CN104316514B - 一种双功能化氧化石墨烯复合材料、其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种双功能化氧化石墨烯复合材料，其制备方法和用途。具体涉及一种双功能化氧化石墨烯复合材料，其包含：氧化石墨烯；源自通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂的发光片段；和源自含亚铁原卟啉活性中心的生物物质的发光增强片段；其中，所述源自通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂的发光片段和源自含亚铁原卟啉活性中心的生物物质的发光增强片段结合在所述氧化石墨烯的表面。本发明的双功能化氧化石墨烯复合材料具有卓越的发光特性。
Description
技术领域
本发明涉及一种含化学发光片段和发光增强片段的双功能化氧化石墨烯复合材料。本发明还涉及该双功能化氧化石墨烯复合材料的制备和应用。
背景技术
氧化石墨烯因其优良的机械、光学和电学性能、特殊的结构和易于制备近年来备受关注。氧化石墨烯具有大的表面积及表面丰富的含氧官能团和良好的水溶性，使其成为合成新型功能化复合材料的理想选择。
目前，通常通过共价键和非共价键两种方式将功能分子结合到氧化石墨烯表面，从而赋予功能化复合材料相应的性能。例如现有技术将具有化学发光性能的N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺作为还原剂和保护剂，在碱性条件下通过非共价键将其结合到氧化石墨烯表面，从而得到具有化学发光性能的发光功能化复合材料(Shen,W.；Yu,Y.；Shu,J.；Cui,H；Chemical Communications 2012,48,2894-2896.)。进一步将该材料组装到电极表面，可构建一个H2O2电致化学发光传感器。然而，现有技术所合成的这种基于N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺发光功能化石墨烯材料需要在碱性条件下才体现优异的化学发光性质，这在一定程度上限制了其在生物医学，生物传感等领域的应用。此外，虽然该发光功能化氧化石墨烯复合材料具有较高的分析灵敏度，但是其灵敏度还具有提高的余地。因此，本领域需要合成一种在较宽的pH范围，尤其在生理环境pH6.5–8.0区间仍具有强的发光性能的复合材料，并且该合成方法较好地满足快速、环保、简便等特点。
发明内容
本发明的一个目的在于对现有的例如N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺发光功能化氧化石墨烯复合材料进行改进，以进一步提高其发光强度，并且改善其所适用的pH值范围，从而进一步提高由该功能化氧化石墨烯复合材料在生物分析中的分析灵敏度和生物兼容性。
本发明的另一目的在于提供一种上述改进的复合材料的制备方法，以及将其作为微量试剂传感平台，构建超灵敏和高选择性的过氧化氢传感器等用途。
因此，本发明的一个方面提供了一种双功能化氧化石墨烯复合材料，其包含：氧化石墨烯；源自通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂的发光片段；和源自含亚铁原卟啉活性中心的生物物质的发光增强片段；其中，所述源自通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂的发光片段和源自含亚铁原卟啉活性中心的生物物质的发光增强片段结合在所述氧化石墨烯的表面：
式中，A环表示C6-C14芳基；R1和R2可独立地表示氢、端基被氨基取代或未取代的直链或支链(C1-C30)烷基，前提条件是该NR1R2具有至少一个NH2端基。
本发明的第二方面提供一种制备本发明的双功能化氧化石墨烯复合材料的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提供含亚铁原卟啉活性中心的生物物质；
2)使通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂和氧化石墨烯水溶液进行反应，在该反应完成后向反应体系中加入所述含亚铁原卟啉活性中心的生物物质，得到双功能化氧化石墨烯复合材料。
本发明的第三方面提供本发明的双功能化氧化石墨烯复合材料在用于构建传感器、纳米界面和纳米探针中的应用，该传感器、纳米界面和分析探针可用于检测和分析以下各种样品中包含的过氧化氢或产生过氧化氢的基质：生物样品、食品或饮料样品、药物样品、环境样品、化学样品。
与现有技术相比，本发明具有如下的优点：
1.本发明新颖的双功能化氧化石墨烯复合材料实现了在氧化石墨烯表面上同时包含鲁米诺类化学发光试剂以及具有发光增强作用的含亚铁原卟啉活性中心的生物物质，与现有发光功能化石墨烯材料相比，本发明的双功能化氧化石墨烯复合材料的发光强度得到极大提高，例如在相同条件下发光强度比Shen等人的在Chemical Communications2012,48,2894-2896上报道的N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺单发光功能化石墨烯材料(下文也称作“单发光试剂单功能化的石墨烯材料”)的发光强度高至少2个数量级。
2.本发明的双功能化氧化石墨烯复合材料能够产生化学发光的pH范围为6.5-13.0，相比于现有技术所报道的pH值范围9.0-13.0得到进一步扩大，因此，本发明的双功能化氧化石墨烯复合材料更适合用于各种生物分析，其应用范围能够得到进一步拓展。
3.本发明的双功能化氧化石墨烯复合材料在稳定性方面相比于现有技术得到进一步提高。在使用高速离心技术进行分离纯化后，仍能够用水进行再分散得到均匀的水溶液而不会发生沉聚现象，而现有技术的发光功能化石墨烯材料在高速离心后会发生聚结，无法通过加水重新分散得到均匀的水溶液。
4.本发明的双功能化氧化石墨烯复合材料的制备方法具有简便、快速等优点；与现有的发光功能化石墨烯材料相比，无需复杂费时的透析纯化过程，取而代之的是简单快速的离心纯化。
5.首次将双功能化氧化石墨烯复合材料作为化学发光传感平台用于实现过氧化氢的超灵敏检测，该传感器构造简单、快捷、操作简便、试剂消耗量小，不但克服了现有的以基于酶催化化学发光反应作为响应信号，酶易失活，操作繁琐，试剂耗量大等缺点，而且由于鲁米诺发光试剂和起催化增强作用的含亚铁原卟啉活性中心的生物物质同时共存在氧化石墨烯表面，使其具有更好的检测灵敏度。本发明示例性过氧化氢传感平台检测生理pH8.0环境下的过氧化氢检测限可达4.7×10-15M，比目前报道检测过氧化氢最灵敏的方法(Lyon,J.L.；Stevenson,K.J.Analytical Chemistry 2006,78,8518-8525.)低两个多数量级。
因此，本发明的双功能化氧化石墨烯复合材料在临床分析、食品安全、环境检测和药物分析等领域具有巨大的应用潜力和良好的应用前景。
下面结合附图对本发明作进一步说明。
附图说明
图1是本发明一个优选例的双功能化氧化石墨烯复合材料的透射电镜照片。
图2是本发明一个优选例的傅里叶红外光谱。
图3是本发明一个优选例的X射线光电子能谱。
图4是本发明一个优选例的原子力显微镜。
图5是本发明一个优选例的圆二色光谱。
图6是比较本发明一个优选例与其它比较例的化学发光强度的图。
图7是本发明一个优选例能够产生化学发光的pH值范围。
图8是在生理pH 8.0环境下使用本发明的材料1来检测过氧化氢的工作曲线。
图9显示了制备实施例1的反应方案。
具体实施方式
下面对本发明的双功能化氧化石墨烯复合材料及其制备方法、基于该双功能化氧化石墨烯复合材料的传感器的具体实施方式进行详细描述。
A.双功能化氧化石墨烯复合材料
本发明提供了一种双功能化氧化石墨烯复合材料，其包含氧化石墨烯，结合在所述氧化石墨烯表面上的源自鲁米诺类化学发光试剂的发光片段、和同样结合在该氧化石墨烯表面上源自含亚铁原卟啉活性中心的生物物质的发光增强片段。
1.氧化石墨烯
本发明所述的氧化石墨烯无特别的限制，可从市场上购得，还可以通过化学或物理方法得到。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述氧化石墨烯是通过对氧化石墨烯的前体化合物(例如氧化石墨、氧化石墨粉)进行超声剥离而制得的具有良好水溶性的氧化石墨烯。
2.鲁米诺类化学发光试剂
适用于本发明的鲁米诺类化学发光试剂具有下列通式I：
式中，A环表示C6-C14芳基，较好C6-C10芳基，更好具有6个碳原子的芳基。在本发明中术语“A环表示C6-C14芳基”是指具有包括两个邻环碳原子在内的碳原子的芳基，例如它可以是苯基、萘基和蒽基。
R1和R2可独立地表示氢、端基被氨基取代或未取代的直链或支链C1-C30、较好C1-C20、更好C1-C10、最好C1-C8、优选C1-C6烷基，前提条件是该NR1R2具有至少一个NH2端基。
在本发明中，术语“NR1R2具有至少一个NH2端基”是指NR1R2本身是NH2，或者R1、R2中至少有一个是带有NH2端基的烷基。
在本发明的一个实例中，R1和R2可各自选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、氨基甲基、氨基乙基、1-氨基丙基、2-甲基-氨基乙基、1-氨基丁基、2-甲基-氨基丙基等。
在本发明的一个较好实例中，上述通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂选自：
其中，R1和R2如上所限定。
在一个实施方式中，代表性通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂选自下组，但不限于此：
在另一个实施方式中，所述通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂优选为N-(4-氨基丁基)-N-乙基萘酰肼；
本发明鲁米诺类化学发光试剂均含有芳香环，利用该基团可将该类化学发光试剂通过π-π堆积结合到氧化石墨烯的表面。另一方面，本发明的鲁米诺类化学发光试剂至少含有一个氨基(NH2)端基，利用该氨基的孤对电子可以使该类化学发光试剂与氧化石墨烯表面的含氧官能团通过氢键相结合。
在本发明中，术语“π-π堆积”指的是具有π电子的芳香环之间的相互作用。
在一个实施方式中，本发明的鲁米诺类化学发光试剂通过π-π堆积和/或氢键结合在氧化石墨烯表面。
3.含亚铁原卟啉活性中心的生物物质
本发明所述的发光增强片段为含亚铁原卟啉活性中心的生物物质。含亚铁原卟啉活性中心的生物物质是一类以亚铁原卟啉作为催化活性中心，对鲁米诺化学发光体系的化学发光反应具有催化增强效应的生物物质，其包括但不限于血红蛋白，肌红蛋白、细胞色素、含亚铁原卟啉活性中心的过氧化物酶，优选辣根过氧化物酶。
在本发明中，含亚铁原卟啉活性中心的生物物质都是生物大分子，它们可以通过静电相互作用，π-π堆积作用或氢键作用结合在氧化石墨烯的表面上。
在本文中，除非另有说明，化学发光的“发光增强片段”与“发光催化片段”可互换使用，都指的是在化学发光反应中，加入到化学发光反应体系中能够使化学发光强度大大增强的片段。
本发明双功能化氧化石墨烯复合材料中源自鲁米诺类化学发光试剂的发光片段与源自含亚铁原卟啉活性中心的生物物质的发光增强片段的相对量无特别的限制，只要该发光增强片段足以提高发光片段的发光强度即可。在本发明的一个实施方式中，所述发光增强片段与发光片段的质量比为1:2500至4:1，宜为1：500-2：1，更好为1：100-1：1，最好为1:50-4:5，优选1:5-2:5.
本发明的双功能化氧化石墨烯复合材料具有优异的化学发光特性。所述双功能化氧化石墨烯复合材料与氧化剂反应产生化学发光。所述氧化剂包括但不限于H2O2、O2、ClO-、I2、IO4 -、MnO4 -。在本发明的一个实例中，所述化学发光反应的条件为：将10-1000微升0.1mMH2O2溶液注入到10-1000微升的经纯化、浓度为0.1mg/mL的双功能化氧化石墨烯复合材料水溶液中，产生化学发光。
在一个优选实例中，所述双功能化氧化石墨烯复合材料，其化学发光片段源自N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺，其发光增强片段源自辣根过氧化物酶，N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺通过π-π堆积作用和氢键作用结合到氧化石墨烯表面，所述辣根过氧化物酶通过静电相互作用、π-π堆积作用和氢键作用结合到氧化石墨烯表面。
在一个实施方式中，本发明的双功能化石墨烯复合材料具有良好的稳定性。对所得的粗产物进行多次高速离心纯化后，仍能够重新分散在水中，得到水溶液。而Shen等人的在Chemical Communications 2012,48,2894-2896上报道的N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺发光功能化石墨烯材料不能进行高速离心纯化，该材料在高速离心后会发生聚集，无法用水重新分散。
在一个实施方式中，本发明的双功能化氧化石墨烯复合材料具有良好的水溶性，将其溶于水后得到深棕色的水溶液。
在一个实施方式中，本发明的双功能化氧化石墨烯复合材料在pH值为6.5-13.0的H2O2水溶液中可以产生很强的化学发光。在相同条件下，其发光强度比现有的仅包含化学发光片段(即N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺)的发光功能化石墨烯材料的发光强度高至少2个数量级。不希望受到理论的限制，我们认为，与现有的仅包含化学发光片段的发光功能化石墨烯材料相比，本发明的双功能化氧化石墨烯复合材料除了在氧化石墨烯表面富集了一个或多个发光片段之外，还结合有一个或多个含亚铁原卟啉活性中心的生物物质作为发光增强片段，该含亚铁原卟啉活性中心的生物物质对鲁米诺类化学发光体系的化学发光具有增强或催化作用，因而使得本发明的双功能化氧化石墨烯复合材料发光性能得到了极大提高。此外，与现有的发光功能化石墨烯复合材料相比，本发明的双功能化氧化石墨烯复合材料能够在更宽的pH范围下产生化学发光。本发明的双功能化氧化石墨烯材料能够在pH值为6.5-13.0的H2O2水溶液中可以产生很强的化学发光，而现有技术的N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺发光功能化石墨烯材料的有效发光pH值范围为9.0-13.0。这使得本发明材料的应用范围和领域得到了很好的拓展，能够更有效地用于各种只适合于中性条件下的生物分析。在发光试剂种类及用量、氧化石墨烯用量和发光实验条件等同的情况下，在中性条件下，本发明的双功能化氧化石墨烯复合材料比现有的发光试剂单功能化石墨烯复合材料的发光效率至少高三个数量级；而在强碱性条件下至少高出两个数量级。
如本文所用，术语“发光功能化”、“发光试剂功能化”或“化学发光功能化”等可互换使用，均是指由于包含发光试剂而使得石墨烯材料具有化学发光特性。
B.双功能化氧化石墨烯复合材料的制备方法
本发明还提供简便、快速地制备本发明双功能化氧化石墨复合材料的绿色方法。
在一个实施方式中，本发明通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂和氧化石墨烯水溶液的反应较好地在搅拌的条件下进行，以得到初级发光试剂单功能化的氧化石墨烯复合材料。反应的条件无特别的限制，可以是常温常压。较好的是，反应体系的pH值约为8-12，优选pH值约为9-11，更优选pH值约为11。通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂与氧化石墨烯的质量比为1：100-1：20，优选1:50-1:10，更优选1：40。
在本发明的一个实施方式中，所述含亚铁原卟啉活性中心的生物物质较好地溶解在pH值为4.5-7.0(优选pH值为5.6)的缓冲溶液中，得到浓度为1×10–4至10mg/mL(优选1mg/mL)的含亚铁原卟啉活性中心的生物物质的溶液。所述缓冲液选自：磷酸缓冲液、碳酸缓冲液，硼酸缓冲液，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，柠檬酸-磷酸氢缓冲液和伯瑞坦-罗比森缓冲溶液。在制得初级发光试剂单功能化的氧化石墨烯复合材料后，将该含亚铁原卟啉活性中心的生物物质的溶液加入到上述制得的初级材料中，使其反应。反应温度较好地为0℃-25℃，优选4℃-10℃。反应时间无特别限制，直至表征结果显示该含亚铁原卟啉活性中心的生物物质稳定地结合在氧化石墨烯表面即可。
本发明双功能化氧化石墨烯复合材料中源自鲁米诺类化学发光试剂的发光片段与源自含亚铁原卟啉活性中心的生物物质的发光增强片段的相对量无特别的限制，只要该发光增强片段足以提高发光片段的发光强度即可。在本发明的一个实施方式中，所述发光增强片段与发光片段的质量比为1:2500至4:1，宜为1：500-2：1，更好为1：100-1：1，最好为1:50-4:5，优选1:5-2:5.
本发明的方法还任选地包括将所述双功能化氧化石墨烯复合材料通过高速离心进行纯化的步骤。所述双功能化氧化石墨烯复合材料可在如下条件下离心：在13000r/min下将双功能化氧化石墨烯复合材料的粗产物离心15分钟，然后用蒸馏水、纯净水或超纯水将沉淀物重新分散；重复上述过程三次，以得到纯化的双功能化氧化石墨烯复合材料。
在本发明中，所述“绿色方法”指的是该方法不使用任何对环境有害的物质。
C.基于本发明的双功能化氧化石墨烯复合材料的化学发光传感器
本发明的双功能化氧化石墨烯复合材料因具有卓越的化学发光性能，用它来构建化学发光传感器可以实现在存在微量目标分析物的条件下检测出待测物的浓度。此外，由于本发明的双功能化石墨烯复合材料可以在较宽pH范围内(尤其是在中性条件下)与目标分析物反应产生化学发光，因而由其构建的化学发光传感器可以广泛用于各种生物样品的超灵敏分析。
如本发明所用，术语“传感平台”或“传感器”是指包含本发明的双功能化氧化石墨烯复合材料的检测装置，其中本发明的双功能化氧化石墨烯复合材料在合适的发光条件下可与目标分析物或其产物直接或间接地反应，并且在含亚铁原卟啉活性中心的生物物质的催化作用下，产生强烈的发光信号，实现对目标分析物的定量分析。
在本发明的一个实施方式中，所述目标分析物选自：过氧化氢，能产生过氧化氢的基质(包括但不限于葡萄糖-葡萄糖氧化酶，尿酸-尿酸氧化酶，胆碱-胆碱氧化酶)，维生素、药物、金属离子、有机物、氨基酸、生物毒素、化学毒素或细胞。
在本发明的另一个实施方式中，其特征在于，所述传感器是化学发光传感器。
本发明的传感器可广泛用于各种领域和各种样品的检测和分析，包括(但不限于)生物样品、食品或饮料样品、药物样品、环境样品、化学样品的检测和分析。生物样品可包括例如血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰液、分泌物(如汗液、泪液等)、培养物等；所述环境样品可为空气样品、水样、土壤样品；所述化学样品可包括中间物、终产物等等。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明专利的内容。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
测试方法：
(1)透射电镜；
测试方法：将制得的试样进行离心，在13000r/min条件下离心15分钟后除去上清液。将所得沉淀分散在超纯水中，在透射电子显微镜(TEM,JEOL Ltd,JEOL-2010,日本)上进行透射电镜分析。
(2)傅里叶变换红外光谱；
测试方法：将制得的试样进行离心，在13000r/min条件下离心15分钟后除去上清液。将所得沉淀在真空条件下烘干，在Nicolet 8700傅立叶变换红外光谱仪上进行傅里叶变换红外光谱测定。
(3)X射线光电子能谱；
测试方法：将制得的试样进行离心，在13000r/min条件下离心15分钟后除去上清液。将所得沉淀在真空条件下烘干，在X射线光电子能谱仪(ESCALABMKⅡelectronspectrograph，VG Scientific,UK)上进行X射线光电子能谱分析。
(4)原子力显微镜；
测试方法：将制得的试样进行离心，在13000r/min条件下离心15分钟后除去上清液。将所得沉淀分散在超纯水中，得到的溶液在原子力显微镜(HysitrontriboindenterHysitron Inc.)下观察其形貌。
(5)圆二色光谱；
测试方法：将制得的试样进行离心，在13000r/min条件下离心15分钟后除去上清液。将所得沉淀分散在超纯水中，得到的溶液在圆二色谱仪(Jasco-810，日本)上进行蛋白结构分析。
(6)化学发光特性：
采用Centro LB 960型微孔板发光检测仪(Berthold，Germany)对双功能化氧化石墨烯复合材料的化学发光特性进行研究。在微孔板的小孔中注入50μL双功能化氧化石墨烯复合材料水溶液，然后通过微孔板发光检测仪的注射口加入50μL 0.1mM H2O2溶液(溶解在pH范围为6.5-11.0的伯瑞坦-罗比森缓冲液里和pH范围为12.0-13.0的NaOH溶液)。由微孔板发光检测仪对化学发光强度进行检测，同时记录下化学发光的动力学曲线。
实施例1：制备辣根过氧化酶和N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺双功能化氧化石墨烯复合材料1(材料1)
在本实施例中，鲁米诺类化学发光试剂为N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺，含亚铁原卟啉活性中心的生物物质为辣根过氧化物酶。制备方法如下，其中步骤(b)和(c)如图9所示：
(a)在室温下，将一定量的氧化石墨溶于适量的超纯水中，超声剥离50分钟得到氧化石墨烯水溶液；使得到的氧化石墨烯水溶液在4000转/分钟的条件下离心5分钟，然后去除沉淀，得到纯的氧化石墨烯水溶液；
(b)在室温和搅拌状态下，将0.01摩尔/升的N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺在0.1摩尔/升的NaOH中的溶液迅速加入步骤(a)得到的氧化石墨烯水溶液中，其中所述N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺溶液与氧化石墨烯水溶液的体积比为1：100，并在室温下将该混合物搅拌24小时，得到N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)单功能化氧化石墨烯复合物；在13000r/min的条件下离心15分钟，除去上清液，收集沉淀，并将沉淀再次用超纯水分散，得到纯化的N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺单功能化的氧化石墨烯溶液；
(c)将辣根过氧化物酶溶解在pH 5.6的柠檬酸盐-磷酸氢盐缓冲中，配制成浓度为1mg/mL的辣根过氧化酶水溶液。将其加入到步骤(b)所制得的N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺单功能化的氧化石墨烯溶液中，所述辣根过氧化物酶溶液与N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺功能化氧化石墨烯的溶液的体积比为1:10，得到的混合物在4℃下放置9小时，即得到辣根过氧化酶和N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺双功能化的氧化石墨烯复合材料的粗产物；
(d)进一步在以下条件下通过高速离心分离对上述步骤(c)中获得的粗产物进行纯化：在13000r/min的条件下离心15分钟，除去上清液，将沉淀物重复溶于超纯水中，重复3次，最后得到纯化的辣根过氧化酶和N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺双功能化的氧化石墨烯复合材料(材料1)。
对材料1进行透射电镜、红外光谱分析、X射线光电子能谱测试、原子力显微镜和圆二色色谱分析，结果分别如图1A、图2E、图3C、图4C)、和图5b所示。根据上述测试方法(6)测定材料1的发光强度，结果见图6中曲线c和表1。
实施例2：制备辣根过氧化酶和鲁米诺双功能化氧化石墨烯复合材料2(材料2)
根据实施例1中制备材料1的相同方法，不同之处在于，在步骤(b)中使用鲁米诺代替N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺，得到材料2。根据上述测试方法(6)测定材料2的化学发光强度，其光强最大值的结果见表1。
实施例3：制备血红蛋白和N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺双功能化氧化石墨烯复合材料3(材料3)
根据实施例1中制备材料1的相同方法，不同之处在于，在步骤(c)中使用血红蛋白代替辣根过氧化物酶，得到材料3。根据上述测试方法(6)测定材料3的化学发光强度，其光强最大值的结果见表1。
比较例1：制备N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺发光单功能化氧化石墨烯复合材料(比较材料1)
根据实施例1中制备材料1的相同方法，不同之处在于，省去步骤(c)和(d)，即仅实施步骤(b)，得到N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)单功能化氧化石墨烯复合物(比较材料1)。
对比较材料1进行透射电镜、红外光谱分析、原子力显微镜和圆二色色谱分析，结果分别如图1B、图2D、图4B)、和图5a所示。根据上述测试方法(6)测定比较材料1的发光强度，结果见图6中曲线c和表1。
比较例2：制备辣根过氧化物酶单功能化氧化石墨烯复合材料(比较材料2)
根据实施例1中制备材料1的相同方法，不同之处在于，省去步骤(b)，即在实施步骤(a)、(c)和(d)后得到辣根过氧化物酶单功能化氧化石墨烯复合材料(比较材料2)。根据上述测试方法(6)测定比较材料2的化学发光强度，其光强最大值的结果见表1。
比较例3：制备N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺与氧化石墨烯的混合物(比较材料3)
向0.02mM N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺在0.1摩尔/升的NaOH中的溶液中加入0.02mg的氧化石墨烯，得到N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺和氧化石墨烯的混合物。在得到该混合物后，立即根据上述测试方法(6)测定比较材料3的化学发光强度，其光强最大值的结果见表1。
在本比较例的体系中，N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺与氧化石墨烯是没有结合在一起的。
比较例4：制备N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺与辣根过氧化物酶的混合物(比较材料4)
向0.02mM N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺在0.1摩尔/升的NaOH中的溶液中加入0.1mg辣根过氧化物酶，得到N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺和辣根过氧化物酶的混合物。根据上述测试方法(6)测定比较材料4的化学发光强度，其光强最大值的结果见表1。
比较例5：制备N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺与比较材料3的混合物(比较材料5)
向0.02mM N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺在0.1摩尔/升的NaOH中的溶液中加入0.02mg的氧化石墨烯和0.1mg辣根过氧化物酶，得到N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺、辣根过氧化物酶和氧化石墨烯的混合物。在得到该混合物后，立即根据上述测试方法(6)测定比较材料5的化学发光强度，其光强最大值的结果见表1。
在本比较例的体系中，N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺和辣根过氧化物酶均没有结合在氧化石墨烯的表面上，该比较例的目的是在于考察N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺和辣根过氧化物酶在氧化石墨烯的表面上的结合对发光强度造成的影响。
比较例6：制备N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺和亚铁原卟啉双功能化的石墨烯复合材料(比较材料6)
根据实施例1中制备材料1的相同方法，不同之处在于，在步骤(c)中使用0.5mg/mL亚铁原卟啉在0.01M KOH中的溶液代替辣根过氧化物酶溶液，得到比较材料6。根据上述测试方法(6)测定比较材料6的化学发光强度，结果见图6中曲线b和表1。
图1是材料1与比较材料1的透射电镜照片，其中A对应本发明材料1；B对应比较材料1。从图中可以看出，材料1与比较材料1相比，在测试铜网上具有更好的伸展性，这是由于辣根过氧化物酶具有两性，增加了材料1与铜网上碳膜的接触面积。
图2是以下物质的傅里叶红外光谱图，其中A对应氧化石墨烯水溶液；B对应N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺溶液；C对应辣根过氧化物酶溶液；D对应比较材料1；E对应本发明材料1。如图3所示，A中1727cm-1处的峰对应氧化石墨烯强烈的C＝O的伸缩振动；B中3365cm-1和1237cm-1两处的峰分别对应N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺典型的氨基官能(VN-H)的伸缩振动和C-N的伸缩振动；对比D和A发现，经N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺功能化的氧化石墨烯在1247cm-1处多了一个吸收峰，其对应于C-N的伸缩振动，其余无明显变化，这说明N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺成功地结合在氧化石墨烯的表面上，得到N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺单功能化氧化石墨烯材料；对比D和E可以看出，材料1相对比较材料1而言，在1654cm-1和1535cm-1处多出两个吸收峰，它们分别对应于如C中所示的辣根过氧化物酶的两个特征峰，此外在1247cm-1处的C-N的伸缩振动峰强度明显增大，这说明N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺和辣根过氧化物酶都结合在氧化石墨烯的表面上，即得到本发明的双功能化氧化石墨烯复合材料。
图3是氧化石墨烯(下)，比较材料1(中)和本发明的材料1(上)的X射线光电子能谱图，其中A)为氧化石墨烯(下)，比较材料1(中)和本发明材料1(上)的总谱，B)和C)分别对应的是氧化石墨烯和材料1的C1s去卷积谱图。对比氧化石墨烯，比较材料1和本发明材料1的总谱可以得到，材料1和比较材料1表面均含有C、N、O三种元素，表明N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺存在于氧化石墨烯的表面上。此外，对比B)和C)的C1s去卷积谱图可以看到，材料1比氧化石墨烯仅多了一个C-N键对应的峰，而其它碳碳键和碳氧键的特征峰位置未发生明显变化，这表明N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺成功结合在氧化石墨烯的表面上，且没有对氧化石墨烯本身造成明显改变。此外，在A)中材料1位于162.4eV处的S2p峰对应于辣根过氧化物酶所包含的S元素，这表明辣根过氧化物酶也结合在了氧化石墨烯的表面上。
图4是以下物质的原子力显微镜结果。其中A)对应于氧化石墨烯；B)对应于比较材料1；C)对应于本发明的材料1。通过对比分析A)和B)可以发现，比较材料1相对氧化石墨烯在厚度上增加了0.6nm左右，而N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺分子的纵向尺寸大概为0.3nm，表明N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺是以单层形式存在氧化石墨烯的两边。对比B)和C)可得，材料1不仅在厚度上相对于比较材料1增加了1.2nm，并且在材料1的原子力照片上可以清楚地看到在氧化石墨烯表面上均匀地分布有辣根过氧化物酶分子，该结果表明N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺和辣根过氧化物酶同时结合在氧化石墨烯的表面上。
图5是本发明材料1的圆二色色谱图。其中，a对应比较材料1；b对应材料1；c对应辣根过氧化物酶。从图中c曲线可以发现，辣根过氧化物酶具有216nm和222nm两个负的特征吸收峰，分别对应其结构的α螺旋和β折叠。对比曲线a和b可得，比较材料1本身不具有旋光性质，而本发明的材料1具有与辣根过氧化物酶相似的吸收峰。综合分析可得，辣根过氧化酶被成功固载在氧化石墨烯的表面，且结构并无明显变化。
以上表征数据表明，成功合成了结合有辣根过氧化物酶和N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺的双功能化氧化石墨烯复合材料，即材料1。
采用相同的表征手段，对材料2和3进行表征，结果均能证明成功制备出各种双功能化氧化石墨烯复合材料。
化学发光性能
图6是材料1，比较材料1和比较材料6的化学发光动力学曲线，其中a对应比较材料1；b对应比较材料6；c对应本发明材料1。对比曲线a、b和c可以发现，材料1具有卓越的化学发光性能，其与比较材料1相比化学发光强度至少提高100倍；并且材料1的化学发光强度是比较材料6的至少2倍。这是归功于辣根过氧化物酶对N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺发光体系良好的催化效果。此外，从实验结果可以得知，辣根过氧化物酶作为含亚铁原卟啉活性中心的生物物质的代表，其在对N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺化学发光的催化作用方面效果明显比亚铁原卟啉直接作为催化剂更好。
为了验证本发明的双功能化氧化石墨烯材料在发光性能上比现有发光功能化纳米材料具有显著提高，以及为了验证本发明的双功能化氧化石墨烯复合材料中所包含的氧化石墨烯和辣根过氧化物酶对于N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺体系的化学发光具有协同催化效应，进行以下对照实验。比较了如下表1中各种材料水溶液的化学发光，结果如表1所示。所述化学发光测试在相同的发光条件下进行。
表1
| 分析对象 | 最大发光强度(A.U.) |
| 本发明的材料1 | 95,8433 |
| 本发明的材料2 | 68,5631 |
| 本发明的材料3 | 79,6306 |
| 比较材料1 | 6500 |
| 比较材料2 | 无 |
| 比较材料3 | 3154 |
| 比较材料4 | 3,5630 |
| 比较材料5 | 9,5342 |
| 比较材料6 | 46,9954 |
| N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺 | 800 |
从上表1可以看出，本发明的材料1-3相比于对比材料1-6具有优异的化学发光性能。具体来说，对比比较材料3(即N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺和氧化石墨烯的混合物)与N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺的化学发光可以看出，比较材料3的发光强度是N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺的发光强度的8倍，而比较材料1的发光强度是比较材料3的强度的2倍，这说明氧化石墨烯对于N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺的化学发光具有催化作用，并且当N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺结合在氧化石墨烯的表面上时，对化学发光的催化作用更佳。对比比较材料4、比较材料5和N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺的化学发光可以看出，比较材料4的发光强度是N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺的发光强度的44倍，比较材料5的发光强度是比较材料4的2.6倍，这表明辣根过氧化物酶对于N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺的化学发光具有很好的催化作用，并且在比较材料4中引入氧化石墨烯后，N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺的化学发光得到进一步增强。进一步研究发现，对比本发明的材料1和比较材料5可以看出，当N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺与辣根过氧化物酶没有结合在氧化石墨烯的表面上时，其发光效果不如这两种物质结合在氧化石墨烯表面上时好。综上所述，当N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺和辣根过氧化物酶同时结合在氧化石墨烯的表面上形成复合材料时，该复合材料具有优异的化学发光特性，与现有技术相比，发光性能得到极大提高，取得了意想不到的技术效果。
本发明的发明人还发现，本发明的材料1在较宽范围的pH值条件下都可以产生化学发光，如图7所示，在10μM过氧化氢的浓度下，本发明的材料1在pH 6.5-13.0区间具有很好的发光特性。特别地，本发明的材料1在生理环境(pH 7.0-8.0)区间仍具有优异的发光性能，如图7中插图所示。这使得本发明的材料1能够用于各种生物相关的检测，大大拓展了鲁米诺及其类似物体系的化学发光应用范围。
实施例4：基于本发明实施例1中的材料1构建的过氧化氢传感器
将过氧化氢稀释在10mM pH8.0的柠檬酸盐—磷酸氢盐缓冲液中，配制成一系列浓度的过氧化氢溶液，等体积注射到材料1水溶液中，检测化学发光强度。化学发光的测试方法如测试方法(6)中所述，结果见图8。
从图8中可以看出，材料1的发光强度与过氧化氢溶液浓度的对数在10-13-10-8M的H2O2浓度范围内呈线性关系，回归方程为I＝6536.99+453.47·log C(I为化学发光信号强度/A.U.，C为H2O2浓度/M)。在信噪比为3的条件下，对H2O2检测限为47×10-15M，该检测限低于目前所报道的所有过氧化氢传感器的检测限。
Claims (2)
1.一种双功能化氧化石墨烯复合材料，其包含：
氧化石墨烯；
源自通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂的发光片段；和
源自含亚铁原卟啉活性中心的生物物质的发光增强片段，所述含亚铁原卟啉活性中心的生物物质选自：血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素、辣根过氧化物酶；
其中，所述源自通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂的发光片段和源自含亚铁原卟啉活性中心的生物物质的发光增强片段结合在所述氧化石墨烯的表面：
(I)
式中，A环表示C6-C14芳基；
R1和R2独立地表示氢、端基被氨基取代或未取代的直链或支链C1-C30烷基，前提条件是该NR1R2具有至少一个NH2端基。
2.如权利要求1所述的双功能化氧化石墨烯复合材料，其特征在于，所述A环表示C6-C10芳基；所述R1和R2独立地表示氢、端基被氨基取代或未取代的直链或支链C1-C10烷基，前提条件是该NR1R2具有至少一个NH2端基。
3. 如权利要求1所述的双功能化氧化石墨烯复合材料，其特征在于，所述A环表示苯、萘或蒽；R1和R2独立地表示氢、端基被氨基取代或未取代的直链或支链C1-C6烷基，前提条件是该NR1R2具有至少一个NH2端基。
4. 如权利要求1所述的双功能化氧化石墨烯复合材料，其特征在于，所述通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂选自：鲁米诺、异鲁米诺、N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺和N-(4-氨基己基)-N-乙基异鲁米诺。
5. 如权利要求1所述的双功能化氧化石墨烯复合材料，其特征在于，所述通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂是N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺。
6. 如权利要求1-5中任一项所述的双功能化氧化石墨烯复合材料，其特征在于，所述含亚铁原卟啉活性中心的生物物质是辣根过氧化物酶。
7. 如权利要求1-5中任一项所述的双功能化氧化石墨烯复合材料，其特征在于，所述源自通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂的发光片段和源自含亚铁原卟啉活性中心的生物物质的发光增强片段通过以下方式结合在所述氧化石墨烯的表面：π-π堆积、氢键、静电相互作用及其组合。
8. 一种制备如权利要求1-7中任一项所述的双功能化氧化石墨烯复合材料的方法，其包括以下步骤：
1) 提供含亚铁原卟啉活性中心的生物物质；
2) 使通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂和氧化石墨烯水溶液进行反应，在该反应完成后向反应体系中加入所述含亚铁原卟啉活性中心的生物物质，得到双功能化氧化石墨烯复合材料，所述含亚铁原卟啉活性中心的生物物质选自：血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素、辣根过氧化物酶。
9. 如权利要求1-7中任一项所述的双功能化氧化石墨烯复合材料在用于构建传感器、纳米界面和纳米探针中的应用，该传感器、纳米界面和纳米探针可用于检测和分析以下各种样品中包含的过氧化氢或产生过氧化氢的基质：生物样品、食品样品、药物样品、环境样品、化学样品。
10. 如权利要求1-7中任一项所述的双功能化氧化石墨烯复合材料在用于构建传感器、纳米界面和纳米探针中的应用，该传感器、纳米界面和纳米探针可用于检测和分析以下样品中包含的过氧化氢或产生过氧化氢的基质：饮料样品。
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