NL9100567A - Werkwijze voor het detecteren van mutaties, transgeen zoogdier, transgene zoogdiercel, en werkwijze voor het onderzoeken van stoffen of omstandigheden op mutagene eigenschappen. - Google Patents
Werkwijze voor het detecteren van mutaties, transgeen zoogdier, transgene zoogdiercel, en werkwijze voor het onderzoeken van stoffen of omstandigheden op mutagene eigenschappen. Download PDFInfo
- Publication number
- NL9100567A NL9100567A NL9100567A NL9100567A NL9100567A NL 9100567 A NL9100567 A NL 9100567A NL 9100567 A NL9100567 A NL 9100567A NL 9100567 A NL9100567 A NL 9100567A NL 9100567 A NL9100567 A NL 9100567A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- plasmid
- dna
- lacz
- transgenic
- negative
- Prior art date
Links
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 51
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims abstract description 42
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 37
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims description 22
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 title claims description 8
- 231100000243 mutagenic effect Toxicity 0.000 title claims description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 120
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 37
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 30
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 22
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 21
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 85
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 47
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 36
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 claims description 28
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 24
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 claims description 21
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 13
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 12
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 12
- 101000946191 Galerina sp Laccase-1 Proteins 0.000 claims description 11
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 claims description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 10
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 9
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 9
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 8
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 8
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 claims description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 claims description 5
- 238000011824 transgenic rat model Methods 0.000 claims description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 101100398597 Botryotinia fuckeliana lcc1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100068374 Gibberella zeae (strain ATCC MYA-4620 / CBS 123657 / FGSC 9075 / NRRL 31084 / PH-1) GIP1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 claims 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 9
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 25
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 13
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 12
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 11
- 101150002054 galE gene Proteins 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 231100000299 mutagenicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000007886 mutagenicity Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000011820 transgenic animal model Methods 0.000 description 4
- 238000010953 Ames test Methods 0.000 description 3
- 231100000039 Ames test Toxicity 0.000 description 3
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 3
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 3
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000644323 Escherichia coli C Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 101100173636 Rattus norvegicus Fhl2 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N UDP-alpha-D-galactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N 0.000 description 2
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 2
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N tioguanine Chemical compound N1C(N)=NC(=S)C2=C1N=CN2 WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 206010007269 Carcinogenicity Diseases 0.000 description 1
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100508793 Mus musculus Ing3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000260 carcinogenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007670 carcinogenicity Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002431 foraging effect Effects 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000006798 ring closing metathesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 108010040614 terminase Proteins 0.000 description 1
- 229960003087 tioguanine Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
- G01N33/5017—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity for testing neoplastic activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Werkwijze voor het detecteren van mutaties, transgeen zoogdier, transgene zoogdiercel, en werkwijze voor het onderzoeken van stoffen of omstandigheden op mutagene eigenschappen
De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het detecteren van mutaties in het DNA van een transgeen zoogdier of een transgene zoogdiercel, welk DNA één of meerdere kopieën van een in een bacteriële kloneringsvector gelegen markergen bevat, omvattende het isoleren van DNA uit cellen van het transgene zoogdier resp. uit transgene zoogdiercellen, het terugwinnen van de vector uit het geïsoleerde DNA, het transformeren met de teruggewonnen vector van een geschikte bacteriële gastheer en het aan de hand van expressie van het markergen in de gastheer vaststellen van mutaties die in het markergen zijn opgetreden.
De uitvinding heeft meer in het bijzonder betrekking op een transgeen diermodel voorzien van een in het genoom geïntegreerd markergen dat, na isolatie van chromosomaal DNA en opzuivering, efficiënt kan worden teruggewonnen. Na overbrenging van het markergen naar een bacterie die niet - in staat is tot gastheerrestrictie, wordt geselecteerd op de aanwezigheid van een gemuteerd markergen om de mutatie frequentie vast te stellen.
Zo'n diermodel is o.a. van belang voor het testen van stoffen op kankerverwekkende eigenschappen. Alle nieuw verkregen verbindingen worden in principe verdacht van carcinogeniciteit. Volgens de huidige inzichten zouden ze de struktuur van erfelijk materiaal, dat in elke celkern aanwezig is, kunnen veranderen. Zulke veranderingen van het erfelijk materiaal (mutaties) kunnen onder andere leiden tot kanker. Mutagene stoffen (stoffen die mutaties in het DNA veroorzaken) zijn voor zover bekend ook carcinogeen en kunnen eveneens mutaties veroorzaken in de geslachtscellen, wat aanleiding kan geven tot overdraagbare genetische afwijkingen. De mutageniciteit van een stof wordt beschouwd als het belangrijkste criterium bij het bepalen van het risico op het krijgen van kanker of erfelijke afwijkingen. Het is daarom bijzonder belangrijk de mutageniciteit van een stof in een vroeg stadium te kunnen vaststellen.
De tot dusver bekendste methode voor het testen van potentiëel mutagene stoffen is de Ames test (Ames, 1973), waarbij mutaties worden gedetecteerd in bacteriën. Alhoewel deze test, vanwege de korte generatietijden van een bacterie, snel kan worden uitgevoerd, heeft uitgebreid onderzoek uitgewezen dat de voorspellende waarde van de Ames test niet 100% is (Hay, 1988; Ashby and Tennant, 1988) . In het algemeen wordt daarom de voorkeur gegeven aan een combinatie van testen, waaronder testen met gekweekte (in vitro) zoogdiercellen.
Op dit moment zijn er maar weinig mogelijkheden mutaties in vlvo in cellen van hogere dieren te detecteren. Een voorbeeld is de HPRT test, waarbij mutaties in het gen voor hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT) gedetecteerd worden op basis van de 6-thioguanine resistentie van de gemuteerde cellen (Albertini, 1982). Deze methode is echter arbeidsintensief en laat alleen metingen toe aan cellen die nog kunnen delen en eenvoudig te kweken zijn. Bovendien is het kunstmatige van de in vitro situatie een nadeel van deze methode, waardoor het moeilijk is uitspraken te doen omtrent mutatie-inductie in organen en weefsels en eventuele verschillen daartussen. Een alternatief hiervoor is het gebruik van proefdieren (met name knaagdieren) in lange-termijn studies. Hierbij worden dieren blootgesteld aan een verdachte stof en wordt gewacht op het al of niet verschijnen van tumoren. Dit is echter een tijdrovend proces dat enkele jaren kan duren en vereist vele dieren, met name wanneer lage concentraties van een verdachte stof worden getest. Dit maakt de test zeer kostbaar, waardoor stoffen die positief zijn in de Ames test vaak niet meer verder worden getest en dus niet op de markt verschijnen.
Een goed alternatief is het gebruik van transgene dieren zoals beschreven door Vijg en Uitterlinden (1987), Lohman et al. (1987) en Gossen et al. (1989) en in de Europese octrooiaanvrage EP-A-0 353 812. Het daarin beschreven transgene muizemodel bevat in elke lichaamscel een bacteriofaag lambda vector, waarin het bacteriële lacZ-gen is gekloneerd dat dient als het mutatie-doelwitgen. De vector kan op efficiënte wijze uit chromosomaal DNA worden teruggewonnen middels het in vitro inpakken van de vector in "lege" faag partikels. Vervolgens worden de vector-bevattende fagen uitgeplaat met £. coli C gastheercellen (die gastheerrestrictie-negatief zijn), waarin de selectie tussen gemuteerde lacZ vectoren (kleurloos) en niet-gemuteerde lacZ vectoren (blauw) plaatsvindt. De verhouding tussen het aantal kleurloze plaques en het aantal blauwe plaques geeft dan de mutatiefrequentie weer. Het redden van markergenen vanuit totaal chromosomaal zoogdier DNA op deze efficiënte wijze is voor het eerst beschreven door Gossen en Vijg (1988; zie ook de Europese octrooiaanvrage EP-A-0 353 812) .
Met behulp van deze methode kan in principe in elk weefsel of orgaan van bovenbeschreven transgene dieren mutatie-inductie worden bestudeerd. Een nadeel van deze methode is echter dat het terugwinnen van de bacteriofaag lambda vectoren door middel van ia vitro inpakken relatief kostbaar en arbeidsintensief is. Dit is inherent aan de aard van de vector die moet worden teruggewonnen en het principe dat ten grondslag ligt aan het bepalen van de mutatie-frequentie, nl. de verhouding van het aantal gemuteerde kleurloze plaques ten opzichte van het aantal niet gemuteerde blauwe plaques. Voor wat betreft de aard van de bacteriofaag lambda vector die moet worden teruggewonnen, hebben experimenten uitgewezen dat er een grote mate van variabiliteit bestaat tussen verschillende batches "packaging" extracten; dit betekent dat voor gebruik van elke afzonderlijke batch eerst de efficiëntie bepaald dient te worden. Met betrekking tot het bepalen van de mutatie-frequentie aan de hand van de ratio van het aantal kleurloze gemuteerde plaques versus het aantal blauwe niet-gemuteerde plaques, kan worden gesteld dat een omgekeerd systeem, waarbij mutante vectoren gekleurd en niet-mutante vectoren kleurloos zijn, de voorkeur zou verdienen. Immers, de spontane mutatiefrequentie in verschillende weefsels en organen is in de orde van 1:100 000. Voor het verkrijgen van betrouwbare mutatiefrequenties in verschillende weefsels en organen dienen met het huidige systeem tenminste 1 tot 1.5 miljoen plaques per orgaan of weefsel geanalyseerd te worden. De analyse van deze aantallen plaques is bijzonder arbeidsintensief en vereist grote hoeveelheden van het "packaging" extract, het substraat X-gal en de voor de analyse noodzakelijke petrischalen.
De uitvinding voorziet nu in een werkwijze en een dier-model die deze nadelen opheffen.
De onderhavige uitvinding verschaft op de eerste plaats een werkwijze voor het detecteren van mutaties in het DNA van een transgeen zoogdier of een transgene zoogdiercel, welk DNA één of meerdere kopieën bevat van een gelineariseerd plasmide dat een lacZ-gen inclusief lacZ-operatorsequentie als markergen bevat, omvattende het isoleren van DNA uit cellen van het transgene zoogdier resp. uit transgene zoogdiercellen, het fragmenteren van het geïsoleerde DNA door behandeling met een restrictie-enzym dat het plasmide uit het DNA kan knippen, het in aanraking brengen van het gefragmenteerde DNA met vaste deeltjes waaraan een lacZ-operator-bindend materiaal is gebonden, het van niet-gebonden DNA scheiden van de vaste deeltjes met daaraan via de interactie tussen het lacZ-operator-bindend materiaal en de lacZ-operator gebonden plasmide DNA, het van de vaste deeltjes losmaken van het plasmide DNA, het circulariseren van het losgemaakte plasmide DNA, het met het verkregen plasmide transformeren van een gastheerrestrictie-negatieve, lacZ-negatieve en galE-negatieve bacteriële gastheer, en het kweken van getransformeerde bacteriën op een lactose-bevattend medium waarop alleen de bacteriën kunnen groeien die ten gevolge van een mutatie in het lacZ-gen geen β-galactosidase bezitten.
Met het detecteren van mutaties wordt hier bedoeld het vaststellen of en met welke frequentie mutaties zijn opgetreden. De mutatie frequentie kan in het geval van een transgeen proefdier betrokken zijn op het proefdier in zijn totaliteit, of op een bepaalde verzameling cellen van het proefdier, zoals cellen van een bepaald orgaan of cellen van een bepaald lichaamsdeel.
Het heeft volgens de uitvinding in het bijzonder de voorkeur dat het plasmide een voor klonering in Escherichia col,i bacteriën geschikt plasmide is en als bacteriële gastheer een gastheerrestrictie-negatieve, lacZ-negatieve en galE-negatieve Escherichia coli stam wordt gebruikt. De uitvinding is echter niet tot het gebruik van £. coli bacteriën beperkt. Ook andere bacteriesoorten komen als bacteriële gastheer in aanmerking, mits geschikte vectorplasmiden en gastheerrestrictie-negatieve stammen ter beschikking staan.
Om getransformeerde van niet-getransformeerde bacteriën te kunnen onderscheiden dient het plasmide een selectiemarkergen te bevatten. Hiervoor zijn vele mogelijkheden aan de deskundige bekend. Doorgaans worden voor dit doel antibioticumresistentie-genen gebruikt die de getransformeerde bacteriën resistentie tegen bepaalde antibiotica verlenen. Het heeft de voorkeur dat het voor klonering in Escherichia coli bacteriën geschikte plasmide een ampicilline-resistentiegen als selectiemarkergen bevat en als bacteriële gastheer een ampicilline-gevoelige, gastheerrestrictie-negatieve, lacZ-negatieve en galE-negatieve Escherichia coli stam wordt gebruikt.
Hoewel het plasmide in een gelineariseerde vorm direct in het zoogdier DNA kan zijn opgenomen, heeft het volgens de uitvinding zeer de voorkeur dat het plasmide in het zoogdier DNA geïntroduceerd is als onderdeel van een bacteriofaag vector waarin het door insertie is opgenomen na met behulp van een restrictie-enzym te zijn gelineariseerd. De voorkeur heeft dat het plasmide door insertie is opgenomen in een bacteriofaag lambda vector. Een dergelijke constructie maakt het mogelijk de huidige uitvinding direct te vergelijken met de op dit moment toegepaste "Mutamouse", d.w.z. een transgene muis op grond van het systeem, beschreven door de uitvinders in hun Europese octrooiaanvrage EP-A-0 353 812. Laatstgenoemde systeem werkt volgens het principe van het terugwinnen van geïntegreerde bacteriofaag (lambda) vectoren uit chromosomaal DNA met behulp van commerciëel verkrijgbare packaging extracten. Met behulp van de beschreven voorkeursuitvoeringsvorm van de huidige uitvinding kunnen mutaties in hetzelfde lacZ-gen zowel door plasmide-rescue als door bacteriofaag lambda rescue worden bepaald. Hiervan kan voor een bevestiging van de gevonden resultaten gebruik worden gemaakt.
Een concrete voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding is dat het plasmide pUR288 is dat in de unieke EcoRI site van de bacteriofaag lambda vector gtlO is gekloneerd en dit restrictie-enzym EcoRI voor de fragmentering van het geïsoleerde DNA wordt gebruikt.
Het zoogdier DNA kan zowel DNA van in vitro gekweekte zoogdiercellen als DNA van een transgeen zoogdier zijn. In het laatste geval zal doorgaans sprake zijn van (kleine) knaagdieren zoals ratten en muizen. De voorkeur heeft dat het plasmide in het DNA van een transgene muis of rat is geïntroduceerd.
In een bijzondere voorkeursuitvoeringsvorm worden als vaste deeltjes magnetische deeltjes gebruikt. Door magnetische deeltjes te gebruiken kan op een zeer eenvoudige en efficiënte wijze een scheiding tot stand worden gebracht tussen het aan de deeltjes gehechte DNA en het niet gebonden DNA. De magnetische deeltjes kunnen eenvoudig met behulp van een magneet uit het mengsel worden opgepikt. Niet-magnetische deeltjes zijn echter ook bruikbaar. In dat geval kan een afscheiding uit het mengsel worden gerealiseerd door filtreren en/of centrifugeren en wassen.
