KR102597698B1 - p-바디에 기반한 세포 내 단백질 간의 상호작용 분석 방법 - Google Patents
p-바디에 기반한 세포 내 단백질 간의 상호작용 분석 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 세포 내에서 단백질들 간의 상호작용을 분석하는 전략에 관한 것으로, 분석 대상 단백질들이 상호작용을 하게 되면 p-바디 위치에 집약되어 상호작용에 의한 형광 신호를 더욱 증폭시킬 수 있는바, 단백질의 상호작용을 훨씬 빠르고 정확하게 분석하고 정량화할 수 있다.
Description
본 발명은 세포 내에서 단백질들 간의 상호작용을 보다 빠르면서도 정확하게 분석하기 위한 전략에 관한 것이다.
생명체의 많은 기능들은 세포 내에 존재하는 다양한 단백질들 간의 상호작용(protein-protein interaction, PPI)을 통해 조절된다. 살아있는 세포 내에 존재하는 대부분의 단백질은 단일 분자가 아닌 다중 단백질 복합체로 존재하고 기능하기 때문에 위와 같은 단백질들 간의 상호작용이 모든 생물학적 과정에 핵심적이며, 전체 생명 현상의 근간이 된다. 그렇기 때문에 비정상적인 단백질 상호작용으로 인하여 암, 헌틴텅병, 낭포성 섬유증, 파킨슨병 등을 포함한 다양한 질병이 유발되기도 하고, 감염체와 숙주 세포의 단백질들 간의 상호작용으로 인하여 감염병이 유발되기도 한다. 따라서 단백질들 간의 상호작용을 조절하는 것이 다양한 질병의 새로운 치료 전략으로 관심을 받고 있다.
질병과 연관된 단백질들 간의 상호작용을 표적으로 하는 치료 전략은 해당 단백질의 기능 전체를 대상으로 하는 기존의 치료 전략에 비해서 선택적인 치료 효과를 기대할 수 있는 강점이 있다. 실제로 대형 제약회사에서 진행중인 파이프라인의 10 내지 20%가 단백질들 간의 상호작용을 표적으로 하고 있고, 이들 중에는 IC50가 100nM 이하로 효율성이 매우 높은 약물도 포함되어 있다.
한편, 종래에는 단백질들 간의 상호작용을 조절하는 물질을 선별하기 위해서는, 세포로부터 단백질을 분리 및 정제한 다음 생체 외(in vitro)에서 단백질들 간의 상호작용을 확인하는 방법을 사용하였다. 그러나 이와 같은 종래의 방법은 다양한 단백질의 복합적인 상호작용에 의해 일어나는 단백질들 간의 상호작용을 충분히 반영하지 못할 뿐만 아니라, 분리 및 정제된 단백질이 진핵 세포에서 수행되는 전사 후 변이(post-translation modification)를 충분히 반영하지 못하므로, 이와 같은 방법에 의해 선별된 물질은 대부분 실제 세포 내에서는 단백질들 간의 상호작용을 조절하는데 성공적이지 못하였다.
상기와 같은 단점을 극복하기 위하여, 현재 세포 내에서 실시간으로 단백질들 간의 상호작용을 확인할 수 있는 방법인 형광공명에너지전이(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) 및 이분자 형광 상보법(Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC) 등에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 상기 FRET는 단백질들 간의 상호작용에 대한 신뢰도가 높을 수 있으나, 고가의 장비를 필요로 하고, 형광의 민감도가 낮다. 또한 상기 BiFC는 단백질들 간의 상호작용 그 자체뿐만 아니라, 그러한 상호작용이 일어나는 세포 내의 위치까지 확인할 수 있다는 장점이 존재하지만, 형광단백질의 말단에 대한 최적의 결합 쌍을 제작하기 위해서는 적어도 8가지의 결합 쌍을 제작하고, 선별하여야 한다는 단점이 존재한다.
이에, 위와 같은 종래 기술의 단점을 보완하면서 단백질들 간의 상호작용을 빠르고 정확하면서도, 동시에 정량적으로 분석할 수 있는 기술에 대한 연구가 여전히 필요한 실정이다.
본 발명의 일 목적은 세포 내에서 단백질 간의 상호작용을 고속 및 고효율로 분석함과 동시에 정량적으로 분석하는데 이용될 수 있는 벡터 및 벡터 키트를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기와 같은 벡터 또는 키트를 이용하여 세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하는 방법 및 단백질 간의 상호작용에 관여하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 제1 단백질을 암호화 하는 유전자, p-바디(p-body) 위치화 신호 펩티드를 암호화 하는 유전자 및 제1 형광 단백질을 암호화 하는 유전자를 포함하는 제1 유전자 컨스트럭트;를 포함하는 세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하기 위한 벡터를 제공한다.
상기 세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하기 위한 벡터는, 제2 단백질을 암호화 하는 유전자 및 제2 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트;를 더 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 다른 측면은 제1 단백질을 암호화 하는 유전자, p-바디 위치화 신호 펩티드를 암호화 하는 유전자 및 제1 형광 단백질을 암호화 하는 유전자를 포함하는 제1 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터; 및 제2 단백질을 암호화 하는 유전자 및 제2 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트를 포함하는 별도의 벡터;를 포함하는 세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하기 위한 벡터 키트를 제공한다.
또한 본 발명의 또 다른 측면은 상기 벡터, 또는 벡터 키트를 세포 내에 형질전환시키는 단계; 상기 세포 내에서 제1 유전자 컨스트럭트 및 제2 유전자 컨스트럭트를 발현시키는 단계; 및 상기 세포 내의 p-바디 위치에서 상기 제1 형광 단백질과 상기 제2 형광 단백질의 형광 신호를 측정하는 단계;를 포함하는 세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명의 또 다른 측면은 상기 벡터 또는 벡터 키트를 세포 내에 형질전환 시키는 단계; 상기 세포 내에서 제1 유전자 컨스트럭트 및 제2 유전자 컨스트럭트를 발현시키는 단계; 및 상기 세포 내의 p-바디 위치에서 상기 제1 형광 단백질과 상기 제2 형광 단백질의 형광 신호를 측정하는 단계; 상기 형광 신호가 측정된 세포에, 단백질 간의 상호작용에 관여할 것으로 예상되는 후보 물질을 처리하는 단계;를 포함하는, 단백질 간의 상호작용에 관여하는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 분석 대상 단백질들이 p-바디 위치에 집약되어 상호작용을 일으키기 때문에, 형광 신호가 더욱 증폭되는바, 단백질들 간의 상호작용을 훨씬 빠르고 정확하게 분석하고 정량화할 수 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 FKBP12(FK506-binding protein 12)와 FRB(FKBP12-rapamycin-binding protein)간의 상호작용을 확인하기 위한 벡터 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 형광현미경을 이용하여 FKBP12 및 FRB간의 상호작용을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3의 A 및 B는 세포의 p-바디 위치에서 FKBP12와 FRB간의 상호작용 시 실시간으로 발현되는 형광 세기의 측정값을 시간 단위로 나타낸 것이다.
도 4는 p53과 MDM2(Mouse double minute 2 homolog, E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2)간의 상호작용을 확인하기 위한 벡터 모식도를 나타낸 것이다.
도 5는 현미경을 이용하여 p53과 MDM2간의 상호작용을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 p-바디 위치에서 p53과 MDM2간의 상호작용 저해제인 Nutlin-3 및 Nutlin-3의 비활성 유사물질인 cmpd7에 의해 나타나는 적색 형광 세기를 측정하여 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 7 및 도 8은 도 6의 Nutlin-3 및 cmpd7에 의한 현미경 분석 결과를 검증하기 위하여, 세포 내에서 Nutlin-3 및 cmpd7에 의한 p53 단백질 양의 변화를 웨스턴 블롯 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 형광현미경을 이용하여 FKBP12 및 FRB간의 상호작용을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3의 A 및 B는 세포의 p-바디 위치에서 FKBP12와 FRB간의 상호작용 시 실시간으로 발현되는 형광 세기의 측정값을 시간 단위로 나타낸 것이다.
도 4는 p53과 MDM2(Mouse double minute 2 homolog, E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2)간의 상호작용을 확인하기 위한 벡터 모식도를 나타낸 것이다.
도 5는 현미경을 이용하여 p53과 MDM2간의 상호작용을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 p-바디 위치에서 p53과 MDM2간의 상호작용 저해제인 Nutlin-3 및 Nutlin-3의 비활성 유사물질인 cmpd7에 의해 나타나는 적색 형광 세기를 측정하여 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 7 및 도 8은 도 6의 Nutlin-3 및 cmpd7에 의한 현미경 분석 결과를 검증하기 위하여, 세포 내에서 Nutlin-3 및 cmpd7에 의한 p53 단백질 양의 변화를 웨스턴 블롯 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1.
세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하기 위한 벡터
본 발명의 일 측면은 세포 내 단백질 간의 상호작용(protein-protein interaction, PPI)을 분석하기 위한 벡터를 제공한다.
본 발명의 상기 벡터는 제1 유전자 컨스트럭트를 포함한다.
상기 제1 유전자 컨스트럭트는 제1 단백질을 암호화 하는 유전자, p-바디 위치화 신호 펩티드를 암호화 하는 유전자 및 제1 형광 단백질을 암호화 하는 유전자를 포함한다.
본 발명의 상기 벡터는 제2 유전자 컨스트럭트를 더 포함할 수 있다.
상기 제2 유전자 컨스트럭트는 제2 단백질을 암호화하는 유전자 및 제2 형광단백질을 암호화하는 유전자를 포함한다.
