KR20070048386A - ｐ53 종양 억제단백질과 형광단백질의 융합단백질을발현하는 형질전환 세포주 및 이를 이용한 ｐ53 종양억제단백질의 활성과 관련된 물질의 검색방법 - Google Patents

ｐ53 종양 억제단백질과 형광단백질의 융합단백질을발현하는 형질전환 세포주 및 이를 이용한 ｐ53 종양억제단백질의 활성과 관련된 물질의 검색방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 p53 종양 억제단백질(tumor suppressor)과 제1 형광단백질의 융합단백질 및 제2 형광단백질을 발현하는 형질전환 세포주, 및 이를 이용하여 p53 종양 억제단백질의 활성에 관여하는 물질을 검색하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 5'에서 3' 방향으로 143번째 아미노산인 발린이 알라닌으로 치환된 비활성 p53 종양 억제단백질 돌연변이 유전자; 상기 유전자에 융합된 제1 형광단백질 유전자; IRES(internal ribosome entry site) 리보솜 결합 염기서열; 및 제2 형광단백질 유전자를 포함하고, 이들의 발현이 하나의 프로모터에 의해 조절되는 재조합 발현벡터; 상기 발현벡터가 안정적으로 도입된 형질전환 세포주; 및 상기 형질전환 세포주를 이용하여 p53 종양 억제단백질의 활성을 증가시키거나 억제하는 물질을 검색하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 발현벡터 및 형질전환 세포주는 p53 종양 억제단백질의 활성과 관련된 물질을 검색하기 위한 바이오센서로서 항암제, 항암치료 보조제 및 퇴행성 질환 관련 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ｐ53 종양 억제단백질과 형광단백질의 융합단백질을 발현하는 형질전환 세포주 및 이를 이용한 ｐ53 종양 억제단백질의 활성과 관련된 물질의 검색방법{TRANSFORMANT EXPRESSING A FUSION PROTEIN OF p53 TUMOR SUPPRESSOR PROTEIN AND A FLUORESCENCE PROTEIN AND METHOD FOR SCREENING SUBSTANCES RELATING TO THE ACTIVITY OF p53 TUMOR SUPPRESSOR PROTEIN USING SAME}
도 1은 p53 종양 억제단백질의 신호전달과정을 간단하게 나타낸 모식도이고,
도 2는 비활성 p53 종양 억제단백질과 적색형광단백질 DsRed1의 융합단백질을 발현하는 발현벡터 pDsRed1-N1/p53V143A의 개열지도를 나타낸 것이고,
도 3은 상기 발현벡터 pDsRed1-N1/p53V143A에 삽입된 비활성 p53 종양 억제단백질이 전사인자로서 활성이 없음을 루시퍼라제 분석을 통해 확인한 결과이고,
도 4는 상기 발현벡터 pDsRed1-N1/p53V143A에 녹색형광단백질 GFP가 삽입된 발현벡터 pP53V143AdsRed1-IRES-GFP의 개열지도를 나타낸 것이고,
도 5는 상기 발현벡터 pP53V143AdsRed1-IRES-GFP가 형질전환된 세포주에서 p53V143A-DsRed1 융합단백질과 GPF 형광단백질이 안정적으로 발현됨을 형광현미경으로 관찰한 결과이고,
도 6은 상기 발현벡터 pP53V143AdsRed1-IRES-GFP가 형질전환된 세포주에서 p53V143A-DsRed1 융합단백질의 발현이 독소루비신의 처리에 의해 증가하였음을 마이크로플레이트 판독기로 측정한 결과이고,
도 7은 본 발명의 형질전환 세포주에서 발현된 p53V143A-DsRed1 융합단백질의 양적 변화와 분포 양상을 하이컨텐츠 이미지 분석기(High-contents image analyzer)로 관찰한 결과이다.
본 발명은 p53 종양 억제단백질과 제1 형광단백질의 융합단백질 및 제2 형광단백질을 발현하는 형질전환 세포주, 및 이를 이용하여 p53 종양 억제단백질의 활성에 관여하는 물질을 검색하는 방법에 관한 것이다.
다세포생물에서 유전자 발현에 의한 세포의 자가사멸(apoptosis)은 발생과 항상성 유지를 위한 필수적 과정이다. 이 과정에서 세포 유전자의 조각화와 세포의 수축 등이 일어나며, 조각난 세포 유전자는 세포질에 싸여 작은 포낭 형태로 식세포 활동에 의해 제거된다. 따라서, 자가사멸은 세포괴사(necrosis)와는 달리 염증반응을 일으키지 않아 정상적인 발생에 중요한 기능을 수행하게 된다.
종양(tumors)의 전형적인 특징 가운데 하나는 분열과 증식이 적절한 수준에서 조절되지 못하고 과도하게 진행된다는 것인데, 세포가 이 같은 양상을 나타내지 못하도록 저해하는 대표적인 종양 억제유전자(tumor-suppressor gene)가 바로 p53이다. 인간을 포함한 많은 고등동물에서 종양 억제인자로 작용하는 p53 단백질은 세포의 비정상적인 증식을 억제하거나, 손상 받은 세포의 증식을 억제 또는 제거하는 기능을 담당한다. 따라서, p53 단백질은 ATM/ATR, Chk2, mdm2, p21, Bax 등 세포 내 중요 인자들과 연관되어 있으며, 이들 인자들은 p53 단백질과 지속적인 상호작용을 유지하는데, 이를 p53 신호전달과정이라고 한다. 또한, p53 단백질은 종양의 발생, 억제 및 노화, 그리고 약물의 세포독성과도 연관이 있다고 알려져 있다. p53 단백질은 핵산에 손상을 일으키는 각종 화합물과 바이러스에 의해 인산화되어 세포질에서 안정화되면서 양적으로 증가하게 되고, 이렇게 안정화된 p53 단백질은 세포핵으로 이동하게 된다. 세포핵에서 p53 단백질은 표적유전자의 프로모터 부위에 특이적으로 결합하는 전사인자로 작용하여 표적단백질의 전사 및 단백질 생산을 유발함으로써 유전자 손상을 복구하기 위한 세포주기 일시정지 또는 손상된 세포의 영구적 제거를 위한 자가사멸을 일으킨다(도 1 참조). 따라서, p53 신호전달과정과 관련하여 각 단계를 상승 또는 저해할 수 있는 새로운 화합물을 확보하는 것은 p53 신호전달과정의 규명과 함께 새로운 항암제 후보물질의 확보에 있어서 매우 중요하다.
