KR20130103538A - 형광 공명 에너지 이동의 원리에 의거하는 1분자형 ｆｒｅｔ 바이오 센서의 링커 - Google Patents

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요시에 이나오카
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겐타 스미야마
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고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠
엘에스아이피 환도 운에이고우도우가이샤
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Abstract

본 발명은 비침습적인 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 저분자량 GTP 결합 단백질의 활성 등의 측정을 가능하게 하는, 형광 공명 에너지 이동의 원리에 의거하는 1분자형 FRET 바이오 센서의 링커 및 당해 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서 등을 제공하는 것을 과제로 한다.
이러한 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 52아미노산 잔기 이상 400아미노산 잔기 이하를 함유하는 폴리펩티드로서, 전(全) 아미노산 잔기수의 적어도 95％가 글리신, 세린, 트레오닌 및 알라닌으로 이루어지고, 글리신을 35 내지 65％, 세린 및 트레오닌 중 적어도 어느 하나를 10 내지 40％, 알라닌을 10 내지 40％ 함유하는 링커, 및 당해 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서, 당해 바이오 센서를 코드하는 유전자를 함유하는 발현 벡터를 보유하는 형질 전환된 세포 및 트랜스제닉 비인간 동물을 제공한다.

Description

형광 공명 에너지 이동의 원리에 의거하는 1분자형 ＦＲＥＴ 바이오 센서의 링커{LINKER FOR UNIMOLECULAR FRET BIOSENSOR BASED ON PRINCIPLE OF FLUORESCENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER}
본 발명은 형광 공명 에너지 이동의 원리에 의거하는 1분자형 FRET 바이오 센서를 최적화하기 위한 링커, 당해 링커를 함유하는 바이오 센서, 당해 링커 또는 1분자형 FRET 바이오 센서를 코드하는 유전자, 당해 링커 또는 1분자형 FRET 바이오 센서를 함유하는 발현 벡터, 당해 발현 벡터를 갖는 형질 전환된 세포 및 트랜스제닉 비인간 동물, 상기 바이오 센서를 사용하는 측정 방법에 관한 것이다.
형광 공명 에너지 이동(Fluorescence resonance energy transfer, 이하 FRET라고 하는 경우가 있음)의 원리와 형광 단백을 이용한 바이오 센서가 생명 과학의 분야에 있어서 급속하게 퍼져 있다(예를 들면 비특허문헌 1-4 참조).
FRET란, 여기(勵起) 상태에 있는 형광 분자(도너: 에너지 공여체)로부터 극히 근방의 형광 분자(억셉터: 에너지 수용체)로 여기 에너지가 이동하는 현상임을 말한다. FRET를 이용한 바이오 센서의 보급에는, 녹색 형광 단백(GFP)의 색변이체의 출현이나 그들의 개량이 크게 기여하고 있다. 현재, 많은 경우, GFP 변이체인 CFP(시안 형광 단백)와 YFP(황색 형광 단백)가 도너 및 억셉터 형광 단백질로서 이용되고 있다.
형광 단백질을 사용한 FRET 바이오 센서의 계(系)는, 2분자형 FRET 바이오 센서(도 1)와 1분자형 FRET 바이오 센서(도 2)로 대별된다. 2분자형 FRET 바이오 센서는 분자간 상호 작용을 검출하는 것이며, 1분자형 FRET 바이오 센서는 분자의 구조 변화를 검출하는 것이다(예를 들면 비특허문헌 1-4 참조).
이 중, 1분자형의 바이오 센서(1분자형 FRET 바이오 센서)는, 이온, 당, 지질(脂質) 등의 저분자의 정량이나, 저분자량 GTP 결합 단백, 인산화 효소 등의 활성 측정에 사용되는 것이 개발되어 있다(예를 들면 비특허문헌 4 참조).
그러나, 이 바이오 센서 작성을 위해서는, 적어도 3개, 많을 경우 4개 이상의 단백질 도메인을 결합할 필요가 있어, 그들을 단순히 결합한 것만으로는 통상, 충분한 감도를 갖는 1분자형 FRET 바이오 센서를 작성할 수는 없다. 즉, 이와 같은 1분자형 FRET 바이오 센서를 작성하기 위해서는, i) 도너 형광 단백질의 발광 스펙트럼과 억셉터 형광 단백질의 흡광 스펙트럼과의 겹침, ⅱ) 도너 형광 단백질과 억셉터 형광 단백질간의 거리, ⅲ) 도너 형광 단백질의 발광 모멘트와 억셉터 형광 단백질의 흡광 모멘트의 배향의 3인자를 고려하지 않으면 안 된다. 또한, 형광 단백질을 다른 단백질과 융합할 경우, 다른 단백질과 융합하는 것이 스트레스가 되어 형광 단백질의 미스폴딩(misfolding)이 생겨, 그 결과, 발색단 형성의 효율이 저하하여, 무형광이 될 가능성도 고려하지 않으면 안 된다. 이와 같이, 도너 형광 단백질과 억셉터 형광 단백질을 이용하여 양자간에 FRET의 양호한 발현을 생기게 하기 위해서는 엄격한 조건이 존재하고, 양자간의 배치 등에 일정한 규칙도 발견되어 있지 않기 때문에, 작성하는 1분자형 FRET 바이오 센서마다, 각각의 단백질 도메인의 길이나, 도메인간의 링커 서열 등을 다양하게 변경시켜, 최적인 것을 작성하는 것이 행해지고 있지만, 이에는, 많은 시행 착오나 복잡 고도한 실험 등을 요하며, 충분한 감도를 갖는 1분자형 FRET 바이오 센서의 개발은 상당한 곤란을 수반하는 것이었다.
각 도메인을 잇는 링커로서는, 9아미노산의 글리신, 세린, 트레오닌으로 이루어지는 것이나(예를 들면 비특허문헌 5 참조), 72아미노산의 글리신 링커(예를 들면 비특허문헌 6 참조)가 보고되고 있지만, 충분히 최적화되어 있다고는 할 수 없었다. 또한, 이들 링커에 있어서는, 많은 종류의 1분자형 FRET 바이오 센서에 공통하여 최적화를 도모할 수 있는 것이 아니었다.
Aoki, K. and M. Matsuda. 2009. Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors. Nature Protocol 4:1623-1631. Giepmans, B. N., S. R. Adams, M. H. Ellisman, and R. Y. Tsien. 2006. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science 312:217-224. Jares-Erijman, E. A. and T. M. Jovin. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. 2006. Curr. Opin. Chem. Biol. 10:409-416. Kiyokawa, E., S. Hara, T. Nakamura, and M. Matsuda. 2006. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97:8-15. Itoh, R. E., K. Kurokawa, Y. Ohba, H. Yoshizaki, N. Mochizuki, and M. Matsuda. 2002. Activation of Rac and Cdc42 video-imaged by FRET-based single-molecule probes in the membrane of living cells. Mol. Cell. Biol. 22:6582-6591. Harvey, C. D., A. G. Ehrhardt, C. Cellurale, H. Zhong, R. Yasuda, R. J. Davis, and K. Svoboda. 2008. A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
본 발명은 상기 종래에 있어서의 문제를 해결하고, 이하의 목적을 달성하는 것을 과제로 한다. 즉, 본 발명은 형광 공명 에너지 이동의 원리에 의거하는 1분자형 FRET 바이오 센서를 최적화하여 고감도의 1분자형 FRET 바이오 센서를 얻기 위해 널리 사용할 수 있는 링커(이하, 본 명세서에서는, 본 발명의 링커를 EV(Enhanced visualization) 링커라고 하는 경우가 있음), 당해 링커를 함유하는 바이오 센서, 당해 링커 또는 바이오 센서를 코드하는 유전자, 당해 링커 또는 바이오 센서를 함유하는 발현 벡터, 당해 발현 벡터를 갖는 형질 전환된 세포 및 트랜스제닉 비인간 동물, 및 상기 링커를 함유하는 바이오 센서를 사용하는 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 저분자량 GTP 결합 단백질의 활성을 측정하기 위해 호적(好適)한 상기 1분자형 FRET 바이오 센서를 사용하는 측정 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 바, 일정 이상의 길이를 갖는 링커가 상기 문제를 해결하고, 형광 공명 에너지 이동의 원리에 의거하는 1분자형 FRET 바이오 센서를 최적화하여 고감도의 1분자형 FRET 바이오 센서를 얻기 위해 널리 사용할 수 있는 링커가 되는 것을 발견했다. 또한, 특정한 아미노산을 일정한 비율 또는 일정한 서열의 반복으로서 함유함으로써, 최적화의 효과가 높아지는 것을 발견했다.
즉, 본 발명은 일정 이상의 길이를 갖는 링커를 사용함으로써, 1분자형 FRET 바이오 센서의 게인(gain)을 낮게 하는 요인인 기저 상태의 FRET를, 현저하게 저감시킬 수 있다는 지견(知見)에 의거하는 것이며, 1분자형 FRET 바이오 센서 작성에 범용적으로 사용할 수 있는 것이다. 본 발명의 링커는, 상기 1분자형 FRET 바이오 센서의 게인을 증대시키기 위해 개발된 것이며, 그 기술적 가치는 매우 크다.
즉, 상기 과제를 해결하기 위한 수단은 이하와 같다.
<1> 형광 공명 에너지 이동의 원리에 의거하는 1분자형 FRET 바이오 센서의 링커로서, 52아미노산 잔기 이상 400아미노산 잔기 이하를 함유하는 폴리펩티드로서, 전(全) 아미노산 잔기수의 적어도 45％가 글리신 및 알라닌 중 적어도 어느 하나이며, 알라닌을 전 아미노산 잔기수의 적어도 10％ 함유하는 것을 특징으로 하는 링커이다.
<2> 84아미노산 잔기 이상을 함유하는 폴리펩티드인 상기 <1>에 기재된 링커이다.
<3> 세린 및 트레오닌 중 적어도 어느 하나를 전 아미노산 잔기수의 적어도 10％ 함유하는 상기 <1> 또는 <2>에 기재된 링커이다.
<4> 전 아미노산 잔기수의 적어도 95％가 글리신, 세린, 트레오닌 및 알라닌으로 이루어지고, 글리신을 35 내지 65％, 세린 및 트레오닌 중 적어도 어느 하나를 10 내지 40％, 알라닌을 10 내지 40％ 함유하는 상기 <3>에 기재된 링커이다.
<5> 전 아미노산 서열 중 적어도 95％가 SAGG 및 GGAS 중 어느 하나의 아미노산 서열의 반복으로 이루어지고, SAGG 및 GGAS 중 어느 하나의 아미노산 서열의 반복 단위를 13개 이상 100개 이하 함유하는 것을 특징으로 하는 상기 <4>에 기재된 링커이다.
<6> 아르기닌 및 글루탐산 중 적어도 어느 하나를 전 아미노산 잔기수의 적어도 10％ 함유하는 상기 <1> 또는 <2>에 기재된 링커이다.
<7> 전 아미노산 잔기수의 적어도 95％가 글리신, 아르기닌, 글루탐산 및 알라닌으로 이루어지고, 글리신을 4 내지 30％, 아르기닌을 5 내지 30％, 글루탐산을 5 내지 30％, 및 알라닌을 30 내지 60％ 함유하는 상기 <6>에 기재된 링커이다.
<8> 상기 <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 기재된 링커를 코드하는 것을 특징으로 하는 유전자이다.
<9> 상기 <1> 내지 <7>중 어느 하나에 기재된 링커를 코드하는 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터이다.
<10> 상기 <9>에 기재된 발현 벡터를 보유하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 형질 전환된 세포이다.
<11> 상기 <9>에 기재된 발현 벡터를 보유하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비인간 동물이다.
<12> 형광 공명 에너지 이동의 원리에 의거하는 1분자형 FRET 바이오 센서로서, 센서 영역, 리간드 영역, 억셉터 형광 단백질 영역, 도너 형광 단백질 영역, 및 당해 센서 영역과 당해 리간드 영역을 연결하는 링커 영역을 갖는 융합 단백질이며, 당해 링커 영역이, 상기 <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 기재된 링커로 이루어지는 것을 특징으로 하는 1분자형 FRET 바이오 센서이다.
<13> 당해 도너 형광 단백질이 YPet인 상기 <12>에 기재된 1분자형 FRET 바이오 센서이다.
<14> 상기 <12> 및 <13> 중 어느 하나에 기재된 1분자형 FRET 바이오 센서를 코드하는 것을 특징으로 하는 유전자이다.
<15> 상기 <14>에 기재된 1분자형 FRET 바이오 센서를 코드하는 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터이다.
<16> 상기 <15>에 기재된 발현 벡터를 보유하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 형질 전환된 세포이다.
<17> 상기 <15>에 기재된 발현 벡터를 보유하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비인간 동물이다.
<18> 상기 <12>에 기재된 1분자형 FRET 바이오 센서를 사용하여 FRET를 검출하는 공정을 포함하고, 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 및 저분자량 GTP 결합 단백질 활성 중 어느 하나를 측정하는 것을 특징으로 하는 측정 방법이다.
<19> 상기 <16>에 기재된 형질 전환된 세포 또는 상기 <13>에 기재된 트랜스제닉 비인간 동물을 이용하여 FRET를 검출하는 공정을 포함하고, 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 및 저분자량 GTP 결합 단백질 활성 중 어느 하나를 측정하는 것을 특징으로 하는 측정 방법이다.
<20> (a) 상기 <16>에 기재된 형질 전환된 세포와 피검 물질을 접촉시키는 공정, 및
(b) FRET를 검출함으로써 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 및 저분자량 GTP 결합 단백질 활성 중 어느 하나의 변화를 검출하는 공정
을 포함하는, 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 및 저분자량 GTP 결합 단백질 활성 중 어느 하나의 조절 물질의 스크리닝 방법이다.
본 발명의 링커에 의하면, 형광 공명 에너지 이동의 원리에 의거하는 1분자형 FRET 바이오 센서를 최적화하여 고감도의 1분자형 FRET 바이오 센서를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 1분자형 FRET 바이오 센서에 의하면, 비침습적인 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 저분자량 GTP 결합 단백질의 활성의 측정이 가능해진다.
도 1은 2분자 FRET 바이오 센서의 기본 구조 및 작동 원리를 나타낸다. A와 B의 분자간 상호 작용을 검출하기 위해, A에 FRET 도너 형광 단백질(CFP를 예시하고 있음)을, B에 FRET 억셉터 형광 단백질(YFP를 예시하고 있음)을 융합하고 있다. A와 B가 결합하면, FRET 도너 형광 단백질이 FRET 억셉터 형광 단백질에 근접하여, FRET에 의해 FRET 억셉터 형광 단백질로부터의 형광을 검출할 수 있다. 화살표 부착 파선은, 여기광 및 형광을 나타내고 있다.
도 2는 1분자 FRET 바이오 센서의 기본 구조 및 작동 원리를 나타낸다. A라는 분자가 구조 변화를 일으키는 것이 알려져 있을 경우, 2개소에 FRET 도너 형광 단백질(CFP를 예시하고 있음)과 FRET 억셉터 형광 단백질(YFP를 예시하고 있음)을 융합시킨다. A분자의 구조 변화에 의해, FRET의 효율이 변화한다. 화살표 부착 파선은, 여기광 및 형광을 나타내고 있다.
도 3은 센서 영역과 리간드 영역을 함유하는 FRET를 이용한 1분자형 FRET 바이오 센서의 원리를 나타낸다. FRET 도너 형광 단백질(CFP를 예시하고 있음)과 FRET 억셉터 형광 단백질(YFP를 예시하고 있음) 사이에, 센서 영역 및 리간드 영역을 링커 서열을 개재(介在)하여 결합한다. 센서 영역은, 인산화 효소의 활성화나, GTP 교환 인자의 활성화 등, 다양한 세포내 환경의 변화에 대응하여 구조가 변화하는 부분을 함유한다. 리간드 영역은, 당해 센서 영역의 구조 변화에 대응하여 결합하는 도메인이다. 센서 영역의 구조가 변화하면 리간드 영역이 결합한다. 이에 수반하여, FRET 도너 형광 단백질이 FRET 억셉터 형광 단백질에 근접하여, FRET에 의해 FRET 억셉터 형광 단백질로부터의 형광을 검출할 수 있다.
도 4는 센서 영역과 리간드 영역을 함유하는 FRET를 이용한 1분자형 FRET 바이오 센서에 있어서의 링커 영역의 역할을, PKA에 대한 바이오 센서 Eevee-PKA를 예로 나타낸다. 센서 영역은, PKA에 의해 특이적으로 인산화되는 기질 서열을 함유한다. 리간드 영역은, 당해 인산화 펩티드에 결합하는 것이 알려져 있는 Rad1 단백질의 FHA1 도메인이다. 센서 영역의 기질 서열이 PKA에 의해 인산화되면 리간드 영역이 결합한다. 이에 수반하여, FRET 도너 형광 단백질(CFP)이 FRET 억셉터 형광 단백질(YFP)에 근접하여, FRET에 의해 FRET 억셉터 형광 단백질로부터의 형광을 검출할 수 있다.
도 5는 EV 링커의 길이와 게인의 관계를 나타낸다. HeLa 세포에 다양한 길이의 EV 링커를 갖는 Eevee-PKA를 발현시켜, 24시간 후에, 1mM의 디부티릴 cAMP로 PKA를 활성화했다. 자극 전과 자극 후 30분의 FRET／CFP 형광비를 측정하여, 자극 전에 대한 증가의 비율을 게인으로 했다.
도 6은 YFP 억셉터 단백질을 YPet 변이체로 함으로써, EV 링커의 효과가 더 현저해지는 것을 나타낸다. YPet와 다양한 길이의 EV 링커를 갖는 Eevee-PKA를 작성했다. 다음으로, HeLa 세포에 이들 Eevee-PKA를 발현시켜, 24시간 후에, 1mM의 디부티릴 cAMP로 PKA를 활성화했다. 자극 전과 자극 후 30분의 FRET／CFP 형광비를 측정하여, 자극 전에 대한 증가의 비율을 게인으로 했다.
도 7은 EV 링커의 효과가 기저 상태의 FRET를 저하시키는 것에 의한 것을 나타낸다. 도 7a는 Eevee-PKA-52를 HeLa 세포에 발현시켜, 공(共)초점 레이저 현미경 FV1000으로, 438㎚의 레이저로 여기하여, 각 파장에 있어서의 형광 강도를 측정한 결과이다.
도 7b는 Eevee-PKA-84에 대해서, 도 7a와 같이 측정한 결과이다.
도 7c는 Eevee-PKA-116에 대해서, 도 7a와 같이 측정한 결과이다. 기저 상태에서의 FRET를 나타내는 530㎚의 형광이 EV 링커를 길게 함으로써 현저하게 저하함을 알 수 있다.
도 8a는 EV 링커에 의한 기저 상태의 FRET 효율의 저하는, 인산화의 저하에 유래하는 것을 나타낸다. 도 7과 같이, Eevee-PKA를 HeLa 세포에 발현시켰다. 자극 전 샘플, 1mM 디부티릴 cAMP를 15분간 처리한 것, 1mM 디부티릴 cAMP와 50nM 칼리큘린(calyculin)을 15분간 처리한 것으로 분류하여, 50μM PhosTag를 함유하는 6％ SDS 폴리아크릴아미드겔로 분리했다. 그 후, 항(抗)GFP 항체 마우스 모노클로널 항체로 면역블로팅(immunoblotting)했다. EV 링커가 짧아짐에 따라, 기저 상태의 인산화가 저하하는 것을 알 수 있다.
도 8b는 도 8a의 인산화의 비율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 9a는 PIP3 결합 도메인을 갖는 Akt 바이오 센서(Eevee-Akt-84)의 구조를 나타낸다. 84a.a.라고 기재되어 있는 것이 EV84 링커이다. AktPH는 Akt 단백질의 PH 도메인을, NES는 핵외 이행 시그널을 나타내고 있다.
도 9b는 PIP3 결합 도메인을 갖는 Akt 바이오 센서(Eevee-Akt-116)의 구조를 도 9a와 같이 나타낸다. 116a.a.라고 기재되어 있는 것이 EV116 링커이다.
도 10은 EV 링커에 의한 기저 상태의 FRET의 저하는 Akt의 바이오 센서에 대해서도 관찰되는 것을 나타낸다. Eevee-Akt를 COS7 세포에 발현시켜, FRET／CFP 형광비를 측정했다. 5개 이상의 세포에 대해서 측정하고, 평균치와 함께 표시했다. EV 링커가 116인 것이 72Gly 링커와 비교하여, 낮은 기저 상태의 FRET를 갖고 있음을 알 수 있다.
도 11은 Eevee-ERK에 의한 ERK의 활성 측정을 글리신 링커를 가질 경우와의 비교에서 나타낸 도면이다. 도 11a는 HeLa 세포에 EV116 링커를 함유하는 Eevee-ERK(3560NES)를 발현시켜, 10ng／ml의 EGF로 자극하여, 실측치의 FRET／CFP 형광비를 Y축에 취한 것이다.
도 11b는 상기 FRET／CFP 형광비를 자극 전의 상태로 표준화한 것을 나타낸다.
도 11c는 글리신 링커를 갖는 EKAR-1667nes(72Gly 링커)(1667NES)에 대한 결과를 도 11a와 같이 나타낸 것이다.
도 11d는 상기 FRET／CFP 형광비를 자극 전의 상태로 표준화한 것을 나타낸다. 실측치의 FRET／CFP는, 2.2 정도가 상한이므로, 글리신 링커를 갖는 EKAR-1667nes보다도 EV116 링커를 함유하는 Eevee-ERK(도 11a 및 b 참조)가, 넓은 게인을 갖는 것은, 낮은 기저 상태의 FRET 효율에 의한 것을 나타내고 있다.
도 12는 EV 링커를 갖는 EGFR／Abl의 바이오 센서 Picchu-734의 반응성을 나타낸다. HeLa 세포에 Picchu-734를 발현시켜, 10ng／ml의 EGF로 자극했다. EV 링커를 갖지 않는 Picchu-730보다도 넓은 게인을 가짐을 알 수 있다.
도 13a는 EV 링커를 갖는 Raichu-Rac1(2246X)에 의한 Rac1 활성의 측정을 나타낸다. HeLa 세포에 EV 링커를 갖지 않는 pRaichu-Rac1(2241X) 및 EV 링커를 갖는 pRaichu-Rac1(2246X)을 트랜스펙트하여, 48시간 후에 실시예 2에 기재된 방법으로 이미징을 행했다. 공초점 레이저 현미경 FV1000으로, 438㎚의 레이저로 여기 하고, 각 파장에 있어서의 형광 강도를 측정한 도면이다. 기저 상태에서의 FRET를 나타내는 530㎚의 형광이 EV 링커를 길게 함으로써 현저하게 저하함을 알 수 있다.
도 13b는 도 13a의 이미징에 있어서, 이미징 개시 10분 후에 상피 세포 증식 인자(EGF)를 25ng／ml가 되도록 투여하고, 이미징을 더 계속했다. 정규화한 FRET／CFP를 그래프로서 표시하고 있다. EV 링커를 갖는 Raichu-Rac1(2246X) 쪽이, 높은 반응성을 갖고 있음을 알 수 있다.
도 14a는 Raichu-2246X를 안정적으로 발현하는 랫트 C6 세포를 24시간에 걸쳐 타임 랩스(time lapse) 이미지하고, FRET／CFP 효율(Rac1 활성이라고 기재되어 있음)을 측정한 데이터를 나타낸다. 화살표는 세포 분열을 나타낸다. EV 링커를 발현하는 세포에서 FRET를 장시간에 걸쳐 안정적으로 측정할 수 있음을 나타내고 있다.
도 14b는 상기와 동일한 조건으로 촬영한 다른 세포의 결과이다.
도 14c는 상기와 동일한 조건으로 촬영한 다른 세포의 결과이다.
도 14d는 상기와 동일한 조건으로 촬영한 다른 세포의 결과이다.
도 15a는 EV 링커를 갖는 Raichu-Cdc42를 COS7 세포에 발현시켰다. 기저 상태의 FRET 효율을 비교하여, EV 링커가 현저하게 기저 상태의 FRET를 저감시키는 것을 나타낸다.
도 15b는 EV 링커를 갖는 Raichu-Cdc42에 대해서, 이미징 개시 10분 후에 상피 세포 증식 인자(EGF)를 25ng／ml가 되도록 투여하고, 이미징을 더 계속했을 때의, 정규화한 FRET／CFP를 그래프로서 표시하고 있다.
도 15c는 EV 링커를 갖지 않는 Raichu-Cdc42에 대해서, 도 15b와 같이, 정규화한 FRET／CFP를 그래프로서 표시하고 있다. EV 링커를 갖는 Raichu-Cdc42 쪽이, EV 링커를 갖지 않는 Raichu-Cdc42보다 높은 반응성을 갖고 있음을 알 수 있다.
도 16a는 EV 링커를 갖는 Raichu-Ras(3705X)를 HeLa 세포에 발현시켜, 10ng／ml의 EGF로 자극하여, 1분 간격으로 타임 랩스 화상을 취득한 도면이다. EV 링커를 갖지 않는 Raichu-HRas(도 16B)와 비교하여, EV 링커를 갖는 Raichu-HRas는 조기(早期)에 또한 강하게 활성화를 검출할 수 있음을 알 수 있다.
도 16b는 EV 링커를 갖지 않는 Raichu-HRas에 대해서 도 16a와 같이 화상을 취득한 도면이다.
도 17은 Eevee-ERK를 발현하는 트랜스제닉 마우스의 태아의 시상단(矢狀斷)을 형광 현미경으로 촬영하고, FRET의 화상을 취한 것이다. 기저 상태에서 전후 40％를 의사(擬似) 컬러로 나타내고 있다(난색(暖色)이 높은 FRET를 나타냄). 개체 내에서의 ERK의 활성 분포를 볼 수 있다.
도 18은 HeLa 세포에 Eevee-ERK를 안정 발현시킨 것을 96웰 배양 접시(well plate)에 심고, 단계 희석한 저해제를 넣은 뒤에, 25ng／ml의 EGF로 자극한 결과이다. 30개 이상의 세포에 대해서, ERK의 활성을 자동 측정하고, 평균한 것을 그래프화했다. 도 18a는 DMSO의 컨트롤을 나타낸다.
도 18b는 저해제로서 EGF 수용체 저해제(AG1478)를 사용했을 경우를 나타낸다.
도 18c는 저해제로서, MEK 저해제(PD15035)를 사용했을 경우를 나타낸다.
도 18d는 저해제로서, BRAF의 저해제(PLX4720)를 사용했을 경우를 나타낸다.
도 18e는 저해제로서, MEK 저해제(PD184351)를 사용했을 경우를 나타낸다.
도 18f는 저해제로서, 포스파티딜이노시톨3인산 키나아제의 저해제(LY294002)를 사용했을 경우를 나타낸다.
도 18g는 저해제로서, RSK의 저해제(BI-D1870)를 사용했을 경우를 나타낸다.
도 18h는 저해제로서, JNK의 저해제(JNK inhibitor Ⅷ)를 사용했을 경우를 나타낸다. EGF 의존성의 ERK 활성화가, HeLa 세포에서는 EGF 수용체 및 MEK의 저해제에 의해 효과적으로 억제되는 것을 나타내고 있다.
도 19는 Eevee-PKA(3536NES)를 발현하는 트랜스제닉 마우스에게, 포스포디에스테라아제의 저해제인 테오필린 및 환상(環狀) 아데노신3인산의 아날로그인 액토신을 각각 정주(靜注)하여, PKA의 활성을 측정한 결과이다. 근간 신경 세포, 장관 평활근, 혈관 평활근의 각각에 있어서의 PKA의 활성 변화를 리얼 타임으로 가시화할 수 있다.
도 20은 도 19의 화상을 그래프화한 것이다.
도 21은 글리신 함량을 줄인 EV3x8 및 EV6x4 링커를 사용한 바이오 센서도 EV116 링커를 사용한 바이오 센서와 거의 동등한 효과를 갖는 것을 나타내는 도면이다. 도 7과 같이 Eevee-PKA-3x8, Eevee-PKA-4x6, Eevee-PKA-116을 HeLa 세포에 발현시켜, 공초점 레이저 현미경 FV1000으로, 438㎚의 레이저로 여기하여, 각 파장에 있어서의 형광 강도를 측정했다. EV3x8 및 EV4x6은 EV116 링커에 필적하는 효능을 가짐을 알 수 있다.
이하에, 본 발명의 실시형태를 설명한다.
본 발명의 링커(EV 링커라고 함)는, 형광 공명 에너지 이동(FRET)의 원리에 의거하는 1분자형 FRET 바이오 센서의 링커로서, 52아미노산 잔기 이상 400아미노산 잔기 이하를 함유하는 폴리펩티드로서, 전 아미노산 잔기수의 적어도 45％가 글리신 및 알라닌 중 적어도 어느 하나이며, 알라닌을 전 아미노산 잔기수의 적어도 10％ 함유하는 것을 특징으로 하는 링커이다.
본 발명의 링커는, 형광 공명 에너지 이동(FRET)의 원리에 의거하는 1분자형 FRET 바이오 센서, 즉, 1분자형 FRET 바이오 센서 중에 구성 요소의 하나로서 연결되어 사용되는 것이다. 본 발명에 있어서, FRET란, 여기 상태에 있는 형광 분자(도너: 에너지 공여체)로부터 극히 근방의 형광 분자(억셉터: 에너지 수용체)로 여기 에너지가 이동하는 현상임을 말한다. 1분자형 FRET 바이오 센서는, 일반적으로 도너 형광 단백질, 억셉터 형광 단백질, 센서 도메인, 리간드 도메인의 4개의 영역을 갖지만, 링커는 그들의 2개의 영역 사이를 이어서 연결되는 것이다.
도 3은 1분자형 FRET 바이오 센서 중에 사용되는 본 발명의 링커의 예시이다. CFP를 도너 형광 단백질의 일례로서, YFP를 억셉터 형광 단백질의 일례로서, 본 발명의 구체적 설명을 행하지만, 후술하는 바와 같이 도너 형광 단백질 및 억셉터 형광 단백질은 이에 한정되지 않는다. 센서 도메인과 리간드 도메인은, 기저 상태에서는 공간적으로 떨어진 위치에 있으며, 이 상태에서는, 도너 형광 단백질과 억셉터 형광 단백질도 또한 공간적으로 떨어진 위치에 있어, 기저 상태의 FRET 효율은 낮다. 활성화 상태에서는, 인산화, GTP 결합 등 다양한 시그널에 의해 유도되는 센서 영역 「A」의 구조 변화를 구조 인식 도메인으로 이루어지는 리간드 영역 「B」가 인식하여 결합함으로써, 도너와 억셉터가 근접하여, 이에 따라 FRET 효율이 상승한다.
여기에서, FRET 효율이란, 도너 형광 단백질을 여기하여 얻어지는 형광 강도의, 억셉터 형광 단백질 존재 하에서의 감소 비율을 가리키지만, 본 명세서에서는, 1분자형 FRET 바이오 센서를 도너 형광 단백질의 여기 파장으로 조사했을 경우의, 도너 형광 단백질의 형광 강도와 억셉터 형광 단백질의 형광 강도와의 비(형광 강도비)를 편의적으로 사용한다(비특허문헌 1 및 3 참조). 이하, 본 명세서에서 기재하는 참조 문헌은 참조에 의해, 그 전 교시가 본 명세서 중에 도입된다.
본 명세서에 따른 EV 링커는, 적어도 52아미노산 이상 400아미노산 이하의 길이를 가지며, 안정된 3차 구조를 취하지 않는 폴리펩티드이다. 52아미노산 미만이면, 기저 상태에서의 FRET 효율이 높아져 게인을 크게 취할 수 없고, 400아미노산을 초과하면, FRET 바이오 센서의 분자량이 커져 발현량이 저하하는 등의 문제가 생긴다. 상기 게인을 크게 취하는 관점에서는, 84아미노산 이상인 것이 보다 바람직하고, 116아미노산 이상인 것이 특히 바람직하다. 상기 분자량을 억제하는 관점에서는 244아미노산 이하인 것이 보다 바람직하다. 상기 관점에서, 링커의 길이로서는, 84아미노산 이상 244아미노산 이하인 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 EV 링커는, 안정된 3차 구조를 취하지 않는 폴리펩티드이며, 전 아미노산 잔기수의 적어도 45％가 글리신 및 알라닌 중 적어도 어느 하나이며(즉, 글리신 잔기와 알라닌 잔기의 합계가 전 아미노산 잔기수의 적어도 45％를 점하는 의미임), 알라닌을 전 아미노산 잔기수의 적어도 10％ 함유하는 것을 특징으로 하는 링커이다. 전 아미노산 잔기수의 적어도 45％가 글리신 및 알라닌 중 적어도 어느 하나로 이루어지는 것은, 가동성이 큰 폴리펩티드를 작성하는 관점에서 중요하며, 알라닌을 전 아미노산 잔기수의 적어도 10％ 함유함으로써, 글리신만의 링커보다 게인을 크게 취할 수 있다. 글리신 및 알라닌 이외의 아미노산 잔기로서는 안정된 3차 구조를 취하지 않는 점을 배려하면, 다른 아미노산을 함유할 수 있다. 안정된 3차 구조를 취하지 않는 폴리펩티드를 작성하는 관점에서, 세린, 트레오닌, 아르기닌, 글루탐산 등을 특히 호적하게 함유할 수 있다.
예를 들면, 알라닌 및 글리신에 더하여, 세린 및 트레오닌 중 적어도 어느 하나를 전 아미노산 잔기수의 적어도 10％ 함유하는 폴리펩티드가 바람직하다. 이와 같은 폴리펩티드로서는, 전 아미노산 잔기의 수 중 적어도 95％가 Gly, Ser, Thr, 및 Ala로 이루어지며, Gly를 35 내지 65％, Ser 및 Thr 중 적어도 어느 하나를 10 내지 40％, Ala를 10 내지 40％ 함유하는 폴리펩티드를 들 수 있다. 이들 아미노산 잔기는, 전장(全長)에 걸쳐 균일하게 분포시키는 것이 바람직하고, 그 중에서도, Ser-Ala-Gly-Gly, 그 역(逆)서열인 Gly-Gly-Ala-Ser, 또는, Gly-Ala-Gly-Ser을 반복하여 함유하는 서열이 바람직하다. 이와 같은 서열로서는, 예를 들면, Ser-Ala-Gly-Gly, Gly-Gly-Ala-Ser, 또는, Gly-Ala-Gly-Ser의 반복 단위를 전 아미노산 잔기의 수의 95％ 이상 함유하고, 상기 기본 서열 외에 Gly, Ser, Ala, Thr 등이 전체의 5％ 미만의 범위로 서열 중에 삽입되어 있는 서열도 바람직하다. 또한, 상기 서열에서, Ser과 성질이 매우 가까운 아미노산인 Thr을 Ser과 치환한 서열도 또한 바람직하다. 상기, 아미노산 서열의 반복 단위를 13개 이상 100개 이하 함유하는 것이 바람직하다. 이와 같은 링커의 구체예로서는 다음의 것을 들 수 있다.
EV52 링커(서열 번호: 12)
SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGG
EV84 링커(서열 번호: 15)
SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGG
EV116 링커(서열 번호: 18)
SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGG
EV180 링커(서열 번호: 23)
SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGG
EV244 링커(서열 번호: 26)
SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGG
또한, 알라닌 및 글리신에 더하여, 아르기닌 및 글루탐산 중 적어도 어느 하나를 전 아미노산 잔기수의 적어도 10％ 함유하는 폴리펩티드도 바람직하다. 이와 같은 폴리펩티드로서는, 전 아미노산 잔기수의 적어도 95％가 글리신, 아르기닌, 글루탐산 및 알라닌으로 이루어지고, 글리신을 4 내지 30％, 아르기닌을 5 내지 30％, 글루탐산을 5 내지 30％, 및 알라닌을 30 내지 60％ 함유하는 폴리펩티드를 들 수 있다. 이들 아미노산 잔기는, 전장에 걸쳐 균일하게 분포시키는 것이 바람직하고, 예를 들면 하기와 같은 서열을 들 수 있다.
EV3x8 링커(서열 번호: 45)
EAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAAR
EV6x4 링커(서열 번호: 46)
EAAAREAAAREAAAREAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAAREAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAAREAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARAAREAAAREAAAR
EV3x8 링커는, EAAAR의 서열을 3회 반복한 15아미노산 잔기의 서열 단위를 8개, GG 서열로 이은 134아미노산 잔기의 폴리펩티드이다. 전 아미노산 잔기수 134개 중 알라닌이 72개(53.7％), 글리신이 14개(10.4％), 글루탐산이 24개(17.9％), 아르기닌이 24개(17.9％)이다. 알라닌 및 글리신을 합하면 64.1％이다. 또한, EV6x4 링커는, 124아미노산 잔기의 폴리펩티드이며, 전 아미노산 잔기수 124개 중 알라닌이 71개(57.3％), 글리신이 6개(4.8％), 글루탐산이 23개(18.5％), 아르기닌이 24개(19.4％)이며, 알라닌 및 글리신을 합하면 62.1％이다.
본 발명의 EV 링커는, 1분자형 FRET 바이오 센서의 게인을 크게 시키는 것이며, 그 1분자형 FRET 바이오 센서 중의 삽입 부위는 기저 상태와 활성화 상태에서의 FRET 효율의 차, 즉, 게인의 증대를 고려하여, 적의(適宜) 선택될 수 있다. 즉, 1분자형 FRET 바이오 센서의 도너 형광 단백질, 억셉터 형광 단백질, 센서 도메인, 및 리간드 도메인의 영역에서 선택되는 어느 2개의 영역 사이를 연결하여 사용할 수 있고, 어느 영역간에 사용할지는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 도 3과 같이, 센서 도메인과 리간드 도메인 사이의 연결에 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 1분자형 FRET 바이오 센서는, 형광 공명 에너지 이동의 원리에 의거하는 1분자형 FRET 바이오 센서로서, 센서 영역, 리간드 영역, 억셉터 형광 단백질 영역, 도너 형광 단백질 영역, 및 당해 센서 영역과 당해 리간드 영역을 연결하는 링커 영역을 갖는 융합 단백질이며, 당해 링커 영역이, 상기 본 발명의 링커로 이루어진다. 본 발명에 따른 1분자형 FRET 바이오 센서의 바람직한 태양으로서는, 도너 형광 단백질, 억셉터 형광 단백질, 센서 도메인, 리간드 도메인, 링커의 5개의 영역을 적어도 하나씩 함유하며, 또한, 아미노 말단측으로부터, 도너(또는 억셉터) 형광 단백질, 센서(또는 리간드) 도메인, EV 링커, 리간드(또는 센서) 도메인, 억셉터(또는 도너) 형광 단백질을 함유하는 태양 (1), 도너 형광 단백질, 억셉터 형광 단백질, 센서 도메인, 리간드 도메인, 링커의 5개의 영역을 적어도 하나씩 함유하며, 또한, 아미노 말단측으로부터, 센서(또는 리간드) 도메인, 도너(또는 억셉터) 형광 단백질, EV 링커, 억셉터(또는 도너) 형광 단백질, 리간드(또는 센서) 도메인을 함유하는 태양 (2), 도너 형광 단백질, 억셉터 형광 단백질, 센서 도메인, 리간드 도메인, 링커의 5개의 영역을 적어도 하나씩 함유하며, 또한, 아미노 말단측으로부터, 도너(또는 억셉터) 형광 단백질, 센서(또는 리간드) 도메인, EV 링커, 억셉터(또는 도너) 형광 단백질, 리간드(또는 센서) 도메인을 함유하는 태양 (3), 도너 형광 단백질, 억셉터 형광 단백질, 센서 도메인, 리간드 도메인, 링커의 5개의 영역을 적어도 하나씩 함유하며, 또한, 아미노 말단측으로부터, 센서(또는 리간드) 도메인, 도너(또는 억셉터) 형광 단백질, EV 링커, 억셉터(또는 도너) 형광 단백질, 리간드(또는 센서) 도메인을 함유하는 태양 (4)를 들 수 있다.
센서 영역에, 인산화되는 펩티드 혹은 저분자량 GTP 결합 단백질을 함유할 경우에는 태양 (1)이 바람직하다. 따라서, 당해 EV 링커는, 1분자형 FRET 바이오 센서에 있어서, 리간드 영역과 센서 영역 사이에 개재하는 것이 바람직하다. 또한, 1분자형 FRET 바이오 센서에 있어서, 도너 형광 단백질, 억셉터 형광 단백질, 리간드 영역, 억셉터 영역, EV 링커는 반드시 하나씩일 필요는 없고, 복수 존재해도 된다.
도너 형광 단백질 영역을 구성하는 도너 형광 단백질로서는 FRET의 페어가 되는 기능이 유지되고 있으면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 기능적 관점에서, 바람직하게는 CFP 또는 TFP(Teal Fluorescence Protein)이다. 한쪽의 억셉터 형광 단백질 영역을 구성하는 억셉터 형광 단백질도 마찬가지로 FRET의 페어가 되는 기능이 유지되고 있으면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 기능적 관점에서, 바람직하게는 YFP이다. 여기에서, FRET의 페어가 되는 기능이란, 여기 상태에 있는 도너 형광 단백질로부터 근방의 억셉터 형광 단백질로 여기 에너지가 이동하여, 당해 여기 에너지의 이동을 검출할 수 있음을 말한다.
도너 형광 단백질 및／또는 억셉터 형광 단백질은, FRET의 페어가 되는 기능이 유지되고 있으면 그들 단백질의 일부여도 되고, 반드시 전부(전장)일 필요는 없다. 여러 차례, 그들 아미노산 서열의 카르복시 말단을 짧게 함으로써, FRET 효율의 차의 증대가 생긴다. 예를 들면, 억셉터 형광 단백질 및／또는 도너 형광 단백질의 일부로서는, 그들의 아미노산 서열의 카르복시 말단 영역에 바람직하게는 적어도 1개, 보다 바람직하게는 1∼11개의 결손을 갖고 이루어지는 것을 들 수 있다. 또한, 이러한 영역에서의 아미노산의 결손 부위에는 특별히 한정은 없다. 예를 들면, YFP의 경우, 그 아미노산 서열의 카르복시 말단 영역에서 바람직하게는 적어도 1개, 보다 바람직하게는 1∼11개, 더 바람직하게는 11개의 아미노산의 결손을 갖고 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, CFP의 경우, 그 아미노산 서열의 카르복시 말단 영역에서 바람직하게는 적어도 1개, 보다 바람직하게는 1∼11개, 더 바람직하게는 11개의 아미노산의 결손을 갖고 이루어지는 것이 바람직하다.
여기에서, 카르복시 말단 영역이란, 본 발명에 사용하는 GFP 관련 단백질의 아미노산 서열에서, 그 카르복시 말단으로부터, 아미노산의 개수로 바람직하게는 1∼20개까지의, 보다 바람직하게는 11개까지의 영역을 말한다. 또한, FRET의 페어가 되는 기능이 유지되고 있는지의 여부는, 예를 들면, 공지의 방법에 따라 FRET의 페어를 형성한다고 상정되는 1쌍의 단백질 분자를 모두 대장균에서 생산하고, 당해 1쌍의 단백질을 함유하는 세포 추출액에서, 당해 단백질 각각이 상정되는 여기 파장에서의 형광 강도를 관찰한다는 방법에 의해 평가할 수 있다.
또한, 억셉터 형광 단백질 및／또는 도너 형광 단백질은 변이를 갖고 있어도 상관없다. 이러한 변이의 도입은, FRET의 페어가 되는 기능이 유지되고 있는 한, 억셉터 형광 단백질 및／또는 도너 형광 단백질의 아미노산 서열에서의 임의의 부위에 대하여 행할 수 있다. 예를 들면, 변이의 태양으로서는 복수의 아미노산의 치환을 들 수 있고, 이러한 아미노산 치환의 구체적 태양으로서는, 예를 들면, GFP의 변이체인 Leu65Phe, Phe47Leu, Thr66Ser 등을 들 수 있다. 이와 같은 변이를 도입함으로써 발색단 형성 효율의 상승이나, FRET 효율의 상승 등의 효과를 얻을 수 있으므로 바람직하다. 변이의 도입은, 공지의 PCR(폴리머라제 연쇄 반응)을 사용하는 방법 등에 의해 행할 수 있다. YFP의 변이체로서, 예를 들면, Ypet〔Nguyen A. W., and P. S. Daugherty. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. 2005. Nat.Biotechnol.23: 355-360〕, EYFP(Clontech사), Venus〔Nagai, T., K. Ibata, E. S. Park, M. Kubota, K. Mikoshiba, and A. Miyawaki. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. 2002. Nat. Biotechnol. 20:87-90〕 등을 들 수 있고, CFP의 변이체로서는, 예를 들면, CyPet〔Nguyen A. W., and P. S. Daugherty. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. 2005. Nat. Biotechnol. 23:355-360〕, ECFP(Clontech사), SECFP(비특허문헌 5), Turquoise(Goedhart, J., L. an Weeren, M. A. Hink, N. O. Vischer, K. Jalink, and T. W. Gadella, Jr. Bright cyan fluorescent protein variants identified by fluorescence lifetime screening. 2010. Nat. Methods 7:137-139.) 등을 들 수 있다. 억셉터 형광 단백질 및 도너 형광 단백질의 조합으로서는, Venus와 ECFP, YPet와 ECFP, Venus와 Turquoise, YPet와 Turquoise를 호적하게 사용할 수 있다.
센서 영역을 구성하는 센서 단백질 및 리간드 영역을 구성하는 리간드의 조합으로서는, 특별히 제한은 없지만, 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 및 저분자량 GTP 결합 단백질 활성 중 어느 하나를 측정 가능한 조합을 호적하게 들 수 있다. 세린트레오닌 인산화 효소 활성을 측정하는 조합으로서는, 포크헤드 회합(Forkhead-associated, 이하 FHA1이라고 기재함) 도메인, WW(Trp-Trp) 도메인, 혹은 BRCT(BRCA1-C 말단) 도메인과 세린 또는 트레오닌을 함유하는 펩티드 서열이, 티로신 인산화 효소 활성을 측정하는 조합으로서는, SH2(Src 호몰로지 2) 도메인 또는 PTB(Phsophotyrosine-binding) 도메인과 티로신을 함유하는 펩티드 서열이, 저분자량 GTP 결합 단백질 활성을 측정하는 조합으로서는, Ras 패밀리 저분자량 GTP 결합 단백질, Rho 패밀리 저분자량 GTP 결합 단백질, Rab 패밀리 저분자량 GTP 결합 단백질, Arf 패밀리 저분자량 GTP 결합 단백질, 혹은 Ran 저분자량 GTP 결합 단백질과 각각의 표적 단백질을 호적하게 들 수 있다.
본 발명의 1분자형 FRET 바이오 센서의 구성 요소 및 각각의 특히 바람직한 조합으로서는, 유효성, 특이성 및 감도의 관점에서, 센서 영역이 저분자량 GTP 결합 단백질 Ras이며, 리간드 영역이 Ras의 표적 단백질 Raf이며, 도너 형광 단백질이 CFP이며, 억셉터 형광 단백질이 YFP이거나, 센서 영역이 저분자량 GTP 결합 단백질 Rac1이며, 리간드 영역이 Rac1의 표적 단백질 Pak이며, 도너 형광 단백질이 CFP이며, 억셉터 형광 단백질이 YFP이거나, 또는 센서 영역이 저분자량 GTP 결합 단백질 Cdc42이며, 리간드 영역이 Cdc42의 표적 단백질 Pak이며, 도너 형광 단백질이 CFP이며, 억셉터 형광 단백질이 YFP이거나, 또는, 센서 영역이 프로테인 키나아제 A(A 키나아제, 이하 PKA라고 기재함)에 의해 인산화되는 펩티드이며, 리간드 영역이 FHA1 도메인이며, 도너 형광 단백질이 CFP이며, 억셉터 형광 단백질이 YFP이거나, 또는, 센서 영역이 세포외 시그널 조절 키나아제(Extracellular Signal-regulated Kinase, 이하 ERK라고 기재함)에 의해 인산화되는 펩티드이며, 리간드 영역이 WW 도메인이며, 도너 형광 단백질이 CFP이며, 억셉터 형광 단백질이 YFP이거나, 또는, 센서 영역이 티로신 인산화 효소에 의해 인산화되는 펩티드이며, 리간드 영역이 Crk 단백질의 SH2 도메인이며, 도너 형광 단백질이 CFP이며, 억셉터 형광 단백질이 YFP이다.
억셉터(또는 도너) 형광 단백질, 리간드(또는 센서) 도메인 또한, 저분자량 GTP 결합 단백질, 표적 단백질의 결합 순서는, 게인의 증대의 관점에서, 본 발명의 EV 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서에 있어서, 바람직하게는 아미노 말단측으로부터 YFP-FHA1-EV 링커 PKA 기질 펩티드-CFP, YFP-FHA1-EV 링커 ERK 기질 펩티드-CFP, YFP-Raf-EV 링커 Ras-CFP, YFP-Rac1-EV 링커 Pak-CFP, YFP-Cdc42-EV 링커 Pak-CFP, 또는 YFP-CRK SH2 도메인-EV 링커 티로신 키나아제 기질 펩티드-CFP를 들 수 있다. 또한, 이들에 있어서 YFP와 CFP의 위치가 서로 교환되어 이루어지는 것, 혹은, YFP 및 CFP의 다양한 변이체, 예를 들면, Ypet, CyPet, EYFP(Clontech사), ECFP(Clontech사), SECFP, Venus 등도 호적하게 사용할 수 있다.
본 발명의 1분자형 FRET 바이오 센서는, 상기 5개의 영역을 갖는 것이면 되고, 세포내 분포를 목적에 따라 변화시키기 위해, 혹은 1분자형 FRET 바이오 센서의 정제를 용이하게 하는 목적 등을 위해, 펩티드 태그 혹은, 다른 형광 단백질, 혹은 세포내 국재(局在) 시그널, 단백-단백질간 상호 작용을 담당하는 도메인 등을 그 N말단, C말단, 혹은 1분자형 FRET 바이오 센서 내부에 더 함유하는 것도 호적하게 사용할 수 있다.
또한, 상술하는 본 발명의 EV 링커가 본 발명의 원하는 효과를 발현할 수 있는지의 여부에 대한 평가는, 예를 들면, 후술하는 실시예 1에 기재된 방법에 준하여 평가할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 상기 EV 링커를 코드하는 유전자(DNA) 및 본 발명에 따른 상기 1분자형 FRET 바이오 센서를 코드하는 유전자(DNA)를 제공한다. EV 링커의 유전자는, 화학 합성하는 것이 가능하며, 또한, 상기 1분자형 FRET 바이오 센서의 유전자는, EV 링커 이외의 상기 각 구성 단백질에 대해서는 유전자 정보를 GenBank 등으로부터 입수하여, 공지의 PCR을 사용한 방법과 제한 효소와 리가아제를 사용한 방법에 의해 통상의 방법에 따라 제작할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 유전자를 함유하는 발현 벡터를 제공한다. 이러한 벡터는, 공지의 방법에 따라, 본 발명의 EV 링커 또는 1분자형 FRET 바이오 센서를 코드하는 유전자를 공지의 원핵 세포 발현 벡터, 예를 들면 pGEX-2T(GE·헬스케어사제), 진핵 세포 발현 벡터, 예를 들면 pCAGGS〔Niwa, H., K. Yamamura, and J. Miyazaki. 1991. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108:193-200.〕에, 혹은 바이러스 벡터, 예를 들면 pCX4〔Iwahara, T., T. Akagi, Y. Fujitsuka, and H. Hanafusa. 2004. CrkII regulates focal adhesion kinase activation by making a complex with Crk-associated substrate, p130Cas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 101:17693-17698.〕에 삽입함으로써 얻을 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 발현 벡터를 보유하는 형질 전환된 세포 및 트랜스제닉 비인간 동물을 제공한다. 이러한 형질 전환된 세포는, 상기 발현 벡터를 대상으로 하는 세포에 도입함으로써 얻을 수 있다. 세포에의 도입법으로서는 공지의 트랜스펙션법이나 바이러스 감염법을 사용할 수 있어 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 인산칼슘법, 리포펙션법, 일렉트로포레이션법, 혹은 트랜스포존을 사용하는 방법 등을 사용할 수 있다. 당해 세포로서는 진핵 세포 혹은 원핵 세포를 사용할 수 있고, 특별히 제한은 없다. 예를 들면, 진핵 세포로서는, 인간 암 유래의 HeLa 세포, 인간 태아 신장 유래 HEK293 세포, 개 신장 유래 MDCK 세포, 원숭이 신장 유래 COS7 세포, 랫트 C6 글리오마(glioma) 세포, 효모 등, 원핵 세포로서는, 대장균 등, 그 외, 각종 세포를 사용할 수 있다.
한편, 상기 발현 벡터를 공지의 방법, 예를 들면, 마우스 수정란의 핵 내에 플라스미드 DNA를 마이크로인젝션하는 방법, 혹은 Tol2 트랜스포제이스를 개재하는 방법〔Sumiyama, K., K. Kawakami, and K. Yagita. 2010. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics 95:306-311.〕 등에 의해, 마우스 등의 개체에 직접 도입함으로써 트랜스제닉 비인간 동물을 얻을 수 있다. 트랜스제닉 비인간 동물로서는, 인간 이외이면 특별히 제한은 없지만, 마우스, 랫트, 돼지, 제브라피쉬, 선충(線蟲) 등을 들 수 있다. 의약 산업에의 응용의 관점에서 마우스가 바람직하다.
본 발명에 있어서는 또한, 본 발명의 1분자형 FRET 바이오 센서를 사용하여 FRET를 검출하는 공정을 포함하며, 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 및 저분자량 GTP 결합 단백질 활성 중 어느 하나를 측정하는 측정 방법을 제공한다. 본 발명의 1분자형 FRET 바이오 센서를 사용하여 FRET를 검출하는 공정으로서는, 1분자형 FRET 바이오 센서를 발현되는 세포주를 형광 현미경에 놓고 관찰하고, 타임 랩스 이미징을 행하는 방법이나, 1분자형 FRET 바이오 센서를 발현하는 세포주를 플로우 사이토미터를 사용하여 해석하는 방법 등을 들 수 있다. 이러한 방법에 의하면, 본 발명에 따른 1분자형 FRET 바이오 센서에 있어서의 FRET를 검출함으로써 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 저분자량 GTP 결합 단백질의 활성을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서는, 본 발명에 따른 형질 전환된 세포 또는 트랜스제닉 비인간 동물을 이용하여 FRET를 검출하는 공정을 포함하는, 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 및 저분자량 GTP 결합 단백질 활성 중 어느 하나를 측정하는 측정 방법을 제공한다. 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 및 저분자량 GTP 결합 단백질 활성은, 상술한 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 및 저분자량 GTP 결합 단백질 활성 중 어느 하나를 측정 가능한 센서 영역 및 리간드 영역을 갖는 1분자형 FRET 바이오 센서를 사용함으로써 측정할 수 있다. FRET를 검출하는 공정으로서는, FRET에 의한 여기 에너지의 이동을 검출할 수 있으면 특별히 제한은 없지만, 예를 들면, 현미경을 사용한 측정 방법, 플로우 사이토미터를 사용한 측정 방법, 분광 광도계를 사용한 방법, 형광 ELISA 리더를 사용한 방법 등을 들 수 있다. 이 측정 방법에 있어서는, FRET를 검출하여, 당해 세포 또는 동물에 있어서의 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 저분자량 GTP 결합 단백질의 활성을 직접 측정할 수도 있다. 이러한 경우, 별도, 인산화 특이적 항체를 사용하여, 인산화의 비율을 산출하여, 대응하는 FRET 효율을 더 측정하여 검량선을 작성하는 것이나, GTP가 결합한 저분자량 GTP 결합 단백질과 GTP로부터의 무기 인산의 유리(遊離)에 의해 생기는 GDP가 결합한 저분자량 GTP 결합 단백질을 측정하여 GTP／GDP비〔또는 GTP／(GDP + GTP)비〕(모두 몰비)를 산출하여, 대응하는 FRET 효율을 더 측정하여 검량선을 작성할 수 있다. 이러한 검량선을 사용하면, 당해 세포 또는 동물에 있어서의 FRET 효율에 의거하여, 인산화나 GTP／GDP비를 산출할 수 있다.
예를 들면, 구체적으로는 이하와 같은 방법이 예시된다.
본 발명에 따른 1분자형 FRET 바이오 센서를 발현한 본 발명의 형질 전환 세포 또는 트랜스제닉 비인간 동물을 형광 현미경으로 관찰하고, 센서 영역의 구조 변화 전후에 생기는 FRET 효율의 변화를 직접적으로 검출한다. 이 측정법에 대해서는, (비특허문헌 1)에 준하여 행할 수 있다. 트랜스제닉 비인간 동물의 경우에는, 예를 들면 외이(外耳) 등 고정하기 쉬운 부위를 관찰 대상으로 하는 것이 바람직하다.
사용하는 형광 현미경에는 특별히 제한은 없지만, 공지의 제논 광원을 갖는 도립형(倒立型) 형광 현미경(IX81, 올림푸스사제)에 회전식 형광 여기 필터 및 회전식 형광 발광 필터를 구비하고, 고감도 냉각 CCD 카메라를 구비한 것이 바람직하다. 또한 필터 및 카메라 화상은, 몰레큘러디바이스사제 MetaMorph 화상 해석 소프트로 제어 및 해석할 수 있는 시스템이 바람직하다.
상기 세포 또는 동물에게 도너 형광 단백질의 여기광을 조사하여, 도너 형광 단백질의 형광 파장에서의 화상을 CCD 카메라에 의해 촬영하고, 그 후, 억셉터 형광 단백질의 형광 파장에서의 화상을 촬영한다. 양(兩)화상의 형광 강도의 비를 측정함으로써 각 측정점에서의 FRET 효율을 산출할 수 있다.
본 발명에 의하면, 본 발명에 따른 EV 링커를 함유하며, 비침습적으로 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 저분자량 GTP 결합 단백질의 활성을 측정하는 것을 가능하게 하는 1분자형 FRET 바이오 센서, 그 유전자 등이 제공된다. 비침습적인 활성 측정이 가능해지는 것은, 사용하는 여기광이 가시광 영역이기 때문이다. 또한, 이러한 1분자형 FRET 바이오 센서를 발현하여, 비침습적인 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 저분자량 GTP 결합 단백질의 활성의 측정에 유용한 상기 발현 벡터를 보유하는 형질 전환된 세포 및 트랜스제닉 비인간 동물, 및 상기 EV 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서를 사용하는 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 저분자량 GTP 결합 단백질의 활성을 측정하는 방법이 제공된다. 따라서, 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 저분자량 GTP 결합 단백질의 활성을 세포 내 또는 개체 내에서 비침습적으로 아는 것이 가능해져, 생명 현상의 이해뿐만 아니라, 약제 개발(예를 들면, 암, 자기 면역 질환, 알레르기성 질환 등의 치료제 또는 예방제)에 있어서 엄청난 이익을 가져올 수 있다.
또한 본 발명의 다른 태양으로서, 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 저분자량 GTP 결합 단백질의 활성 조절 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 즉, (a) 본 발명의 형질 전환된 세포와 피검 물질을 접촉시키는 공정, 및 (b) FRET를 검출함으로써 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 및 저분자량 GTP 결합 단백질 활성 중 어느 하나의 변화를 검출하는 공정을 포함하는, 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 및 저분자량 GTP 결합 단백질 활성 중 어느 하나의 조절 물질의 스크리닝 방법이다. 본 발명의 형질 전환된 세포는, 본 발명의 1분자형 FRET 바이오 센서를 발현하는, EV 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서 유전자를 함유하는 발현 벡터를 보유하는 형질 전환된 세포이다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의하면, 본 발명의 EV 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서를 발현되는 세포를 구축하고, 바이오 어세이계를 사용함으로써, 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 저분자량 GTP 결합 단백질의 활성을 변화시키는 물질 또는 그 염(즉, 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 저분자량 GTP 결합 단백질의 활성 조절 물질)을 효율 좋게 스크리닝할 수 있다. 당해 방법에 있어서의 피검 물질로서는 특별히 한정되는 것이 아니지만, 예를 들면, 펩티드, 단백질, 비펩티드성 물질, 합성 물질, 발효 생산물 등을 들 수 있다.
[실시예]
이하, 본 발명을 실시예에 의해 설명하지만, 본 발명의 범위는 이러한 실시예만으로 한정되는 것이 아니다.
(실시예 1)
Eevee-PKA에 의한 세린트레오닌 인산화 효소 A 키나아제(PKA)의 효소 활성의 측정
(1) PKA의 효소 활성을 측정하기 위한, EV 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서를 코드하는 유전자의 작성
(i) EV 링커 유전자를 삽입하기 위한 플랫폼 Eevee-PKA-G72(3520NES) 유전자의 작성
1분자형 FRET 바이오 센서 Eevee-PKA-G72(3520NES) 유전자는, PCR 등의 공지의 방법을 이용하여 작성했다(도 3). 즉, 1분자형 FRET 바이오 센서는, 아미노 말단으로부터 YFP, 링커, 리간드 도메인(여기에서는 인산화 트레오닌에 특이적으로 결합하는 FHA1 도메인), 링커, PKA에 의해 인산화되는 기질 서열, 링커, CFP 도너 형광 단백질을 갖는다. 이 염기 서열(서열 번호: 1) 및 예측되는 아미노산 서열(서열 번호: 2)을 설명한다:
nt 1-714: 오완해파리(Aequorea)의 YFP(YPet)
nt 715-720: 링커(Leu-Glu)
nt 721-1143: 효모의 Rad53 유전자의 FHA1 도메인
nt 1144-1149: 링커(Gly-Thr)
nt 1150-1392: 글리신 링커
nt 1393-1437: PKA의 기질 서열
nt 1438-1446: 링커(Gly-Gly-Arg)
nt 1447-2163: 오완해파리의 CFP(ECFP)
nt 2164-2169: 링커(Ser-Arg)
nt 2170-2205: 핵외 이행 시그널(NES)
nt 2206-2208: 종지 코돈
(ⅱ) EV20 링커의 합성과 Eevee-PKA-20 유전자(3532NES)의 작성
센스 프라이머 F_20a.a_linker(서열 번호: 3) 및 안티센스 프라이머 R_20a.a_linker(서열 번호: 4)를 어닐링하고, 3520NES의 Asp718I와 Aor13HI의 제한 효소 절단 부위에 삽입했다. 이 삽입된 뉴클레오티드가 코드하는 20아미노산의 링커를 EV20링커라고 한다(서열 번호: 5). 또한, YPet는 Venus로 치환했다. 작성된 1분자형 FRET 바이오 센서를 Eevee-PKA-20(3532NES)으로 명명했다. 이러한 염기 서열(서열 번호: 6) 및 예측되는 아미노산 서열(서열 번호: 7)을 설명한다:
nt 1-714: 오완해파리(Aequorea)의 YFP(Venus)
nt 715-720: 링커(Leu-Glu)
nt 721-1143: 효모의 Rad53 유전자의 FHA1 도메인
nt 1143-1149: 링커(Gly-Thr)
nt 1150-1209: EV20 링커(서열 번호: 5)
nt 1210-1215: 링커(Ser-Gly)
nt 1216-1239: PKA의 기질 서열
nt 1239-1248: 링커(Gly-Gly-Arg)
nt 1249-1965: 오완해파리의 CFP(ECFP)
nt 1966-1971: 링커(Ser-Arg)
nt 1972-2007: 핵외 이행 시그널(NES)
nt 2008-2010: 종지 코돈
(ⅲ) Eevee-PKA-52(3535NES)의 작성
Eevee-PKA-20의 포유 세포 발현 벡터 pEevee-PKA-20을 제한 효소 EcoRI와 Asp718I로 절단하고, 사이즈가 큰 쪽의 단편을 벡터로서 조정했다. 이 pEevee-PKA-20 단편을 EcoRI와 Aor13HI로 절단한 링커를 함유하는 부분 및, 센스 프라이머 F_10a.a_linker(서열 번호: 8) 및 안티센스 프라이머 R_10a.a_linker(서열 번호: 9)를 어닐링한 DNA의 3자를 라이게이션(ligation)하여, pEevee-PKA-52를 작성했다. 이러한 염기 서열(서열 번호: 10) 및 예측되는 아미노산 서열(서열 번호: 11)을 설명한다:
nt 1-714: 오완해파리(Aequorea)의 YFP(Venus)
nt 715-720: 링커(Leu-Glu)
nt 721-1143: 효모의 Rad53 유전자의 FHA1 도메인
nt 1144-1149: 링커(Gly-Thr)
nt 1150-1305: EV52 링커(서열 번호: 12)
nt 1306-1311: 링커(Ser-Gly)
nt 1312-1335: PKA의 기질 서열
nt 1336-1344: 링커(Gly-Gly-Arg)
nt 1345-2061: 오완해파리의 CFP(ECFP)
nt 2062-2067: 링커(Ser-Arg)
nt 2068-2103: 핵외 이행 시그널(NES)
nt 2104-2106: 종지 코돈
(ⅳ) pEevee-PKA-84(3537NES)의 작성
Eevee-PKA-20의 포유 세포 발현 벡터 pEevee-PKA-20을 제한 효소 EcoRI와 Asp718I로 절단하고, 사이즈가 큰 쪽의 단편을 벡터로서 조정했다. 이 pEevee-PKA-20 단편을 EcoRI와 Aor13HI로 절단한 링커를 함유하는 부분 및, 센스 프라이머 F_10a.a_linker(서열 번호: 8) 및 안티센스 프라이머 R_10a.a_linker(서열 번호: 9)를 어닐링한 DNA의 3자를 라이게이션하여, Eevee-PKA-84를 작성했다. 이러한 염기 서열(서열 번호: 13) 및 예측되는 아미노산 서열(서열 번호: 14)을 설명한다:
nt 1-714: 오완해파리(Aequorea)의 YFP(YPet)
nt 715-720: 링커(Leu-Glu)
nt 721-1143: 효모의 Rad53 유전자의 FHA1 도메인
nt 1144-1149: 링커(Gly-Thr)
nt 1150-1401: EV84 링커(서열 번호: 15)
nt 1402-1407: 링커(Ser-Gly)
nt 1408-1431: PKA의 기질 서열
nt 1432-1440: 링커(Gly-Gly-Arg)
nt 1441-2157: 오완해파리의 CFP(ECFP)
nt 2158-2163: 링커(Ser-Arg)
nt 2164-2199: 핵외 이행 시그널(NES)
nt 2200-2202: 종지 코돈
(ⅴ) pEevee-PKA-116(3536NES)의 작성
Eevee-PKA-52의 포유 세포 발현 벡터 pEevee-PKA-20을 제한 효소 EcoRI와 Asp718I로 절단하고, 사이즈가 큰 쪽의 단편을 벡터로서 조정했다. 이 pEevee-PKA-52 단편을 EcoRI와 Aor13HI로 절단한 링커를 함유하는 부분 및, 센스 프라이머 F_10a.a_linker(서열 번호: 8) 및 안티센스 프라이머 R_10a.a_linker(서열 번호: 9)를 어닐링한 DNA의 3자를 라이게이션하여, Eevee-PKA-116을 작성했다. 이러한 염기 서열(서열 번호: 16) 및 예측되는 아미노산 서열(서열 번호: 17)을 설명한다.
nt 1-714: 오완해파리(Aequorea)의 YFP(YPet)
nt 715-720: 링커(Leu-Glu)
nt 721-1143: 효모의 Rad53 유전자의 FHA1 도메인
nt 1144-1149: 링커(Gly-Thr)
nt 1150-1497: EV116 링커(서열 번호: 18)
nt 1498-1503: 링커(Ser-Gly)
nt 1504-1527: PKA의 기질 서열
nt 1528-1536: 링커(Gly-Gly-Arg)
nt 1537-2247: 오완해파리의 CFP(ECFP)
nt 2248-2253: 링커(Ser-Arg)
nt 2254-2289: 핵외 이행 시그널(NES)
nt 2290-2292: 종지 코돈
(ⅵ) pEevee-PKA-5(3522NES)의 작성
1분자형 FRET 바이오 센서 pEevee-PKA-5는, PCR 등의 공지의 방법을 이용하여 작성했다. 이러한 염기 서열(서열 번호: 19) 및 예측되는 아미노산 서열(서열 번호: 20)을 설명한다.
nt 1-714: 오완해파리(Aequorea)의 YFP(Venus)
nt 715-720: 링커(Leu-Glu)
nt 721-1143: 효모의 Rad53 유전자의 FHA1 도메인
nt 1144-1170: 링커(Gly-Thr-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly )
nt 1171-1194: PKA의 기질 서열
nt 1195-1203: 링커(Gly-Gly-Arg)
nt 1204-1920: 오완해파리의 CFP(ECFP)
nt 1921-1926: 링커(Ser-Arg)
nt 1927-1962: 핵외 이행 시그널(NES)
nt 1963-1965: 종지 코돈
(ⅶ) pEevee-PKA-180(3597NES)의 작성
pEevee-PKA-116을 제한 효소 EcoRI와 Asp718I로 절단하고, 사이즈가 큰 쪽의 단편을 벡터로서 조정했다. 이 pEevee-PKA-116 단편을 EcoRI와 Aor13HI로 절단한 링커를 함유하는 부분 및, 센스 프라이머 F_10a.a_linker(서열 번호: 8) 및 안티센스 프라이머 R_10a.a_linker(서열 번호: 9)를 어닐링한 DNA의 3자를 라이게이션하여, Eevee-PKA-180을 작성했다. 또한 Venus는 YPet로 치환했다. 이러한 염기 서열(서열 번호: 21) 및 예측되는 아미노산 서열(서열 번호: 22)을 설명한다.
nt 1-714: 오완해파리(Aequorea)의 YFP(YPet)
nt 715-720: 링커(Leu-Glu)
nt 721-1143: 효모의 Rad53 유전자의 FHA1 도메인
nt 1144-1149: 링커(Gly-Thr)
nt 1150-1689: EV180 링커(서열 번호: 23)
nt 1690-1695: 링커(Ser-Gly)
nt 1696-1719: PKA의 기질 서열
nt 1720-1728: 링커(Gly-Gly-Arg)
nt 1729-2439: 오완해파리의 CFP(ECFP)
nt 2440-2445: 링커(Ser-Arg)
nt 2446-2481: 핵외 이행 시그널(NES)
nt 2482-2484: 종지 코돈
(ⅷ) pEevee-PKA-244(3598NES)의 작성
pEevee-PKA-116을 제한 효소 EcoRI와 Asp718I로 절단하고, 사이즈가 큰 쪽의 단편을 벡터로서 조정했다. 이 pEevee-PKA-116 단편을 EcoRI와 Aor13HI로 절단한 링커를 함유하는 부분 및, 센스 프라이머 F_10a.a_linker(서열 번호: 8) 및 안티센스 프라이머 R_10a.a_linker(서열 번호: 9)를 어닐링한 DNA의 3자를 라이게이션하여, Eevee-PKA-244를 작성했다. 이러한 염기 서열(서열 번호: 24) 및 예측되는 아미노산 서열(서열 번호: 25)을 설명한다.
nt 1-714: 오완해파리(Aequorea)의 YFP(YPet)
nt 715-720: 링커(Leu-Glu)
nt 721-1143: 효모의 Rad53 유전자의 FHA1 도메인
nt 1144-1149: 링커(Gly-Thr)
nt 1150-1881: EV244 링커(서열 번호: 26)
nt 1882-1887: 링커(Ser-Gly)
nt 1888-1911: PKA의 기질 서열
nt 1912-1920: 링커(Gly-Gly-Arg)
nt 1921-2631: 오완해파리의 CFP(ECFP)
nt 2632-2637: 링커(Ser-Arg)
nt 2638-2673: 핵외 이행 시그널(NES)
nt 2674-2676: 종지 코돈
(2) 포유류 세포에서의 EV 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서(Eevee-PKA)의 발현과 타임 랩스 형광 현미경에 의한 해석
여기에서는, 다양한 길이의 EV 링커를 갖는 PKA의 바이오 센서를 Eevee-PKA, 그 포유 세포 발현 벡터를 pEevee-PKA라고 총칭한다. 포유 세포 발현 벡터로서는, pCAGGS〔Niwa, H., K. Yamamura, and J. Miyazaki. 1991. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108:193-200.〕를 최적으로 사용할 수 있다. 자궁 경부암 유래 HeLa 세포는 10％ 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 배지(培地)(INVITROGEN사제)로 배양했다. 당해 HeLa 세포에 상기 (1)에서 얻어진 pEevee-PKA를 293fectin(INVITROGEN사제)을 사용하여, 당해 시약에 첨부된 프로토콜에 따라 트랜스펙트했다. 트랜스펙트 후의 HeLa 세포를 10％ 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 배지(INVITROGEN사제)로 배양하고, Eevee-PKA 단백질을 발현시켰다. 트랜스펙션의 24시간 후에, 배양 세포를 타임 랩스 형광 현미경에 의한 관찰에 제공했다.
이러한 현미경은, 회전식 형광 여기 필터 장치 및 회전식 형광 발광 필터 장치(LUDL electronic사제)를 구비하고, 고감도 냉각 CCD 카메라(니혼로퍼사제, CoolSNAP-HQ)를 더 구비한, 제논 광원을 갖는 도립형 형광 현미경(올림푸스사제, IX81)이며, 관찰시에는, 당해 현미경의 제어 및 관찰 결과의 해석을 니혼몰레큘러디바이스사제 메타 몰프 화상 해석 소프트에 의해 행하는 시스템을 사용했다. 형광 여기 필터, 형광 발광 필터, 다이클로익 미러는 오메가사에서 구입했다.
상기 배양 세포에 440㎚의 여기광을 조사하고, 480㎚의 CFP 도너의 형광 파장에서의 화상을 CCD 카메라에 의해 촬영하고, 이어서, 530㎚의 YFP 억셉터의 형광 파장에서의 화상을 촬영했다. 양 화상 데이터를 바탕으로 양자의 형광 강도의 비를 구함으로써 각 측정점에서의 FRET 효율의 지표로 했다.
PKA의 활성화제인 1mM의 디부티릴 cAMP를 첨가하여, 자극 전의 FRET 효율과 비교함으로써 Eevee-PKA의 게인을 알 수 있다. 도 4에 나타내는 바와 같이 PKA의 활성화에 의해 변화하는 게인은, 52아미노산 이상의 길이의 EV 링커를 사용함으로써 현저하게 증가함을 알 수 있다.
또한, YFP 도너 단백질을, FRET에 최적화한 것, 예를 들면 YPet로 함으로써, 그 효과는 더 현저해진다(도 6). 그러나, 그 효과는 116아미노산으로 거의 포화해 있으며, 그 이상 길게 해도 현저한 효과는 없다.
이 게인의 증대의 원인을 조사하기 위해, 기저 상태에서의 형광 프로필을 측정했다(도 7a, b 및 c). EV 링커가 길어짐에 따라, 기저 상태에서의 YFP 도너 단백질의 형광이 감소함을 알 수 있었다. 즉, EV 링커는, 기저 상태에서의 FRET를 저감시킴으로써 높은 게인을 가져오고 있음을 알 수 있었다. 이 효과는 244아미노산까지 계속되었다.
(3) Eevee-PKA의 인산화 레벨의 면역블로팅에 의한 해석
상기와 같이, Eevee-PKA를 HeLa 세포에 발현시켜, 24시간 후에, 1mM의 디부티릴 cAMP 및 50nM 칼리큘린으로 처리한 뒤에, 공지의 방법으로 세포를 가용화하고, SDS-PAGE에 의해 분리했다. 또한, PhosTag(PhosTag 컨소시엄) 50μM를 함유하는 폴리아크릴아미드 6％ 겔을 단백질의 분리에 사용했다. PVDF 멤브레인(밀리포아사제)에 전사(轉寫) 후, anti-GFP 항체(자가제)와 반응시켜, 계속해서, IRDye800CW 표지 항토끼 항체(LI-COR사제)에서 Eevee-PKA 단백질을 검출했다. 결합한 형광 표지 항체는 오디세이 형광 아날라이저(LI-COR사제)로 정량했다. 도 8a 및 도 8b에 나타내는 바와 같이 EV 링커는, 기저 상태에서의 인산화 레벨을 현저히 저감시키고 있음을 알 수 있다. 즉, 리간드 도메인은 일반적으로, 센서 도메인에 결합함으로써, 활성화 상태의 센서 도메인이 기저 상태로 돌아가는 것을 저해하는 효과가 있지만, EV 링커는 이 효과를 저하시키고, 그것에 의해 기저 상태의 FRET를 저하시켜, 이것이 게인의 증대를 가져오고 있음이 명확해졌다.
(실시예 2)
Eevee-Akt에 의한 세린트레오닌 인산화 효소 Akt의 효소 활성의 측정
(1) 세린트레오닌 인산화 효소 Akt의 효소 활성을 측정하기 위한, EV 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서를 코드하는 유전자의 작성
Eevee-Akt-84(3547NES) 및 Eevee-Akt-116(3548NES)의 PKA 기질 서열 부위를, Akt의 인산화에 적합한 아미노산 서열로 치환한 유전자를, 합성 프라이머 등을 이용하여 작성했다. 상기 Eevee-PKA에 이 서열을 삽입하며, 또한, 아미노 말단에 Akt의 PH 도메인을 삽입함으로써 작성한 유전자 Eevee-Akt-84 및 Eevee-Akt-116의 염기 서열(서열 번호: 27, 29) 및 예측되는 아미노산 서열(서열 번호: 28, 30)을 제시한다. 또한, 그 구조를 도 9a 및 b에 나타낸다.
Eevee-Akt-84(3547NES)
nt 1-453: Akt 단백질의 AH 도메인
nt 454-462: 링커(Glu-Phe-Gly)
nt 463-1176: 오완해파리(Aequorea)의 YFP(YPet)
nt 1177-1182: 링커(Leu-Glu)
nt 1183-1605: 효모의 Rad53 유전자의 FHA1 도메인
nt 1606-1611: 링커(Gly-Thr)
nt 1612-1863: EV84 링커
nt 1864-1869: 링커(Ser-Gly)
nt 1870-1902: PKA의 기질 서열
nt 1903-1911: 링커(Gly-Gly-Arg)
nt 1912-2622: 오완해파리의 CFP(ECFP)
nt 2623-2628: 링커(Ser-Arg)
nt 2629-2664: 핵외 이행 시그널(NES)
nt 2665-2667: 종지 코돈
Eevee-Akt-116(3548NES)
nt 1-453: Akt 단백질의 AH 도메인
nt 454-462: 링커(Glu-Phe-Gly)
nt 463-1176: 오완해파리(Aequorea)의 YFP(YPet)
nt 1177-1182: 링커(Leu-Glu)
nt 1183-1605: 효모의 Rad53 유전자의 FHA1 도메인
nt 1606-1611: 링커(Gly-Thr)
nt 1612-1959: EV116 링커
nt 1864-1965: 링커(Ser-Gly)
nt 1870-1998: PKA의 기질 서열
nt 1903-2007: 링커(Gly-Gly-Arg)
nt 1912-2718: 오완해파리의 CFP(ECFP)
nt 2623-2724: 링커(Ser-Arg)
nt 2629-2760: 핵외 이행 시그널(NES)
nt 2665-2763: 종지 코돈
(2) 포유류 세포에서의 EV 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서(Eevee-Akt)의 발현과 타임 랩스 형광 현미경에 의한 해석
실시예 1-(2)에 기재된 방법에 의해 해석했다. 단, 세포는 COS7 세포를 사용했다. 도 10에 나타내는 바와 같이 116아미노산의 EV 링커는 현저히 기저 상태의 현저한 저하를 가져온다.
(실시예 3)
Eevee-ERK에 의한 ERK의 효소 활성의 측정
(1) ERK의 효소 활성을 측정하기 위한, EV 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서 Eevee-ERK(3550NES)를 코드하는 유전자의 작성
(i) Eevee-PKA-116의 기질 서열 부위 및 인산화 펩티드 인식 서열을 ERK의 기질 서열로 치환한 플라스미드를, PCR 및 합성 프라이머를 이용하여 작성했다. 작성한 플라스미드를 Eevee-ERK로 명명했다. 이러한 염기 서열(서열 번호: 31) 및 예측되는 아미노산 서열(서열 번호: 32)을 설명한다:
nt 1-714: 오완해파리(Aequorea)의 YFP(YPet)
nt 715-720: 링커(Leu-Glu)
nt 721-882: Pin1 유전자의 WW 도메인
nt 1144-888: 링커(Gly-Thr)
nt 1150-1236: EV116 링커
nt 1498-1242: 링커(Ser-Gly)
nt 1504-1272: ERK의 기질 서열
nt 1528-1281: 링커(Gly-Gly-Arg)
nt 1537-1992: 오완해파리의 CFP(ECFP)
nt 2248-2004: 링커(Gly-Arg-Ser-Arg)
nt 2254-2040: 핵외 이행 시그널(NES)
nt 2290-2043: 종지 코돈
(ⅱ) 또한, ERK의 기질에 특유의 도킹(docking) 서열을 부가한 벡터도 마찬가지로 작성하고, Eevee-ERK-DS(3560NES)로 명명했다. 이러한 염기 서열(서열 번호: 33) 및 예측되는 아미노산 서열(서열 번호: 34)을 설명한다:
nt 1-714: 오완해파리(Aequorea)의 YFP(YPet)
nt 715-720: 링커(Leu-Glu)
nt 721-882: Pin1 유전자의 WW 도메인
nt 883-888: 링커(Gly-Thr)
nt 889-1236: EV116 링커
nt 1237-1242: 링커(Ser-Gly)
nt 1243-1272: ERK의 기질 서열
nt 1273-1284: 링커(Ala-Lys-Leu-Ser)
nt 1285-1296: 도킹 서열(Phe-Gln-Phe-Pro)
nt 1297-1305: 링커(Gly-Gly-Arg)
nt 1306-2016: 오완해파리의 CFP(ECFP)
nt 2017-2028: 링커(Gly-Arg-Ser-Arg)
nt 2029-2064: 핵외 이행 시그널(NES)
nt 2065-2067: 종지 코돈
(2) 포유류 세포에서의 EV 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서(Eevee-ERK)의 발현과 타임 랩스 형광 현미경에 의한 해석
실시예 1-(2)에 기재된 방법에 의해 해석했다. 즉, HeLa 세포에 Evee-ERK를 발현시켜, EGF로 자극했다. 도 11a, b, c 및 d에 나타내는 바와 같이 EV 링커를 갖는 바이오 센서(3560NES)는, Gly 링커를 함유하는 바이오 센서(EKAR-1667nes)보다 넓은 게인을 갖는다. 이 효과 중 하나는, 기저 상태에서의 FRET의 낮음에 기인하고 있다.
(실시예4)
EV 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서 Picchu-734에 의한 티로신 키나아제 활성의 측정
(1) 티로신 키나아제 활성을 측정하기 위한, EV 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서 Picchu-734의 작성
(i) Eevee-PKA-116(3536NES)의 XhoI 및 Asp718I로 절단한 것에 CrkII 단백질의 SH2 도메인을 함유하는 영역을 PCR로 증폭하여 삽입했다. 또한, 기질 서열 부위를 치환하고, Picchu-734의 유전자를 작성했다. 이러한 염기 서열(서열 번호: 35) 및 예측되는 아미노산 서열(서열 번호: 36)을 설명한다:
nt 1-714: 오완해파리(Aequorea)의 YFP(YPet)
nt 715-720: 링커(Leu-Glu)
nt 721-1332: CRKII 유전자의 SH2 도메인
nt 883-1338: 링커(Gly-Thr)
nt 889-1686: EV116 링커
nt 1237-1692: 링커(Ser-Gly)
nt 1243-1719: CRKII의 티로신 인산화 기질 서열
nt 1273-1728: 링커(Ala-Lys-Leu-Ser)
nt 1306-2439: 오완해파리의 CFP(ECFP)
nt 2017-2451: 링커(Gly-Arg-Ser-Arg)
nt 2029-2487: 핵외 이행 시그널(NES)
nt 2065-2490: 종지 코돈
(2) 포유류 세포에서의 티로신 키나아제 활성을 측정하기 위한, EV 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서 Picchu-734의 발현과 타임 랩스 형광 현미경에 의한 해석.
실시예 3-(2)에 기재된 방법에 의해 해석했다. 도 12에 나타내는 바와 같이 EV 링커를 함유하는 Picchu 바이오 센서(Picchu-734)는 이를 함유하지 않는 Picchu 바이오 센서(Picchu-730)〔Kurokawa, K., N. Mochizuki, Y. Ohba, H. Mizuno, A. Miyawaki, and M. Matsuda.2001. A pair of FRET-based probes for tyrosine phosphorylation of the CrkII adaptor protein in vivo. J. Biol. Chem. 276:31305-31310.〕보다 넓은 게인을 가짐을 알 수 있었다.
(실시예 5)
Raichu-Rac1에 의한 Rac1 활성의 측정
(1) Rac1 활성을 측정하기 위한, EV 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서 Raichu-Rac1(2246X)의 작성
(i) Rac1 활성을 측정하는 1분자형 FRET 바이오 센서 Raichu-Rac1(2241X)은, PCR 등을 사용하여, 기지의 Raichu-Rac1(1011X)〔비특허문헌 5〕을 바탕으로 작성했다. 이러한 염기 서열(서열 번호: 37) 및 예측되는 아미노산 서열(서열 번호: 38)을 설명한다:
nt 1-714: 오완해파리(Aequorea)의 YFP(YPet)
nt 715-720: 링커(Leu-Glu)
nt 721-969: Pak 단백질의 CRIB 도메인
nt 883-996: 글리신 링커
nt 1237-1527: Rac1
nt 1273-1536: 링커(Arg-Gly-Arg)
nt 1306-2247: 오완해파리의 CFP(Turquoise)
nt 1273-2253: 링커(Ser-Arg)
nt 2017-2313: KRas 단백질의 C말단 도메인
nt 2065-2316: 종지 코돈
(ⅱ) Rac1 활성을 측정하는 EV 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서 Raichu-Rac1(2246X)은, Raichu-Rac1(2241X)을 바탕으로, 링커를 교체함으로써 작성했다. 이러한 염기 서열(서열 번호: 39) 및 예측되는 아미노산 서열(서열 번호: 40)을 설명한다:
nt 1-714: 오완해파리(Aequorea)의 YFP(YPet)
nt 715-720: 링커(Leu-Glu)
nt 721-969: Pak 단백질의 CRIB 도메인
nt 970-1332: EV116 링커
nt 1333-1860: Rac1
nt 1861-1869: 링커(Arg-Gly-Arg)
nt 1870-2580: 오완해파리의 CFP(Turquoise)
nt 2581-2586: 링커(Ser-Arg)
nt 2587-2646: KRas 단백질의 C말단 도메인
nt 2647-2649: 종지 코돈
(2) 포유류 세포에서의 Rac1 활성을 측정하기 위한, EV 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서를 Raichu-Rac1의 발현과 타임 랩스 형광 현미경에 의한 해석.
실시예 3-(2)에 기재된 방법에 의해 해석했다. 도 13a 및 도 13b에 나타내는 바와 같이 EV 링커를 갖는 Raichu 바이오 센서(Raichu-2246X)는 통상의 링커를 갖는 Raichu 바이오 센서(Raichu-2241X)보다도 기저 상태에서의 FRET가 낮고, EGF 자극 하에 관찰되는 상승, 즉 감도가 크게 상승하고 있다.
(3) Raichu-Rac1(2246X)을 안정 발현하는 세포주의 수립(樹立).
Raichu-Rac1(2246X)의 유전자를 pPB 플라스미드에 삽입했다. 이 플라스미드와, 트랜스포제이스 발현 벡터(pCMV-mPBase)〔Yusa, K., R. Rad, J. Takeda, and A. Bradley. 2009. Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon. Nat. Methods 6:363-369.〕와 동시에 C6 세포에 트랜스펙트하고, 이틀 후에 블라스티시딘(Blasticidine)을 10μg／ml의 농도로 첨가하여, 2주간 배양을 계속했다. 그 후, 96웰 배양 접시에서 클로닝을 행했다. 그 결과, 바이오 센서를 안정적으로 발현하는 배양 세포주의 수립에 성공했다. 이 세포주를 사용함으로써, 장기간에 걸쳐 Rac1의 활성을 모니터할 수 있었다(도 14a, b, c 및 d).
(실시예 6)
Raichu-Cdc42(2253X)에 의한 Cdc42 활성의 측정
(1) Cdc42 활성을 측정하기 위한, EV 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서 Raichu-Cdc42(2253X)의 작성
(i) Cdc42 활성을 측정하는 1분자형 FRET 바이오 센서 Raichu-Cdc42(2253X)는, PCR 등을 사용하여, 기지의 Raichu-Cdc42(1054X)를 바탕으로 작성했다. 작성한 유전자 Raichu-Cdc42(2253X)의 염기 서열(서열 번호: 41) 및 예측되는 아미노산 서열(서열 번호: 42)을 제시한다.
nt 1-714: 오완해파리(Aequorea)의 YFP(YPet)
nt 715-720: 링커(Leu-Glu)
nt 721-969: Pak 단백질의 CRIB 도메인
nt 970-1332: EV116 링커
nt 1333-1857: Cdc42
nt 1858-1866: 링커(Arg-Gly-Arg)
nt 1867-2577: 오완해파리의 CFP(Turquoise)
nt 2578-2583: 링커(Ser-Arg)
nt 2584-2643: KRas 단백질의 C말단 도메인
nt 2644-2646: 종지 코돈
(2) 포유류 세포에서의 Cdc42 활성을 측정하기 위한 EV 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서 Raichu-Cdc42의 발현과 타임 랩스 형광 현미경에 의한 해석.
실시예 3-(2)에 기재된 방법에 의해 해석했다. 도 15a 내지 도 15c에 나타내는 바와 같이 이 바이오 센서도 기저 상태에서의 낮은 FRET가 관찰되어, 지금까지 곤란했던 EGF 자극 의존성의 Cdc42의 활성화를 고감도로 검출할 수 있게 되었다.
(실시예 8)
Raichu-HRas(3705X)에 의한 HRas 활성의 측정
(1) HRas 활성을 측정하기 위한, EV 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서 Raichu-HRas(3705X)의 작성
(i) HRas 활성을 측정하는 1분자형 FRET 바이오 센서 Raichu-HRas(3705X)는, PCR 등을 사용하여, 기지의 Raichu-HRas〔Mochizuki, N., S. Yamashita, K. Kurokawa, Y. Ohba, T. Nagai, A. Miyawaki, and M. Matsuda. 2001. Spacio-temporal images of growth factor-induced activation of Ras and Rap1. Nature 411:1065-1068.〕를 바탕으로 작성했다. 작성한 유전자 Raichu-HRas(3705X)의 염기 서열(서열 번호: 43) 및 예측되는 아미노산 서열(서열 번호: 44)을 제시한다.
nt 1-714: 오완해파리(Aequorea)의 YFP(YPet)
nt 715-720: 링커(Leu-Glu)
nt 721-1236: HRas 단백질
nt 1237-1602: EV116 링커
nt 1603-1845: Raf 단백질의 RBD 도메인
nt 1846-1854: 링커(Gly-Gly-Arg)
nt 1855-2565: 오완해파리의 CFP(Turquoise)
nt 2566-2571: 링커(Ser-Arg)
nt 2584-2631: KRas 단백질의 C말단 도메인
nt 2632-2634: 종지 코돈
(2) 포유류 세포에서의 HRas 활성을 측정하기 위한 EV 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서 Raichu-HRas의 발현과 타임 랩스 형광 현미경에 의한 해석.
실시예 3-(2)에 기재된 방법에 의해 해석했다. 도 16a 및 b에는 타임 랩스FRET 이미징의 데이터를 나타내고 있다. 프로토타입의 HRas〔Mochizuki, N., S. Yamashita, K. Kurokawa, Y. Ohba, T. Nagai, A. Miyawaki, and M. Matsuda. 2001. Spacio-temporal images of growth factor-induced activation of Ras and Rap1. Nature 411:1065-1068.〕보다 조기에 또한, 강하게 활성화를 검출할 수 있음을 알 수 있다.
(실시예 10)
Eevee-ERK(3560NES) 및 Eevee-PKA(3536NES)를 발현하는 트랜스제닉 마우스의 작성
(1) ERK 및 PKA의 효소 활성을 측정하기 위한, EV 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서 Eevee-ERK(3560NES) 및 Eevee-PKA(3536NES)를 코드하는 유전자의 수정란에의 마이크로인젝션
실시예 1에 기재된 Eevee-PKA(3536NES) 혹은 실시예 3에 기재된 Eevee-ERK(3560NES) 유전자를 함유하는 포유 세포 발현 플라스미드를, 트랜스포존 인식 서열을 갖는 플라스미드 pT2A에 삽입했다. 이 플라스미드와, Tol2 트랜스포존을 이미 보고된 바와 같이 마이크로인젝션했다〔Sumiyama, K., K. Kawakami, and K. Yagita. 2010. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics 95:306-311.〕.
(2) 바이오 센서를 발현하는 트랜스제닉 마우스의 스크리닝
태어난 마우스는, 420㎚의 LED로 조사하고, 470㎚의 단파장 커트 필터를 사용하여, 컬러 디지털 카메라로 촬영하여 녹색 형광을 확인함으로써 용이하게 도입이 일어난 마우스를 동정(同定)할 수 있다. 또한, 태아의 시상단의 FRET 화상을 실시예 1에 기재된 형광 현미경으로 촬영함으로써, ERK 혹은 PKA 활성의 공간 분포를 조사할 수도 있다(도 17).
(실시예 11)
Eevee-ERK(3560NES)를 발현하는 세포주를 사용한 약제 감수성 시험
(1) ERK의 효소 활성을 측정하기 위한, EV 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서 Eevee-ERK(3560NES)를 코드하는 유전자를 안정 발현하는 세포주의 수립
실시예 3에 기재된 Eevee-ERK(3560NES) 유전자를 함유하는 포유 세포 발현 플라스미드를, 트랜스포존 인식 서열을 갖는 플라스미드에 삽입했다. 이 플라스미드와, 트랜스포존 발현 벡터를 이미 보고된 바와 같이 트랜스펙션하고, 블라스티시딘으로 바이오 센서 발현 세포주를 선별했다〔Yusa, K., R. Rad, J. Takeda, and A. Bradley. 2009. Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon. Nat. Methods 6(5):363-369〕.
(2) 바이오 센서를 안정 발현하는 세포주에 의한 FRET 측정을 행했다.
배양 세포주를 96웰 배양 접시에 심고, 단계 희석한 저해제를 넣은 뒤에, 25ng／ml의 EGF로 자극했다. 30분 후에, 실시예 3에 기재된 대로 ERK의 활성을 측정했다(도 18a∼도 18h). 30개 이상의 세포에 대해서, ERK의 활성을 측정하여, 평균한 것을 그래프화했다. 사용한 저해제는 EGF 수용체 저해제(AG1478), MEK 저해제(PD15035, PD184351), BRAF의 저해제(PLX4720), 포스파티딜이노시톨3인산 키나아제의 저해제(LY294002), RSK의 저해제(BI-D1870), JNK의 저해제(JNK inhibitor Ⅷ)이다. 결과는 EGF 의존성의 ERK 활성화가, HeLa 세포에서는 EGF 수용체(AG1478) 및 MEK의 저해제(PD153035, PD184352)에 의해 효과적으로 억제되는 것을 나타내고 있다. EGF 의존성의 ERK 활성화가, 이들 저해제에 의해 농도 의존성에 저해되는 것이, 생세포를 사용하여 극히 용이하게 측정할 수 있었다.
(실시예 12)
Eevee-PKA(3536NES)를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 사용한 약제 감수성 시험
(1) Eevee-PKA(3536NES)를 발현하는 트랜스제닉 마우스의 소장(小腸) 이미징
실시예 10에서 작성한 Eevee-PKA(3536NES)를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 이소프렌으로 마취하고, 소장을 올림푸스사제 도립형 2광자 현미경 IX81／FV1000으로 타임 랩스 촬영했다. Spectra Physics사의 티타늄 사파이어 레이저 Mai Tai DeepSee HP를 사용하여, 세포를 840㎚로 여기하고, CFP의 형광을 BA460-500(올림푸스) 형광 필터, YFP의 형광을 BA520-560(올림푸스)으로 취득하여, 실시예 3에 기재된 바와 같이 FRET 화상을 작성했다.
(2) 태어난 마우스에서의 약제 효과의 가시화
마우스에게 포스포디에스테라제의 저해제인 테오필린 및 환상 아데노신3인산의 아날로그인 액토신을 각각 정주하고, PKA의 활성을 측정했다. 도 19 및 도 20에 나타내는 바와 같이 근간 신경 세포, 장관 평활근, 혈관 평활근의 각각에 있어서의 PKA의 활성 변화를 리얼 타임으로 가시화할 수 있다.
(실시예 13)
링커의 길이를 길게 하면, 프로테아제에 의한 분해가 일어나기 쉬워지는 것이 염려된다. 그래서, 링커로부터 글리신을 저감하여, 알파 헬릭스를 형성하기 쉬운 알라닌을 증가시킨 링커인, EV3x8 및 EV6x4를 작성하여, 게인을 조사했다.
(1) (i) Eevee-PKA-3x8(3676NES)의 작성
실시예 1-(1) (ⅲ)과 같이, Eevee-PKA-20의 포유 세포 발현 벡터 pEevee-PKA-20을 제한 효소 Asp718I와 Aor13HI로 절단하고, 사이즈가 큰 쪽의 단편을 벡터로서 조정했다. EV3x8 링커(서열 번호: 45)에 대응하는 DNA에 제한 효소 Asp718I와 Aor13HI를 양단에 부가한 DNA는 합성했다. 이 DNA를 Asp718I와 Aor13HI로 절단한 것을 인서트로서 사용했다. 인서트와 벡터를 라이게이션하여, pEevee-PKA-3x8을 작성했다. 이러한 염기 서열(서열 번호: 47) 및 예측되는 아미노산 서열(서열 번호: 48)을 설명한다:
nt 1-714: 오완해파리(Aequorea)의 YFP(YPet)
nt 715-720: 링커(Leu-Glu)
nt 721-1143: 효모의 Rad53 유전자의 FHA1 도메인
nt 1144-1149: 링커(Gly-Thr)
nt 1150-1551: EV3x8 링커(서열 번호: 45)
nt 1552-1557: 링커(Ser-Gly)
nt 1558-1581: PKA의 기질 서열
nt 1582-1590: 링커(Gly-Gly-Arg)
nt 1591-2307: 오완해파리의 ECFP
nt 2308-2313: 링커(Ser-Arg)
nt 2314-2349: 핵외 이행 시그널(NES)
nt 2350-2352: 종지 코돈
(1) (ⅱ) Eevee-PKA-6x4(3677NES)의 작성
Eevee-PKA-20의 포유 세포 발현 벡터 pEevee-PKA-20을 제한 효소 Asp718I와 Aor13HI로 절단하고, 사이즈가 큰 쪽의 단편을 벡터로서 조정했다. EV6x4 링커(서열 번호: 46)에 대응하는 DNA에 제한 효소 Asp718I와 Aor13HI를 양단에 부가한 DNA는 합성했다. 이 DNA를 Asp718I와 Aor13HI로 절단한 것을 인서트로서 사용했다. 인서트와 벡터를 라이게이션하여, pEevee-PKA-6x4를 작성했다. 이러한 염기 서열(서열 번호: 49) 및 예측되는 아미노산 서열(서열 번호: 50)을 설명한다:
nt 1-714: 오완해파리(Aequorea)의 YFP(YPet)
nt 715-720: 링커(Leu-Glu)
nt 721-1143: 효모의 Rad53 유전자의 FHA1 도메인
nt 1144-1149: 링커(Gly-Thr)
nt 1150-1521: EV6x4 링커(서열 번호: 46)
nt 1522-1527: 링커(Ser-Gly)
nt 1528-1551: PKA의 기질 서열
nt 1552-1560: 링커(Gly-Gly-Arg)
nt 1561-2277: 오완해파리의 ECFP
nt 2278-2283: 링커(Ser-Arg)
nt 2284-2319: 핵외 이행 시그널(NES)
nt 2320-2322: 종지 코돈
(2) 실시예 1과 같이 게인을 조사한 바, EV3x8 및 EV6x4 모두, 116아미노산과 필적하는 게인을 가짐을 알 수 있었다(도 21).
본 발명에 의하면, 비침습적인 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 저분자량 GTP 결합 단백질의 활성 등의 측정을 가능하게 하는 EV 링커 및 당해 EV 링커를 함유하는 1분자형 FRET 바이오 센서; 당해 EV 링커 또는 바이오 센서를 코드하는 유전자; 당해 유전자를 함유하는 발현 벡터; 상기 바이오 센서를 발현하고, 비침습적인 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 저분자량 GTP 결합 단백질의 활성의 측정에 유용한 상기 발현 벡터를 보유하는 형질 전환된 세포 및 트랜스제닉 비인간 동물; 상기 바이오 센서를 사용하는 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 저분자량 GTP 결합 단백질의 활성을 측정하는 방법, 및 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 저분자량 GTP 결합 단백질의 활성 조절 물질의 스크리닝 방법이 제공된다.
SEQUENCE LISTING <110> Kyoto University Matsuda, Michiyuki <120> LINKER FOR UNIMOLECULAR FRET BIOSENSOR BASED ON PRINCIPLE OF FLUORESCENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER <130> N-ST016-11P <150> JP2010-215738 <151> 2010-09-27 <160> 50 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2208 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FRET biosensor for PKA <400> 1 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagct tctatgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgggcta cggcctgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca ccgccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg ccaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcggcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagct accagtccgc cctgttcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcctgaccgc cgccgggatc actgagggca tgaacgagct gtacctcgag 720 aagttttctc aagaacagat cggcgaaaac attgtgtgca gggtcatttg taccacgggt 780 caaattccca tccgagattt gtcagctgat atttcacaag tgcttaagga aaaacgatcc 840 ataaagaaag tttggacatt tggtagaaac ccagcctgtg actatcattt aggaaacatt 900 tcaagactgt caaataagca tttccaaata ctactaggag aagacggtaa ccttttattg 960 aatgacattt ccactaatgg gacctggtta aatgggcaaa aagtcgagaa gaacagcaat 1020 cagttactgt cccaaggtga tgaaataacc gttggtgtag gcgtggaatc agatatttta 1080 tctctggtca ttttcataaa cgacaaattt aagcagtgcc tggagcagaa caaagttgat 1140 cgcggtaccg ggcttgtgtc tagaggcgga ggtggtggag gaggtggagg tggtggaggt 1200 ggaggtggag gtggtggcgg tggtggagga ggaggagcta gaggcggagg tggtggagga 1260 ggtggaggtg gtggaggtgg aggtggaggt ggtggcggtg gtggaggagg aggagctagc 1320 ggcggaggtg gtggaggagg tggaggtggt ggaggtggag gtggaggtgg tggcggtggt 1380 ggaggaggag gaatggctga ccaactgtcc ggattgaggc gcgcgacgct ggttgacggc 1440 ggccgcatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag 1500 ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc 1560 acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg 1620 cccaccctcg tgaccaccct gacctggggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac 1680 atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc 1740 atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 1800 accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 1860 gggcacaagc tggagtacaa ctacatcagc cacaacgtct atatcaccgc cgacaagcag 1920 aagaacggca tcaaggccaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 1980 ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac 2040 aaccactact tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac 2100 atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgggc 2160 cgctctagac tgcagctgcc tcctctggaa cgcctgactc tggattaa 2208 <210> 2 <211> 735 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FRET biosensor of PKA <400> 2 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Leu Leu 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr 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Gly Gly Gly Ala Arg Gly Gly 405 410 415 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 420 425 430 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 435 440 445 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Met Ala Asp Gln Leu Ser Gly Leu Arg Arg Ala Thr Leu Val Asp Gly 465 470 475 480 Gly Arg Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro 485 490 495 Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val 500 505 510 Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys 515 520 525 Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val 530 535 540 Thr Thr Leu Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His 545 550 555 560 Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val 565 570 575 Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg 580 585 590 Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu 595 600 605 Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn 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Leu 740 745 750 Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Gly 755 760 765 Arg Ser Arg Leu Gln Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu Asp 770 775 780 <210> 49 <211> 2322 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3677NES <400> 49 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagct tctatgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgggcta cggcctgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca ccgccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg ccaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcggcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagct accagtccgc cctgttcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcctgaccgc cgccgggatc actgagggca tgaacgagct gtacctcgag 720 aagttttctc aagaacagat cggcgaaaac attgtgtgca gggtcatttg taccacgggt 780 caaattccca tccgagattt gtcagctgat atttcacaag tgcttaagga aaaacgatcc 840 ataaagaaag tttggacatt tggtagaaac ccagcctgtg actatcattt aggaaacatt 900 tcaagactgt caaataagca tttccaaata ctactaggag aagacggtaa ccttttattg 960 aatgacattt ccactaatgg gacctggtta aatgggcaaa aagtcgagaa gaacagcaat 1020 cagttactgt cccaaggtga tgaaataacc gttggtgtag gcgtggaatc agatatttta 1080 tctctggtca ttttcataaa cgacaaattt aagcagtgcc tggagcagaa caaagttgat 1140 cgcggtaccg aagccgcagc aagggaagca gccgctcggg aagccgccgc tcgggaggca 1200 gcagcacggg aagcagcagc cagagaagcc gccgcacgag gaggagaggc agctgcacgg 1260 gaagcagctg caagagaggc cgctgcaagg gaagcagctg cacgcgaggc agctgcacga 1320 gaagcagctg cacggggagg cgaagcagct gcaagagaag cagctgcaag ggaggcagct 1380 gcacgcgaag cagctgcacg agaggctgcc gcaagggaag ctgccgctcg cgggggcgag 1440 gccgccgcca gagaggccgc cgccagagaa gcagcagcca gagcagcaag agaagccgca 1500 gcacgggaag cagcagcaag gtccggattg aggcgcgcga cgctggttga cggcggccgc 1560 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 1620 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 1680 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 1740 ctcgtgacca ccctgacctg gggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 1800 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 1860 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 1920 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 1980 aagctggagt acaactacat cagccacaac gtctatatca ccgccgacaa gcagaagaac 2040 ggcatcaagg ccaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 2100 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 2160 tacttgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 2220 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gggccgctct 2280 agactgcagc tgcctcctct ggaacgcctg actctggatt aa 2322 <210> 50 <211> 773 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3677NES <400> 50 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Leu Leu 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Phe Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Leu Thr Ala Ala Gly Ile Thr Glu Gly Met Asn Glu Leu Tyr Leu Glu 225 230 235 240 Lys Phe Ser Gln Glu Gln Ile Gly Glu Asn Ile Val Cys Arg Val Ile 245 250 255 Cys Thr Thr Gly Gln Ile Pro Ile Arg Asp Leu Ser Ala Asp Ile Ser 260 265 270 Gln Val Leu Lys Glu Lys Arg Ser Ile Lys Lys Val Trp Thr Phe Gly 275 280 285 Arg Asn Pro Ala Cys Asp Tyr His Leu Gly Asn Ile Ser Arg Leu Ser 290 295 300 Asn Lys His Phe Gln Ile Leu Leu Gly Glu Asp Gly Asn Leu Leu Leu 305 310 315 320 Asn Asp Ile Ser Thr Asn Gly Thr Trp Leu Asn Gly Gln Lys Val Glu 325 330 335 Lys Asn Ser Asn Gln Leu Leu Ser Gln Gly Asp Glu Ile Thr Val Gly 340 345 350 Val Gly Val Glu Ser Asp Ile Leu Ser Leu Val Ile Phe Ile Asn Asp 355 360 365 Lys Phe Lys Gln Cys Leu Glu Gln Asn Lys Val Asp Arg Gly Thr Glu 370 375 380 Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala 385 390 395 400 Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Glu 405 410 415 Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala 420 425 430 Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Glu 435 440 445 Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala 450 455 460 Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Glu 465 470 475 480 Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Ala Ala 485 490 495 Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Ser Gly Leu Arg Arg 500 505 510 Ala Thr Leu Val Asp Gly Gly Arg Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu 515 520 525 Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn 530 535 540 Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr 545 550 555 560 Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val 565 570 575 Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe 580 585 590 Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala 595 600 605 Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp 610 615 620 Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu 625 630 635 640 Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn 645 650 655 Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Ile Ser His Asn Val Tyr 660 665 670 Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile 675 680 685 Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln 690 695 700 Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His 705 710 715 720 Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg 725 730 735 Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu 740 745 750 Gly Met Asp Glu Leu Gly Arg Ser Arg Leu Gln Leu Pro Pro Leu Glu 755 760 765 Arg Leu Thr Leu Asp 770

Claims (20)

  1. 형광 공명 에너지 이동의 원리에 의거하는 1분자형 FRET 바이오 센서의 링커로서, 52아미노산 잔기 이상 400아미노산 잔기 이하를 함유하는 폴리펩티드로서, 전(全) 아미노산 잔기수의 적어도 45％가 글리신 및 알라닌 중 적어도 어느 하나이며, 알라닌을 전 아미노산 잔기수의 적어도 10％ 함유하는 것을 특징으로 하는 링커.
  2. 제1항에 있어서,
    84아미노산 잔기 이상을 함유하는 폴리펩티드인 링커.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    세린 및 트레오닌 중 적어도 어느 하나를 전 아미노산 잔기수의 적어도 10％ 함유하는 링커.
  4. 제3항에 있어서,
    전 아미노산 잔기수의 적어도 95％가 글리신, 세린, 트레오닌 및 알라닌으로 이루어지고, 글리신을 35 내지 65％, 세린 및 트레오닌 중 적어도 어느 하나를 10 내지 40％, 알라닌을 10 내지 40％ 함유하는 링커.
  5. 제4항에 있어서,
    전 아미노산 서열 중 적어도 95％가 SAGG 및 GGAS 중 어느 하나의 아미노산 서열의 반복으로 이루어지고, SAGG 및 GGAS 중 어느 하나의 아미노산 서열의 반복 단위를 13개 이상 100개 이하 함유하는 것을 특징으로 하는 링커.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    아르기닌 및 글루탐산 중 적어도 어느 하나를 전 아미노산 잔기수의 적어도 10％ 함유하는 링커.
  7. 제6항에 있어서,
    전 아미노산 잔기수의 적어도 95％가 글리신, 아르기닌, 글루탐산 및 알라닌으로 이루어지고, 글리신을 4 내지 30％, 아르기닌을 5 내지 30％, 글루탐산을 5 내지 30％, 및 알라닌을 30 내지 60％ 함유하는 링커.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 링커를 코드하는 것을 특징으로 하는 유전자.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 링커를 코드하는 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  10. 제9항에 기재된 발현 벡터를 보유하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 형질 전환된 세포.
  11. 제9항에 기재된 발현 벡터를 보유하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비인간 동물.
  12. 형광 공명 에너지 이동의 원리에 의거하는 1분자형 FRET 바이오 센서로서, 센서 영역, 리간드 영역, 억셉터 형광 단백질 영역, 도너 형광 단백질 영역, 및 당해 센서 영역과 당해 리간드 영역을 연결하는 링커 영역을 갖는 융합 단백질이며, 당해 링커 영역이, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 링커로 이루어지는 것을 특징으로 하는 1분자형 FRET 바이오 센서.
  13. 당해 도너 형광 단백질이 YPet인 제12항에 기재된 1분자형 FRET 바이오 센서.
  14. 제12항 및 제13항 중 어느 한 항에 기재된 1분자형 FRET 바이오 센서를 코드하는 것을 특징으로 하는 유전자.
  15. 제14항에 기재된 1분자형 FRET 바이오 센서를 코드하는 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  16. 제15항에 기재된 발현 벡터를 보유하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 형질 전환된 세포.
  17. 제15항에 기재된 발현 벡터를 보유하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비인간 동물.
  18. 제12항에 기재된 1분자형 FRET 바이오 센서를 사용하여 FRET를 검출하는 공정을 포함하고, 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 및 저분자량 GTP 결합 단백질 활성 중 어느 하나를 측정하는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
  19. 제16항에 기재된 형질 전환된 세포 또는 제17항에 기재된 트랜스제닉 비인간 동물을 이용하여 FRET를 검출하는 공정을 포함하고, 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 및 저분자량 GTP 결합 단백질 활성 중 어느 하나를 측정하는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
  20. (a) 제16항에 기재된 형질 전환된 세포와 피검 물질을 접촉시키는 공정, 및
    (b) FRET를 검출함으로써 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 및 저분자량 GTP 결합 단백질 활성 중 어느 하나의 변화를 검출하는 공정
    을 포함하는, 세린트레오닌 인산화 효소 활성, 티로신 인산화 효소 활성, 및 저분자량 GTP 결합 단백질 활성 중 어느 하나의 조절 물질의 스크리닝 방법.
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