CN103512878B

CN103512878B - 基于GO和GQDs之间ECL-RET作用的传感器制备方法及激酶检测应用

Info

Publication number: CN103512878B
Application number: CN201310356006.8A
Authority: CN
Inventors: 邱建丁; 向彩云; 梁汝萍
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2013-08-16
Filing date: 2013-08-16
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2033-08-16
Also published as: CN103512878A

Abstract

本发明公开了一种基于GO和GQDs之间ECL-RET作用的传感器制备方法及激酶检测应用，属于电致化学发光领域；它先将壳聚糖滴涂于电极表面，通过共价作用先后将石墨烯量子点和多肽组装到电极表面；在蛋白激酶和三磷酸腺苷的作用下，多肽发生磷酸化，通过抗原-抗体之间的特异性识别作用，磷酸化抗体共轭的氧化石墨烯被组装到多肽的磷酸化丝氨酸位点上，拉近了氧化石墨烯和石墨烯量子点之间的距离，使得石墨烯量子点的电致化学发光被猝灭。蛋白激酶的浓度越大，多肽修饰电极表面产生的磷酸化位点越多，组装于传感界面的氧化石墨烯就越多，对石墨烯量子点的电致化学发光猝灭效应越强，实现了对蛋白质激酶的高灵敏检测。

Description

基于GO和GQDs之间ECL-RET作用的传感器制备方法及激酶检测应用

技术领域

本发明涉及电致化学发光领域，尤其涉及一种基于GO和GQDs之间ECL-RET作用的传感器制备方法及激酶检测应用。

背景技术

石墨烯是一种二维自由态原子晶体，它是构筑维富勒烯、一维碳纳米管、三维体相石墨等sp²杂化碳的基本结构单元，自2004年首次报道以来，引起了国内外研究者们的极大关注。石墨烯优良的电化学、力学和热力学性质，使得其广泛应用于聚合物材料、传感器、与能量相关的材料和场效应晶体管等研究。然而，石墨烯是一种零带隙材料，很难观察到其发光现象。因此，运用各种方式处理石墨烯的带隙并拓展其发光应用，引起了科学家极大的研究兴趣，如，通过掺杂打开石墨烯的带隙，通过部分还原和表面钝化利用氧化石墨烯(GO)，将石墨烯材料腐蚀切割成石墨烯量子点(GQDs)以诱导其光致发光(PL)等。尤其是新发现的GQDs，为电致化学发光(ECL)研究和应用提供了良好材料。然而，迄今为止，GQDs在ECL方面的研究应用非常少。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种基于GO和GQDs之间ECL-RET作用的传感器制备方法及激酶检测应用，它制备的传感器具有检测灵敏、选择性好和稳定性好的优点。

本发明是这样来实现的，一种基于氧化石墨烯和石墨烯量子点之间电致化学发光能量转移（ECL-RET）作用的传感器制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤：

（1）采用Hummers方法制备GO：将1.0 g石墨和1.0 g NaNO₃加入到46 mL的质量百分浓度为98%的H₂SO₄中，冰浴下缓慢加入6.0 g KMnO₄，于35℃水浴中搅拌1 h，加入80 mL超纯水，继续搅拌30 min，再加入200 mL超纯水后，逐滴加入6 mL的质量百分浓度为30%的H₂O₂，室温下反应1 h；将产物趁热过滤并用超纯水清洗至滤液为中性，将产物分散到500 mL超纯水中，超声处理2 h，即制得均匀分散的GO；

（2）利用水热法制备GQDs：将干燥的GO置于管式炉中，在N₂保护的条件下，以5℃/min的升温速率加热到200℃并保持2 h，得到石墨烯片；将0.05 g石墨烯片加入到体积比为1:3的浓硫酸:浓硝酸的混合溶液中超声17 h，加入250 mL超纯水稀释；用0.22μm微孔滤膜过滤，将收集的滤饼悬浮在40 mL超纯水中，用NaOH调节溶液pH为8后，转移入反应釜中于200℃反应12 h，冷却到室温；用0.22μm的微孔滤膜过滤除去大体积的石墨烯片，得到的棕色滤液即为GQDs溶液；所述的浓硫酸的质量百分浓度为98%，浓硝酸的质量百分浓度为68%；

（3）羧基化GQDs的制备：将0.05 g的NaOH和0.1 g的氯乙酸钠加入到20 mL的GQDs溶液中，超声反应3 h，用盐酸调节溶液pH为中性，即得到羧基化的GQDs；

（4）抗磷酸化丝氨酸抗体氧化石墨烯（Ab-GO）复合物的制备：将200μL、1 mg/mL的GO和200μL、5 μg/mL的抗磷酸化丝氨酸抗体（Ab）混合，室温条件下反应12 h；将产物在10000 rpm下离心30 min，用超纯水清洗3次，将产物重悬于10 mM、pH 7.4的磷酸盐（PBS）缓冲溶液中，4℃下保存；

（5）ECL传感器的制备：玻碳电极先在粒径为1.0，0.3，0.05μm的α-Al₂O₃糊中抛光，再用乙醇和水超声清洗1 min。将10 μL、质量百分浓度为0.5%的壳聚糖溶液滴涂到玻碳电极表面并晾干后，将电极浸入到含有5 mM的N-乙基-N’-1-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的羧基化GQDs溶液中，室温下孵化5 h；用10 mM、pH 7.4的PBS缓冲溶液清洗后，将电极插入到含有5 mM的EDC、8 mM的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和50 μM的多肽溶液中反应3 h；再将电极插入到含有蛋白激酶（CK2）和三磷酸腺苷（ATP）的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris）缓冲溶液中反应2 h，使多肽发生磷酸化；将磷酸化多肽修饰电极在Ab-GO复合物溶液中孵化1 h，即制得ECL传感器；上述步骤中，所述的壳聚糖溶液的配制方法为将壳聚糖加入到质量百分比为1%的醋酸溶液中并超声溶解。所述的Tris缓冲溶液的浓度为20 mM，pH为7.4，包含20 mM的MgCl₂。

激酶检测应用是指传感器对蛋白激酶活性及其抑制剂的检测：随着CK2浓度的增加，多肽修饰电极表面产生的磷酸化位点越多，组装到GQDs修饰电极表面的GO就越多，在含有0.1 M Na₂S₂O₈和0.1 M KCl的PBS缓冲溶液中，电极表面捕获的GO对GQDs的电致化学发光产生的猝灭效应越强，使得ECL信号逐渐下降，CK2浓度在0.01-5 U/mL范围内与ECL信号呈线性关系，对CK2的检测限为0.023 U/mL；ECL强度随着CK2抑制剂浓度的增大而增强，当鞣花酸浓度为0.15μM时，ECL信号达到最大，计算得到的鞣花酸的半抑制浓度为0.043μM。所述的PBS缓冲溶液的浓度为0.1 M，pH为7.4。

本发明的技术效果是：本发明利用GO与GQDs之间的电致化学发光能量转移，使得GO对GQDs的电致化学发光产生猝灭，构建了一种用于对蛋白激酶活性及其抑制剂检测的ECL生物传感器，此传感器具有高灵敏度、检测限低和稳定性好等特点。

附图说明

图1是ECL生物传感器检测CK2活性和抑制剂的原理图。

图2是（A）GO和（B）GQDs的透射电微镜图；（C）(a) GO、(b) GQDs和(c) GQDs-COOH的FTIR图；(D) GQDs-COOH的(a)紫外吸收光谱和(b)荧光光谱，内插图为GQDs (1, 2)和GQD-COOH (3, 4)在可见光(1, 3)和紫外光(2, 4)下的对比图。

图3是(a)玻碳电极，(b) CS、(c) GQDs/CS、(d)多肽/GQDs/CS修饰电极以及电极(d)在(e)磷酸化前和(f)磷酸化后在含0.1 M Na₂S₂O₈和0.1 M KCl的PBS (0.1 M，pH 7.4)中的ECL强度-电位图。扫描速率为100 mV/s，光电倍增管的电位为800 V。

图4是(a)玻碳电极，(b) CS、(c) GQDs/CS、(d)多肽/GQDs/CS、(e)磷酸化多肽/GQDs/CS和(f) GO-Ab/磷酸化多肽/GQDs/CS修饰玻碳电极在含有5 mM的[Fe(CN)₆]^3-/4-和0.1 M的KCl的PBS溶液中的循环伏安和交流阻抗。扫描速率为100 mV/s，频率范围为0.1-10⁵ Hz和扰动电压为5 mV。

图5是(a) CS、(b) GQDs/CS、(c)多肽/GQDs/CS和(d) GO-Ab/磷酸化多肽/GQDs/CS修饰电极的AFM图。

图6是不同浓度CK2的（A）ECL强度-时间曲线和（B）标准曲线。曲线a-j为0，0.1，0.5，2，5，7，10，20 U/mL的CK2。其他条件与图3相同。

图7是（A）ECL强度与鞣花酸浓度的关系图。（B）传感器对鞣花酸、DRB、大黄素和槲皮素的选择性。其他条件与图3相同。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，本发明并不限于此。

实施例1

（2）利用水热法制备GQDs：将干燥的GO置于管式炉中，在N₂保护的条件下，以5℃/min的升温速率加热到200℃并保持2 h，得到石墨烯片；将0.05 g石墨烯片加入到体积比为1:3的浓硫酸:浓硝酸的混合溶液中超声17 h，其中浓硫酸的质量百分浓度为98%，浓硝酸的质量百分浓度为68%；然后加入250 mL超纯水稀释；用0.22μm微孔滤膜过滤，将收集的滤饼悬浮在40 mL超纯水中，用NaOH调节溶液pH为8后，转移入反应釜中于200℃反应12 h，冷却到室温；用0.22μm的微孔滤膜过滤除去大体积的石墨烯片，得到的棕色滤液即为GQDs溶液；

（4）抗磷酸化丝氨酸抗体氧化石墨烯（Ab-GO）复合物的制备：将200μL、1 mg/mL的GO和200μL、5μg/mL的抗磷酸化丝氨酸抗体（Ab）混合，室温条件下反应12 h；将产物在10000 rpm下离心30 min，用超纯水清洗3次，将产物重悬于10 mM、pH 7.4的PBS缓冲溶液中，4℃下保存；

采用透射电镜（TEM）对GO和GQDs合成进行表征。由图可见，GO以单层或者2层形式存在，表面有皱褶（图2A）；当采用水热合成法处理GO后，获得了均匀分散且粒径为3-5 nm的GQDs（图2B）。

采用傅里叶红外光谱（FTIR）对制备的GO和GQDs进行表征（图2C）。曲线a在3440 cm^-1（υ_-OH）、1640 cm^-1（υ_C=O）、1380 cm^-1（υ_O-H）、1240 cm^-1（υ_C-O/COOH）和1052 cm^-1（υ_C-O-C）处呈现出GO的特征吸收峰，表明成功制备了GO。与GO相比，GQDs在1240 cm^-1处C-O/COOH的伸缩振动减弱，而在1052 cm^-1处环氧基团的伸缩振动消失（曲线b），表明GO在热还原过程中，边缘和基底的含氧基团被破坏，除去了桥梁氧原子，被切割为小片的GQDs。为了将GQDs通过酰胺反应组装到壳聚糖修饰电极表面，采用氯乙酸钠对GQDs进行羧基化，由曲线c可见，在1725cm^?1、1240 cm^?1和1052 cm^?1处的吸收峰增强，表明采用本方法成功将GQDs羧基化，制备了GQDs-COOH。

采用紫外-可见吸收光谱（UV-vis）对GQD-COOH的形成进行表征（图2D）。曲线a在310 nm处呈现出GQDs的微弱肩峰；采用光致发光法（PL）对GQDs和GQDs-COOH的光学性质进行了表征（图2D）。在310 nm激发下，GQDs（曲线b）和GQDs-COOH（曲线c）在450 nm处均出现一个强吸收峰。而且，GQDs（1）和GQDs-COOH（3）在可见光下均为黄色溶液，在365 nm紫外灯的照射下，GQDs（2）和GQDs-COOH（4）均发出强烈的蓝光，表明羧基化之后没有改变GQDs的光学性质。

实施例2

ECL生物传感器的制备过程

（1）玻碳电极的预处理：玻碳电极在修饰之前，先在粒径为1.0，0.3，0.05μm的α-Al₂O₃糊中抛光，再用乙醇和水超声清洗1 min；

（2）ECL生物传感器的制备过程如图1所示。将10 μL、质量百分浓度为0.5%的壳聚糖溶液滴涂到玻碳电极表面并晾干后，将电极浸入到含有5 mM的EDC的GQDs-COOH溶液中，室温下孵化5 h；用10 mM、pH 7.4的PBS缓冲溶液清洗后，将电极插入到含有5 mM的EDC、8 mM的NHS和50 μM的多肽溶液中反应3 h；再将电极插入到含有CK2和ATP的Tris缓冲溶液中反应2 h，使多肽发生磷酸化；将磷酸化多肽修饰电极在Ab-GO溶液中孵化1 h，即制得ECL传感器；

图3为不同修饰电极在的ECL强度-电位图。裸电极（曲线a）和壳聚糖修饰电极（曲线b）的ECL强度很低；当将GQDs组装到电极表面后，在-1.6 V处的ECL响应迅速增大（曲线c）；将多肽共价结合到GQDs/CS电极表面后，GQDs的ECL响应稍有下降（曲线d），这可能是由于多肽增大了电极表面的电阻，从而降低了Na₂S₂O₈和GQDs的ECL反应速率；当没有CK2存在时，电极表面的多肽不发生磷酸化，不能将Ab-GO捕获到电极表面，因而，ECL响应仅稍有下降（曲线e）；当向溶液中加入5 U/mL CK2和50μM ATP后，电极表面的多肽发生磷酸化，在抗原-抗体的特异性识别作用下，Ab-GO被组装到电极表面，从而拉近了GO和GQDs之间的距离，GO与GQDs之间发生ECL-RET作用，导致GQDs的ECL响应大大降低（曲线f）。

采用电化学交流阻抗法对传感器的制备过程进行表征（图4）。裸玻碳电极的电子传递阻力（R_et）很低（曲线a）；当将壳聚糖修饰到电极表面后，电极的R_et增大（曲线b）；将GQDs键合到电极表面后, R_et增加为605 Ω（曲线c），这是由于GQDs带负电，静电排斥溶液中的Fe(CN)₆]^3?/4?向电极表面传递；当将多肽修饰到电极表面后，R_et增大为725 Ω（曲线d）；当CK2和ATP将电极表面修饰的多肽发生磷酸化之后，R_et继续增大（曲线e）；当通过抗原-抗体的特异性作用将Ab-GO组装到磷酸化多肽修饰电极表面之后，R_et进一步增大（曲线f）。以上结果表明，采用本方法成功实现了Ab-GO在电极表面的组装。

采用原子力显微镜（AFM）对生物传感器的构建过程进行了表征（图5）。壳聚糖修饰玻碳基底表面较为光滑（图5A）；当将GQDs-COOH共价键合到玻碳基底表面后，AFM图中出现了高度约2 nm的小突起（图5B），表明GQDs成功修饰到玻碳基底表面；将多肽共价组装到GQDs修饰玻碳基底表面时，AFM图中出现均匀的高度约6 nm的突起（图5C），表明多肽成功组装到了玻碳基底表面；当将Ab-GO进一步捕获到玻碳基底表面时，AFM图中突起的高度增加至约30 nm（图5D），表明GO-Ab成功组装到了基底表面。

实施例3

ECL生物传感器用于检测CK2

在最优实验条件下，利用GO与GQDs之间的ECL-RET作用构建的ECL生物传感器检测CK2活性。由图6A可见，随着CK2浓度的增大，GQDs的ECL信号逐渐下降，当CK2浓度为30 U/mL时，ECL强度达到最大。图6B为CK2检测的标准曲线，CK2浓度为0.05-5 U/mL时，CK2浓度与ECL信号呈良好的线性关系，线性方程为I = 1621.6 - 142.7c（I为ECL强度，c为CK2浓度），检测限为0.023 U/mL。本方法比采用电化学法和荧光法的检测限低且线性范围宽，表明本发明提出的ECL传感器能高灵敏检测激酶活性。

在含有0.1 M Na₂S₂O₈和0.1 M KCl的PBS (0.1 M，pH 7.4)溶液中，将组装了Ab-GO的玻碳电极在电位范围为0到-1.6 V (vs Ag/AgCl)、扫描速率为100 mV/s条件下连续扫描，扫描22圈后GQDs的ECL信号仍然非常稳定，相对标准偏差为0.97%，表明传感器具有良好的电位循环稳定性。对ECL传感器的重现性和再现性进行了考察。在CK2浓度为2.5 U/mL时，测量10次ECL响应以评估生物传感器的批内分析精确度，批间分析精确度用制备的10根电极测量CK2，批内分析和批间分析的偏差系数分别为6.7%和8.1%。以上结果表明，本发明设计的ECL生物传感器具有良好的稳定性、重现性和再现性。

实施例4

ECL生物传感器用于对CK2抑制剂的筛选

本研究以鞣花酸为例对CK2的抑制剂进行筛选研究（图7）。GQDs的ECL信号随着鞣花酸浓度的增加而增强，当鞣花酸浓度为0.15μM时，ECL信号达到最大，鞣花酸对CK2的半抑制浓度为0.043μM。还考察了另外三种非CK2特异性抑制剂如5,6-二氯-l-β-D-呋喃核糖基苯丙咪唑（DRB）、大黄素和槲皮素对CK2活性的影响。由图7B可见，鞣花酸对CK2的抑制效果最强，表明本发明构建的生物传感器对CK2抑制剂具有良好的选择性。

Claims

1.基于GO和GQDs之间ECL-RET作用的传感器制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤：

（1）采用Hummers方法制备氧化石墨烯：将1.0 g石墨和1.0 g NaNO₃加入到46 mL的质量百分浓度为98%的H₂SO₄中，冰浴下缓慢加入6.0 g KMnO₄，于35 ℃水浴中搅拌1 h，加入80 mL超纯水，继续搅拌30 min，再加入200 mL超纯水后，逐滴加入6 mL的质量百分浓度为30%的H₂O₂，室温下反应1 h；将产物趁热过滤并用超纯水清洗至滤液为中性，将产物分散到500 mL超纯水中，超声处理2 h，即制得均匀分散的氧化石墨烯；

（2）利用水热法制备石墨烯量子点：将干燥的氧化石墨烯置于管式炉中，在N₂保护的条件下，以5 ℃/min的升温速率加热到200 ℃并保持2 h，得到石墨烯片；将0.05 g石墨烯片加入到体积比为1:3的浓硫酸:浓硝酸的混合溶液中超声17 h，加入250 mL超纯水稀释；用0.22 μm微孔滤膜过滤，将收集的滤饼悬浮在40 mL超纯水中，用NaOH调节溶液pH为8后，转移入反应釜中于200 ℃反应12 h，冷却到室温；用0.22 μm的微孔滤膜过滤除去大体积的石墨烯片，得到的棕色滤液即为石墨烯量子点溶液；

（3）羧基化石墨烯量子点的制备：将0.05 g的NaOH和0.1 g的氯乙酸钠加入到20 mL的石墨烯量子点溶液中，超声反应3 h，用盐酸调节溶液pH为中性，即得到羧基化的石墨烯量子点；

（4）抗磷酸化丝氨酸抗体氧化石墨烯复合物的制备：将200 μL、1 mg/mL的氧化石墨烯和200 μL、5 μg/mL的抗磷酸化丝氨酸抗体混合，室温条件下反应12 h；将产物在10000 rpm下离心30 min，用超纯水清洗3次，将产物重悬于10 mM、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，4 oC下保存；

（5）ECL传感器的制备：玻碳电极先在粒径为1.0，0.3，0.05 μm的α-Al₂O₃糊中抛光，再用乙醇和水超声清洗1 min；将10 μL、质量百分浓度为0.5%的壳聚糖溶液滴涂到玻碳电极表面并晾干后，将电极浸入到含有5 mM的N-乙基-N’-1-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的羧基化石墨烯量子点溶液中，室温下孵化5 h；用10 mM、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液清洗后，将电极插入到含有5 mM的N-乙基-N’-1-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、8 mM的N-羟基琥珀酰亚胺和50 μM的多肽溶液中反应3 h；再将电极插入到含有蛋白激酶和三磷酸腺苷的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液中反应2 h，使多肽发生磷酸化；将磷酸化多肽修饰电极在抗磷酸化丝氨酸抗体氧化石墨烯复合物溶液中孵化1 h，即制得ECL传感器。

2.根据权利要求1所述的基于GO和GQDs之间ECL-RET作用的传感器制备方法，其特征在于步骤（2）中，所述的浓硫酸的质量百分浓度为98%，浓硝酸的质量百分浓度为68%。

3.根据权利要求1所述的基于GO和GQDs之间ECL-RET作用的传感器制备方法，其特征在于步骤（5）中，所述的壳聚糖溶液的配制方法为将壳聚糖加入到质量百分比为1%的醋酸溶液中并超声溶解。

4.根据权利要求1所述的基于GO和GQDs之间ECL-RET作用的传感器制备方法，其特征在于步骤（5）中，所述的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液的浓度为20 mM，pH为7.4，包含20 mM的MgCl₂。

5.如权利要求1-4中的任一项所述基于GO和GQDs之间ECL-RET作用的传感器制备方法所制备的传感器在蛋白激酶活性及其抑制剂的检测中的应用，其特征在于，随着蛋白激酶浓度的增加，多肽修饰电极表面产生的磷酸化位点越多，组装到石墨烯量子点修饰电极表面的氧化石墨烯就越多，在含有0.1 M Na₂S₂O₈和0.1 M KCl的磷酸盐缓冲溶液中，电极表面捕获的氧化石墨烯对石墨烯量子点的电致化学发光产生的猝灭效应越强，使得电致化学发光信号逐渐下降，蛋白激酶的浓度在0.01-5U/mL范围内与电致化学发光信号呈线性关系，检测限为0.023 U/mL；电致化学发光强度随着蛋白激酶抑制剂浓度的增加而增强，当鞣花酸浓度为0.15μM时，电致发光信号达到最大，计算得到的鞣花酸的半抑制浓度为0.043 μM。

6.根据权利要求5所述的传感器在蛋白激酶活性及其抑制剂的检测中的应用，其特征在于所述的含有0.1 M Na₂S₂O₈和0.1 M KCl的磷酸盐缓冲溶的浓度为0.1 M，pH为7.4。