化認識ドメインと結合することによってタン パク質分解シグナル配列へのュビキチン結合は阻害されるが、レポーター分子はそ の機能を維持すること、
を満たすように直鎖状に連結していることを特徴とするタンパク質リン酸化インディケ 一ターである。
[0011] なお、本願発明において、「生細胞」とは、それ本来の機能の少なくとも一部を保持 した状態で人工的な環境下に置かれた細胞（例えば培養細胞）、あるいは多細胞生 物個体 (例えば動物個体）を構成し、かつ本来の機能の少なくとも一部を保持してい る細胞を意味する。後者において、インディケ一ターが導入された生細胞は、多細胞 生物個体の一部又は全部を構成してもよレ、。
[0012] 「被験タンパク質」とは、導入する生細胞におけるリン酸化について調べる対象であ るタンパク質である。またこの被験タンパク質は、タンパク質の全体であってもよぐリ ン酸化酵素の基質となる部分ペプチドであってもよい。
[0013] 「タンパク質分解シグナル配歹 1J」は、ュビキチンが結合し、その配列を有するタンパ ク質を分解しうるアミノ酸配列を含む分子 (ペプチド）である。
[0014] 「リン酸化認識ドメイン」とは、被験タンパク質またはその基質ペプチドのリン酸化を 認識して、リン酸化した被験タンパク質またはその基質ペプチドと結合する分子 (ぺ プチド）である。
[0015] 「レポーター分子」とは、視覚的または光学的機器によって認識しうるシグナルを発 する分子（タンパク質またはペプチド）を意味する。 「レポーター分子が分解される」と 、このシグナルは消失し、「レポーター分子がその機能を維持する」と、このシグナノレ が継続する。
[0016] さらに、「直鎖状に連結」とは、被験タンパク質のリン酸化以外の条件ではインディケ 一ターの全体が直鎖状の構造 (一次構造)を維持しており、かつ、インディケ一ターを 構成する各要素が、リンカ一等を介して互いに結合することを意味する。
[0017] そしてこのような直鎖状のインディケ一ターは、リン酸化された被験タンパク質がリン 酸化認識ドメインと結合することによってその構造を変化させ（2次構造化）、この構造 変化によって「タンパク質分解シグナル配列へのュビキチン結合が阻害」される。た だし、レポーター分子はそのシグナル発生ができる状態を継続させる。一方、被験タ ンパク質がリン酸化されない場合は、インディケ一ターは一次構造を維持するため、 タンパク質分解シグナル配列にュビキチンが結合してポリュビキチン鎖が形成され、 生細胞内に存在するプロテアソームによって分解される。インディケ一ターのレポ一 ター分子も分解され、従ってレポーター分子のシグナルも消失する。
[0018] この第 1発明の好ましい一つの態様は、 N末端から C末端方向にタンパク質分解シ ダナル配歹 1J、被験タンパク質、リン酸化認識ドメイン、レポーター分子の順で直鎖状 に連結してレ、るインディケ一ターである。
[0019] 第 2の発明は、前記第 1発明のインディケ一ターをキメラタンパク質として発現しうる ベクターであって、発現カセット内にタンパク質分解シグナル配列のコード配歹 lj、リン 酸化認識ドメインのコード配列、レポーター分子のコード配列を有し、さらに被験タン パク質のコード配列クローニング部位を備えていることを特徴とする発現ベクターであ る。
[0020] なお、第 2発明の発現ベクターは、第 1発明のインディケ一ターを遺伝子工学的に 作成するためのツールとしての、または第 1発明のインディケ一ターを生細胞内に導 入するためのツールとしてのベクターである。この発現ベクターにおける「発現カセッ ト」とは、ベクター構築物の一部であって、インディケ一ターを一つのタンパク質（キメ ラタンパク質）として発現するために必要な要素を備えたポリヌクレオチドを意味する 。発現カセットは、例えば、前記の全コード配列上流には「転写制御配列（プロモータ 一/ェンハンサ一）」や、下流には「ポリ A付カ卩シグナル」を備えている。
[0021] 「キメラタンパク質」とは、第 1発明のインディケ一ターを構成する各要素（ペプチドま たはタンパク質）が結合した複合体タンパク質を意味する。
[0022] さらに「コード配歹 1 とは、インディケ一ターを構成する各要素（ペプチドまたはタン パク質）をコードしてレ、るヌクレオチド鎖（ポリヌクレオチド）である。
[0023] 第 2発明の好ましい態様の一つは、発現カセットにおいて、 5'から 3'方向にタンパ ク質分解シグナル配列のコード配歹' J、被験タンパク質のコード配列クローニングサイト 、リン酸化認識ドメインのコード酉己列、レポーター分子のコード配列が、この順で連結 されてレ、る発現ベクターである。
[0024] 第 3の発明は、生細胞内における被験タンパク質のリン酸化を検出する方法であつ て、第 1発明のインディケ一ターを生細胞内に導入し、このインディケ一ターのレポ一 ター分子から生じるシグナルを測定し、シグナルが増加した場合には被験タンパク質 カ^ン酸化されていると判定することを特徴とするリン酸化検出方法である。
[0025] この第 3発明の方法における好ましい態様の一つは、前記第 2発明の発現ベクター に被験タンパク質のコード配列をクローユングし、この組換え発現ベクターを生細胞 内に導入することによってインディケ一ターを生細胞内に導入するリン酸化検出方法 である。
[0026] 第 4の発明は、被験タンパク質のリン酸化に影響を及ぼす物質をスクリーニングする 方法であって、前記第 1発明のインディケ一ターを生細胞内に導入し、このインディケ 一ターのレポーター分子から生じるシグナルを測定し、候補物質をその生細胞内に 導入したときシグナルが増加した場合には候補物質が被験タンパク質のリン酸化を 促進する物質であり、シグナルが減少した場合には候補物質が被験タンパク質のリン 酸化を抑制する物質であると判定することを特徴とするスクリーニング方法である。
[0027] この第 4発明における好ましい態様の一つは、前記第 2発明の発現ベクターに被験 タンパク質のコード配列をクローニングし、この組換え発現ベクターを生細胞内に導 入することによってインディケ一ターを生細胞内に導入するスクリーニング方法である
[0028] なお、第 3発明および第 4発明における「シグナルの増カロ」、「シグナルの減少」とは 、例えば測定コントロール条件との対比における増カロ、減少である。コントロール条件 は、検出の対象やスクリーニング方法において特定すべき候補物質の特性、あるい はインディケ一ターの細胞内導入形態等に応じて適宜に設定される。
[0029] 第 5の発明は、第 1の発明のインディケ一ターが導入された生細胞である。この生細 胞は、前記第 1発明のインディケ一ターを発現するための発現ベクターが導入されて いてもよい。
[0030] 第 6の発明は、第 1の発明インディケ一ターが導入された生細胞が体の一部又は全 部を構成する多細胞生物個体である。ここで、多細胞生物個体は動物であっても植 物であってもよぐ特に限定されない。
[0031] 以上の各発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例 において詳しく説明する。また本願発明を実施するために使用する様々な技術は、 特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれ ば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術 は Sambrook and Mamatis, in Molecularし lonmg_A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等の記載事項を参 考とすることができる。さらに、この発明における用語は基本的には IUPAC-IUB Com mission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるレヽは当該技 "分野にお レ、て慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
発明の効果
[0032] 本願発明によれば、生細胞内におけるタンパク質それ自体のリン酸化の有無力 タ ンパク質に付属したレポーター分子のシグナルの有無、あるいはシグナルの明瞭な 大小として検出することが可能である。これによつて、タンパク質のリン酸化が極めて 簡便な手続で高精度に検出することが可能となり、細胞内シグナル伝達のメカニズム や、その破綻の結果としての各種疾患原因の解明に大きく貢献する。また、各種疾 患の治療法や治療薬剤を開発するための有効なツールとなりうる。
図面の簡単な説明
[0033] [図 1]図 1は、本願発明のリン酸化インディケ一ターの構成例と、このインディケ一ター によるリン酸化検出の原理を示す。（a)は被験タンパク質 (基質配列）がリン酸化され ずに、インディケ一ターがュビキチン/プロテアソームシステムによって分解され、レ ポーター分子からのシグナルが消失する場合、（b)は基質配列がリン酸化されてレポ 一ター分子からのシグナルが継続して発せられる場合をそれぞれ示す。
[図 2]図 2は、実施例 1のインディケ一ターのルシフェラーゼ発光強度である。インスリ ンを加えていないときの発光強度を 1とした相対値で表した。 白バーはインディケータ 一の場合、黒バーはコントロールである。
[図 3]図 3は、実施例 1のインディケ一ターの細胞内発現量を調べたウェスタンブロッ ティングの結果である。インディケ一ターの C末端に V5ェピトープタグを施してあるの で、抗 V5抗体でウェスタンブロッテイングしたものはインディケ一ターの全量を、抗リン 酸化チロシン抗体（pTyr)でウェスタンブロッテイングしたものはリン酸化されているィ ンディケ一ターの量を示してレ、る。
[図 4]図 4は、実施例 2のインディケ一ターの YFP発光を蛍光顕微鏡で観察した写真 である。 白く写っているのが蛍光シグナルである。
[図 5]図 5は、実施例 3のインディケ一ターのルシフェラーゼ発光強度である。 EGFを 加えていないときの発光強度を 1とした相対値で表した。
[図 6]図 6は、実施例 4のインディケ一ターを有する細胞を移植されたマウス個体にお ける発光を観察した写真である。
[図 7]図 7は、実施例 4の個体で観察された発光強度を数値化し、各群において、体 左側（LA)の発光に対する体右側（L)における発光強度の比を示した。
発明を実施するための最良の形態
[0034] 第 1発明のインディケ一ターは、タンパク質分解シグナル配歹 U、リン酸化認識ドメイ ン、レポーター分子および被験タンパク質が直鎖状に連結してレ、る。
[0035] タンパク質分解シグナル配列としては、ュビキチンリガーゼによってュビキチン化さ れる配列であれば特段の制限なぐ公知のュビキチンィ匕配列を使用することができる
[0036] リン酸化認識ドメインは、被験タンパク質との関係において選択する。例えば、被験 タンパク質がセリン/スレオニンキナーゼによりリン酸化される場合は、ホスホセリンま たはホスホスレオニンまたはその両方と結合できるようなホスホアミノ酸結合ドメイン（ 例えば 14-3-3ドメインや forkhead-associated domain)を選択する。被験タンパク質が チロシンキナーゼによりリン酸化される場合は、ホスホチロシンと結合するようなホスホ アミノ酸結合ドメイン (例えば Srcホモロジ一ドメイン- 2(SH2)や PTBドメイン）を選択する
[0037] レポーター分子としては、発光タンパク質 (例えば、ホタルルシフェラーゼ、クリックビ 一トルルシフェラーゼ、ゥミシィタケルシフェラーゼゃそれらの変異体等）、蛍光タンパ ク質 (例えば、 GFP、 CFP、 YFP、 RFPやそれらの変異体等）から適宜に選択して用い ること力 Sできる。また、鉄貯蔵タンパク質フェリチンを用いた場合には、 Magnetic reson ance imaging (MRI)によって可視化することもできる。
[0038] インディケ一ターのこれらの各要素は、以下の条件を満たすように連結される。（1)タ ンパク質分解シグナル配列へのュビキチンの結合によってレポーター分子が分解さ れる。すなわちこのインディケ一ターは、タンパク質分解シグナル配列にュビキチン が結合することによって、インディケ一ター全体 (少なくともレポーター分子）が分解さ れるような構成をとる必要がある。（2)リン酸化された被験タンパク質力 Sリン酸化認識ド メインと結合することによってタンパク質分解シグナル配列へのュビキチン結合は阻 害されるが、レポーター分子はその機能を維持する。
[0039] 図 1は、このような条件を満たす好ましい構成例である。この図 1の例では、 N末端 力 C末端方向にタンパク質分解シグナル配歹 lj、被験タンパク質、リン酸化認識ドメィ ン、レポーター分子が直鎖状に連結している。図 1 (a)に示すように、被験タンパク質（ 基質配列）がリン酸化されない場合には、インディケ一ター全体は一次構造をとり、ュ ビキチン (Ub)の結合によって、プロテアソームによる分解の対象となる。一方、図 1 (b) に示したように、基質配列がリン酸化されて認識ドメインと結合した場合には、分解シ グナルのュビキチン結合部位 (リジン残基)も認識ドメインにより被覆された状態となり
、ュビキチン結合が阻害される。結果として、インディケ一ター全体は分解されず、レ ポーター分子もそのシグナル発生機能を維持し続ける。
