CN110208529B - 一种多层流控光检测装置和使用该装置的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种多层流控光检测装置，该装置至少包括相互层叠的第一功能层和第二功能层，第一功能层包括未液体连通的第一主区域和至少两个第一次要区域，第二功能层包括经由液体通道液体连通的第二主区域和至少两个第二次要区域，并且从所述第二主区域到各个第二次要区域的液体通道长度不同，所述第一次要区域或第二区域内分别具有不同的特异性检测载体。本发明还提供了使用所述多层流控光检测装置对样品中至少两种检测物进行化学发光检测的方法。

Description

一种多层流控光检测装置和使用该装置的检测方法

技术领域

本发明涉及光化学检测领域，具体来说，本发明提供了用来对单一样品中包含的多种检测对象进行时间分辨检测的装置和方法。

背景技术

对包含多种检测对象的单一样品进行简便而有效的检测一直是相关领域的难点，因为各种检测对象具有不同的物理化学性质，并且不同检测对象呈现出的检测信息可能会发生严重的相互干扰。最早人们通常采用色谱、层析、萃取、重结晶等手段将各种检测对象分离出来，但是这些分离手段耗时耗力，对检测对象可能造成变性或损耗，而且对于一些取样量较小的情况，可能并没有足够的样品量供分析人员进行上述分离。人们一直希望开发出一种能够快速、灵敏、低成本、无需繁杂预处理和后处理的新技术，对包含多种检测对象的单一复杂成分样品进行分析。人们希望这种新技术具有以下的至少一部分或者全部的优点：由廉价材料制造，制造成本低，生产工艺简单，体积小便于携带，对被测样品消耗量小，具有优异的生物相容性，检测背景低，分析速度快等优点。

为了解决上述问题，本发明开发了一种多层流控光检测装置，该装置在用来对包含多种检测对象的样品进行检测的时候，可以同时获得多个相互分离的尖锐的化学发光峰，实现多重标志物的同时检测。

发明内容

根据本发明的第一个方面，提供了一种多层流控光检测装置，该装置至少包括第一功能层和第二功能层，所述第一功能层和第二功能层各自具有液体可通过部分和液体不可通过部分；

所述第一功能层中的液体可通过部分限定出第一主区域和至少两个第一次要区域，在所述第一功能层内，所述第一主区域和所述至少两个第一次要区域之间没有建立液体连通；

所述第二功能层中的液体可通过部分限定出第二主区域和至少两个第二次要区域，在所述第二功能层内，所述第二主区域和所述至少两个第二次要区域之间通过液体通道建立液体连通，并且从所述第二主区域到各个第二次要区域的液体通道长度不同；

所述第一功能层和第二功能层相互层叠，所述第一主区域与第二主区域的相对位置和尺寸一致，所述至少两个第一次要区域分别与所述至少两个第二次要区域的相对位置和尺寸一致，从而在所述第一主区域与第二主区域之间建立液体连通，每个第一次要区域分别与相应的第二次要区域之间建立液体连通；

所述至少两个第一次要区域内分别具有至少两种特异性检测载体之一，或者所述至少两个第二次要区域内分别具有至少两种特异性检测载体之一。

本发明的第二个方面提供了一种使用本发明的上述装置对包含多种检测对象的样品进行检测的方法，该方法使用本发明的多层流控光检测装置，该方法包括以下步骤：

i)使得所述至少两种检测物分别与所述至少两种特异性检测载体特异性地结合，形成复合物；

ii)将化学发光激活液施加于所述第一主区域或第二主区域，使得所述化学发光激活液经由所述第二功能层内的液体连通以及第一功能层和第二功能层之间的液体连通与所述复合物接触，导致化学发光；

iii)对上述化学发光进行光学检测。

附图说明

在接下来的段落中结合附图对本发明的各种实施方式进行论述。但是此处需要指出的是，附图中所示和以下具体描述的实施方式仅仅是本发明的一些优选实施方式，本发明的保护范围由权利要求书来限定，而非仅限于这些优选的实施方式。

图1显示根据本发明一个优选实施方式的装置设计；

图2显示图1的两个层层叠之后的状态；

图3显示根据本发明一个实施方式的第二功能层的设计；

图4显示两个功能层中可能采用的其他图案设计方式；

图5显示根据本发明另一个实施方式的装置设计；

图6A-6B显示根据本发明一个实施方式制得的装置的化学发光动力学曲线；

图7A-7B显示根据本发明另一个实施方式制得的装置的化学发光动力学曲线；

图8A-8B显示单功能层结构的装置的化学发光动力学曲线；

图9-12显示了根据本发明实施方式采用不同的特异性载体获得的化学发光动力学曲线。

具体实施方式

本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60-120和80-110的范围，理解为60-110和80-120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1-3、1-4、1-5、2-3、2-4和2-5。

