KR100711939B1 - 형질전환 세포주 및 재조합 바이러스를 이용한 스크리닝방법 - Google Patents

형질전환 세포주 및 재조합 바이러스를 이용한 스크리닝방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100711939B1
KR100711939B1 KR1020050133257A KR20050133257A KR100711939B1 KR 100711939 B1 KR100711939 B1 KR 100711939B1 KR 1020050133257 A KR1020050133257 A KR 1020050133257A KR 20050133257 A KR20050133257 A KR 20050133257A KR 100711939 B1 KR100711939 B1 KR 100711939B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gene
hif
cell line
recombinant
cis
Prior art date
Application number
KR1020050133257A
Other languages
English (en)
Inventor
민용기
이우길
김범태
김성환
허정녕
이혁
박상은
Original Assignee
한국화학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국화학연구원 filed Critical 한국화학연구원
Priority to KR1020050133257A priority Critical patent/KR100711939B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100711939B1 publication Critical patent/KR100711939B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0091—Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 형질전환 세포주 및 재조합 아데노바이러스를 이용한 스크리닝 방법에 관한 것으로, 구체적으로 전사 인자가 결합하는 시스-엘리먼트 (cis-element)를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 형질전환 세포주, 및 상기 시스-엘리먼트에 결합하는 전사 인자를 암호화하는 유전자와 형광 단백질을 암호화하는 유전자의 융합 유전자를 포함하는 재조합 바이러스를 함께 사용하여 특정 질병에 관여하는 물질을 검색하는 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 스크리닝 방법은 인위적인 오류 결과가 거의 없는 신속한 세포기반 스크리닝 방법을 제공하므로, 각종 질병의 메카니즘을 조절할 수 있는 물질을 경제적이고 신속하게 선별할 수 있을 뿐 아니라, 이들 물질이 관여하는 질병의 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

형질전환 세포주 및 재조합 바이러스를 이용한 스크리닝 방법 {SCREENING METHOD USING TRANSFORMANT AND RECOMBINANT VIRUS}
도 1은 저산소증 반응 요소 (Hypoxia Responsive Element, HRE) 염기서열을 포함한 올리고뉴클레오타이드가 라이게이즈 효소에 의해 반복적으로 연결되어 복합체를 형성한 것을 보여주는 전기영동 사진이고 (이때, M은 사이즈 마커; 1은 EPO (erythropoietin)에서 유래한 이중가닥 올리고뉴클레오타이드; 2는 VEGF (vascular endothelial growth factor)에서 유래한 이중가닥 올리고뉴클레오타이드; 및 3은 EPO 및 VEGF 유래의 이중가닥 올리고뉴클레오타이드를 혼합한 것이다.),
도 2는 내부 표준 벡터 pRL-CMV (Promega사)의 개열지도를 나타낸 것이고,
도 3은 배수화된 HRE 염기서열을 포함하는 재조합 벡터 클론을 포함하는 형질전환 세포주에 저산소증 유발물질인 DFO (deferoxamine mesylate)를 처리한 후 레닐라 루시퍼라아제의 발광도에 대한 반딧불이 (firefly) 루시퍼라아제의 발광도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고,
도 4는 재조합 벡터 pGL3-tata-HRE-FL의 개열지도를 나타낸 것이고,
도 5는 재조합 발현 벡터 pCMV-EGFP-HIF-1α의 개열지도를 나타낸 것이고,
도 6은 재조합 아데노바이러스 Ad-EGFP-HIF-1α의 제작과정을 포함한 개략도 이고,
도 7은 형질전환 세포주 HeLa/pGL3-tata-HRE-FL와 표준 세포주 HeLa/pRL-CMV를 혼합 배양한 후 이를 이용하여 HIF-1의 전사 활성에 영향을 주는 화합물을 스크리닝한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 8은 재조합 아데노바이러스 Ad-EGFP-HIF-1α와 GFP 단백질만을 생산하는 표준 아데노바이러스에 CoCl2를 처리한 경우, 저산소증에 의한 형광 단백질의 발현량을 비교한 그래프이고,
도 9는 본 발명의 스크리닝 방법이 EGFP-HIF-1α 융합 단백질의 발현량 변화뿐만 아니라 세포 내 이동을 정량적으로 측정할 수 있음을 보여 주는 형광 현미경 사진이며,
도 10은 재조합 아데노바이러스 Ad-EGFP-HIF-1α와 GFP 단백질만을 생산하는 표준 아데노바이러스에 YC-1과 CoCl2를 처리하여, 저산소증에 의한 형광 단백질의 발현량이 YC-1에 의해 감소함을 보여주는 그림이고,
도 11은 본 발명의 스크리닝 방법이 EGFP-HIF-1α 융합 단백질의 발현량 변화뿐만 아니라 세포 내 이동을 정량적으로 측정할 수 있음을 보여주는 스크리닝 그래프이고,
도 12는 형질전환 세포주 HeLa/pGL3-tata-HRE-FL 및 표준 세포주HeLa/pRL-CMV와 재조합 아데노바이러스 Ad-EGFP-HIF-1α를 통합하여 저산소증에 관여하는 물질을 다차원적으로 스크리닝하는 방법을 보여주는 개략도이다.
본 발명은 전사 인자가 결합하는 시스-엘리먼트 (cis-element)를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 형질전환 세포주, 및 상기 시스-엘리먼트에 결합하는 전사 인자를 암호화하는 유전자와 형광 단백질을 암호화하는 유전자의 융합 유전자를 포함하는 재조합 바이러스를 함께 사용하여 특정 질병에 관여하는 물질을 검색하는 스크리닝 방법에 관한 것이다.
진핵세포에 있어서 유전자의 발현은 세포 내의 복잡한 신호전달계와 밀접한 관련이 있는데 이러한 세포 내 신호는 유전자의 프로모터에 위치한 시스-엘리먼트 (cis-element)와 특이적으로 결합하는 전사 인자 (transcription factor)와 밀접한 관련이 있다.
이러한 특이적 전사 인자의 예로는 p53과 HIF-1 (hypoxia inducing factor-1) 등이 있으며, 이들은 세포 내외의 특이적 신호에 의해 활성화되고, 각각 세포성장/사멸과 신혈관형성을 유도할 수 있는 특이적 표적 유전자의 프로모터에 결합하여 유전자의 발현을 촉진한다.
예를 들어, 저산소증에 관여하는 전사인자인 HIF-1은 저산소증 유도성 인자 HIF-1α (hypoxia inducing factor-1α) 및 HIF-1β (ARNT)로 이루어진 이질 이량 체성 복합체로서, 저산소증 조건 하에서 저산소증 반응 요소 (hypoxia responsive element, HRE)를 인지한다 (문헌 [Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci,. 92, 5510-5514 (1995)] 및 [Gradin et al., Mol. Cell. Biol., 16, 5221-5231 (1996)] 참조).
산소를 이용한 호흡과정은 인간을 포함한 많은 생명체의 필수 현상으로서, 세포, 조직 또는 특정 장기에 산소 공급이 감소되는 저산소증 또는 혈액 공급이 차단되는 허혈증의 경우, 세포는 손상되거나 죽게 된다. 이때, 생체 내 세포는 낮은 산소환경에서 글리코겐 분해과정, 혈구 생성과정, 신혈관 생성과정, 침윤과정 등과 관련된 유전자의 전사를 활성화시킴으로써 적응하게 되는데, 상기 유전자들의 예로는 혈관 내피 성장인자 (VEGF), 에리스로포이에틴 (EPO), 여러 당분해 효소 및 유도성 산화 질소 신타제 등이 있으며, 이들은 모두 HRE를 함유하는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Guillemin and Krasnow, Cell, 89, 9-12 (1997)] 및 [Wenger and Gassmann, Biol. Chem., 378, 609-616 (1997)] 참조).
생체 내에서 HIF-1β의 양은 거의 일정한데 비해 HIF-1α의 양은 산소의 농도에 의해 결정되므로, 상기 저산소증 신호전달계는 HIF-1α에 의존적이다. 정상적인 산소농도 하에서 HIF-1α는 본 히펠-린다우-유비퀴틴 (von Hippel-Lindau(VHL)-ubiquitin) 의존성 단백질 분해과정에 의해 낮은 농도로 존재하지만 산소 농도가 낮아지면 상기 분해과정이 억제되어 HIF-1α의 농도가 크게 증가하고, HIF-1β와 결합하여 최종적으로 표적 유전자의 발현을 활성화시킨다.