Om selectief het plasmide DNA te kunnen oppikken zijn de vaste deeltjes bekleed met een lacZ-operator-bindend materiaal. Met "materiaal" wordt hier in hoofdzaak gedoeld op "eiwitachtig" of "eiwit" materiaal. Zo'n lacZ-operator-bindend materiaal zou bijvoorbeeld een antilichaam (polyklonaal of monoklonaal) met specifieke affiniteit voor de lacZ-operator kunnen zijn. In een concrete voorkeursuitvoeringsvorm bestaat het lacZ-operator-bindend materiaal uit een Lacl-repressor omvattend eiwitmateriaal, d.i. Lacl-repressor eiwit of Lacl-repressor fusie-eiwit. Dit materiaal kan direct aan de vaste deeltjes zijn gebonden, maar is bij voorkeur indirect aan de vaste deeltjes gebonden. De voorkeur heeft dat voor de isolatie van plasmide DNA vaste deeltjes worden gebruikt waaraan achtereenvolgens anti-p-galactosidase en Lacl-repressor/p-galactosidase fusie-eiwit zijn gebonden.
Nadat de vaste deeltjes met daaraan gebonden plasmide DNA van het niet-gebonden DNA zijn afgescheiden, moet het aan de deeltjes gebonden plasmide DNA weer van de deeltjes worden losgemaakt. In het geval dat als lacZ-operator-bindend materiaal bijvoorbeeld een Lacl-repressor omvattend eiwitmateriaal aan de vaste deeltjes is gebonden, kan men hiertoe gebruik maken van stoffen die een grotere affiniteit voor de Lacl-repressor of de lacZ-operator hebben dan de Lacl-repressor en de lacZ-operator voor elkaar hebben. De voorkeur heeft dat voor het losmaken van plasmide DNA van de vaste deeltjes isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) wordt gebruikt dat de binding tussen de Lacl-repressor en de lacZ-operator opheft.
De uitvinding strekt zich voorts uit tot een transgeen zoogdier, met uitzondering van de mens, omvattende in het zoogdier DNA een of meerdere kopieën van een plasmide dat een lacZ-gen inclusief lacZ-operatorsequentie bevat. Het plasmide is bij voorkeur een voor klonering in Escherichia coli bacteriën geschikt plasmide, dat bij voorkeur als selectiemarkergen een ampicilline-resistentiegen bevat en bij voorkeur in het zoogdier DNA is geïntroduceerd als onderdeel van een bacteriofaag vector, liefst een bacteriofaag lambda vector, waarin het door insertie is opgenomen na met behulp van een restrictie-enzym te zijn gelineariseerd. Een concrete voorkeursuitvoeringsvorm volgens de uitvinding is een transgeen zoogdier, waarin het plasmide pUR288 is dat in de unieke EcoRI site van de bacteriofaag lambda vector gtlO is gekloneerd. Het transgene zoogdier is bij voorkeur een transgeen knaagdier, liefst een transgene muis of rat.
De uitvinding strekt zich voorts uit tot een transgene zoogdiercel die in het zoogdier DNA een of meerdere kopieën omvat van een plasmide dat een lacZ-gen inclusief lacZ-operator-sequentie bevat. Het plasmide is bij voorkeur een voor klonering in Escherichia coli bacteriën geschikt plasmide. Dit plasmide bevat bij voorkeur een ampicilline-resistentiegen als selectiemarkergen. Het plasmide is bij voorkeur in het zoogdier DNA geïntroduceerd als onderdeel van een bacteriofaag vector, liefst een bacteriofaag lambda vector, waarin het door insertie is opgenomen na met behulp van een restrictie-enzym te zijn gelineariseerd. In een concrete transgene zoogdiercel volgens de uitvinding is het plasmide pUR288 dat in de unieke EcoRI site van de bacteriofaag lambda vector gtlO is gekloneerd. Bij voorkeur is de transgene zoogdiercel een transgene knaagdiercel, liefst een transgene muize- of rattecel.
De uitvinding verschaft een in vivo werkwijze voor het onderzoeken van stoffen of omstandigheden op mutagene eigenschappen door een of meerdere transgene zoogdieren volgens de uitvinding aan een te onderzoeken stof of omstandigheid bloot te stellen en vervolgens op de hierboven beschreven wijze mutaties in het als markergen fungerende lacZ-gen te detecteren. Men kan hierbij ook cel- of orgaan-specifiek werken om verschillen in mutageniciteit van de onderzochte stof of omstandigheid voor verschillende cellen of organen vast te stellen.
Ook verschaft de uitvinding een in vitro werkwijze voor het onderzoeken van stoffen of omstandigheden op mutagene eigenschappen door transgene zoogdiercellen volgens de uitvinding aan een te onderzoeken stof of omstandigheid bloot te stellen en vervolgens op de beschreven wijze mutaties in het als markergen fungerende lacZ-gen te detecteren.
De uitvinding zal onderstaand nader worden toegelicht aan de hand van een concrete voorkeursuitvoeringsvorm, die een nieuwe transgene muis betreft.
De uitvinding, welke bijvoorbeeld een transgene muis betreft waarbij het markergen zich in een plasmide bevindt binnen een bacteriofaag lambda vector die in meerdere kopieën op één der chromosomen is geïntegreerd, kent niet de bovengenoemde beperkingen van de bekende methoden voor het vaststellen van mutaties in DNA. In het diermodel volgens de uitvinding is de terugwinning van het markergen bijzonder efficiënt doordat hij gebruik maakt van een plasmide als bacteriële kloneringsvector en lacZ inclusief de lacZ-operatorsequentie als markergen, waardoor de sterke en specifieke binding van Lacl-repressoreiwit aan de operatorsequentie die voorafgaat aan het bacteriële lacZ-gen in het plasmide, kan worden benut om de vector terug te winnen. Door verder gebruik te maken van magnetische bolletjes met daaraan gebonden een tegen β-galactosidase gericht anti-lichaam dat vervolgens wordt gekoppeld aan het β-galactosidase-Lacl-repressor fusie-eiwit (Lacl/Z), kan het lacZ markergen na binding met het Lacl-repressoreiwit eenvoudig met behulp van een magneet uit chromosomaal DNA worden geïsoleerd. De binding tussen de operator-sequentie van het markergen en het repressor-eiwit kan worden opgeheven door toevoeging van IPTG (isopropyl β-D-thiogalactoside). Door de veel hogere affiniteit van IPTG voor de Lacl-repressor zal het markergen-bevattende plasmide DNA vrij in oplossing komen. De na ringsluiting verkregen plasmiden worden vervolgens overgebracht naar een bacteriële gastheer die alleen in staat is tot groei (op een lactose-bevattend medium) wanneer een gemuteerd markergen is opgenomen (£. coli. amp negatief, gastheerrestrictie-negatief, lacZ-negatief, galE-negatief). Door het aantal kolonies te relateren aan de hoeveelheid geïsoleerde markergenen kan dus op eenvoudige wijze de spontane of geïnduceerde mutatiefrequentie in alle weefsels en organen van de transgene muis nauwkeurig en snel bepaald worden. Het kostbare en tijdrovende doormeten van honderdduizenden plaques wordt hiermee vermeden. In tegenstelling tot packaging extracten, die theoretisch in staat zijn circa 10% van de bacteriofaag lambda moleculen terug te winnen, bestaat er geen variabiliteitsprobleem bij het terugwinnen van plasmiden uit totaal genomisch DNA met behulp van het aan magnetische bolletjes gekoppelde repressor eiwit en het overbrengen van de plasmiden naar £. coli gastheercellen door middel van bijvoorbeeld elektroporatie. Bij laatstgenoemd proces, dat eveneens een efficiëntie heeft van ongeveer 10% (vergeleken met ca. 0.01% zonder de opzuiveringsstap) zijn alleen de competente fi. coli cellen een mogelijke biologische variabele, maar de ervaring heeft geleerd dat deze factor redelijk constant is.
De hierboven beschreven methode voor het isoleren van markergen moleculen uit totaal chromosomaal DNA, waarbij gebruik gemaakt wordt van de sterke binding tussen het Lacl-repressor eiwit en de operator sequentie, is niet eerder in de literatuur beschreven. Wel is een soortgelijke methode beschreven voor het isoleren van DNA bindende eiwitten (Levens and Howly 1985) welke methode eveneens gebaseerd is op de hoge affiniteit van het Lacl-repressor eiwit voor de operator sequentie. Toepassing van de Lacl-repressor-operator binding voor het snel opzuiveren van het markergen lacZ uit chromosomaal DNA ten behoeve van mutatie analyse is echter, zoals gezegd, niet eerder voorgesteld. Het preparatief aanwenden van de magnetische bolletjes-technologie en de bekende binding tussen het Lacl-repressor eiwit en de lacZ-operator sequentie bij de opzuivering van specifieke DNA sequenties rechtstreeks uit chromosomaal DNA behelst een uniek toepassingsgebied, namelijk dat van de mutatie analyse. Binnen dit vakgebied is direkte selectie gebruikelijk, terwijl volgens de uitvinding eerst zoveel mogelijk kopieën van het markergen worden geïsoleerd.
Een belangrijk aspect van de huidige uitvinding is de efficiëntie waarmee plasmiden, geïntegreerd in het genoom van hogere organismen, kunnen worden teruggewonnen. Eerder onderzoek door onder andere de huidige uitvinders (Gossen en Vijg, 1988; Europese octrooiaanvrage EP-A-0 353 812) ter bepaling van de terugwinningsefficiëntie van bacteriofaag lambda vectoren uit totaal chromosomaal DNA van transgene muizen, met behulp van verschillende E. coli gastheerstammen, toonde aan dat alleen E. coli gastheerstammen gebruikt konden worden die niet in staat zijn tot gastheerrestrictie. E- coli stammen die niet in staat zijn tot gastheerrestrictie zijn noodzakelijk omdat bacteriofaag lambda vectoren, na introductie in het genoom van een dier, worden gemodificeerd. Het gemodificeerde DNA wordt na introductie in een bacteriële cel als zodanig herkend en onmiddellijk afgebroken door gastheerrestrictie systemen. Dit geldt eveneens voor het terugwinnen van plasmide vectoren.
Een op geïntegreerde plasmiden gebaseerd mutatiemodel ligt op zich zelf niet voor de hand omdat het bekend is dat het terugwinnen van bacteriofaag lambda vectoren aanzienlijk efficiënter is dan het terugwinnen van plasmide vectoren. Een mogelijke oorzaak hiervan is dat plasmiden, alvorens ze kunnen worden overgebracht naar een bacteriële gastheer, uit het genomisch DNA geknipt en vervolgens gecirculariseerd moeten worden. Dit laatste proces is normaliter weinig efficiënt omdat, door de aanwezigheid van een overmaat aan chromosomaal DNA, de circularisatie stap bij een zeer lage DNA concentratie moet worden uitgevoerd. Dit heeft tot nu toe een succesvolle toepassing van een op geïntegreerde plasmiden gebaseerd mutatie-model in de weg gestaan.
De huidige uitvinding kent bovengenoemde beperkingen niet door toepassing van een snelle opzuiveringsstap, namelijk het efficiënt scheiden van het markergen-bevattende plasmide van chromosomaal DNA door binding van het, aan magnetische bolletjes gekoppelde, Lacl-repressor eiwit aan de operator sequentie die voorafgaat aan het lacZ-gen. Door deze opzuiveringsstap wordt in essentie al het overtollige chromosomaal DNA verwijderd en kan de circularisatie daarna in een klein volume efficiënt worden uitgevoerd.
Bovengenoemd principe maakt de huidige uitvinding, een transgeen diermodel met in elke lichaamscel (waaronder ook de geslachtscellen) een markergen dat op eenvoudige wijze kan worden teruggewonnen en geanalyseerd op de aanwezigheid van mutaties, bij uitstek geschikt voor het testen van stoffen die verdacht worden van mutageniciteit. Het geïntegreerde plasmide kan na binding met het Lacl-repressor complex met een hoge efficiëntie worden teruggewonnen en overgebracht naar een E. coli gastheercel (gastheerrestrictie-negatief) voor het bepalen van de mutatie-frequentie.
Teneinde in staat te zijn mutante lacZ-genen eenvoudig te kunnen detecteren is het gewenst een selectie-systeem te hanteren waarbij de niet mutante kolonies niet overleven ten gunste van de mutante kolonies. Dit is volgens een ander aspect van de uitvinding gerealiseerd door gebruik te maken van een galE-negatieve E. coli stam. Indien na opzuivering de lacZ-bevattende plasmiden worden overgebracht naar een E. coli gastheer die gastheerrestrictie-negatief, lacZ-negatief en galE-negatief is, zullen na uitplaten op een lactose-bevattend medium slechts die cellen groeien die een gemuteerd plasmide hebben opgenomen; E. coli cellen die een niet-gemuteerd plasmide hebben opgenomen zullen, door de aanwezigheid van het β-galactosidase, lactose omzetten tot galactose. De verdere omzetting van galactose is echter, door de mutatie in het galE gen, niet mogelijk. Dit leidt tot een ophoping van het toxische bijprodukt UDP-galactose waardoor de cel sterft (Malamy, 1966). Toepassing van galE-negatieve stammen voor mutatie-analyse bij hogere dieren is nieuw. Deze vorm van selectie is niet mogelijk met bacteriofaag lambda vectoren omdat een £. coli cel die door een bacteriofaag virus is geïnfecteerd, na korte tijd sterft. Het toxische effect van ophoping van het UDP-galactose zou dan verloren gaan.
De huidige uitvinding kent aldus twee componenten, te weten (1) technische componenten die een snelle opzuivering van geïntegreerde plasmiden uit totaal chromosomaal zoogdier DNA en een eenvoudige detectie van gemuteerde markergenen verzekeren, en (2) biologische componenten in de gedaante van een nieuwe soort transgene zoogdieren en een bepaald type bacteriële gastheer voor het detecteren van gemuteerde markergenen, resulterend in een transgeen diermodel met behulp waarvan de bovengenoemde technische componenten direkt kunnen worden toegepast als een nieuw in vivo mutatiemodel.
De volgens de uitvinding toegepaste methodieken, waaronder de magnetische bolletjes technologie voor het opzuiveren van markergenen uit totaal chromosomaal zoogdier DNA en het gebruik van een galE-, lacZ- en gastheerrestrictie-negatieve E.. coli stam voor het op eenvoudige wijze bepalen van de mutatie frequentie, maken het hier beschreven transgene muizemodel bij uitstek geschikt als een in vivo mutatie model. Een belangrijk aspect van het transgene muizemodel volgens de uitvinding is de relatief lage prijs die is verbonden aan het testen van potentiëel carcinogene stoffen. Ter vergelijking, de kosten van het testen van een mogelijk carcinogene stof met behulp van lange termijn studies in knaagdieren bedraagt circa 2 miljoen gulden (Goldberg and Frazier, 1989) en met behulp van het in de Europese octrooiaanvrage EP-A-0 353 812 beschreven transgene muizemodel gebaseerd op het terugwinnen van bacteriofaag lambda vectoren, circa 120 000 gulden. Laatstgenoemde kosten zijn gebaseerd op de analyse van 40 dieren waarbij de mutatie-frequentie wordt bepaald in één orgaan en zullen dus een veelvoud hiervan zijn wanneer meerdere organen getest worden. De kosten bij gebruik van het hier beschreven transgene muizemodel zullen daarentegen, wanneer één orgaan getest wordt, circa 20 000 gulden bedragen. De sterke kosten-reductie wordt voornamelijk verkregen door het gecombineerde gebruik van de magnetische bolletjes technologie en een galE-negatieve, lacZ-negatieve en gastheerrestrictie-negatieve £. coli gastheer, en speelt een belangrijke rol in het gebruik van een transgeen diermodel voor mutatie analyse in vivo.
Experiment 1: Het maken van transgene muizestam Ingeny Ml
De gebruikte vector was de bacteriofaag lambda-gtlO vector (Promega B.V. te Leiden) waarin het plasmide pUR288 is gekloneerd in de unieke EcoRI site (Fig. 1). Het pUR288 plasmide bevat een pBR322 Ori voor replicatie, het ampicilline gen, de lacZ-operatorsequentie en het gehele lacZ-gen (Ruther and Muller-Hill, 1986). De vector werd overgebracht naar de geslachtslijn van CD2 (Balb/c x DBA/2) muizen door middel van microïnjektie van bevruchte eicellen (Hogan et al., 1986).
Balb/c en DBA/2 zijn twee muizestammen afkomstig uit de knaagdierenkolonie van het TNO-Instituut voor Veroudering en Vaatonderzoek (TNO-IWO) te Rijswijk.
Uit de literatuur is bekend dat na microïnjektie van lineair DNA in een pronucleus van een bevruchte eicel, het geïnjecteerde DNA op een willekeurige plaats in een kop-staart oriëntatie in het genoom integreert (Palmiter and Brinster, 1986). Fig. 2A toont een schematische weergave van een kop-staart integratie van de plasmide-bevattende bacteriofaag lambda vectoren in het genoom van een muis. Het op deze wijze integreren van de lambda vectoren is essentieel voor het terugwinnen uit chromosomaal DNA door middel van in vitro packaging. Tijdens het integratie proces vormen de twee 12 baseparen overhangende uiteinden (cohesive ends) één intacte cos-site, welke wordt herkend door het terminase enzym in het in vitro inpak extract. Het lambda DNA tussen twee intacte cos-sites wordt ingepakt in een leeg faag partikeltje. Een en ander is uitgebreid beschreven in Europese octrooiaanvrage EP-A-0 353 812. Fig. 2B toont dat de plasmide bevattende lambda vectoren inderdaad kop-staart zijn geïntegreerd in het genoom van een muis van de stam Ingeny Ml (ING3). Dit werd aangetoond door Southern analyse van lever DNA.
Het chromosomale DNA is geknipt met het restrictie enzym Dral, dat de plasmide bevattende vector knipt in een aantal fragmenten waaronder één fragment van 1.2 kb. Dit fragment, dat een intacte cos-site bevat, is alleen aanwezig na kop-staart integratie van lambda vectoren. Het autoradiogram in Fig. 2B toont dat het 1.2 kb fragment inderdaad aanwezig is in chromosomaal DNA van een muizestam Ingeny Ml. Uit kruisingsexperimenten is gebleken dat het desbetreffende concatemeer mendeliaans overerft.
Experiment 2. Het opzuiveren van geïntegreerde plaémiden uit chromosomaal DNA van muis ING3
Fig. 3 toont de opzuivering en circularisatie van het lineaire pUR288 plasmide uit chromosomaal DNA van een Ingeny Ml transgene muis (ING3). Voor het opzuiveren van het lacZ bevattende plasmide uit chromosomaal DNA werd het chromosomale DNA vooraf met het restrictie enzym EcoRI geknipt (laan a). Vervolgens werden aan circa 10 μg chromosomaal DNA circa 10^ magnetische bolletjes (bijvoorbeeld Dyna-beads M-450 schaap anti-muis IgG, ITK Diagnostics B.V. te Uithoorn) toegevoegd, waaraan achtereenvolgens een anti-p-galactosidase antilichaam (Promega B.V.) en een Lacl-p-galactosidase fusie eiwit (Promega B.V.) waren gekoppeld. De koppeling van het anti-p-galactosidase antilichaam aan de magnetische bolletjes en de koppeling van het Lacl/p-galactosidase fusie eiwit aan het anti-p-galactosidase antilichaam werden uitgevoerd volgens standaard protocollen (respectievelijk van ITK Diagnostics B.V. en Promega B.V.). Na 1 uur werden de magnetische bolletjes, met daaraan gebonden het lacZ bevattende plasmide, gescheiden van het overige chromosomale DNA met behulp van een magneet (ITK Diagnostics B.V.) en tenminste 2 maal gewassen in 250 μΐ 50 mM Tris.HCl pH 8.0, 100 mM NaCl. De koppeling tussen het Lacl-repressor eiwit en de operator sequentie werd opgeheven door de magneetbolletjes over te brengen naar 10 μΐ 50 mM Tris.HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, 0.2% IPTG (laan b). Circularisatie van het plasmide werd uitgevoerd volgens standaard protocollen (Maniatis et al., 1982). Omdat het gecirculariseerde plasmide in vergelijking met het lineaire plasmide tijdens agarose gel electroforese een lagere migratie snelheid heeft, kan de circularisatie van het teruggewonnen pUR288 plasmide eenvoudig geanalyseerd worden (laan c).
Experiment 3. Het bepalen van de terugwinningsefficiëntie van geïntegreerde plasmiden uit chromosomaal DNA van muis ING3 De terugwinningsefficiëntie van het lacZ bevattende plasmide wordt bepaald door een klein gedeelte van de gecirculariseerde pUR288 plasmiden over te brengen door middel van transformatie naar competente cellen. De transformatie kan worden uitgevoerd met ampicilline-gevoelige E. coli stammen die gastheer-restrictie en lacZ negatief zijn zoals: E. coli C (Gossen en Vijg, 1988), E. coli Sure (Stratagene, Westburg B.V. te Leusden) of DH5aMCR (Life Technologies B.V. te Breda). De transformatie werd uitgevoerd door middel van electroporatie zoals beschreven door Dower et al., 1988. De pUR288 bevattende E· coli cellen werden vervolgens uitgeplaat op ampicilline (50 μg/ml) bevattend LB Agar medium (Gibco BRL). Na incubatie van de platen overnacht bij 37°C is het aantal kolonies (A) een maat voor de terugwinningsefficiëntie. In dit experiment werden uit ca. 5 μg chromosomaal DNA, dat vooraf geknipt was met het restrictie-enzym EooRI. ca. 50 000 plasmides teruggewonnen. De overige gecirculariseerde plasmiden kunnen vervolgens worden overgebracht naar een E. coli gastheer (amp negatief, lacZ negatief en gastheerrestrictie negatief) die gevoelig is voor galactose (galE negatief) . Na transformatie worden de E. ££li cellen uitgeplaat op lactose (1%) en ampicilline (50 μg/ml) bevattend LB medium. Alleen cellen die ten gevolge van een mutatie in het lacZ-gen geen β-galactosidase bezitten, zijn niet in staat lactose om te zetten naar galactose en kunnen groeien op dit medium. Het aantal kolonies (B), na incubatie van de platen overnacht bij 37°C, is een maat voor het aantal mutanten. De mutatiefrequentie wordt vervolgens bepaald door de verhouding B/A.
Experiment 4. Het terugwinnen van geïntegreerde bacteriofaag lambda vectoren uit chromosomaal DNA van een transgeen dier.
Ter vergelijking werden met de Ingeny Ml muizestam lacZ terugwinningsexperimenten gedaan door middel van bacteriofaag lambda in plaats van plasmide rescue. Het terugwinnen van de plasmide bevattende bacteriofaag lambda vector werd uitgevoerd door toevoeging van maximaal 10 μg chromosomaal DNA aan een in vitro packaging extract (Stratagene, Westburg B.V. te Leusden). Na incubatie van het extract bij 22°C gedurende 2 uur werd het extract verdund met 500 μΐ SM buffer (100 mM NaCl, 8 mM MgS04.H20, 50 mM Tris.Cl pH 7.5) en werd de terugwinnings- efficiëntie bepaald door middel van het uitplaten van de circa 5 μΐ faag oplossing met E.. coli C (lacZ negatief, gastheerrestrictie negatief) gastheer cellen (Maniatis et al., 1982). Op deze wijze konden circa 500 000 vectoren worden teruggewonnen uit circa 10 μg lever DNA van een transgene muis van stam Ingeny Ml (ING3). De mutatiefrequentie wordt bepaald als de ratio tussen het aantal kleurloze (lacZ-gen gemuteerd) en blauwe (lacZ-gen niet gemuteerd) plaques.
Beschrijving van de figuren
Fig. 1 is een schematische weergave van de pUR288 plasmide bevattende bacteriofaag lambda vector gt-10 zoals beschreven in experiment 1.
Fig 2a is een schematische weergave van een kop-staart integratie van de vector in het genoom van een muis.
Fig 2b is een weergave van het autoradiogram verkregen na Southern blotting van lever DNA van verschillende transgene muizen, geknipt met het restrictie-enzym Dral.
Fig 3 toont het terugwinnen van het pUR288 plasmide uit totaal chromosomaal DNA van een Ingeny Ml transgene muis. Het autoradiogram werd verkregen na Southern-blotting van lever DNA van transgene muis ING-3 geknipt met het restrictie-enzym EcoRI (laan a), het m.b.v. magnetische bolletjes opgezuiverd pUR288 plasmide (laan b), het gecirculariseerde pUR288 plasmide (laan c). Als probe werd het 32P-gelabelde pUR288 plasmide gebruikt.
Referenties
Albertini, R.J. et al. Proc Natl. Acad. Sci. USA 79, 6617 (1982) Ames, B.N., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70, 2281 (1973) Ashby, J. and Tennant, R.W. Mutation Res. 204, 17-115 (1988) Dower, W.J. et al. Nucleic. Acids. Res. 16, 6127-5145 (1988) Europese octrooiaanvrage EP-A-0 353 812
Goldberg, A.M. and Frazier, J.M., Scientific American 261, 16-22 (1989)
Gossen, J.A. and Vijg, J. Nucleic Acids Res. 16, 9343 (1988) Gossen, J.A., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 7971-7975 (1989) Hay, A., Nature 332, 782-783 (1988)
Hogan, B. et al. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1986)
Levens, D. and Howly, P.M. Mol. Cell. Biol. 5, 2307 (1985) Lohman, P.H.M. et al. Mutation Res. 181, 227-234 (1987)
Malamy, M.H., Cold Spring Harbor Symposium on Quantitive Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 31, 189-201 (1966)
Maniatis, T. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982) Palmiter, R.D. and Brinster, R.L. Annu. Rev. Genet. 20, 465 (1987)
Ruther, U. and Müller-Hill, B. EMBO 2, 1791-1793 (1983)
Vijg, J. and Uitterlinden, A.G. Mech. Ageing Dev. 41, 47-63 (1987)
Claims (27)
1. Werkwijze voor het detecteren van mutaties in het DNA van een transgeen zoogdier of een transgene zoogdiercel, welk DNA één of meerdere kopieën bevat van een gelineariseerd plasmide dat een lacZ-gen inclusief lacZ-operatorsequentie als markergen bevat, omvattende het isoleren van DNA uit cellen van het transgene zoogdier resp. uit transgene zoogdiercellen, het fragmenteren van het geïsoleerde DNA door behandeling met een restrictie-enzym dat het plasmide uit het DNA kan knippen, het in aanraking brengen van het gefragmenteerde DNA met vaste deeltjes waaraan een lacZ-operator-bindend materiaal is gebonden, het van niet-gebonden DNA scheiden van de vaste deeltjes met daaraan via de interactie tussen het lacZ-operator-bindend materiaal en de lacZ-operator gebonden plasmide DNA, het van de vaste deeltjes losmaken van het plasmide DNA, het circulariseren van het losgemaakte plasmide DNA, het met het verkregen plasmide transformeren van een gastheerrestrictie-negatieve, lacZ-negatieve en galE-negatieve bacteriële gastheer, en het kweken van getransformeerde bacteriën op een lactose-bevattend medium waarop alleen de bacteriën kunnen groeien die ten gevolge van een mutatie in het lacZ-gen geen β-galactosidase bezitten.
2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin het plasmide een voor klonering in Escherichia coli bacteriën geschikt plasmide is en als bacteriële gastheer een gastheerrestrictie-negatieve, lacZ-negatieve en galE-negatieve Escherichia coli stam wordt gebruikt,
3. Werkwijze volgens conclusie 2, waarin het voor klonering in Escherichia coli bacteriën geschikte plasmide een ampicilline-resistentiegen als selectiemarkergen bevat en als bacteriële gastheer een ampicilline-gevoelige, gastheerrestrictie-negatieve, lacZ-negatieve en galE-negatieve Escherichia coli stam wordt gebruikt.
4. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-3, waarin het plasmide in het zoogdier DNA geïntroduceerd is als onderdeel van een bacteriofaag vector waarin het door insertie is opgenomen na met behulp van een restrictie-enzym te zijn gelineariseerd.
5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarin het plasmide door insertie is opgenomen in een bacteriofaag lambda vector.
6. Werkwijze volgens conclusie 5, waarin het plasmide pUR288 is dat in de unieke Eco.RI site van de bacteriofaag lambda vector gtlO is gekloneerd en dit restrictie-enzym EcoRI voor de fragmentering van het geïsoleerde DNA wordt gebruikt.
7. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-6, waarin het plasmide in het DNA van een transgene muis of rat is geïntroduceerd.
8. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-7, waarin als vaste deeltjes magnetische deeltjes worden gebruikt.
9. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-8, waarin als lacZ-operator-bindend materiaal een Lacl-repressor omvattend eiwitmateriaal wordt toegepast.
10. Werkwijze volgens conclusie 9, waarin voor de isolatie van plasmide DNA gebruik wordt gemaakt van vaste deeltjes waaraan achtereenvolgens anti-p-galactosidase en Lacl-repressor/p-galactosidase fusie-eiwit zijn gebonden.
11. Werkwijze volgens conclusie 9 of 10, waarin voor het losmaken van plasmide DNA van de vaste deeltjes isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) wordt gebruikt dat de binding tussen de Lacl-repressor en de lacZ-operator opheft.
12. Transgeen zoogdier, met uitzondering van de mens, omvattende in het zoogdier DNA een of meerdere kopieën van een plasmide dat een lacZ-gen inclusief lacZ operatorsequentie bevat.
13. Transgeen zoogdier volgens conclusie 12, waarin het plasmide een voor klonering in Escherichia coli bacteriën geschikt plasmide is.
14. Transgeen zoogdier volgens conclusie 13, waarin het voor klonering in Escherichia coli bacteriën geschikte plasmide een ampicilline-resistentiegen als selectiemarkergen bevat.
15. Transgeen zoogdier volgens een van de conclusies 12-14, waarin het plasmide in het zoogdier DNA is geïntroduceerd als onderdeel van een bacteriofaag vector waarin het door insertie is opgenomen na met behulp van een restrictie-enzym te zijn gelineariseerd.
16. Transgeen zoogdier volgens conclusie 15, waarin het plasmide door insertie is opgenomen in een bacteriofaag lambda vector.
17. Transgeen zoogdier volgens conclusie 16, waarin het plasmide pUR288 is dat in de unieke EcoRI site van de bacteriofaag lambda vector gtlO is gekloneerd.
18. Transgeen knaagdier, in het bijzonder transgene muis of rat, volgens een van de conclusies 12-17.
19. Transgene zoogdiercel, omvattende in het zoogdier DNA een of meerdere kopieën van een plasmide dat een lacZ-gen inclusief lacZ operatorsequentie bevat.
20. Transgene zoogdiercel volgens conclusie 19, waarin het plasmide een voor klonering in Escherichia coli bacteriën geschikt plasmide is.
21. Transgene zoogdiercel volgens conclusie 20, waarin het voor klonering in Escherichia coli bacteriën geschikte plasmide een ampicilline-resistentiegen als selectiemarkergen bevat.
22. Transgene zoogdiercel volgens een der conclusies 19-21, waarin het plasmide in het zoogdier DNA geïntroduceerd is als onderdeel van een bacteriofaag vector waarin het door insertie is opgenomen na met behulp van een restrictie-enzym te zijn gelineariseerd.
23. Transgene zoogdiercel volgens conclusie 22, waarin het plasmide door insertie is opgenomen in een bacteriofaag lambda vector.
24. Transgene zoogdiercel volgens conclusie 23, waarin het plasmide pUR288 is dat in de unieke EcoRI site van de bacteriofaag lambda vector gtlO is gekloneerd.
25. Transgene knaagdiercel, in het bijzonder transgene muize- of rattecel, volgens een van de conclusies 19-24.
26. Werkwijze voor het onderzoeken van stoffen of omstandigheden op mutagene eigenschappen door een of meerdere transgene zoogdieren volgens een van de conclusies 12-18 aan een te onderzoeken stof of omstandigheid bloot te stellen en vervolgens mutaties in het als markergen fungerende lacZ-gen te detecteren door het isoleren van DNA uit cellen van het transgene zoogdier, het fragmenteren van het geïsoleerde DNA door behandeling met een restrictie-enzym dat het plasmide uit het DNA kan knippen, het in aanraking brengen van het gefragmenteerde DNA met vaste deeltjes waaraan een lacZ-operator-bindend materiaal is gebonden, het van niet-gebonden DNA scheiden van de vaste deeltjes met daaraan via de interactie tussen het lacZ-operator-bindend materiaal en de lacZ-operator gebonden plasmide DNA, het van de vaste deeltjes losmaken van het plasmide DNA, het circulariseren van het losgemaakte plasmide DNA, het met het verkregen plasmide transformeren van een bacteriële gastheer die gastheerrestrictie-negatief, lacZ-negatief en galE-negatief is, en het kweken van getransformeerde bacteriën op een lactose-bevattend medium waarop alleen de bacteriën kunnen groeien die ten gevolge van een mutatie in het lacZ-gen geen β-galactosidase bezitten.
27. Werkwijze voor het onderzoeken van stoffen of omstandigheden op mutagene eigenschappen door transgene zoogdiercellen volgens een van de conclusies 19-25 aan een te onderzoeken stof of omstandigheid bloot te stellen en vervolgens mutaties in het markergen te detecteren door het isoleren van DNA uit de transgene zoogdiercellen, het fragmenteren van het geïsoleerde DNA door behandeling met een restrictie-enzym dat het plasmide uit het DNA kan knippen, het in aanraking brengen van het gefragmenteerde DNA met vaste deeltjes waaraan een lacZ-operator-bindend materiaal is gebonden, het van niet-gebonden DNA scheiden van de vaste deeltjes met daaraan via de interactie tussen het lacZ-operator-bindend materiaal en de lacZ-operator gebonden plasmide DNA, het van de vaste deeltjes losmaken van het plasmide DNA, het circulariseren van het losgemaakte plasmide DNA, het met het verkregen plasmide transformeren van een bacteriële gastheer die gastheerrestrictie-negatief, lacZ-negatief en galE-negatief is, en het kweken van getransformeerde bacteriën op een lactose-bevattend medium waarop alleen de bacteriën kunnen groeien die ten gevolge van een mutatie in het lacZ-gen geen β-galactosidase bezitten.
Priority Applications (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL9100567A NL9100567A (nl) | 1991-04-02 | 1991-04-02 | Werkwijze voor het detecteren van mutaties, transgeen zoogdier, transgene zoogdiercel, en werkwijze voor het onderzoeken van stoffen of omstandigheden op mutagene eigenschappen. |
| AT92909305T ATE128735T1 (de) | 1991-04-02 | 1992-04-02 | Verfahren für die bestimmung von mutationen in der dna eines genetisch manipuliertien säugetiers oder einer genetisch manipulierten säugetierzelle. |
| US08/122,562 US5602300A (en) | 1991-04-02 | 1992-04-02 | Process for detecting mutations, transgenic mammal transgenic mammalian cell, and process for testing agents or conditioning for mutagenic properties |
| ES92909305T ES2078043T3 (es) | 1991-04-02 | 1992-04-02 | Procedimiento para detectar mutaciones en el adn de un mamifero transgenico o una celula de mamifero transgenico. |
| PCT/NL1992/000062 WO1992017605A1 (en) | 1991-04-02 | 1992-04-02 | Process for detecting mutations, transgenic mammal, transgenic mammalian cell, and process for testing agents or conditions for mutagenic properties |
| DK92909305.2T DK0579713T3 (da) | 1991-04-02 | 1992-04-02 | Fremgangsmåde til påvisning af mutationer i et transgent pattedyrs eller en transgen pattedyrcelles DNA |
| EP92909305A EP0579713B1 (en) | 1991-04-02 | 1992-04-02 | Process for detecting mutations in the DNA of a transgenic mammal or a transgenic mammalian cell |
| DE69205277T DE69205277T2 (de) | 1991-04-02 | 1992-04-02 | Verfahren für die Bestimmung von Mutationen in der DNA eines genetisch manipuliertien Säugetiers oder einer genetisch manipulierten Säugetierzelle. |
| JP4508708A JPH06506357A (ja) | 1991-04-02 | 1992-04-02 | トランスジェニック哺乳動物またはトランスジェニック哺乳動物細胞の変異検出方法、および変異特性に対する作用剤または条件の試験方法 |
| GR950402898T GR3017795T3 (en) | 1991-04-02 | 1995-10-18 | Process for detecting mutations in the DNA of a transgenic mammal or a transgenic mammalian cell. |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL9100567 | 1991-04-02 | ||
| NL9100567A NL9100567A (nl) | 1991-04-02 | 1991-04-02 | Werkwijze voor het detecteren van mutaties, transgeen zoogdier, transgene zoogdiercel, en werkwijze voor het onderzoeken van stoffen of omstandigheden op mutagene eigenschappen. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL9100567A true NL9100567A (nl) | 1992-11-02 |
Family
ID=19859081
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL9100567A NL9100567A (nl) | 1991-04-02 | 1991-04-02 | Werkwijze voor het detecteren van mutaties, transgeen zoogdier, transgene zoogdiercel, en werkwijze voor het onderzoeken van stoffen of omstandigheden op mutagene eigenschappen. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5602300A (nl) |
| EP (1) | EP0579713B1 (nl) |
| JP (1) | JPH06506357A (nl) |
| AT (1) | ATE128735T1 (nl) |
| DE (1) | DE69205277T2 (nl) |
| DK (1) | DK0579713T3 (nl) |
| ES (1) | ES2078043T3 (nl) |
| GR (1) | GR3017795T3 (nl) |
| NL (1) | NL9100567A (nl) |
| WO (1) | WO1992017605A1 (nl) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6307121B1 (en) | 1998-05-31 | 2001-10-23 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Bacteriophage-based transgenic fish for mutation detection |
| US6472583B1 (en) | 1998-10-26 | 2002-10-29 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Plasmid-based mutation detection system in transgenic fish |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991015579A1 (en) * | 1990-04-05 | 1991-10-17 | Stratagene | Mutagenesis testing using transgenic non-human animals carrying test dna sequences |
| CA2130081A1 (en) * | 1992-02-14 | 1993-08-19 | Jay M. Short | Mutagenesis testing using transgenic non-human animals carrying test dna sequences |
| EP0680517B2 (en) * | 1993-01-21 | 2005-01-19 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and diagnostic kits utilizing mammalian stress promoters to determine toxicity of a compound |
| JPH11510692A (ja) * | 1995-07-28 | 1999-09-21 | ベス イスラエル ディーコネス メディカル センター，インク． | 突然変異誘発を検査するための方法及び検査器具 |
| US6063359A (en) * | 1997-09-26 | 2000-05-16 | Washington University | Method for determining oncogenic activity of a substance |
| GB9826247D0 (en) * | 1998-11-30 | 1999-01-20 | Nycomed Pharma As | Method |
| EP1176211A1 (en) * | 2000-07-27 | 2002-01-30 | Novartis Forschungsstiftung, c/o Novartis International AG | Process for monitoring mutagens in plants |
| WO2021050227A1 (en) | 2019-09-13 | 2021-03-18 | Exxonmobil Chemical Patents Inc. | Slurry loop reactor polymerization rate and quality controller |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4753874A (en) * | 1985-07-08 | 1988-06-28 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Rapid mutation testing system for human cells |
| US5128256A (en) * | 1987-01-12 | 1992-07-07 | Stratagene | DNA cloning vectors with in vivo excisable plasmids |
| EP0289121B1 (en) * | 1987-05-01 | 1995-12-27 | Stratagene | Mutagenesis testing using transgenic non-human animals carrying test DNA sequences |
| WO1989009272A1 (en) * | 1988-03-22 | 1989-10-05 | Chemical Industry Institute Of Toxicology | A transgenic mouse for measurement and characterization of mutation induction in vivo |
| NL8801826A (nl) * | 1988-07-19 | 1990-02-16 | Tno | Werkwijze voor het detecteren van mutaties in markergenen. |
| EP0370813A3 (en) * | 1988-11-25 | 1991-06-19 | Exemplar Corporation | Rapid screening mutagenesis and teratogenesis assay |
-
1991
- 1991-04-02 NL NL9100567A patent/NL9100567A/nl not_active Application Discontinuation
-
1992
- 1992-04-02 WO PCT/NL1992/000062 patent/WO1992017605A1/en active IP Right Grant
- 1992-04-02 ES ES92909305T patent/ES2078043T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-02 EP EP92909305A patent/EP0579713B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-02 AT AT92909305T patent/ATE128735T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-04-02 US US08/122,562 patent/US5602300A/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-04-02 DE DE69205277T patent/DE69205277T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-04-02 JP JP4508708A patent/JPH06506357A/ja active Pending
- 1992-04-02 DK DK92909305.2T patent/DK0579713T3/da active
-
1995
- 1995-10-18 GR GR950402898T patent/GR3017795T3/el unknown
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6307121B1 (en) | 1998-05-31 | 2001-10-23 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Bacteriophage-based transgenic fish for mutation detection |
| US6472583B1 (en) | 1998-10-26 | 2002-10-29 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Plasmid-based mutation detection system in transgenic fish |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5602300A (en) | 1997-02-11 |
| DE69205277T2 (de) | 1996-03-21 |
| ES2078043T3 (es) | 1995-12-01 |
| GR3017795T3 (en) | 1996-01-31 |
| JPH06506357A (ja) | 1994-07-21 |
| ATE128735T1 (de) | 1995-10-15 |
| EP0579713B1 (en) | 1995-10-04 |
| DE69205277D1 (de) | 1995-11-09 |
| EP0579713A1 (en) | 1994-01-26 |
| WO1992017605A1 (en) | 1992-10-15 |
| DK0579713T3 (da) | 1995-12-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Paschke et al. | Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum | |
| Chiou et al. | p300 binding by E1A cosegregates with p53 induction but is dispensable for apoptosis | |
| Nakanishi et al. | Association with capsid proteins promotes nuclear targeting of simian virus 40 DNA. | |
| KR101762970B1 (ko) | 면역 기반 보툴리눔 독소 혈청형 ａ 활성 검정에 유용한 세포 | |
| JPH11502717A (ja) | 逆ツーハイブリッドシステム | |
| CN100379862C (zh) | 增强体细胞同源重组的方法和构建特异抗体的方法 | |
| JPH05504254A (ja) | レセプター感染アッセイ | |
| KR101380410B1 (ko) | 뉴클레아제에 의해 유전자 변형된 세포를 농축시키는 방법 | |
| KR100948767B1 (ko) | 생체 고분자 물질의 상호작용 검출 방법 | |
| US7157571B2 (en) | Hepatoma specific chimeric regulatory sequence | |
| NL9100567A (nl) | Werkwijze voor het detecteren van mutaties, transgeen zoogdier, transgene zoogdiercel, en werkwijze voor het onderzoeken van stoffen of omstandigheden op mutagene eigenschappen. | |
| JPH0484900A (ja) | 変異誘発性および催奇形性を迅速にスクリーニングする検定法 | |
| US6479289B2 (en) | Mammalian two-hybrid system | |
| Chucair-Elliott et al. | Translatomic response of retinal Müller glia to acute and chronic stress | |
| AU778719B2 (en) | Trap vector and gene trapping method by using the same | |
| CN109679976A (zh) | 一种可变剪接报告载体及其制备方法 | |
| Welsh et al. | A second domain of simian virus 40 T antigen in which mutations can alter the cellular localization of the antigen | |
| Lane et al. | Cellular targets for SV40 large T-antigen | |
| Mignone et al. | Nestin-based reporter transgenic mouse lines | |
| Smith et al. | Transdominant inhibition of herpes simplex virus growth in transgenic mice | |
| JP2021524016A (ja) | タンパク質のハイスループット分析法及びその適用ライブラリー | |
| CN110656088A (zh) | 一种稳定表达人源CaSR基因的细胞模型及其构建方法 | |
| KR102597698B1 (ko) | p-바디에 기반한 세포 내 단백질 간의 상호작용 분석 방법 | |
| JP2002530074A (ja) | 細胞表現型に相関するポリペプチド標的を検証する方法 | |
| Gurniak et al. | HuGE, a novel GFP-actin-expressing mouse line for studying cytoskeletal dynamics |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1B | A search report has been drawn up | ||
| BV | The patent application has lapsed |