在本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。

如果没有特别指出，本说明书所用的术语“两种”指“至少两种”。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有步骤可以顺序进行，也可以随机进行，但是优选是顺序进行的。例如，所述方法包括步骤(a)和(b)，表示所述方法可包括顺序进行的步骤(a)和(b)，也可以包括顺序进行的步骤(b)和(a)。例如，所述提到所述方法还可包括步骤(c)，表示步骤(c)可以任意顺序加入到所述方法，例如，所述方法可以包括步骤(a)、(b)和(c)，也可包括步骤(a)、(c)和(b)，也可以包括步骤(c)、(a)和(b)等。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的“包括”表示开放式，也可以是封闭式。例如，所述“包括”可以表示还可以包含没有列出的其他组分，也可以仅包括列出的组分。

在本发明的全文中，本发明的装置是一种多层流控光检测装置，由于其具有多个层叠的层(即具有三维立体结构而非平面二维设计)、内部设计有流动控制结构、并且基于光检测获得检测对象信息而得名，在以下描述的一些具体实施方式中，“多层流控光检测装置”也可能称作“三维流控光检测装置”、“三维流控纸芯片”、“三维微流控纸芯片”，这些术语可以互换使用，均用来表示本发明的光检测装置。所述检测装置中的两个层可能简单地称作“第一功能层”和“第二功能层”，也可能根据其各自的位置简单地称作“顶层”和“底层”。

根据本发明的各种实施方式，所述第一功能层和第二功能层各自包含液体可通过部分和液体不可通过部分，在本发明的附图中，液体可通过部分显示为浅色，而液体不可通过部分显示为深色。根据本发明的一个优选的实施方式，所述液体为水、水溶液或水性溶液，因此液体可通过部分为亲水部分，液体不可通过部分为疏水部分。根据本发明的另一个优选的实施方式，所述第一功能层和第二功能层使用选自以下的一种或多种材料制成：纸、纤维材料和聚合物，并且其中通过各种亲水性或疏水性处理使得这些功能层中不同的区域具有所需的亲水性和疏水性。根据一个特别优选的实施方式，为了降低成本，所述第一功能层和第二功能层分别由纸制成，并且通过使用石蜡对选定的区域进行涂敷和渗渍而在这些功能层中形成了所需的疏水区域和亲水区域。根据本发明的优选实施方式，所述第一功能层中的亲水区域和疏水区域的形状、尺寸和位置与所述第二功能层中亲水区域和疏水区域的形状、尺寸和位置完全一致，使得当这两个功能层相互对齐叠置的时候，两个功能层中亲水区域和疏水区域可以完全重合。

本发明的图1显示了本发明的一个优选的实施方式，其中第一功能层位于第二功能层的上方，因此第一功能层被称作“顶层”，而第二功能层被称作“底层”。在图1所示的实施方式中，第一功能层具有第一主区域以及三个第一次要区域(1，2，3)，可以看到，所述第一主区域与三个第一次要区域被疏水材料完全隔开，除非凭借一些第一功能层以外的手段，否则水或水溶液是无法在上述几个亲水性区域之间流动或渗流的。在本发明中，假如两个区域之间没有任何亲水(亲液体)连接方式，使得水或水溶液无法在这些几个区域之间流动或渗流，则这两个区域之间没有“液体连通”或“水连通”；相对应的，如果在两个区域之间有亲水(亲液体)的连接方式，使得水或水溶液能够在这些两个区域之间流动或渗流，则这两个区域之间建立了“液体连通”或“水连通”。例如，在作为底层的第二功能层中，第二主区域与三个第二次要区域(1’，2’，3’)之间通过多条互通的液体通道相邻，因此认为在所述第二主区域与三个第二次要区域(1’，2’，3’)之间建立了“液体连通”或“水连通”。另外，在所述第一功能层和第二功能层如图2所示相互对齐叠置的时候，所示第一功能层中的第一主区域与所述第二功能层中的第二主区域直接接触，因此这两个主区域之间建立了“液体连通”或“水连通”；这两个功能层中相应的次要区域之间也按照类似的方式建立了“液体连通”或“水连通”。根据本发明的一个实施方式，两个功能层的疏水区也相互紧密接触，由此在两个功能层之间建立良好的疏水屏障，使得水或水溶液在这些疏水屏障之间保留或移动。

