JP6955243B2 - ネクローシスの検出キット及びその使用 - Google Patents
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Description
[1]ネクローシスの検出方法であって、スプリットレポータータンパク質の一方を発現する第1の細胞と、前記スプリットレポータータンパク質の他方を発現する第2の細胞とを共培養する工程と、前記第1の細胞及び前記第2の細胞がネクローシスを起こした場合に、前記第1の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の一方が放出され、前記第2の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の他方が放出され、放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、を備え、前記スプリットレポータータンパク質は、2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質と、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質との組み合わせであり、前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質とが接触すると、前記第1のプロテインスプライシングドメインと前記第2のプロテインスプライシングドメインとがプロテインスプライシングを起こし、前記レポータータンパク質のN末端側領域と前記レポータータンパク質のC末端側領域とが結合して活性型のレポータータンパク質が形成される、方法。
[2]ネクローシスの検出方法であって、スプリットレポータータンパク質の一方を発現する細胞を培養する工程と、前記細胞の培地に前記スプリットレポータータンパク質の他方を添加する工程と、前記細胞がネクローシスを起こした場合に、前記細胞から放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と前記スプリットレポータータンパク質の他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、を備え、前記スプリットレポータータンパク質は、2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質と、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質との組み合わせであり、前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質とが接触すると、前記第1のプロテインスプライシングドメインと前記第2のプロテインスプライシングドメインとがプロテインスプライシングを起こし、前記レポータータンパク質のN末端側領域と前記レポータータンパク質のC末端側領域とが結合して活性型のレポータータンパク質が形成される、方法。
[3]前記レポータータンパク質が蛍光タンパク質又は酵素である、[1]又は[2]に記載の方法。
[4]前記第1のプロテインスプライシングドメインが配列番号1に記載のアミノ酸配列、又は配列番号1に記載のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、且つプロテインスプライシングを行う活性を有するドメインである、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]前記第2のプロテインスプライシングドメインが配列番号2に記載のアミノ酸配列、又は配列番号2に記載のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、且つプロテインスプライシングを行う活性を有するドメインである、[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6]癌細胞のネクローシスを誘導する抗癌剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、スプリットレポータータンパク質の一方を発現する第1の細胞と、前記スプリットレポータータンパク質の他方を発現する第2の細胞とを共培養する工程と、前記第1の細胞及び前記第2の細胞がネクローシスを起こした場合に、前記第1の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の一方が放出され、前記第2の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の他方が放出され、放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、検出されたレポータータンパク質の量が、対照と比較して増加していた場合に、前記被験物質は癌細胞のネクローシスを誘導する抗癌剤の候補であると判断する工程と、を備え、前記スプリットレポータータンパク質は、2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質と、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質との組み合わせであり、前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質とが接触すると、前記第1のプロテインスプライシングドメインと前記第2のプロテインスプライシングドメインとがプロテインスプライシングを起こし、前記レポータータンパク質のN末端側領域と前記レポータータンパク質のC末端側領域とが結合して活性型のレポータータンパク質が形成される、方法。
[7]癌細胞のネクローシスを誘導する抗癌剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、スプリットレポータータンパク質の一方を発現する細胞を培養する工程と、前記細胞の培地に前記スプリットレポータータンパク質の他方を添加する工程と、前記細胞がネクローシスを起こした場合に、前記細胞から放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と前記スプリットレポータータンパク質の他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、検出されたレポータータンパク質の量が、対照と比較して増加していた場合に、前記被験物質は癌細胞のネクローシスを誘導する抗癌剤の候補であると判断する工程と、を備え、前記スプリットレポータータンパク質は、2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質と、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質との組み合わせであり、
前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質とが接触すると、前記第1のプロテインスプライシングドメインと前記第2のプロテインスプライシングドメインとがプロテインスプライシングを起こし、前記レポータータンパク質のN末端側領域と前記レポータータンパク質のC末端側領域とが結合して活性型のレポータータンパク質が形成される、方法。
[8]放射線増感剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、スプリットレポータータンパク質の一方を発現する第1の細胞と、前記スプリットレポータータンパク質の他方を発現する第2の細胞とを共培養する工程と、前記第1の細胞及び前記第2の細胞に放射線を照射する工程と、前記第1の細胞及び前記第2の細胞がネクローシスを起こした場合に、前記第1の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の一方が放出され、前記第2の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の他方が放出され、放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、検出されたレポータータンパク質の量が、対照と比較して増加していた場合に、前記被験物質は放射線増感剤の候補であると判断する工程と、を備え、前記スプリットレポータータンパク質は、2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質と、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質との組み合わせであり、前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質とが接触すると、前記第1のプロテインスプライシングドメインと前記第2のプロテインスプライシングドメインとがプロテインスプライシングを起こし、前記レポータータンパク質のN末端側領域と前記レポータータンパク質のC末端側領域とが結合して活性型のレポータータンパク質が形成される、方法。
[9]放射線増感剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、スプリットレポータータンパク質の一方を発現する細胞を培養する工程と、前記細胞に放射線を照射する工程と、前記細胞の培地に前記スプリットレポータータンパク質の他方を添加する工程と、前記細胞がネクローシスを起こした場合に、前記細胞から放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と前記スプリットレポータータンパク質の他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、検出されたレポータータンパク質の量が、対照と比較して増加していた場合に、前記被験物質は放射線増感剤の候補であると判断する工程と、を備え、前記スプリットレポータータンパク質は、2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質と、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質との組み合わせであり、前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質とが接触すると、前記第1のプロテインスプライシングドメインと前記第2のプロテインスプライシングドメインとがプロテインスプライシングを起こし、前記レポータータンパク質のN末端側領域と前記レポータータンパク質のC末端側領域とが結合して活性型のレポータータンパク質が形成される、方法。
[10]放射線照射プロトコルの評価方法であって、スプリットレポータータンパク質の一方を発現する第1の細胞と、前記スプリットレポータータンパク質の他方を発現する第2の細胞とを共培養する工程と、前記第1の細胞及び前記第2の細胞に評価対象の放射線照射プロトコルで放射線を照射する工程と、前記第1の細胞及び前記第2の細胞がネクローシスを起こした場合に、前記第1の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の一方が放出され、前記第2の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の他方が放出され、放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、検出されたレポータータンパク質の量が、対照と比較して増加していた場合に、前記放射線照射プロトコルは癌細胞の治療効果が高いと評価する工程と、を備え、前記スプリットレポータータンパク質は、2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質と、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質との組み合わせであり、前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質とが接触すると、前記第1のプロテインスプライシングドメインと前記第2のプロテインスプライシングドメインとがプロテインスプライシングを起こし、前記レポータータンパク質のN末端側領域と前記レポータータンパク質のC末端側領域とが結合して活性型のレポータータンパク質が形成される、方法。
[11]放射線照射プロトコルの評価方法であって、スプリットレポータータンパク質の一方を発現する細胞を培養する工程と、前記細胞に評価対象の放射線照射プロトコルで放射線を照射する工程と、前記細胞の培地に前記スプリットレポータータンパク質の他方を添加する工程と、前記細胞がネクローシスを起こした場合に、前記細胞から放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と前記スプリットレポータータンパク質の他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、検出されたレポータータンパク質の量が、対照と比較して増加していた場合に、前記放射線照射プロトコルは癌細胞の治療効果が高いと評価する工程と、を備え、前記スプリットレポータータンパク質は、2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質と、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質との組み合わせであり、前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質とが接触すると、前記第1のプロテインスプライシングドメインと前記第2のプロテインスプライシングドメインとがプロテインスプライシングを起こし、前記レポータータンパク質のN末端側領域と前記レポータータンパク質のC末端側領域とが結合して活性型のレポータータンパク質が形成される、方法。
[12]ネクローシスの検出キットであって、2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質の発現ベクター、又は、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質の発現ベクター、を備え、前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質とが接触すると、前記第1のプロテインスプライシングドメインと前記第2のプロテインスプライシングドメインとがプロテインスプライシングを起こし、前記レポータータンパク質のN末端側領域と前記レポータータンパク質のC末端側領域とが結合して活性型のレポータータンパク質が形成される、キット。
[13]ネクローシスの検出キットであって、2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質を発現する細胞、又は、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質を発現する細胞、を備え、前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質とが接触すると、前記第1のプロテインスプライシングドメインと前記第2のプロテインスプライシングドメインとがプロテインスプライシングを起こし、前記レポータータンパク質のN末端側領域と前記レポータータンパク質のC末端側領域とが結合して活性型のレポータータンパク質が形成される、キット。
[14]ネクローシスの検出キットであって、2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質、又は、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質、を備え、前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質とが接触すると、前記第1のプロテインスプライシングドメインと前記第2のプロテインスプライシングドメインとがプロテインスプライシングを起こし、前記レポータータンパク質のN末端側領域と前記レポータータンパク質のC末端側領域とが結合して活性型のレポータータンパク質が形成される、キット。
1態様において、本発明は、ネクローシスの検出方法を提供する。
第1実施形態に係るネクローシスの検出方法は、スプリットレポータータンパク質の一方を発現する第1の細胞と、前記スプリットレポータータンパク質の他方を発現する第2の細胞とを共培養する工程と、前記第1の細胞及び前記第2の細胞がネクローシスを起こした場合に、前記第1の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の一方が放出され、前記第2の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の他方が放出され、放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、を備える。
第2実施形態に係るネクローシスの検出方法は、スプリットレポータータンパク質の一方を発現する細胞を培養する工程と、前記細胞の培地に前記スプリットレポータータンパク質の他方を添加する工程と、前記細胞がネクローシスを起こした場合に、前記細胞から放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と前記スプリットレポータータンパク質の他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、を備える。
1態様において、本発明は、抗癌剤のスクリーニング方法を提供する。
第1実施形態に係る抗癌剤のスクリーニング方法は、癌細胞のネクローシスを誘導する抗癌剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、スプリットレポータータンパク質の一方を発現する第1の細胞と、前記スプリットレポータータンパク質の他方を発現する第2の細胞とを共培養する工程と、前記第1の細胞及び前記第2の細胞がネクローシスを起こした場合に、前記第1の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の一方が放出され、前記第2の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の他方が放出され、放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、検出されたレポータータンパク質の量が、対照と比較して増加していた場合に、前記被験物質は癌細胞のネクローシスを誘導する抗癌剤の候補であると判断する工程と、を備える。
第2実施形態に係る抗癌剤のスクリーニング方法は、癌細胞のネクローシスを誘導する抗癌剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、スプリットレポータータンパク質の一方を発現する細胞を培養する工程と、前記細胞の培地に前記スプリットレポータータンパク質の他方を添加する工程と、前記細胞がネクローシスを起こした場合に、前記細胞から放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と前記スプリットレポータータンパク質の他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、検出されたレポータータンパク質の量が、対照と比較して増加していた場合に、前記被験物質は癌細胞のネクローシスを誘導する抗癌剤の候補であると判断する工程と、を備える。
1態様において、本発明は、放射線増感剤のスクリーニング方法を提供する。
第1実施形態に係る放射線増感剤のスクリーニング方法は、被験物質の存在下で、スプリットレポータータンパク質の一方を発現する第1の細胞と、前記スプリットレポータータンパク質の他方を発現する第2の細胞とを共培養する工程と、前記第1の細胞及び前記第2の細胞に放射線を照射する工程と、前記第1の細胞及び前記第2の細胞がネクローシスを起こした場合に、前記第1の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の一方が放出され、前記第2の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の他方が放出され、放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、検出されたレポータータンパク質の量が、対照と比較して増加していた場合に、前記被験物質は放射線増感剤の候補であると判断する工程と、を備える。
第2実施形態に係る放射線増感剤のスクリーニング方法は、被験物質の存在下で、スプリットレポータータンパク質の一方を発現する細胞を培養する工程と、前記細胞に放射線を照射する工程と、前記細胞の培地に前記スプリットレポータータンパク質の他方を添加する工程と、前記細胞がネクローシスを起こした場合に、前記細胞から放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と前記スプリットレポータータンパク質の他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、検出されたレポータータンパク質の量が、対照と比較して増加していた場合に、前記被験物質は放射線増感剤の候補であると判断する工程と、を備える。
1態様において、本発明は、放射線照射プロトコルの評価方法を提供する。
第1実施形態に係る放射線照射プロトコルの評価方法は、スプリットレポータータンパク質の一方を発現する第1の細胞と、前記スプリットレポータータンパク質の他方を発現する第2の細胞とを共培養する工程と、前記第1の細胞及び前記第2の細胞に評価対象の放射線照射プロトコルで放射線を照射する工程と、前記第1の細胞及び前記第2の細胞がネクローシスを起こした場合に、前記第1の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の一方が放出され、前記第2の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の他方が放出され、放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、検出されたレポータータンパク質の量が、対照と比較して増加していた場合に、前記放射線照射プロトコルは癌細胞の治療効果が高いと評価する工程と、を備える。
第2実施形態に係る放射線照射プロトコルの評価方法は、スプリットレポータータンパク質の一方を発現する細胞を培養する工程と、前記細胞に評価対象の放射線照射プロトコルで放射線を照射する工程と、前記細胞の培地に前記スプリットレポータータンパク質の他方を添加する工程と、前記細胞がネクローシスを起こした場合に、前記細胞から放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と前記スプリットレポータータンパク質の他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、検出されたレポータータンパク質の量が、対照と比較して増加していた場合に、前記放射線照射プロトコルは癌細胞の治療効果が高いと評価する工程と、を備える。
1態様において、本発明は、ネクローシスの検出キットを提供する。以下の第1実施形態〜第3実施形態のキットのいずれか1つ又は2つ以上を組み合わせて用いることにより、ネクローシスを効率的に検出することができる。
第1実施形態に係るネクローシスの検出キットは、2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質の発現ベクター、又は、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質の発現ベクター、を備える。
第2実施形態に係るネクローシスの検出キットは、2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質を発現する細胞、又は、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質を発現する細胞、を備える。
第3実施形態に係るネクローシスの検出キットは、2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質、又は、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質、を備える。
本実施形態のネクローシスの検出キットは、上述した第1実施形態〜第3実施形態のキットのいずれか1つ又は2つ以上の組み合わせであってもよい。
(スプリットレポータータンパク質の発現ベクターの作製)
ルシフェラーゼをレポータータンパク質とし、スプリットレポータータンパク質の発現ベクターを作製した。
(プロテインスプライシングの確認)
HeLa細胞の亜株であるChang細胞に、実験例1で作製したLucNタンパク質の発現ベクターを一過性に発現させた。一方で、Chang細胞に、LucCタンパク質の発現ベクターを一過性に発現させた。続いて、各細胞に細胞溶解用試薬を添加し、細胞内容物をそれぞれ抽出した。
(スプリットレポータータンパク質の安定発現細胞株の作製)
Chang細胞にLucNタンパク質の発現ベクターを導入した安定発現細胞株を作製した。また、Chang細胞にLucCタンパク質の発現ベクターを導入した安定発現細胞株を作製した。
Claims (14)
- ネクローシスの検出方法であって、
スプリットレポータータンパク質の一方を発現する第1の細胞と、前記スプリットレポータータンパク質の他方を発現する第2の細胞とを共培養する工程と、
前記第1の細胞及び前記第2の細胞がネクローシスを起こした場合に、前記第1の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の一方が放出され、前記第2の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の他方が放出され、放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、を備え、
前記スプリットレポータータンパク質は、2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質と、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質との組み合わせであり、
前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質とが接触すると、前記第1のプロテインスプライシングドメインと前記第2のプロテインスプライシングドメインとがプロテインスプライシングを起こし、前記レポータータンパク質のN末端側領域と前記レポータータンパク質のC末端側領域とが結合して活性型のレポータータンパク質が形成される、方法。 - ネクローシスの検出方法であって、
スプリットレポータータンパク質の一方を発現する細胞を培養する工程と、
前記細胞の培地に前記スプリットレポータータンパク質の他方を添加する工程と、
前記細胞がネクローシスを起こした場合に、前記細胞から放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と前記スプリットレポータータンパク質の他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、を備え、
前記スプリットレポータータンパク質は、2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質と、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質との組み合わせであり、
前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質とが接触すると、前記第1のプロテインスプライシングドメインと前記第2のプロテインスプライシングドメインとがプロテインスプライシングを起こし、前記レポータータンパク質のN末端側領域と前記レポータータンパク質のC末端側領域とが結合して活性型のレポータータンパク質が形成される、方法。 - 前記レポータータンパク質が蛍光タンパク質又は酵素である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記第1のプロテインスプライシングドメインが配列番号1に記載のアミノ酸配列、又は配列番号1に記載のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、且つプロテインスプライシングを行う活性を有するドメインである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のプロテインスプライシングドメインが配列番号2に記載のアミノ酸配列、又は配列番号2に記載のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、且つプロテインスプライシングを行う活性を有するドメインである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 癌細胞のネクローシスを誘導する抗癌剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下で、スプリットレポータータンパク質の一方を発現する第1の細胞と、前記スプリットレポータータンパク質の他方を発現する第2の細胞とを共培養する工程と、
前記第1の細胞及び前記第2の細胞がネクローシスを起こした場合に、前記第1の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の一方が放出され、前記第2の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の他方が放出され、放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、
検出されたレポータータンパク質の量が、対照と比較して増加していた場合に、前記被験物質は癌細胞のネクローシスを誘導する抗癌剤の候補であると判断する工程と、を備え、
前記スプリットレポータータンパク質は、2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質と、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質との組み合わせであり、
前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質とが接触すると、前記第1のプロテインスプライシングドメインと前記第2のプロテインスプライシングドメインとがプロテインスプライシングを起こし、前記レポータータンパク質のN末端側領域と前記レポータータンパク質のC末端側領域とが結合して活性型のレポータータンパク質が形成される、方法。 - 癌細胞のネクローシスを誘導する抗癌剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下で、スプリットレポータータンパク質の一方を発現する細胞を培養する工程と、
前記細胞の培地に前記スプリットレポータータンパク質の他方を添加する工程と、
前記細胞がネクローシスを起こした場合に、前記細胞から放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と前記スプリットレポータータンパク質の他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、
検出されたレポータータンパク質の量が、対照と比較して増加していた場合に、前記被験物質は癌細胞のネクローシスを誘導する抗癌剤の候補であると判断する工程と、を備え、
前記スプリットレポータータンパク質は、2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質と、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質との組み合わせであり、
前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質とが接触すると、前記第1のプロテインスプライシングドメインと前記第2のプロテインスプライシングドメインとがプロテインスプライシングを起こし、前記レポータータンパク質のN末端側領域と前記レポータータンパク質のC末端側領域とが結合して活性型のレポータータンパク質が形成される、方法。 - 放射線増感剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下で、スプリットレポータータンパク質の一方を発現する第1の細胞と、前記スプリットレポータータンパク質の他方を発現する第2の細胞とを共培養する工程と、
前記第1の細胞及び前記第2の細胞に放射線を照射する工程と、
前記第1の細胞及び前記第2の細胞がネクローシスを起こした場合に、前記第1の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の一方が放出され、前記第2の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の他方が放出され、放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、
検出されたレポータータンパク質の量が、対照と比較して増加していた場合に、前記被験物質は放射線増感剤の候補であると判断する工程と、を備え、
前記スプリットレポータータンパク質は、2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質と、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質との組み合わせであり、
前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質とが接触すると、前記第1のプロテインスプライシングドメインと前記第2のプロテインスプライシングドメインとがプロテインスプライシングを起こし、前記レポータータンパク質のN末端側領域と前記レポータータンパク質のC末端側領域とが結合して活性型のレポータータンパク質が形成される、方法。 - 放射線増感剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下で、スプリットレポータータンパク質の一方を発現する細胞を培養する工程と、
前記細胞に放射線を照射する工程と、
前記細胞の培地に前記スプリットレポータータンパク質の他方を添加する工程と、
前記細胞がネクローシスを起こした場合に、前記細胞から放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と前記スプリットレポータータンパク質の他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、
検出されたレポータータンパク質の量が、対照と比較して増加していた場合に、前記被験物質は放射線増感剤の候補であると判断する工程と、を備え、
前記スプリットレポータータンパク質は、2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質と、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質との組み合わせであり、
前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質とが接触すると、前記第1のプロテインスプライシングドメインと前記第2のプロテインスプライシングドメインとがプロテインスプライシングを起こし、前記レポータータンパク質のN末端側領域と前記レポータータンパク質のC末端側領域とが結合して活性型のレポータータンパク質が形成される、方法。 - 放射線照射プロトコルの評価方法であって、
スプリットレポータータンパク質の一方を発現する第1の細胞と、前記スプリットレポータータンパク質の他方を発現する第2の細胞とを共培養する工程と、
前記第1の細胞及び前記第2の細胞に評価対象の放射線照射プロトコルで放射線を照射する工程と、
前記第1の細胞及び前記第2の細胞がネクローシスを起こした場合に、前記第1の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の一方が放出され、前記第2の細胞から前記スプリットレポータータンパク質の他方が放出され、放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、
検出されたレポータータンパク質の量が、対照プロトコルで放射線を照射した場合と比較して増加していた場合に、前記放射線照射プロトコルは前記対照プロトコルと比較して癌細胞の治療効果が高いと評価する工程と、を備え、
前記スプリットレポータータンパク質は、2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質と、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質との組み合わせであり、
前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質とが接触すると、前記第1のプロテインスプライシングドメインと前記第2のプロテインスプライシングドメインとがプロテインスプライシングを起こし、前記レポータータンパク質のN末端側領域と前記レポータータンパク質のC末端側領域とが結合して活性型のレポータータンパク質が形成される、方法。 - 放射線照射プロトコルの評価方法であって、
スプリットレポータータンパク質の一方を発現する細胞を培養する工程と、
前記細胞に評価対象の放射線照射プロトコルで放射線を照射する工程と、
前記細胞の培地に前記スプリットレポータータンパク質の他方を添加する工程と、
前記細胞がネクローシスを起こした場合に、前記細胞から放出された前記スプリットレポータータンパク質の一方と前記スプリットレポータータンパク質の他方とが接触し、プロテインスプライシングを起こすことにより形成される、レポータータンパク質の存在を検出する工程と、
検出されたレポータータンパク質の量が、対照プロトコルで放射線を照射した場合と比較して増加していた場合に、前記放射線照射プロトコルは前記対照プロトコルと比較して癌細胞の治療効果が高いと評価する工程と、を備え、
前記スプリットレポータータンパク質は、2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質と、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質との組み合わせであり、
前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質とが接触すると、前記第1のプロテインスプライシングドメインと前記第2のプロテインスプライシングドメインとがプロテインスプライシングを起こし、前記レポータータンパク質のN末端側領域と前記レポータータンパク質のC末端側領域とが結合して活性型のレポータータンパク質が形成される、方法。 - ネクローシスの検出キットであって、
2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質の発現ベクター、及び
第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質の発現ベクター、を備え、
前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質とが接触すると、前記第1のプロテインスプライシングドメインと前記第2のプロテインスプライシングドメインとがプロテインスプライシングを起こし、前記レポータータンパク質のN末端側領域と前記レポータータンパク質のC末端側領域とが結合して活性型のレポータータンパク質が形成される、キット。 - ネクローシスの検出キットであって、
2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質を発現する細胞、及び
第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質を発現する細胞、を備え、
前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質とが接触すると、前記第1のプロテインスプライシングドメインと前記第2のプロテインスプライシングドメインとがプロテインスプライシングを起こし、前記レポータータンパク質のN末端側領域と前記レポータータンパク質のC末端側領域とが結合して活性型のレポータータンパク質が形成される、キット。 - ネクローシスの検出キットであって、
2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質、及び、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質を発現する細胞、又は
2つに分割されたレポータータンパク質のN末端側領域のC末端側に第1のプロテインスプライシングドメインが結合した第1の融合タンパク質を発現する細胞、及び、第2のプロテインスプライシングドメインのC末端側に前記レポータータンパク質のC末端側領域が結合した第2の融合タンパク質、を備え、
前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質とが接触すると、前記第1のプロテインスプライシングドメインと前記第2のプロテインスプライシングドメインとがプロテインスプライシングを起こし、前記レポータータンパク質のN末端側領域と前記レポータータンパク質のC末端側領域とが結合して活性型のレポータータンパク質が形成される、キット。
Priority Applications (1)
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JP2017033968A JP6955243B2 (ja) | 2017-02-24 | 2017-02-24 | ネクローシスの検出キット及びその使用 |
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2017
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