전체 암의 50% 정도는 돌연변이로 인해 p53 단백질의 활성이 상실된 데서 비롯되는데, 그 결과로 p53 단백질이 비정상적인 세포성장을 차단하지 못하게 되어 암이 유발되는 것이다. 이러한 이유로 p53 단백질의 활성을 다시 정상적으로 되돌리기 위해 p53 유전자의 돌연변이를 복구시키거나 이의 발현을 증가시킬 수 있는 물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있는 시스템의 개발이 요구되고 있다. 반면, 몇몇 정상세포들, 예를 들면 임파구, 혈액생성기관세포, 장상피세포 등의 정상세포에서는 p53 유전자가 높은 발현율을 보이는데, 이들 세포에 p53 유전자의 발현을 증강시키는 항암제를 처리하는 경우에는 손상을 유발할 수도 있어 항암치료시 수반되는 심각한 빈혈, 탈모, 구토 등의 부작용을 일으키기도 한다. 따라서, p53 유전자의 발현을 적절히 억제할 수 있는 물질의 개발 또한 절실히 요구되고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 p53 단백질의 활성을 증가시키거나 억제할 수 있는 후보물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있는 시스템을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, p53 종양 억제단백질과 제1 형광단백질과의 융합단백질 및 내부지표용 제2 형광단백질이 하나의 프로모터에 의해 발현되는 재조합 발현벡터를 제조하였고, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환 세포주를 이용하여 p53 종양 억제단백질의 활성에 관여하는 물질을 효과적으로 검색할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 형광단백질을 이용하여 p53 종양 억제단백질의 세포 내 양적 변화와 분포 양상을 효과적으로 분석함으로써 p53 종양 억제단백질의 활성을 증가시키거나 억제하여 항암제, 항암치료 보조제 또는 퇴행성 질환 관련 치료제로서 유용하게 사용될 수 있는 후보물질을 검색하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 검색방법을 이용하여 p53 종양 억제단백질의 활성을 증가시키거나 억제하는 후보물질을 검색할 수 있는 바이오센서를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 5'에서 3' 방향으로, 143번째 아미노산인 발린이 알라닌으로 치환된 비활성 p53 종양 억제단백질(이하, '비활성 p53 단백질'이라 약칭함) 유전자; 상기 유전자에 융합된 제1 형광단백질 유전자; IRES(internal ribosome entry site) 리보솜 결합 염기서열; 및 제2 형광단백질 유전자를 포함하고, 이들의 발현이 하나의 프로모터에 의해 조절되는 재조합 p53 단백질 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 p53 단백질 발현벡터가 도입되어 비활성 p53 단백질과 제1 형광단백질의 융합단백질 및 제2 형광단백질을 안정적으로 발현하는 형질전환 세포주를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 형질전환 세포주를 이용하여 p53 종양 억제단백질의 활성에 관여하는 물질을 검색하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 항암제, 항암치료 보조제 또는 퇴행성 질환 관련 치료제로 사용될 수 있는 화합물 및 유전자가 p53 단백질의 안정화와 핵으로의 이동에 영향을 주는 지를 검색하는데 유용하게 사용될 수 있는 재조합 p53 단백질 발현벡터 및 이를 안정적으로 발현하는 형질전환 세포주에 관한 것이다.
본 발명의 재조합 p53 단백질 발현벡터는 5'에서 3' 방향으로 사람의 암세포 사멸과 세포 주기조절에 핵심적인 p53 종양 억제단백질에서 143번째 아미노산인 발린이 알라닌으로 치환된 비활성 p53 돌연변이 유전자; 상기 돌연변이 유전자에 융합된 제1 형광단백질 유전자; IRES 리보솜 결합 염기서열; 및 제2 형광단백질 유전자를 포함하고, 이들의 발현이 하나의 프로모터에 의해 조절되도록 고안된다.
본 발명의 재조합 p53 단백질 발현벡터에서 제1 형광단백질의 유전자는 비활성 p53 유전자에 해독틀(in-frame)을 유지하도록 융합되어 있어 상기 발현벡터로부터 p53 단백질과 제1 형광단백질의 융합단백질 및 제2 형광단백질이 발현된다.
야생형 p53 단백질이 세포 내에서 과량으로 발현되는 경우에는 p53 단백질이 세포의 자가사멸을 유발하기 때문에, 이 단백질을 상시 발현하는 세포는 제작할 수가 없다. 이에, 본 발명에서는 p53 단백질이 세포 내에서 과량으로 발현되어도 세포사멸을 유발하지 않도록 하기 위하여 p53 단백질의 전사인자활성을 소실시킨 비활성 p53 돌연변이 유전자를 사용한다. 상기 유전자로부터 코딩되는 비활성 p53 단백질은 야생형 p53 단백질의 아미노산 서열 중에서 143번째 아미노산인 발린이 알라닌으로 치환된 것으로, 서열번호: 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는다. p53 단백질의 143번째 발린은 p53 단백질이 표적유전자의 DNA에 결합하는 단백질 부위 중 핵심 아미노산 잔기로, 이 부위가 돌연변이된 p53 단백질은 표적유전자에 결합할 수 없기 때문에 p53 활성에 의한 세포 자가사멸이 발생하지 않게 되고, 그로 인 해 p53 단백질의 양적 증가와 세포 내 이동을 용이하게 관찰할 수 있다(도 3 참조).
또한, 본 발명에서는 p53 단백질의 세포 내 분포와 이동을 추적하고, 상기 단백질이 발현된 세포의 형태와 세포질의 위치를 정확히 분석하기 위해 형광단백질을 사용한다. 형광단백질은 다른 단백질과 융합되어도 본래의 형광을 유지하는 경향이 매우 높아 목적단백질과 융합된 융합단백질 형태로 세포 내에서 발현되어 상기 목적단백질의 정량적 및 정성적 분석에 응용되고 있다. 특히, 이와 같이 발현된 융합단백질은 형광단백질에 피융합된 단백질의 고유한 성질에 의해 세포 내 위치와 이동성이 결정되기 때문에, 특정 단백질의 세포 내 위치와 관련한 연구에 유용하게 사용될 수 있다.
우선, 본 발명의 재조합 발현벡터로부터 p53 단백질과의 융합단백질 형태로 발현되는 제1 형광단백질은 p53 단백질의 세포 내 분포와 이동을 실시간으로 추적하기 위한 것이고, 제2 형광단백질은 p53 단백질이 발현된 세포의 형태, 세포수, 세포질의 위치 등을 관찰하기 위한 것이다. 본 발명에서 제1 형광단백질과 제2 형광단백질은 서로 다른 여기파장과 방출파장을 갖는 것이 바람직하며, 에쿠오레아 빅토리아(Aequorea Victoria)라는 발광 해파리에서 유래된 녹색형광단백질(green fluorescence protein, GFP), 이를 유전공학적으로 돌연변이시켜 다른 여기 및 방출파장을 갖도록 조작된 청색(CFP), 황색(YFP), 적색(DsRed) 형광단백질 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 제1 형광단백질로 적색형광단백질 DsRed를, 제2 형광단백질로 녹색형광단백질 EGFP(enhanced GFP)를 사용한다. 적색 형광단백질 DsRed는 558 ㎚에서 최고의 여기파장(excitation)과 583 ㎚에서 최고의 방출파장(emission)을 나타내고, 녹색형광단백질 GFP는 488 ㎚에서 최고의 여기파장과 507 ㎚에서 최고의 방출파장을 나타낸다.
상기와 같이 서로 다른 파장을 갖는 두 종류의 형광단백질이 각기 다른 프로모터에서 전사되는 경우에는 표적 형광단백질의 발현량이 각 웰에서의 전사활성이나 세포상태의 차이에 따라 변할 수 있다. 따라서, 특정 단백질의 생산 후 변형 또는 이동에 의한 세포 내 활성을 관찰하고자 할 때는 전사활성에 의한 차이를 제거하기 위해서 동일한 프로모터에 의해 생산된 내부지표 단백질을 이용하여 세포 내 전사활성을 일치시키는 것이 매우 중요하다. 이에, 본 발명에서는 p53 단백질과 제1 형광단백질의 융합단백질 유전자와 제2 형광단백질 유전자가 하나의 프로모터에 의해 하나의 mRNA로 동시에 전사되고, 이로부터 두 가지 형광단백질이 생산될 수 있도록 하기 위하여 두 개의 리보솜 결합부위를 포함하는 발현벡터를 고안한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 비활성 p53 단백질에 융합되는 적색형광단백질인 DsRed1과 이와 대비되는 녹색형광단백질인 GFP 유전자 사이에 IRES 염기서열을 위치시키는데, 상기 IRES 염기서열은 mRNA의 5'-말단부위가 아닌 중간부위에 새로운 리보솜이 결합하여 5'-말단부위의 단백질 생성과 상관없이 새로운 단백질 생산을 가능하게 한다.
이와 같이 제조된 재조합 p53 단백질 발현벡터에서는 동일한 하나의 프로모터로부터 전사된 하나의 mRNA상에서 비활성 p53 단백질과 제1 형광단백질의 융합단백질 및 내부지표인 제2 형광단백질의 두 가지 단백질이 동시에 발현되어, 상기 내 부지표 단백질의 발현을 기준으로 p53 단백질의 양적인 변화와 세포 내 이동을 용이하게 분석할 수 있다. 즉, 상기 발현벡터는 융합단백질만을 발현시킬 경우 발생할 수 있는 화합물의 비특이적 작용, 세포독성에 의한 활성오류 등을 배제하기 위하여 내부적 표준지표로서 제2 형광단백질을 비특이적이고 지속적인 방법으로 발현시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 비활성 p53 종양 억제단백질과 적색형광단백질 DsRed1의 융합단백질을 코딩하는 유전자 DsRed1-N1/p53V143A; IRES 염기서열; 및 녹색형광단백질 GFP를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 p53 단백질 발현벡터 pP53V143AdsRed1-IRES-GFP를 제조한다(도 2 및 4 참조).
본 발명은 또한 상기와 같은 특징을 갖는 재조합 p53 단백질 발현벡터를 이용하여 p53 단백질의 활성에 관여하는 물질을 검색하기 위한 바이오센서로서 상기 발현벡터가 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 안정적으로 재조합 p53 단백질을 발현하는 형질전환 세포주를 제공한다. 상기 재조합 p53 단백질 발현벡터는 통상의 형질감염방법, 예를 들어 DEAE-덱스트란, 칼슘 포스페이트법, 미세주사법, DNA-함유 리포좀 방법, 리포펙타민-DNA 복합체 방법 등, 바람직하게는 전기천공법에 의해 숙주세포, 바람직하게는 동물세포, 더욱 바람직하게는 BHK 세포, CHO 세포, COS 세포 및 다양한 암세포에 도입시킬 수 있다. 상기 형질감염 방법은 당업계에 공지되어 있다(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001).
본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 재조합 p53 단백질 발현벡터 pP53V143AdsRed1-IRES-GFP가 염색체에 도입되어 p53V143A-DsRed1 융합단백질과 GFP 형광단백질을 안정적으로 발현하는 형질전환 세포주 U2OS/pP53V143ADsRed-IRES-GFP를 제조하고, 상기 형질전환 세포주를 2005년 10월 14일자로 한국생명공학연구원 부설 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 10863BP).