상기 벡터는 상기 제1 유전자 컨스트럭트에 포함되어 있는, 제1 단백질, p-바디 위치화 신호 펩티드 및 제1 형광 단백질이 융합된 제1 융합 단백질이 발현되도록 한다. 또한 상기 벡터는 상기 제1 유전자 컨스트럭트로부터 생성된 융합 단백질과 별도로, 상기 제2 유전자 컨스트럭트에 포함되어 있는 제2 단백질과 제2 형광단백질이 융합된 제2 융합 단백질이 발현되도록 할 수 있다.
상기 제1 유전자 컨스트럭트에 포함되는 제1 단백질을 암호화하는 유전자는 본 발명에서 분석하고자 하는 상호작용을 일으키는 단백질들 중 하나를 암호화하는 염기 서열로서, 예를 들어 단백질들 간의 상호작용을 일으키는 바이트(bait) 단백질을 암호화하는 염기 서열일 수 있다.
상기 제1 단백질은 항체, 유사항체, 상호작용 단백질, 리간드 단백질, 의약 표적 단백질 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한 상기 제1 단백질은 자연형의 단백질뿐만 아니라, 분석하고자 하는 단백질의 도메인 또는 폴리펩티드의 일부일 수 있다.
상기 p-바디 위치화 신호 펩티드를 암호화하는 유전자는 세포 내에서 상기 제1 단백질을 포함하는 제1 융합 단백질이 p-바디로 위치화될 수 있도록 하는 펩티드를 암호화하는 유전자이다. 상기 p-바디 위치화 신호 펩티드는, 상기 제1 융합 단백질을 p-바디로 위치화시킬 수 있는 것이라면 한정 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 p-바디 위치화 신호 펩티드는 MOV10(MOV10), EDC3(EDC3), EDC4(EDC4), TUT4(ZCCHC11), DHX9(DHX9), RENT1(UPF1), ZCHC3(ZCCHC3), ABC3F(APOBEC3F), NOP58(NOP58), MYO1C(MYO1C), IF4A3(EIF4A3), AGO2(AGO2), MYH10(MYH10), DCP2(DCP2), SMG7(SMG7), AGO1(AGO1), MYO1D(MYO1D), DDX6/p54/RCK(DDX6), NOP56(NOP56), LS14B(LSM14B), EIF4E2(EIF4E2), 4-ET(EIF4ENIF1), LS14A(LSM14A), IF2B2(IGF2BP2), DCP1B(DCP1B), PUM1(PUM1), DCP1A(DCP1A), IF2B1(IGF2BP1), HNRPU(HNRNPU), IF2B3(IGF2BP3), STAU2(STAU2), HNRPM(HNRNPM), ELAV1(ELAVL1), HNRPQ(SYNCRIP), ILF3(ILF3), CK1δ(CSNK1D), XRN1(XRN1), GW182(TNRC6A), TNRC6B(TNRC6B), TNRC6C(TNRC6C), LSM4(LSM4), LSM1(LSM1), LSM2(LSM2), LSM3(LSM3), LSM5(LSM5), LSM6(LSM6), LSM7(LSM7), CCR4/CNOT1(CNOT1), CNOT10(CNOT10), CNOT11(CNOT11), CNOT2(CNOT2), CNOT3(CNOT3), CNOT4(CNOT4), CNOT6(CNOT6), CNOT6L(CNOT6L), CNOT7(CNOT7), CNOT8(CNOT8), CNOT9(CNOT9), RBFOX1(RBFOX1), ANKHD1(ANKHD1), ANKRD17(ANKRD17), CEP192(CEP192), CPEB4(CPEB4), DVL3(DVL3), FAM193A(FAM193A), GIGYF2(GIGYF2), HELZ(HELZ), KIAA0232(KIAA0232), KIAA0355(KIAA0355), MARF1(MARF1), N4BP2(N4BP2), PATL1(PATL1), RNF219(RNF219), ST7(ST7), TMEM131(TMEM131), TNKS1BP1(TNKS1BP1), TTC17(TTC17), RS27A(RPS27A), SMCA5(SMARCA5), TOP2A(TOP2A), HSP72(HSPA2), SPTN1(SPTAN1), SMC1A(SMC1A), ACTBL(ACTBL2), SPTB2(SPTBN1), DHX15(DHX15), ARGI1(ARG1), TOP2B(TOP2B), RPF2(RPF2), S10A9(S100A9), DDX41(DDX41), KIF23(KIF23), ZA2G(AZGP1), DDX50(DDX50), SPB3(SERPINB3), SBSN(SBSN), BAZ1B(BAZ1B), SPB12(SERPINB12), U5S1(EFTUD2), RB15B(RBM15B), DDX10(DDX10), FABP5(FABP5), ADT2(SLC25A5), DMKN(DMKN), S10A8(S100A8), NCBP1(NCBP1), YTDC2(YTHDC2), NOL6(NOL6), SYF1(XAB2), PUF60(PUF60), RBM19(RBM19), WDR33(WDR33), PNRC1(PNRC1), ADT3(SLC25A6), MCM7(MCM7), GSDMA(GSDMA), HSPB1(HSPB1), LYSC(LYZ), DHX30(DHX30), BRX1(BRIX1), MEX3A(MEX3A), MSI1H(MSI1), RBM25(RBM25), UTP11(UTP11L), UTP15(UTP15), LEG7(LGALS7), XRCC5(XRCC5), ZCCHV(ZC3HAV1), DDX27(DDX27), NUMA1(NUMA1), DSG1(DSG1), DDX21(DDX21), DSC1(DSC1), NKRF(NKRF), SMC3(SMC3), RS3(RPS3), PIP(PIP), RL26(RPL26), NOG1(GTPBP4), PESC(PES1), ELAV2(ELAVL2), LAC2(IGLC2), RS16(RPS16), SF3B1(SF3B1), ZFR(ZFR), F120A(FAM120A), STRBP(STRBP), RBM15(RBM15), LMNB2(LMNB2), MK67I(NIFK), TRFE(TF), HNRPR(HNRNPR), LMNB1(LMNB1), ILF2(ILF2), H2AY(H2AFY), RBM28(RBM28), MATR3(MATR3), HNRCL(HNRNPCL1), APOA1(APOA1), XRCC6(XRCC6), RS4X(RPS4X), DDX18(DDX18), SAFB2(SAFB2), RBMX(RBMX), ATD3A(ATAD3A), HNRPC(HNRNPC), RMXL1(RBMXL1), ALBU(ALB) 등일 수 있고, 특히 MOV10(MOV10), EDC3(EDC3), EDC4(EDC4), TUT4(ZCCHC11), DHX9(DHX9), RENT1(UPF1), ZCHC3(ZCCHC3), ABC3F(APOBEC3F), NOP58(NOP58), MYO1C(MYO1C), IF4A3(EIF4A3), AGO2(AGO2), MYH10(MYH10), DCP2(DCP2), SMG7(SMG7), AGO1(AGO1), MYO1D(MYO1D), DDX6/p54/RCK(DDX6), NOP56(NOP56), LS14B(LSM14B), EIF4E2(EIF4E2), 4-ET(EIF4ENIF1), LS14A(LSM14A), IF2B2(IGF2BP2), DCP1B(DCP1B), PUM1(PUM1), DCP1A(DCP1A), IF2B1(IGF2BP1), HNRPU(HNRNPU), IF2B3(IGF2BP3), STAU2(STAU2), HNRPM(HNRNPM), ELAV1(ELAVL1), HNRPQ(SYNCRIP), ILF3(ILF3), CK1δ(CSNK1D), XRN1(XRN1), GW182(TNRC6A), TNRC6B(TNRC6B), TNRC6C(TNRC6C), LSM4(LSM4), LSM1(LSM1), LSM2(LSM2), LSM3(LSM3), LSM5(LSM5), LSM6(LSM6), LSM7(LSM7), CCR4/CNOT1(CNOT1), CNOT10(CNOT10), CNOT11(CNOT11), CNOT2(CNOT2), CNOT3(CNOT3), CNOT4(CNOT4), CNOT6(CNOT6), CNOT6L(CNOT6L), CNOT7(CNOT7), CNOT8(CNOT8), CNOT9(CNOT9), RBFOX1(RBFOX1), ANKHD1(ANKHD1), ANKRD17(ANKRD17), CEP192(CEP192), CPEB4(CPEB4), DVL3(DVL3), FAM193A(FAM193A), GIGYF2(GIGYF2), HELZ(HELZ), KIAA0232(KIAA0232), KIAA0355(KIAA0355), MARF1(MARF1), N4BP2(N4BP2), PATL1(PATL1), RNF219(RNF219), ST7(ST7), TMEM131(TMEM131), TNKS1BP1(TNKS1BP1), TTC17(TTC17) 등일 수 있으며, 본 발명의 구체적인 실시예들에서는 이들 중 대표적으로 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 DCP1A(DCP1A)를 이용하여 그 효과를 확인하였다.
상기 p-바디 위치화 신호 펩티드는 세포 내에서 발현된 뒤에 각각의 기능을 수행하기 위하여 p-바디에 위치화된다. 따라서 상기 p-바디 위치화 신호 펩티드는 상기 벡터 내 존재하는 제1 유전자 컨스트럭트로부터 발현된 제1 융합 단백질이 세포 내 존재하는 p-바디에 위치화하여 응집될 수 있도록 한다.
상기 제1 형광 단백질을 암호화하는 유전자는 세포 내에서 상기 제1 유전자 컨스트럭트로부터 발현된 제1 융합 단백질의 위치를 시각적으로 확인할 수 있는 역할을 수행한다. 상기 제1 형광 단백질은 특정 에너지에 반응하거나 자발적으로 형광을 낼 수 있는 폴리펩티드로서, GFP(Green Fluorescent Protein), EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), mGFP(modified green fluorescent protein), RFP(Red Fluorescent Protein), mRFP(Monomeric Red Fluorescent Protein), ERFP(Enhanced Red Fluorescent Protein), DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein), BFP(Blue Fluorescent Protein), EBFP(Enhanced Blue Fluorescent Protein), CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), ECFP(Enhanced Cyan Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), EYFP(Enhanced Yellow Fluorescent Protein), AzG(Azami Green), HcR(HcRed, Heteractis crispared fluorescent protein), BFP(Blue Fluorescent Protein) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제2 단백질을 암호화하는 유전자는 상기 제1 단백질과 상호작용을 일으키거나 상호작용을 일으킬 것으로 예상되는 프레이(prey) 단백질을 암호화하는 염기 서열일 수 있다.
상기 제2 단백질은 상기 제1 단백질과 상호작용하거나 상호작용할 것으로 예상되는 것이라면 제한없이 사용될 수 있다. 구체적으로, 항원, 상호작용 단백질, 리간드 결합 단백질, 의약 표적 단백질 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한 상기 제2 단백질 역시 자연형의 단백질뿐만 아니라, 상기 제1 단백질과의 상호작용에 관여하는 단백질의 도메인 또는 폴리펩티드의 일부일 수 있다.
상기 제2 형광단백질을 암호화하는 유전자는 상기 제2 유전자 컨스트럭트로부터 발현된 제2 융합 단백질의 세포 내 위치를 실시간으로 시각적으로 확인할 수 있는 역할을 수행한다. 상기 제2 형광단백질은 특정 에너지에 반응하거나 자발적으로 형광을 낼 수 있는 폴리펩티드라면 제한없이 사용될 수 있지만, 바람직하게는 단백질들 간의 상호작용의 시각화를 보다 용이하게 하기 위하여 상기 제1 융합 단백질의 제1 형광 단백질과는 상이한 형광을 나타내는 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, FKBP12의 1번째 내지 108번째 아미노산을 암호화하는 유전자(서열번호 5) 또는 p53의 N 말단의 1번째 내지 72번째 아미노산을 암호화하는 유전자(서열번호 7), Dcp1a를 암호화하는 유전자 및 GFP를 암호화하는 유전자를 포함하는 제1 유전자 컨스트럭트와 상기 FKBP12와 상호작용하는 FRB의 2019번째 내지 2114번째 아미노산을 암호화하는 유전자(서열번호 10), 또는 상기 p53과 상호작용하는 MDM2의 N 말단의 1번째 내지 119번째 아미노산을 암호화하는 유전자(서열번호 12) 및 mCherry를 암호화하는 유전자가 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트를 이용하여, 이들로부터 FKBP12과 FRB의 상호작용 및 p53과 MDM2의 상호작용이 모두 p-바디 위치에 집약됨을 확인하였다(도 2, 3, 5 및 6 참고).
상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파이지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 벡터는 본 발명의 상기 제1 유전자 컨스트럭트 및 제2 유전자 컨스트럭트로부터 암호화된 융합 단백질들을 발현하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 유도성 프로모터(Inducible promoter) 또는 구조성 프로모터(constitutive promoter)와 같은 프로모터(promoter), 터미네이터(terminator), 엔핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절서열, 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 목적에 따라 조합할 수 있다.
상기 유도성 프로모터는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화되는 것으로, 상기 외부 자극은 예를 들면 테트라사이클린(tetracycline) 또는 독소사이클린(doxycycline) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
2.
세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하기 위한 벡터 키트
본 발명의 또 다른 측면은 세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하기 위한 벡터 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 벡터 키트는 제1 단백질을 암호화 하는 유전자, p-바디 위치화 신호 펩티드를 암호화 하는 유전자 및 제1 형광 단백질을 암호화 하는 유전자를 포함하는 제1 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터와, 제2 단백질을 암호화하는 유전자 및 제2 형광단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트를 포함하는 별도의 벡터를 포함한다.
상기 제1 유전자 컨스트럭트 및 상기 제2 유전자 컨스트럭트는 상기 "1. 세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하기 위한 벡터 " 항목에서 설명한 바와 동일하고, 따라서 이에 대해서는 상기 항목에서의 설명을 원용하고 상세한 설명은 생략하도록 한다.
이와 같이, 제1 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터와 제2 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터가 별도로 제작되어 포함되는 경우, 보다 다양한 단백질들 간의 상호작용을 이미 제조된 여러 벡터들의 조합으로부터 확인할 수 있는바, 새롭게 벡터를 제작하여야 하는 번거로움을 덜 수 있을 뿐만 아니라, BiFC와 같이 최적의 형광의 세기를 발휘하는 결합쌍을 제작하고 선별하여야 하는 과정을 수행하지 않아도 된다는 장점이 있다. 예를 들어, A라는 제1 단백질과 상호작용하는 것으로 예상되는 B, C, D라는 제2 단백질이 있다고 한다면, A라는 제1 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 제1 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터와, B라는 제2 단백질을 암호화하는 유전자, C라는 제2 단백질을 암호화하는 유전자, D라는 제2 단백질을 암호화하는 유전자 각각을 포함하는 별도의 발현 벡터를 준비함으로써, 이들 벡터들의 조합만으로 A-B, A-C, 그리고 A-D 간의 상호작용을 확인할 수 있는 것이다.
상기 키트는 형광 단백질의 검출에 사용되는 당업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있으며, 필요에 따라 각 성분들을 혼합하는데 사용될 튜브, 웰 플레이트 등을 추가로 포함할 수 있다.
3.
세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하는 방법
본 발명의 다른 측면은 세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명의 세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하는 방법은 상기 "1. 세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하기 위한 벡터 " 항목에서 설명한 벡터 또는 상기 "2. 세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하기 위한 벡터 키트 " 항목에서 설명한 벡터 키트를 세포 내에 형질전환시키는 단계, 상기 세포 내에서 제1 유전자 컨스트럭트 및 제2 유전자 컨스트럭트를 발현시키는 단계 및 상기 세포 내의 p-바디 위치에서 상기 제1 형광 단백질과 상기 제2 형광 단백질의 형광 신호를 측정하는 단계를 포함한다.
이와 같이, 상기 벡터 또는 상기 벡터 키트의 제1 유전자 컨스트럭트 및 제2 유전자 컨스트럭트로부터 발현된 융합 단백질들 간의 상호작용이 p-바디 위치에서 집약적으로 일어남으로써 형광 신호가 더욱 증폭되고, 이렇게 증폭된 형광 신호를 측정함으로써 보다 정밀하고 정확하게 단백질들 간의 상호작용을 정량적으로 측정할 수 있다.
상기 벡터 또는 상기 벡터 키트를, 단백질들 간의 상호작용의 분석 목적에 따라 박테리아, 효모, 대장균, 진균류, 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 적절한 세포에 형질전환시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 세포는 불멸화된 동물 세포 등 일 수 있다. 이때, 세포의 종류에 따라 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.
본 발명의 상기 벡터의 도입 방법은 공지의 기술, 즉 열 충격법, 전기 충격법, 또는 리포펙타민(lipofectamine)과 같은 형질도입 시약(transfection reagent)등을 사용할 수 있다.
상기 형광 신호를 측정하는 단계는 형광 현미경, 유세포 분석기 또는 세포를 이미징하는 과정 없이 웰 자체에서 형광 강도를 측정해 신호를 분석할 수 있는 형광 마이크로플레이트 검사 등을 통해 수행될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, FBKP12의 1번째 내지 108번째 아미노산을 암호화하는 유전자(서열번호 5), Dcp1a를 암호화하는 유전자 및 GFP를 암호화하는 유전자를 포함하는 제1 유전자 컨스트럭트와 FRB의 2019번째 내지 2114번째 아미노산을 암호화하는 유전자(서열번호 10) 및 mCherry를 암호화하는 유전자가 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트를 이용하여, p-바디 위치에서 라파마이신에 의해 FKBP12와 FRB 간의 상호작용이 유도된 것을 확인하였다(도 2 및 도 3 참고). 또한 p53의 N 말단의 1번째 내지 72번째 아미노산을 암호화하는 유전자(서열번호 7), Dcp1a를 암호화하는 유전자 및 GFP를 암호화하는 유전자를 포함하는 제1 유전자 컨스트럭트와 MDM2의 N 말단의 1번째 내지 119번째 아미노산을 암호화하는 유전자(서열번호 12) 및 mCherry를 암호화하는 유전자가 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트를 이용하여, p-바디 위치에서 Nutlin-3에 의해 p53과 MDM2 간의 결합이 억제되고, Nutlin-3의 비활성 유사물질인 cmpd7에 의해서는 p53과 MDM2 간의 결합이 억제가 일어나지 않는 것을 확인하였다(도 5 및 도 6 참고).
본 발명의 상기 분석 방법은 세포 내에서 일어나는 단백질들 간의 상호작용을 실시간으로 모니터링 할 수 있을 뿐만 아니라, 세포 내 형광 신호가 p-바디에서 응집됨으로써 증폭되어 나타나므로 상기 단백질들 간의 상호작용을 정량적으로 측정해 낼 수 있다.
4.
단백질 간의 상호작용에 관여하는 물질의 스크리닝 방법
본 발명의 또 다른 측면은 단백질 간의 상호작용에 관여하는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 단백질 간의 상호작용에 관여하는 물질의 스크리닝 방법은 상기 "1. 세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하기 위한 벡터 "에서 설명한 벡터 또는 상기 "2. 세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하기 위한 벡터 키트 " 항목에서 설명한 벡터 키트를 세포에 형질전환 시키는 단계, 상기 세포 내에서 제1 유전자 컨스트럭트 및 제2 유전자 컨스트럭트를 발현시키는 단계, 상기 세포 내의 p-바디 위치에서 상기 제1 형광 단백질과 상기 제2 형광 단백질의 형광 신호를 측정하는 단계, 및 상기 형광 신호가 측정된 세포에, 단백질 간의 상호작용에 관여할 것으로 예상되는 후보 물질을 처리하는 단계를 포함한다.