[0040] 以上の条件を満たすように各要素を連結してインディケ一ターを作成する場合には 、各要素（タンパク質またはペプチド）を、例えば適当なリンカ一配列を介してべプチ ド結合により連結させる。各要素は、基本的に公知のタンパク質またはペプチドであ り、既存のデータベースに登録されたアミノ酸配列に基づいて、公知のペプチド合成 法 (Memfield, R. B. J. solid phase peptide synthesis I. i e synthesis or tetrapeptide. J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963 ; Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Chan, W. C . and White, P. D. , Oxford University Press, 2000等 )に準じて作成することが出来る。あるいは、既知の配列情報に基づいて作成したォ リゴヌクレオチドプローブやプライマーを用いてプローブハイブリダィゼーシヨンや RT -PCR法により取得したそれぞれのコード配列を、 in vitro転写翻訳や宿主—ベクター 系において発現させる遺伝子組み換え技術によって取得することもできる。
[0041] インディケ一ターはまた、第 2発明の発現ベクターを用いて遺伝子工学的に作成し てもよい。
[0042] インディケ一ターを遺伝子工学的に作成するための発現ベクターは、インディケ一 ターの発現形態等に応じて公知のベクターを適宜に選択して構築することができる。
[0043] 例えば、 in vitro転写翻訳によりインディケ一ターを作成する場合には、 RNAポリメラ ーゼプロモーターを含む pKAl、 pCDM8、 pT3ZT718、 pT7/319、 pBluescriptllなど を基に発現ベクターを構築できる。微生物（大腸菌等）を宿主とする場合には、 pUC 系、 pBluescriptII、 pETベクターシリーズ、 pGEXベクターシリーズ等を使用する。真核 細胞を宿主とする場合には、例えば、 pKAl、 pCDM8、 pSVK3、 pSVL、 pBK_CMV、 p BK- RSV、 EBVベクター、 pRS、 pYE82などのベクターが使用可能である。
[0044] 発現ベクターを宿主細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポ ゾーム法、 DEAEデキストラン法など公知の方法を用いることができる。また、宿主細 胞で発現させたインディケ一ターは、公知の分離操作を組み合わせて単離精製する こと力 Sできる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵 素消化、塩析ゃ溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、 SDS -PAGE, 等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロ マトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィー（タグ配列を利用した方法など）であ る。
[0045] またこの発現ベクターの発現カセットには、インディケ一ターの各要素のコード配列 が所定の順番で組込まれている力 これらのコード配列は、リンカ一ペプチドをコード するヌクレオチド鎖によって連結されてもょレ、。このようなリンカ一ヌクレオチド鎖は、 例えば文献（Carruthers (1982) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418; Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661 ; Belousov (1997) Nucleic Acid Res. 25:344 0-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Bioche mistry 33:7886—7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enz ymol. 68: 109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22: 1859;米国特許第 4，458，066号）に記 載されているような周知の化学合成技術により、 in vitroにおいて合成することができ る。
[0046] なお、インディケ一ターを宿主細胞で発現させて作成する場合には、インディケ一 ターが宿主細胞に存在するュビキチンによって分解されないように、宿主細胞のュビ キチンシステムを阻害しておく必要がある。例えば、ュビキチンシステムに関与する酵 素（ュビキチン活性化酵素、ュビキチン結合酵素、ュビキチンリガーゼ）の不活化処 理などである。
[0047] 第 2発明の発現ベクターは、また、インディケ一ターを生細胞内に導入するための ウィルスベクターとして構築することができる。例えば、哺乳動物細胞への適用に適し たレトロウイルスベクター、ヒト免疫不全ウィルス（HIV)をベースとするベクター、レン チウイノレスベクター、アデノウイノレスベクター、アデノ随伴ウイノレスベクター、へノレぺス ウィルスベクター、ワクシニアウィルスベクターなどである（例えば、 Miller et al. BioTe chniques 7:980—990， 1992 ; Anderson et al., Nature 392:25—30 Suppl., 1998 ; Verma and Somia, Nature 389:239-242， 1997 ; Wilson, New Engl. J. Med. 334: 1185-1187， 1996等を参照）。
[0048] 以上のとおりのリン酸化インディケ一ターは、例えば、第 3発明および第 4発明の方 法に使用される。
[0049] 第 3の発明は、生細胞内における被験タンパク質のリン酸化を検出する方法であつ て、第 1発明のインディケ一ターを生細胞内に導入し、このインディケ一ターのレポ一 ター分子から生じるシグナルを測定し、シグナルが増加した場合には被験タンパク質 力 Sリン酸化されていると判定することを特徴とするリン酸化検出方法である。
[0050] ここで、シグナルが増加することの判定は、レポーター分子からのシグナルが継続（ ON)するか消失（OFF)するかの択一的結果、あるいはシグナルの明瞭な大小によつ て可能になるが、シグナルの強度を測定し、数値化することにより比較、判定してもよ レ、。シグナルが増加するか減少するかの判定に際し、例えば、明らかにシグナル強 度が増加した場合はシグナルの絶対値で被験タンパク質がリン酸化されていると判 定することができるが、弱いシグナルの増加を判定する場合は、被験タンパク質によ るシグナル強度を、例えば、リン酸化部位に変異を導入してリン酸化されないような変 異タンパク質をコントロールとし、その変異タンパク質を生細胞内に導入した時に観 察されるシグナルの強度と比較すればょレ、。
[0051] 第 1発明のインディケ一ターを生細胞内に導入するためには、例えば、脂質 (BioP
ORTER (Gene Therapy Systems社、米国）、 Chariot (Active Motiff土、米国）等）による 細胞内導入法を採用することができる。
[0052] またシグナルの測定は、レポーター分子が発するシグナルの種類に応じて、ノレミノメ ータゃ蛍光光度計、 MRI装置等、適宜な手段で行うことができる。レポーター分子が シグナルを発するのに基質が必要な場合は、適宜、生細胞に基質を供給すればよい
[0053] この第 3発明の方法によって、被験タンパク質が、ある生細胞においてリン酸化され るタンパク質であるか否かの判定を行うことができる。また、この方法における別の判 定対象は、インディケ一ターを導入した生細胞が、タンパク質リン酸化機能（キナーゼ 機能）を有しているか否かの判定である。例えば、別の生細胞でリン酸化されることが 既知である被験タンパク質のリン酸化標的アミノ酸 (例えばセリン、スレオニン、チロシ ン)を脱リン酸化した状態で生細胞に導入した場合、インディケ一ターからのシグナ ルが増加すれば、この生細胞はキナーゼ機能を有していると判定することができる。
[0054] またこの第 3発明の方法では、被験タンパク質とリン酸化認識ドメインの結合が可逆 的であることを利用して、脱リン酸化の検出も可能である。すなわち、リン酸化した被 験タンパク質と認識ドメインが結合した状態のインディケ一ターを生細胞に導入し、シ グナルが継続すれば細胞は脱リン酸化（ホスファターゼ)機能を有しておらず、シグナ ルが消失または明らかに減少すれば脱リン酸化機能が存在と判定することができる。
[0055] この第 3発明の方法における好ましい態様の一つは、前記第 2発明の発現ベクター に被験タンパク質のコード配列をクローユングし、この組換え発現ベクターを生細胞 内にトランスフエタトすることによってインディケ一ターを生細胞内に導入することであ る。例えば、前記のウィルス性発現ベクターを有するウィルスを生細胞に感染させる ことによって、インディケ一ターを生細胞内で発現させることができる。また、例えば、 発現ベクターをマイクロインジヱクシヨン法によって生細胞に導入する方法や、生体 認識分子を提示した中空ナノ粒子に発現ベクターを封入して生細胞に発現ベクター を導入することもできる。 [0056] ここで、生細胞とは、それ本来の機能の少なくとも一部を保持した状態で人工的な 環境下に置かれた細胞（例えば培養細胞）であっても、あるいは多細胞生物個体 (例 えば動物個体）を構成し、かつ本来の機能の少なくとも一部を保持している細胞であ つてもよレ、。また、多細胞生物個体の場合、インディケ一ターを導入した細胞が、移 植等により個体の一部を構成してレ、ても、個体の全部を構成してレ、てもよレ、。
[0057] 第 4の発明は、被験タンパク質のリン酸化に影響を及ぼす物質をスクリーニングする 方法であって、前記第 1発明のインディケ一ターを生細胞内に導入し、このインディケ 一ターのレポーター分子から生じるシグナルを測定し、候補物質を導入したときシグ ナルが増加した場合には候補物質が被験タンパク質のリン酸化を促進する物質であ り、シグナルが減少した場合には候補物質が被験タンパク質のリン酸化を抑制する 物質であると判定することを特徴とするスクリーニング方法である。
[0058] インディケ一ターと候補物質の導入の順番は、特定すべき候補物質の特性等に応 じて適宜とすることができる。例えば、両者を同時に生細胞内に導入してもよぐある いはインディケ一ターを先に導入し、候補物質を後で生細胞内に導入するか、また は候補物質を先に導入し、インディケ一ターを後で導入するようにしてもよい。例えば 、シグナルの増カロ'減少を判定する際、前記第 1発明のインディケ一ターを生細胞内 に導入し、このインディケ一ターのレポーター分子から生じるシグナルを測定し、候補 物質をその生細胞内に導入して、候補物質の導入前後でシグナルを比較してもよく 、あるいは、インディケ一ターしか加えないコントロール実験を行い、候補物質導入の
[0059] このスクリーニング方法によって特定される物質は、被験タンパク質のリン酸化を促 進するか、抑制する物質である。例えば、生細胞のキナーゼ機能を欠損させた状態 で候補物質を作用させた場合に、インディケ一ターからのシグナルが増加すれば、こ の候補物質はキナーゼ様のリン酸化機能を有する物質と判定することができる。また 、キナーゼ機能を有する細胞に候補物質を作用された場合に、コントロールと比較し て強いシグナルが生じた場合には、この候補物質はキナーゼを活性化させる物質で あると判定することができ、シグナルが弱くなればこの候補物質はキナーゼを抑制さ せる物質であると判定することができる。さらにまた、例えば被験タンパクが任意の刺 激によってリン酸化するものである場合、候補物質によってシグナルが観察されれば 、この候補物質はリン酸化刺激物質と同様の、あるいは刺激物質を活性化する物質 であると判定することができる。
[0060] またさらに、被験タンパク質とリン酸化認識ドメインの結合が可逆的であることを利用 すれば、脱リン酸化機能 (ホスファターゼ機能）に影響を及ぼす物質を特定することも できる。
[0061] なお、このスクリーニング方法に使用する候補物質には、例えば、有機または無機 の化合物（特に低分子量の化合物）、タンパク質、ペプチド等が含まれる。これらの物 質は、機能や構造が公知のものであって未知のものであってもよレ、。あるいは「コンビ ナトリアルケミカルライブラリー」は、 目的物質を効率的に特定するための候補物質群 として有効な手段である。コンビナトリアルケミカルライブラリ一は、化学合成または生 物学的合成により、試薬などの多くの化学的「ビルディングブロック」を結びつけること により生成される種々の化学組成物のコレクションである。例えば、ペプチドライブラリ 一などの直線的なコンビナトリアルケミカルライブラリ一は、ビルディングブロック（アミ ノ酸）のセットを、所与の化合物の長さ（すなわちペプチドのサイズ）について可能な すべての方法で結びつけることにより形成されている。化学的なビルディングブロック につレ、てのこのようなコンビナトリアルミキシングを通して、多数の化学組成物を合成 することが可能である。コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニン グは、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第 6,004,617号； 5,985,3 65号を参照）。また各種の市販ライブラリーを使用することもできる。また、タンパク質 やペプチドの場合、候補物質を発現する発現ベクターを使用してもよい。
[0062] 第 5の発明は、第 1の発明のインディケ一ターが導入された生細胞である。インディ ケーターの導入方法は特に限定されず、インディケ一ターを発現する発現ベクターを 生細胞に導入することによってインディケ一ターを生細胞に導入してもよい。その場 合、この生細胞は、前記第 1発明のインディケ一ターを発現する発現ベクターを有す る。その発現ベクターは、生細胞のゲノム外にあってもゲノムに導入されていてもよい 。この第 5の発明にかかる細胞は、第 4の発明のスクリーニング等に有効に用いること ができる。 [0063] 第 6の発明は、第 1の発明のインディケ一ターが導入された生細胞が体の一部又は 全部を構成する多細胞生物個体である。この多細胞生物個体は、植物であっても、 マウス等の動物であっても構わない。また、この多細胞動物個体の作製方法も特に 限定されず、インディケ一ターが導入された生細胞を個体に移植してもよぐインディ ケーターが導入された生細胞と導入されていない生細胞によってキメラ個体を作製し てもよぐインディケ一ターが導入された生細胞を体全体に有するトランスジヱニック 個体を作製してもよい。トランスジヱニック個体の作製方法も特に限定されず、インデ ィケーターを発現する発現ベクターを配偶子にマイクロインジェクションしてもよぐィ ンディケ一ターが導入された ES細胞を用いて作製された生殖系列キメラ個体からトラ ンスジヱニック個体を作製してもよい。この第 6の発明に力かる多細胞生物個体は、 第 4の発明のスクリーニング等に有効に用いることができる。
[0064] 以下、実施例を示して本願発明をさらに具体的に説明するが、本願発明は以下の 例によって限定されるものではない。
実施例 1
(1) 材料
図 1に構成を例示したリン酸化インディケ一ターを発現するベクターを以下のように 構築した。なお、インディケ一ターの各要素は以下のとおりである。
•レポーター分子：ホタルルシフェラーゼ（配列番号 1 )
•V5タグ配歹 IJ : (配列番号 2)
•基質配列：蛋白質リン酸化酵素のインスリン受容体の基質配列 (配列番号 3)
'リン酸化認識ドメイン:前記の基質配列にリン酸化依存的に結合するホスファチジノレ イノシトール 3-キナーゼの SH2ドメイン（配列番号 4)
'タンパク質分解シグナル配列：どの組織にでも ubiquitousに発現しているュビキチン リガーゼ (Ubrl等）によりュビキチン化される配列（配列番号 5)
まず、タンパク質分解シグナル配列のコード配列を含む断片は，ヒトュビキチンの c DNAを錡型として下記プライマーを用いて PCRにより作製した。
プライマー 1 : (配列番号 6)
プライマー 2 : (配列番号 7) 次に、スぺーサ一/リン酸化認識ドメイン/スぺーサ一のコード配列を含む断片は、 ゥシ PI3Kの SH2ドメインの cDNAを铸型として下記プライマーを用いて PCRにより作製 した。
プライマー 3 : (配列番号 8)
プライマー 4 : (配列番号 9)
ホタルルシフェラーゼのコード配列を含む断片は、市販のホタルルシフェラーゼの c DNA (Promega社）を铸型として下記プライマーを用いて PCRにより作製した。
プライマー 5 : (配列番号 10)
プライマー 6 : (配列番号 11)
なお、このように作製した各 PCRフラグメントの配列が正しい配列であることを、塩基 配列を決定することで確認した。こうして得られた各フラグメントをそれぞれ Hindin/Ba mHI、 BamHI/Sall, Sall/EcoRIで制限酵素処理して得られた各 DNA断片を、 Hindlll/ EcoRIで制限酵素処理した pcDNA3.1/V5_His Aベクターにこの順序で挿入すること により、インディケ一ターを発現するベクターを作製した。
[0065] 以上の構成からなるインディケ一ターは、インスリン受容体によりリン酸化されると安 定化して蓄積し、発光量の増大としてリン酸化を検出することができる。
(2)方法と結果
Lipofectamine2000 (Invitrogen社）を用いて発現ベクターを CHO-IR細胞（インスリン 受容体を発現する細胞）に導入し、インディケ一ターを発現させ、培地にインスリン（ 最終濃度 100 nM)を加え、細胞を刺激した。インスリン刺激によってインスリン受容体 が活性化し、インディケ一ターの基質配列がリン酸化されることになる。
[0066] インスリン刺激後 1、 2、 4時間で培地に基質を添加し発光量を測定したところ、期待 通り、発光量の増大が観察された（図 2)。対照実験として、リン酸化されるチロシン残 基をリン酸化されないァラニンにかえたコントロールインディケ一ターで同様に試験し た場合には、インスリン刺激によって発光の増大が観察されなかった（図 2)。なお、 発光量の測定には、発光測定キット (Luciferase Assay System (Promega社））を用い、 添付の使用説明書に従って行なった。
[0067] またインディケ一ターがインスリン受容体によって確かにリン酸化されていることはゥ エスタンブロッテイングにより確認した（図 3)。リン酸化によってインディケ一ターが安 定化し、細胞内でインディケ一ターの量が増加していることもウェスタンブロッテイング により確認した（図 3)。具体的には、インスリン刺激後 1、 2、 4時間の各細胞の抽出物 のブロットに対し、発現インディケ一ターを検出するための抗 V5抗体（Invitrogen社）と 、そのうちリン酸化されているインディケ一ターを検出するための抗リン酸化チロシン 抗体（pTyr)である抗 PY20抗体（Santa Cruz Biotechnology社）を用いて、インディケ 一ター及びリン酸化インディケ一ターを検出した。
実施例 2
本実施例では、インディケ一ターが有するレポーターとして、ホタルルシフェラーゼ の代わりに黄色蛍光蛋白質（Yellow fluorescent protein; YFP :配列番号 12)を用レヽ た。
[0068] まず、 YFPの cDNAを有するプラスミドを錡型として以下の二つのプライマーを用レヽ て PCRを行った。
プライマー 7 : (配列番号 13)
プライマー 8 : (配列番号 14)
なお、作製した各 PCRフラグメントの配列が正しい配列であることを塩基配列を決定 することで確認した。こうして得られた YFPのコード配列を Sall/EcoRIで制限酵素処理 して得た Sall/EcoRI DNA断片、及び、実施例 1で作製した、ホタルルシフェラーゼを 有するインディケ一ターを発現するベクターを Hindlll/Sallで制限酵素処理して得た H indlll/Sall DNA断片を、 Hindlll/EcoRIで制限酵素処理した pcDNA3.1/V5_His Aベタ ターに挿入することにより、 YFPを含むインディケ一ターを作製した。このインディケ一 ターを、実施例 1と同様に CHO-IR細胞に導入し、インスリン (最終濃度 100 nM)で細 胞を刺激した。その際に生じた YFPの蛍光（535 nm)の時間経過を蛍光顕微鏡で観 察した（図 4)。
[0069] 細胞からの蛍光は、インスリン刺激前には観察されず、インスリン刺激後 2時間後か ら観察され、 6時間まで蛍光が増強した。このように、インディケ一ターが有するレポ 一ターとして、ホタルルシフェラーゼのみならず、 YFPも利用できた。
[0070] ホタルルシフェラーゼは 544アミノ酸からなるのに対し、 YFPはその半分以下の 238ァ ミノ酸力らなり、両者の構造は全く相違するにもかかわらず、レポーターとして機能す る。従って、本発明のインディケ一ターが有するレポーターは、特に限定されることな ぐ広く一般的なレポーターを利用できる。
実施例 3
本実施例では、基質配列およびリン酸化認識ドメインとして下記の配列を用い、蛋 白質リン酸化酵素 Aktによるリン酸化の検出を行なった。
•基質配列：蛋白質リン酸化酵素 Aktの基質配列（配列番号 15)
'リン酸化認識ドメイン:前記の基質配列にリン酸化依存的に結合するリン酸化セリン 結合ドメインの 14-3-3ドメイン (配列番号 16)
タンパク質分解シグナル配列のコード配列を含む断片は、ヒトュビキチンの cDNAを 铸型として下記プライマーを用いて PCRにより作製した。
プライマー 9 : (配列番号 17)
プライマー 10 : (配列番号 18)
また、 14-3-3ドメインは、ゥシ 14-3-3eta遺伝子の cDNAを铸型として、下記プライマ 一を用いて PCRによって作製した。
プライマー 11 : (配列番号 19)
プライマー 12 : (配列番号 20)
なお、作製した各 PCRフラグメントの配列が正しい配列であることを塩基配列を決定 することで確認した。こうして得られた各 DNA断片を、それぞれ HindIII/BamHI、 BamH I/Sallで制限酵素処理して得た各 DNA断片と、実施例 1で作製したルシフェラーゼの Sall/EcoRI DNA断片とを、 Hindlll/EcoRIで制限酵素処理した pcDNA3.1/V5_His A ベクターに揷入し、 Aktによるリン酸化の検出を行うためのインディケ一ターを作製し た。
こうして作製したインディケ一ターを、 Lipofectamine2000 (Invitrogen社）を用いて CH ◦-EGFR細胞に導入し発現させた後、培地に上皮成長因子細胞（EGF) (最終濃度 5 0 ng/mL)を添加して細胞を刺激し、細胞内の Aktを活性化させた。刺激後 4時間で 培地に基質を添加し、インディケ一ターの発光強度を測定したところ、図 5に示すよう に 2. 5倍程度の発光強度の増加が観察された。また、 EGFと共に、ホスファチジルイ ノシトール 3-キナーゼの阻害剤で、 Aktの活性化を抑制する化合物 LY294, 002 (最終 濃度 30 μ Μ)を添加すると、 EGF刺激によるインディケ一ターの発光強度の増加が 抑制された。この対照実験は、インディケ一ターの発光強度の増加力 Aktによるイン ディケ一ターのリン酸化によることを示してレ、る。
[0072] このように、本発明のインディケ一ターは、異なる基質配列に対しても機能する。従 つて、本発明のインディケ一ターは、広く一般的なリン酸化反応を検出でき、検出す るリン酸化反応に関して特に限定されない。
実施例 4
本実施例では、インディケ一ターを有する細胞をマウス個体に移植し、実際に個体 中で細胞内でのリン酸化を検出できることを確認した。
[0073] まず、実施例 1で作製したインディケ一ターをコードする発現ベクターを Lipofectami ne2000を用いたリボフヱクシヨンによって、 CHO-IR細胞に導入し、 G418 (最終濃度 0. 8 mg/mL)で選択して得られたコロニーをクローン化した。このようにして、インディケ 一ターの cDNAを導入した stable transformant (L)を作製した。一方、コントロール細 胞として、リン酸受容アミノ酸のチロシンをリン酸非受容アミノ酸のァラニンに改変した コントロールのインディケ一ターをコードする cDNAを CHO-IR細胞に導入した stable t ransformant (LA)を同様に作製した。これらの細胞をスクレイパーで培養用フラスコか ら剥がし、 PBSで 107 cells/ mLの細胞懸濁液を調製した。 Lおよび LAの懸濁液を、 15 匹の BALB/ c-皿雌マウス（6週齢）のそれぞれ右側（図 6では Lと示す）および左側（ 図 6では LAと示す）の大腿部付け根 (背面）の皮下 1 mmに 100 μ Lずつ（細胞数は 1 06個）注入し、これらのマウスをそれぞれ 5匹ずつ A〜C群に分けた。 D-Luciferin (150 mg/kg)をマウスに腹腔内注射するとともに、移植細胞のインスリンレセプターを刺激 し、インディケ一ターをリン酸化するため、 A群および B群に、それぞれ PBSおよびイン シュリン（1.0 IU/kg体重）を腹腔内注射した。 C群においては、グルコース（2 g/kg体 重）を腹腔内注射し、そのグルコースによってマウスの瞎臓から分泌されるインスリン によるインディケ一ターの反応を調べた。 4時間放置後、発光イメージング装置 IVIS ( Xenogen社）を用いてイメージングを行った。その結果を図 6に示す。
[0074] A群では、発光強度の増加はほとんど観察されなかった力 B群および C群では、発 光強度の増加が観察され、コントローノレ (LA)に対する Lの発光強度は、それぞれ、 約 3倍弱（B群）、 1. 5倍 (C群)であった（図 7)。
このこと力ら、本発明のインディケ一ターは、動物個体内の細胞におけるリン酸化も 検出できることがわかる。
産業上の利用可能性
本願発明は、細胞内シグナル伝達のメカニズムや、その破綻の結果としての各種 疾患原因の解明に係わる基礎生命科学分野や医学研究分野、あるいは創薬研究分 野等において利用可能である。

Claims

請求の範囲 [1] 生細胞内における被験タンパク質のリン酸化を検出するためのインディケ一ターであ つて、タンパク質分解シグナル配歹 IJ、リン酸化認識ドメイン、レポーター分子および被 験タンパク質が、以下の条件：
(1)タンパク質分解シグナル配列へのュビキチンの結合によってレポーター分子が分 角军されること、および
(2)リン酸化された被験タンパク質力 Sリン酸化認識ドメインと結合することによってタン パク質分解シグナル配列へのュビキチン結合は阻害されるが、レポーター分子はそ の機能を維持すること、
を満たすように直鎖状に連結していることを特徴とするタンパク質リン酸化インディケ
~タ^ ~
[2] N末端から C末端方向にタンパク質分解シグナル配列、被験タンパク質、リン酸化認 識ドメイン、レポーター分子の順で直鎖状に連結している請求項 1のインディケータ
[3] 前記生細胞が、培養細胞であることを特徴とする請求項 1のインディケ一ター。
[4] 前記生細胞が、多細胞生物個体の一部または全部を構成することを特徴とする請求 項 1のインディケ一ター。
[5] 請求項 1のインディケ一ターをキメラタンパク質として発現しうるベクターであって、発 現カセット内にタンパク質分解シグナル配列のコード配歹 ij、リン酸化認識ドメインのコ ード配列、レポーター分子のコード配列を有し、さらに被験タンパク質のコード配列ク ローニング部位を備えていることを特徴とする発現ベクター。
[6] 発現カセットにおいて、 5 'から 3 '方向にタンパク質分解シグナル配列のコード配列、 被験タンパク質のコード配列クローニングサイト、リン酸化認識ドメインのコード配歹 IJ、 レポーター分子のコード配列が、この順で連結されている請求項 5の発現ベクター。
[7] 請求項 1または 2記載のインディケ一ターが導入された生細胞。
[8] 請求項 1または 2記載のインディケ一ターが導入された生細胞が体の一部又は全部 を構成する多細胞生物個体。
[9] 生細胞内における被験タンパク質のリン酸化を検出する方法であって、請求項 1また は 2記載のインディケ一ターを生細胞内に導入し、このインディケ一ターのレポーター 分子から生じるシグナルを測定し、シグナルが増加した場合には、当該生細胞内で 被験タンパク質カ^ン酸化されていると判定することを特徴とするリン酸化検出方法。
[10] 請求項 5または 6記載の発現ベクターに被験タンパク質のコード配列をクローニング し、この組換え発現ベクターを生細胞内に導入することによってインディケ一ターを生 細胞内に導入する請求項 9のリン酸化検出方法。
[11] 前記生細胞が、培養細胞であることを特徴とする請求項 9のリン酸化検出方法。
[12] 前記生細胞が、多細胞生物個体の一部または全部を構成することを特徴とする請求 項 9のリン酸化検出方法。
[13] 被験タンパク質のリン酸化に影響を及ぼす物質をスクリーニングする方法であって、 請求項 1または 2記載のインディケ一ターを生細胞内に導入し、このインディケ一ター のレポーター分子から生じるシグナルを測定し、候補物質を生細胞に導入したときに 、シグナルが増加した場合には候補物質が被験タンパク質のリン酸化を促進する物 質であり、シグナルが減少した場合には候補物質が被験タンパク質のリン酸化を抑 制する物質であると判定することを特徴とするスクリーニング方法。
[14] 請求項 5または 6記載の発現ベクターに被験タンパク質のコード配列をクローニング し、この組換え発現ベクターを生細胞内に導入することによってインディケ一ターを生 細胞内に導入する請求項 13のスクリーニング方法。
PCT/JP2007/054333 2006-03-06 2007-03-06 タンパク質リン酸化インディケーター WO2007102507A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006059615 2006-03-06
JP2006-059615 2006-03-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007102507A1 true WO2007102507A1 (ja) 2007-09-13

Family

ID=38474934

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2007/054333 WO2007102507A1 (ja) 2006-03-06 2007-03-06 タンパク質リン酸化インディケーター

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2007102507A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009278942A (ja) * 2008-05-23 2009-12-03 Hokkaido Univ Ｂｃｒ−ａｂｌチロシンキナーゼ活性測定用試薬

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000325086A (ja) * 1999-05-21 2000-11-28 Igaku Seibutsugaku Kenkyusho:Kk リン酸化酵素活性の測定方法
WO2002077623A1 (en) * 2001-03-23 2002-10-03 Japan Science And Technology Corporation Probe for visualizing phosphorylation/dephosphorylation of protein and method of detecting and quantifying phosphorylation/dephosphorylation of protein
US20030170611A1 (en) * 2002-03-09 2003-09-11 Cardone Michael H. Cell-based screening methods
US20030170850A1 (en) * 2002-03-09 2003-09-11 Cardone Michael H. Cell-based screening methods
JP2005501525A (ja) * 2001-05-24 2005-01-20 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ カリフォルニア リン酸化の蛍光比測定インディケーター
WO2005019447A1 (ja) * 2003-08-26 2005-03-03 Japan Science And Technology Agency 単色蛍光プローブ
WO2005116267A2 (en) * 2004-05-28 2005-12-08 The Regents Of The University Of California Emission ratiometric indicators of phosphorylation by c-kinase
JP2006061073A (ja) * 2004-08-26 2006-03-09 National Institute Of Agrobiological Sciences ユビキチン依存型タンパク質分解系を利用した生体内タンパク質分解システム，及びそのシステムを利用したタンパク質の機能解明方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000325086A (ja) * 1999-05-21 2000-11-28 Igaku Seibutsugaku Kenkyusho:Kk リン酸化酵素活性の測定方法
WO2002077623A1 (en) * 2001-03-23 2002-10-03 Japan Science And Technology Corporation Probe for visualizing phosphorylation/dephosphorylation of protein and method of detecting and quantifying phosphorylation/dephosphorylation of protein
JP2005501525A (ja) * 2001-05-24 2005-01-20 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ カリフォルニア リン酸化の蛍光比測定インディケーター
US20030170611A1 (en) * 2002-03-09 2003-09-11 Cardone Michael H. Cell-based screening methods
US20030170850A1 (en) * 2002-03-09 2003-09-11 Cardone Michael H. Cell-based screening methods
WO2005019447A1 (ja) * 2003-08-26 2005-03-03 Japan Science And Technology Agency 単色蛍光プローブ
WO2005116267A2 (en) * 2004-05-28 2005-12-08 The Regents Of The University Of California Emission ratiometric indicators of phosphorylation by c-kinase
JP2006061073A (ja) * 2004-08-26 2006-03-09 National Institute Of Agrobiological Sciences ユビキチン依存型タンパク質分解系を利用した生体内タンパク質分解システム，及びそのシステムを利用したタンパク質の機能解明方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAWAI Y. ET AL.: "Ikita Saibonai de Fukusu no Tanpakushitsu Phosphorylation Koso no Kassei o Doji ni Kansatsu suru Tameno Tanshoku Keiko Probe Bunshi no Kaihatsu", THE JAPAN SOCIETY FOR ANALYTICAL CHEMISTRY NENKAI KOEN YOSHISHU, vol. 52ND, 2003, pages 240 + ABSTR. NO. 3K10, XP003017663 *
SATO M. ET AL.: "Saibonai no Tanpakushitsu Phosphorylation o Ikitamama Kansatsu suru", GENDAI KAGAKU, no. 377, 2002, pages 48 - 54, XP003017662 *
UMEZAWA Y. ET AL.: "Seisaibonai Joho Dentatsu no Keiko Kashika Probe", BUNSEKI, no. 1, 2003, pages 18 - 25, XP003017661 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009278942A (ja) * 2008-05-23 2009-12-03 Hokkaido Univ Ｂｃｒ−ａｂｌチロシンキナーゼ活性測定用試薬

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6684857B2 (ja) ダイナミックｂｈ３プロファイリング
EP4049032A1 (en) Indicator compounds, devices comprising indicator compounds, and methods of making and using the same
KR101151805B1 (ko) 바이포달 펩타이드 바인더
US20020192721A1 (en) Modular molecular clasps and uses thereof
JP5802674B2 (ja) 蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型ｆｒｅｔバイオセンサーのリンカー
CN103298938B (zh) 氧化应激指示物表达用核酸构建物及其应用
JP5143552B2 (ja) 細胞周期フェーズマーカー
JP2006515743A (ja) プロテインキナーゼＡアンカー蛋白の新規なスプライシング変異体ＡＫＡＰ１８δおよびその使用
JP5553326B2 (ja) 一分子型プローブ及びその利用
JP4271026B2 (ja) アクチン重合状態の調節剤を含む腫瘍病変の診断、予防又は治療用の薬剤組成物
WO2007102507A1 (ja) タンパク質リン酸化インディケーター
US20070231835A1 (en) Proteomic Screening for Redox State Dependent Protein-Protein Interactions
US11579149B2 (en) Hippo pathway bioluminescent biosensor
KR20120115022A (ko) 타겟 친화도가 유지되고 안정성이 개선된 ｄ－앱타이드
JP5665262B2 (ja) Ｂｃｒ−ａｂｌチロシンキナーゼ活性測定用試薬
JPWO2005019447A1 (ja) 単色蛍光プローブ
WO2020028381A1 (en) Biosensors for detecting arrestin signaling
KR20200037522A (ko) 세포내 타우-튜불린의 상호작용을 모니터링하기 위한 이분자 형광 상보성 아미노산 서열 쌍
US20030211523A1 (en) Two-hybrid double screening system and method
Ou et al. Role of a conserved amino-terminal sequence in the ecotropic MLV receptor mCAT1
JP2008224277A (ja) 過酸化水素インディケーター
EP1716177B1 (en) Cytochrome c protein and assay
WO2024058178A1 (ja) チロシンキナーゼ活性測定のための試薬及びその利用
WO2023192915A1 (en) Monobodies selective to nras
CN115786373A (zh) 一种用于检测protac分子的重组核酸分子

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 07737880

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP