JP5802674B2 - 蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型ｆｒｅｔバイオセンサーのリンカー - Google Patents

Description

本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを最適化するためのリンカー、該リンカーを含むバイオセンサー、該リンカー又は一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーをコードする遺伝子、該リンカー又は一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを含む発現ベクター、該発現ベクターを有する形質転換された細胞およびトランスジェニック非ヒト動物、前記バイオセンサーを用いる測定方法に関する。

蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、以下ＦＲＥＴと称することがある）の原理と蛍光蛋白とを利用したバイオセンサーが生命科学の分野において急速に広がっている（例えば非特許文献１−４参照）。

ＦＲＥＴとは、励起状態にある蛍光分子（ドナー：エネルギー供与体）からごく近傍の蛍光分子（アクセプター：エネルギー受容体）へ励起エネルギーが移動する現象のことである。ＦＲＥＴを利用したバイオセンサーの普及には、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）の色変異体の出現やそれらの改良が大きく寄与している。現在、多くの場合、ＧＦＰ変異体であるＣＦＰ（シアン蛍光蛋白）とＹＦＰ（黄色蛍光蛋白）とがドナーおよびアクセプター蛍光タンパク質として利用されている。

蛍光タンパク質を用いたＦＲＥＴバイオセンサーの系は、二分子型ＦＲＥＴバイオセンサー（図１）と一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー（図２）に大別される。二分子型ＦＲＥＴバイオセンサーは分子間相互作用を検出するものであり、一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーは分子の構造変化を検出するものである（例えば非特許文献１−４参照）。

このうち、１分子型のバイオセンサー（一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー）は、イオン、糖、脂質などの低分子の定量や、低分子量ＧＴＰ結合タンパク、リン酸化酵素などの活性測定に用いられるものが開発されている（例えば非特許文献４参照）。
しかし、このバイオセンサー作成のためには、少なくとも３つ、多くの場合４つ以上のタンパク質ドメインを結合する必要があり、それらを単に結合しただけでは通常、十分な感度を有する一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを作成することはできない。すなわち、このような一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを作成するためには、ｉ）ドナー蛍光タンパク質の発光スペクトラムとアクセプター蛍光タンパク質の吸光スペクトラムとの重なり、ii）ドナー蛍光タンパク質とアクセプター蛍光タンパク質間の距離、iii）ドナー蛍光タンパク質の発光モーメントとアクセプター蛍光タンパク質の吸光モーメントの配向の３因子を考慮しなければならない。また、蛍光タンパク質を他のタンパク質と融合する場合、他のタンパク質と融合することがストレスとなって蛍光タンパク質のミスフォールディングが生じ、その結果、発色団形成の効率が低下し、無蛍光となる可能性をも考慮しなければならない。このように、ドナー蛍光タンパク質とアクセプター蛍光タンパク質を利用して両者間にＦＲＥＴの良好な発現を生じさせるには厳格な条件が存在し、両者間の配置等に一定の規則も見出されていないため、作成する一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーごとに、それぞれのタンパク質ドメインの長さや、ドメイン間のリンカー配列などをさまざまに変更させて、至適なものを作成することが行われているが、これには、多くの試行錯誤や複雑高度の実験等を要し、十分な感度を有する一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーの開発は非常な困難を伴うものであった。

各ドメインをつなぐリンカーとしては、９アミノ酸のグリシン、セリン、スレオニンからなるものや（例えば非特許文献５参照）、７２アミノ酸のグリシンリンカー（例えば非特許文献６参照）が報告されているが、十分に最適化しているとはいえなかった。また、これらのリンカーにおいては、多くの種類の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーに共通して最適化を図れるものではなかった。

Aoki, K. and M. Matsuda. 2009. Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors. Nature Protocol 4:1623-1631. Giepmans, B. N., S. R. Adams, M. H. Ellisman, and R. Y. Tsien. 2006. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science 312:217-224. Jares-Erijman, E. A. and T. M. Jovin. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. 2006. Curr.Opin.Chem.Biol. 10:409-416. Kiyokawa, E., S. Hara, T. Nakamura, and M. Matsuda. 2006. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97:8-15. Itoh, R. E., K. Kurokawa, Y. Ohba, H. Yoshizaki, N. Mochizuki, and M. Matsuda. 2002. Activation of Rac and Cdc42 video-imaged by FRET-based single-molecule probes in the membrane of living cells. Mol.Cell.Biol. 22:6582-6591. Harvey, C. D., A. G. Ehrhardt, C. Cellurale, H. Zhong, R. Yasuda, R. J. Davis, and K. Svoboda. 2008. A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.

本発明は、前記従来における問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。すなわち、本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを最適化し高感度の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを得るために広く使用することができるリンカー（以下、本明細書においては、本発明のリンカーをＥＶ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ）リンカーと称することがある）、該リンカーを含むバイオセンサー、該リンカー又はバイオセンサーをコードする遺伝子、該リンカー又はバイオセンサーを含む発現ベクター、該発現ベクターを有する形質転換された細胞およびトランスジェニック非ヒト動物、および、前記リンカーを含むバイオセンサーを用いるセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を測定するのに好適な前記一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを用いる測定方法を提供することを目的とする。

前記課題を解決するために鋭意検討したところ、一定以上の長さを有するリンカーが前記問題を解決し、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを最適化し高感度の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを得るために広く使用することができるリンカーとなることを見出した。さらに、特定のアミノ酸を一定の割合又は一定の配列の繰り返しとして含むことにより、最適化の効果が高まることを見出した。
すなわち、本発明は、一定以上の長さを有するリンカーを用いることで、一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーのゲインを低くする要因である基底状態のＦＲＥＴを、著しく低減させることができるという知見に基づくものであり、一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー作成に汎用的に用いることが出来るものである。本発明のリンカーは、前記一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーのゲインを増大させるために開発されたものであり、その技術的価値は非常に大きい。

即ち、前記課題を解決するための手段は以下のとおりである。
＜１＞ 蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーのリンカーであって、５２アミノ酸残基以上４００アミノ酸残基以下を含むポリペプチドであって、全アミノ酸残基数の少なくとも４５％がグリシン及びアラニンの少なくともいずれかであり、アラニンを全アミノ酸残基数の少なくとも１０％含むことを特徴とするリンカーである。
＜２＞ ８４アミノ酸残基以上を含むポリペプチドである前記＜１＞に記載のリンカーである。
＜３＞ セリン及びスレオニンの少なくともいずれかを全アミノ酸残基数の少なくとも１０％含む前記＜１＞又は＜２＞に記載のリンカーである。
＜４＞ 全アミノ酸残基数の少なくとも９５％がグリシン、セリン、スレオニン及びアラニンからなり、グリシンを３５から６５％、セリン及びスレオニンの少なくともいずれかを１０から４０％、アラニンを１０から４０％含む前記＜３＞に記載のリンカーである。
＜５＞ 全アミノ酸配列の少なくとも９５％がＳＡＧＧ及びＧＧＡＳのいずれかのアミノ酸配列の繰り返しからなり、ＳＡＧＧ及びＧＧＡＳのいずれかのアミノ酸配列の繰り返し単位を１３個以上１００個以下含むことを特徴とする前記＜４＞に記載のリンカーである。
＜６＞ アルギニン及びグルタミン酸の少なくともいずれかを全アミノ酸残基数の少なくとも１０％含む前記＜１＞又は＜２＞に記載のリンカーである。
＜７＞ 全アミノ酸残基数の少なくとも９５％がグリシン、アルギニン、グルタミン酸及びアラニンからなり、グリシンを４から３０％、アルギニンを５から３０％、グルタミン酸を５から３０％、及びアラニンを３０から６０％含む前記＜６＞に記載のリンカーである。
＜８＞ 前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載のリンカーをコードすることを特徴とする遺伝子である。
＜９＞ 前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載のリンカーをコードする遺伝子を含むことを特徴とする発現ベクターである。
＜１０＞ 前記＜９＞に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とする形質転換された細胞である。
＜１１＞ 前記＜９＞に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物である。
＜１２＞ 蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーであって、センサー領域、リガンド領域、アクセプター蛍光タンパク質領域、ドナー蛍光タンパク質領域、及び、該センサー領域と該リガンド領域とを連結するリンカー領域を有する融合タンパク質であり、該リンカー領域が、前記＜1＞から＜７＞のいずれかに記載のリンカーからなることを特徴とする一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーである。
＜１３＞ 該ドナー蛍光タンパク質がＹＰｅｔである前記＜１２＞に記載の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーである。
＜１４＞ 前記＜１２＞及び＜１３＞のいずれかに記載の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーをコードすることを特徴とする遺伝子である。
＜１５＞ 前記＜１４＞に記載の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーをコードする遺伝子を含むことを特徴とする発現ベクターである。
＜１６＞ 前記＜１５＞に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とする形質転換された細胞である。
＜１７＞ 前記＜１５＞に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物である。
＜１８＞ 前記＜１２＞に記載の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを用いてＦＲＥＴを検出する工程を含み、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質活性のいずれかを測定することを特徴とする測定方法である。
＜１９＞ 前記＜１６＞に記載の形質転換された細胞または前記＜１３に記載のトランスジェニック非ヒト動物を用いてＦＲＥＴを検出する工程を含み、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質活性のいずれかを測定することを特徴とする測定方法である。
＜２０＞ （ａ）前記＜１６＞に記載の形質転換された細胞と被検物質とを接触させる工程、および
（ｂ）ＦＲＥＴを検出することによりセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質活性のいずれかの変化を検出する工程、
を含む、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質活性のいずれかの調節物質のスクリーニング方法である。

本発明のリンカーによれば、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを最適化し高感度の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを得ることができる。また、本発明の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーによれば、非侵襲的なセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性の測定が可能となる。

図１は、二分子ＦＲＥＴバイオセンサーの基本構造ならびに作動原理を示す。ＡとＢの分子間相互作用を検出するために、ＡにＦＲＥＴドナー蛍光タンパク質（ＣＦＰを例示してある）を、ＢにＦＲＥＴアクセプター蛍光タンパク質（ＹＦＰを例示してある）を融合している。ＡとＢが結合すると、ＦＲＥＴドナー蛍光タンパク質がＦＲＥＴアクセプター蛍光タンパク質に近接し、ＦＲＥＴによりＦＲＥＴアクセプター蛍光タンパク質からの蛍光を検出できる。矢印付波線は、励起光ならびに蛍光を示している。 図２は、一分子ＦＲＥＴバイオセンサーの基本構造ならびに作動原理を示す。Ａという分子が構造変化を起こすことが知られている場合、二箇所にＦＲＥＴドナー蛍光タンパク質（ＣＦＰを例示してある）とＦＲＥＴアクセプター蛍光タンパク質（ＹＦＰを例示してある）を融合させる。Ａ分子の構造変化により、ＦＲＥＴの効率が変化する。矢印付波線は、励起光ならびに蛍光を示している。 図３は、センサー領域とリガンド領域を含むＦＲＥＴを利用した一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーの原理を示す。ＦＲＥＴドナー蛍光タンパク質（ＣＦＰを例示してある）とＦＲＥＴアクセプター蛍光タンパク質（ＹＦＰを例示してある）の間に、センサー領域ならびにリガンド領域をリンカー配列を介して結合する。センサー領域は、リン酸化酵素の活性化や、ＧＴＰ交換因子の活性化など、様々な細胞内環境の変化に対応して構造が変化する部分を含む。リガンド領域は、該センサー領域の構造変化に対応して結合するドメインである。センサー領域の構造が変化するとリガンド領域が結合する。これに伴い、ＦＲＥＴドナー蛍光タンパク質がＦＲＥＴアクセプター蛍光タンパク質に近接し、ＦＲＥＴによりＦＲＥＴアクセプター蛍光タンパク質からの蛍光を検出できる。 図４は、センサー領域とリガンド領域を含むＦＲＥＴを利用した一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーにおけるリンカー領域の役割を、ＰＫＡに対するバイオセンサーＥｅｖｅｅ−ＰＫＡを例に示す。センサー領域は、ＰＫＡにより特異的にリン酸化される基質配列を含む。リガンド領域は、該リン酸化ペプチドに結合することが知られているＲａｄ１タンパク質のＦＨＡ１ドメインである。センサー領域の基質配列がＰＫＡによりリン酸化されるとリガンド領域が結合する。これに伴い、ＦＲＥＴドナー蛍光タンパク質（ＣＦＰ）がＦＲＥＴアクセプター蛍光タンパク質（ＹＦＰ）に近接し、ＦＲＥＴによりＦＲＥＴアクセプター蛍光タンパク質からの蛍光を検出できる。 図５は、ＥＶリンカーの長さとゲインの関係を示す。ＨｅＬａ細胞に様々な長さのＥＶリンカーを有するＥｅｖｅｅ−ＰＫＡを発現させ、２４時間後に、１ｍＭのジブチリルｃＡＭＰにてＰＫＡを活性化した。刺激前と刺激後３０分のＦＲＥＴ／ＣＦＰ蛍光比を測定し、刺激前に対しての増加の割合をゲインとした。 図６は、ＹＦＰアクセプタータンパク質をＹＰｅｔ変異体にすることで、さらにＥＶリンカーの効果が顕著になることを示す。ＹＰｅｔと様々な長さのＥＶリンカーを有するＥｅｖｅｅ−ＰＫＡを作成した。次に、ＨｅＬａ細胞にこれらのＥｅｖｅｅ−ＰＫＡを発現させ、２４時間後に、１ｍＭのジブチリルｃＡＭＰにてＰＫＡを活性化した。刺激前と刺激後３０分のＦＲＥＴ／ＣＦＰ蛍光比を測定し、刺激前に対しての増加の割合をゲインとした。 図７は、ＥＶリンカーの効果が基底状態のＦＲＥＴを低下させることによることを示す。図７Ａは、Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡ−５２をＨｅＬａ細胞に発現させ、共焦点レーザー顕微鏡ＦＶ１０００にて、４３８ｎｍのレーザーで励起し、各波長における蛍光強度を測定した結果である。 図７Ｂは、Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡ−８４について、図７Ａと同様に測定した結果である。 図７Ｃは、Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡ−１１６について、図７Ａと同様に測定した結果である。基底状態におけるＦＲＥＴを示す５３０ｎｍの蛍光がＥＶリンカーを長くすることで著明に低下することがわかる。 図８Ａは、ＥＶリンカーによる基底状態のＦＲＥＴ効率の低下は、リン酸化の低下に由来することを示す。図７と同様に、Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡをＨｅＬａ細胞に発現させた。刺激前サンプル、１ｍＭ ジブチリルｃＡＭＰを１５分間処理したもの、１ｍＭ ジブチリルｃＡＭＰと５０ｎＭカリクリンとを１５分間処理したものに分けて、５０μＭ ＰｈｏｓＴａｇを含む６％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにて分離した。その後、抗ＧＦＰ抗体マウスモノクローナル抗体で免疫ブロッティングした。ＥＶリンカーが短くなるにつれ、基底状態のリン酸化が低下するのがわかる。 図８Ｂは、図８Ａのリン酸化の割合をグラフに表したものである。 図９Ａは、ＰＩＰ_３結合ドメインを有するＡｋｔバイオセンサー（Ｅｅｖｅｅ−Ａｋｔ−８４）の構造を示す。８４ａ．ａ．と記載してあるのが、ＥＶ８４リンカーである。ＡｋｔＰＨは、Ａｋｔタンパク質のＰＨドメインを、ＮＥＳは、核外移行シグナルを示している。 図９Ｂは、ＰＩＰ_３結合ドメインを有するＡｋｔバイオセンサー（Ｅｅｖｅｅ−Ａｋｔ−１１６）の構造を図９Ａと同様に示す。１１６ａ．ａ．と記載してあるのが、ＥＶ１１６リンカーである。 図１０は、ＥＶリンカーによる基底状態のＦＲＥＴの低下はＡｋｔのバイオセンサーについても観察されることを示す。Ｅｅｖｅｅ−ＡｋｔをＣＯＳ７細胞に発現させ、ＦＲＥＴ／ＣＦＰ蛍光比を測定した。５個以上の細胞について測定し、平均値とともに表示した。ＥＶリンカーが１１６のものが７２Ｇｌｙリンカーと比較して、低い基底状態のＦＲＥＴを有していることが分かる。 図１１は、Ｅｅｖｅｅ−ＥＲＫによるＥＲＫの活性測定をグリシンリンカーを有する場合との比較において示した図である。図１１Ａは、ＨｅＬａ細胞にＥＶ１１６リンカーを含むＥｅｖｅｅ−ＥＲＫ（３５６０ＮＥＳ）を発現させ、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで刺激して、実測値のＦＲＥＴ／ＣＦＰ蛍光比をＹ軸にとったものである。 図１１Ｂは、上記ＦＲＥＴ／ＣＦＰ蛍光比を刺激前の状態に標準化したものを示す。 図１１Ｃは、グリシンリンカーを有するＥＫＡＲ−１６６７ｎｅｓ（７２Ｇｌｙリンカー）（１６６７ＮＥＳ）についての結果を図１１Ａと同様に示したものである。 図１１Ｄは、上記ＦＲＥＴ／ＣＦＰ蛍光比を刺激前の状態に標準化したものを示す。実測値のＦＲＥＴ／ＣＦＰは、２．２程度が上限であるので、グリシンリンカーを有するＥＫＡＲ−１６６７ｎｅｓよりもＥＶ１１６リンカーを含むＥｅｖｅｅ−ＥＲＫ（図１１Ａ及びＢ参照）が、広いゲインを有するのは、低い基底状態のＦＲＥＴ効率によることを示している。 図１２は、ＥＶリンカーを有するＥＧＦＲ／ＡｂｌのバイオセンサーＰｉｃｃｈｕ−７３４の反応性を示す。ＨｅＬａ細胞にＰｉｃｃｈｕ−７３４を発現させ、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで刺激した。ＥＶリンカーを有しないＰｉｃｃｈｕ−７３０よりも広いゲインを有することがわかる。 図１３Ａは、ＥＶリンカーを有するＲａｉｃｈｕ−Ｒａｃ１（２２４６Ｘ）によるＲａｃ１活性の測定を示す。ＨｅＬａ細胞にＥＶリンカーを持たないｐＲａｉｃｈｕ−Ｒａｃ１（２２４１Ｘ）およびＥＶリンカーを有するｐＲａｉｃｈｕ−Ｒａｃ１（２２４６Ｘ）をトランスフェクトして、４８時間後に実施例２に記載の方法でイメージングを行った。共焦点レーザー顕微鏡ＦＶ１０００にて、４３８ｎｍのレーザーで励起し、各波長における蛍光強度を測定した図である。基底状態におけるＦＲＥＴを示す５３０ｎｍの蛍光がＥＶリンカーを長くすることで著明に低下することがわかる。 図１３Ｂは、図１３Ａのイメージングにおいて、イメージング開始１０分後に上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）を２５ｎｇ／ｍｌになるように投与し、さらにイメージングを続けた。正規化したＦＲＥＴ／ＣＦＰをグラフとして表示している。ＥＶリンカーを有するＲａｉｃｈｕ−Ｒａｃ１（２２４６Ｘ）のほうが、高い反応性を有していることがわかる。 図１４Ａは、Ｒａｉｃｈｕ−２２４６Ｘを安定に発現するラットＣ６細胞を２４時間にわたってタイムラプスイメージし、ＦＲＥＴ／ＣＦＰ効率（Ｒａｃ１活性と記載してある）を測定したデータを示す。矢印は細胞分裂を示す。ＥＶリンカーを発現する細胞においてＦＲＥＴが長時間にわたり安定的に測定できることを示している。 図１４Ｂは、上記と同じ条件で撮影した別の細胞の結果である。 図１４Ｃは、上記と同じ条件で撮影した別の細胞の結果である。 図１４Ｄは、上記と同じ条件で撮影した別の細胞の結果である。 図１５Ａは、ＥＶリンカーを有するＲａｉｃｈｕ−Ｃｄｃ４２をＣＯＳ７細胞に発現させた。基底状態のＦＲＥＴ効率を比較し、ＥＶリンカーが顕著に基底状態のＦＲＥＴを低減させることを示す。 図１５Ｂは、ＥＶリンカーを有するＲａｉｃｈｕ−Ｃｄｃ４２について、イメージング開始１０分後に上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）を２５ｎｇ／ｍｌになるように投与し、さらにイメージングを続けたときの、正規化したＦＲＥＴ／ＣＦＰをグラフとして表示している。 図１５Ｃは、ＥＶリンカーを有さないＲａｉｃｈｕ−Ｃｄｃ４２について、図１５Ｂと同様に、正規化したＦＲＥＴ／ＣＦＰをグラフとして表示している。ＥＶリンカーを有するＲａｉｃｈｕ−Ｃｄｃ４２のほうが、ＥＶリンカーを有さないＲａｉｃｈｕ−Ｃｄｃ４２より高い反応性を有していることがわかる。 図１６Ａは、ＥＶリンカーを有するＲａｉｃｈｕ−Ｒａｓ（３７０５Ｘ）をＨｅＬａ細胞に発現させ、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで刺激し、１分おきにタイムラプス画像を取得した図である。ＥＶリンカーを有しないＲａｉｃｈｕ−ＨＲａｓ（図１６Ｂ）と比較して、ＥＶリンカーを有するＲａｉｃｈｕ−ＨＲａｓは早期にかつ強く活性化を検出できていることがわかる。 図１６Ｂは、ＥＶリンカーを有しないＲａｉｃｈｕ−ＨＲａｓについて図１６Ａと同様に画像を取得した図である。 図１７は、Ｅｅｖｅｅ−ＥＲＫを発現するトランスジェニックマウスの胎児の矢状断を蛍光顕微鏡で撮影し、ＦＲＥＴの画像を取ったものである。基底状態から前後40%を擬似カラーで示している（暖色が高いＦＲＥＴを示す）。個体内でのＥＲＫの活性分布を見ることができる。 図１８はＨｅＬａ細胞にＥｅｖｅｅ−ＥＲＫを安定発現させたものを９６ウェル培養皿にて植え、段階希釈した阻害剤を入れたのちに、２５ｎｇ/ｍｌのＥＧＦで刺激した結果である。３０個以上の細胞について、ＥＲＫの活性を自動測定し、平均したものをグラフ化した。図１８ＡはＤＭＳＯのコントロールを表す。 図１８Ｂは、阻害剤としてＥＧＦ受容体阻害剤（ＡＧ１４７８）を用いた場合を表す。 図１８Ｃは、阻害剤として、ＭＥＫ阻害剤（ＰＤ１５０３５）を用いた場合を表す。 図１８Ｄは、阻害剤として、ＢＲＡＦの阻害剤（ＰＬＸ４７２０） 図１８Ｅは、阻害剤として、ＭＥＫ阻害剤（ＰＤ１８４３５１）を用いた場合を表す。 図１８Ｆは、阻害剤として、ホスファチジルイノシトール３リン酸キナーゼの阻害剤（ＬＹ２９４００２）、を用いた場合を表す。 図１８Ｇは、阻害剤として、ＲＳＫの阻害剤（ＢＩ−Ｄ１８７０）、を用いた場合を表す。 図１８Ｈは、阻害剤として、ＪＮＫの阻害剤（ＪＮＫ inhibitor VIII）を用いた場合を表す。ＥＧＦ依存性のＥＲＫ活性化が、ＨｅＬａ細胞においてはＥＧＦ受容体およびＭＥＫの阻害剤によって効果的に抑制されることを示している。 図１９は、Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡ（３５３６ＮＥＳ）を発現するトランスジェニックマウスに、ホスホジエステラーゼの阻害剤であるテオフィリンおよび環状アデノシン三リン酸のアナログであるアクトシンをそれぞれ静注し、ＰＫＡの活性を測定した結果である。筋間神経細胞、腸管平滑筋、血管平滑筋のそれぞれにおけるＰＫＡの活性変化がリアルタイムに可視化できる。 図２０は、図１９の画像をグラフ化したものである。 図２１は、グリシン含量を減らしたＥＶ３ｘ８およびＥＶ６ｘ４リンカーを用いたバイオセンサーもＥＶ１１６リンカーを用いたバイオセンサーとほぼ同等の効果を有することを示す図である。図７と同様にＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−３ｘ８，Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡ−４ｘ６、Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡ−１１６をＨｅＬａ細胞に発現させ、共焦点レーザー顕微鏡ＦＶ１０００にて、４３８ｎｍのレーザーで励起し、各波長における蛍光強度を測定した。ＥＶ３ｘ８およびＥＶ４ｘ６はＥＶ１１６リンカーに匹敵する効能を有することがわかる。

以下に、本発明の実施の形態を説明する。
本発明のリンカー（ＥＶリンカーと称する）は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の原理に基づく一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーのリンカーであって、５２アミノ酸残基以上４００アミノ酸残基以下を含むポリペプチドであって、全アミノ酸残基数の少なくとも４５％がグリシン及びアラニンの少なくともいずれかであり、アラニンを全アミノ酸残基数の少なくとも１０％含むことを特徴とするリンカーである。

本発明のリンカーは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の原理に基づく一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー、すなわち、一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー中に構成要素のひとつとして連結されて用いられるものである。本発明において、ＦＲＥＴとは、励起状態にある蛍光分子（ドナー：エネルギー供与体）からごく近傍の蛍光分子（アクセプター：エネルギー受容体）へ励起エネルギーが移動する現象のことをいう。一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーは、一般にドナー蛍光タンパク質、アクセプター蛍光タンパク質、センサードメイン、リガンドドメインの４つの領域を有するが、リンカーはそれらの２つの領域の間をつないで連結されるものである。

図３は一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー中に用いられる本発明のリンカーの例示である。ＣＦＰをドナー蛍光タンパク質の一例として、ＹＦＰをアクセプター蛍光タンパク質の一例として、本発明の具体的説明を行なうが、後述するようにドナー蛍光タンパク質及びアクセプター蛍光タンパク質はこれに限られない。センサードメインとリガンドドメインは、基底状態では空間的に離れた位置にあり、この状態では、ドナー蛍光タンパク質とアクセプター蛍光タンパク質もまた空間的に離れた位置にあり、基底状態のＦＲＥＴ効率は低い。活性化状態においては、リン酸化、ＧＴＰ結合など様々なシグナルにより誘導されるセンサー領域「Ａ」の構造変化を構造認識ドメインからなるリガンド領域「Ｂ」が認識して結合することにより、ドナーとアクセプターが近接し、これにより、ＦＲＥＴ効率が上昇する。
ここで、ＦＲＥＴ効率とは、ドナー蛍光タンパク質を励起して得られる蛍光強度の、アクセプター蛍光タンパク質存在下における減少割合を指すが、本明細書においては、一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーをドナー蛍光タンパク質の励起波長で照射した場合の、ドナー蛍光タンパク質の蛍光強度とアクセプター蛍光タンパク質の蛍光強度との比（蛍光強度比）を便宜的に用いる（非特許文献１及び３参照）。以下、本明細書において記載する参照文献は参照により、その全教示が本明細書中に取り込まれる。

本明細書に係るＥＶリンカーは、少なくとも５２アミノ酸以上４００アミノ酸以下の長さを有し、安定した３次構造をとらないポリペプチドである。５２アミノ酸未満であると、基底状態でのＦＲＥＴ効率が高くなりゲインを大きく取れず、４００アミノ酸を超えると、ＦＲＥＴバイオセンサーの分子量が大きくなり発現量が低下する等の問題が生じる。前記ゲインを大きく取る観点からは、８４アミノ酸以上であることがより好ましく、１１６アミノ酸以上であることが特に好ましい。前記分子量を抑える観点からは２４４アミノ酸以下であることがより好ましい。前記観点から、リンカーの長さとしては、８４アミノ酸以上２４４アミノ酸以下であることが特に好ましい。

本発明のＥＶリンカーは、安定した３次構造をとらないポリペプチドであり、全アミノ酸残基数の少なくとも４５％がグリシン及びアラニンの少なくともいずれかであり（即ち、グリシン残基とアラニン残基の合計が全アミノ酸残基数の少なくとも４５％を占める意である）、アラニンを全アミノ酸残基数の少なくとも１０％含むことを特徴とするリンカーである。全アミノ酸残基数の少なくとも４５％がグリシン及びアラニンの少なくともいずれかからなることは、可動性が大きいポリペプチドを作成する観点から重要であり、アラニンを全アミノ酸残基数の少なくとも１０％含むことにより、グリシンのみのリンカーよりゲインを大きくとることができる。グリシン及びアラニン以外のアミノ酸残基としては安定した３次構造をとらないことに配慮すれば、他のアミノ酸を含むことができる。安定した三次構造をとらないポリペプチドを作成する観点から、セリン、スレオニン、アルギニン、グルタミン酸などを特に好適に含むことができる。
例えば、アラニン及びグリシンに加えて、セリン及びスレオニンの少なくともいずれかを全アミノ酸残基数の少なくとも１０％含むポリペプチドが好ましい。このようなポリペプチドとしては、全アミノ酸残基の数の少なくとも９５％がＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及び、Ａｌａからなり、Ｇｌｙを３５から６５％、Ｓｅｒ及びＴｈｒの少なくともいずれかを１０から４０％、Ａｌａを１０から４０％含むポリペプチドが挙げられる。これらのアミノ酸残基は、全長にわたって均一に分布させることが好ましく、中でも、Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、その逆配列であるＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ、または、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒを繰り返し含む配列が好ましい。このような配列としては、例えば、Ｓｅｒ−Ａｌａ―Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ、または、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒの繰り返し単位を全アミノ酸残基の数の９５％以上含み、前記基本配列の他にＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ等が全体の５％未満の範囲で配列中に挿入されているような配列も好ましい。さらに、上記配列において、Ｓｅｒと性質の非常に近いアミノ酸であるＴｈｒをＳｅｒと置換した配列もまた好ましい。前記、アミノ酸配列の繰り返し単位を１３個以上１００個以下含むことが好ましい。このようなリンカーの具体例としては次のものが挙げられる。
ＥＶ５２リンカー（配列番号：１２）
SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGG
ＥＶ８４リンカー（配列番号：１５）
SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGG
ＥＶ１１６リンカー（配列番号：１８）
SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGG
ＥＶ１８０リンカー（配列番号：２３）
SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGG
ＥＶ２４４リンカー（配列番号：２６）
SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGG
また、アラニン及びグリシンに加えて、アルギニン及びグルタミン酸の少なくともいずれかを全アミノ酸残基数の少なくとも１０％含むポリペプチドも好ましい。このようなポリペプチドとしては、全アミノ酸残基数の少なくとも９５％がグリシン、アルギニン、グルタミン酸及びアラニンからなり、グリシンを４から３０％、アルギニンを５から３０％、グルタミン酸を５から３０％、及びアラニンを３０から６０％含むポリペプチドが挙げられる。これらのアミノ酸残基は、全長にわたって均一に分布させることが好ましく、例えば下記のような配列が挙げられる。
ＥＶ３ｘ８リンカー（配列番号：４５）
EAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAAR
ＥＶ６ｘ４リンカー（配列番号：４６）
EAAAREAAAREAAAREAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAAREAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAAREAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARAAREAAAREAAAR
ＥＶ３ｘ８リンカーは、EAAARの配列を３回繰り返した１５アミノ酸残基の配列単位を８個、ＧＧ配列で繋げた１３４アミノ酸残基のポリペプチドである。全アミノ酸残基数１３４個のうちのアラニンが７２個（５３．７％）、グリシンが１４個（１０．４％）、グルタミン酸が２４個（１７，９％）、アルギニンが２４個（１７．９％）である。アラニン及びグリシンを合わせると６４．１％である。また、ＥＶ６ｘ４リンカーは、１２４アミノ酸残基のポリペプチドであり、全アミノ酸残基数１２４個のうちのアラニンが７１個（５７，３％）、グリシンが６個（４，８％）、グルタミン酸が２３個（１８，５％）、アルギニンが２４個（１９，４％）であり、アラニン及びグリシンを合わせると６２，１％である。

本発明のＥＶリンカーは、一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーのゲインを大きくさせるものであり、その一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー中の挿入部位は基底状態と活性化状態におけるＦＲＥＴ効率の差、すなわち、ゲインの増大を考慮して、適宜選択され得る。すなわち、一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーのドナー蛍光タンパク質、アクセプター蛍光タンパク質、センサードメイン、および、リガンドドメインの領域から選択されるいずれか２つの領域の間を連結して用いることができ、どの領域間に用いるかは特に制限されない。例えば、図３のように、センサードメインとリガンドドメインの間の連結に用いることができる。

本発明に係る一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーは、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーであって、センサー領域、リガンド領域、アクセプター蛍光タンパク質領域、ドナー蛍光タンパク質領域、及び、該センサー領域と該リガンド領域とを連結するリンカー領域を有する融合タンパク質であり、該リンカー領域が、前記本発明のリンカーからなる。本発明に係る一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーの好ましい態様としては、ドナー蛍光タンパク質、アクセプター蛍光タンパク質、センサードメイン、リガンドドメイン、リンカーの５つの領域を少なくともひとつずつ含み、かつ、アミノ末端側より、ドナー（またはアクセプター）蛍光タンパク質、センサー（またはリガンド）ドメイン、ＥＶリンカー、リガンド（またはセンサー）ドメイン、アクセプター（またはドナー）蛍光タンパク質を含む態様（１）、ドナー蛍光タンパク質、アクセプター蛍光タンパク質、センサードメイン、リガンドドメイン、リンカーの5つの領域を少なくともひとつずつ含み、かつ、アミノ末端側より、センサー（またはリガンド）ドメイン、ドナー（またはアクセプター）蛍光タンパク質、ＥＶリンカー、アクセプター（またはドナー）蛍光タンパク質、リガンド（またはセンサー）ドメインを含む態様（２）、ドナー蛍光タンパク質、アクセプター蛍光タンパク質、センサードメイン、リガンドドメイン、リンカーの5つの領域を少なくともひとつずつ含み、かつ、アミノ末端側より、ドナー（またはアクセプター）蛍光タンパク質、センサー（またはリガンド）ドメイン、ＥＶリンカー、アクセプター（またはドナー）蛍光タンパク質、リガンド（またはセンサー）ドメインを含む態様（３）、ドナー蛍光タンパク質、アクセプター蛍光タンパク質、センサードメイン、リガンドドメイン、リンカーの5つの領域を少なくともひとつずつ含み、かつ、アミノ末端側より、センサー（またはリガンド）ドメイン、ドナー（またはアクセプター）蛍光タンパク質、ＥＶリンカー、アクセプター（またはドナー）蛍光タンパク質、リガンド（またはセンサー）ドメインを含む態様（４）が挙げられる。

センサー領域に、リン酸化されるペプチドあるいは低分子量ＧＴＰ結合タンパク質を含む場合は態様（１）が好ましい。従って、該ＥＶリンカーは、一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーにおいて、リガンド領域とセンサー領域との間に介在することが好ましい。なお、一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーにおいて、ドナー蛍光タンパク質、アクセプター蛍光タンパク質、リガンド領域、アクセプター領域、ＥＶリンカーは必ずしもひとつずつである必要はなく、複数存在してもよい。

ドナー蛍光タンパク質領域を構成するドナー蛍光タンパク質としてはＦＲＥＴのペアとなる機能が保たれていれば特に限定されるものはないが、機能的観点から、好ましくはＣＦＰまたはＴＦＰ（Ｔｅａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）である。一方のアクセプター蛍光タンパク質領域を構成するアクセプター蛍光タンパク質も同様にＦＲＥＴのペアとなる機能が保たれていれば特に限定されるものはないが、機能的観点から、好ましくはＹＦＰである。ここで、ＦＲＥＴのペアとなる機能とは、励起状態にあるドナー蛍光タンパク質から近傍のアクセプター蛍光タンパク質へ励起エネルギーが移動し、該励起エネルギーの移動が検出できることをいう。

ドナー蛍光タンパク質および／またはアクセプター蛍光タンパク質は、ＦＲＥＴのペアとなる機能が保たれていればそれらタンパク質の一部でもよく、必ずしも全部（全長）である必要はない。しばしば、それらのアミノ酸配列のカルボキシル末端を短くすることにより、ＦＲＥＴ効率の差の増大が生ずる。たとえば、アクセプター蛍光タンパク質および／またはドナー蛍光タンパク質の一部としては、それらのアミノ酸配列のカルボキシル末端領域に好ましくは少なくとも１個、より好ましくは１〜１１個の欠損を有してなるものを挙げることができる。なお、かかる領域におけるアミノ酸の欠損部位には特に限定はない。たとえば、ＹＦＰの場合、そのアミノ酸配列のカルボキシル末端領域において好ましくは少なくとも１個、より好ましくは１〜１１個、さらに好ましくは１１個のアミノ酸の欠損を有してなるものが好ましい。また、ＣＦＰの場合、そのアミノ酸配列のカルボキシル末端領域において好ましくは少なくとも１個、より好ましくは１〜１１個、さらに好ましくは１１個のアミノ酸の欠損を有してなるものが好ましい。

ここで、カルボキシル末端領域とは、本発明に使用するＧＦＰ関連タンパク質のアミノ酸配列において、そのカルボキシル末端から、アミノ酸の個数で好ましくは１〜２０個までの、より好ましくは１１個までの領域をいう。なお、ＦＲＥＴのペアとなる機能が保たれているか否かは、たとえば、公知の方法に従いＦＲＥＴのペアを形成すると想定される１対のタンパク質分子を共に大腸菌で生産し、当該１対のタンパク質を含む細胞抽出液において、当該タンパク質それぞれの想定される励起波長での蛍光強度を観察するという方法により評価することができる。

さらに、アクセプター蛍光タンパク質および／またはドナー蛍光タンパク質は変異を有していてもかまわない。かかる変異の導入は、ＦＲＥＴのペアとなる機能が保たれている限り、アクセプター蛍光タンパク質および／またはドナー蛍光タンパク質のアミノ酸配列における任意の部位に対し行うことができる。たとえば、変異の態様としては複数のアミノ酸の置換が挙げられ、かかるアミノ酸置換の具体的態様としては、たとえば、ＧＦＰの変異体であるＬｅｕ６５Ｐｈｅ、Ｐｈｅ４７Ｌｅｕ、Ｔｈｒ６６Ｓｅｒなどが挙げられる。このような変異を導入することで発色団形成効率の上昇や、ＦＲＥＴ効率の上昇などの効果が得られるので好ましい。変異の導入は、公知のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いる方法などにより行うことができる。ＹＦＰの変異体としては、例えば、Ｙｐｅｔ〔Nguyen A. W., and P. S. Daugherty. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. 2005. Nat.Biotechnol. 23:355-360〕、ＥＹＦＰ(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社) ，Ｖｅｎｕｓ〔Nagai, T., K. Ibata, E. S. Park, M. Kubota, K. Mikoshiba, and A. Miyawaki. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. 2002. Nat.Biotechnol. 20:87-90〕などが挙げられ、ＣＦＰの変異体としては、例えば、ＣｙＰｅｔ〔Nguyen A. W., and P. S. Daugherty. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. 2005. Nat.Biotechnol. 23:355-360〕、ＥＣＦＰ(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社)、ＳＥＣＦＰ（非特許文献５）、 Ｔｕｒｑｕｏｉｓｅ(Goedhart, J. , L. an Weeren, M. A. Hink, N. O. Vischer, K. Jalink, and T. W. Gadella, Jr. Bright cyan fluorescent protein variants identified by fluorescence lifetime screening. 2010. Nat.Methods 7:137-139.)などが挙げられる。アクセプター蛍光タンパク質およびドナー蛍光タンパク質の組み合わせとしては、ＶｅｎｕｓとＥＣＦＰ、ＹＰｅｔとＥＣＦＰ、ＶｅｎｕｓとＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＹＰｅｔとＴｕｒｑｕｏｉｓｅが好適に使用できる。

センサー領域を構成するセンサータンパク質及びリガンド領域を構成するリガンドの組み合わせとしては、特に制限はないが、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質活性のいずれかを測定可能な組み合わせが好適に挙げられる。セリンスレオニンリン酸化酵素活性を測定する組み合わせとしては、ホークヘッド会合（Ｆｏｒｋｈｅａｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ， 以下ＦＨＡ１と記載する）ドメイン、ＷＷ（Ｔｒｐ−Ｔｒｐ）ドメイン、あるいはＢＲＣＴ（ＢＲＣＡ１−Ｃ末端）ドメインとセリンまたはスレオニンを含むペプチド配列が、チロシンリン酸化酵素活性を測定する組み合わせとしては、ＳＨ２（Ｓｒｃホモロジー２）ドメインまたはＰＴＢ（Ｐｈｓｏｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ）ドメインとチロシンを含むペプチド配列が、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質活性を測定する組み合わせとしては、Ｒａｓファミリー低分子量ＧＴＰ結合タンパク質、Ｒｈｏファミリー低分子量ＧＴＰ結合タンパク質、Ｒａｂファミリー低分子量ＧＴＰ結合タンパク質、Ａｒｆファミリー低分子量ＧＴＰ結合タンパク質、あるいはＲａｎ低分子量ＧＴＰ結合タンパク質と、とそれぞれの標的タンパク質が好適に挙げられる。

本発明の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーの構成要素およびそれぞれの特に好ましい組み合わせとしては、有効性、特異性および感度の観点から、センサー領域が低分子量ＧＴＰ結合タンパク質Ｒａｓであり、リガンド領域がＲａｓの標的タンパク質Ｒａｆであり、ドナー蛍光タンパク質がＣＦＰであり、アクセプター蛍光タンパク質がＹＦＰであるか、センサー領域が低分子量ＧＴＰ結合タンパク質Ｒａｃ１であり、リガンド領域がＲａｃ１の標的タンパク質Ｐａｋであり、ドナー蛍光タンパク質がＣＦＰであり、アクセプター蛍光タンパク質がＹＦＰであるか、またはセンサー領域が低分子量ＧＴＰ結合タンパク質Ｃｄｃ４２であり、リガンド領域がＣｄｃ４２の標的タンパク質Ｐａｋであり、ドナー蛍光タンパク質がＣＦＰであり、アクセプター蛍光タンパク質がＹＦＰであるか、または、センサー領域がプロテインキナーゼＡ（Ａキナーゼ、以下ＰＫＡと記載する）によりリン酸化されるペプチドであり、リガンド領域がＦＨＡ１ドメインであり、ドナー蛍光タンパク質がＣＦＰであり、アクセプター蛍光タンパク質がＹＦＰであるか、または、センサー領域が細胞外シグナル調節キナーゼ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｋｉｎａｓｅ、以下ＥＲＫと記載する）によりリン酸化されるペプチドであり、リガンド領域がＷＷドメインであり、ドナー蛍光タンパク質がＣＦＰであり、アクセプター蛍光タンパク質がＹＦＰであるか、または、センサー領域がチロシンリン酸化酵素によりリン酸化されるペプチドであり、リガンド領域がＣｒｋタンパク質のＳＨ２ドメインであり、ドナー蛍光タンパク質がＣＦＰであり、アクセプター蛍光タンパク質がＹＦＰである。

アクセプター（またはドナー）蛍光タンパク質、リガンド（またはセンサー）ドメインまた、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質、標的タンパク質、の結合の順序は、ゲインの増大の観点から、本発明のＥＶリンカーを含む一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーにおいて、好ましくはアミノ末端側よりＹＦＰ−ＦＨＡ１−ＥＶリンカーＰＫＡ基質ペプチド−ＣＦＰ、ＹＦＰ−ＦＨＡ１−ＥＶリンカーＥＲＫ基質ペプチド−ＣＦＰ、ＹＦＰ−Ｒａｆ−ＥＶリンカーＲａｓ−ＣＦＰ、ＹＦＰ−Ｒａｃ１−ＥＶリンカーＰａｋ−ＣＦＰ、ＹＦＰ−Ｃｄｃ４２−ＥＶリンカーＰａｋ−ＣＦＰ、またはＹＦＰ−ＣＲＫ ＳＨ２ドメイン−ＥＶリンカーチロシンキナーゼ基質ペプチド−ＣＦＰが挙げられる。また、これらにおいてＹＦＰとＣＦＰとの位置が互いに交換されてなるもの、あるいは、ＹＦＰおよびＣＦＰの様々な変異体、たとえば、Ｙｐｅｔ、ＣｙＰｅｔ、ＥＹＦＰ(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社)，ＥＣＦＰ(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社)，ＳＥＣＦＰ、Ｖｅｎｕｓなども好適に使用できる。

本発明の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーは、前記５つの領域を有するものであればよく、細胞内分布を目的に応じて変化させるため、あるいは一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーの精製を容易にする目的などのために、ペプチドタグあるいは、他の蛍光タンパク質、あるいは細胞内局在シグナル、タンパク−タンパク質間相互作用を司るドメインなどをそのＮ末端、Ｃ末端、あるいはまた、一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー内部に含むものも好適に用いることが出来る。

なお、上述する本発明のＥＶリンカーが本発明の所望の効果を発現し得るか否かについての評価は、たとえば、後述の実施例１に記載の方法に準じて評価することができる。

本発明はまた、本発明に係る前記ＥＶリンカーをコードする遺伝子（ＤＮＡ）ならびに本発明に係る前記一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーをコードする遺伝子(ＤＮＡ)を提供する。ＥＶリンカーの遺伝子は、化学合成することが可能であり、また、前記一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーの遺伝子は、ＥＶリンカー以外の前記各構成タンパク質については遺伝子情報をＧｅｎＢａｎｋ等から入手し、公知のＰＣＲを用いた方法と制限酵素とリガーゼとを用いた方法により常法に従って作製することができる。

本発明はさらに、前記遺伝子を含む発現ベクターを提供する。かかるベクターは、公知の方法に従い、本発明のＥＶリンカーまたは一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーをコードする遺伝子を公知の原核細胞発現ベクター、例えばｐＧＥＸ−２Ｔ（ＧＥ・ヘルスケア社製）、真核細胞発現ベクター、例えばｐＣＡＧＧＳ〔Niwa, H., K. Yamamura, and J. Miyazaki. 1991. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108:193-200.〕に、あるいはウイルスベクター、例えばｐＣＸ４〔Iwahara, T., T. Akagi, Y. Fujitsuka, and H. Hanafusa. 2004. CrkII regulates focal adhesion kinase activation by making a complex with Crk-associated substrate, p130Cas. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 101:17693-17698.〕に挿入することにより得ることができる。

本発明はさらに、前記発現ベクターを保持する形質転換された細胞およびトランスジェニック非ヒト動物を提供する。かかる形質転換された細胞は、前記発現ベクターを対象とする細胞に導入することにより得られる。細胞への導入法としては公知のトランスフェクション法やウイルス感染法が使用でき特に制限はないが、たとえばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、あるいはトランスポゾンを用いる方法等が使用できる。該細胞としては真核細胞あるいは原核細胞を用いることができ、特に制限はない。たとえば、真核細胞としては、ヒト癌由来のＨｅＬａ細胞、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、イヌ腎臓由来ＭＤＣＫ細胞、サル腎臓由来ＣＯＳ７細胞、ラットＣ６グリオーマ細胞、酵母など、原核細胞としては、大腸菌など、その他、各種細胞を使用できる。

一方、前記発現ベクターを公知の方法、たとえば、マウス受精卵の核内にプラスミドＤＮＡをマイクロインジェクションする方法、あるいはＴｏｌ２トランスポゼースを介する方法〔Sumiyama, K., K. Kawakami, and K. Yagita. 2010. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics 95:306-311. 〕などにより、マウス等の個体に直接導入することでトランスジェニック非ヒト動物を得ることができる。トランスジェニック非ヒト動物としては、ヒト以外であれば特に制限はないが、マウス、ラット、ブタ、ゼブラフィッシュ、線虫などが挙げられる。医薬産業への応用の観点からマウスが好ましい。

本発明においてはさらに、本発明の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを用いてＦＲＥＴを検出する工程を含み、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質活性のいずれかを測定する測定方法を提供する。本発明の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを用いてＦＲＥＴを検出する工程としては、一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを発現する細胞株を蛍光顕微鏡において観察し、タイムラプスイメージングを行なう方法や、一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを発現する細胞株をフローサイトメーターを用いて解析する手法などが挙げられる。かかる方法によれば、本発明に係る一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーにおけるＦＲＥＴを検出することでセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を測定することができる。

また、本発明においては、本発明に係る形質転換された細胞またはトランスジェニック非ヒト動物を用いてＦＲＥＴを検出する工程を含む、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質活性のいずれかを測定する測定方法を提供する。セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質活性は、前述のセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質活性のいずれかを測定可能なセンサー領域およびリガンド領域を有する一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを用いることにより測定することができる。ＦＲＥＴを検出する工程としては、ＦＲＥＴによる励起エネルギーの移動が検出できれば特に制限はないが、例えば、顕微鏡を用いた測定方法、フローサイトメーターを用いた測定方法、分光光度計を用いた方法、蛍光ＥＬＩＳＡリーダーを用いた方法などが挙げられる。この測定方法においては、ＦＲＥＴを検出し、当該細胞または動物におけるセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を直接測定することもできる。かかる場合、別途、リン酸化特異的抗体を用いて、リン酸化の割合を算出し、さらに対応するＦＲＥＴ効率を測定して検量線を作成することや、ＧＴＰの結合した低分子量ＧＴＰ結合タンパク質とＧＴＰからの無機リン酸の遊離によって生じるＧＤＰの結合した低分子量ＧＴＰ結合タンパク質とを測定してＧＴＰ／ＧＤＰ比〔またはＧＴＰ／（ＧＤＰ＋ＧＴＰ）比〕（いずれもモル比）を算出し、さらに対応するＦＲＥＴ効率を測定して検量線を作成することができる。かかる検量線を用いれば、当該細胞または動物におけるＦＲＥＴ効率に基づいて、リン酸化やＧＴＰ／ＧＤＰ比を算出することができる。

たとえば、具体的には以下のような方法が例示される。
本発明に係る一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを発現した本発明の形質転換細胞またはトランスジェニック非ヒト動物を蛍光顕微鏡で観察し、センサー領域の構造変化前後に生ずるＦＲＥＴ効率の変化を直接的に検出する。この測定法については、（非特許文献１）に準じて行うことができる。トランスジェニック非ヒト動物の場合には、例えば外耳など固定しやすい部位を観察対象とすることが好ましい。
用いる蛍光顕微鏡には特に制限はないが、公知のキセノン光源を有する倒立型蛍光顕微鏡（ＩＸ８１、オリンパス社製）に回転式蛍光励起フィルターおよび回転式蛍光発光フィルターを備え、高感度冷却ＣＣＤカメラを備えたものが好ましい。さらにフィルターおよびカメラ画像は、モレキュラーデバイス社製ＭｅｔａＭｏｒｐｈ画像解析ソフトにて制御ならびに解析できるシステムが望ましい。

前記細胞または動物にドナー蛍光タンパク質の励起光を照射し、ドナー蛍光タンパク質の蛍光波長での画像をＣＣＤカメラにより撮影し、その後、アクセプター蛍光タンパク質の蛍光波長での画像を撮影する。両画像の蛍光強度の比を測定することにより各測定点でのＦＲＥＴ効率を算出できる。

本発明によれば、本発明に係るＥＶリンカーを含み、非侵襲的にセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を測定することを可能にする一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー、その遺伝子等が提供される。非侵襲的な活性測定が可能となるのは、用いる励起光が可視光領域であるためである。また、かかる一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを発現し、非侵襲的なセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性の測定に有用な前記発現ベクターを保持する形質転換された細胞およびトランスジェニック非ヒト動物、ならびに前記ＥＶリンカーを含む一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを用いるセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を測定する方法が提供される。従って、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を細胞内または個体内で非侵襲的に知ることが可能となり、生命現象の理解のみならず、薬剤開発（たとえば、癌、自己免疫疾患、アレルギー性疾患等の治療剤または予防剤）において多大な利益をもたらし得る。

さらに本発明の別の態様として、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法を提供する。すなわち、（ａ）本発明の形質転換された細胞と被検物質とを接触させる工程、および、（ｂ）ＦＲＥＴを検出することによりセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質活性のいずれかの変化を検出する工程、を含む、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質活性のいずれかの調節物質のスクリーニング方法である。本発明の形質転換された細胞は、本発明の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを発現する、ＥＶリンカーを含む一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー遺伝子を含む発現ベクターを保持する形質転換された細胞である。本発明のスクリーニング方法によれば、本発明のＥＶリンカーを含む一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを発現する細胞を構築し、バイオアッセイ系を用いることによって、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を変化させる物質またはその塩（すなわち、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質）を効率よくスクリーニングすることができる。当該方法における被検物質としては特に限定されるものではないが、たとえば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性物質、合成物質、発酵生産物等を挙げることができる。

以下、本発明を実施例により説明するが、本発明の範囲はかかる実施例のみに限定されるものではない。

（実施例１）
Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡによるセリンスレオニンリン酸化酵素Ａキナーゼ（ＰＫＡ）の酵素活性の測定
（１）ＰＫＡの酵素活性を測定するための、ＥＶリンカーを含む一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーをコードする遺伝子の作成
（ｉ）ＥＶリンカー遺伝子を挿入するためのプラットフォームＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−Ｇ７２（３５２０ＮＥＳ）遺伝子の作成
一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−Ｇ７２（３５２０ＮＥＳ）遺伝子は、ＰＣＲ等の公知の方法を用いて作成した（図３）。すなわち、一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーは、アミノ末端よりＹＦＰ、リンカー、リガンドドメイン（ここではリン酸化スレオニンに特異的に結合するＦＨＡ１ドメイン）、リンカー、ＰＫＡによりリン酸化される基質配列、リンカー、ＣＦＰドナー蛍光タンパク質を有する。この塩基配列（配列番号：１）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：２）を説明する：
nt 1 − 714 ：オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）のＹＦＰ（ＹＰｅｔ）
nt 715 − 720 ：リンカー（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）
nt 721 − 1143 ：酵母のＲａｄ５３遺伝子のＦＨＡ１ドメイン
nt 1144 − 1149 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｔｈｒ）
nt 1150 − 1392 ：グリシンリンカー
nt 1393 − 1437 ：ＰＫＡの基質配列
nt 1438 − 1446 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）
nt 1447 − 2163 ：オワンクラゲのＣＦＰ（ＥＣＦＰ）
nt 2164 − 2169 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ａｒｇ）
nt 2170 − 2205 ：核外移行シグナル（ＮＥＳ）
nt 2206 − 2208 ：終止コドン

（ii）ＥＶ２０リンカーの合成とＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−２０遺伝子（３５３２ＮＥＳ）の作成
センスプライマーＦ＿２０ａ．ａ＿ｌｉｎｋｅｒ（配列番号：３）およびアンチセンスプライマーＲ＿２０ａ．ａ＿ｌｉｎｋｅｒ （配列番号：４）をアニーリングし、３５２０ＮＥＳのＡｓｐ７１８ＩとＡｏｒ１３ＨＩの制限酵素切断部位に挿入した。この挿入されたヌクレオチドがコードする２０アミノ酸のリンカーをＥＶ２０リンカーと呼ぶ（配列番号：５）。さらに、ＹＰｅｔはＶｅｎｕｓに置換した。作成された一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーをＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−２０（３５３２ＮＥＳ）と命名した。かかる塩基配列（配列番号：６）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：７）を説明する：
nt 1 − 714 ：オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）のＹＦＰ（Ｖｅｎｕｓ）
nt 715 − 720 ：リンカー（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）
nt 721 − 1143 ：酵母のＲａｄ５３遺伝子のＦＨＡ１ドメイン
nt 1143 − 1149 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｔｈｒ）
nt 1150 − 1209 ：ＥＶ２０リンカー（配列番号：５）
nt 1210 − 1215 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）
nt 1216 − 1239 ：ＰＫＡの基質配列
nt 1239 − 1248 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）
nt 1249 − 1965 ：オワンクラゲのＣＦＰ（ＥＣＦＰ）
nt 1966 − 1971 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ａｒｇ）
nt 1972 − 2007 ：核外移行シグナル（ＮＥＳ）
nt 2008 − 2010 ：終止コドン

（iii）Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡ−５２（３５３５ＮＥＳ）の作成
Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡ−２０の哺乳細胞発現ベクターｐＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−２０を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｓｐ７１８Ｉで切断し、サイズの大きいほうの断片をベクターとして調整した。このｐＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−２０断片をＥｃｏＲＩとＡｏｒ１３ＨＩで切断したリンカーを含む部分および、センスプライマーＦ＿１０ａ．ａ＿ｌｉｎｋｅｒ（配列番号：８）およびアンチセンスプライマーＲ＿１０ａ．ａ＿ｌｉｎｋｅｒ（配列番号：９）をアニーリングしたＤＮＡの3者をライゲーションし、pＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−５２を作成した。かかる塩基配列（配列番号：１０）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：１１）を説明する：
nt 1 − 714 ：オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）のＹＦＰ（Ｖｅｎｕｓ）
nt 715 - 720 ：リンカー（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）
nt 721 − 1143 ：酵母のＲａｄ５３遺伝子のＦＨＡ１ドメイン
nt 1144 − 1149 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｔｈｒ）
nt 1150 − 1305 ：ＥＶ５２リンカー（配列番号：１２）
nt 1306 − 1311 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）
nt 1312 − 1335 ：ＰＫＡの基質配列
nt 1336 − 1344 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）
nt 1345 − 2061 ：オワンクラゲのＣＦＰ（ＥＣＦＰ）
nt 2062 − 2067 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ａｒｇ）
nt 2068 − 2103 ：核外移行シグナル（ＮＥＳ）
nt 2104 − 2106 ：終止コドン

（iv）ｐＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−８４（３５３７ＮＥＳ）の作成
Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡ−２０の哺乳細胞発現ベクターｐＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−２０を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｓｐ７１８Ｉで切断し、サイズの大きいほうの断片をベクターとして調整した。このｐＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−２０断片をＥｃｏＲＩとＡｏｒ１３ＨＩで切断したリンカーを含む部分および、センスプライマーF＿１０ａ.ａ＿ｌｉｎｋｅｒ（配列番号：８）およびアンチセンスプライマーＲ＿１０ａ．ａ＿ｌｉｎｋｅｒ（配列番号：９）をアニーリングしたＤＮＡの３者をライゲーションし、Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡ−８４を作成した。かかる塩基配列（配列番号：１３）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：１４）を説明する。：
nt 1 − 714 ：オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）のＹＦＰ（ＹＰｅｔ）
nt 715 − 720 ：リンカー（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）
nt 721 − 1143 ：酵母のＲａｄ５３遺伝子のＦＨＡ１ドメイン
nt 1144 − 1149 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｔｈｒ）
nt 1150 − 1401 ：ＥＶ８４リンカー（配列番号：１５）
nt 1402 − 1407 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）
nt 1408 − 1431 ：ＰＫＡの基質配列
nt 1432 − 1440 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）
nt 1441 − 2157 ：オワンクラゲのＣＦＰ（ＥＣＦＰ）
nt 2158 − 2163 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ａｒｇ）
nt 2164 − 2199 ：核外移行シグナル（ＮＥＳ）
nt 2200 − 2202 ：終止コドン

（v）ｐＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−１１６（３５３６ＮＥＳ）の作成
Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡ−５２の哺乳細胞発現ベクターｐＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−２０を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｓｐ７１８Ｉで切断し、サイズの大きいほうの断片をベクターとして調整した。このｐＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−５２断片をＥｃｏＲＩとＡｏｒ１３ＨＩで切断したリンカーを含む部分および、センスプライマーＦ＿１０ａ.ａ＿ｌｉｎｋｅｒ（配列番号：８）およびアンチセンスプライマーＲ＿１０ａ.ａ＿ｌｉｎｋｅｒ（配列番号：９）をアニーリングしたＤＮＡの3者をライゲーションし、Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡ−１１６を作成した。かかる塩基配列（配列番号：１６）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：１７）を説明する。
nt 1 − 714 ：オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）のＹＦＰ（ＹＰｅｔ）
nt 715 − 720 ：リンカー（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）
nt 721 − 1143 ：酵母のＲａｄ５３遺伝子のＦＨＡ１ドメイン
nt 1144 − 1149 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｔｈｒ）
nt 1150 − 1497 ：ＥＶ１１６リンカー（配列番号：１８）
nt 1498 − 1503 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）
nt 1504 − 1527 ：ＰＫＡの基質配列
nt 1528 − 1536 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）
nt 1537 − 2247 ：オワンクラゲのＣＦＰ（ＥＣＦＰ）
nt 2248 − 2253 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ａｒｇ）
nt 2254 − 2289 ：核外移行シグナル（ＮＥＳ）
nt 2290 − 2292 ：終止コドン

（vi）ｐＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−５（３５２２ＮＥＳ）の作成
一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーｐＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−５は、ＰＣＲ等の公知の方法を用いて作成した。かかる塩基配列（配列番号：１９）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：２０）を説明する。
nt 1 − 714 ：オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）のＹＦＰ（Ｖｅｎｕｓ）
nt 715 − 720 ：リンカー（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）
nt 721 − 1143 ：酵母のＲａｄ５３遺伝子のＦＨＡ１ドメイン
nt 1144 − 1170 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ ）
nt 1171 − 1194 ：ＰＫＡの基質配列
nt 1195 − 1203 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）
nt 1204 − 1920 ：オワンクラゲのＣＦＰ（ＥＣＦＰ）
nt 1921 − 1926 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ａｒｇ）
nt 1927 − 1962 ：核外移行シグナル（ＮＥＳ）
nt 1963 − 1965 ：終止コドン

（vii）ｐＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−１８０（３５９７ＮＥＳ）の作成
ｐＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−１１６を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｓｐ７１８Ｉで切断し、サイズの大きいほうの断片をベクターとして調整した。このｐＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−１１６断片をＥｃｏＲＩとＡｏｒ１３ＨＩで切断したリンカーを含む部分および、センスプライマーＦ＿１０ａ.ａ＿ｌｉｎｋｅｒ（配列番号：８）およびアンチセンスプライマーＲ＿１０ａ.ａ＿ｌｉｎｋｅｒ（配列番号：９）をアニーリングしたＤＮＡの3者をライゲーションし、Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡ−１８０を作成した。さらにＶｅｎｕｓはＹＰｅｔに置換した。かかる塩基配列（配列番号：２１）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：２２）を説明する。
nt 1 − 714 ：オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）のＹＦＰ（ＹＰｅｔ）
nt 715 − 720 ：リンカー（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）
nt 721 − 1143 ：酵母のＲａｄ５３遺伝子のＦＨＡ１ドメイン
nt 1144 − 1149 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｔｈｒ）
nt 1150 − 1689 ：ＥＶ１８０リンカー（配列番号：２３）
nt 1690 − 1695 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）
nt 1696 − 1719 ：ＰＫＡの基質配列
nt 1720 − 1728 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）
nt 1729 − 2439 ：オワンクラゲのＣＦＰ（ＥＣＦＰ）
nt 2440 − 2445 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ａｒｇ）
nt 2446 − 2481 ：核外移行シグナル（ＮＥＳ）
nt 2482 − 2484 ：終止コドン

（vii）ｐＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−２４４（３５９８ＮＥＳ）の作成
ｐＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−１１６を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｓｐ７１８Ｉで切断し、サイズの大きいほうの断片をベクターとして調整した。このｐＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−１１６断片をＥｃｏＲＩとＡｏｒ１３ＨＩで切断したリンカーを含む部分および、センスプライマーＦ＿１０ａ.ａ＿ｌｉｎｋｅｒ（配列番号：８）およびアンチセンスプライマーＲ＿１０ａ.ａ＿ｌｉｎｋｅｒ（配列番号：９）をアニーリングしたＤＮＡの3者をライゲーションし、Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡ−２４４を作成した。かかる塩基配列（配列番号：２４）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：２５）を説明する。
nt 1 − 714 ：オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）のＹＦＰ（ＹＰｅｔ）
nt 715 − 720 ：リンカー（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）
nt 721 − 1143 ：酵母のＲａｄ５３遺伝子のＦＨＡ１ドメイン
nt 1144 − 1149 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｔｈｒ）
nt 1150 − 1881 ：ＥＶ２４４リンカー（配列番号：２６）
nt 1882 − 1887 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）
nt 1888 − 1911 ：ＰＫＡの基質配列
nt 1912 − 1920 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）
nt 1921 − 2631 ：オワンクラゲのＣＦＰ（ＥＣＦＰ）
nt 2632 − 2637 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ａｒｇ）
nt 2638 − 2673 ：核外移行シグナル（ＮＥＳ）
nt 2674 − 2676 ：終止コドン

（２）哺乳類細胞でのＥＶリンカーを含む一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー（Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡ）の発現とタイムラプス蛍光顕微鏡による解析
ここでは、様々な長さのＥＶリンカーを有するＰＫＡのバイオセンサーをＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ、その哺乳細胞発現ベクターをｐＥｅｖｅｅ−ＰＫＡと総称する。哺乳細胞発現ベクターとしては、ｐＣＡＧＧＳ 〔Niwa, H., K. Yamamura, and J. Miyazaki. 1991. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108:193-200. 〕を至適に用いることが出来る。子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞は１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）で培養した。該ＨｅＬａ細胞に前記（１）で得られたｐＥｅｖｅｅ−ＰＫＡを２９３ｆｅｃｔｉｎ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）を用いて、該試薬に添付のプロトコールに従いトランスフェクトした。トランスフェクト後のＨｅＬａ細胞を１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）で培養し、Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡタンパク質を発現させた。トランスフェクションの２４時間後に、培養細胞をタイムラプス蛍光顕微鏡による観察に供した。

かかる顕微鏡は、回転式蛍光励起フィルター装置および回転式蛍光発光フィルター装置（ＬＵＤＬ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ 社製）を備え、さらに高感度冷却ＣＣＤカメラ（日本ローパー社製、ＣｏｏｌＳＮＡＰ−ＨＱ）を備えた、キセノン光源を有する倒立型蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ８１）であり、観察の際は、該顕微鏡の制御ならびに観察結果の解析を日本モレキュラーデバイス社製メタモルフ画像解析ソフトにより行うシステムを用いた。蛍光励起フィルター、蛍光発光フィルター、ダイクロイックミラーはオメガ社より購入した。

前記培養細胞に４４０ｎｍの励起光を照射し、４８０ｎｍのＣＦＰドナーの蛍光波長での画像をＣＣＤカメラにより撮影し、次いで、５３０ｎｍのＹＦＰアクセプターの蛍光波長での画像を撮影した。両画像データをもとに両者の蛍光強度の比を求めることにより各測定点でのＦＲＥＴ効率の指標とした。
ＰＫＡの活性化剤である１ｍＭのヂブチリルｃＡＭＰを添加し、刺激前のＦＲＥＴ効率と比較することでＥｅｖｅｅ−ＰＫＡのゲインを知ることができる。図４に示すように、ＰＫＡの活性化によって変化するゲインは、５２アミノ酸以上の長さのＥＶリンカーを用いることにより顕著に増加することがわかる。
さらに、ＹＦＰドナータンパク質を、ＦＲＥＴに最適化したもの、例えばＹＰｅｔにすることで、その効果はさらに顕著となる（図６）。しかし、その効果は１１６アミノ酸でほぼ飽和しており、それ以上長くしても顕著な効果はない。

このゲインの増大の原因を調べるために、基底状態における蛍光プロフィールを測定した（図７Ａ、Ｂ及びＣ）。ＥＶリンカーが長くなるにつれ、基底状態におけるＹＦＰドナータンパク質の蛍光が減少することがわかった。すなわち、ＥＶリンカーは、基底状態におけるＦＲＥＴを低減させることで高いゲインをもたらしていることがわかった。この効果は２４４アミノ酸まで続いた。

（３）Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡのリン酸化レベルのイムノブロッティングによる解析
前記と同様に、Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡをＨｅＬａ細胞に発現させ、２４時間後に、１ｍＭのヂブチリルｃＡＭＰおよび５０ｎＭカリクリンで処理したのちに、公知の方法で細胞を可溶化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。なお、ＰｈｏｓＴａｇ（ＰｈｏｓＴａｇコンソーシアム）５０μＭを含むポリアクリルアミド６％ゲルをタンパク質の分離に用いた。ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）に転写後、ａｎｔｉ−ＧＦＰ抗体（自家製）と反応させ、引き続き、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識抗ウサギ抗体（ＬＩ−ＣＯＲ社製）でＥｅｖｅｅ−ＰＫＡタンパク質を検出した。結合した蛍光標識抗体はオデッセイ蛍光アナライザー（ＬＩ−ＣＯＲ社製）にて定量した。図８Ａおよび図８Ｂに示すように、ＥＶリンカーは、基底状態におけるリン酸化レベルを著しく低減させていることがわかる。すなわち、リガンドドメインは一般に、センサードメインに結合することにより、活性化状態のセンサードメインが基底状態に戻るのを阻害する効果があるが、ＥＶリンカーはこの効果を低下させ、それによって基底状態のＦＲＥＴを低下させ、このことがゲインの増大をもたらしていることが明らかとなった。

（実施例２）
Ｅｅｖｅｅ−Ａｋｔによるセリンスレオニンリン酸化酵素Ａｋｔの酵素活性の測定
（１）セリンスレオニンリン酸化酵素Ａｋｔの酵素活性を測定するための、ＥＶリンカーを含む一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーをコードする遺伝子の作成
Ｅｅｖｅｅ−Ａｋｔ−８４（３５４７ＮＥＳ）およびＥｅｖｅｅ−Ａｋｔ−１１６（３５４８ＮＥＳ）のＰＫＡ基質配列部位を、Ａｋｔのリン酸化に適したアミノ酸配列に置換した遺伝子を、合成プライマー等を利用して作成した。前記Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡにこの配列を挿入し、かつ、アミノ末端にＡｋｔのＰＨドメインを挿入することにより作成した遺伝子Ｅｅｖｅｅ−Ａｋｔ−８４およびＥｅｖｅｅ−Ａｋｔ−１１６の塩基配列（配列番号：２７，２９）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：２８，３０）を提示する。また、その構造を図９Ａ及びＢに示す。

Ｅｅｖｅｅ−Ａｋｔ−８４（３５４７ＮＥＳ）

nt 1 − 453 ：Ａｋｔタンパク質のＡＨドメイン
nt 454 − 462 ：リンカー（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）
nt 463 − 1176 ：オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）のＹＦＰ（ＹＰｅｔ）
nt 1177 − 1182 ：リンカー（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）
nt 1183 − 1605 ：酵母のＲａｄ５３遺伝子のＦＨＡ１ドメイン
nt 1606 − 1611 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｔｈｒ）
nt 1612 − 1863 ：ＥＶ８４リンカー
nt 1864 − 1869 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）
nt 1870 − 1902 ：ＰＫＡの基質配列
nt 1903 − 1911 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）
nt 1912 − 2622 ：オワンクラゲのＣＦＰ（ＥＣＦＰ）
nt 2623 − 2628 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ａｒｇ）
nt 2629 − 2664 ：核外移行シグナル（ＮＥＳ）
nt 2665 − 2667 ：終止コドン

Ｅｅｖｅｅ−Ａｋｔ−１１６（３５４８ＮＥＳ）

nt 1 − 453 ：Ａｋｔタンパク質のＡＨドメイン
nt 454 − 462 ：リンカー（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）
nt 463 − 1176 ：オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）のＹＦＰ（ＹＰｅｔ）
nt 1177 − 1182 ：リンカー（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）
nt 1183 − 1605 ：酵母のＲａｄ５３遺伝子のＦＨＡ１ドメイン
nt 1606 − 1611 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｔｈｒ）
nt 1612 − 1959 ：ＥＶ１１６リンカー
nt 1864 − 1965 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）
nt 1870 − 1998 ：ＰＫＡの基質配列
nt 1903 − 2007 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）
nt 1912 − 2718 ：オワンクラゲのＣＦＰ（ＥＣＦＰ）
nt 2623 − 2724 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ａｒｇ）
nt 2629 − 2760 ：核外移行シグナル（ＮＥＳ）
nt 2665 − 2763 ：終止コドン

（２）哺乳類細胞でのＥＶリンカーを含む一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー（Ｅｅｖｅｅ−Ａｋｔ）の発現とタイムラプス蛍光顕微鏡による解析
実施例１―（２）に記載の方法により、解析した。ただし、細胞はＣＯＳ７細胞を用いた。図１０に示すように、１１６アミノ酸のＥＶリンカーは顕著に基底状態の顕著な低下をもたらす。

（実施例３）
Ｅｅｖｅｅ−ＥＲＫによるＥＲＫの酵素活性の測定
（１）ＥＲＫの酵素活性を測定するための、ＥＶリンカーを含む一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーＥｅｖｅｅ−ＥＲＫ（３５５０ＮＥＳ）をコードする遺伝子の作成
(i) Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡ−１１６の基質配列部位およびリン酸化ペプチド認識配列をＥＲＫの基質配列に置換したプラスミドを、ＰＣＲおよび合成プライマーを利用して作成した。作成したプラスミドをＥｅｖｅｅ−ＥＲＫと命名した。かかる塩基配列（配列番号：３１）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：３２）を説明する：

nt 1 − 714 ：オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）のＹＦＰ（ＹＰｅｔ）
nt 715 − 720 ：リンカー（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）
nt 721 − 882 ：Ｐｉｎ１遺伝子のＷＷドメイン
nt 1144 − 888 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｔｈｒ）
nt 1150 − 1236 ：ＥＶ１１６リンカー
nt 1498 − 1242 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）
nt 1504 − 1272 ：ＥＲＫの基質配列
nt 1528 − 1281 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）
nt 1537 − 1992 ：オワンクラゲのＣＦＰ（ＥＣＦＰ）
nt 2248 − 2004 ：リンカー（Gly-Ａrg-Ｓｅｒ−Ａｒｇ）
nt 2254 − 2040 ：核外移行シグナル（ＮＥＳ）
nt 2290 − 2043 ：終止コドン

(ii) さらに、ＥＲＫの基質に特有のドッキング配列を付加したベクターも同様に作成し、Ｅｅｖｅｅ−ＥＲＫ−ＤＳ（３５６０ＮＥＳ）と命名した。かかる塩基配列（配列番号：３３）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：３４）を説明する：

nt 1 − 714 ：オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）のＹＦＰ（ＹＰｅｔ）
nt 715 − 720 ：リンカー（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）
nt 721 − 882 ：Ｐｉｎ１遺伝子のＷＷドメイン
nt 883 − 888 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｔｈｒ）
nt 889 − 1236 ：ＥＶ１１６リンカー
nt 1237 − 1242 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）
nt 1243 − 1272 ：ＥＲＫの基質配列
nt 1273 − 1284 ：リンカー（Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ）
nt 1285 − 1296 ：ドッキング配列（Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ）
nt 1297 − 1305 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）
nt 1306 − 2016 ：オワンクラゲのＣＦＰ（ＥＣＦＰ）
nt 2017 − 2028 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ）
nt 2029 − 2064 ：核外移行シグナル（ＮＥＳ）
nt 2065 − 2067 ：終止コドン

（２）哺乳類細胞でのＥＶリンカーを含む一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー（Ｅｅｖｅｅ―ＥＲＫ）の発現とタイムラプス蛍光顕微鏡による解析
実施例１（２）に記載の方法により、解析した。すなわち、ＨｅＬａ細胞にＥｖｅｅ−ＥＲＫを発現させ、ＥＧＦで刺激した。図１１Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤに示すように、ＥＶリンカーを有するバイオセンサー（３５６０ＮＥＳ）は、Ｇｌｙリンカーを含むバイオセンサー（ＥＫＡＲ−１６６７ｎｅｓ）より広いゲインを有する。この効果の一つは、基底状態におけるＦＲＥＴの低さに起因している。

（実施例４）
ＥＶリンカーを含む一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーＰｉｃｃｈｕ−７３４によるチロシンキナーゼ活性の測定
（１）チロシンキナーゼ活性を測定するための、ＥＶリンカーを含む一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーＰｉｃｃｈｕ−７３４の作成
(i) Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡ−１１６（３５３６ＮＥＳ）のＸｈｏＩおよびＡｓｐ７１８Ｉで切断したものにＣｒｋＩＩタンパク質のＳＨ２ドメインを含む領域をＰＣＲにて増幅して挿入した。さらに、基質配列部位を置換し、Ｐｉｃｃｈｕ−７３４の遺伝子を作成した。かかる塩基配列（配列番号：３５）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：３６）を説明する：

nt 1 − 714 ：オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）のＹＦＰ（ＹＰｅｔ）
nt 715 − 720 ：リンカー（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）
nt 721 − 1332 ：ＣＲＫＩＩ遺伝子のＳＨ２ドメイン
nt 883 − 1338 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｔｈｒ）
nt 889 − 1686 ：ＥＶ１１６リンカー
nt 1237 − 1692 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）
nt 1243 − 1719 ：ＣＲＫＩＩのチロシンリン酸化基質配列
nt 1273 − 1728 ：リンカー（Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ）
nt 1306 − 2439 ：オワンクラゲのＣＦＰ（ＥＣＦＰ）
nt 2017 − 2451 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ）
nt 2029 − 2487 ：核外移行シグナル（ＮＥＳ）
nt 2065 − 2490 ：終止コドン

（２）哺乳類細胞でのチロシンキナーゼ活性を測定するための、ＥＶリンカーを含む一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーＰｉｃｃｈｕ−７３４の発現とタイムラプス蛍光顕微鏡による解析。
実施例３−（２）に記載の方法により、解析した。図１２に示すように、ＥＶリンカーを含むＰｉｃｃｈｕバイオセンサー（Ｐｉｃｃｈｕ−７３４）はこれを含まないＰｉｃｃｈｕバイオセンサー（Ｐｉｃｃｈｕ−７３０）〔Kurokawa, K., N. Mochizuki, Y. Ohba, H. Mizuno, A. Miyawaki, and M. Matsuda. 2001. A pair of FRET-based probes for tyrosine phosphorylation of the CrkII adaptor protein in vivo. J.Biol.Chem. 276:31305-31310.〕より広いゲインを有することがわかった。

（実施例５）
Ｒａｉｃｈｕ−Ｒａｃ１によるＲａｃ１活性の測定
（１）Ｒａｃ１活性を測定するための、ＥＶリンカーを含む一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーＲａｉｃｈｕ−Ｒａｃ１（２２４６Ｘ）の作成
(i) Ｒａｃ１活性を測定する一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーＲａｉｃｈｕ−Ｒａｃ１（２２４１Ｘ）は、ＰＣＲ等を用いて、既知のＲａｉｃｈｕ−Ｒａｃ１（１０１１Ｘ）〔非特許文献５〕をもとに作成した。かかる塩基配列（配列番号：３７）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：３８）を説明する：

nt 1 − 714 ：オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）のＹＦＰ（ＹＰｅｔ）
nt 715 − 720 ：リンカー（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）
nt 721 − 969 ：Ｐａｋタンパク質のＣＲＩＢドメイン
nt 883 − 996 ：グリシンリンカー
nt 1237 − 1527 ：Ｒａｃ１
nt 1273 − 1536 ：リンカー（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）
nt 1306 − 2247 ：オワンクラゲのＣＦＰ（Ｔｕｒｑｕｏｉｓｅ）
nt 1273 − 2253 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ａｒｇ）
nt 2017 − 2313 ：ＫＲａｓタンパク質のＣ末端ドメイン
nt 2065 − 2316 ：終止コドン

(i i) Ｒａｃ１活性を測定するＥＶリンカーを含む一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーＲａｉｃｈｕ−Ｒａｃ１（２２４６Ｘ）は、Ｒａｉｃｈｕ−Ｒａｃ１（２２４１Ｘ）をもとに、リンカーを入れ替えることで作成した。かかる塩基配列（配列番号：３９）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：４０）を説明する：

nt 1 − 714 ：オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）のＹＦＰ（ＹＰｅｔ）
nt 715 − 720 ：リンカー（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）
nt 721 − 969 ：Ｐａｋタンパク質のＣＲＩＢドメイン
nt 970 − 1332 ：ＥＶ１１６リンカー
nt 1333 − 1860 ：Ｒａｃ１
nt 1861 − 1869 ：リンカー（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）
nt 1870 − 2580 ：オワンクラゲのＣＦＰ（Ｔｕｒｑｕｏｉｓｅ）
nt 2581 − 2586 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ａｒｇ）
nt 2587 − 2646 ：ＫＲａｓタンパク質のＣ末端ドメイン
nt 2647 − 2649 ：終止コドン

（２）哺乳類細胞でのＲａｃ１活性を測定するための、ＥＶリンカーを含む一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーをＲａｉｃｈｕ−Ｒａｃ１の発現とタイムラプス蛍光顕微鏡による解析。
実施例３−（２）に記載の方法により、解析した。図１３Ａおよび図１３Ｂに示すように、ＥＶリンカーを有するＲａｉｃｈｕバイオセンサー（Ｒａｉｃｈｕ−２２４６Ｘ）は通常のリンカーを有するＲａｉｃｈｕバイオセンサー（Ｒａｉｃｈｕ−２２４１Ｘ）よりも基底状態におけるＦＲＥＴが低く、ＥＧＦ刺激下に観察される上昇、すなわち感度が大きく上昇している。

（３）Ｒａｉｃｈｕ−Ｒａｃ１（２２４６Ｘ）を安定発現する細胞株の樹立。
Ｒａｉｃｈｕ−Ｒａｃ１（２２４６Ｘ）の遺伝子をｐＰＢプラスミドに挿入した。このプラスミドと、トランスポゼース発現ベクター（ｐＣＭＶ−ｍＰＢａｓｅ）〔Yusa, K., R. Rad, J. Takeda, and A. Bradley. 2009. Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon. Nat.Methods 6:363-369. 〕と同時にＣ６細胞にトランスフェクトし、２日後にＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎｅを１０μｇ／ｍｌの濃度に添加し、２週間培養を続けた。その後、９６ウェル培養皿でクローニングを行った。その結果、バイオセンサーを安定に発現する培養細胞株の樹立に成功した。この細胞株を用いることにより、長期間にわたってＲａｃ１の活性をモニターすることができた。（図１４Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）。

（実施例６）
Ｒａｉｃｈｕ−Ｃｄｃ４２（２２５３Ｘ）によるＣｄｃ４２活性の測定
（１）Ｃｄｃ４２活性を測定するための、ＥＶリンカーを含む一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーＲａｉｃｈｕ−Ｃｄｃ４２（２２５３Ｘ）の作成
(i) Ｃｄｃ４２活性を測定する一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーＲａｉｃｈｕ−Ｃｄｃ４２（２２５３Ｘ）は、ＰＣＲ等を用いて、既知のＲａｉｃｈｕ−Ｃｄｃ４２（１０５４Ｘ）をもとに作成した。作成した遺伝子Ｒａｉｃｈｕ−Ｃｄｃ４２（２２５３Ｘ）の塩基配列（配列番号：４１）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：４２）を提示する。
nt 1 − 714 ：オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）のＹＦＰ（ＹＰｅｔ）
nt 715 − 720 ：リンカー（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）
nt 721 − 969 ：Ｐａｋタンパク質のＣＲＩＢドメイン
nt 970 − 1332 ：ＥＶ１１６リンカー
nt 1333 − 1857 ：Ｃｄｃ４２
nt 1858 − 1866 ：リンカー（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）
nt 1867 − 2577 ：オワンクラゲのＣＦＰ（Ｔｕｒｑｕｏｉｓｅ）
nt 2578 − 2583 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ａｒｇ）
nt 2584 − 2643 ：ＫＲａｓタンパク質のＣ末端ドメイン
nt 2644 − 2646 ：終止コドン

（２）哺乳類細胞でのＣｄｃ４２活性を測定するためのＥＶリンカーを含む一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーＲａｉｃｈｕ−Ｃｄｃ４２の発現とタイムラプス蛍光顕微鏡による解析。
実施例３−（２）に記載の方法により、解析した。図１５Ａから図１５Ｃに示すように、このバイオセンサーも基底状態における低いＦＲＥＴが観察され、これまで困難であったＥＧＦ刺激依存性のＣｄｃ４２の活性化を高感度に検出することが出来るようになった。

（実施例８）
Ｒａｉｃｈｕ−ＨＲａｓ（３７０５Ｘ）によるＨＲａｓ活性の測定
（１）ＨＲａｓ活性を測定するための、ＥＶリンカーを含む一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーＲａｉｃｈｕ−ＨＲａｓ（３７０５Ｘ）の作成
(i) ＨＲａｓ活性を測定する一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーＲａｉｃｈｕ−ＨＲａｓ（３７０５Ｘ）は、ＰＣＲ等を用いて、既知のＲａｉｃｈｕ−ＨＲａｓ〔Mochizuki, N., S. Yamashita, K. Kurokawa, Y. Ohba, T. Nagai, A. Miyawaki, and M. Matsuda. 2001. Spacio-temporal images of growth factor-induced activation of Ras and Rap1. Nature 411:1065-1068.〕をもとに作成した。作成した遺伝子Ｒａｉｃｈｕ−ＨＲａｓ（３７０５Ｘ）の塩基配列（配列番号：４３）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：４４）を提示する。
nt 1 − 714 ：オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）のＹＦＰ（ＹＰｅｔ）
nt 715 − 720 ：リンカー（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）
nt 721 − 1236 ：ＨＲａｓタンパク質
nt 1237 − 1602 ：ＥＶ１１６リンカー
nt 1603 − 1845 ：Ｒａｆタンパク質のＲＢＤドメイン
nt 1846 − 1854 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）
nt 1855 − 2565 ：オワンクラゲのＣＦＰ（Ｔｕｒｑｕｏｉｓｅ）
nt 2566 − 2571 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ａｒｇ）
nt 2584 − 2631 ：ＫＲａｓタンパク質のＣ末端ドメイン
nt 2632 − 2634 ：終止コドン

（２）哺乳類細胞でのＨＲａｓ活性を測定するためのＥＶリンカーを含む一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーＲａｉｃｈｕ−ＨＲａｓの発現とタイムラプス蛍光顕微鏡による解析。
実施例３−（２）に記載の方法により、解析した。図１６Ａ及びＢにはタイムラプスＦＲＥＴイメージングのデータを示している。プロトタイプのＨＲａｓ〔Mochizuki, N., S. Yamashita, K. Kurokawa, Y. Ohba, T. Nagai, A. Miyawaki, and M. Matsuda. 2001. Spacio-temporal images of growth factor-induced activation of Ras and Rap1. Nature 411:1065-1068.〕より早期にかつ、強く活性化を検出できていることがわかる。

（実施例１０）
Ｅｅｖｅｅ−ＥＲＫ（３５６０ＮＥＳ）およびＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ（３５３６ＮＥＳ）を発現するトランスジェニックマウスの作成
（１）ＥＲＫおよびＰＫＡの酵素活性を測定するための、ＥＶリンカーを含む一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーＥｅｖｅｅ−ＥＲＫ（３５６０ＮＥＳ）およびＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ（３５３６ＮＥＳ）をコードする遺伝子の受精卵へのマイクロインジェクション
実施例１に記載のＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ（３５３６ＮＥＳ）あるいは実施例３に記載のＥｅｖｅｅ−ＥＲＫ（３５６０ＮＥＳ）遺伝子を含む哺乳細胞発現プラスミドを、トランスポゾン認識配列を有するプラスミドｐＴ２Ａに挿入した。このプラスミドと、Ｔｏｌ２トランスポゾンを既報のとおりマイクロインジェクションした〔Sumiyama, K., K. Kawakami, and K. Yagita. 2010. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics 95:306-311. 〕。

（２）バイオセンサーを発現するトランスジェニックマウスのスクリーニング
生まれたマウスは、４２０ｎｍのＬＥＤで照射し、４７０ｎｍの短波長カットフィルターを使い、カラーデジタルカメラで撮影して緑色蛍光を確認することで容易に組み込みの起きたマウスを同定することができる。また、胎児の矢状断のＦＲＥＴ画像を実施例１に記載の蛍光顕微鏡で撮影することで、ＥＲＫあるいはＰＫＡ活性の空間分布を調べることもできる（図１７）。

（実施例１１）
Ｅｅｖｅｅ−ＥＲＫ（３５６０ＮＥＳ）を発現する細胞株を用いた薬剤感受性試験
（１）ＥＲＫの酵素活性を測定するための、ＥＶリンカーを含む一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーＥｅｖｅｅ−ＥＲＫ（３５６０ＮＥＳ）をコードする遺伝子を安定発現する細胞株の樹立
実施例３に記載のＥｅｖｅｅ−ＥＲＫ（３５６０ＮＥＳ）遺伝子を含む哺乳細胞発現プラスミドを、トランスポゾン認識配列を有するプラスミドに挿入した。このプラスミドと、トランスポゾン発現ベクターを既報のとおりトランスフェクションし、ブラストサイジンでバイオセンサー発現細胞株を選別した〔Yusa, K., R. Rad, J. Takeda, and A. Bradley. 2009. Generation of
transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon.
Nat.Methods 6 (5):363-369〕。

（２）バイオセンサーを安定発現する細胞株でのＦＲＥＴ測定を行った。
培養細胞株を９６ウェル培養皿に植え、段階希釈した阻害剤を入れたのちに、２５ｎｇ/ｍｌのＥＧＦで刺激した。３０分後に、実施例３に記載のとおりＥＲＫの活性を測定した（図１８Ａ〜図１８Ｈ）。３０個以上の細胞について、ＥＲＫの活性を測定し、平均したものをグラフ化した。用いた阻害剤はＥＧＦ受容体阻害剤（ＡＧ１４７８）、ＭＥＫ阻害剤（ＰＤ１５０３５、ＰＤ１８４３５１）、ＢＲＡＦの阻害剤（ＰＬＸ４７２０）、ホスファチジルイノシトール３リン酸キナーゼの阻害剤（ＬＹ２９４００２）、ＲＳＫの阻害剤（ＢＩ−Ｄ１８７０）、ＪＮＫの阻害剤（ＪＮＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＶＩＩＩ）である。結果はＥＧＦ依存性のＥＲＫ活性化が、ＨｅＬａ細胞においてはＥＧＦ受容体（ＡＧ１４７８）およびＭＥＫの阻害剤（ＰＤ１５３０３５、ＰＤ１８４３５２）によって効果的に抑制されることを示している。ＥＧＦ依存性のＥＲＫ活性化が、これらの阻害剤によって濃度依存性に阻害されることが、生細胞を用いてきわめて容易に測定できた。

（実施例１２）
Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡ（３５３６ＮＥＳ）を発現するトランスジェニックマウスを用いた薬剤感受性試験
（１）Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡ（３５３６ＮＥＳ）を発現するトランスジェニックマウスの小腸イメージング
実施例１０で作成したＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ（３５３６ＮＥＳ）を発現するトランスジェニックマウスをイソフルレンで麻酔し、小腸をオリンパス社製倒立型二光子顕微鏡ＩＸ８１/ＦＶ１０００にてタイムラプス撮影した。Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃｓ社のチタンサファイヤレーザＭａｉ Ｔａｉ ＤｅｅｐＳｅｅ ＨＰを用いて、細胞を８４０ｎｍで励起し、ＣＦＰの蛍光をＢＡ４６０-５００
(オリンパス)蛍光フィルター、ＹＦＰの蛍光をＢＡ５２０-５６０ (オリンパス)にて取得し、実施例３に記載のようにＦＲＥＴ画像を作成した。

（２）生きたマウスでの薬剤効果の可視化
マウスにホスホジエステラーゼの阻害剤であるテオフィリンおよび環状アデノシン三リン酸のアナログであるアクトシンをそれぞれ静注し、ＰＫＡの活性を測定した。図１９および図２０に示すように、筋間神経細胞、腸管平滑筋、血管平滑筋のそれぞれにおけるＰＫＡの活性変化がリアルタイムに可視化できる。

（実施例１３）
リンカーの長さを長くすると、プロテアーゼによる分解が起こりやすくなることが懸念される。そこで、リンカーからグリシンを減らして、アルファヘリクスを獲りやすいアラニンを増加させたリンカーである、ＥＶ３ｘ８およびＥＶ６ｘ４を作成し、ゲインを調べた。
（１）（ｉ）Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡ−３ｘ８（３６７６ＮＥＳ）の作成
実施例１（１）（ｉｉｉ）と同様に、Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡ−２０の哺乳細胞発現ベクターｐＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−２０を制限酵素Ａｓｐ７１８ＩとＡｏｒ１３ＨＩで切断し、サイズの大きいほうの断片をベクターとして調整した。ＥＶ３ｘ８リンカー（配列番号：４５）に対応するＤＮＡに制限酵素Ａｓｐ７１８ＩとＡｏｒ１３ＨＩを両端に付加したＤＮＡは、合成した。このＤＮＡをＡｓｐ７１８ＩとＡｏｒ１３ＨＩで切断したものをインサートとして用いた。インサートとベクターをライゲーションし、pＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−３ｘ８を作成した。かかる塩基配列（配列番号：４７）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：４８）を説明する：
nt 1 − 714 ：オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）のＹＦＰ（ＹＰｅｔ）
nt 715 − 720 ：リンカー（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）
nt 721 − 1143 ：酵母のＲａｄ５３遺伝子のＦＨＡ１ドメイン
nt 1144 − 1149 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｔｈｒ）
nt 1150 − 1551 ：ＥＶ３ｘ８リンカー（配列番号：４５）
nt 1552 − 1557 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）
nt 1558 − 1581 ：ＰＫＡの基質配列
nt 1582 − 1590 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）
nt 1591 − 2307 ：オワンクラゲのＥＣＦＰ
nt 2308 − 2313 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ａｒｇ）
nt 2314 − 2349 ：核外移行シグナル（ＮＥＳ）
nt 2350 − 2352 ：終止コドン

（１）（ｉｉ）Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡ−６ｘ４（３６７７ＮＥＳ）の作成
Ｅｅｖｅｅ−ＰＫＡ−２０の哺乳細胞発現ベクターｐＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−２０を制限酵素Ａｓｐ７１８ＩとＡｏｒ１３ＨＩで切断し、サイズの大きいほうの断片をベクターとして調整した。ＥＶ６ｘ４リンカー（配列番号：４６）に対応するＤＮＡに制限酵素Ａｓｐ７１８ＩとＡｏｒ１３ＨＩを両端に付加したＤＮＡは、合成した。このＤＮＡをＡｓｐ７１８ＩとＡｏｒ１３ＨＩで切断したものをインサートとして用いた。インサートとベクターをライゲーションし、pＥｅｖｅｅ−ＰＫＡ−６ｘ４を作成した。かかる塩基配列（配列番号：４９）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：５０）を説明する：
nt 1 − 714 ：オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）のＹＦＰ（ＹＰｅｔ）
nt 715 − 720 ：リンカー（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）
nt 721 − 1143 ：酵母のＲａｄ５３遺伝子のＦＨＡ１ドメイン
nt 1144 − 1149 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｔｈｒ）
nt 1150 − 1521 ：ＥＶ６ｘ４リンカー（配列番号：４６）
nt 1522 − 1527 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）
nt 1528 − 1551 ：ＰＫＡの基質配列
nt 1552 − 1560 ：リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）
nt 1561 − 2277 ：オワンクラゲのＥＣＦＰ
nt 2278 − 2283 ：リンカー（Ｓｅｒ−Ａｒｇ）
nt 2284 − 2319 ：核外移行シグナル（ＮＥＳ）
nt 2320 − 2322 ：終止コドン
（２） 実施例１と同様にゲインを調べたところ、ＥＶ３ｘ８およびＥＶ６ｘ４とも、１１６アミノ酸と匹敵するゲインを有することが分かった（図２１）。

本発明によれば、非侵襲的なセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性などの測定を可能にするＥＶリンカー及び概ＥＶリンカーを含む一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー；該ＥＶリンカー又はバイオセンサーをコードする遺伝子；該遺伝子を含む発現ベクター；前記バイオセンサーを発現し、非侵襲的なセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性の測定に有用な前記発現ベクターを保持する形質転換された細胞およびトランスジェニック非ヒト動物；前記バイオセンサーを用いるセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を測定する方法、ならびにセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法が提供される。

Claims (21)

1. 蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーのリンカーであって、５２アミノ酸残基以上４００アミノ酸残基以下を含むポリペプチドであって、全アミノ酸残基数の少なくとも４５％がグリシン及びアラニンの少なくともいずれかであり、下記（ｉ）及び（ｉｉ）のいずれかを満たすことを特徴とするリンカー、
   （ｉ）全アミノ酸残基数の少なくとも９５％がグリシン、セリン、スレオニン及びアラニンであり、全アミノ酸残基数の３５％から６５％がグリシンであり、全アミノ酸残基数の１０％から４０％がセリン及びスレオニンの少なくともいずれかであり、全アミノ酸残基数の１０％から４０％がアラニンであり、全アミノ酸配列の少なくとも８８％がＳＡＧＧ及びＧＧＡＳのいずれかのアミノ酸配列の繰り返しからなるリンカー、
   （ｉｉ）全アミノ酸残基数の少なくとも１０％がアルギニン及びグルタミン酸の少なくともいずれかであり、全アミノ酸残基数の少なくとも９５％がグリシン、アルギニン、グルタミン酸及びアラニンであり、全アミノ酸残基数の４％から３０％がグリシンであり、全アミノ酸残基数の５％から３０％がアルギニンであり、全アミノ酸残基数の５％から３０％がグルタミン酸であり、全アミノ酸残基数の３０％から６０％がアラニンであり、全アミノ酸配列の少なくとも８９％がＥＡＡＡＲのアミノ酸配列の繰り返しからなるリンカー。
2. ８４アミノ酸残基以上を含むポリペプチドである請求項１に記載のリンカー。
3. 下記（ｉ）を満たす請求項１に記載のリンカー、
   （ｉ）全アミノ酸残基数の少なくとも９５％がグリシン、セリン、スレオニン及びアラニンであり、全アミノ酸残基数の３５％から６５％がグリシンであり、全アミノ酸残基数の１０％から４０％がセリン及びスレオニンの少なくともいずれかであり、全アミノ酸残基数の１０％から４０％がアラニンであり、全アミノ酸配列の少なくとも８８％がＳＡＧＧ及びＧＧＡＳのいずれかのアミノ酸配列の繰り返しからなるリンカー。
4. ＳＡＧＧ及びＧＧＡＳのいずれかのアミノ酸配列の繰り返し単位を１３個以上１００個以下含む請求項３に記載のリンカー。
5. ＳＡＧＧ及びＧＧＡＳのいずれかのアミノ酸配列の繰り返し単位を１２個以上５４個以下含む請求項３に記載のリンカー。
6. 配列番号：１２、配列番号：１５、配列番号：１８、配列番号：２３、及び配列番号：２６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる請求項３から５のいずれかに記載のリンカー。
7. 下記（ｉｉ）を満たす請求項１に記載のリンカー、
   （ｉｉ）全アミノ酸残基数の少なくとも１０％がアルギニン及びグルタミン酸の少なくともいずれかであり、全アミノ酸残基数の少なくとも９５％がグリシン、アルギニン、グルタミン酸及びアラニンであり、全アミノ酸残基数の４％から３０％がグリシンであり、全アミノ酸残基数の５％から３０％がアルギニンであり、全アミノ酸残基数の５％から３０％がグルタミン酸であり、全アミノ酸残基数の３０％から６０％がアラニンであり、全アミノ酸配列の少なくとも８９％がＥＡＡＡＲのアミノ酸配列の繰り返しからなるリンカー。
8. 配列番号：４５及び配列番号：４６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる請求項７に記載のリンカー。
9. 請求項１から８のいずれかに記載のリンカーをコードすることを特徴とする遺伝子。
10. 請求項１から８のいずれかに記載のリンカーをコードする遺伝子を含むことを特徴とする発現ベクター。
11. 請求項１０に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とする形質転換された細胞。
12. 請求項１０に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物。
13. 蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーであって、センサー領域、リガンド領域、アクセプター蛍光タンパク質領域、ドナー蛍光タンパク質領域、及び、該センサー領域と該リガンド領域とを連結するリンカー領域を有する融合タンパク質であり、該リンカー領域が、請求項1から８のいずれかに記載のリンカーからなることを特徴とする一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー。
14. 該ドナー蛍光タンパク質がＹＰｅｔである請求項１３に記載の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー。
15. 請求項１３及び１４のいずれかに記載の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーをコードすることを特徴とする遺伝子。
16. 請求項１５に記載の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーをコードする遺伝子を含むことを特徴とする発現ベクター。
17. 請求項１６に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とする形質転換された細胞。
18. 請求項１６に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物。
19. 請求項１３に記載の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを用いてＦＲＥＴを検出する工程を含み、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質活性のいずれかを測定することを特徴とする測定方法。
20. 請求項１７に記載の形質転換された細胞または請求項１８に記載のトランスジェニック非ヒト動物を用いてＦＲＥＴを検出する工程を含み、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質活性のいずれかを測定することを特徴とする測定方法。
21. （ａ）請求項１７に記載の形質転換された細胞と被検物質とを接触させる工程、及び
    （ｂ）ＦＲＥＴを検出することによりセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質活性のいずれかの変化を検出する工程、
    を含む、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質活性のいずれかの調節物質のスクリーニング方法。