상기 단백질들 간의 상호작용에 관여하는 물질의 스크리닝 방법은 벡터로부터 발현되는 융합 단백질들의 형광 신호의 측정을 통해 수행될 수 있기 때문에, 상기 단백질 간의 상호작용에 의한 형광 신호의 측정에 대해서는 상기 "3. 세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하는 방법 " 항목에서 설명한 바와 동일하므로, 상기 항목에서의 설명을 원용하고 상세한 설명은 생략하도록 한다.
상기 단백질들 간의 상호작용에 관여하는 물질은, 단백질들 상호 간의 결합을 유도하거나, 단백질들 상호 간의 결합을 방해하는, 직접적인 방식으로 작용할 수 있다. 또한 알로스테릭 자리(Allosteric site)에 결합함으로써 단백질 상호간의 결합을 유도하거나 방해하는, 간접적인 방식으로도 작용할 수 있다. 특히, 세포 내에서 일어나는 비정상적인 단백질들 간의 상호작용 또는 바이러스 등과 같은 감염체와 숙주 사이의 단백질들 간의 상호작용에 작용하여, 단백질들 간의 결합을 유도하거나 단백질들 간의 결합을 방해하는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 방법은 상기 후보 물질이 처리된 세포 내의 p-바디의 위치에서, 상기 제2 형광 단백질의 형광 신호의 변화를 측정하는 단계를 더 포함한다. 구체적으로, 상기 제2 형광 단백질이 p-바디 이외의 위치, 즉 세포질, 핵, 세포 소기관 등에 산재되어 있다가 p-바디로 응집되어 나타나는 형광 신호의 변화를 유도하는 후보 물질은, 단백질들 간의 결합을 유도하는 후보 물질로 선별될 수 있다. 또한, 상기 제2 형광 단백질이 p-바디 위치에 응집되어 있다가 p-바디 이외의 세포질, 핵 또는 다른 세포 소기관 등에 산재되어 나타나는 형광 신호의 변화를 유도하는 후보 물질은, 단백질들 간의 결합을 억제하는 후보 물질로 선별될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, FBKP12와 FRB 간의 결합을 유도하는 라파마이신을 처리하였을 때, 세포질에 산재되어 있던 제2 형광 신호(적색)가 p-바디 위치에 응집되어 나타나는 것을 확인하였으며(도 2 참고), p53과 MDM2 간의 상호작용을 억제하는 Nutlin-3를 처리하였을 때, p-바디 위치에 응집되어 나타나던 제2 형광 신호(적색)가 세포 전체에 분산(산재)되어 나타나는 것을 확인하였다(도 5 및 도 6 참고).
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되지 아니한다.
세포 내 FKBP12 및 FRB 간의 상호작용 분석
FKBP12와 mTOR(mammalian target of rapamycin)의 FRB 도메인은 라파마이신(rapamycin)에 의하여 결합되는 특징을 가지는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 FKBP12와 FRB 간의 라파마이신에 의한 상호작용을 확인함으로써, 본 발명의 단백질 간의 상호작용 분석 전략이 적용 가능한지 또는 유효성이 있는지에 대해 검증하였다.
[1-1]
벡터의 제조
FKBP12의 유전자, p-바디 위치화 펩티드인 Dcp1a의 유전자 및 GFP 형광 단백질의 유전자, FRB 유전자 및 mCherry 형광 단백질의 유전자를 하기 표 1과 같이 조합하여, 5개 그룹의, 제1 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터(제1 발현 벡터)와 제2 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터(제2 발현 벡터)를 제작하였다.
EcoRI 및 KpnI 제한효소로 절단된 pEGFP-C1(Takara Clonetech 社) 벡터에 Dcp1a 펩티드를 암호화하는 염기 서열(서열번호 2)을 삽입하여 그룹 1-1의 제1 발현 벡터를 제작하였다. 그런 다음, KpnI 제한효소로 다시 한번 상기 그룹 1-1의 제1 발현 벡터를 절단하고, 절단된 위치에 GS linker를 암호화하는 염기 서열(서열번호 4) 및 FKBP12의 1번째 내지 108번째 아미노산을 암호화하는 염기 서열(서열번호 5)을 삽입하여, 그룹 1-2 내지 1-5의 제1 발현 벡터를 제작하였다.
AgeI 및 XhoI 제한효소를 통해 EGFP를 암호화하는 염기 서열이 제거된 pEGFP-C1 벡터에 mCherry를 암호화하는 염기 서열(서열번호 9)을 삽입하여 그룹 1-2의 제2 발현 벡터를 제작하였다. 그런 다음, XhoI 제한효소를 이용하여 다시 한번 그룹 1-2의 제2 발현 벡터를 절단하고, FRB의 2019번째 내지 2114번째 아미노산을 암호화하는 염기 서열(서열번호 10)을 삽입하여, 그룹 1-1, 1-3 내지 1-5의 제2 발현 벡터를 제작하였다.
| 구분 | 제1 발현 벡터 | 제2 발현 벡터 |
| 그룹 1-1 | EGFP-Dcp1a | mCherry-FRB |
| 그룹 1-2 | EGFP-Dcp1a-FKBP12 | mCherry |
| 그룹 1-3 | EGFP-Dcp1a-FKBP12 | mCherry-FRB |
| 그룹 1-4 | EGFP-Dcp1a-FKBP12 | mCherry-FRB |
| 그룹 1-5 | EGFP-Dcp1a-FKBP12 | mCherry-FRB |
[1-2]
벡터의 형질전환
10% 우태아혈청이 포함된 DMEM 동물세포 배양용 배지에서 배양된 HeLa 세포를 12mm의 현미경용 커버 글래스(Marlenfeld GmbH 社)가 바닥에 놓여진 12웰 플레이트에 8 × 104 세포 개수로 분주한 뒤, 12시간 이상 부착 시켰다. 그런 다음, 상기 실시예 [1-1]에서 제작된 두 발현 벡터들의 조합으로 이루어진 상기 표 1의 5개 그룹의 벡터들을 각각 리포펙타민 3000 시약(Lipofectamine 3000 reagent)(Thermo Fisher Scientific 社)을 이용하여 형질전환시킨 다음, 24시간 동안 배양하여 상기 발현 벡터들로부터 융합 단백질들을 충분히 발현시켰다.
[1-3]
FKBP12 및 FRB 간의 상호작용 확인
상기 실시예 [1-2]에서 배양된 HeLa 세포들을 대상으로 형광현미경을 이용하여 HeLa 세포 내 FKBP12와 FRB 간의 상호작용을 확인하였다.
보다 구체적으로, 상기 실시예 [1-2]에서 배양된 각각의 그룹의 HeLa 세포들에 250nM의 라파마이신을 10분 동안 처리한 다음, 상기 HeLa 세포를 4% 포름알데히드로 5분 동안 고정화시키고, 상기 HeLa 세포가 존재하는 커버 글래스를 현미경용 슬라이드에 마운팅한 후 형광 현미경으로 관찰하였다. 이때, 상기 그룹 1-3의 두 발현 벡터를 형질전환한 HeLa 세포에는 라파마이신 대신에 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 처리하였고, 상기 그룹 5의 두 발현 벡터를 형질전환한 HeLa 세포에는 라파마이신을 처리하기 전에, FKBP12와 FRB의 결합 억제제인 25μM의 FK-506을 10분 동안 전처리하였다.
그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, 그룹 1-1, 1-2와, 라파마이신을 처리하지 않은 그룹 1-3에서는 녹색 형광만이 p-바디 위치에 응집되어 있는 것으로 관찰되었고, 적색 형광은 세포질 전반에 산재되어 있는 것으로 관찰되었다(도 2의 1 내지 3). 반면, 라파마이신을 처리한 그룹 1-4에서는 라파마이신에 의하여 FKBP12와 FRB의 결합이 유도되어 녹색 형광과 적색 형광이 모두 p-바디 위치에 응집되어 있는 것으로 관찰되었다(도 2의 4). 또한, FKBP12와 FRB의 결합 억제제인 FK-506을 전처리한 그룹 1-5에서는 p-바디 위치에 녹색 형광만이 관찰되고 적색 형광은 다시 세포질로 분산되는 것으로 확인되었다.
상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 전략에 기초하여 p-바디 위치에 응집된 형광 신호를 측정함으로써 보다 정밀하게 단백질들 간의 상호작용을 분석해 낼 수 있음은 물론, 나아가 이러한 본 발명의 전략이 단백질들 간의 상호작용을 유도하는 물질을 스크리닝해 내는데 응용될 수 있음을 알 수 있다.
[1-4]
p-바디 위치에서 형광 세기 변화의 실시간 분석
상기 실시예 [1-2]에서 배양된 실험군 1의 HeLa 세포에 2.5nM 또는 250nM의 라파마이신을 처리하면서, 상기 라파마이신을 처리하기 40초 전부터 라파마이신을 처리한 후 120초까지 각각 6.2초 (2.5nM 처리군) 또는 3.8초 (250nM 처리군)의 간격으로 p-바디 위치에서 관찰되는 녹색 및 적색 형광의 세기(intensity)의 변화를 형광 현미경으로 사진을 촬영하고, 촬영된 사진을 ZEN 2010 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 2.5nM의 라파마이신을 처리한 경우에는 라파마이신 처리 약 65초 후부터 p-바디 위치에서 적색 형광의 세기가 증가되는 것으로 확인되었는데(도 3의 B), 그 보다 더 높은 농도인 250nM의 라파마이신을 처리한 경우에는 p-바디 위치에서 라파마이신 처리 약 5초 후부터 적색 형광의 세기가 증가되었을 뿐만 아니라, 라파마이신 처리 약 12초 후 적색 형광의 세기가 최대로 증가되는 것으로 관찰되었다(도 3의 A). 이로부터, p-바디 위치의 적색 형광의 세기 변화는 라파마이신의 처리 농도에 따라 달라지는 것으로 확인되었다.
상기와 같은 결과로부터, 단백질들 간의 상호작용을 p-바디 위치로 집중시키는 본 발명의 전략이, 단백질들 간의 상호작용을 종래 기술에 비해 훨씬 빠른 시간 안에 실시간으로 정량할 수 있게 함은 물론, 실제로 세포 내의 역동적인 단백질들 간의 상호작용을 보다 정확하게 모사하는 것임을 알 수 있다.
세포 내 p53 및 MDM2 간의 상호작용 분석
암 억제 단백질인 p53은 E3 리가아제(ligase)인 MDM2와 결합하고, 유비퀴틴화되어 최종적으로 프로테아좀에 의해 분해되는 것으로 알려져 있다. 그리고 위와 같은 p53과 MDM2 간의 결합은 Nutlin-3에 의해 억제되는 것으로 알려져 있다. 이들 상호작용을 본 발명의 단백질들 간 상호작용 분석법에 적용해 보고 더불어 Nutlin-3나 Nutlin-3의 비활성 유사물질인 cmpd7에 의해 적절한 반응이 나타나는 지를 검증하였다.
[2-1]
벡터의 제조
p53의 유전자, p-바디 위치화 펩티드인 Dcp1a의 유전자 및 GFP 형광 단백질의 유전자, MDM2의 유전자 및 mCherry 형광 단백질의 유전자를 하기 표 2와 같이 조합하여, 4개 그룹의, 제1 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터(제1 발현 벡터)와 제2 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터(제2 발현 벡터)를 제작하였다.
EcoRI 및 KpnI 제한효소로 절단된 pEGFP-C1 벡터에 Dcp1a 펩티드를 암호화하는 염기 서열(서열번호 2)을 삽입하여 그룹 2-1의 제1 발현 벡터를 제작하였다. 그런 다음, KpnI 제한효소로 다시 한번 상기 그룹 2-1의 제1 발현 벡터를 절단하고, 절단된 위치에 GS linker를 암호화하는 염기 서열(서열번호 4) 및 p53의 N 말단의 1번째 내지 72번째 아미노산을 암호화하는 염기 서열(서열번호 7)을 삽입하여, 그룹 2-2 내지 2-4의 제1 발현 벡터를 제작하였다.
AgeI 및 XhoI 제한효소를 통해 EGFP를 암호화하는 염기 서열이 제거된 pEGFP-C1 벡터에 mCherry를 암호화하는 염기 서열(서열번호 9)을 삽입한 다음, XhoI 제한효소를 이용하여 다시 한번 상기 벡터를 절단하고, MDM2의 N 말단의 1번째 내지 119번째 아미노산을 암호화하는 염기 서열(서열번호 12)을 삽입하여, 그룹 2-1, 2-3 및 2-4의 제2 발현 벡터를 제작하였다.
| 구분 | 제1 발현 벡터 | 제2 발현 벡터 |
| 그룹 2-1 | EGFP-Dcp1a | mCherry-MDM2N |
| 그룹 2-2 | EGFP-Dcp1a-p53N | mCherry |
| 그룹 2-3 | EGFP-Dcp1a-p53N | mCherry-MDM2N |
| 그룹 2-4 | EGFP-Dcp1a-p53N | mCherry-MDM2N |
[2-2]
벡터의 형질전환
상기 실시예 [2-1]에서 제작된 두 발현 벡터들을 위 표 2와 같은 4개의 조합으로 HeLa 세포에 상기 실시예 [1-2]과 동일한 방법으로 형질전환시켰다.
또한, 10% 우태아혈청이 포함된 RPMI 1640 동물세포 배양용 배지에서 배양된 USOS 세포를 12mm의 현미경용 커버 글래스(Marlenfeld GmbH 社)가 바닥에 놓여진 12웰 플레이트에 9×104 세포 개수로 분주한 뒤, 12시간 이상 부착 시켰다. 그런 다음, 상기 그룹 2-3의 두 벡터를 각각 리포펙타민 3000 시약을 이용하여 형질전환시켰다. 그런 다음, 상기 형질전환된 HeLa 세포 및 USOS 세포를 24시간 동안 배양하여 상기 발현 벡터들로부터 융합 단백질들을 충분히 발현시켰다.
[2-3]
p53 및 MDM2 간의 상호작용 확인
상기 실시예 [2-2]에서 배양된 HeLa 세포들을 대상으로 형광현미경을 이용하여 HeLa 세포 내의 p-바디 위치에서 p53의 N 말단과 MDM2의 N 말단 간의 상호작용을 확인하였다.
보다 구체적으로, 상기 실시예 [2-2]에서 배양된 HeLa 세포들 중 그룹 2-4에만 1μM의 Nutlin-3을 30분 동안 처리하고, 나머지 HeLa 세포들에는 DMSO를 처리한 다음, 4% 포름알데히드로 10분 동안 고정화시키고, 12mm 현미경용 커버 글래스를 현미경용 슬라이드에 마운팅한 후 형광 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, 그룹 2-1, 2-2에서는 녹색 형광만이 p-바디 위치에 응집되어 있는 것으로 관찰되었고, 적색 형광은 세포 전체에 산재해 있는 것으로 관찰되었다(도 4의 1 및 2). Nutlin-3을 처리하지 않은 그룹 2-3의 경우에는 p-바디 위치에서 녹색 형광 및 적색 형광이 함께 관찰되었고, Nutlin-3가 처리된 그룹 2-4에서는 p-바디 위치에 녹색 형광만이 관찰되었으며, 적색 형광은 다시 세포 전체에 퍼져서 나타나는 것으로 확인되었다(도 4의 3 및 4).
상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 전략에 기초하여 p-바디 위치에 응집된 형광 신호를 측정함으로써 보다 정밀하게 단백질들 간의 상호작용을 분석해 낼 수 있음을 한번 더 확인했음은 물론, 나아가 이러한 본 발명의 전략이 단백질들 간의 상호작용을 억제하는 물질을 스크리닝해 내는데 응용될 수 있음을 알 수 있다.
[2-4]
p-바디 내 형광 세기의 정량적 측정
상기 실시예 [2-2]에서 배양된 U2OS 세포를 대상으로 형광현미경을 이용하여 U2OS 세포 내 p53의 N 말단과 MDM2의 N 말단 간의 상호작용을 확인하였다.
보다 구체적으로, 상기 실시예 [2-2]에서 배양된 U2OS 세포에, 1μM의 Nutlin-3와 Nutlin-3의 비활성 유사물질인 cmpd7을 각각 처리한 다음, 상기 U2OS 세포들을 4% 포름알데히드로 10분 동안 고정화시키고, 12mm 현미경용 커버 글래스를 현미경용 슬라이드 위에 마운팅한 후 형광 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 6에 도시된 바와 같이, Nutlin-3를 처리한 경우에는 p-바디 위치에서 적색 형광의 세기가 80% 정도 큰폭으로 감소된 반면, p53과 MDM2의 결합을 억제하는 활성이 없는 Nutlin-3의 비활성 유사물질인 cmpd7을 처리한 경우에는 p-바디 위치에서 적색 형광의 세기가 20% 정도로 소폭 감소하였다.
상기와 같은 결과로부터, 단백질들 간의 상호작용을 p-바디 위치로 집중시키는 본 발명이 전략을 통해 단백질들 간의 상호작용을 정량화하여 분석할 수 있음을 알 수 있다.
[2-5]
p53 및 MDM2 간의 상호작용 재검증
Nutlin-3에 의하여 p53과 MDM2 간의 상호작용이 억제되면 p53의 단백질의 양이 증가하는 것을 통하여, 상기 [2-4]에서의 Nutlin-3와 cmpd7의 효과가 실제로 세포 내 p53과 MDM2 간의 상호작용을 제대로 반영할 수 있는 것인지 여부를 간접적으로 분석하였다.
이때, U2OS 세포 내 존재하는 p53의 양은, p53에 특이적인 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다.
그 결과, 도 7 및 도 8에 도시된 바와 같이, Nutlin-3가 처리된 U2OS 세포 에서는 Nutlin-3에 의해 p53과 MDM2의 결합이 억제되어 p53의 분해가 억제됨으로써 p53 단백질이 분해되지 않고 증가되는 것으로 확인되었다(도 7, 도 8의 'Nutlin-3'). 그에 반해, cmpd7가 처리된 U2OS 세포에서는 p53과 MDM2의 결합이 억제되는 효과가 없기 때문에, 세포 내에 존재하는 p53 단백질 양의 증가가 거의 없는 것으로 확인되었다(도 7, 도 8의 'cmpd7').
상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 단백질들 간의 상호작용을 p-바디 위치로 집중시키는 본 발명의 전략이 실제로 세포 내에 존재하는 단백질들 간의 상호작용을 보다 정확하게 모사하는 것임을 알 수 있다.