본 발명에 따른 재조합 p53 단백질 발현벡터 및 이를 안정적으로 발현하는 형질전환 세포주는 다양한 악성 종양세포의 자가사멸을 유도할 수 있는 화합물 및 유전자의 스크리닝, 항암 치료시 항암제와 p53 단백질과의 상호작용으로 인한 부작용을 방지하기 위하여 p53 단백질의 활성을 적절히 억제할 수 있는 화합물의 스크리닝, 및 각헌팅턴병 등을 포함한 퇴행성 관련 질환의 치료제로 사용될 수 있는 화합물의 스크리닝에 매우 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 형질전환 세포주는 현재 임상에서 치료목적으로 사용되고 있는 화학 항암제의 세포사멸 효능을 평가하는데도 적용될 수 있다. 특히, 돌연변이형 p53 단백질 유전자를 이용한 본 발명의 벡터 시스템은 p53 단백질의 자가사멸에 의한 세포사가 억제된 안정화된 세포 내 환경에서 p53 단백질의 이동과 관련된 약물과 유전자의 스크리닝에 유용할 것이다. 더욱이, 본 발명의 재조합 p53 단백질 발현벡터는 형질전환 세포주, 재조합 아데노바이러스, 형질전환동물 등에 도입되어 바이오센서(biosensor)로서 유용하게 사용될 수 있다. 상기 재조합 p53 단백질 발현벡터가 도입된 세포주는 항암제, 항암치료 보조제 및 퇴행적 질환의 치료제의 스크리닝에 유용할 뿐만 아니라 상기 재조합 벡터를 이용하여 제작된 유전자 이식동물은 p53 이동성 및 안정화를 관찰 및 평가할 수 있는 실험 질환 모델동물로 사용될 수 있을 것이다.
따라서, 재조합 p53 단백질 발현벡터 및 이를 안정적으로 발현하는 형질전환 세포주를 이용한 본 발명의 스크리닝 시스템은 p53 단백질의 활성에 관여하는 물질을 검색하기 위한 바이오센서로서 상기 단백질과 연관된 항암제, 항암 보조제 및 퇴행성 질환 관련 치료제의 개발에 유용한 도구가 될 것이다.
아울러, 본 발명은 상기 재조합 p53 단백질 발현벡터를 안정적으로 발현하는 형질전환 세포주를 이용하여 p53 단백질의 활성에 관여하는 물질을 검색하는 방법을 제공한다.
상기 검색방법은
1) 본 발명의 재조합 p53 단백질 발현벡터를 안정적으로 발현하는 형질전환 세포주를 웰 플레이트에서 배양하는 단계;
2) 상기 플레이트의 각 웰에 검색하고자 하는 시료를 첨가하고 배양하는 단계;
3) 이로부터 융합단백질 형태로 발현된 제1 형광단백질의 형광과 제2 형광단백질의 형광을 측정하고 형광의 분포양상을 분석하는 단계; 및
4) 제2 형광단백질의 형광을 내부지표로 사용하여 제1 형광단백질의 형광을 보정함으로써 발현된 p53 단백질의 양을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단계 2)에서, p53 단백질의 양을 증가시키는 시료를 검색하기 위해서는 단순히 형질전환 세포주의 배양액에 검색하고자 하는 시료만을 처리하면 된다. 반면, DNA 손상신호에 의한 p53 단백질의 양적 증가를 억제하는 시료를 검색하기 위해서는 단계 2)에서 시료를 처리하고 1시간 후에 DNA 손상물질을 처리하고 추가로 배양하는 것이 바람직하다. 본 단계에서 사용될 수 있는 DNA 손상물질로는 통상적으로 항암치료시 사용되는 항암제라면 어느 것이나 사용될 수 있으며, 특히 독소루비신(doxorubicin)이 바람직하다.
단계 3)에서, 제1 형광단백질로부터 나온 형광으로는 형질전환 세포주로부터 발현된 융합단백질의 세포 내 분포와 이동을 확인할 수 있고, 제2 형광단백질로부터 나온 형광으로는 세포의 전체모양과 세포수를 확인할 수 있다. 이때, 제2 형광단백질에 의한 형광은 표준 내부지표(Internal control)로 사용되는데, 이는 화합물의 세포독성, 세포수, 세포형태, 웰간의 차이에 따른 변수 등 실험 수행시 나타날 수 있는 요인들, 즉 DNA 손상 등과 같은 p53 단백질의 활성화와 관련이 없는 외생 변수들을 표준화하는 요소이다.
루시퍼라제를 이용한 일반적인 발광 측정 세포기반 스크리닝 시스템에 사용되는 마이크로플레이트의 바닥은 빛이 통과할 필요가 없기 때문에, 보통의 경우에는 불투명한 바닥을 갖는 플레이트가 사용된다. 그러나, 본 발명에서와 같이 형광과 함께 세포 내 단백질의 이동을 분석하는 경우에는 반드시 바닥이 투명하고 빛의 산란이 적은 마이크로플레이트를 사용해야만 한다. 이에 본 발명에서는 바닥이 투명하고 빛의 산란이 최소한으로 발생하는 셀캐리어 384-웰 마이크로플레이트(CellCarrier 384 μClear bottom microplate, Evotech사)를 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명이 상기 마이크로플레이트에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 검색방법은 재조합 형광단백질을 이용하여 p53 종양 억제단백질의 안정성 및 핵으로의 이동성을 용이하게 분석할 수 있어 향후 다양한 약물의 스크리닝과 고속 평가시스템 등 관련 분야의 연구에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
이하, 하기 제조예 및 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다.
하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 종양 억제단백질 p53과 형광단백질 DsRed1의 융합단백질 및 녹색형광단백질 GFP가 하나의 프로모터에 의해 발현되는 발현벡터 및 형질전환 세포주의 제조
<1-1> p53-DsRed1 융합단백질을 발현하는 발현벡터의 제조
먼저, 적색형광단백질 DsRed1 유전자와 융합될 전사인자활성이 소실된 비활성 p53 유전자를 증폭하기 위하여, 야생형 p53 단백질의 아미노산 서열 중에서 143번째 아미노산인 발린이 알라닌으로 치환된 돌연변이 p53 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하고 있는 pCMVp53-V143A 플라스미드를 주형으로 하고 서열번호: 2 및 3의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응용액은 상기 플라스미드 주형 DNA 10 ng, 서열번호: 2 및 3의 프라이머 쌍 각각 1 pM, 16 mM (NH)4SO4, 67 mM Tris-HCl(pH 8.8), 0.01% 트윈20, 1.5 mM MgCl2을 혼합하여 제조하였고, PCR 반응은 95℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분의 반응을 20회 반복하였다. 이 때, 상기 서열번호: 2 및 3의 프라이머 쌍은 PCR 생성물의 양 말단에 각각 XhoI과 HindⅢ 제한효소 절단부위를 생성시키고, 야생형 p53 단백질의 아미노산 서열에서 143번째 아미노산인 발린을 알라닌으로 치환시키도록 고안되었다. 이로부터 증폭된 PCR 생성물을 제한효소 XhoI과 HindⅢ로 절단한 후 메가-스핀 겔 추출 킷트(Mega-spin gel extraction kit, Intron Biotechnology사)를 이용하여 분리·정제하였다.
한편, DsRed1 단백질 발현벡터인 pDsRed1-N1(Clontech)을 제한효소 XhoI과 HindⅢ로 절단한 후 메가-스핀 겔 추출 킷트(Intron Biotechnology사)를 이용하여 분리·정제하였다. 이와 같이 분리·정제된 p53 유전자 절편과 pDsRed1-N1 벡터 절편을 3:1의 비율로 혼합한 후 16℃에서 12시간 동안 리가아제를 처리하여 연결시켜 p53 유전자와 형광단백질 DsRed1의 융합단백질을 발현하는 발현벡터 pDsRed1-N1/p53V143A를 제조하였다(도 2).
상기 발현벡터 pDsRed1-N1/p53V143A로부터 발현되는 p53-DsRed1 융합단백질이 전사인자활성이 없는 돌연변이 단백질임을 확인하기 위하여, 이 발현벡터를 p53 결합 염기서열을 포함하는 리포터 발현벡터인 pGL3-(p53)12와 함께 HeLa 세포주(ATCC CCL-2)에 리포펙타민(lipofectamine)을 이용하여 공-형질감염(co-transfection)시켰다. 이때, 리포터 발현벡터 pGL3-(p53)12는 pGL3-basic 플라스미드(Promega사)에 E1B TATA 박스와 12개의 p53 단백질 결합부위가 클로닝된 벡터로, 야생형 p53 단백질이 결합할 수 있는 결합 염기서열이 12개 배수화되어 초파리 루시퍼라제(firefly luciferase) 유전자의 앞부분에 위치하고 있어 루시퍼라제 분 석을 통해 상기 단백질의 발현여부를 확인할 수 있다. 상기 발현벡터 pDsRed1-N1/p53V143A를 HeLa 세포에 리포펙타민 플러스(Lipofectamine Plus, Invitrogen사) 시약을 이용하여 다음과 같이 형질전환시켰다. 20 ㎕의 혈청 부재 및 항생제 부재인 DMEM에 pDsRed1-N1/p53V143A 벡터 DNA 100 ng, pGL3-(p53)12 벡터 DNA 250 ng, 내부표준 벡터 pRL-CMV DNA 50 ng 및 2 ㎕ 플러스 시약(Invitrogen사)을 첨가하여 혼합하고, 15분간 상온에서 항온 처리하였다. 상기 혼합물을 다시 22 ㎕의 혈청 부재 및 항생제 부재 DMEM과 3 ㎕의 리포펙타민 혼합물에 첨가한 후 추가로 15분간 상온에서 항온 처리하여 DNA:리포펙타민:Plus 시약:DMEM의 복합체를 제조하였다. 이때, 야생형 p53 유전자를 포함하고 있는 pEGFP-N1/wt p53 DNA 100 ng을 대조군으로 사용하여 상기와 동일하게 형질감염을 수행하였다. 복합체를 형성하는 동안에 HeLa 세포주를 PBS로 두 번 세척한 후 200 ㎕의 혈청 부재 및 항생제 부재 DMEM에 첨가하였다. 완성된 복합체를 상기 세포주에 첨가한 후 3시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 그런 다음 배지를 10% 소태아 혈청 및 페니실린(100 단위/㎖, Invitrogen사)과 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖, Invitrogen사)이 첨가된 DMEM으로 교체하고, 48시간 동안 37℃에서 항온 배양하였다.
상기와 같이 일시적으로 형질감염시키고 48시간 후에 p53 단백질 발현에 의한 초파리 루시퍼라제의 활성변화를 이중-루시퍼라제 킷트(Dual Luciferase Kit, Promega사)를 이용하여 확인하였다. 우선 플레이트 내에 잔존하는 배지를 제거하고 PBS 완충용액으로 3번 세척한 후 킷트 내에 포함되어 있는 5 ㎖의 5× 수동성 용해 완충용액(Passive Lysis Buffer)을 1× 수동성 세포용해액으로 희석한 후 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 세포를 용해시켰다. 용해된 세포 추출물을 5 ㎕씩 취하여 384-웰 플레이트에 옮긴 후 용해된 세포 추출물이 포함된 각 웰에 25 ㎕의 LARⅡ 시약을 첨가하고 약 1분 후에 마이크로플레이트 판독기(Envision Reader, Perkin Elmer사)를 이용하여 클론 벡터의 전사활성에 의해 결정되는 초파리 루시퍼라제에 의한 발광도를 0.1초간 측정하였다. 1차 측정이 끝난 후 각 웰에 다시 25 ㎕의 스톱 & 글로우(Stop & Glow) 시약을 처리하였고, 1분 후에 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 pRL-CMV의 전사활성에 의해 결정되는 레닐라 루시퍼라제에 의한 발광도를 0.1초간 측정하였다. 이때, CMV 프로모터하의 레닐라 루시퍼라제 발광도는 표준 내부지표(Internal control)로 사용되는데, 이 값은 화합물의 세포독성, 세포수, 독소루비신에 의한 활성화 정도, 웰간의 차이에 의한 변수 등 실험 수행시 나타날 수 있는, 즉 저산소증 신호와는 상관없는 외생 변수들을 표준화하는 요소이다. 형질감염 2일 후 이중-루시퍼라제 킷트를 이용한 리포터 분석을 통해 각 p53 유전자의 전사활성화 여부를 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 야생형 p53 단백질은 pGL3-(p53)12 리포터 벡터의 p53 결합부위에 결합하여 프로모터가 작동함에 따라 초파리 루시퍼라제의 활성값이 높게 나타난 반면, 돌연변이형 p53 유전자의 경우에는 비활성 p53 단백질이 프로모터에 결합하지 않아 프로모터가 작동할 수 없기 때문에 낮은 활성값을 나타내었다. 이로부터 상기에서 제조된 발현벡터 pDsRed1-N1/p53V143A의 p53 유전자가 전사인자활성이 없는 돌연변이형임을 확인하였고, 상기 발현벡터를 IRES 염기서열과 녹색형광단백질 GFP를 포함한 최종 발현벡터를 제작하기 위한 중간벡터로 사용하였다.
<1-2> p53-DsRed1 융합단백질과 녹색형광단백질 GFP가 하나의 프로모터에 의해 발현되는 발현벡터의 제조
실시예 <1-1>에서 제조된 발현벡터 pDsRed1-N1/p53V143A에 포함된 융합단백질 유전자 p53V143A-DsRed1을 IRES 염기서열의 앞쪽에 클로닝하기 위하여, 상기 발현벡터를 제한효소 BglⅡ와 NotI으로 절단하여 p53V143A-DsRed1 융합단백질 유전자를 포함하는 절편을 분리·정제하였다. 또한, IRES 염기서열을 포함한 절편을 분리하기 위하여, IRES 함유 벡터인 pIRES-hrGFP-1a(Stratagene사)를 제한효소 BamHI-MluI 및 MluI-NotI으로 각각 절단한 후 BamHI-MluI 절편(벡터 염기서열 2571∼687에 해당, 2695 bp) 및 MluI-NotI 절편(벡터 염기서열 667∼2571에 해당, 1904 bp)을 각각 분리·정제하였다. 분리·정제된 세 가지 절편을 혼합한 후 16℃에서 12시간 동안 리가아제를 처리하여 이들을 연결시킴으로써 pIRES-hrGFP-1a 벡터의 다중 클로닝 부위에 p53V143A-DsRed1 유전자를 클로닝하였다. 정상적으로 클로닝되면 BglⅡ와 BamHI 제한효소 인식부위가 연결과정에서 소멸된다. 이로부터 하나의 프로모터에 의해 p53V143A-DsRed1 융합단백질과 녹색형광단백질 GFP의 발현이 조절되는 발현벡터를 제작하였고, 이를 pP53V143ADsRed1-IRES-GFP라고 명명하였다(도 4).
<1-3> 발현벡터 pP53V143ADsRed-IRES-GFP가 안정적으로 도입된 형질전환 세포주의 제조
인간 골육종 세포주 U2OS(ATCC HTB-96)를 100 ㎜ 배양접시에 5×105 세포씩 이식하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포에 상기 실시예 <1-2>에서 제작된 발현벡터 pP53V143ADsRed-IRES-GFP와 선별용 벡터인 pTK-Hyg(Clontech사)를 혼합하여 리포펙타민(Lipofectamine plus reagent, Invitrogen사)을 이용하여 공-형질감염시켰다. 일반적으로, 리포펙타민을 이용하여 안정한 세포주를 제조할 때 형질감염시키는 DNA의 총량은 5 ㎍/100 ㎜ 배양접시이므로, pP53V143ADsRed-IRES-GFP 발현벡터 DNA 4 ㎍과 pTK-Hyg 벡터 DNA 1 ㎍을 혼합하여 형질감염시켰다. 상기 DNA 혼합물에 항생제를 포함하지 않는 맥코이 5A 배지(McCoy's 5A, GIBCO사) 350 ㎕를 넣고, 여기에 플러스 시약(Plus reagent) 40 ㎕를 첨가하고 피펫으로 혼합한 후 상온에서 15분간 방치하였다. 15분 경과 후에 리포펙타민이 함유된 멕코이 5A 배지(McCoy's 5A+리포펙타민) 400 ㎕를 첨가하고 피펫으로 혼합한 후 다시 상온에서 15분간 방치하였다. 15분 경과 후 신선한 배지 3.2 ㎖이 들어있는 100 ㎜ 배양접시에 상기 혼합액 800 ㎕를 넣고 37℃, 5% CO2 배양기에서 3시간 동안 배양하였다. 3시간이 지나면 PBS 완충액으로 배양접시를 3회 세척한 후 배지 10 ㎖씩을 첨가하고 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포가 포화성장(confluent growth) 상태에 이르면, 하이그로마이신 B(Hygromycin B)를 200 ㎍/㎖ 농도로 처리하였다. 발현벡터를 형질감염시키지 않은 대조군 세포가 모 두 사멸될 때까지 하이그로마이신 B를 처리하였고, 대조군 세포가 모두 사멸되면 생존하는 세포, 즉 형질감염 세포를 0.25% 트립신으로 처리하여 배양접시로부터 떼어낸 후 96-웰 플레이트의 각 웰에 단일세포(single cell)가 들어가도록 희석하여 배양하였다. 배양된 세포로부터 분리한 단일세포를 다시 24-웰 플레이트로 옮겨서 포화성장 상태가 될 때까지 배양하였다. 배양된 세포를 25T 배양 플라스크에 옮겨서 48시간 동안 배양하고, 다시 75T 배양 플라스크에 옮겨서 72시간 동안 대량으로 배양한 후, 60 ㎜ 배양접시당 5×105 세포수로 이식하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 발현벡터 pP53V143ADsRed-IRES-GFP가 형질감염된 세포주에 독소루비신(Doxorubicin)을 최종 농도가 0.5 μM이 되도록 처리한 후 형광현미경 하에서 적색형광(최대 여기파장=558 ㎚; 최대 방출파장=583 ㎚)과 녹색형광(최대 여기파장=488 ㎚; 최대 방출파장=507 ㎚)의 세포형태를 확인하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 세포의 전체모양과 세포수는 GFP의 녹색형광으로 확인할 수 있고, 융합단백질 p53V143A-DsRed1의 세포 내 분포와 이동은 DsRed1의 적색형광으로 확인할 수 있었다. 특히, 항암제인 독소루비신을 처리한 경우에는 전체적으로 p53V143A-DsRed1 융합단백질의 양적 증가와 함께 핵으로의 이동이 관찰되었는데, 이는 p53V143A-DsRed1 융합단백질이 야생형 p53 단백질의 세포 내에서의 활성을 그대로 모방한다는 것을 의미한다. 또한, 전체적으로 세포의 모양과 성장속도에 있어서 정상의 U2OS 세포와 거의 차이가 없었는데, 이는 숙주세포에서 발현된 p53V143A-DsRed1 융합단백질의 p53 단백질이 비활성 돌연변이이기 때문에 p53 단백질이 과도하게 발현되어도 세포성장에 아무런 영향을 미치지 않음을 나타내는 것이다. 이와 같이 p53 단백질의 세포 내 증가와 이동을 용이하게 관찰할 수 있는 U2OS 세포 기원의 형질감염 세포주를 U2OS/pP53V143ADsRed-IRES-GFP라고 명명하였고, 2005년 10월 14일자로 한국생명공학연구원 부설 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 10863BP).
실시예 2: 형질감염 세포주 U2OS/pP53V143ADsRed-IRES-GFP를 이용한 p53의 양적 증가와 세포 내 이동에 영향을 주는 물질의 검색
상기 실시예 1에서 제조된 형질감염 세포주 U2OS/pP53V143ADsRed-IRES-GFP를 이용하여 p53 단백질의 세포 내 양적 증가와 분포 양상에 영향을 주는 화합물을 검색하기 위하여, 상기 세포주를 24-, 96- 및 384-웰 플레이트(CellCarrier 384 μClear bottom microplate, Evotech사)에 약 30%의 밀도로 이식 배양하였다. 37℃, 5% CO2 배양기에서 약 20시간 가량 배양한 후 배지를 10% FBS를 포함하는 신선한 맥코이 5A 배지(McCoy's 5A/10% FBS)로 바꿔주었다. 이를 다시 약 1시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였고, 각 웰에 검색하고자 하는 시료를 처리하였다. 이때, DNA 손상신호에 의해 p53 단백질의 양을 증가시키는 시료만을 검색하기 위해서는 단순히 형질감염 세포의 배양액에 시료만을 처리하였고, DNA 손상신호에 의한 p53 단백질의 양적 증가를 억제하는 시료를 검색하기 위해서는 시료 처리 1시간 후에 독소루비신을 최종 농도 0.5 mM로 처리하고 추가로 20시간 더 배양하였다. 20 시간 경과 후 형광현미경으로 583 ㎚ 파장에서 DsRed1의 적색형광을, 507 ㎚ 파장에서 GFP의 녹색형광을 측정하여 세포형태를 확인한 후 CCD 카메라로 이미지를 저장하였다. GFP의 녹색형광으로 세포의 전체모양과 세포수를 확인할 수 있고, DsRed1의 적색형광으로 융합단백질 p53V143A-DsRed1의 세포 내 분포와 이동을 확인할 수 있다. 이때, GFP에 의한 녹색형광은 표준 내부지표(Internal control)로 사용되는데, 이는 화합물의 세포독성, 세포수, 세포형태, 웰간의 차이에 따른 변수 등 실험 수행시 나타날 수 있는 요인들, 즉 DNA 손상 등과 같은 p53 단백질의 활성화와 관련이 없는 외생 변수들을 표준화하는 요소이다.
도 5에 나타난 바와 같이, 독소루비신과 마찬가지로 p53 단백질의 핵에서 세포질로의 이동을 억제하여 p53 단백질을 핵으로 이동시키거나 집중시키는 것으로 알려진 화합물인 렙토마이신(Leptomycin)을 시료로 사용한 결과, p53 단백질의 발현이 증가하였고, 발현된 p53 단백질들이 핵으로 집중됨을 확인하였다.
일반적으로 이러한 p53 단백질의 증가는 형광현미경에 의해 관찰이 가능하지만, 10,000개 이상의 시료 화합물들을 대상으로 하는 스크리닝에서는 일일이 관찰하는데 너무 많은 시간이 소요되기 때문에, 실제로 수많은 후보물질들을 대상으로 검색하는 과정에는 적용하기가 어렵다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명에서는 도 6에 나타난 바와 같이, 특정 파장의 형광을 매우 짧은 시간에 측정할 수 있는 장비인 마이크로플레이트 판독기(Envision Reader, Perkin Elmer사)를 이용하여 실제로 독소루비신에 의한 p53V143A-DsRed1 융합단백질의 적색형광의 증가를 확인하였다.
실시예 3: 형질감염 세포주 U2OS/pP53V143ADsRed-IRES-GFP를 이용한 p53의 양적 증가와 이동에 영향을 주는 물질의 하이컨텐츠 검색방법
상기 실시예 2에서 사용된 마이크로플레이트 판독기는 흡광, 발광 또는 형광에 의해 단백질 양의 증감을 측정할 수 있지만 세포 내에 존재하는 단백질의 분포와 이동을 확인할 수는 없다. 이에 본 발명자들은 세포 내에서 발생할 있는 각종 현상을 분석할 수 있는 장비인 하이컨텐츠 이미지 스크리닝 시스템(High Throughput Conforcal Cell Screening System, Evotech사)을 이용하여 세포 내에서 발현된 p53V143A-DsRed1 융합단백질의 양적 변화뿐만 아니라 세포 내 이동을 정량적으로 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 일반 형광현미경으로는 핵막에 결합되어 있는 p53V143A-DsRed1 융합단백질을 핵 내에 존재하는 p53V143A-DsRed1 융합단백질과 구별할 수 없었지만, 본 실시예에서 사용한 상기 하이컨텐츠 이미지 스크리닝 시스템은 공초점 형광현미경이 장착되어 있어 이를 쉽게 구분할 수 있었다. 도 7의 왼쪽 패널은 독소루비신의 처리에 의해 p53 단백질의 발현이 증가되었음을 나타내는 것이고, 오른쪽 패널은 p53 단백질의 핵 이동에 영향을 주는 시료를 처리한 후 독소루비신을 처리한 것으로 DNA 손상신호에 의한 p53 단백질의 양적 증가 후 핵으로의 이동이 억제되었음을 나타내는 것이다.
상기 결과들로부터 본 발명에 따라 제조된 발현벡터 pP53V143ADsRed-IRES-GFP 및 이를 포함하는 형질전환 세포주가 p53 단백질의 활성과 관련된 화합물, 유 전자 및 단백질을 검색하거나 이들의 작용기작 연구에 매우 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 재조합 p53 단백질 발현벡터 및 이를 포함하는 형질전환 세포주는 p53 단백질의 활성과 관련된 바이오센서로서 항암제, 항암 보조제 및 퇴행성 질환의 치료제 개발에 효과적으로 사용될 수 있다.
<110> Korea Research Institute of Chemical Technology <120> TRANSFORMANT EXPRESSING A FUSION PROTEIN OF p53 TUMOR SUPPRESSOR PROTEIN AND A FLUORESCENCE PROTEIN AND METHOD FOR SCREENING SUBSTANCES RELATING TO THE ACTIVITY OF p53 TUMOR SUPPRESSOR PROTEIN USING SAME <130> FPD200509-0012 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 391 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 mutant protein having subsitution of 143rd valine with alanine <400> 1 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro 65 70 75 80 Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser 85 90 95 Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly 100 105 110 Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro 115 120 125 Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Ala Gln 130 135 140 Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met 145 150 155 160 Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys 165 170 175 Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln 180 185 190 His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp 195 200 205 Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu 210 215 220 Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser 225 230 235 240 Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr 245 250 255 Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val 260 265 270 Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Lys Glu Asn 275 280 285 Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr 290 295 300 Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys 305 310 315 320 Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu 325 330 335 Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp 340 345 350 Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His 355 360 365 Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met 370 375 380 Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp 385 390 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 2 ggattactcg agatggagga gccgcagtca gatc 34 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 3 atttataagc ttgtcaggcc cttctgtctt gaac 34

Claims (12)

  1. 5'에서 3' 방향으로, 143번째 아미노산인 발린이 알라닌으로 치환된 비활성 p53 종양 억제단백질 돌연변이 유전자; 상기 유전자에 융합된 제1 형광단백질 유전자; IRES(internal ribosome entry site) 리보솜 결합 염기서열; 및 제2 형광단백질 유전자를 포함하고, 이들의 발현이 하나의 프로모터에 의해 조절되는 재조합 발현벡터.
  2. 제 1항에 있어서,
    p53 종양 억제단백질 돌연변이 유전자가 서열번호: 1로 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
  3. 제 1항에 있어서,
    제1 형광단백질과 제2 형광단백질은 각각 서로 다른 여기 및 방출파장을 갖는 형광단백질로, 녹색형광단백질(green fluorescence protein, GFP), 청색형광단백질(CFP), 황색형광단백질(YFP) 및 적색형광단백질(DsRed)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
  4. 제 1항에 있어서,
    서열번호: 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 돌연변이 단백질을 코딩하는 p53 종 양 억제단백질 돌연변이 유전자; 적색형광단백질 DsRed1을 코딩하는 유전자; IRES 염기서열; 및 녹색형광단백질 GFP를 코딩하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
  5. 제 4항에 있어서,
    pP53V143AdsRed1-IRES-GFP인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
  6. 제 1항의 재조합 발현벡터가 도입되어 비활성 p53 종양 억제단백질과 제1 형광단백질의 융합단백질 및 제2 형광단백질을 안정적으로 발현하는 형질전환 세포주.
  7. 제 6항에 있어서,
    U2OS/pP53V143ADsRed-IRES-GFP(기탁번호: KCTC 10863BP)인 것을 특징으로 하는 형질전환 세포주.
  8. 1) 제 6항의 형질전환 세포주를 웰 플레이트에서 배양하는 단계;
    2) 상기 플레이트의 각 웰에 검색하고자 하는 시료를 첨가하고 배양하는 단계;
    3) 이로부터 융합단백질 형태로 발현된 제1 형광단백질의 형광과 제2 형광단백질의 형광을 측정하고 형광의 분포양상을 분석하는 단계; 및
    4) 제2 형광단백질의 형광을 내부지표로 사용하여 제1 형광단백질의 형광을 보정함으로써 발현된 p53 단백질의 양적 변화를 측정하는 단계를 포함하는, p53 종양 억 제단백질의 활성에 관여하는 물질을 검색하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    단계 2)에서 형질전환 세포주의 배양액에 검색하고자 하는 시료를 처리함으로써 p53 단백질의 양을 증가시키는 시료를 검색하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8항에 있어서,
    단계 2)에서 시료를 처리하고 1시간 후에 DNA 손상물질을 처리하고 추가로 배양함으로써 DNA 손상신호에 의한 p53 단백질의 양적 증가를 억제하는 시료를 검색하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8항에 있어서,
    단계 3)에서, 제1 형광단백질로부터 나온 형광으로는 형질전환 세포주로부터 발현된 융합단백질의 세포 내 분포와 이동을 확인하고, 제2 형광단백질로부터 나온 형광으로는 세포의 전체 모양과 세포수를 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항의 재조합 발현벡터 또는 제 6항의 형질전환 세포주를 포함하는, p53 종양 억제단백질의 활성에 관여하는 물질을 검색하기 위한 바이오센서.
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