根据本发明的一个实施方式，所述第一/第二主区域的面积大于所述第一/第二次要区域中任意一个的面积。例如，所述第一/第二主区域为直径5-10毫米、优选7-8毫米的圆形，或者是面积相当于的直径5-10毫米、优选7-8毫米的圆形的其他形状；所述第一/第二次要区域为直径2-8毫米、优选5-6毫米的圆形，或者是面积相当于的直径2-8毫米、优选5-6毫米的圆形的其他形状。

根据本发明的一个优选实施方式，参见图3，在所述第一和第二功能层中，所述第一/第二主区域以及第一/第二次要区域总体来说分布在直径不大于10厘米、优选不大于8厘米、更优选不大于6厘米、更优选不大于5厘米、更优选不大于4厘米的圆形范围内，以避免一部分被检测的光学信号落到检测器视场以外。

根据本发明的另一个实施方式，为了有效地实现检测结构的时间分辨效果，对连接第二主区域与各个第二次要区域的液体通道长度进行合理的设计。根据本发明一个优选的实施方式，参见图1中对底层(第二功能层)的示意图，以从所述第二主区域到最接近的第二次要区域(1’)的液体通道长度为100％计，从所述第二主区域到任意一个另外的第二次要区域(例如2’或3’)的液体通道长度为102％至500％，优选105％至400％，更优选110％至300％。例如，根据本发明的一个优选的实施方式，假设从第二主区域到最接近的第二次要区域(1’)的液体通道长度为100％，则从第二主区域到其次接近的第二次要区域(2’)的液体通道长度为150-250％，从第二主区域到最远的第二次要区域(3’)的液体通道长度为260-400％。在本发明中，“液体通道长度”表示从第二主区域的几何中心到相应的第二次要区域的几何中心的距离，在第二主区域和第二次要区域均为圆形的情况下，则表示二者圆心之间的距离。由于第一功能层中亲水区域的形状、尺寸和位置都与第二功能层中的亲水区域相一致，所以第一功能层中的第一主区域和各个第一次要区域之间的相对距离也满足以上规定，区别仅在于在第一功能层中没有液体通道将各个区域相连。

在图1-3中显示了一种亲水区域图案的设计方式，但是本发明的保护范围不限于此。例如，在两个功能层中可以分别具有两个次要区域，或者像图1和图2所示具有三个次要区域，或者如图3所示具有四个次要区域，也可以具有更多的次要区域，例如五个、六个、七个、八个、九个或十个次要区域，取决于许多因素，例如所要分析的样品的种类、检测设备的检测能力以及本发明装置的便携性和制造成本之间的平衡。另外，图4显示了两个功能层中亲水区域多种设计图案，所有这些设计图案式样都包括在本发明的保护范围之内。

根据本发明的一个实施方式，第一功能层中的第一主要区域既可以是亲水性的材料(例如纸)，也可以将该主要区域中的材料完全除去。例如，本发明图1所示的一个优选实施方式中，第一功能层中的第一主要区域是亲水性的材料(例如纸)，而在如图2所示的优选实施方式中，第一功能层中的第一主要区域内的材料被完全切去，成为了一个开口，由于该开口也可以有效地提供液体(水)传输功能，因此也看作液体可通过部分(亲水性区域)的一个实施方式。

在图1或图2所示的实施方式中，第一功能层作为顶层，位于作为底层的第二功能层之上，顶层与底层彼此接触并且叠置，形成本发明所述的多层流控光检测装置。

图5显示了本发明的另一个实施方式，其中第一功能层作为底层，位于作为顶层的第二功能层之下，顶层与底层彼此接触并且叠置，形成本发明所述的多层流控光检测装置。

本发明多层流控光检测装置中的第一功能层和第二功能层可以采用本领域已知的任意方法进行制造。根据本发明的一个优选的实施方式，使用CAD软件设计所述第一功能层和第二功能层中的图案，并且通过丝网印刷工艺在纸上涂刷疏水的石蜡材料，使得石蜡渗透到纸内而形成所需的图案。例如，根据本发明的一个优选的实施方式，通过以下步骤来制造所需的疏水性图案：用CAD软件设计主要区域、次要区域以及液体通道(对于第二功能层)的形状、尺寸和位置，使用不可渗透的光敏乳剂在200目尼龙网上印刷上述设计的图案，获得丝网模板。将该丝网模板紧贴一张滤纸放置于滤纸之上，用一块石蜡在丝网模板上反复涂刷，石蜡透过丝网模板的孔隙，在滤纸上形成蜡膜图案，将印有蜡膜的纸在设定为100℃的烘箱中加热30秒，使蜡熔化并渗透到纸结构内部，从而在滤纸上形成疏水图案；丝网模板上的石蜡不能透过的部分在滤纸上形成亲水图案。由此制得的第一功能层和第二功能层相互对齐并叠置便可制得本发明的多层流控光检测装置。

根据本发明的各种实施方式，本发明的多层流控光检测装置可以用来对满足以下条件的任意样品进行检测：所述样品中同时包含至少两种待检测的对象，这些对象分别可以与特定的特异性载体结合，并且能够通过化学光检测技术进行定性或者定量的检测。根据本发明的一个优选的实施方式，所述样品中包含的待检测对象可以包括以下的一种或多种：蛋白质、核酸分子、小分子化合物、病毒和细胞。针对这些待测对象，特异性载体中应当包含相应的特异性功能分子或分子片段，在本发明中将这些特异性功能分子或分子片段称为“特异性识别体”，例如，所述特异性识别体可以选自蛋白质抗体、多肽、核酸适配体和酶中的一种或多种。根据本发明的一个优选的实施方式，所述特异性检测载体包含相互结合的特异性识别体和发光功能化微纳材料，所述识别体选自蛋白质抗体、多肽、核酸适配体和酶中的一种或多种；所述发光功能化微纳材料包括发光试剂、发光催化剂和磁性物质中的一种或多种的组合；所述发光催化剂为过渡金属离子，该过渡金属离子选自Co²⁺、Ni²⁺、Fe³⁺和Fe²⁺，优选为Co²⁺；所述磁性物质选自Fe₃O₄、Co₂O₃、CoFe₂O₄和Ni₂O₃；

所述发光试剂为通式(I)的化合物，

其中，A环表示C₆-C₁₄芳环，所述芳环包括苯环、萘环、蒽环等；

R₁和R₂独立地表示氢、端基被氨基取代或为未取代的直链或支链(C₁-C₃₀)烷基，前提是该NR₁R₂具有至少一个NH₂端基。

根据本发明的一个优选的实施方式，在所述通式(I)的化合物中，所述A环表示C₆-C₁₀芳环，优选苯环、萘环或蒽环，所述R₁和R₂独立地表示氢、端基被氨基取代或为未取代的直链或支链(C₁-C₁₀)烷基，优选端基被氨基取代或为未取代的直链或支链(C₁-C₆)烷基，前提是该-NR₁R₂部分具有至少一个NH₂端基。

根据本发明的一个更优选的实施方式，在所述通式(I)的化合物中，A环是苯环或萘环，且-NR₁R₂部分是氨基或N-(氨基C₁-C₆亚烷基)N-(C₁-C₆烷基)氨基；更优选A环是苯环，且-NR₁R₂部分是氨基、N-(4-氨基丁基)N-(乙基)氨基或(N-4-氨基己基)(N-乙基)氨基。

根据本发明的一个特别优选的实施方式，特别优选式(I)的化合物具有以下所示的结构：

根据本发明一个优选的实施方式，所述过渡金属离子选自Co²⁺、Ni²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Cr^{3 +}、Cu²⁺，优选为Co²⁺；所述通式(I)的化合物与所述过渡金属离子的摩尔比为1:10至10000:1，优选1:5至1000:1，更优选1:1至100:1。

根据本发明的一个优选的实施方式，所述发光功能化微纳材料同时包含所述发光试剂、发光催化剂和磁性物质。

根据本发明的另一个实施方式，所述特异性载体中还包含刚性聚合物分子，例如含氨基官能团的刚性聚合物分子。根据一个具体实施方式，所述刚性聚合物分子可以是壳聚糖及其衍生物，以及还任选另外包含可与壳聚糖化学交联或物理交联的含氨基官能团的聚合物分子。根据一个优选实施方式，以溶液状态的所述特异性载体的总重量为基准计，所述刚性聚合物分子的浓度含量为0.0113重量％～25.6重量％，优选为0.113重量％～12.7重量％，更优选为1.13重量％～1.88重量％。