암세포의 성장과정에서 암세포는 과다분열의 결과 국지적인 저산소 상태를 유발하게 되므로, 이 과정에서 활성화된 HIF-1이 산소공급을 원활히 하기 위해 혈관 생성을 촉진하는 유전자를 활성화시켜 신혈관 생성을 촉진할 뿐만 아니라 암세포의 전이에도 관여한다. 따라서, 현재 HIF-1α의 발현은 암 진단에 있어서 나쁜 예후로 간주되고 있다.
따라서, HIF-1α의 불활성화는 암 성장 및 신혈관 생성의 억제와 직접적으로 관련이 있으므로, HIF-1α를 포함한 저산소증 신호전달계를 이해하고 조절하는 것은 항암제 개발 연구에 매우 중요하다.
이와 같이, 특정 질병이 유발되는 과정을 이해하기 위해서는, 이 과정에 핵심적으로 작용하는 전사 인자를 알아내고, 이 전사 인자의 활성 메카니즘을 규명하며, 상기 메카니즘을 조절할 수 있는 물질을 찾아내는 것이 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약물을 개발하는 중요한 단계라고 할 수 있다.
인간의 유전체내의 전체 염기서열이 규명되고 조합 화학과 화합물 합성 기술의 진보로 보다 많은 새로운 신약 타겟 및 많은 수의 화합물이 합성되는 등 현재 신약 개발은 고성능 스크리닝 (high-throughput screening)의 필요성과 함께 스크리닝에서 얻을 수 있는 정보의 질적, 양적 증가를 요구하고 있다. 고성능 스크리닝은 신규 또는 기존의 화합물 중에서 바람직한 활성을 갖는 화합물을 발굴하는 효율적인 방법으로, 많은 제약 및 생물공학 회사들이 신약 개발을 위해 이 기술을 채택하고 있다.
신약의 발굴 및 개발에 있어서의 실패 및 비용 등의 문제들을 해결할 수 있는 방법 중 가장 좋은 것은 생체 내 조건과 유사하고 좀 더 많은 정보를 제공할 수 있는 화합물의 초기 스크리닝 시스템이다. 또한 한번의 스크리닝으로 세포독성을 포함하여 신약 표적의 활성과 관련한 많은 정보를 단시간 내에 제공하는 스크리닝 방법에 의해 성공률의 제고뿐만 아니라 비용의 절감을 동시에 얻을 수 있다.
현재까지 세포를 이용한 스크리닝 방법은 각각의 독립적인 리포터 유전자를 이용하여 전사인자의 전사활성을 측정하거나, 특정 단백질의 세포 내 양적 변화와 이동, 단백질간의 상호작용을 측정하기 위한 것이었다. 이러한 리포터 시스템으로 주로 사용되는 유전자는 반딧불이 루시퍼레이즈, 레닐라 루시퍼레이즈, 분비성 태반 알칼린 포스파테이즈 (SEAP), 녹색 형광 단백질 (GFP) 등이 이용되었다. 앞의 3가지 유전자는 기질이 첨가되었을 때 발광을 일으키는 단백질이고, 녹색 형광 단백질 유전자는 주로 관심 있는 단백질에 융합되어 세포 내 단백질이동이나 양적 증가를 추적하는데 이용되었다. 또 하나의 응용 예는 특정 단백질간의 상호작용을 해석하기 위하여 리포터 유전자를 두 부분으로 분할한 후 특정 유전자와 각각 융합하거나 [Paulmurugan and Gambhir, Cancer Res. 15, 7413-20 (2005)], 발광유전자와 형광유전자 각각에 각기 다른 유전자를 융합하여 발광에 의한 형광발현을 측정함으로서 단백질간의 밀접한 상호작용을 측정하였다 [Inagaki et al., Gastroenterology. 129, 259-68, 2005)]. 이처럼 종래의 리포터 유전자 활용기술은 독자적 사용이나 단순한 결합을 통하여 한두 가지의 생물학적 정보를 획득하는데 불과하였다.
이에, 본 발명자들은 특정 질병을 조절하는 물질을 효과적으로 검색할 수 있는 세포기반 스크리닝 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 전사 인자가 결합하는 시스-엘리먼트를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 형질전환 세포주 및 상기 전사 인자를 암호화하는 유전자와 형광 단백질을 암호화하는 유전자의 융합 유전자를 포함하는 재조합 바이러스를 제조하였고, 이들을 이용하여 특정 질병에 관여하는 물질을 효과적으로 검색하는 다차원적 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 특정 질병 조건에서 특이적으로 작동하는 전사 인자의 전사 활성 및 세포 내 양적 변화와 분포 양상을 효과적으로 분석함으로써 특정 질병의 메카니즘을 조절하여 치료제로서 유용하게 사용될 수 있는 후보 물질을 검색하는 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은
(1) 5'에서 3' 방향으로 순서대로, 전사 인자가 결합하는 시스-엘리먼트, 진핵세포에서 작동하며 인핸서를 포함하지 않는 최소 프로모터 및 리포터 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 세포주, 및 상기 시스-엘리먼트에 결합하는 전사 인자를 암호화하는 유전자와 형광 단백질을 암호화하는 유전자의 융합 유전자를 포함하는 재조합 바이러스를 혼합하여 배양하는 단계;
(2) 상기 배양물에 후보 물질을 처리하는 단계; 및
(3) 리포터 유전자의 발현량, 및 형광 단백질의 발현량 및 발현 위치를 측정 하고, 후보 물질을 처리하지 않은 경우의 결과와 비교하는 단계를 포함하는,
상기 전사 인자가 관여하는 전사 활성에 영향을 미치는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 스크리닝 방법은 특정 질병의 메카니즘에 관여하는 전사 인자가 결합하는 시스-엘리먼트를 포함하는 재조합 벡터를 안정적으로 발현하는 형질전환 세포주, 및 상기 전사 인자를 발현하는 재조합 바이러스를 혼합 배양함으로써, 한 번의 후보 물질 처리로 상기 전사 인자의 전사 활성, 세포 내 발현 및 이동 등에 영향을 주는 물질을 스크리닝하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 재조합 벡터는 5'에서 3' 방향으로 순서대로 1) 전사 인자가 결합하는 시스-엘리먼트, 2) 진핵세포에서 작동하며 인핸서를 포함하지 않는 최소 프로모터, 및 3) 리포터 유전자를 포함한다.
상기 재조합 벡터는 특정 유전자의 발현에 필수적인 복제 원점, 다중 클로닝 부위, 항생제 내성 표지, 및 폴리아데닐화 신호 서열 등을 포함할 수 있으며, 목적하는 전사 활성 이외의 전사 활성을 멈추게 하여 외부적인 요인을 억제하는 추가의 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 수 있다. 또한, 다중 클로닝 부위는 리포터 유전자의 업스트림에 위치해 있으며 분석하고자 하는 최소 프로모터나 시스-엘리먼트가 삽입될 수 있는 2개 이상의 제한자리를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 벡터에서, 상기 시스-엘리먼트로는 HRE (hypoxia reponse element), NFκB (nuclear factor κB 결합 자리), PPRE (peroxisome proliferator response element), MRE (metal response element), XRE (xenobiotic response element), PRE (progesterone response element), HSE (heat shock response element), Sp1 (Sp1 결합 자리), AP1 (AP1 결합 자리), AP2 (AP2 결합 자리), p53 (p53 결합 자리) 등을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 벡터는 특정 전사 인자의 결합에 의한 특정 전사 활성을 특이적으로 증폭시키기 위해 상기 시스-엘리먼트를 다수 반복하여 포함하는 것이 바람직하며, 본 발명에서는 시스-엘리먼트가 반복된 서열을 시스-엘리먼트 복합체라고 언급한다.
본 발명에서 "시스-엘리먼트"는 전사 활성을 조절 (증가 또는 감소) 할 수 있는 특정 전사조절 인자가 결합하는 서열 단위를 의미한다.
본 발명의 벡터에 포함되는 프로모터는 전사 개시 복합체를 형성하는 데 필요한 최소의 서열만으로 구성된 최소 프로모터로서, 다른 조절 서열, 예컨대 인핸서를 갖지 않는다. 이러한 최소 프로모터로는 아데노바이러스의 E1b tata 박스, HSV-tk 및 SV40 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서는 상기 시스-엘리먼트 복합체 및 최소 프로모터를 리포터 벡터의 다중 클로닝 부위에 삽입함으로써 특정 질병을 유발하는 조건에서 특이적으로 작동하는 재조합 벡터를 제작한다.
본 발명의 재조합 벡터는 프로모터로서 인핸서 부위가 없는 최소 프로모터를 사용하기 때문에, 리포터 유전자의 전사 활성 수준과 특이성은 최소 프로모터의 업스트림에 삽입된 시스-엘리먼트의 활성에 의해서만 결정되므로, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 전사 활성에 영향을 미치는 다른 요소의 효과가 완전하게 제거된 인핸서 또는 시스-엘리먼트만의 효과를 분석하는 데 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에서는 전사 인자의 전사 활성을 측정하기 위해 리포터 유전자를 사용한다. 벡터 내의 리포터 유전자는 프로모터에 결합하는 전사 인자의 활성에 따라 리포터 단백질로 발현되므로, 발현된 리포터 단백질의 활성 또는 양을 측정함으로써 전사 인자의 활성을 예측할 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 리포터 유전자로는 반딧불이 (firefly) 루시퍼라아제, 레닐라 루시퍼라아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제, β-갈락토시다아제, 인간 성장 호르몬, 각종 형광 단백질 (fluorescent protein), 분비성 태반 알칼라인 포스파타아제 (secreted placental alkaline phosphatase, SEAP) 등을 암호화하는 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이 중, 활성 분석의 편이성 및 민감도 면에서 반딧불이 루시퍼라아제 또는 레닐라 루시퍼라아제를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 리포터 단백질들의 활성은 하기와 같이 당업자에게 공지되어 있는 방법을 사용하여 측정할 수 있다:
반딧불이 루시퍼라아제 (문헌 [de Wet J. et al., Mol. Cell Biol., 7, 725-737 (1987)] 참조), 레닐라 루시퍼라아제 (문헌 [Lorenz W.W. et al., PNAS 88, 4438-42 (1991)] 참조), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 (문헌 [Gorman C. et al., Mol. Cell Biol., 2, 1044-1051 (1982)] 참조), β-갈락토시다아제 (문헌 [Hall C.V. et al., J. Mol. Appl. Genet., 2, 101-109 (1983)] 참조), 인간 성장 호르몬 (문헌 [Selden R. et al.., Mol. Cell Biol., 6, 3173-3179 (1986)] 참조), 녹색 형광 단백질 (문헌 [Chalfie M. et al., Science, 263, 802-805 (1994)] 참조) 및 분비성 태반 알칼린 포스파타아제 (문헌 [Berger, J. et al., Gene, 66, 1-10 (1988)] 참조).
본 발명의 바람직한 실시예에서는 저산소증 조건에서 특이적으로 작동하는 리포터 벡터로서 1) 저산소증 반응 요소 (HRE) 복합체; 2) 아데노바이러스로부터 유래된 최소 프로모터로서의 E1b tata 박스; 및 3) 리포터 유전자로서 반딧불이 루시퍼라아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pGL3-tata-HRE-FL를 제조한다 (도 4 참조).
저산소증 조건 하에서 저산소증 유도성 인자 HIF-1α는 HIF-1β (ARNT)와 결합하여 이질 이량체성 복합체 HIF-1로 활성화되고, 활성화된 전사 인자는 표적 유전자의 프로모터 내에 있는 HRE (5'-ACGTG-3')에 결합하여 표적 유전자의 전사 과정을 활성화시키며, 생체 내에서 HIF-1β의 양은 거의 일정한데 비해 HIF-1α의 양은 산소의 농도에 의해 결정되므로, 상기 저산소증 신호전달계는 HIF-1α에 의존적이다.
이에 본 발명의 실시예에서는, 저산소증에 특이적으로 반응하는 리포터 벡터를 제작하기 위해, HIF-1 전사 인자가 특이적으로 결합하여 전사를 활성화시키는 표적 유전자인 VEGF 및 EPO의 프로모터 내에 있는 HRE의 염기서열 부위를 참고하여 이들 HRE 염기서열을 포함하는 서열번호 1 내지 4의 올리고뉴클레오타이드를 합성하고, 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드로 전환한 다음, DNA 연결효소인 라이게이즈 (Ligase)로 연결하여, HRE 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 반복적으로 연결된 복합체를 형성한다 (도 1 참조). 이때, 각 단위의 올리고뉴클레오타이드는 이중 가닥으로 합성되면 5' 및 3' 말단에 제한효소 인지부위가 생성되고, 이들이 라이게이즈에 의해 반복적으로 연결된 후에는 제한효소 인지부위가 소멸되도록 고안된다.
본 발명의 재조합 벡터는 특정 질병에 관여하는 전사 인자의 전사 활성을 특이적으로 확인할 수 있는 리포터 벡터로서, 이를 진핵 세포주에 도입시켜 세포기반의 스크리닝 시스템에 적용할 수도 있다.
이때, 상기와 같은 재조합 벡터 내의 리포터 단백질의 발현량은 후보 물질의 세포독성, 세포수, 독소루비신 등에 의한 활성화 정도 및 각 웰간의 차이에 따라 변할 수 있다. 따라서, 본 발명의 스크리닝 방법에서는 목적하는 전사 인자를 활성화시키는 신호와는 상관없는 외생 변수들을 표준화하기 위한 내부 표준 지표 (Internal control)로서 상기 전사 인자와 무관하게 단백질을 발현하는 표준 벡터를 도입하는 것이 바람직하다.
본 발명의 실시예에서는 내부 표준 벡터로서, 진핵세포에서 작동하는 사이토메갈로 바이러스로부터 유래된 최소 프로모터 및 상기 프로모터의 다운스트림에 위치한 레닐라 루시퍼라아제 유전자를 갖는 리포터 벡터를 사용하여 작위적인 활성을 배제한다.
본 발명은 또한 상기와 같은 특징을 갖는 재조합 벡터를 이용하여 특정 질병에 관여하는 물질을 검색하기 위해, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포주를 제공한다.
상기 재조합 벡터는 칼슘 포스페이트 공동-침전법 (문헌 [Graham, F.L. et al., Virology, 52, 456 (1973)] 참조), 전기 천공법 (문헌 [Neumann, E. et al., EMBO J., 1, 841 (1982)] 참조), 양이온성 리포좀 이용법 (문헌 [Wong, T.K. et al., Gene, 10, 87 (1980)] 참조) 등의 통상의 형질감염 방법에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 본 발명에 사용할 수 있는 숙주 세포는 진핵 세포주, 더욱 바람직하게는 동물 세포주, 더욱 바람직하게는 포유동물 세포주, 가장 바람직하게는 사람의 종양세포주, 예를 들어 HeLa, HepG2, MCF-7 또는 U2OS 세포주이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 숙주 세포 내로 도입된 재조합 벡터는 무작위 재조합 기작을 통해 숙주 세포의 염색체로 삽입되어 숙주 세포의 유전적 레퍼토리의 안정한 부분이 된다. 상기 벡터들에 포함된 유전자는 숙주 염색체 내의 유전자와 동일한 양상으로 발현되고, 숙주세포의 유전자와 함께 세포의 외부 또는 내부의 자극에 반응하여 발현된다.
상기와 같이 형질전환된 세포주는 벡터 내에 포함되어 있는 항생제 내성 유전자에 의해 효과적으로 선별될 수 있으므로, 본 발명에서는 선별과 배양을 반복하여 안정되게 형질전환된 세포를 얻을 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 재조합 벡터 pGL3-tata-HRE-FL가 세포주의 염색체에 도입되어 반딧불이 루시퍼라아제 단백질을 안정적으로 발현하는 형질전환 세포주 HeLa/pGL3-tata-HRE-FL를 제조하고, 상기 형질전환 세포주를 2005년 10월 14일자로 한국생명공학연구원 부설 유전자은행에 기탁하였다 (기탁번호: KCTC10862BP)
인핸서 또는 시스-엘리먼트의 염기서열에 결합하는 전사 인자의 세포 내 분포 및 양적 변화는 세포 내부 또는 외부의 스트레스나 환경변화에 의해 질적/양적 변화를 겪게 되는데, 이는 동물세포에서의 일반적인 현상이다. 이때, 세포 내 전사 인자의 양을 인위적으로 증가시키면 실험자는 각종 환경 변화에 의한 전사 인자의 활성변화를 명확하게 볼 수 있을 것이다.
이에, 본 발명에서는, 전사 인자와 형광 단백질의 융합 단백질을 발현하는 재조합 발현 벡터 및 상기 벡터가 도입되어 전사 인자를 안정적이고 대량으로 생산할 수 있는 재조합 바이러스를 제공한다.
상기 "재조합 바이러스"란 당업계의 숙련자들이 통상적으로 사용하는 방법에 따라 외래 단백질 유전자를 인위적으로 포함하는 재조합 바이러스로서, 재조합 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로 바이러스 등의 다양바이러스를 말하며, 바람직하게는 재조합 아데노바이러스를 말하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 전사 인자를 암호화하는 유전자 및 상기 유전자에 융합되어 발현되는 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하고, 이들의 발현이 하나의 프로모터에 의해 조절되도록 고안된다.
형광 단백질은 다른 단백질과 융합되어도 본래의 형광을 유지하는 경향이 매우 높고, 현미경 하에서 용이하게 관찰되므로, 목적 단백질과 융합된 융합 단백질 형태로 세포 내에서 발현되어 상기 목적 단백질의 정량 및 정성 분석에 응용되고 있다. 특히, 이와 같이 발현된 융합 단백질은 형광 단백질과 융합된 단백질의 고유한 성질에 의해 세포 내 위치와 이동성이 결정되기 때문에, 특정 단백질의 세포 내 위치와 관련한 연구에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 형광 단백질은 에쿠오레아 빅토리아 (Aequorea Victoria)라는 발광 해파리에서 유래된 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescence protein, EGFP), 이를 유전공학적으로 돌연변이 시켜 다른 여기 및 방출파장을 갖도록 조작된 청색 (CFP), 황색 (YFP), 적색 (DsRed) 형광 단백질 등이 사용될 수 있다.
상기 재조합 발현 벡터에서는 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 전사 인자를 암호화하는 유전자의 앞쪽에 해독틀을 유지하도록 (in frame) 삽입하여 하나의 mRNA에서 하나의 융합 단백질로 생산되도록 하는 것이 바람직하지만, 형광 단백질 유전자의 위치가 전사 인자 유전자의 앞쪽으로만 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 EGFP를 암호화하는 유전자를 HIF-1α 전사 인자를 암호화하는 유전자의 앞쪽에 해독틀을 유지하도록 삽입하여 하나의 융합 단백질 (EGFP-HIF-1α)로 생산되도록 고안된 재조합 발현 벡터 pCMV-EGFP-HIF-1α를 제조한다 (도 5 참조).
또한, 상기 재조합 발현 벡터를 이용하여 특정 질병에 관여하는 물질을 검색 하기 위해, 상기 발현 벡터를 바이러스에 도입하여, 재조합 바이러스를 제작한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 재조합 발현 벡터 pCMV-EGFP-HIF-1α가 아데노바이러스의 염색체에 도입되어 융합 단백질 EGFP-HIF-1α를 안정적으로 발현하는 재조합 아데노바이러스 Ad-EGFP-HIF-1α를 제조하고 (도 6 참조), 상기 재조합 아데노바이러스를 2005년 10월 14일자로 한국생명공학연구원 부설 유전자은행에 기탁하였다 (기탁번호: KCTC10861BP).
아울러, 본 발명은 상기 전사 인자에 의해 리포터 단백질을 안정적으로 발현하는 형질전환 세포주 및 전사 인자와 형광 단백질의 융합 단백질을 안정적으로 발현하는 재조합 바이러스를 이용하여 특정 질병에 관여하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일반적인 화합물 스크리닝 방법은 흡광, 발광, 형광 또는 세포이미지 분석 등 한가지의 물리적 현상만을 측정할 수 있는 단순한 방법이다. 그러나 본 발명에서는 상기 방법 뿐 아니라, 발광, 형광 그리고 세포 내의 단백질의 이동을 거의 동시에 확인할 수 있는 다차원적 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 다차원적 스크리닝 방법은
(1) 5'에서 3' 방향으로 순서대로, 전사 인자가 결합하는 시스-엘리먼트, 진핵세포에서 작동하며 인핸서를 포함하지 않는 최소 프로모터, 및 리포터 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 세포주, 및 상기 시스-엘리먼트에 결합하는 전사 인자를 암호화하는 유전자와 형광 단백질을 암호화하는 유전자의 융합 유전자를 포함하는 재조합 바이러스를 혼합하여 배양하는 단계;
(2) 상기 배양물에 후보 물질을 처리하는 단계; 및
(3) 리포터 유전자의 발현량, 및 형광 단백질의 발현량 및 발현 위치를 측정하고, 후보 물질을 처리하지 않은 경우의 결과와 비교하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 스크리닝 방법은 전사 인자의 전사 활성에 의해 안정적인 리포터 단백질을 발현할 수 있는 형질전환 세포주 및 전사 인자와 형광 단백질의 융합 단백질을 안정적으로 생산할 수 있는 재조합 바이러스를 함께 사용함으로써 1차적으로 특정 질병에 관여하는 전사 인자의 전사 활성을 증폭하여 리포터 유전자 활성을 쉽게 측정할 수 있고, 전사 인자의 발현에 따른 형광도 및 분포 변화를 이용하여 전사 인자의 세포 내 양적 변화 및 이동을 효과적으로 관찰할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 (1)에서 재조합 바이러스를 사용하지 않고 형질전환 세포주만을 이용하면 전사 인자의 전사 활성에 영향을 주는 물질을 검색할 수 있다. 또한, 단계 (1)에서 재조합 바이러스만을 이용하면 전사 인자의 세포 내 이동 및 안정성에 영향을 주는 물질을 검색할 수 있다.
본 발명에 있어서, 형질전환 세포주와 아데노바이러스의 혼합 배양은 마이크로플레이트를 이용하여 수행하는 것이 바람직한데, 발광 측정을 위해 사용하는 마이크로플레이트의 바닥은 빛이 통과할 필요가 없기 때문에 바닥의 투명도가 결과에 영향을 주지 않는 반면, 형광과 세포 내 단백질의 이동을 이미지로 분석하는 경우에는 반드시 마이크로플레이트 바닥이 투명하고 빛의 산란이 적은 것을 사용해야 한다. 따라서, 본 발명에 따른 다차원적 스크리닝 방법에서는 바닥이 투명하고 빛 의 산란이 최소한으로 발생하는 마이크로플레이트, 예를 들어, 셀캐리어 384-웰 마이크로플레이트 (CellCarrier 384 mClear bottom microplate, Evotech사)를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 형질전환 세포주 HeLa/pGL3-tata-HRE-FL 및 재조합 아데노바이러스 Ad-EGFP-HIF-1α를 웰 플레이트에서 배양한 다음, 후보 물질을 상기 플레이트의 각 웰에 첨가하고 반딧불이 루시퍼라아제의 발현량, 및 EGFP의 발현량 및 발현 위치를 측정하고, 후보 물질을 처리하지 않은 경우의 결과와 비교함으로써, 저산소증에 관여하는 물질을 검색한다.
본 발명에 따른 방법은 (a) 프로모터, 인핸서 및 시스-엘리먼트와 연관된 전사 활성, (b) 전사 인자의 양적 변화와 관련한 세포 내 기작 또는 단백질, (c) 전사 인자의 세포 내 이동과 관련한 세포 내 기작 또는 단백질, (d) 전사 인자의 표적 프로모터 또는 시스-엘리먼트로의 접근과 관련한 세포 내 기작 또는 단백질 등과 같이 세포 내에서 발생할 수 있는 각종 세포 내 기작 또는 단백질과 연관하여 전사 활성에 영향을 미치는 신약의 선도 물질을 스크리닝하는데 매우 유용하다.
또한, 본 발명에 따른 방법은 정확하고 신속할 뿐만 아니라 화합물의 작용 기작과 관련한 많은 정보를 제공할 수 있으며 다양한 신약 후보물질을 경제적으로 스크리닝할 수 있는 세포기반의 고성능 분석 방법을 제공할 수 있다.
아울러, 본 방법은 선도 화합물의 적중률을 높이므로 전임상 또는 임상 시험에서의 비용과 시간을 상당히 감소시킬 수 있을 뿐 아니라 전임상 시험에서 동물 모델의 대안으로 이용될 수도 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 비교예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.
하기 실시예 및 시험예에서 저산소증을 유발하는 CoCl2 또는 DFO (Deferoxamine Mesylate)의 처리는 생략되거나 다른 저산소증 유발물질이나 환경에 의해 대체될 수 있으며, 생략되는 경우 저산소증을 유발하는 화합물을 스크리닝할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 하기의 실험순서, 재료 및 사용 장비는 고정된 것이 아니며 상황에 따라 변화와 응용이 가능하므로, 이들은 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1 : HRE 및 리포터 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작
<1-1> HRE 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 합성
HIF-1 전사 인자가 특이적으로 결합하여 활성화시키는 표적 유전자인 VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) 및 EPO (Erythropoietin)의 프로모터 내에 있는 HRE (Hypoxia Responsive Element) 시스-엘리먼트의 염기서열 부위를 참고하 여 이들 HRE 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. VEGF 유래의 HRE 포함 올리고뉴클레오타이드의 염기서열은 5'-CTAGAAGTGCATACGTGGGCTCCAG-3' (서열번호: 1)와 5'-CTAGCTGGAGCCCACGTATGCACTT-3' (서열번호: 2)이고, EPO 유래의 HRE 포함 올리고뉴클레오타이드의 염기서열은 5'-CTAGATGCCCTACGTGCTGTCTCG-3' (서열번호: 3)와 5'-CTAGCGAGACAGCACGTAGGGCAT-3' (서열번호: 4)이었다.
상기에서 합성된 각 쌍의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 각각 500 ㎍의 양으로 혼합한 후, 약 90℃에서 10분간 가열하고 상온으로 냉각함으로써, 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드들 사이에 수소결합을 형성시켜 한 단위의 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드를 제조하였다. 이때 각 단위의 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드는 5' 말단 및 3' 말단의 서열이 각각 제한효소 Xba I 및 Nhe I 절단부위에 연결되었을 때 각 제한효소 인지부위가 생성되도록 고안되었다.
<1-2> 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드의 복합체 형성
상기 <1-1>에서 합성된 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드의 Xba I 절단부위와 Nhe I 절단부위는 서로 단일 가닥 염기서열 부위가 상보적으로 수소결합을 형성하기 때문에 DNA 연결효소인 라이게이즈 (Ligase)에 의해 완벽하게 연결된 후 제한효소 인지부위가 소멸되게 된다. 따라서, 상기에서 제조된 두 가지 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드를 각각 250 ㎍의 양으로 혼합한 후 라이게이즈를 이용하여 HRE 포함 올리고뉴클레오타이드가 반복적으로 연결된 복합체를 형성하고, 이를 1.5% 아가 로스 젤에 전기영동하여 확인하였다 (도 1).
<1-3> 재조합 벡터의 제작
상기 <1-2>에서 제조된 복합체를, pGL2-tata-Luc (Zhang et al., J. Virology 74, 11270-11277) 플라스미드 내의 아데노바이러스 E1b tata 박스 염기서열 (문헌 [Lillie et al., Nature 338, 39-44] 참조)을 포함하고 있는 Xho I 절단부위를 pGL3-basic 벡터 (Promega사)에 삽입하여 제조된 플라스미드 벡터인 pGL3-tata-Luc 벡터의 다중 클로닝 부위 (MCS) 내의 제한효소 Nhe I 부위에 삽입하여 클로닝하여, 저산소증에 의존적인 HIF-1의 전사 활성에 따라 리포터 단백질을 발현시키는 재조합 벡터 클론들을 제작하였다.
<1-4> 전사 활성을 갖는 재조합 벡터 클론의 선별
<1-4-1> 재조합 벡터 클론들의 형질전환
상기 <1-3>에서 제작된 재조합 벡터 클론들 중 전사 활성을 갖는 것을 선별하기 위해, 리포펙타민 플러스 (LipoFectamine Plus, Invitrogen사) 시약을 이용하여 사람 세포주인 HeLa 세포 (ATCC 번호: CCL-2)에 상기의 재조합 벡터들을 하기와 같이 형질전환시켰다.
20 ㎕ 혈청 부재 및 항생제 부재 DMEM 배지에 재조합 벡터 DNA 350 ng, 내부 표준 벡터 pRL-CMV (Promega 사, 도 2) DNA 50 ng 및 2 ㎕ 리포펙타민 플러스 시약 (Invitrogen사)을 혼합하고, 상온에서 15분 동안 항온 처리한 다음, 상기의 혼합물을 다시 22 ㎕ 혈청 부재 및 항생제 부재 DMEM 배지와 3 ㎕ 리포펙타민의 혼합물에 첨가한 후 추가로 15분 동안 상온에서 항온 처리하여 DNA:리포펙타민 플러스 시약:DMEM 배지의 복합체를 제조하였다. 상기 복합체를 형성하는 동안, HeLa 세포주를 PBS로 두 번 세척하고, 각 웰당 20,000개의 세포가 20시간 전에 이식 배양된 24-웰 플레이트 (Falcon 사)의 웰에, 200 ㎕의 혈청 부재 및 항생제 부재 DMEM 배지를 투입하였다. 각 웰에 상기 복합체 50 ㎕를 첨가한 후, 37℃, 5% CO2 배양기에서 3시간 동안 배양하였다. 배양이 끝나면 10% 우태아 혈청, 페니실린 (100 U/㎖, Invitrogen사) 및 스트렙토마이신 (100 ㎍/㎖, Invitrogen사)이 첨가된 DMEM 배지로 교체하고, 37℃에서 24 시간 동안 항온 배양하였다.
<1-4-2> 전사 활성 시험
세포를 형질전환한지 24시간 후 각 웰에 저산소증 유발 화합물인 CoCl2 200 μM 및 DFO (Deferoxamine Mesylate) 100 μM을 가하고 20시간 동안 처리한 후 각 재조합 벡터 클론의 저산소증 의존 발현 정도를 조사하였다. 발현에 의한 반딧불이 루시퍼라아제의 활성변화는 듀얼루시퍼라아제 킷트 (Dual Luciferase Kit, Promega사)를 이용하여 하기와 같이 확인하였다.
CoCl2 및 DFO 처리 후 플레이트 내에 남아 있는 배지는 버리고 PBS 완충용액 으로 3번 씻은 다음, 킷트 내에 포함되어 있는 1× 용해 완충용액 (Passive Lysis Buffer)을 각 웰당 5 ㎕씩 첨가하여 세포를 용해시켰다. 용해된 세포 추출물이 포함된 각 웰에 25 ㎕의 LAR II 시약을 첨가한 다음, 약 1분 후에 재조합 벡터의 전사 활성에 의해 발현되는 반딧불이 루시퍼라아제의 발광도를 마이크로플레이트 리더 (Envision Reader, Perkin Elmer)를 이용하여 0.1초간 측정하였다. 상기 측정 후, 각 웰에 25 ㎕의 Stop & Glow 시약을 처리한 다음, 1분 후에 CMV 프로모터의 전사 활성에 의해 발현되는 레닐라 루시퍼라아제의 발광도를 마이크로플레이트 리더를 이용하여 0.1초간 측정하였으며 (mock), 측정된 레닐라 루시퍼라아제의 발광도에 대한 반딧불이 루시퍼라아제의 발광도 (FL/RL)를 도 3에 나타내었다. 이때 CMV 프로모터 하의 레닐라 루시퍼라아제 발광도는 화합물의 세포독성, 세포수, 독소루비신 등에 의한 활성화정도, 웰간의 차이 등, 저산소증 신호와는 상관없는 외생변수들을 표준화하는 내부 표준 지표 (Internal control)로서 사용되었다.
<1-5> pGL3-tata-HRE-FL 재조합 벡터의 제작
상기 <1-4-2>의 결과에 따라, 가장 높은 발현 배수를 보인 클론 32번의 DNA에 제한 효소 Mlu I과 Xma I을 처리하여 HRE 염기서열이 포함된 DNA 절편을 분리 정제한 다음, 절편의 Xma I 제한효소 부위가 꼬리-꼬리 결합 (tail-to-tail), 즉 MluI--XmaIXmaI--MluI의 형태로 형성된 이량체를 다시 원래의 클론 32번 DNA의 Mlu I 절단 부위에 클로닝하여 최종적으로 효소 Mlu I과 Xma I DNA 절편이 2개 더 (총 3개) 삽입되도록 하였다. 상기 재조합 벡터의 저산소증 의존성 루시퍼라아제 발현 을 저산소증 유발 화합물인 CoCl2 및 DFO의 처리와 HIF-1α 발현 벡터인 하기 실시예 3의 pCMV-EGFP-HIF-1α와의 코트랜스펙션(co-transfection)으로 확인하였으며 ([Wilson and Poellinger, Biochem Bioph. Res. Co. 293, 446-450, (2002)]; 및 [Bertges et al., J. Surg. Res. 106, 157-165, (2002)] 참조), 제작된 벡터를 pGL3-tata-HRE-FL이라고 명명하였다 (도 4).
실시예 2 : 재조합 벡터 pGL3-tata-HRE-FL과 표준 벡터 pRL-CMV를 안정적으로 포함하는 형질전환 세포주의 제작
사람의 자궁 경부암 세포주 HeLa를 100 ㎜ 배양접시에 5×105 세포씩 분주하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후에 실시예 1에서 제작된 재조합 벡터 pGL3-tata-HRE-FL와 표준 벡터 pRL-CMV (Promega사)를, 차후 형질전환된 세포주를 선별하기 위한 벡터인 pTK-Hyg (Clontech사)와 함께 리포펙타민 플러스 시약을 이용하여 하기와 같은 방법으로 각각 코트렌스펙션하였다.
pGL3-tata-HRE-FL 플라스미드 또는 pRL-CMV 플라스미드 4 ㎍과 pTK-Hyg 플라스미드 1 ㎍을 혼합한 후, 항생제 부재 DMEM 배지 350 ㎕ 및 리포펙타민 플러스 시약 40 ㎕를 첨가하여 파이펫으로 잘 섞어준 다음, 상온에서 15분 동안 방치하였다. 여기에 리포펙타민이 10%로 함유된 항생제 부재 DMEM 배지 400 ㎕를 넣고 파이펫으로 섞어준 다음, 상온에서 15분 동안 방치하였다. HeLa 세포 약 500,000 개를 100 ㎜ 배양접시에 이식한 다음, 24시간 후에 배지를 버리고, 신선한 DMEM 배지 3.2 ㎖로 교환하였다. 15분 후에, 상기 혼합액 800 ㎕를 넣고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 PBS로 3번 씻은 다음, 신선한 배지 10 ㎖를 넣어 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포가 포화성장 (confluent growth) 상태가 되면 200 ㎍/㎖의 하이그로마이신 B (Hygromycin B)를 처리하였다. 플라스미드를 트렌스펙션하지 않은 대조군 세포가 다 죽을 때까지 하이그로마이신 B를 처리하고, 대조군 세포가 다 죽으면 0.25% 트립신을 처리하여 살아남은 세포 (형질전환체)를 떼어 낸 후 96-웰 플레이트에 웰당 한 개 세포 (single cell)가 되도록 희석하여 배양하였다. 세포가 포화성장 상태로 자라면 24-웰 플레이트, 25T 배양 플라스크 및 75T 배양 플라스크로 순차적으로 옮기면서 대량으로 세포를 배양한 다음, 60 ㎜ 배양접시에 5×105 세포수로 이식하여 배양하였다.
pGL3-tata-HRE-FL을 도입한 형질전환 세포주에 CoCl2를 실시예 1과 동일한 방법으로 처리한 다음, 듀얼루시퍼라아제 킷트를 이용하여 반딧불이 루시퍼라아제의 발현을 비교하였다. 상기 결과에 따라 저산소증에 의존적으로 반딧불이 루시퍼라아제를 발현하는 세포주만을 선택한 다음, 이를 대량으로 배양하여 보관용 세포주 HeLa/pGL3-tata-HRE-FL (기탁번호: KCTC10862BP)을 제조하였으며, 표준 벡터 pRL-CMV을 도입한 형질전환 세포주는 상기와 동일한 방법으로 레닐라 루시퍼라아제의 발현 정도가 높은 세포주만을 선택하고 대량으로 배양하여 보관용 세포주 HeLa/pRL-CMV를 제조하였다.
실시예 3 : HIF-1α와 형광 단백질 EGFP의 융합 단백질을 발현하는 재조합 발현 벡터의 제작
HIF-1α가 융합된 녹색 형광 단백질 (EGFP)을 발현할 수 있는 벡터를 만들기 위해, HIF-1α의 전장 유전자 (NCBI 유전자 번호: BC007656)를 제한효소 Nco I으로, EGFP 유전자를 포함하는 EGFP 발현 벡터 pEGFP-c1 (Clontech사)을 제한효소 Sal I으로 각각 절단한 후, 클레나우 절편 (klenow fragment) 효소를 이용하여 HIF-1α의 전장 유전자 및 pEGFP-c1 절편의 말단 각각을 블런트 (blunt)로 전환시키고, 이들을 다시 제한효소 Xba I으로 절단하였다. 제한 효소에 의해 절단된 DNA 절편들을 라이게이즈로 연결하여 HIF-1α와 형광 단백질 EGFP의 융합 단백질을 발현하는 재조합 발현 벡터를 제작한 후 pCMV-EGFP-HIF-1α라고 명명하였다 (도 5).
실시예 4 : HIF-1α-EGFP 융합 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스 Ad-EGFP-HIF-1α의 제작
(주) 뉴로제넥스에 의뢰하여 HIF-1α의 전장 유전자 (NCBI 유전자 번호: BC007656) 주형으로 하고 서열번호 5 및 6의 프라이머 5'-GCAGGCTCCACCATGGAGGGCGCCGGCGGCGCGAA-3'(서열번호: 5)과 5'-CAAGAAAGCTGGGTGTCAGTTAACTTGATCCAAAGCTC-3'(서열번호: 6) 를 이용하여 HIF-1α 전 장 유전자 부분을 포함하는 염기서열을 PCR (polymerase chain reaction)로 증폭하였다 (도 6). 증폭된 유전자를 클로닝용 플라스미드 pDonr201 (Neurogenex사)에 Invitrogen 사의 BP Clonase II 시스템을 이용하여 직접적인 PCR 클로닝을 수행하여 플라스미드 pEntr-NAS45를 제작하였다. 제작된 상기 재조합 발현 벡터 pEntr-NAS45 플라스미드를 이용하여 EGFP-HIF-1α 융합 단백질 발현용 재조합 아데노바이러스를 제작하였다 (도 6).
상기로부터 얻어진 8가지의 재조합 아데노바이러스를 각각 약 200,000개의 HEK293 세포가 배양 중인 6-웰 플레이트에 첨가한 후 37℃, 5% CO2 조건에서 DMEM 배지를 이용하여 6일 동안 배양 한 후 각 배양액 1 ㎕씩을 프로타아제 K로 처리하여 PCR 반응을 위한 주형으로 준비한 다음, 삽입된 유전자의 정체를 서열번호 7 및 8의 프라이머 전방향 프라이머: 5'-GGTCTATATAAGCAGAGCTG-3' (서열번호: 7) 및 역방향 프라이머: 5'-GTATGGCTGATTATGATCAG-3' (서열번호: 8)을 이용하여 PCR로 확인하였다. 상기 8가지 재조합 아데노바이러스 중 정확한 크기의 HIF-1α 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스를 선별하여 재조합 아데노바이러스 Ad-EGFP-HIF-1α (기탁 번호: KCTC10861BP)로 명명하였다.
상기 Ad-EGFP-HIF-1α를 HEK293 세포주를 숙주로 이용하여 DMEM 배지 상에서 37℃, 5% CO2에서 3일 동안 배양 증폭한 다음, 증폭된 재조합 아데노바이러스를 2% FBS 및 10 mM MgCl2를 포함하는 냉동보관 배지에 1×109 PFU/㎖의 농도로 희석하여 -75℃에서 보관하였다.
시험예 1 : 형질전환 세포주 HeLa/pGL3-tata-HRE-FL을 이용한 HIF-1의 전사 활성에 영향을 주는 물질의 선별
pGL3-tata-HRE-FL 벡터를 안정적으로 포함하고 있는 형질전환 세포주 HeLa/pGL3-tata-HRE-FL (기탁 번호: KCTC10862BP)를 이용하여 저산소증을 조절할 수 있는 화합물을 선별하기 위해, 상기 실시예 2에서 제조한 세포주 HeLa/pGL3-tata-HRE-FL 및 표준 세포주 HeLa/pRL-CMV를 3:1의 비율로 혼합한 후, 24-, 96- 또는 384-웰 플레이트에 약 30%의 밀도로 이식하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 약 20시간 동안 배양하였다. 배양이 끝나면 신선한 DMEM/10% FBS 배지로 바꿔주고 37℃, 5% CO2 배양기에서 약 1시간 동안 배양한 다음, 선별하고자 하는 화합물 (한국화학연구원내 한국화합물은행의 화합물 라이브러리 KRICT-RP)을 10 μM의 농도로 1시간 동안 처리하였다. 여기에 저산소증을 유발하기 위해 CoCl2를 최종 농도 100 μM로 처리한 다음 추가로 20시간 더 배양하였다. 배양이 끝나면 실시예 1의 <1-4-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 HIF-1의 전사 활성에 의한 재조합 벡터 pGL3-tata-HRE-FL 내 반딧불이 루시퍼라아제의 발광도 및 pRL-CMV 벡터의 전사 활성에 의한 레닐라 루시퍼라아제의 발광도를 차례로 측정하였으며 이들을 비교한 결과를 도 7에 나타내었다.
상기 도 7에 나타난 바와 같이, 내부 표준 지표로 사용된 레닐라 루시퍼라아 제의 발광도에 대한 반딧불이 루시퍼라아제의 발광도를 비교함으로써, 저산소증을 억제하는 화합물을 선별할 수 있다.
시험예 2 : 재조합 아데노바이러스 Ad-EGFP-HIF-1α를 이용한 HIF-1α의 발현 및 이동에 영향을 주는 물질의 선별
본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스에 의한 HeLa 세포주에서 EGFP-HIF-1α 융합 단백질의 안정적 생산 및 저산소증에 의한 발현량의 증가 여부와 함께 상기 융합 단백질의 핵으로의 이동을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<2-1> 형광 발광도를 이용한 단백질의 발현량 측정
상기 실시예 4에서 제조된 재조합 아데노바이러스 Ad-EGFP-HIF-1α와 GFP 단백질만을 생산하는 표준 아데노바이러스 (neurogenex사)를 37℃에서 급속히 해동한 다음, 1, 10 및 100 MOI로 각각 희석하여 24-웰 플레이트에 배양된 HeLa 세포주에 첨가하였다. 여기에 저산소증을 유발하는 CoCl2를 100 μM의 최종 농도로 처리하여 24시간 동안 배양한 후, 형광 현미경으로 관찰한 다음, (도 8), 마이크로플레이트 리더 (Envision, Perkin Elmer사)로 측정하였다 [Furtado A and Henry R, Anal Biochem. 310, 84-92 (2002); Hellweg C. E. et al., J Biomol Screen. 8, 511-521 (2003); Ponomarev V. et al., Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 740-751 (2004)].
도 8에 나타난 바와 같이, 세포에 처리한 아데노바이러스의 양이 증가할수록 GFP 단백질 및 EGFP-HIF-1α 융합 단백질의 발현에 의한 녹색 형광의 강도가 증가함을 알 수 있다. 또한, 같은 양의 바이러스만을 처리한 경우, 저산소증을 유발하는 CoCl2를 처리한 경우가 CoCl2를 처리하지 않은 대조군보다 훨씬 강한 형광을 나타냄을 알 수 있다. 따라서, 상기 스크리닝 방법은 HIF-1α의 발현량 변화에 영향을 줄 수 있는 물질을 검색하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.
<2-2> 하이컨텐츠 이미지 스크리닝 장비를 이용한 단백질의 분포 및 핵으로의 이동 측정 (1)
상기 시험예 <2-1>에서 사용된 장비는 흡광, 발광 또는 형광에 의한 단백질 발현량의 증감을 측정할 수는 있지만 세포 내에서 발생하는 단백질의 분포 및 이동을 확인할 수는 없으므로, 세포 내에서 발생할 수 있는 각종 현상을 분석할 수 있는 장비인 하이컨텐츠 이미지 스크리닝 시스템 (high throughput confocal cell screening system, Evotech사)을 이용하여 상기 시험예 <2-1>과 동일한 방법으로 준비된 세포를 이용하여 세포 내에서의 EGFP-HIF-1α 융합 단백질의 발현량 변화뿐만 아니라 세포 내 이동을 정량적으로 측정하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, CoCl2를 처리하여 저산소증을 유발하면 EGFP-HIF- 1α 융합 단백질의 발현량 증가뿐만 아니라, 하이컨텐츠 이미지 스크리닝 시스템 내의 분석프로그램의 알고리즘에 의한 분석 결과 및 둥글고 크기가 일정한 세포핵으로 융합 단백질 형광 신호가 이동하는 것으로부터, 단백질의 세포핵으로의 이동이 증가함을 알 수 있다.
<2-3> 하이컨텐츠 이미지 스크리닝 장비를 이용한 단백질의 분포 및 핵으로의 이동 측정 (2)
상기 <2-1>과 동일한 방법으로 처리된 Ad-EGFP-HIF-1α를 HeLa 세포주에 첨가한 다음, 1 시간 후에 20 μM의 YC-1 (Sigma사)를 처리하였다. 다시 1시간 후 상기 <2-1>과 동일한 방법으로 CoCl2를 처리하여 저산소증을 유도한 다음, 상기 <2-2>와 동일한 방법으로 단백질의 분포 및 핵으로의 이동 측정하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, YC-1와 CoCl2를 순차적으로 처리를 처리한 군은 CoCl2만을 처리한 군에 비해 EGFP-HIF-1α 융합 단백질의 양적 증가 및 핵으로의 이동이 동시에 저하되었다. 이는 전체적으로 세포 내 EGFP-HIF-1α 융합 단백질의 양이 그게 감소하였기 때문이다.
시험예 3 : 형질전환 세포주 및 재조합 아데노바이러스를 통합한 다차원적 스크리닝 방법
각각 독립적 스크리닝 방법으로서 사용된 상기의 시험예 1 및 2의 방법들을 통합하여 다차원적 스크리닝 방법으로 사용할 수 있는지를 알아보기 위해, 하기와 같은 방법으로 스크리닝을 수행하였다 (도 12 참조).
384-웰 마이크로플레이트 (Evotech사) 에 형질전환 세포주 HeLa/pGL3-tata-HRE-FL과 HeLa/pRL-CMV 세포주를 24시간 동안 배양한 것을 제외하고는 시험예 1과 동일한 방법으로 세포를 배양하고 스크리닝하고자 하는 화합물 및 CoCl2를 처리하였다. 여기에 시험예 2와 동일한 방법으로 재조합 아데노바이러스 Ad-EGFP-HIF-1α를 첨가한 다음, 약 20시간 후 재조합 아데노바이러스 Ad-EGFP-HIF-1α 감염에 의한 HIF-1α의 발현량 변화를 시험예 <2-1>과 동일한 방법으로 측정하여 그 결과를 도 11의 A에 나타내었다.
또한, 시험예 <2-2>와 동일한 방법으로 상기 세포 내에서의 EGFP-HIF-1α 융합 단백질의 양적 변화 및 세포 내 이동을 정량적으로 측정하였으며 [Kain S. R. Drug Discov Today. 4: 304-312 (1999); Ghosh RN, Biotechniques. 29(1): 170-5 (2000); Granas C. et al., Comb Chem High Throughput Screen. 8: 301-309 (2005)], 그 결과를 도 11의 B에 나타내었다.
아울러, HIF-1의 전사 활성은 실시예 <1-5>와 동일한 방법으로 반딧불이 루시퍼라아제와 레닐라 루시퍼라아제의 발현량을 측정하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7 및 도 11에 나타난 바와 같이, 본 발명의 다차원적 스크리닝 방법을 이용하면 저산소증에 의한 HIF-1의 전사 활성뿐만 아니라 HIF-1α의 발현량 및 세포 내 이동에 관여하는 화합물을 검색할 수 있다.
만일, HIF-1α의 발현량 및 핵으로의 이동 양상은 변하지 않았지만 HIF-1에 의한 전사 활성만이 감소되었다면 이 화합물은 전사 인자 HIF-1이 HRE에 결합하는 것을 억제한다는 것을 의미하므로, 각각의 측정 결과는 화합물의 세포 내 여러 기작을 예측하는 단서를 제공할 수도 있다.
본 발명에 따른 다차원적 스크리닝 방법은 세포기반의 재조합 벡터와 재조합 바이러스를 결합하여 단시간 내에 한 번의 세포배양, 한 번의 후보 물질 처리로 인핸서 또는 시스-엘리먼트의 전사 활성, 상기 인핸서 또는 시스-엘리먼트에 결합하는 전사 인자의 양적 변화, 세포 내 분포 또는 핵으로의 이동에 영향을 줄 수 있는 물질을 검색할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법을 사용하면 각종 질병의 메카니즘을 조절할 수 있는 물질을 경제적이고 신속하게 선별할 수 있으므로, 본 발명은 간단한 공정으로 특정 질병에 대한 치료제의 개발 또는 치료제의 효능 검색에 효율적인 스크리닝 방법을 제공할 수 있어 생물의약 산업에 매우 유용하다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (17)

  1. (1) 5'에서 3' 방향으로 순서대로, 전사 인자가 결합하는 시스-엘리먼트, 진핵세포에서 작동하며 인핸서를 포함하지 않는 최소 프로모터, 및 리포터 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 세포주, 및 상기 시스-엘리먼트에 결합하는 전사 인자를 암호화하는 유전자와 형광 단백질을 암호화하는 유전자의 융합 유전자를 포함하는 재조합 바이러스를 혼합하여 배양하는 단계;
    (2) 상기 배양물에 후보 물질을 처리하는 단계; 및
    (3) 리포터 유전자의 발현량, 및 형광 단백질의 발현량 및 발현 위치를 측정하고, 후보 물질을 처리하지 않은 경우의 결과와 비교하는 단계를 포함하는,
    상기 전사 인자가 관여하는 전사 활성에 영향을 미치는 물질의 스크리닝 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    시스-엘리먼트가 HRE (hypoxia responsive element), NFκB (nuclear factor kB 결합 자리), PPRE (peroxisome proliferator response element), MRE (metal response element), XRE (xenobiotic response element), PRE (progesterone response element), HSE (heat shock response element), Sp1 (Sp1 결합 자리), AP1 (AP1 결합 자리), AP2 (AP2 결합 자리), 및 p53 (p53 결합 자리)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    리포터 유전자가 반딧불이 (firefly) 루시퍼라아제, 레닐라 루시퍼라아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제, β-갈락토시다아제, 인간 성장 호르몬, 형광 단백질 (fluorescent protein) 및 분비성 태반 알칼라인 포스파타아제 (secreted placental alkaline phosphatase, SEAP)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    최소 프로모터가 E1b tata 박스, HSV-tk 및 SV40으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 전사 인자가 저산소증 의존성 전사 인자인 HIF-1α (Hypoxia Inducing Factor-1α)이고, 시스-엘리먼트가 HRE (hypoxia responsive element)이며, 저산소 조건에 의해 유도되는 전사 활성에 영향을 미치는 물질을 스크리닝하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    최소 프로모터가 E1b tata 박스이고, 리포터 유전자가 루시퍼라아제 유전자이고, 형광 단백질 유전자가 EGFP (enhanced green fluorescence protein) 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    세포주가 HeLa, HepG2, MCF-7 또는 U2OS인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    바이러스가 아데노바이러스, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    세포주가 HeLa/pGL3-tata-HRE-FL 세포주 (기탁번호: KCTC10862BP)이고, 재조합 아데노바이러스가 Ad-EGFP-HIF-1α (기탁번호: KCTC10861BP)인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 녹색 형광 단백질 (EGFP (enhanced green fluorescence protein)) 유전자와 HIF-1α 유전자의 융합 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 Ad-EGFP-HIF-1α (기탁번호: KCTC10861BP).