이상에서 본 발명은 기재된 실시예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 청구범위에 속함은 당연한 것이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology
<120> A method for analysis of protein-protein interaction in cell
based on p-body
<130> 2018-DPA-2629
<160> 13
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 582
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Glu Ala Leu Ser Arg Ala Gly Gln Glu Met Ser Leu Ala Ala Leu
1 5 10 15
Lys Gln His Asp Pro Tyr Ile Thr Ser Ile Ala Asp Leu Thr Gly Gln
20 25 30
Val Ala Leu Tyr Thr Phe Cys Pro Lys Ala Asn Gln Trp Glu Lys Thr
35 40 45
Asp Ile Glu Gly Thr Leu Phe Val Tyr Arg Arg Ser Ala Ser Pro Tyr
50 55 60
His Gly Phe Thr Ile Val Asn Arg Leu Asn Met His Asn Leu Val Glu
65 70 75 80
Pro Val Asn Lys Asp Leu Glu Phe Gln Leu His Glu Pro Phe Leu Leu
85 90 95
Tyr Arg Asn Ala Ser Leu Ser Ile Tyr Ser Ile Trp Phe Tyr Asp Lys
100 105 110
Asn Asp Cys His Arg Ile Ala Lys Leu Met Ala Asp Val Val Glu Glu
115 120 125
Glu Thr Arg Arg Ser Gln Gln Ala Ala Arg Asp Lys Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Gln Ala Asn Gly Cys Ser Asp His Arg Pro Ile Asp Ile Leu Glu Met
145 150 155 160
Leu Ser Arg Ala Lys Asp Glu Tyr Glu Arg Asn Gln Met Gly Asp Ser
165 170 175
Asn Ile Ser Ser Pro Gly Leu Gln Pro Ser Thr Gln Leu Ser Asn Leu
180 185 190
Gly Ser Thr Glu Thr Leu Glu Glu Met Pro Ser Gly Ser Gln Asp Lys
195 200 205
Ser Ala Pro Ser Gly His Lys His Leu Thr Val Glu Glu Leu Phe Gly
210 215 220
Thr Ser Leu Pro Lys Glu Gln Pro Ala Val Val Gly Leu Asp Ser Glu
225 230 235 240
Glu Met Glu Arg Leu Pro Gly Asp Ala Ser Gln Lys Glu Pro Asn Ser
245 250 255
Phe Leu Pro Phe Pro Phe Glu Gln Leu Gly Gly Ala Pro Gln Ser Glu
260 265 270
Thr Leu Gly Val Pro Ser Ala Ala His His Ser Val Gln Pro Glu Ile
275 280 285
Thr Thr Pro Val Leu Ile Thr Pro Ala Ser Ile Thr Gln Ser Asn Glu
290 295 300
Lys His Ala Pro Thr Tyr Thr Ile Pro Leu Ser Pro Val Leu Ser Pro
305 310 315 320
Thr Leu Pro Ala Glu Ala Pro Thr Ala Gln Val Pro Pro Ser Leu Pro
325 330 335
Arg Asn Ser Thr Met Met Gln Ala Val Lys Thr Thr Pro Arg Gln Arg
340 345 350
Ser Pro Leu Leu Asn Gln Pro Val Pro Glu Leu Ser His Ala Ser Leu
355 360 365
Ile Ala Asn Gln Ser Pro Phe Arg Ala Pro Leu Asn Val Thr Asn Thr
370 375 380
Ala Gly Thr Ser Leu Pro Ser Val Asp Leu Leu Gln Lys Leu Arg Leu
385 390 395 400
Thr Pro Gln His Asp Gln Ile Gln Thr Gln Pro Leu Gly Lys Gly Ala
405 410 415
Met Val Ala Ser Phe Ser Pro Ala Ala Gly Gln Leu Ala Thr Pro Glu
420 425 430
Ser Phe Ile Glu Pro Pro Ser Lys Thr Ala Ala Ala Arg Val Ala Ala
435 440 445
Ser Ala Ser Leu Ser Asn Met Val Leu Ala Pro Leu Gln Ser Met Gln
450 455 460
Gln Asn Gln Asp Pro Glu Val Phe Val Gln Pro Lys Val Leu Ser Ser
465 470 475 480
Ala Ile Pro Val Ala Gly Ala Pro Leu Val Thr Ala Thr Thr Thr Ala
485 490 495
Val Ser Ser Val Leu Leu Ala Pro Ser Val Phe Gln Gln Thr Val Thr
500 505 510
Arg Ser Ser Asp Leu Glu Arg Lys Ala Ser Ser Pro Ser Pro Leu Thr
515 520 525
Ile Gly Thr Pro Glu Ser Gln Arg Lys Pro Ser Ile Ile Leu Ser Lys
530 535 540
Ser Gln Leu Gln Asp Thr Leu Ile His Leu Ile Lys Asn Asp Ser Ser
545 550 555 560
Phe Leu Ser Thr Leu His Glu Val Tyr Leu Gln Val Leu Thr Lys Asn
565 570 575
Lys Asp Asn His Asn Leu
580
<210> 2
<211> 1746
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atggaggcgc tgagtcgagc tgggcaggag atgagcctag cggccctgaa gcaacacgac 60
ccctatatca ccagcatcgc agacctcacg ggccaggtcg ctctgtacac cttctgcccc 120
aaggccaacc agtgggagaa gactgatata gaagggacct tattcgtata tcgaaggtca 180
gcttcccctt accatggttt taccattgtg aatcgactaa atatgcacaa tctagttgaa 240
ccagtgaata aagatttgga atttcagctc catgaaccat ttcttctgta tagaaatgca 300
agcttgtcga tatatagtat ctggttttat gacaagaatg actgtcaccg catagcaaaa 360
ctcatggctg atgtggtaga agaggagaca cggcgatccc agcaagctgc tcgggacaaa 420
cagagtccca gccaggccaa tggctgcagc gaccacaggc ccatcgacat cctggagatg 480
ctgagcagag ccaaggatga gtatgagagg aatcagatgg gtgactcaaa tatctccagc 540
cctgggttac agccaagcac tcagctctcc aatctgggaa gcaccgagac tctagaagaa 600
atgccctccg ggtcacagga taagtctgct ccatctggac acaagcatct gacggtagaa 660
gagttatttg gaacctcttt gccaaaggaa caaccagcag ttgtgggtct ggattcagaa 720
gaaatggaga ggttgccagg agatgcctcc cagaaagagc ccaattcatt cctaccattt 780
ccctttgagc agttaggagg agcccctcaa tcagaaaccc tgggtgtccc ttctgctgcc 840
caccattcag tccagcctga aatcaccacc ccggtgctaa tcactccagc ctccatcaca 900
cagtccaatg aaaagcatgc tccaacctac acaatcccgt tgagccctgt tctcagtccc 960
actctgccag ctgaagctcc tactgcacag gttcccccca gcttacctcg aaacagcacc 1020
atgatgcagg cagtgaagac cacgcctaga cagaggtctc cactcctgaa ccagccagtc 1080
cctgagctaa gccatgccag tctgattgcc aaccagagcc ccttcagggc cccattgaac 1140
gtgacgaaca cagctggcac atccctccca agcgttgatc ttctccagaa actcaggttg 1200
accccacagc atgaccaaat acagacacaa ccacttggga aaggtgcaat ggtagccagc 1260
ttttctccgg cagctggtca gctagccaca cctgagagct tcatagagcc tccctctaag 1320
acagcagcag caagagtggc ggcctcagcc tccctgagca acatggtgct tgctcccctt 1380
cagtctatgc agcagaacca ggatcctgaa gtatttgtgc agcctaaggt gttatccagt 1440
gccatcccgg ttgcaggcgc cccactggtt actgcaacga ccactgcagt gtcttcagtc 1500
ctgctggccc caagtgtttt ccagcagaca gttacaagat cttcggacct tgagaggaaa 1560
gccagctccc cttctcctct aactattgga acgccagaaa gtcagagaaa gccttccatt 1620
attctcagca agtctcagct ccaggataca ttaatacatc taataaagaa tgattccagc 1680
ttcctcagta cacttcatga agtctacttg caggttctga ccaagaacaa agacaaccac 1740
aaccta 1746
<210> 3
<211> 717
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFP
<400> 3
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GS linker
<400> 4
ggcggtggct ctggaggtgg tgggtccggc ggtggctct 39
<210> 5
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FKBP12
<400> 5
ggagtgcagg tggaaaccat ctccccagga gacgggcgca ccttccccaa gcgcggccag 60
acctgcgtgg tgcactacac cgggatgctt gaagatggaa agaaatttga ttcctcccgg 120
gacagaaaca agccctttaa gtttatgcta ggcaagcagg aggtgatccg aggctgggaa 180
gaaggggttg cccagatgag tgtgggtcag agagccaaac tgactatatc tccagattat 240
gcctatggtg ccactgggca cccaggcatc atcccaccac atgccactct cgtcttcgat 300
gtggagcttc taaaactgga attgtag 327
<210> 6
<211> 2871
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFP-Dcp1a-FKBP12
<400> 6
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720
ggactcagat ctcgagctca agcttcgaat tcaatggagg cgctgagtcg agctgggcag 780
gagatgagcc tagcggccct gaagcaacac gacccctata tcaccagcat cgcagacctc 840
acgggccagg tcgctctgta caccttctgc cccaaggcca accagtggga gaagactgat 900
atagaaggga ccttattcgt atatcgaagg tcagcttccc cttaccatgg ttttaccatt 960
gtgaatcgac taaatatgca caatctagtt gaaccagtga ataaagattt ggaatttcag 1020
ctccatgaac catttcttct gtatagaaat gcaagcttgt cgatatatag tatctggttt 1080
tatgacaaga atgactgtca ccgcatagca aaactcatgg ctgatgtggt agaagaggag 1140
acacggcgat cccagcaagc tgctcgggac aaacagagtc ccagccaggc caatggctgc 1200
agcgaccaca ggcccatcga catcctggag atgctgagca gagccaagga tgagtatgag 1260
aggaatcaga tgggtgactc aaatatctcc agccctgggt tacagccaag cactcagctc 1320
tccaatctgg gaagcaccga gactctagaa gaaatgccct ccgggtcaca ggataagtct 1380
gctccatctg gacacaagca tctgacggta gaagagttat ttggaacctc tttgccaaag 1440
gaacaaccag cagttgtggg tctggattca gaagaaatgg agaggttgcc aggagatgcc 1500
tcccagaaag agcccaattc attcctacca tttccctttg agcagttagg aggagcccct 1560
caatcagaaa ccctgggtgt cccttctgct gcccaccatt cagtccagcc tgaaatcacc 1620
accccggtgc taatcactcc agcctccatc acacagtcca atgaaaagca tgctccaacc 1680
tacacaatcc cgttgagccc tgttctcagt cccactctgc cagctgaagc tcctactgca 1740
caggttcccc ccagcttacc tcgaaacagc accatgatgc aggcagtgaa gaccacgcct 1800
agacagaggt ctccactcct gaaccagcca gtccctgagc taagccatgc cagtctgatt 1860
gccaaccaga gccccttcag ggccccattg aacgtgacga acacagctgg cacatccctc 1920
ccaagcgttg atcttctcca gaaactcagg ttgaccccac agcatgacca aatacagaca 1980
caaccacttg ggaaaggtgc aatggtagcc agcttttctc cggcagctgg tcagctagcc 2040
acacctgaga gcttcataga gcctccctct aagacagcag cagcaagagt ggcggcctca 2100
gcctccctga gcaacatggt gcttgctccc cttcagtcta tgcagcagaa ccaggatcct 2160
gaagtatttg tgcagcctaa ggtgttatcc agtgccatcc cggttgcagg cgccccactg 2220
gttactgcaa cgaccactgc agtgtcttca gtcctgctgg ccccaagtgt tttccagcag 2280
acagttacaa gatcttcgga ccttgagagg aaagccagct ccccttctcc tctaactatt 2340
ggaacgccag aaagtcagag aaagccttcc attattctca gcaagtctca gctccaggat 2400
acattaatac atctaataaa gaatgattcc agcttcctca gtacacttca tgaagtctac 2460
ttgcaggttc tgaccaagaa caaagacaac cacaacctag gcggtggctc tggaggtggt 2520
gggtccggcg gtggctctgg agtgcaggtg gaaaccatct ccccaggaga cgggcgcacc 2580
ttccccaagc gcggccagac ctgcgtggtg cactacaccg ggatgcttga agatggaaag 2640
aaatttgatt cctcccggga cagaaacaag ccctttaagt ttatgctagg caagcaggag 2700
gtgatccgag gctgggaaga aggggttgcc cagatgagtg tgggtcagag agccaaactg 2760
actatatctc cagattatgc ctatggtgcc actgggcacc caggcatcat cccaccacat 2820
gccactctcg tcttcgatgt ggagcttcta aaactggaat tgtagggtac c 2871
<210> 7
<211> 219
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p53 N
<400> 7
atggaggagc cgcagtcaga tcctagcgtc gagccccctc tgagtcagga aacattttca 60
gacctatgga aactacttcc tgaaaacaac gttctgtccc ccttgccgtc ccaagcaatg 120
gatgatttga tgctgtcccc ggacgatatt gaacaatggt tcactgaaga cccaggtcca 180
gatgaagctc ccagaatgcc agaggctgct cccccctga 219
<210> 8
<211> 2769
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFP-Dcp1a-p53N
<400> 8
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720
ggactcagat ctcgagctca agcttcgaat tcaatggagg cgctgagtcg agctgggcag 780
gagatgagcc tagcggccct gaagcaacac gacccctata tcaccagcat cgcagacctc 840
acgggccagg tcgctctgta caccttctgc cccaaggcca accagtggga gaagactgat 900
atagaaggga ccttattcgt atatcgaagg tcagcttccc cttaccatgg ttttaccatt 960
gtgaatcgac taaatatgca caatctagtt gaaccagtga ataaagattt ggaatttcag 1020
ctccatgaac catttcttct gtatagaaat gcaagcttgt cgatatatag tatctggttt 1080
tatgacaaga atgactgtca ccgcatagca aaactcatgg ctgatgtggt agaagaggag 1140
acacggcgat cccagcaagc tgctcgggac aaacagagtc ccagccaggc caatggctgc 1200
agcgaccaca ggcccatcga catcctggag atgctgagca gagccaagga tgagtatgag 1260
aggaatcaga tgggtgactc aaatatctcc agccctgggt tacagccaag cactcagctc 1320
tccaatctgg gaagcaccga gactctagaa gaaatgccct ccgggtcaca ggataagtct 1380
gctccatctg gacacaagca tctgacggta gaagagttat ttggaacctc tttgccaaag 1440
gaacaaccag cagttgtggg tctggattca gaagaaatgg agaggttgcc aggagatgcc 1500
tcccagaaag agcccaattc attcctacca tttccctttg agcagttagg aggagcccct 1560
caatcagaaa ccctgggtgt cccttctgct gcccaccatt cagtccagcc tgaaatcacc 1620
accccggtgc taatcactcc agcctccatc acacagtcca atgaaaagca tgctccaacc 1680
tacacaatcc cgttgagccc tgttctcagt cccactctgc cagctgaagc tcctactgca 1740
caggttcccc ccagcttacc tcgaaacagc accatgatgc aggcagtgaa gaccacgcct 1800
agacagaggt ctccactcct gaaccagcca gtccctgagc taagccatgc cagtctgatt 1860
gccaaccaga gccccttcag ggccccattg aacgtgacga acacagctgg cacatccctc 1920
ccaagcgttg atcttctcca gaaactcagg ttgaccccac agcatgacca aatacagaca 1980
caaccacttg ggaaaggtgc aatggtagcc agcttttctc cggcagctgg tcagctagcc 2040
acacctgaga gcttcataga gcctccctct aagacagcag cagcaagagt ggcggcctca 2100
gcctccctga gcaacatggt gcttgctccc cttcagtcta tgcagcagaa ccaggatcct 2160
gaagtatttg tgcagcctaa ggtgttatcc agtgccatcc cggttgcagg cgccccactg 2220
gttactgcaa cgaccactgc agtgtcttca gtcctgctgg ccccaagtgt tttccagcag 2280
acagttacaa gatcttcgga ccttgagagg aaagccagct ccccttctcc tctaactatt 2340
ggaacgccag aaagtcagag aaagccttcc attattctca gcaagtctca gctccaggat 2400
acattaatac atctaataaa gaatgattcc agcttcctca gtacacttca tgaagtctac 2460
ttgcaggttc tgaccaagaa caaagacaac cacaacctag gcggtggctc tggaggtggt 2520
gggtccggcg gtggctctgg taccatggag gagccgcagt cagatcctag cgtcgagccc 2580
cctctgagtc aggaaacatt ttcagaccta tggaaactac ttcctgaaaa caacgttctg 2640
tcccccttgc cgtcccaagc aatggatgat ttgatgctgt ccccggacga tattgaacaa 2700
tggttcactg aagacccagg tccagatgaa gctcccagaa tgccagaggc tgctcccccc 2760
tgaggtacc 2769
<210> 9
<211> 708
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCherry
<400> 9
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaag 708
<210> 10
<211> 291
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FRB
<400> 10
gtggccatcc tctggcatga gatgtggcat gaaggcctgg aagaggcatc tcgtttgtac 60
tttggggaaa ggaacgtgaa aggcatgttt gaggtgctgg agcccttgca tgctatgatg 120
gaacggggcc cccagactct gaaggaaaca tcctttaatc aggcctatgg tcgagattta 180
atggaggccc aagagtggtg caggaagtac atgaaatcag ggaatgtcaa ggacctcacc 240
caagcctggg acctctatta tcatgtgttc cgacgaatct caaagcagta g 291
<210> 11
<211> 1065
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCherry-FRB
<400> 11
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta cgaattacat 720
atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgggatc ctctcgaggt ggccatcctc 780
tggcatgaga tgtggcatga aggcctggaa gaggcatctc gtttgtactt tggggaaagg 840
aacgtgaaag gcatgtttga ggtgctggag cccttgcatg ctatgatgga acggggcccc 900
cagactctga aggaaacatc ctttaatcag gcctatggtc gagatttaat ggaggcccaa 960
gagtggtgca ggaagtacat gaaatcaggg aatgtcaagg acctcaccca agcctgggac 1020
ctctattatc atgtgttccg acgaatctca aagcagtagc tcgag 1065
<210> 12
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MDM2 N
<400> 12
atgtgcaata ccaacatgtc tgtacctact gatggtgctg taaccacctc acagattcca 60
gcttcggaac aagagaccct ggttagacca aagccattgc ttttgaagtt attaaagtct 120
gttggtgcac aaaaagacac ttatactatg aaagaggttc ttttttatct tggccagtat 180
attatgacta aacgattata tgatgagaag caacaacata ttgtatattg ttcaaatgat 240
cttctaggag atttgtttgg cgtgccaagc ttctctgtga aagagcacag gaaaatatat 300
accatgatct acaggaactt ggtagtagtc aatcagcagg aatcatcgga ctcaggttga 360
360
<210> 13
<211> 1134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCherry-MDM2 N
<400> 13
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta cgaattacat 720
atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgggatc ctctcgagat gtgcaatacc 780
aacatgtctg tacctactga tggtgctgta accacctcac agattccagc ttcggaacaa 840
gagaccctgg ttagaccaaa gccattgctt ttgaagttat taaagtctgt tggtgcacaa 900
aaagacactt atactatgaa agaggttctt ttttatcttg gccagtatat tatgactaaa 960
cgattatatg atgagaagca acaacatatt gtatattgtt caaatgatct tctaggagat 1020
ttgtttggcg tgccaagctt ctctgtgaaa gagcacagga aaatatatac catgatctac 1080
aggaacttgg tagtagtcaa tcagcaggaa tcatcggact caggttgact cgag 1134
Claims (9)
- 제1 단백질을 암호화 하는 유전자, p-바디 위치화 신호 펩티드를 암호화 하는 유전자 및 제1 형광 단백질을 암호화 하는 유전자를 포함하는 제1 유전자 컨스트럭트;를 포함하는, 세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하기 위한 벡터.
- 청구항 1에 있어서,
상기 p-바디 위치화 신호 펩티드는 MOV10(MOV10), EDC3(EDC3), EDC4(EDC4), TUT4(ZCCHC11), DHX9(DHX9), RENT1(UPF1), ZCHC3(ZCCHC3), ABC3F(APOBEC3F), NOP58(NOP58), MYO1C(MYO1C), IF4A3(EIF4A3), AGO2(AGO2), MYH10(MYH10), DCP2(DCP2), SMG7(SMG7), AGO1(AGO1), MYO1D(MYO1D), DDX6/p54/RCK(DDX6), NOP56(NOP56), LS14B(LSM14B), EIF4E2(EIF4E2), 4-ET(EIF4ENIF1), LS14A(LSM14A), IF2B2(IGF2BP2), DCP1B(DCP1B), PUM1(PUM1), DCP1A(DCP1A), IF2B1(IGF2BP1), HNRPU(HNRNPU), IF2B3(IGF2BP3), STAU2(STAU2), HNRPM(HNRNPM), ELAV1(ELAVL1), HNRPQ(SYNCRIP), ILF3(ILF3), CK1δ(CSNK1D), XRN1(XRN1), GW182(TNRC6A), TNRC6B(TNRC6B), TNRC6C(TNRC6C), LSM4(LSM4), LSM1(LSM1), LSM2(LSM2), LSM3(LSM3), LSM5(LSM5), LSM6(LSM6), LSM7(LSM7), CCR4/CNOT1(CNOT1), CNOT10(CNOT10), CNOT11(CNOT11), CNOT2(CNOT2), CNOT3(CNOT3), CNOT4(CNOT4), CNOT6(CNOT6), CNOT6L(CNOT6L), CNOT7(CNOT7), CNOT8(CNOT8), CNOT9(CNOT9), RBFOX1(RBFOX1), ANKHD1(ANKHD1), ANKRD17(ANKRD17), CEP192(CEP192), CPEB4(CPEB4), DVL3(DVL3), FAM193A(FAM193A), GIGYF2(GIGYF2), HELZ(HELZ), KIAA0232(KIAA0232), KIAA0355(KIAA0355), MARF1(MARF1), N4BP2(N4BP2), PATL1(PATL1), RNF219(RNF219), ST7(ST7), TMEM131(TMEM131), TNKS1BP1(TNKS1BP1), TTC17(TTC17), RS27A(RPS27A), SMCA5(SMARCA5), TOP2A(TOP2A), HSP72(HSPA2), SPTN1(SPTAN1), SMC1A(SMC1A), ACTBL(ACTBL2), SPTB2(SPTBN1), DHX15(DHX15), ARGI1(ARG1), TOP2B(TOP2B), RPF2(RPF2), S10A9(S100A9), DDX41(DDX41), KIF23(KIF23), ZA2G(AZGP1), DDX50(DDX50), SPB3(SERPINB3), SBSN(SBSN), BAZ1B(BAZ1B), SPB12(SERPINB12), U5S1(EFTUD2), RB15B(RBM15B), DDX10(DDX10), FABP5(FABP5), ADT2(SLC25A5), DMKN(DMKN), S10A8(S100A8), NCBP1(NCBP1), YTDC2(YTHDC2), NOL6(NOL6), SYF1(XAB2), PUF60(PUF60), RBM19(RBM19), WDR33(WDR33), PNRC1(PNRC1), ADT3(SLC25A6), MCM7(MCM7), GSDMA(GSDMA), HSPB1(HSPB1), LYSC(LYZ), DHX30(DHX30), BRX1(BRIX1), MEX3A(MEX3A), MSI1H(MSI1), RBM25(RBM25), UTP11(UTP11L), UTP15(UTP15), LEG7(LGALS7), XRCC5(XRCC5), ZCCHV(ZC3HAV1), DDX27(DDX27), NUMA1(NUMA1), DSG1(DSG1), DDX21(DDX21), DSC1(DSC1), NKRF(NKRF), SMC3(SMC3), RS3(RPS3), PIP(PIP), RL26(RPL26), NOG1(GTPBP4), PESC(PES1), ELAV2(ELAVL2), LAC2(IGLC2), RS16(RPS16), SF3B1(SF3B1), ZFR(ZFR), F120A(FAM120A), STRBP(STRBP), RBM15(RBM15), LMNB2(LMNB2), MK67I(NIFK), TRFE(TF), HNRPR(HNRNPR), LMNB1(LMNB1), ILF2(ILF2), H2AY(H2AFY), RBM28(RBM28), MATR3(MATR3), HNRCL(HNRNPCL1), APOA1(APOA1), XRCC6(XRCC6), RS4X(RPS4X), DDX18(DDX18), SAFB2(SAFB2), RBMX(RBMX), ATD3A(ATAD3A), HNRPC(HNRNPC), RMXL1(RBMXL1) 및 ALBU(ALB)로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나인, 세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하기 위한 벡터.
- 청구항 1에 있어서,
상기 p-바디 위치화 신호 펩티드는 MOV10(MOV10), EDC3(EDC3), EDC4(EDC4), TUT4(ZCCHC11), DHX9(DHX9), RENT1(UPF1), ZCHC3(ZCCHC3), ABC3F(APOBEC3F), NOP58(NOP58), MYO1C(MYO1C), IF4A3(EIF4A3), AGO2(AGO2), MYH10(MYH10), DCP2(DCP2), SMG7(SMG7), AGO1(AGO1), MYO1D(MYO1D), DDX6/p54/RCK(DDX6), NOP56(NOP56), LS14B(LSM14B), EIF4E2(EIF4E2), 4-ET(EIF4ENIF1), LS14A(LSM14A), IF2B2(IGF2BP2), DCP1B(DCP1B), PUM1(PUM1), DCP1A(DCP1A), IF2B1(IGF2BP1), HNRPU(HNRNPU), IF2B3(IGF2BP3), STAU2(STAU2), HNRPM(HNRNPM), ELAV1(ELAVL1), HNRPQ(SYNCRIP), ILF3(ILF3), CK1δ(CSNK1D), XRN1(XRN1), GW182(TNRC6A), TNRC6B(TNRC6B), TNRC6C(TNRC6C), LSM4(LSM4), LSM1(LSM1), LSM2(LSM2), LSM3(LSM3), LSM5(LSM5), LSM6(LSM6), LSM7(LSM7), CCR4/CNOT1(CNOT1), CNOT10(CNOT10), CNOT11(CNOT11), CNOT2(CNOT2), CNOT3(CNOT3), CNOT4(CNOT4), CNOT6(CNOT6), CNOT6L(CNOT6L), CNOT7(CNOT7), CNOT8(CNOT8), CNOT9(CNOT9), RBFOX1(RBFOX1), ANKHD1(ANKHD1), ANKRD17(ANKRD17), CEP192(CEP192), CPEB4(CPEB4), DVL3(DVL3), FAM193A(FAM193A), GIGYF2(GIGYF2), HELZ(HELZ), KIAA0232(KIAA0232), KIAA0355(KIAA0355), MARF1(MARF1), N4BP2(N4BP2), PATL1(PATL1), RNF219(RNF219), ST7(ST7), TMEM131(TMEM131), TNKS1BP1(TNKS1BP1) 및 TTC17(TTC17)로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나인, 세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하기 위한 벡터.
- 청구항 1에 있어서,
제2 단백질을 암호화 하는 유전자 및 제2 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트를 더 포함하는, 세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하기 위한 벡터로서,
상기 제2 형광 단백질은 상기 제1 형광 단백질과 다른 종류의 형광 단백질인, 세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하기 위한 벡터.
- 삭제
- 청구항 1의 벡터; 및
제2 단백질을 암호화 하는 유전자 및 제2 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트를 포함하는 별도의 벡터;를 포함하는, 세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하기 위한 벡터 키트.
- 청구항 4의 벡터, 또는 청구항 6의 벡터 키트를 분리된 세포 내에 형질전환 시키는 단계;
상기 세포 내에서 제1 유전자 컨스트럭트 및 제2 유전자 컨스트럭트를 발현시키는 단계; 및
상기 세포 내의 p-바디 위치에서 상기 제1 형광 단백질과 상기 제2 형광 단백질의 형광 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, 세포 내 단백질 간의 상호작용을 분석하는 방법.
- 청구항 4의 벡터, 또는 청구항 6의 벡터 키트를 분리된 세포 내에 형질전환 시키는 단계;
상기 세포 내에서 제1 유전자 컨스트럭트 및 제2 유전자 컨스트럭트를 발현시키는 단계;
상기 세포 내의 p-바디 위치에서 상기 제1 형광 단백질과 상기 제2 형광 단백질의 형광 신호를 측정하는 단계; 및
상기 형광 신호가 측정된 세포에, 단백질 간의 상호작용에 관여할 것으로 예상되는 후보 물질을 처리하는 단계;를 포함하는, 단백질 간의 상호작용에 관여하는 물질의 스크리닝 방법.
- 청구항 8에 있어서,
상기 후보 물질이 처리된 세포 내의 p-바디의 위치에서, 상기 제2 형광 단백질의 형광 신호의 변화를 측정하는 단계;를 더 포함하는, 단백질 간의 상호작용에 관여하는 물질의 스크리닝 방법.
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180060565A KR102597698B1 (ko) | 2018-05-28 | 2018-05-28 | p-바디에 기반한 세포 내 단백질 간의 상호작용 분석 방법 |
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-
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