在本发明的各种实施方式中，被测的样品中包含至少两种不同的被测对象，因此需要使用相同数量的(也即最少两种)特异性检测载体。根据本发明的一个优选的实施方式，所述至少两个第一次要区域内分别具有至少两种特异性检测载体之一，或者所述至少两个第二次要区域内分别具有至少两种特异性检测载体之一。在本发明中，可以先将所述特异性检测载体设置在所述第一次要区域或第二次要区域内，然后使得特异性检测载体与其所针对的检测物结合，在所述次要区域内形成复合物；或者也可以先在本发明装置以外的其他位置使得特异性检测载体与其所针对的检测物结合，在所述装置以外形成复合物，然后在将形成的复合物设置在所述第一次要区域或第二次要区域内。在上述两种情况下，特异性检测载体(可以是未结合的形式或者是结合之后的复合物形式)均包括在所述次要区域内，因此本发明保护范围所限定的“所述至少两个第一次要区域内分别具有至少两种特异性检测载体之一，或者所述至少两个第二次要区域内分别具有至少两种特异性检测载体之一”涵盖了以上两种情况。类似地，本发明方法中所记载的“使得所述至少两种检测物分别与所述至少两种特异性检测载体特异性地结合，形成复合物”既可以指预先将特异性检测载体设置于次要区域内，并使得特异性检测载体在所述次要区域内与检测物反应而形成复合物；也可以指首先在本发明装置以外使得特异性检测载体与检测物反应而形成复合物，然后再将该复合物设置于所述次要区域的操作方式；也即是说，以上两种方式均包括在本发明范围之内。

实施例

为了更好地理解本发明，下面结合实施例以及附图对本发明进一步说明。以下实施例只用于对本发明进行进一步的阐明，不能理解为对本发明内容的限制，任何根据本发明的发明思路和技术方案作出一些非本质的改进和调整，都将涵盖在本发明的保护范围之内。

若无特别说明，以下实施例中使用的试剂均为分析纯。

在以下实施例中，如果记载了“按照与上述某实施例相同的步骤进行操作，区别仅在于……”，则表示采用随后记载的工艺条件和步骤，而其他没有提及的工艺条件和步骤按照引用的之前的实施例的记载。

试剂和仪器

以下实施例中所使用到的化学试剂和测试使用化学仪器如表1和表2所示。

表1实施例中使用到的化学试剂

表2实施例中测试所用设备

制备实施例1

在该实施例中，制备了一种图2所示的多层流控光检测装置，其中没有液体通道的第一功能层位于具有液体通道的第二功能层之上，其制造步骤如下：用CAD软件设计主要区域、次要区域以及液体通道(对于第二功能层)的形状、尺寸和位置，其中使用不可渗透的光敏乳剂在200目尼龙网上印刷上述设计的图案，获得丝网模板。将该丝网模板紧贴一张滤纸放置于滤纸之上，用一块石蜡在丝网模板上反复涂刷，石蜡透过丝网模板的孔隙，在滤纸上形成蜡膜图案，将印有蜡膜的纸在设定为100℃的烘箱中加热30秒，使蜡熔化并渗透到纸结构内部，从而在滤纸上形成疏水图案；丝网模板上的石蜡不能透过的部分在滤纸上形成亲水图案。在第一和第二功能层中，第一和第二主区域均为直径8毫米的圆形，并且第一主区域为通过打孔机形成的开口，主区域通过一条长度为5毫米的液体通道与第一个直径为5毫米的圆形次要区域相连，在主样品通道中部以样品迁移方向为基准顺时针偏转60°分化出一条相同长度的二级液体通道，二级液体通道的尽头连接第二个相同的圆形次要区域，在二级液体通道中部再次以样品迁移方向为基准顺时针偏转60°分化出相同长度的三级液体通道，三级液体通道的尽头连接第三个相同的圆形次要区域。该实施例1所设计的多层流控光检测装置尺寸较小，直径在28mm以内。该实施例制得的装置记作装置1。

制备实施例2

在该实施例中，制备了一种图5所示的多层流控光检测装置，该实施例的步骤与实施例1相同，区别仅在于具有液体通道的第二功能层位于没有液体通道的第一功能层之上，并且第一功能层和第二功能层中的主区域均未被切掉。该实施例制得的装置记作装置2。

制备实施例3(比较例)

在该实施例中，制备了一种单层流控光检测装置，该装置仅包括实施例1所制备的第二功能层。该实施例制得的装置记作装置3。

表征实施例：

在以下表征实施例中，表征了以上三个制备实施例中制得的装置对不同的表征对象进行时间分辨表征的性能。

该表征实施例中使用的特异性载体包含作为发光催化剂的钴离子、作为发光试剂的ABEI[N-(氨基丁基)-N-(乙基异鲁米诺)]、作为磁性物质的Fe₃O₄以及用不同官能团修饰而作为识别体的壳聚糖-Au-Ab，以上各组分彼此结合。具体来说，通过以下步骤进行所述特异性载体的制备：

A.Co²⁺-ABEI-Fe₃O₄@void@C-CS的制备

将8.2mg Fe₃O₄@void@C超声溶解于10mL超纯水中，依次加入100μL4mM ABEI(pH＝13)水溶液和200μL 1mM CoCl₂水溶液，2500rpm搅拌24h，得到Co²⁺-ABEI-Fe₃O₄@void@C。将0.5mL pH＝6 0.2％壳聚糖(CS)加入到1mL的以上所述制备的Co²⁺-ABEI-Fe₃O₄@void@C溶液中，在1000rpm搅拌15h，得到Co²⁺-ABEI-Fe₃O₄@void@C-CS。

B.Au-Ab的制备(其中Ab分别表示copeptin、h-FABP或cTnI的抗体)

将89.5mL超纯水和6.5mL 4.857mM的HAuCl₄溶液分别加入到一个250mL三口烧瓶中，在冷凝回流和磁力搅拌状态下加热至沸腾，快速加入4mL 1％(w/v)柠檬酸钠水溶液，在100℃反应4h。待反应结束冷却至室温，在6000rpm的转速下离心10min，保留上清液，用0.1M的NaOH水溶液将其pH值调节至pH＝8.0，制备得到cit-Au溶胶，于4℃条件下保存。

取三分上述cit-Au溶胶，每份1毫升，分别向每份中加入25μL 1mg/mL copeptin、hFABP或cTnI的抗体，混匀，在4℃的条件下保持过夜。第二天分别加入0.25mL 5％BSA溶液，混合10min使其均匀化，在12500rpm的转速下离心30min，移去上清液，所得沉淀用1mL0.5％BSA溶液重新分散，制备得到Au-Ab，置于4℃保存备用。

C.Co²⁺-ABEI-Fe₃O₄@void@C-CS/Au-Ab/Ag复合物的制备(其中Ag分别表示copeptin、h-FABP或cTnI)

取0.5mL在以上步骤A中制得的Co²⁺-ABEI-Fe₃O₄@void@C-CS溶液，磁分离后加入等体积H₂O重新分散，然后加入0.5mL Au-Ab(Ab＝copeptin/hFABP/cTnI的抗体)溶液，混合1h使其均匀化，在4℃保持过夜。第二天加入0.25mL 5％的BSA溶液并封闭40min，磁分离，然后加入1mL pH＝7.4的10mM PBS溶液重新分散，得到Co²⁺-ABEI-Fe₃O₄@void@C-CS/Au-Ab。然后取100μL上述制得的Co²⁺-ABEI-Fe₃O₄@void@C-CS/Au-Ab，分别加入100μL copeptin/h-FABP/cTnI，在37℃、500rpm条件下孵育40min后磁分离，用pH＝7.4的10mM PBS溶液重新分散，即可得到Co²⁺-ABEI-Fe₃O₄@void@C-CS/Au-Ab/Ag复合物。

D.检测对象(copeptin/h-FABP/cTnI)的化学发光分析

在对装置1进行检测的时候，将2.5μL以上制得的各种复合物(Co²⁺-ABEI-Fe₃O₄@void@C-CS/Au-Ab/Ag，Ag＝copeptin/h-FABP/cTnI)分别滴加在顶层(第一功能层)的三个第一次要区域(也记作检测区1、2、3)，晾干后再向每个次要区域添加2.5μL 10％吐温-20，室温孵育5min。顶层和底层(第二功能层)通过对齐的方式叠置形成三维微流控纸芯片装置，将该纸芯片装置放置在超微弱化学发光仪的光电倍增管顶部。向顶层(第一功能层)的第一主要区域(也称作试剂区)注入100μL 1mM的H₂O₂(pH＝13)，溶液通过微通道分别迁移至底层的三个次要区域(也称作小试剂区1’、2’、3’)，然后分别润湿上层的三个第一次要区域(也记作检测区1、2、3)引发化学发光反应。分别在10s、30s和55s得到Peak I，Peak II和Peak III三个尖锐的化学发光峰，如图6A所示，分别对应于copeptin检测区，h-FABP检测区和cTnI检测区，根据这三个时间分辨的化学发光信号可以实现copeptin/h-FABP/cTnI的时间分辨多分析物定量检测，图6B是h-FABP浓度均为100pg/mL时的三个平行测定结果，得到的化学发光峰峰型尖锐且平行性好。

在对装置2进行检测的时候，重复以上用于表征装置1的步骤和条件，区别仅在于将复合物滴加于该装置2的顶层(第二功能层)的三个第二次要区域(1’、2’、3’)，而H₂O₂溶液则注入到顶层(第二功能层的第二主要区域)，结果如图7所示。结果如图7A和7B所示，图7A是copeptin、h-FABP和cTnI浓度均为1pg/mL的化学发光动力学曲线，其中显示了两条曲线，这两条曲线分别是两次平行测定的结果；同理，图7B是copeptin、h-FABP和cTnI浓度均为100pg/mL的化学发光动力学曲线，其中显示了两条曲线，这两条曲线分别是两次平行测定的结果。从图7A和7B的结果可以看到，通过此种设置方式不一定能够观察到三个化学发光峰，有时不能同时获得三个化学发光峰，且出峰时间不固定，发光峰平行性较差，峰型重现性差，有时为宽峰，有时为尖峰，无法根据出峰时间对检测的目标物进行定性分析。

在对装置3进行检测的时候，也重复以上用于表征装置1的步骤和条件，但是由于装置3仅有一个层(对应于装置1中的第二功能层)，将复合物滴加于该装置3的三个第二次要区域(1’、2’、3’)，而H₂O₂溶液则注入到第二功能层的第二主要区域。结果如图8A和图8B所示，图8A是copeptin、h-FABP和cTnI浓度均为1pg/mL的化学发光动力学曲线，其中显示了两条曲线，这两条曲线分别是两次平行测定的结果；同理，图8B是copeptin、h-FABP和cTnI浓度均为100pg/mL的化学发光动力学曲线，其中显示了两条曲线，这两条曲线分别是两次平行测定的结果。从图8A和8B的结果可以看到，通过此种设置方式可以一定程度上观察到三个化学发光峰，但是与装置1的结果相比，装置2的发光峰平行性较差，三个化学发光峰宽度均较宽并且部分重叠，第一个峰的出峰位置相对较固定，而第二个和第三个峰出峰时间不固定，无法根据出峰时间对检测的目标物进行定性分析。

发明人还进行了以下四个不同的实验，表征了不同的特异性载体在以上所述的装置1中的适用性。具体来说，在以下的实验1-4中，重复了以上所述合成复合物(Co²⁺-ABEI-Fe₃O₄@void@C-CS/Au-Ab/Ag的步骤，区别仅在于分别用等摩尔量的Cu²⁺替代Co²⁺(实验1)、用等摩尔量的γ-Fe₂O₃替代Fe₃O₄(实验2)、用等摩尔量的luminol替代ABEI(实验3)、用等摩尔量的Ag-Ab(此处Ag为银)替代Au-Ab(实验4)，这四个实验制得的复合物以相同的步骤和条件施用于以上所述的装置1，对其化学发光动力学曲线进行了表征并分别示于图9-12。从图中的结果可以看到，在使用不同的特异性载体的情况下，同样可以在装置1中获得尖锐且平行性极佳的发光峰。

Claims (13)

1.一种多层流控光检测装置，该装置至少包括第一功能层和第二功能层，所述第一功能层和第二功能层各自具有液体可通过部分和液体不可通过部分；

所述第一功能层中的液体可通过部分限定出第一主区域和至少两个第一次要区域，在所述第一功能层内，所述第一主区域和所述至少两个第一次要区域之间没有建立液体连通；

所述第二功能层中的液体可通过部分限定出第二主区域和至少两个第二次要区域，在所述第二功能层内，所述第二主区域和所述至少两个第二次要区域之间通过液体通道建立液体连通，并且从所述第二主区域到各个第二次要区域的液体通道长度不同；

所述第一功能层和第二功能层相互层叠，所述第一主区域与第二主区域的相对位置和尺寸一致，所述至少两个第一次要区域分别与所述至少两个第二次要区域的相对位置和尺寸一致，从而在所述第一主区域与第二主区域之间建立液体连通，每个第一次要区域分别与相应的第二次要区域之间建立液体连通；

所述第一功能层位于所述第二功能层之上，所述至少两个第一次要区域内分别具有不同种类的特异性检测载体，且所述至少两个第二次要区域内均不具有特异性检测载体。

2.如权利要求1所述的多层流控光检测装置，其特征在于，所述特异性检测载体包含相互结合的特异性识别体和发光功能化微纳材料，所述识别体选自蛋白质抗体、多肽、核酸适配体和酶中的一种或多种；所述发光功能化微纳材料包括发光试剂、发光催化剂和磁性物质中的一种或多种的组合；所述发光催化剂为过渡金属离子，该过渡金属离子选自Co²⁺、Ni^{2 +}、Fe³⁺和Fe²⁺；所述磁性物质选自Fe₃O₄、Co₂O₃、CoFe₂O₄和Ni₂O₃；

所述发光试剂为通式(I)的化合物，

其中，A环表示C₆-C₁₄芳环；

R₁和R₂独立地表示氢、端基被氨基取代或为未取代的直链或支链(C₁-C₃₀)烷基，前提是该NR₁R₂具有至少一个NH₂端基。

3.如权利要求2所述的多层流控光检测装置，其特征在于，所述过渡金属离子为Co²⁺。

4.如权利要求1所述的多层流控光检测装置，其特征在于，在所述第一功能层内，所述第一主区域和至少两个第一次要区域分布在直径不超过10厘米的圆范围之内；在所述第二功能层内，所述第二主区域和至少两个第二次要区域分布在直径不超过10厘米的圆范围之内。

5.如权利要求1所述的多层流控光检测装置，其特征在于，所述液体是水，所述液体可通过部分是亲水部分，所述液体不可通过部分是疏水部分。

6.如权利要求5所述的多层流控光检测装置，其特征在于，所述液体不可通过部分由涂蜡或渗蜡的纸构成，所述液体可通过部分由纸构成或者是开口。

7.如权利要求1所述的多层流控光检测装置，其特征在于，以从所述第二主区域到最接近的第二次要区域的液体通道长度为100％计，从所述第二主区域到任意一个另外的第二次要区域的液体通道长度为102％至500％。

8.如权利要求1所述的多层流控光检测装置，其特征在于，以从所述第二主区域到最接近的第二次要区域的液体通道长度为100％计，从所述第二主区域到任意一个另外的第二次要区域的液体通道长度为105％至400％。

9.如权利要求1所述的多层流控光检测装置，其特征在于，以从所述第二主区域到最接近的第二次要区域的液体通道长度为100％计，从所述第二主区域到任意一个另外的第二次要区域的液体通道长度为110％至300％。

10.一种对样品中至少两种检测物进行化学发光检测的非疾病诊断方法，该方法使用如权利要求1-9中任一项所述的多层流控光检测装置，该方法包括以下步骤：

i)使得所述至少两种检测物分别与至少两种特异性检测载体特异性地结合，形成复合物；

ii)将化学发光激活液施加于所述第一主区域，使得所述化学发光激活液经由所述第二功能层内的液体连通以及第一功能层和第二功能层之间的液体连通与所述复合物接触，导致化学发光；

iii)对上述化学发光进行光学检测；在所述多层流控光检测装置中，所述第一功能层位于所述第二功能层之上，所述至少两个第一次要区域内分别具有不同种类的特异性检测载体，且所述至少两个第二次要区域内均不具有特异性检测载体；

化学发光激活液施加于所述第一主区域，使得所述化学发光激活液经由所述第一主区域和第二主区域之间的液体连通从所述第一主区域流到第二主区域，随后经由所述液体通道从所述第二主区域流到所述至少两个第二次要区域，再经由所述至少两个第二次要区域和至少两个第一次要区域之间的液体连通从所述至少两个第二次要区域流到所述至少两个第一次要区域，在所述至少两个第一次要区域中与所述复合物接触，导致化学发光。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述检测物选自以下的一种或多种：蛋白质、核酸分子、小分子化合物、病毒、细胞。

12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述特异性检测载体包含相互结合的特异性识别体和发光功能化微纳材料，所述识别体选自蛋白质抗体、多肽、核酸适配体和酶中的一种或多种；所述发光功能化微纳材料包括发光试剂、发光催化剂和磁性物质中的一种或多种的组合；所述发光催化剂为过渡金属离子，该过渡金属离子选自Co²⁺、Ni²⁺、Fe³⁺和Fe²⁺；所述磁性物质选自Fe₃O₄、Co₂O₃、CoFe₂O₄和Ni₂O₃；

所述发光试剂为通式(I)的化合物，

其中，A环表示C₆-C₁₄芳环；

R₁和R₂独立地表示氢、端基被氨基取代或为未取代的直链或支链(C₁-C₃₀)烷基，前提是该NR₁R₂具有至少一个NH₂端基。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述过渡金属离子为Co²⁺。

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