  16. 5'에서 3' 방향으로 순서대로 전사 인자가 결합하는 시스-엘리먼트, 진핵세포에서 작동하며 인핸서를 포함하지 않는 최소 프로모터, 및 리포터 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 세포주, 및 상기 시스-엘리먼트에 결합하는 전사 인자를 암호화하는 유전자와 형광 단백질을 암호화하는 유전자의 융합 유전자를 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는, 상기 전사 인자가 관여하는 전사 활성에 영향을 미치는 물질의 스크리닝용 킷트.
  17. 제 16 항에 있어서,
    HeLa/pGL3-tata-HRE-FL 세포주 (기탁번호: KCTC10862BP), HeLa/pRL-CMV 세포주, 및 재조합 아데노바이러스 Ad-EGFP-HIF-1α (기탁번호: KCTC10861BP)를 포함하는 것을 특징으로 하는 킷트.
KR1020050133257A 2005-12-29 2005-12-29 형질전환 세포주 및 재조합 바이러스를 이용한 스크리닝방법 KR100711939B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050133257A KR100711939B1 (ko) 2005-12-29 2005-12-29 형질전환 세포주 및 재조합 바이러스를 이용한 스크리닝방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050133257A KR100711939B1 (ko) 2005-12-29 2005-12-29 형질전환 세포주 및 재조합 바이러스를 이용한 스크리닝방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR100711939B1 true KR100711939B1 (ko) 2007-05-02

Family

ID=38269158

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020050133257A KR100711939B1 (ko) 2005-12-29 2005-12-29 형질전환 세포주 및 재조합 바이러스를 이용한 스크리닝방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100711939B1 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100888343B1 (ko) * 2007-05-25 2009-03-10 경북대학교 산학협력단 나트륨 옥소 공동수송체 유전자 및 녹색 형광유전자로구성된 이중 리포터 유전자를 발현하는 간암세포주
KR101195164B1 (ko) 2007-09-28 2012-10-29 한양대학교 에리카산학협력단 ＮＦ-κＢ의 활성 측정용 세포주 및 이를 이용한 ＮＦ-κＢ 활성을 유도하거나 저해하는 물질을 선별하는 방법
KR101680006B1 (ko) 2016-03-10 2016-12-06 (주)한도기공 압출실린더 내부에 냉각수 순환홀을 구비한 이동식 압출기

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000074725A1 (en) 1999-06-04 2000-12-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Identification of compounds that modify transcriptional responses to hypoxia
KR20030065506A (ko) * 2000-11-06 2003-08-06 주식회사 메덱스바이오 형질전환된 세포주를 이용하는 전사조절 분석 시스템을기초로 한 스크리닝 방법
US20050053971A1 (en) 2003-09-08 2005-03-10 Alex Chenchik Methods and constructs for developing cell lines for biological assays
US20050058991A1 (en) 2003-07-10 2005-03-17 Irm Llc, A Delaware Limited Liability Company Methods and compositions for inhibiting herpesviral replication

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000074725A1 (en) 1999-06-04 2000-12-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Identification of compounds that modify transcriptional responses to hypoxia
KR20030065506A (ko) * 2000-11-06 2003-08-06 주식회사 메덱스바이오 형질전환된 세포주를 이용하는 전사조절 분석 시스템을기초로 한 스크리닝 방법
US20050058991A1 (en) 2003-07-10 2005-03-17 Irm Llc, A Delaware Limited Liability Company Methods and compositions for inhibiting herpesviral replication
US20050053971A1 (en) 2003-09-08 2005-03-10 Alex Chenchik Methods and constructs for developing cell lines for biological assays

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100888343B1 (ko) * 2007-05-25 2009-03-10 경북대학교 산학협력단 나트륨 옥소 공동수송체 유전자 및 녹색 형광유전자로구성된 이중 리포터 유전자를 발현하는 간암세포주
KR101195164B1 (ko) 2007-09-28 2012-10-29 한양대학교 에리카산학협력단 ＮＦ-κＢ의 활성 측정용 세포주 및 이를 이용한 ＮＦ-κＢ 활성을 유도하거나 저해하는 물질을 선별하는 방법
KR101680006B1 (ko) 2016-03-10 2016-12-06 (주)한도기공 압출실린더 내부에 냉각수 순환홀을 구비한 이동식 압출기

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kang et al. A self-enabling TGFβ response coupled to stress signaling: Smad engages stress response factor ATF3 for Id1 repression in epithelial cells
Miska et al. HDAC4 deacetylase associates with and represses the MEF2 transcription factor
Zhou et al. Smooth muscle-specific genes are differentially sensitive to inhibition by Elk-1
Luo et al. Transcriptional inhibition by Stat5: differential activities at growth-related versus differentiation-specific promoters
EP1198255B1 (en) Identification of compounds that modify transcriptional responses to hypoxia
JP2019106996A (ja) タンパク質の安定性を測定する方法およびその使用
Zhang et al. Sterile alpha motif domain-mediated self-association plays an essential role in modulating the activity of the Drosophila ETS family transcriptional repressor Yan
JP3978139B2 (ja) Ｒｅｎｉｌｌａｍｕｌｌｅｒｉの緑色蛍光タンパク質をコードするヒト化ポリヌクレオチド配列
KR100711939B1 (ko) 형질전환 세포주 및 재조합 바이러스를 이용한 스크리닝방법
Mahajan et al. DNA-dependent adenosine triphosphatase (helicaselike transcription factor) activates β-globin transcription in K562 cells
US20030108877A1 (en) Methods for selecting and producing selective pharmaceutical compounds and compositions using an established genetically altered cell-based library responsive to transcription factors; genetic constructs and library therefor.
US8907073B2 (en) Nucleic acids encoding FOXD3 promoter and methods to isolate FOXD3 expressing cells
US20130260386A1 (en) Nucleic acid construct systems capable of diagnosing or treating a cell state
Malicet et al. Distinct properties of human HMGN5 reveal a rapidly evolving but functionally conserved nucleosome binding protein
Vagner et al. A novel bicistronic sensor vector for detecting caspase-3 activation
Kimura et al. A brain region-specific gene product Lhx6. 1 interacts with Ldb1 through tandem LIM-domains
Wang et al. Single HSV-amplicon vector mediates drug-induced gene expression via dimerizer system
US6986881B1 (en) Identification of compounds that modify transcriptional responses to hypoxia
KR20130084536A (ko) ＨＩＦ-1 알파와 ｐ300 단백질과의 결합을 실시간 분석하는 방법
KR100791859B1 (ko) ｐ53 종양 억제단백질과 형광단백질의 융합단백질을발현하는 형질전환 세포주 및 이를 이용한 ｐ53 종양억제단백질의 활성과 관련된 물질의 검색방법
Wang et al. Naked cuticle inhibits wingless signaling in Drosophila wing development
Khursheed et al. Characterisation of multiple regulatory domains spanning the major transcriptional start site of the FUS gene, a candidate gene for motor neurone disease
Kim A reporter platform for characterizing transcription factor-DNA interactions in live cells
US8232070B2 (en) DNP63A gene and screening methods of anticancer agent by using it
AU2001277775B2 (en) Protein monitoring the activity of low-molecular weight GTP-binding protein

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20091228

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee