CN108586620B - 筛选昆虫性信息素受体的配体的传感器分子以及筛选方法 - Google Patents

筛选昆虫性信息素受体的配体的传感器分子以及筛选方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108586620B
CN108586620B CN201810440118.4A CN201810440118A CN108586620B CN 108586620 B CN108586620 B CN 108586620B CN 201810440118 A CN201810440118 A CN 201810440118A CN 108586620 B CN108586620 B CN 108586620B
Authority
CN
China
Prior art keywords
leu
ile
receptor
lys
val
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810440118.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108586620A (zh
Inventor
孙金鹏
陈新
杜继翔
林靖宇
于晓
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Ninglu Technology Co ltd
Shandong University
Original Assignee
Jiangsu Ninglu Technology Co ltd
Shandong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Ninglu Technology Co ltd, Shandong University filed Critical Jiangsu Ninglu Technology Co ltd
Priority to CN201810440118.4A priority Critical patent/CN108586620B/zh
Publication of CN108586620A publication Critical patent/CN108586620A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108586620B publication Critical patent/CN108586620B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5041—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving analysis of members of signalling pathways
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种筛选昆虫性信息素受体的配体的传感器分子以及筛选方法，所述分子包括：信息素受体，所述信息素受体氨基端连接有生物发光共振能量转移供体蛋白，所述信息素受体内部插入生物发光共振能量转移受体蛋白，所述供体蛋白和受体蛋白之间互相作用发出BRET信号。利用本发明提供的方法能够方便、快速地筛选昆虫性信息素，为制备性引诱剂，进行害虫的防治和环境保护提供了新途径。

Description

筛选昆虫性信息素受体的配体的传感器分子以及筛选方法
技术领域
本发明涉及一种筛选昆虫性信息素受体的配体的传感器分子以及筛选方法。
背景技术
信息素（pheromone）又称外激素，是指用于同种生物个体间信息交流的化合物，早年由Karlson 和Butenandt提出，意思是“携带”与“刺激”。利用化学物质进行信息交流是自然界动物的一种古老、有效的交流方式，可见于各种动物，包括哺乳动物、节肢动物等。
昆虫信息素是昆虫用来进行信息交流的化学语言，传递聚集、觅食、交配、警戒、社会等级等各种信息，在同种昆虫中营造了一个合理的“社会秩序”。其中昆虫性信息素是调控昆虫雌雄吸引和交配行为的化合物，其由雌性昆虫分泌产生、作用距离远、引起行为反应快，利用昆虫性信息素的这些特性，人们发明了性诱剂——模拟自然界的昆虫性信息素，通过释放器释放到田间来吸引、诱捕、杀灭雄性害虫，干扰雌雄交配，进而控制害虫的仿生高科技产品。该技术诱杀害虫，不接触植物和农产品，没有农药残留之忧，不会对周围环境造成污染，是现代农业生态防治害虫的首选方法之一。然而，目前对于昆虫性信息素的寻找方法，主要是通过色谱和质谱分析等方法，这些方法需要从昆虫实体提取加工分析等繁琐步骤，因此由于缺乏有效的筛选方法，在某种程度上限制了性信息素的推广应用。此外，利用信息素不只可以无公害地防控农业害虫，在防控传播疾病的害虫（如蚊子）甚至寄生虫，控制传染病等疾病方面有广阔的应用前景。
昆虫嗅觉受体（insect olfactory receptor）是用于接受和传递信息素信号的膜蛋白，位于昆虫触角感受器上的嗅觉神经元，其在昆虫感知化学信息、传递神经信号中发挥关键作用。早在21世纪开始之际，在黑腹果蝇身上发现了第一个嗅觉受体，目前对于昆虫嗅觉受体家族的研究已经进入基因组时代，其家族的许多基因已被发现。昆虫嗅觉受体基因在进化上属于较为古老的基因，受体结构上具有七次跨膜结构域；然而，这种七次跨膜与G蛋白偶联受体（G protein coupled receptor, GPCR）不同，嗅觉受体氨基端位于胞内，而GPCR氨基端位于胞外。此外，嗅觉受体还与基因更为保守的伴侣蛋白（co-receptor）共同组成异源复合体。其中，嗅觉受体起特异性感知气味的作用，伴侣蛋白发挥辅助接受信号和稳定嗅觉受体表达的作用。由于对该复合体的结构解析尚未完成，关于嗅觉受体复合物与配体作用后传递信号的分子机制只存在很多假说模型，但根据这些功能学研究结果，嗅觉受体复合物传递信号可能依赖离子通道和代谢通路两种作用机制；而嗅觉受体对化学信息感知的特异性的机制如今也存在争议，一种说法是通过气味结合蛋白来传递配体给嗅觉受体，另一种说法是用一定浓度的配体直接刺激嗅觉受体也可以产生信号。无论哪一种理论都指出了嗅觉受体在传递化学信号方面发挥关键作用。配体刺激后，神经元随即将信号传递至更高级的神经中枢，进而产生相应行为。
BRET（Bioluninescence resonance energy transfer 生物发光共振能量转移）是在海洋生物（如水母，海肾等）中发现的一种分子间作用，表现为具有酶活性的供体蛋白氧化底物产生激发光，此激发光向受体蛋白 eYFP转移，从而激发 eYFP 产生发射光，产生光的强度与供体蛋白和受体蛋白间的距离呈反比，有效距离范围为10nm以内。BRET技术为一种利用上述原理在活细胞内实时监测两种蛋白质相互作用的方法。此方法将两种目标蛋白分别与生物发光共振能量转移供体蛋白（如Renilla的荧光素酶Rluc）和受体蛋白（如加强型黄色荧光蛋白eYFP）融合表达，当两种目标蛋白产生相互作用时， 距离会小于 10nm，这时加入外源底物（如Coelenterazine h）而使 Rluc 产生激发光，向eYFP转移，从而激发eYFP 产生发射光，通过仪器可检测蛋白质发生作用前后的信号变化。BRET技术是一种研究蛋白质之间相互作用的良好方法，其在探究膜蛋白与下游蛋白的相互作用方面具有显著优势。
如何利用利用生物发光共振能量转移（BRET）技术，来筛选获得更多能作用于昆虫性信息素受体的配体，用于制备绿色农药的生物学方法还未见报道。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种筛选昆虫性信息素受体的配体的传感器分子以及筛选方法，填补现有技术的空白，解决现有技术中筛选昆虫性信息素受体的配体的方法过于复杂的问题。
检测原理：在未加入待测样品时生物发光共振能量转移供体蛋白与生物发光共振能量转移受体蛋白相互作用产生BRET信号（荧光），利用检测工具可以检测到荧光的强度信号。当与信息素受体与之相匹配的配体接触后，相互作用，使得受体的构象发生改变，进而使得供体蛋白和受体蛋白之间距离发生改变，继而使得荧光强度（BRET信号）发生改变。设置待测样品浓度梯度，检测BRET信号变化，若BRET信号呈浓度相关曲线，则待检样品为昆虫性信息素。例如在本发明的实施例中，使用Mithras LB940多功能酶标仪进行检测荧光。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种筛选昆虫性信息素受体的配体的传感器分子，所述分子包括：信息素受体，所述信息素受体氨基端连接有生物发光共振能量转移供体蛋白，所述信息素受体内部插入生物发光共振能量转移受体蛋白，所述供体蛋白和受体蛋白之间互相发出BRET信号。
进一步地，所述信息素受体选自： 豌豆长管蚜气味受体ApisOR5。其氨基酸序列如SQE ID 17所示。其结构简图如图2和3。
SQE ID 17：
Met Gln Arg Ile Asp Thr Ile Asn Met Phe Leu Gln Met Thr Gly Cys ThrAsp Ser Lys Ala Met Leu Tyr Leu Thr Tyr Phe Glu Phe Leu Ile Thr Phe Tyr TyrLeu Ile Ala Thr Tyr Ala Ser Ile Val His Phe Glu Gln Ser Val Thr Ile Gln LeuPhe Ala Leu Leu Cys Met Leu Ile Glu Cys Val Ile Leu Leu Asn Ile Thr Phe ArgLeu Tyr His Lys Asn His Ile Arg Glu Met His Gln Tyr Ser Arg Arg Leu Gly IlePro Asp Ser Tyr Arg Ser Val Ile Asn Val Ile Thr Lys Tyr His Leu Ile Ala SerAsn Ile Phe Val Val Phe Pro Val Thr Tyr Ala Ile Phe Cys Asp Ser Val Arg ValGly Asp Pro Phe Thr Phe Pro Phe Leu Asp Val Leu Pro Met His Thr Asp Asn LeuAla Ile Tyr Ala Cys Lys Tyr Leu Val Tyr Ala Ile Ser Val Tyr Ile Ala His ValGlu Leu Cys Phe Ile Asn Thr Thr Phe Ile Tyr Tyr Val Gly Val Leu Lys His ArgLeu Glu Thr Ile Val Gln Thr Ile Gly Glu Ala Phe Ala Asp Asn Asp Glu Gln LysPhe Lys Tyr Ala Ile Ile Gln His Gln Lys Leu Leu Ser Tyr Phe Asn Thr Met LysIle Val Phe Ser Lys Pro Ile Leu Leu Ser Met Ser Phe Asn Ala Ile Tyr Phe GlyLeu Thr Thr Ser Phe Val Ile Gln Ala Ile Arg Gly Tyr Ile Asn Gln Ala Ile LeuSer Ile Cys Ile Ala Ser Ser Ala Ala Ala Val Ile Asn Ile Thr Ile Tyr Thr PheTyr Gly Ser Glu Leu Met Asp Leu His Asp Lys Ile Leu His Val Leu Phe Asp AsnAla Phe Phe Tyr Val Ser Lys Ser Phe Lys Ser Ser Ile Leu Ile Met Met Thr ArgVal Thr Ile Pro Leu Lys Phe Thr Val Gly Tyr Ile Phe Thr Ile Asn Leu Asn LeuLeu Leu Lys Ile Leu Lys Met Ser Tyr Thr Val Leu Asn Val Leu Leu Ser Ser GluThr Ile Lys Pro His Lys Leu Ser
进一步地，所述生物发光共振能量转移供体蛋白选自 ：海肾荧光素酶 Rluc（氨基酸序列如SQE ID 18所示），所述的生物发光共振能量转移受体蛋白选自：增强型黄色荧光蛋白 eYFP（氨基酸序列如SQE ID 19所示）。
SQE ID 18：
Met Thr Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile Thr GlyPro Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu Asp Ser Phe Ile Asn TyrTyr Asp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val Ile Phe Leu His Gly Asn Ala AlaSer Ser Tyr Leu Trp Arg His Val Val Pro His Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys IleIle Pro Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr ArgLeu Leu Asp His Tyr Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro LysLys Ile Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ala Cys Leu Ala Phe His Tyr Ser TyrGlu His Gln Asp Lys Ile Lys Ala Ile Val His Ala Glu Ser Val Val Asp Val IleGlu Ser Trp Asp Glu Trp Pro Asp Ile Glu Glu Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ser GluGlu Gly Glu Lys Met Val Leu Glu Asn Asn Phe Phe Val Glu Thr Met Leu Pro SerLys Ile Met Arg Lys Leu Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe LysGlu Lys Gly Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile Pro Leu ValLys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg Asn Tyr Asn Ala Tyr Leu ArgAla Ser Asp Asp Leu Pro Lys Met Phe Ile Glu Ser Asp Pro Gly Phe Phe Ser AsnAla Ile Val Glu Gly Ala Lys Lys Phe Pro Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys GlyLeu His Phe Ser Gln Glu Asp Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser PheVal Glu Arg Val Leu Lys Asn Glu Gln
SQE ID 19：
Ala Leu Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile LeuVal Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly GluGly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys LeuPro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe Gly Tyr Gly Leu Lys Cys Phe AlaArg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu GlyTyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg AlaGlu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile AspPhe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser HisAsn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys IleArg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn ThrPro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln SerLys Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe ValThr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
进一步地，所述生物发光共振能量转移受体蛋白在信息素受体的插入部位为跨膜间区。即LOOP环。
进一步地，所述生物发光共振能量转移受体蛋白在信息素受体的插入部位为第89位氨基酸精氨酸后一位和/或第309位氨基酸精氨酸后一位。
本发明的另外一个方面提供了一种重组表达基因序列，所述重组表达基因编码上述分子。
本发明的另外一个方面公开了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有如上所述重组表达基因序列。
本发明的另外一个方面公开了一种细胞，所述细胞内含有如上所述重组表达载体。
进一步地，所述细胞为HEK293细胞。
本发明的另外一个方面公开了一种试剂盒，所述试剂盒包含所述试剂盒包含如上所述的重组表达基因序列、如上所述的重组表达载体，如上所述的细胞中的任意一种或几种。
进一步地，所述试剂盒还包括底物。
优选地，所述底物为Coelenterazine h（肠腔素h）。
本发明的另外一个方面提供了上述分子、重组表达基因，重组表达载体、细胞、试剂盒用于筛选昆虫性信息素受体的配体的用途。
本发明的另外一个方面公开了一种筛选昆虫性信息素受体的配体的方法，所述方法包括：
以已知昆虫性信息素的受体作为靶点，向表达R-R-Y的细胞中加入浓度梯度的待测样品，并检测细胞BRET信号的变化，若BRET信号呈浓度相关性上升，则待测样品为昆虫信息素，所述R-R-Y为在靶点信息素受体氨基端连接生物发光共振能量转移供体蛋白，受体内部插入生物发光共振能量转移受体蛋白。
例如，可以采用已知的豌豆长管蚜气味受体ApisOR5的配体(E)-beta-Farnesene，结构式如图1a； 家蚕嗅觉受体BmorOR3的配体(10E,12Z)-Hexadecadienal, 结构式如图1b。
如上所述，本发明的筛选昆虫性信息素受体的配体的传感器分子以及筛选方法，具有以下有益效果：
本 发 明 运 用 生 物 发 光 共 振 能 量 转 移 (Bioluminescenceresonance energy transfer，BRET) 技术，以豌豆长管蚜气味受体ApisOR5的自身构象变化为药物靶点，应用 BRET 方法，针对表达Rluc-Receptor-YFP（R-R-Y）的细胞系，筛选出使ApisOR5产生特异构象变化的小分子化合物，建立了细胞水平的昆虫信息素筛选模型。进而提供了一种制备诱捕和驱除害虫的绿色农药的方法。 在此方法中，将待测化合物直接加入到此表达受体蛋白的细胞中，观察 BRET 信号是否随化合物浓度的梯度上升而上升。如呈浓度相关曲线上升，说明受体自身的构象变化与化合物有关，可作为初筛阳性结果。本发明中的药物筛选方法不受信号传导机制研究缺乏的影响，准确有效地实现药物筛选。利用该方法能够方便、快速地筛选昆虫信息素。为制备性引诱剂，进行害虫的防治和环境保护提供了新途径。
附图说明
图1a：为已在昆虫性引诱剂中投入使用的信息素结构式：(E)-beta-Farnesene，为豌豆长管蚜气味受体ApisOR5的配体结构。
图1b:为为已在昆虫性引诱剂中投入使用的信息素结构式：(10E,12Z)-Hexadecadienal ，家蚕嗅觉受体BmorOR3的配体结构式。
图2为嗅觉受体——豌豆长管蚜气味受体ApisOR5的结构简图。箭头指示为生物发光共振能量转移受体蛋白增强型黄色荧光蛋白 eYFP在受体内部的插入位置——软件分析模拟得知的细胞膜内的LOOP环即跨膜间区，R89为第89位氨基酸精氨酸，Q206为第206位氨基酸谷氨酰胺，K309为第309位氨基酸赖氨酸。
图3为嗅觉受体——豌豆长管蚜气味受体ApisOR5的氨基酸分布蛇形图，其中：标记为eYFP在受体内部的插入位置前的氨基酸，即第89位氨基酸精氨酸、第206位氨基酸谷氨酰胺、第309位氨基酸赖氨酸。
图4为氨基端连接Rluc的豌豆长管蚜气味受体ApisOR5与氨基端连接Rluc的家蚕嗅觉受体BmorOR3的在HEK293A细胞中表达的发光情况。以氨基端连接Rluc的人1型血管紧张素受体作为对照。
图5为发现了激活氨基端连接Rluc和第89位氨基酸精氨酸后插入YFP的嗅觉受体N-Rluc-ApisOR5-89YFP的配体(E)-beta-Farnesene。
图6为发现了激活氨基端连接Rluc和第89位氨基酸精氨酸后插入YFP的嗅觉受体N-Rluc-ApisOR5-89YFP的配体(E)-beta-Farnesene。
图7为无法激活氨基端连接Rluc和第206位氨基酸精氨酸后插入YFP的嗅觉受体N-Rluc-ApisOR5-206YFP的配体(E)-beta-Farnesene。
图8为发现了激活氨基端连接Rluc和第309位氨基酸精氨酸后插入YFP的嗅觉受体N-Rluc-ApisOR5-309YFP的配体(E)-beta-Farnesene。
图9为发现了激活氨基端连接Rluc和第309位氨基酸精氨酸后插入YFP的嗅觉受体N-Rluc-ApisOR5-309YFP的配体(E)-beta-Farnesene。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。
实施例1
1、构建表达载体
以pRluc为模板，以如下引物进行PCR扩增，得到Rluc片段：
F(SEQ ID:1):ATGACTTCGAAAGTTTATGATCCAGAACAAAGGAAACGG，
R(SEQ ID:2): TTGTTCATTTTTGAGAACTCGCTCAACGAACGATTTG
以pApisOR5为模板，以如下引物进行PCR扩增得到以ApisOR5氨基端为连接点的核酸片段：
F(SEQ ID:3):CTCAAAAATGAACAAGCCACCATGCAGCGCATCGAC，
R(SEQ ID:4): AAACTTTCGAAGTCATGGTACCAAGCTTAAGTTTAAACGCTAGCC
以pBmorOR3为模板，以如下引物进行PCR扩增得到以BmorOR3氨基端为连接点的核酸片段：
F(SEQ ID:5): CAAAAATGAACAAGCCACCATGATCTTCGTGGACG. ，
R(SEQ ID:6): AAACTTTCGAAGTCATGGTACCAAGCTTAAGTTTAAACGCTAGCC
将上述片段进行T4酶切连接反应，构建质粒N-Rluc-ApisOR5 (R-A)，N-Rluc-BmorOR3 (R-B)。 PCR反应体系：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
PCR参数（ApisOR5，BmorOR3） ：95℃预变性 5min后，再以 95℃变性 30sec、53℃退火 40sec、72℃延伸4min的条件进行30次循环，最后 72℃延伸 10min，4℃持续。
PCR参数（Rluc） ：95℃预变性 5min后，再以 95℃变性 30sec、53℃退火 40sec、72℃延伸1min的条件进行30次循环，最后 72℃延伸 10min，4℃持续。
2、细胞培养
全程无菌操作。取293细胞进行培养，待细胞在100-mm 培养皿中长成致密单层，已基本上饱和后，吸除培养瓶内旧培养液，3ml PBS洗1~2次，以去除残余的血清，向瓶内加入0.25%胰蛋白酶1ml ，37℃ 消化2min ，向皿内加入高糖完全培养基（含10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的DMEM），轻轻吹打，使之从皿底脱离形成细胞悬液，并将细胞团打散成单细胞，根据培养皿面积比例，取部分细胞悬液加入到60-mm培养皿中，待转染质粒，于37℃、5%CO2 培养箱中培养。
3、细胞转染
全程无菌操作。细胞提前一天传代，细胞到达对数生长期且细胞融合度达到80-90%时方可转染。取待转染质粒共4µg，两种质粒共转则各自2ug（R-A，R-B，R-A+Orco，R-B+Orco，R-A+BmOR2，R-B+ BmOR2，） 分别加入500µl 无血清无抗生素的DMEM中，混匀成质粒混合液，室温放置5min ，同时取12µl PEI (1µg/µl) 加入500µl 无血清无抗生素的DMEM中，混匀成PEI混合液，室温放置5min 。将质粒混合液和PEI混合液混匀，制成转染混合液，室温放置20min 。吸弃60-mm 皿中的旧培养基，换成新的完全培养基，分别加入转染混合液，轻轻晃匀，置于37℃、5% CO2 培养箱中培养。4~6h 后吸弃培养基，换成新的完全培养基，继续培养40~48h。
注：Orco，BmOR2，为从Addgene购买的质粒，货号分别为53441，73926。
4、生物发光共振能量转移（BRET） 测定
显微镜下观察细胞状态，荧光显微镜下观察细胞有无荧光，可初步判断质粒是否转染成功。吸弃培养基，加入无血清抗生素的DMEM饥饿4h，使细胞同步化。吸弃培养基，1mlPBS洗1~2次，吸弃PBS，滴加400μl 2nmol/L EDTA室温静置3min 消化细胞，加入1ml PBS，使之从皿底脱离形成细胞悬液，并将细胞团打散成单细胞，吹打细胞悬液，吸取细胞悬液入1.5ml EP管。室温离心，500rpm，5min，弃上清，加入1ml PBS重悬细胞沉淀，再离心，重复洗涤2次。弃上清，加入适量PBS重悬细胞，调整细胞数为1*106个/ml，分至底部、周围不透光的96孔乳胶板中，每孔60μl，每组设置3个平行孔，加入20μl 海肾荧光素酶底物Coelenterazine h（终浓度5μmol/L），上机测定480nm和530nm两处发射光强度。
结果如图4所示，实验结果表明在HEK293A细胞中，豌豆长管蚜气味受体ApisOR5的Rluc信号值在分别共表达伴侣蛋白Orco和BmorOR2后有明显增加，T检验示信号差异显著；家蚕嗅觉受体BmorOR3的Rluc信号在分别共表达伴侣蛋白Orco和BmorOR2后变化不明显。
实施例2
1、配体的初步合成
从已投入使用的性引诱剂的成分中选择的化合物，查找该化合物即信息素所对应的昆虫嗅觉受体基因序列，进行合成改造，作为筛选类似化合物的靶点。
2、构建表达载体
将受体序列用软件模拟后，获得其结构简图。豌豆长管蚜气味受体ApisOR5为氨基端位于细胞内的七次跨膜蛋白，在其氨基端连接生物发光共振能量转移供体蛋白Rluc，在受体细胞膜内的LOOP环即跨膜间区插入生物发光共振能量转移受体蛋白增强型黄色荧光蛋白 eYFP，具体插入位置为第89位氨基酸精氨酸、第206位氨基酸谷氨酰胺、第309位氨基酸赖氨酸之后，所选插入位置理论上对受体的表达和功能影响最小。
以pRluc为模板，以如下引物进行PCR扩增，得到Rluc片段：
F(SEQ ID:7): ATGACTTCGAAAGTTTATGATCCAGAACAAAGGAAACGG，
R(SEQ ID:8): TTGTTCATTTTTGAGAACTCGCTCAACGAACGATTTG
以peYFP为模板，以如下引物进行PCR扩增，得到eYFP片段：
F(SEQ ID:9): GCACTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC，
R(SEQ ID:10): CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGTGAGTGATC
以pApisOR5为模板，以如下引物进行PCR扩增，得到以ApisOR5第89个氨基酸为连接点的核酸片段：
R(SEQ ID:11): GCCCTTGCTCACCAGTGCCGGCTGTACTGGTGCAGTCTCGCGGATG，
F(SEQ ID:12): CATGGACGAGCTGTACAAG CGCCTGGGCATCCCCGACAGCTAC
以pApisOR5为模板，以如下引物进行PCR扩增，得到以ApisOR5第206个氨基酸为连接点的核酸片段：
R(SEQ ID:13): GCCCTTGCTCACCAGTGCCTGCTCGTCGTTGTCGGCGAAG，
F(SEQ ID:14): CATGGACGAGCTGTACAAG AAGTTCAAGTACGCCATCATCCAGCAC
以pApisOR5为模板，以如下引物进行PCR扩增，得到以ApisOR5第309个氨基酸为连接点的核酸片段：
R(SEQ ID:15): GCCCTTGCTCACCAGTGCCTTGCTCACGTAGAAGAAGGCG，
F(SEQ ID:16): CATGGACGAGCTGTACAAGAGCTTCAAGAGCAGCATCCTGATC
将上述片段进行T4酶切连接反应，N-Rluc-ApisOR5- 89YFP (R-A-Y89)，N-Rluc-ApisOR5- 206YFP (R-A-Y206)，N-Rluc-ApisOR5- 309YFP (R-A-Y309)
PCR反应体系：
Figure 836529DEST_PATH_IMAGE002
PCR参数（ApisOR5，） ：95℃预变性 5min后，再以 95℃变性 30sec、53℃退火40sec、72℃延伸4min10sec的条件进行30次循环，最后 72℃延伸 10min，4℃持续。
PCR参数（Rluc,eYFP） ：95℃预变性 5min后，再以 95℃变性 30sec、53℃退火40sec、72℃延伸1min的条件进行30次循环，最后 72℃延伸 10min，4℃持续。
3、细胞培养
全程无菌操作。取293细胞进行培养，待细胞在100-mm 培养皿中长成致密单层，已基本上饱和后，吸除培养瓶内旧培养液，3ml PBS洗1~2次，以去除残余的血清，向瓶内加入0.25%胰蛋白酶1ml ，37℃ 消化2min ，向皿内加入高糖完全培养基（含10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的DMEM），轻轻吹打，使之从皿底脱离形成细胞悬液，并将细胞团打散成单细胞，根据培养皿面积比例，取部分细胞悬液加入到60-mm培养皿中，待转染质粒，于37℃、5%CO2 培养箱中培养。
4、细胞转染
全程无菌操作。细胞提前一天传代，细胞到达对数生长期且细胞融合度达到80-90%时方可转染。取4µg待转染质粒N-Rluc-ApisOR5-89YFP、N-Rluc-ApisOR5-206YFP、N-Rluc-ApisOR5-309YFP 分别加入500µl 无血清无抗生素的DMEM中，混匀成质粒混合液，室温放置5min ，同时取12µl PEI (1µg/µl) 加入500µl 无血清无抗生素的DMEM中，混匀成PEI混合液，室温放置5min 。将质粒混合液和PEI混合液混匀，成转染混合液，室温放置20min 。吸弃60-mm 皿中的旧培养基，换成新的完全培养基，分别加入转染混合液，轻轻晃匀，置于37℃、5% CO2 培养箱中培养。4~6h 后吸弃培养基，换成新的完全培养基，继续培养40~48h。
5、配体制备
DMSO稀释纯品化合物(E)-beta-Farnesene到500µmol/L ，先用PBS稀释至终浓度5000nmol/L ，再梯度稀释至终浓度分别为1500nmol/L 、500nmol/L 、150nmol/L 、50nmol/L 、15nmol/L 、5nmol/L 、0.5nmol/L。
6、生物发光共振能量转移（BRET） 测定
显微镜下观察细胞状态，荧光显微镜下观察细胞有无荧光，可初步判断质粒是否转染成功。吸弃培养基，加入无血清抗生素的DMEM饥饿4h，使细胞同步化。吸弃培养基，1mlPBS洗1~2次，吸弃PBS，滴加400μl 2nmol/L EDTA室温静置3min 消化细胞，加入1ml PBS，使之从皿底脱离形成细胞悬液，并将细胞团打散成单细胞，吹打细胞悬液，吸取细胞悬液入1.5ml EP管。室温离心，500rpm，5min，弃上清，加入1ml PBS重悬细胞沉淀，再离心，重复洗涤2次。弃上清，加入适量PBS重悬细胞，调整细胞数为1*106个/ml，分至底部、周围不透光的96孔乳胶板中，每孔60μl，实验组加入20μl 已配置好不同浓度的配体，对照组加入等量PBS，每组设置3个平行孔，37℃反应3min，立即加入20μl 海肾荧光素酶底物Coelenterazine h（终浓度5μmol/L），上机测定480nm和530nm两处发射光强度。以公式530nm 发射光强度/475nm 发射光强度计算 BRET 比值。
实验结果如图5~9。
如图5，将N-Rluc-ApisOR5-89YFP质粒转染到HEK293细胞以后，发现应用(E)-beta-Farnesene在37℃下刺激3min，可促进N-Rluc-ApisOR5-89YFP自身BRET信号的增加，说明(E)-beta-Farnesene能够激活受体N-Rluc-ApisOR5-89YFP。
如图6，实验方法同图5，测量不同浓度的(E)-beta-Farnesene对嗅觉受体N-Rluc-ApisOR5-89YFP的激活作用，并经Graphpad分析，显示(E)-beta-Farnesene的EC50为1.16*10-9 M。
如图7，将N-Rluc-ApisOR5-206YFP质粒转染到HEK293细胞以后，发现应用(E)-beta-Farnesene在37℃下刺激3min，无法促进N-Rluc-ApisOR5-206YFP自身BRET信号的增加，说明(E)-beta-Farnesene无法激活受体N-Rluc-ApisOR5-206YFP，推测受体N-Rluc-ApisOR5-206YFP可能无生物学活性。
如图8，将N-Rluc-ApisOR5-309YFP质粒转染到HEK293细胞以后，发现应用(E)-beta-Farnesene在37℃下刺激3min，可促进N-Rluc-ApisOR5-309YFP自身BRET信号的增加，说明(E)-beta-Farnesene能够激活受体N-Rluc-ApisOR5309YFP。
如图9，实验方法同图8，测量不同浓度的(E)-beta-Farnesene对嗅觉受体N-Rluc-ApisOR5-309YFP的激活作用，并经Graphpad分析，显示(E)-beta-Farnesene的EC50为2.15*10-9 M。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 山东大学
常州宁录生物科技有限公司
<120> 筛选昆虫性信息素受体的配体的传感器分子以及筛选方法
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgacttcga aagtttatga tccagaacaa aggaaacgg 39
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgttcattt ttgagaactc gctcaacgaa cgatttg 37
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcaaaaatg aacaagccac catgcagcgc atcgac 36
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaactttcga agtcatggta ccaagcttaa gtttaaacgc tagcc 45
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caaaaatgaa caagccacca tgatcttcgt ggacg 35
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaactttcga agtcatggta ccaagcttaa gtttaaacgc tagcc 45
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgacttcga aagtttatga tccagaacaa aggaaacgg 39
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttgttcattt ttgagaactc gctcaacgaa cgatttg 37
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcactggtga gcaagggcga ggagctgttc 30
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cttgtacagc tcgtccatgc cgtgagtgat c 31
<210> 11
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcccttgctc accagtgccg gctgtactgg tgcagtctcg cggatg 46
<210> 12
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
catggacgag ctgtacaagc gcctgggcat ccccgacagc tac 43
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcccttgctc accagtgcct gctcgtcgtt gtcggcgaag 40
<210> 14
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
catggacgag ctgtacaaga agttcaagta cgccatcatc cagcac 46
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcccttgctc accagtgcct tgctcacgta gaagaaggcg 40
<210> 16
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
catggacgag ctgtacaaga gcttcaagag cagcatcctg atc 43
<210> 17
<211> 367
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Met Gln Arg Ile Asp Thr Ile Asn Met Phe Leu Gln Met Thr Gly Cys
1 5 10 15
Thr Asp Ser Lys Ala Met Leu Tyr Leu Thr Tyr Phe Glu Phe Leu Ile
20 25 30
Thr Phe Tyr Tyr Leu Ile Ala Thr Tyr Ala Ser Ile Val His Phe Glu
35 40 45
Gln Ser Val Thr Ile Gln Leu Phe Ala Leu Leu Cys Met Leu Ile Glu
50 55 60
Cys Val Ile Leu Leu Asn Ile Thr Phe Arg Leu Tyr His Lys Asn His
65 70 75 80
Ile Arg Glu Met His Gln Tyr Ser Arg Arg Leu Gly Ile Pro Asp Ser
85 90 95
Tyr Arg Ser Val Ile Asn Val Ile Thr Lys Tyr His Leu Ile Ala Ser
100 105 110
Asn Ile Phe Val Val Phe Pro Val Thr Tyr Ala Ile Phe Cys Asp Ser
115 120 125
Val Arg Val Gly Asp Pro Phe Thr Phe Pro Phe Leu Asp Val Leu Pro
130 135 140
Met His Thr Asp Asn Leu Ala Ile Tyr Ala Cys Lys Tyr Leu Val Tyr
145 150 155 160
Ala Ile Ser Val Tyr Ile Ala His Val Glu Leu Cys Phe Ile Asn Thr
165 170 175
Thr Phe Ile Tyr Tyr Val Gly Val Leu Lys His Arg Leu Glu Thr Ile
180 185 190
Val Gln Thr Ile Gly Glu Ala Phe Ala Asp Asn Asp Glu Gln Lys Phe
195 200 205
Lys Tyr Ala Ile Ile Gln His Gln Lys Leu Leu Ser Tyr Phe Asn Thr
210 215 220
Met Lys Ile Val Phe Ser Lys Pro Ile Leu Leu Ser Met Ser Phe Asn
225 230 235 240
Ala Ile Tyr Phe Gly Leu Thr Thr Ser Phe Val Ile Gln Ala Ile Arg
245 250 255
Gly Tyr Ile Asn Gln Ala Ile Leu Ser Ile Cys Ile Ala Ser Ser Ala
260 265 270
Ala Ala Val Ile Asn Ile Thr Ile Tyr Thr Phe Tyr Gly Ser Glu Leu
275 280 285
Met Asp Leu His Asp Lys Ile Leu His Val Leu Phe Asp Asn Ala Phe
290 295 300
Phe Tyr Val Ser Lys Ser Phe Lys Ser Ser Ile Leu Ile Met Met Thr
305 310 315 320
Arg Val Thr Ile Pro Leu Lys Phe Thr Val Gly Tyr Ile Phe Thr Ile
325 330 335
Asn Leu Asn Leu Leu Leu Lys Ile Leu Lys Met Ser Tyr Thr Val Leu
340 345 350
Asn Val Leu Leu Ser Ser Glu Thr Ile Lys Pro His Lys Leu Ser
355 360 365
<210> 18
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Met Thr Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile Thr
1 5 10 15
Gly Pro Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu Asp Ser
20 25 30
Phe Ile Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val Ile
35 40 45
Phe Leu His Gly Asn Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His Val Val
50 55 60
Pro His Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile Ile Pro Asp Leu Ile Gly
65 70 75 80
Met Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr Arg Leu Leu Asp
85 90 95
His Tyr Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro Lys
100 105 110
Lys Ile Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ala Cys Leu Ala Phe His
115 120 125
Tyr Ser Tyr Glu His Gln Asp Lys Ile Lys Ala Ile Val His Ala Glu
130 135 140
Ser Val Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp Glu Trp Pro Asp Ile Glu
145 150 155 160
Glu Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met Val Leu
165 170 175
Glu Asn Asn Phe Phe Val Glu Thr Met Leu Pro Ser Lys Ile Met Arg
180 185 190
Lys Leu Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys Glu
195 200 205
Lys Gly Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile Pro
210 215 220
Leu Val Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg Asn Tyr
225 230 235 240
Asn Ala Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Met Phe Ile Glu
245 250 255
Ser Asp Pro Gly Phe Phe Ser Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala Lys Lys
260 265 270
Phe Pro Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe Ser Gln
275 280 285
Glu Asp Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe Val Glu
290 295 300
Arg Val Leu Lys Asn Glu Gln
305 310
<210> 19
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Ala Leu Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile
1 5 10 15
Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser
20 25 30
Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe
35 40 45
Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr
50 55 60
Thr Phe Gly Tyr Gly Leu Lys Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met
65 70 75 80
Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln
85 90 95
Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala
100 105 110
Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys
115 120 125
Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu
130 135 140
Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys
145 150 155 160
Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly
165 170 175
Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp
180 185 190
Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Lys
195 200 205
Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu
210 215 220
Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235 240

Claims (8)

1.一种筛选昆虫性信息素受体的配体的传感器分子，其特征在于，所述分子至少包括：
信息素受体，所述信息素受体氨基端连接生物发光共振能量转移供体蛋白，所述信息素受体内部插入生物发光共振能量转移受体蛋白，所述供体蛋白和受体蛋白之间互相作用发出BRET信号；
所述信息素受体选自：豌豆长管蚜气味受体ApisOR5，所述生物发光共振能量转移供体蛋白选自：海肾荧光素酶 Rluc，所述的生物发光共振能量转移受体蛋白选自：增强型黄色荧光蛋白 eYFP；
所述生物发光共振能量转移受体蛋白在信息素受体的插入部位为紧邻第89位氨基酸精氨酸之后或紧邻第309位氨基酸赖氨酸之后。
2.一种重组表达基因，其特征在于，所述重组表达基因序列编码如权利要求1所述的筛选昆虫性信息素受体的配体的传感器分子。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有如权利要求2所述重组表达基因。
4.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含如权利要求3所述的重组表达载体。
5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求2所述的重组表达基因、如权利要求3所述的重组表达载体，如权利要求4所述的细胞中的任意一种或几种。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括底物，所述底物为Coelenterazine h 。
7.如权利要求1所述的筛选昆虫性信息素受体的配体的传感器分子、权利要求2所述的重组表达基因、权利要求3所述的重组表达载体、权利要求4所述的细胞、权利要求5~6任一项所述的试剂盒用于筛选昆虫性信息素受体的配体的用途。
8.一种筛选昆虫性信息素受体的配体的方法，所述方法包括：以已知昆虫性信息素的受体作为靶点，向表达Rluc-Receptor-YFP的细胞中加入浓度梯度的待测样品，并检测细胞BRET信号的变化，若BRET信号呈浓度相关性上升，则待测样品为昆虫信息素，所述Rluc-Receptor-YFP为权利要求1所述的筛选昆虫性信息素受体的配体的传感器分子。
CN201810440118.4A 2018-05-10 2018-05-10 筛选昆虫性信息素受体的配体的传感器分子以及筛选方法 Active CN108586620B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810440118.4A CN108586620B (zh) 2018-05-10 2018-05-10 筛选昆虫性信息素受体的配体的传感器分子以及筛选方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810440118.4A CN108586620B (zh) 2018-05-10 2018-05-10 筛选昆虫性信息素受体的配体的传感器分子以及筛选方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108586620A CN108586620A (zh) 2018-09-28
CN108586620B true CN108586620B (zh) 2021-11-23

Family

ID=63636136

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810440118.4A Active CN108586620B (zh) 2018-05-10 2018-05-10 筛选昆虫性信息素受体的配体的传感器分子以及筛选方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108586620B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102439444A (zh) * 2009-01-29 2012-05-02 联邦科学技术研究组织 测量g蛋白偶联受体激活
CN103228669A (zh) * 2010-09-27 2013-07-31 国立大学法人京都大学 基于荧光共振能量转移的原理的单分子型fret生物传感器接头
WO2013155553A1 (en) * 2012-04-16 2013-10-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods and systems for detecting an analyte or classifying a sample
CN105555964A (zh) * 2013-07-18 2016-05-04 洛桑联邦理工学院 生物样品中进行生物发光共振能量转移(bret)分析的方式和方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60324331D1 (de) * 2002-12-20 2008-12-04 Univ Wuerzburg J Maximilians Millisekunden-aktivationsschalter für 7-transmembran-proteine
HUE036982T2 (hu) * 2011-06-21 2018-08-28 Vib Vzw GPCR:G-fehérje komplexek ellen irányuló kötõdomének és alkalmazások

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102439444A (zh) * 2009-01-29 2012-05-02 联邦科学技术研究组织 测量g蛋白偶联受体激活
CN103228669A (zh) * 2010-09-27 2013-07-31 国立大学法人京都大学 基于荧光共振能量转移的原理的单分子型fret生物传感器接头
WO2013155553A1 (en) * 2012-04-16 2013-10-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods and systems for detecting an analyte or classifying a sample
CN105555964A (zh) * 2013-07-18 2016-05-04 洛桑联邦理工学院 生物样品中进行生物发光共振能量转移(bret)分析的方式和方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRET方法研究BST-2和HIV-1 Vpu相互作用及小分子化合物抑制剂的筛选;庞晓静;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20131115(第11（2013）期);E059-42 *
Insights into subunit interactions within the insect olfactory receptor complex using FRET;German 等;《Insect Biochemistry and Molecular Biology》;20121126;第43卷;第138-145页 *
Molecular Basis of Alarm Pheromone Detection in Aphids;Zhang 等;《Current Biology》;20170109;第27卷;摘要 *
昆虫嗅觉受体的研究进展;巩中军 等;《昆虫学报》;20080720;第51卷(第7期);第761页摘要，第762页右栏第3段，第763页左栏第2段，第765页右栏第2段 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108586620A (zh) 2018-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cave et al. Progress in the development of olfactory-based bioelectronic chemosensors
JP4459058B2 (ja) 改善された生物発光を有する発光タンパク質
RU2412250C2 (ru) Модифицированные зеленые флуоресцентные белки и способы их использования
CN109553687A (zh) 基于g蛋白偶联受体构建的荧光探针
WO1998030715A1 (en) Optical sensors of cell signaling
Webb et al. Retrospective on the development of aequorin and aequorin‐based imaging to visualize changes in intracellular free [Ca2+]
CN108586620B (zh) 筛选昆虫性信息素受体的配体的传感器分子以及筛选方法
WO2007056043A2 (en) Use of potassium channels for identifying compounds that have an insecticidal effect
USRE39270E1 (en) Process for continuous optimized protein production in insect larvae
WO2006051944A1 (ja) 蛍光蛋白質
CN113243375B (zh) 化合物vuaa-1作为昆虫引诱剂及在农业害虫防治领域的应用
JP4427671B2 (ja) 蛋白質のプロセッシングを測定するためのモニター蛋白質
US6660844B1 (en) Optical sensors of cell signaling
US20180348231A1 (en) Ligand inducible polypeptide coupler system
CN107840875B (zh) 菜蛾盘绒茧蜂神经肽Cv-sNPF和其受体以及在提高小菜蛾体内海藻糖含量中的应用
CN114573676B (zh) 神经肽Gm-Crz及其受体在梨小食心虫防治中的应用
US20200080991A1 (en) Screening for agents that target the actin cytoskeleton using c. elegans exposed to heat shock
CN113243364B (zh) 化合物十八碳三烯作为EoOR33配体的应用
Varela et al. Programming olfaction into Pichia pastoris for high-throughput detection of odors that influence mosquito behavior
Agnihotri Molecular study of odorant binding proteins to better understand insect chemosensation
US20070256147A1 (en) Combinatorial marking of cells and cell structures with reconstituted fluorescent proteins
Sangaletti A new isoform of peptide transporter PepT1 (sbPepT1) and ion channels in touch sensation.
Kannan et al. Regulatory mechanism of mouse sex pheromone and intracellular calcium level in V2Rx receptor expressing cells
JPH11215934A (ja) 探索物質に基いて特異行動を示す生物体、これを用いた物質探索方法及び物質処理方法
Wong Odor representations in the Drosophila brain

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: Shandong University, No.27, Shanda South Road, Jinan City, Shandong Province

Applicant after: SHANDONG University

Applicant after: Jiangsu Ninglu Technology Co.,Ltd.

Address before: Shandong University, No.27, Shanda South Road, Jinan City, Shandong Province

Applicant before: SHANDONG University

Applicant before: Changzhou Ninglu Biotechnology Co.,Ltd.

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant