JP2021524016A - タンパク質のハイスループット分析法及びその適用ライブラリー - Google Patents

タンパク質のハイスループット分析法及びその適用ライブラリー Download PDF

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Abstract

タンパク質のハイスループット分析法及びその適用ライブラリーであって、タンパク質のハイスループット分析法では、タグ付きセミクローンマウスライブラリーを使用し、１又は複数のタグタンパク質抗体で複数の興味のある異なる標的タンパク質を並行的に特定して分析する。前記のタグ付きセミクローンマウスライブラリーにおいて、各セミクローンマウスは、雄性発生半数体胚性幹細胞を卵子に注入し、培養して取得したセミクローンマウス又はその有性生殖の子孫である。前記雄性発生半数体胚性幹細胞には、興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現する遺伝子が含まれているため、前記セミクローンマウスは、興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現可能である。これにより、生体高分子の研究に、ハイスループットであり、生体内におけるリアルタイムで動的な研究に適した体系が提供される。【選択図】図１

Description

本発明は生物学分野に関し、特にプロテオミクス研究分野に関し、とりわけ、タンパク質のハイスループット分析法及びその適用ライブラリーに関する。
現在、ヒトゲノム計画によって、タンパク質をコードする２６０００余りの機能遺伝子が発見及びマッピングされている。しかし、このうち４２％の遺伝子については未だ機能が知られていない。また、既知の遺伝子については、酵素が１０．２８％、ヌクレアーゼが７．５％、シグナル伝達が１２．２％、転写因子が６．０％、シグナル分子が１．２％、受容体分子が５．３％、選択的調節分子が３．２％等となっている。これら機能遺伝子の働きを発見及び把握することは、生命の理解や新薬のスクリーニングにとって重要な意味を持つ。タンパク質機能の研究では、対応する抗体の調製が不可欠な作業となるが、抗体の取得には、１）調製が煩雑であり、コストが嵩む、２）多くのタンパク質は抗体を持っていない、３）由来の違いによる抗体の特異性や研究目的の違いによって、同一のタンパク質にも様々な種類の抗体が存在するため、実験の違いに応じて異なる抗体を選択せねばならない、４）細胞内及び体内においてタンパク質を研究する場合、抗体の多くは十分に機能を発揮できない、５）同一の抗体メーカーであっても抗体の調製ロットによって自然な差異が存在する場合がある、等の課題が存在する。これらの課題は科学研究の時間や経費の膨大な浪費につながり、研究者にとって極めて手間がかかることから、研究の進捗が制約されている。
卵子と精子が結合して形成される全能性の受精卵から生命は始まる。胚が発育し、最終的に２００種類あまりの異なる体細胞を備えた生命個体を形成するという過程は極めて複雑である。受精卵から生物個体への発育過程において、細胞は、それまでの個性や状態を維持するか、別の個性や状態に変化するかという選択に常に直面することになる。細胞の個性や状態の維持及び変化は、細胞自身に内在する遺伝的要因に制御されるほか、細胞を取り巻く環境要因によっても調整される。つまり、細胞内外の要因が互いに作用し合うことで、細胞の運命に変化可能性や転換といった特徴が備わることになる。また、生命個体は誕生後にも、成長、成熟、老いという過程を経るが、このような全ての変化の物質的基礎はタンパク質を含む生体高分子である。しかし、生体高分子は生命活動においてどのようにその機能を発揮するのだろうか。また、生体高分子同士はどのように協調し、役割を発揮しているのだろう。これらの問題提起は生命を理解するための一助となり、且つ、生命を更にコントロールし、疾病を回避するための理論的裏付けを提供することにもなる。ところが、現在のところ、生体高分子の研究については、生体内におけるリアルタイムで動的な研究に適した体系が不足している。
従来技術の欠点に鑑みて、本発明は一の局面において、タグ付きセミクローンマウスライブラリーを使用し、１又は複数のタグタンパク質抗体で複数の興味のある異なる標的タンパク質を並行的に特定して分析するタンパク質のハイスループット分析法を提供する。タグ付きセミクローンマウスライブラリーにおいて、各セミクローンマウスは、雄性発生半数体胚性幹細胞を卵子に注入し、培養して取得したセミクローンマウス又はその有性生殖の子孫である。前記雄性発生半数体胚性幹細胞には、興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現する遺伝子が含まれているため、前記セミクローンマウスは、興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現可能である。
本発明は、第２の局面において、更に、上記のタンパク質のハイスループット分析法に適用されるタグ付きセミクローンマウスライブラリー及びその構築方法を提供する。
本発明のタグ付きセミクローンマウスライブラリーにおいて、各セミクローンマウスが発現する興味のある標的タンパク質はいずれもタグタンパク質と融合発現する。各セミクローンマウスは、雄性発生半数体胚性幹細胞を卵子に注入し、培養して取得したセミクローンマウス又はその有性生殖の子孫である。前記雄性発生半数体胚性幹細胞には、興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現する遺伝子が含まれている。
本発明におけるタグ付きセミクローンマウスライブラリー又は前記ライブラリー由来のセミクローンマウスは、タンパク質の分析、タンパク質の機能研究又は薬物研究分野に適用可能である。
本発明は、第３の局面において、更に、上記のタンパク質のハイスループット分析法に適用されるタグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリー及びその構築方法を提供する。
本発明のタグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーにおいて、各雄性発生半数体胚性幹細胞には、興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現する遺伝子が含まれている。前記雄性発生半数体胚性幹細胞を卵子に注入し、培養して取得したセミクローンマウスは、興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現可能である。
本発明におけるタグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリー又は前記ライブラリー由来の雄性発生半数体胚性幹細胞は、タンパク質の分析、タンパク質の機能研究、薬物研究分野に適用可能である。
本発明によれば、以下の有益な効果が得られる。
ａ）タンパク質の科学研究が大幅に簡易化され、煩雑で複雑な抗体調製過程が回避されるとともに、高価な抗体を必要とすることもない。これにより、抗体の調製が難しいという標的タンパク質研究における課題が解決される。また、一般的な「タグ」抗体を利用することで、プロテオーム解析及びタンパク質間相互作用ネットワークの解析を実現し、薬物標的を手軽にスクリーニングできるため、疾患の診断や治療に良質の解析手段及び手頃な解析コストを提供可能となる。
ｂ）本発明を応用することで、タンパク質研究を、細胞から各発育段階、更には成体の各組織・器官にまで水平展開可能となる。本発明を利用すれば、生体内におけるリアルタイムで動的な定性・定量観測の実現、細胞内のタンパク質又はＲＮＡ分子間の作用ネットワークの解明、未知のタンパク質発現プロファイル及び生理機能の探索、個体の全発育過程の監視制御の実現等が可能となる。
ｃ）同一基準でタグを調製し、同一の抗体を応用することで、研究システムの一致性を向上させられるため、結果の信頼性が大幅に上昇する。よって、低コスト、高効率、大規模との特性を有する。
ｄ）タグが付加された興味のあるタンパク質をコードする遺伝子は細胞形式で保存可能であり、タグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーを構築している。よって、必要
なときに卵子に注入してマウスを取得すればよく、動物飼育等のコストが大幅に節約される。また、従来のタンパク質過剰発現の研究方法と比較して、研究開発の時間が極めて大幅に短縮される。
図１は、Ｂｒｄ４の内在性ゲノムにおけるＴＡＰタグの付加を示す図であり、図１のＡは、マウスのＢｒｄ４ゲノム及びその３つのアイソフォームを示しており、図１のＢは、Ｂｒｄ４の全長タンパク質のアイソフォーム３のゲノムにおいてＣ末端又はＮ末端にＴＡＰタグを付加した場合を示しており、図１のＣは、Ｂｒｄ４のＣ末端又はＮ末端にＴＡＰタグを付加した場合に対応するアイソフォーム１、２及び３を示している。 図２は、Ｂｒｄ４−Ｎ−ＡＴＦのタグ配列である。 図３は、Ｂｒｄ４−Ｃ−ＦＴＡのタグ配列である。 図４は、Ｂｒｄ４−Ｃ−ＨＴＡのタグ配列である。 図５は、ＴＡＰタグが付加されたＢｒｄ４のタンパク質の発現検出を示している。 図６は、細胞内におけるＴＡＰタグが付加されたＢｒｄ４のマッピング検出を示しており、図６のＡは、Ｂｒｄ４−Ｃ−ＨＴＡが付加された雄性発生半数体胚性幹細胞及びこれに対応するＩＣＡＨＣＩにより構築されたＥＳ細胞系（＃で示すサンプル）の免疫蛍光検出図、図６のＢは、Ｂｒｄ４−Ｃ−ＦＴＡ、Ｂｒｄ４−Ｎ−ＡＴＦが付加された雄性発生半数体胚性幹細胞及びこれに対応するＩＣＡＨＣＩにより構築されたＥＳ細胞系（＃で示すサンプル）の免疫蛍光検出図である。 図７は、ＴＡＰタグが付加されたＢｒｄ４のＣｏ−ＩＰによるタンパク質結合検出を示しており、図７のＡは、ＮＣ及びＢｒｄ４−Ｎ−ＡＴＦ雄性発生半数体胚性幹細胞のＣｏ−ＩＰによる検出結果であり、図７のＢは、Ｂｒｄ４−Ｃ−ＦＴＡ、Ｂｒｄ４−Ｎ−ＡＴＦ及びＢｒｄ４−Ｃ−ＨＴＡ雄性発生半数体胚性幹細胞のＣｏ−ＩＰによる検出結果である。 図８は、ＴＡＰタグが付加されたブロモドメイン遺伝子のタンパク質発現レベルの検出を示しており、図８のＡは、ＤＫＯ−ＡＧ−ｈａＥＳＣｓ雄性発生半数体幹細胞系のＣ−ＨＴＡタグが付加されたブロモドメイン遺伝子におけるＡｔａｄ２ｂ、Ｂａｚ２ｂ、Ｂｒｄ３、Ｃｅｃｒ２のタンパク質発現レベルの検出結果であり、図８のＢは、ＤＫＯ−ＡＧ−ｈａＥＳＣｓ雄性発生半数体幹細胞系のＣ−ＨＴＡタグが付加されたブロモドメイン遺伝子におけるＢａｚ１ｂ、Ｐｂｒｍ１のタンパク質発現レベルの検出結果である。 図９は、Ｐｈｆ７のＮ末端にＫＩ Ｆｌａｇが付加されたマウスにおいてゲノム上のＰｈｆ７の結合部位を研究したものであり、図９のＡは、雄性発生半数体胚性幹細胞のＰｈｆ７内在性ゲノムのＮ末端に３×Ｆｌａｇ配列を挿入した場合を示す図であり、図９のＢは、ＩＣＡＨＣＩ注入によりＰｈｆ７−ＫＩ−Ｆｌａｇヘテロ接合マウスＦ０を取得し、Ｆ１ヘテロ接合マウス同士を交配させて取得したＰｈｆ７−ＫＩ−Ｆｌａｇホモ接合雄マウスについての検出結果であり、図９のＣは、Ｐｈｆ７−ＫＩ−Ｆｌａｇホモ接合雄マウスから分離した異なる生殖細胞から検出したＰｈｆ７−Ｆｌａｇの発現の結果であり、図９のＤは、Ｃｏ−ＩＰによってＰｈｆ７−ＫＩ−Ｆｌａｇホモ接合雄マウスの生殖細胞におけるＰｈｆ７−Ｆｌａｇの発現を検出した結果であり、図９のＥは、Ｆｌａｇ抗体を用いてＰｈｆ７をｃｈｉｐ−ｓｅｑ検出し、プロモーター／エクソン／イントロン／インタージェニック領域におけるエンリッチメント状況をＨ３Ｋ４ｍｅ３ ｃｈｉｐ−ｓｅｑ及びｕｂＨ２Ａ Ｃｈｉｐ−ｓｅｑの結果と比較したものであり、図９のＦは、Ｐｈｆ７ ｃｈｉｐ−ｓｅｑとＨ３Ｋ４ｍｅ３ ｃｈｉｐ−ｓｅｑの結合領域におけるｐｅａｋｓの重なり度合を示すベン図であり、図９のＧは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３＆Ｐｈｆ７ ｃｏｍｍｏｎ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ ｕｎｉｑｕｅ、Ｐｈｆ７ ｕｎｉｑｕｅの結果におけるｕｂＨ２Ａの信号分布を示すヒートマップであり、図９のＨはｕｂＨ２Ａの信号結果の値である。 図１０は、Ｈｓｐｇ２のＣ末端にＫＩ Ｆｌａｇを付加したマウスの胚期Ｅ１５．５日目のタンパク質検出を示す。
本発明におけるタンパク質のハイスループット分析法では、タグ付きセミクローンマウスライブラリーを使用し、１又は複数のタグタンパク質抗体で複数の興味のある異なる標的タンパク質を並行的に特定して分析する。上記のタグ付きセミクローンマウスライブラリーにおいて、各セミクローンマウスは、雄性発生半数体胚性幹細胞を卵子に注入し、培養して取得したセミクローンマウス又はその有性生殖の子孫である。前記雄性発生半数体胚性幹細胞には、興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現する遺伝子が含まれているため、前記セミクローンマウスは、興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現可能である。
タンパク質のハイスループット分析法と称するのは、次の理由による。即ち、当該分析法では、タグ付きセミクローンマウスライブラリーを使用し、ライブラリー内のタグに対応する有限個数の汎用的なタグタンパク質抗体を利用するだけで、ライブラリー内の興味のある複数の標的タンパク質を同時に並行研究可能である。そのため、興味のある標的タンパク質の抗体を調製する必要がないだけでなく、同様の操作フローを用いて同時に複数の興味のある標的タンパク質につき生体内研究を実施することも可能である。これは、興味のある標的タンパク質の抗体を調製せねばならない従来の研究方法とは異なっており、タンパク質の科学研究が極めて大幅に簡易化されるため、研究効率が向上する。本発明におけるタンパク質の分析法によれば、興味のある標的タンパク質の抗体を調製又は使用する必要がない。特に、抗体の調製が困難な場合や、非常に高価な抗体しか持たない標的タンパク質の研究にとっては十分明らかなメリットがある。当該方法は、一般的なタンパク質の生体内研究の考え方を変えるものであり、薬物スクリーニング、薬物の作用メカニズムの分析、薬物代謝等の研究に極めて大きな利便性をもたらすものである。且つ、同様の抗体を用いて研究を行うため、抗体と抗原の結合親和性等も比較的一致することになる。よって、興味のある標的タンパク質の違いに応じて異なる標的タンパク質の抗体を利用する場合と比べ、並行比較を行う際に、タグタンパク質抗体の研究が成熟していることも相まって、感度及び特異性のいずれにおいても発現が安定的となり、参考可能性にいっそう優れる。
本発明における前記雄性発生半数体胚性幹細胞は、幹細胞の自己複製能力と多能性を有しているため、精子に代わって卵母細胞と結合し、胚の完全な発育を支えることが可能である。
本発明で記載するセミクローンマウスとは、雄性発生半数体胚性幹細胞を卵子に注入したあとの各段階での形態のことであり、二倍体胚性幹細胞形態、胚期形態、誕生後の各発育成長段階の形態を含み得る。
タグタンパク質抗体を利用して興味のある標的タンパク質を特定し、分析する際には、主に、タグタンパク質抗体とタグタンパク質との抗原抗体結合の性質を利用する。興味のある標的タンパク質とタグタンパク質は融合発現するため、タグタンパク質抗体は興味のある標的タンパク質を合わせて特定可能である。
ウェスタンブロッティング、免疫蛍光検出（ＩＦ）、免疫沈降（ＩＰ）、共免疫沈降（Ｃｏ−ＩＰ）、クロマチン免疫沈降（Ｃｈｉｐ−ｓｅｑ）、ＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ）、クロスリンク免疫沈降（ＣＬＩＰ）、質量分析法ＭＳ、Ｅｌｉｓａ、タンデムアフィニティ精製、蛍光共鳴エネルギー移動技術、レポーター遺伝子融合マッピング等を含む（ただし、これらに限らない）従来の抗原と抗体との特異的結合反応を利用する免疫分析試験法
は、いずれも本発明におけるタグタンパク質抗体を利用した興味のある標的タンパク質の特定・分析に適用される。具体的な分析・実験の実行時には、分析サンプルとして、各形態のセミクローンマウスから採取した生体切片、組織サンプル、体液サンプル、インビトロ細胞サンプル、器官サンプル等を使用可能である。
本発明におけるタンパク質の分析法には、タンパク質の発現、タンパク質の時空間マッピング、タンパク質間相互作用、タンパク質の代謝、タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、タンパク質とＲＮＡの結合ドメイン等の分析が含まれる（ただし、これらに限らない）。
具体的には、ウエスタンブロッティング及びＥｌｉｓａによってタンパク質の発現状況を特定可能であり、免疫蛍光検出及びレポーター遺伝子融合マッピングによってタンパク質の時空間マッピングが可能である。また、共免疫沈降技術、タンデムアフィニティ精製技術及び蛍光共鳴エネルギー移動技術、共免疫沈降−質量分析法（Ｃｏ−ＩＰ−ＭＳ）によってタンパク質間相互作用を分析可能である。また、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、質量分析法（ＭＳ）、クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ，ＧＣ）、及びクロマトグラフィー−質量分析法技術によってタンパク質の代謝を分析し、Ｃｈｉｐ−ｓｅｑによってタンパク質のＤＮＡ結合ドメインを分析する。また、ＲＩＰ、ＣＬＩＰ、ノーザンブロッティングによってタンパク質とＲＮＡの特異的結合ドメインを分析するとともに、上記の各システムによってタンパク質の生理代謝ネットワークを総合的に分析・研究する。
本発明を利用してセミクローンマウス由来の各成長段階、各組織のサンプルを分析することで、タンパク質について、マウス体内の各組織における発現、任意の具体的成長段階における発現、又は一定の成長段階における発現を理解可能となる。よって、本発明のタンパク質の分析法は、生体内におけるリアルタイムで動的な分析に適していると考えられる。
なお、理解すべき点として、本発明におけるタンパク質の分析法は、疾患の診断や治療を目的とするものではない。
本発明におけるタンパク質の分析法は、タグ付きセミクローンマウスライブラリーを利用して実現可能である。本発明のタグ付きセミクローンマウスライブラリーにおいて、各セミクローンマウスが発現する興味のある標的タンパク質は、いずれもタグタンパク質と融合発現する。各セミクローンマウスは、雄性発生半数体胚性幹細胞を卵子に注入し、培養して取得したセミクローンマウスとしてもよいし、その有性生殖の子孫としてもよい。セミクローンマウスを構築するための雄性発生半数体胚性幹細胞には、興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現する遺伝子が含まれていなければならない。
タグを付加可能な雄性発生半数体胚性幹細胞はＩＣＡＨＣＩのドナーであり、ＩＣＡＨＣＩ法によってセミクローン胚が得られる。また、更に、胚移植法によって適切な母マウスの体内で前記セミクローン胚を培養することで、セミクローンマウスを得ることが可能である。
構築済みのタグ付きセミクローンマウスライブラリーをベースに、当該ライブラリーから研究対象の標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を融合発現可能なセミクローンマウスを選択するだけで、タンパク質の生体内分析を迅速に実現可能である。
セミクローンマウスの繁殖や品種保全には多大なコストがかかるほか、広大な場所を占有する必要もある。そのため、本発明におけるタンパク質の分析法では、タグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーを優先的に利用してセミクローンマウス又はセミクロー
ンマウスライブラリーを作製する。合理化された雄性発生半数体胚性幹細胞技術に基づけば、雄性発生半数体胚性幹細胞を体外で複数回にわたり遺伝操作し、且つ体外で長期間培養したとしても、セミクローンマウスを安定的に取得可能である。また、構築済みのタグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーをベースに、タンパク質の分析前にライブラリーから標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質の発現に適した雄性発生半数体胚性幹細胞を選択して卵子に注入するだけで、わずか１ヶ月で所望のセミクローンマウス又はセミクローンマウスライブラリーを得ることが可能なため、調製時間が短く、効率がよい。且つ、大量のマウスを飼育するためのケージや時間が節約されるため、コストが大幅に削減される。タグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーは細胞形式でされ、必要なときに卵子に注入するだけでマウスを得ることが可能なため、動物の品種保全に要するコストが大幅に削減される。
研究開発の目的に基づき、タグ付きセミクローンマウスライブラリー又はタグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーから、タグタンパク質と融合発現する興味のある標的タンパク質を発現可能な種類を決定し、興味のある標的タンパク質の組み合わせを構成することが可能である。そして、興味のある標的タンパク質を発現可能な組み合わせのうち、各興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質におけるタグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞又はタグ付きセミクローンマウスを組み合わせることで、タグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリー又はタグ付きセミクローンマウスライブラリーを構成する。
興味のある標的タンパク質の組み合わせにおける各興味のある標的タンパク質の選択は、必要に応じて設定すればよい。例えば、ドメイン分類、機能分類、位置分類、シグナル経路分類、疾患経路分類等に基づき、興味のある標的タンパク質の組み合わせの構成を決定すればよい。ドメイン分類には、ブロモドメインファミリー、デス・ドメイン（ｄｅａｔｈ−ｄｏｍａｉｎ）ファミリー、ＰＨＤフィンガーファミリー、ＰＯＵドメインファミリー、リングフィンガーファミリー、ＳＥＴドメインファミリー等が含まれる（ただし、これらに限らない）。機能分類には、細胞接着、ＲＮＡ結合、ＤＮＡ修復、細胞表面受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、転写因子、炎症関連因子、キナーゼ、脂質輸送代謝関連因子、ストレス関連因子、アポトーシス、核内受容体、細胞周期調節因子、熱ショックタンパク質、成長因子、遊走等が含まれる（ただし、これらに限らない）。位置分類には、細胞質、核小体、核膜、中心体、ゴルジ体、小胞体、ミトコンドリア、リボソーム、細胞膜、リソソーム等が含まれる（ただし、これらに限らない）。シグナル経路分類には、カスパーゼファミリー、ＩＡＰファミリー、ＴＲＡＦファミリー、ＴＮＦ受容体ファミリー、ＴＮＦリガンドファミリー、Ｐ５３シグナル経路、ＤＮＡ損傷応答経路、細胞周期停止通路、Ｎｏｔｃｈシグナル経路、低分子量ＧＴＰアーゼタンパク質シグナル経路、Ｗｎｔシグナル経路等が含まれる（ただし、これらに限らない）。疾患経路分類には、癌、免疫系疾患、神経変性疾患、循環器系疾患、代謝障害、感染症循環器系疾患等が含まれる（ただし、これらに限らない）。
タグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞の構築には、：
１）各興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現する遺伝子を含むよう、雄性発生半数体胚性幹細胞を遺伝子改造するステップ、
２）興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現可能な雄性発生半数体胚性幹細胞をスクリーニングするステップ、及び
３）スクリーニングした雄性発生半数体胚性幹細胞の初代細胞又はその継代半数体細胞を品種保全し、ライブラリーを構築してタグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーを取得するステップを含む。
ステップ１）では、従来技術を用いて雄性発生半数体胚性幹細胞の遺伝子改造を行えば
よい。本発明の遺伝子改造では、マウスの雄性発生半数体胚性幹細胞に存在している興味のある標的タンパク質をコードする遺伝子について、遺伝子改造により本来の位置（ｉｎ
ｓｉｔｕ）にタグタンパク質遺伝子を導入してもよいし、マウスの雄性発生半数体胚性幹細胞内に、外来の興味のある標的タンパク質をコードする遺伝子を導入してから、当該外来の興味のある標的タンパク質をコードする遺伝子の本来の位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）にタグタンパク質遺伝子を導入してもよい。或いは、マウスの雄性発生半数体胚性幹細胞に、タグが付加された外来の興味のある標的タンパク質をコードする遺伝子を直接導入してもよい。遺伝子改造は、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）等の遺伝子操作を含む（ただし、これらに限らない）従来の遺伝子ターゲティングや相同組換え等の技術を用いて完了すればよい。本発明の好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９技術媒介型の遺伝子編集技術を利用し、雄性発生半数体胚性幹細胞に対し遺伝子ターゲティングを行うことでタグタンパク質遺伝子を導入する。
ステップ２）では、ＰＣＲによって遺伝子型を鑑定し、興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現可能な雄性発生半数体胚性幹細胞をスクリーニングすればよい。遺伝子型については、鑑定対象の具体的状況に応じ、複数組のプライマーをデザインして決定すればよい。更に、タグタンパク質抗体を用い、正確にシーケンシングされた雄性発生半数体胚性幹細胞をウエスタンブロッティング検出することで、興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現可能な雄性発生半数体胚性幹細胞をスクリーニングしてもよい。
ステップ３）では、一般的な細胞の継代及び品種保全の方法を雄性発生半数体胚性幹細胞の継代及び品種保全に用いればよい。また、半数体細胞はフローサイトメーターを用いて収集すればよい。
タグタンパク質抗体を利用して興味のある標的タンパク質を検出しやすいよう、好ましくは、雄性発生半数体胚性幹細胞又はセミクローンマウスが発現する興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質において、タグタンパク質の全部又は一部は融合タンパク質の表面から露出している。例えば、ＯＭＩＣ Ｔｏｏｌｓ、Ｉ−ＴＡＳＳＥＲ、ＨＨｐｒｅｄ、ＲａｐｔｏｒＸ、ＩｎｔＦＯＬＤ、ＮＡＭＤ（ＮＡｎｏｓｃａｌｅ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）及びＶＭＤといった関連のシミュレーションソフトによって、デザインする融合タンパク質がタグタンパク質を露出可能か否かを予測すればよい。
好ましい方式としては、前記タグタンパク質を興味のある標的タンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に位置させる。このような方式は、大多数の興味のある標的タンパク質に適合し得る。また、タグタンパク質を興味のある標的タンパク質のＮ末端又はＣ末端に位置させたとき、タグタンパク質のエピトープを露出させられないことが分かった場合には、タグタンパク質を興味のある標的タンパク質における適切な位置に挿入することで、エピトープを露出可能としてもよい。例えば、ＯＭＩＣ Ｔｏｏｌｓ、Ｉ−ＴＡＳＳＥＲ、ＨＨｐｒｅｄ、ＲａｐｔｏｒＸ、ＩｎｔＦＯＬＤ、ＮＡＭＤ（ＮＡｎｏｓｃａｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）及びＶＭＤといったソフトウェアによって関連のデザインを行ってもよい。例えば、シグナルペプチドが存在する場合には、タグタンパク質を興味のある標的タンパク質のＣ末端にデザインしてもよいし、タグタンパク質をＮ末端のシグナルペプチドの後方にデザインしてもよい。
興味のある標的タンパク質のＮ末端にタグタンパク質を融合する場合には、タグタンパク質の遺伝子を、興味のある標的タンパク質の開始コドンＡＴＧの後ろであって興味のあ
る標的タンパク質をコードする遺伝子の前に導入すればよい。また、興味のある標的タンパク質のＣ末端にタグタンパク質を融合する場合には、タグタンパク質の遺伝子を、興味のある標的タンパク質の終止コドンの前であって興味のある標的タンパク質をコードする遺伝子の後ろに導入すればよい。また、興味のある標的タンパク質のＮ末端にシグナルペプチドが存在する場合には、興味のある標的タンパク質のシグナルペプチドのコード遺伝子と興味のある標的タンパク質の残りのコード遺伝子との間にタグタンパク質の遺伝子を導入すればよい。
本発明で使用するタグタンパク質は、Ｆｌａｇ、ＨＡ、緑色蛍光タンパク質（ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＥＧＦＰ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、Ｃｌｏｖｅｒ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ＮｏｗＧＦＰ、ｍＣｌｏｖｅｒ３）、赤色蛍光タンパク質（ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ＲＲｖＴ、ｍＲｕｂｙ、ｍＲｕｂｙ２、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＦｕｓｉｏｎＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＮｅｃｔａｒｉｎｅ、ｍＲｕｂｙ３、ｍＳｃａｒｌｅｔ、ｍＳｃａｒｌｅｔ−Ｉ）、青色蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ３、ＳＣＦＰ３Ａ、ＣｙＰｅｔ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ、Ａｑｕａｍａｒｉｎｅ）、黄色蛍光タンパク質（ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｔｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ＳＹＦＰ２、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｙｐｅｔ、ｌａｎＲＦＰ−ΔＳ８３、ｍＰａｐａｙａ１，ｍＣｙＲＦＰ１）、橙色蛍光タンパク質（Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＫＯκ、ｍＫＯ２）、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ、ＧＳＴ、Ｓｔｒｅｐ、ＣＢＰ、ＭＢＰ、ｉＤｉｍｅｒｉｚｅ、ＰｒｏｔｅｏＴｕｎｅｒ、Ｓｈｉｅｌｄ１、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＡＣＰタグ、ＭＣＰタグ、Ｈａｌｏタグ、Ａｖｉタグ、ＴＡＰタグ、Ｌｕｍｉｏ（登録商標）タグ等の１又は複数から選択可能である。具体的なタグタンパク質を選択するにあたっては、次の原則を順守すればよい。即ち、蛍光共鳴エネルギー移動技術、レポーター遺伝子融合マッピングの場合には、必要に応じて、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＡＣＰタグ、ＭＣＰタグ、Ｌｕｍｉｏ（登録商標）タグ等を選択すればよい。また、特異的コントロールによるタンパク質の高速分解においては、必要に応じてＰｒｏｔｅｏＴｕｎｅｒを選択すればよい。また、誘導的タンパク質再配置又はタンパク質の相互作用を実現する際には、必要に応じてｉＤｉｍｅｒｉｚｅを選択すればよい。また、ウエスタンブロッティング、免疫蛍光検出（ＩＦ）、共免疫沈降（Ｃｏ−ＩＰ）、Ｃｈｉｐ−ｓｅｑ、質量分析法ＭＳ、Ｅｌｉｓａ、タンデムアフィニティ精製技術、ノーザンブロッティングの場合には、必要に応じて、Ｆｌａｇ、ＨＡ、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ、ＧＳＴ、Ｓｔｒｅｐ、ＣＢＰ、ＭＢＰ、Ｈａｌｏタグ、Ａｖｉタグ、ＴＡＰタグ等から１又は複数を選択すればよい。１つのタグ部位に複数のタグタンパク質を用いる場合には、各タグタンパク質同士を直接連結してもよいし、Ｃ−ペプチドを介して連結してもよい。何度も操作しやすいように、タグタンパク質の間には、特定の酵素によって酵素切断可能なタンパク質又はポリペプチド配列等を挿入してもよい。本発明の具体的実施例では、３×Ｆｌａｇ−ＴＥＶ−Ａｖｉ、３×Ｆｌａｇ−ＴＥＶ−Ａｖｉ及びＨＡ−ＴＥＶ−Ａｖｉをそれぞれブロモドメインタンパク質のタグタンパク質として選択する。
研究により、雄性発生半数体胚性幹細胞のＨ１９ ＤＭＲ及びＩＧ−ＤＭＲをノックアウトすることで、セミクローンマウスの出生効率の低さ及びセミクローンマウスの発育欠陥との課題を解決可能なことが分かっている。よって、本発明の雄性発生半数体胚性幹細胞は、Ｈ１９ ＤＭＲ及びＩＧ−ＤＭＲがノックアウトされる雄性発生半数体胚性幹細胞とすることが好ましい。
Ｈ１９ ＤＭＲとは、Ｈ１９−Ｉｇｆ２インプリンティングクラスタ内のメチル可変領域（ＤＭＲ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）のことである。Ｈ１９ ＤＭＲの具体的な位置及び配列は、従来のメチル化シーケンス又は相同配列分析予測等の方法で明らかにできる。ヒトのＨ１９ ＤＭＲは染色体１ １ｐ１ ５．５領域に位置しており、ネズミのＨ１９ ＤＭＲは、７番染色体の遠位端におけるＨ１９とＩｇｆ２の２つの遺伝子の間であって、Ｈ１９遺伝子の上流の２ｋｂから４ｋｂの位置にあることが知られている。Ｈ１９ ＤＭＲは父系対立遺伝子上でメチル化状態となる。これにより、ＣＴＣＦタンパク質がこのメチル化領域に結合不可能となり、Ｈ１９下流のエンハンサーがＣＴＣＦという障害を乗り越える必要がなくなる結果、上流のＩｇｆ２の発現が強化される一方、Ｈ１９の発現は低下する。また、母系対立遺伝子上では脱メチル化状態となり、ＣＴＣＦタンパク質がこのメチル化されていない領域に結合可能となる。これにより、Ｈ１９下流のエンハンサーはＨ１９の発現のみを強化可能となり、上流のＩｇｆ２についてはコントロール不可能となる。また、父系のＨ１９ ＤＭＲをノックアウトした場合には、Ｈ１９下流のエンハンサーはＩｇｆ２の発現を増加させられる。雄性発生半数体は父系由来であるため、理論的には完全なメチル化状態となるはずである。しかし、研究の結果、体外で培養した雄性発生半数体のＨ１９ ＤＭＲのメチル化には異常な消去が発生し、脱メチル化状態となる結果、Ｈ１９の発現が異常に増加する一方、Ｉｇｆ２の発現は減少することが分かった。そこで、Ｈ１９ ＤＭＲをノックアウトすれば、このようなＨ１９の発現の増加及びＩｇｆ２の発現の減少という異常状態を是正可能となる。
ＩＧ−ＤＭＲとは、Ｄｌｋ−Ｄｉｏ３インプリンティングクラスタ内のメチル可変領域（ＤＭＲ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）のことである。ＩＧ−ＤＭＲの具体的な位置及び配列は、従来のメチル化シーケンス又は相同配列分析予測等の方法で明らかにできる。マウスの場合、ＩＧ−ＤＭＲは１２番染色体上であって、インプリンティングクラスタのＤｌｋ１とＧｔｌ２の２つの遺伝子の間における４．１５ｋｂの反復配列に位置しており、ヒトの場合には１４番染色体（１４ｑ３２．２）に位置することが知られている。ＩＧ−ＤＭＲが父系対立遺伝子上にある場合、この領域にはＤＮＡメチル化が発生する。これにより、このインプリンティングクラスタの遺伝子Ｇｔｌ２及び一部のｍｉｒｃｒｏＲＮＡは発現しないが、遺伝子Ｒｔｌ１、Ｄｌｋ１及びＤｉｏ３は発現する。一方、母系対立遺伝子上にある場合には、この領域にＤＮＡメチル化は発生しない（脱メチル化状態）。そのため、Ｇｔｌ２及び一部のｍｉｒｃｒｏＲＮＡは発現するが、遺伝子Ｒｔｌ１、Ｄｌｋ１及びＤｉｏ３は発現しない。研究の結果、雄性発生半数体（父系由来）と先天異常のあるＳＣ動物では、本来はメチル化状態となるはずのＩＧ−ＤＭＲのメチル化に異常な消去が発生する結果、遺伝子Ｒｔｌ１、Ｄｌｋ１及びＤｉｏ３が沈黙し、Ｇｔｌ２及び一部のｍｉｒｃｒｏＲＮＡが異常に活性化することが分かった。
タグ付きセミクローンマウスライブラリー又はタグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーを利用してタンパク質分析を行う場合、好ましい実施形態では、各興味のある標的タンパク質と融合発現するタグタンパク質を全て同じとする。この場合には、１つのタグタンパク質又は複数のタグタンパク質を用いて興味のある標的タンパク質をタグ付け可能である。例えば、興味のある標的タンパク質のＮ末端又はＣ末端のみにタグタンパク質を融合発現させるか、興味のある標的タンパク質のＮ末端又はＣ末端に異なるタグタンパク質を用いて融合発現させる。複数のタグタンパク質を用いて興味のある標的タンパク質をタグ付けする場合には、各興味のある標的タンパク質がいずれも同様のいくつかのタグタンパク質と融合発現するよう保証するだけで、各興味のある標的タンパク質が同じタグタンパク質を備えるよう保証可能となる。また、各興味のある標的タンパク質と融合発現するタグタンパク質を全て同じとすることで、並行分析操作を更に簡易化できるため、並行分析がより容易となる。
言うまでもなく、タグ付きセミクローンマウスライブラリー又はタグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーでは、各興味のある標的タンパク質と融合発現するタグタンパク質を異ならせてもよい。この場合にも、ライブラリー内のタグタンパク質は有限数のタグタンパク質から構成される組み合わせとなるため、当該有限数のタグタンパク質から構成される組み合わせのうちの各タグタンパク質の抗体を使用すれば、興味のある標的タンパク質の抗体を調製する必要なく、各興味のある標的タンパク質を同様に並行分析可能となる。
本発明で提供するライブラリー内のマウス又は雄性発生胚性幹細胞を利用すれば、興味のある標的タンパク質を分析可能なだけでなく、薬物研究も実施可能である。本発明におけるライブラリー内のマウス又は雄性発生胚性幹細胞を薬物研究に適用する実施形態では、薬物の作用前後に興味のある標的タンパク質を研究することで薬物の作用メカニズムを理解する。また、他の実施形態では、薬物の作用前後におけるマウス体内の各興味のある標的タンパク質の発現の変化から、特定の作用を有する薬物をハイスループットスクリーニングしてもよい。また、他の実施形態では、タグ付きの毒性モデル動物を作製し、薬物の作用前後において、対応する毒性タンパク質の発現の変化を検出することで薬物代謝について生体内研究を行ってもよい。
本発明で提供するライブラリー内のマウス又は雄性発生胚性幹細胞を利用すれば、興味のある標的タンパク質の発現のノックダウンについて機能研究を実施することも可能である。Ｔｒｉｍ２１はＥ３ユビキチンリガーゼであり、抗体のＦｃ領域と結合することで、抗体によって特定の認識エピトープ（即ち、抗原）に導かれ、下流のタンパク質分解経路を誘導することで、抗体が認識した抗原タンパク質を特異的に分解可能とする。本発明におけるライブラリー内の雄性発生胚性幹細胞をＴｒｉｍ２１とタグタンパク質に対する特異的抗体に導入すれば、一過性トランスフェクションがなされるか、或いは、ゲノムがＴｒｉｍ２１とタグタンパク質に対する特異的抗体のＤＮＡ配列に統合される結果、タグタンパク質と融合発現する標的タンパク質の特異的で迅速且つ高効率の分解を実現可能となる。且つ、条件付きでＴｒｉｍ２１及びタグタンパク質抗体を発現させる場合、例えば、誘導型プロモーターＴｅｔ−Ｏｎ／Ｏｆｆシステムで発現を駆動する場合には、ドキシサイクリン／テトラサイクリンで媒介される誘導型の特異的で高効率且つ迅速な標的タンパク質の分解を実現可能である。また、本発明におけるライブラリー内のマウスからＦ０世代のヘテロ接合タグを取得し、マウスにノックインしたあと、更に交配によってホモ接合タグがノックインされたＦ２子世代マウスを取得してもよい。ホモ接合Ｆ２子世代マウスは、組織特異性プロモーター又は誘導型プロモーターＴｅｔ−Ｏｎ／ＯｆｆシステムによってＴｒｉｍ２１及びタグタンパク質抗体の発現が駆動されたツールマウスと交配することで、標的タンパク質の誘導可能な分解制御を実現することができ、これによりマウスの表現型及び生理指標の変化が検出される。
以下に、特定の具体的実施例によって本発明の実施形態につき説明する。なお、本発明の保護の範囲は後述する特定の具体的実施方案に限らないと解釈すべきである。また、本発明の実施例で使用される用語は特定の具体的実施方案を記載するためのものであって、本発明の保護の範囲を制限するものではないと解釈すべきである。本発明の明細書及び請求の範囲では、本文中で別途明示しない限り、「１つ」「一の」及び「この」といった単数形には複数形が含まれる。
別途定義しない限り、本発明で使用するあらゆる技術用語及び科学用語は、当業者が一般的に理解する意味と等しい。また、実施例で使用される具体的方法、デバイス、材料以外にも、当業者による従来技術の理解及び本発明の記載に基づいて、本発明の実施例における上記の方法、デバイス、材料と類似又は同等の従来技術における任意の方法、デバイ
ス及び材料を用いて本発明を実現してもよい。
別途説明している場合を除き、本発明で開示される実験方法、検出方法、調製方法には、当業者にとって一般的な分子生物学、生物化学、クロマチン構造及び分析、分析化学、細胞培養、組換えＤＮＡ技術及び関連分野の一般技術が採用される。これらの技術については、従来文献に十分に説明されている。
実験材料及び方法：
１．雄性発生半数体胚性幹細胞系の構築
すでに報告されている方法に基づき構築する（Ｙａｎｇ，Ｈ．，Ｓｈｉ，Ｌ．，Ｗａｎｇ，Ｂ．Ａ．，Ｌｉａｎｇ，Ｄ．，Ｚｈｏｎｇ，Ｃ．，Ｌｉｕ，Ｗ．，Ｎｉｅ，Ｙ．，Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｚｈａｏ，Ｊ．，Ｇａｏ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｉｃｅ ｂｙ ｏｏｃｙｔｅ
ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ ｈａｐｌｏｉｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ １４９，６０５−６１７）。
方法：
ＭＩＩ卵子の細胞核を除去して対応する精子頭部を注入した。マウスのＭＩＩ卵子をヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）で処理してから１４時間後に収集し、ピエゾ針を用いて、５μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢ（ＣＢ）を含有するＨＥＰＥＳ−ＣＺＢ培養液中で核を除去した。徐核後に、単一の精子頭部を卵細胞質に注入した。再構築した胚をＣＺＢ培養液内で１時間培養したあと、１ｍＭ Ｓｒ２＋を含有する活性化液に移して活性化した。活性化後に、全ての再構築胚をアミノ酸を含有するＫＳＯＭ培養液に移し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。そして、３．５日後に、桑実胚又は胞胚段階となった再構築胚をＥＳＣ培地に移植した。
再構築胚の透明帯を酸性タイロード（Ａｃｉｄ Ｔｙｒｏｄｅ）液で消化して除去した。次に、各々をマウスの線維芽細胞栄養膜を敷き詰めた９６ウェルマイクロプレートのウェルに移動させ、２０％血清代替物（ＫＳＲ）、１５００Ｕ／ｍｌ ＬＩＦ、３Ｍ ＣＨＩＲ９９０２１及び１Ｍ ＰＤ０３２５９０１を含有するＥＳＣ培地を用いて培養した。４〜５日培養したあと、細胞クローンをパンクレアチンで消化し、新鮮な栄養膜を敷き詰めた９６ウェルマイクロプレートに移動させた。そして、細胞を更に大きくなるまで培養したあと、４８ウェルマイクロプレートに継代し、更に６マイクロプレートへと継代した。日常的には、６マイクロプレートにのみ細胞を維持すればよいとした。半数体細胞を選別するために、胚性幹細胞をパンクレアチンで消化したあと、ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ）で１回洗浄してから、１５μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を含有するＥＳＣ培地で３０ｍｉｎ水浴させた。その後、フローソーターＢＤ ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩで半数体１Ｎピーク形状の細胞を選別して収集し、続く培養によって雄性発生半数体胚性幹細胞系を取得した。
Ｈ１９ ＤＭＲ及びＩＧ−ＤＭＲをノックアウトした雄性発生半数体胚性幹細胞ＤＫＯ−ＡＧ−ｈａＥＳＣｓを従来技術を参照して構築した。具体的には、国際公開第２０１７／０００３０２号の記載を参照すればよい。
２．タグ付き雄性発生胚性幹細胞の構築
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９プラスミドの構築：合成されたｓｇＲＮＡの順方向オリゴヌクレオチド鎖と逆方向オリゴヌクレオチド鎖をアニーリングし、２本鎖のオリゴヌクレオチド鎖を取得したあと（本発明において、ｓｇＲＮＡ配列とは、ｓｇＲＮＡの順方向オリゴヌクレオチド鎖の配列のことをいう）、ＢｂｓＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）で酵素切断したｐＸ３３０−ｍＣｈｅｒｒｙ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃９８７５０）と接続し
た。
ＫＩドナーベクターの構築：合成した左右のホモロジーアーム増幅プライマーを用い、興味のある標的タンパク質遺伝子を含むゲノムから左右のホモロジーアームを増幅した。興味のある標的タンパク質がマウスの内在性タンパク質の場合には、マウスのゲノムを鋳型としてホモロジーアームを増幅可能であった。また、タグタンパク質の遺伝子が例えば２０〜７０ｂｐのような非常に小さな断片の場合には、１本鎖ＤＮＡの合成及びアニーリングによって調製可能であった。また、タグタンパク質の遺伝子の長さが比較的長く、そのままでは合成不可能な場合には、Ｔベクター上に構築するか遺伝子合成を行ったあと、タグのハイフィデリティーＰＣＲ増幅を行うことで調製可能であった。左右のホモロジーアーム断片、タグタンパク質遺伝子断片及び線形化Ｔベクターをシームレスクローニング試薬キット（Ｓｅａｍｌｅｓｓ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ）を用いて接続し、ＫＩドナーベクターを取得した。
構築した対応プラスミド及びＫＩドナーベクターを、説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ライフテクノロジーズ社）により雄性発生半数体胚性幹細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションから１２時間後にフローソータ（ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩ，ＢＤバイオサイエンス社）によって半数体細胞を選別したあと、比較的低い密度で敷き詰めた。そして、４〜５日成長させてから、クローンを１つ選別して続く株構築を実施した。最後に、取得したタグ付き雄性発生胚性幹細胞系をＰＣＲシーケンシングの手法で鑑定した。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９技術媒介型の遺伝子編集技術は成熟した技術であり、ＣＲＩＳＰＲ ｄｅｓｉｇｎサイト（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ：８０７９／）を用いれば、オンラインで所望のｓｇＲＮＡ Ｏｌｉｇｏｓをデザイン可能である。ｓｇＲＮＡのデザインは、タグタンパク質を予め挿入する遺伝子座付近の２５〜４０ｂｐのゲノム配列を選択して行った。また、タグタンパク質を予め挿入する遺伝子座の上流及び下流からそれぞれ適切な長さ（１ｋｂ〜１．５ｋｂ）のホモロジーアームを選択し、オンラインプライマーデザインサイトｐｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒ３．ｕｔ．ｅｅ／）を利用して、左右のホモロジーアームの増幅プライマーをデザインした。そして、これにより、左右のホモロジーアームを増幅してＫＩドナーベクターを構築した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介型の遺伝子操作によって、雄性発生半数体胚性幹細胞の遺伝子編集を行い、タグ付きの興味のある標的タンパク質を発現可能な雄性発生半数体胚性幹細胞を取得した。
興味のある標的タンパク質がマウス由来でない場合にも、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９技術媒介型の遺伝子編集技術を用い、発現される興味のある標的タンパク質を含有する雄性発生半数体胚性幹細胞を構築してから、更にタグタンパク質を挿入すればよい。
３．タグ付きセミクローンマウスの構築
細胞質基質に対するタグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞の注入（ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ＡＧ−ｈａＥＳＣｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ＩＣＡＨＣＩ）：
セミクローン（ＳＣ）胚を取得するために、０．０５μｇ／ｍｌのコルヒチンを含有する培地でタグ付きＡＧ−ｈａＥＳＣｓを８ｈ処理し、細胞をＭ期に同期したあと、卵子の細胞質基質に注入した。消化されたＡＧ−ｈａＥＳＣｓをＨＥＰＥＳ−ＣＺＢ培養液で３回洗浄してから、３％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ，ＰＶＰ）を含有するＨＥＰＥＳ−ＣＺＢ培養液で再懸濁した。次に、ピエゾマイクロマニピュレータを用いてＭ期の各ＡＧ−ｈａＥＳＣｓの細胞核をＭＩＩ卵子に注入した。そして、再構築した胚をＣＺＢ培養液内で１ｈ培養してから、ＣＢを含有しな
い活性化液で５〜６ｈ活性化した。活性化後に、ＫＳＯＭ培養液内で、全ての再構築胚を３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。そして、ＩＣＡＨＣＩ胚をＫＳＯＭ培養液内で２４ｈ培養することで２細胞期胚を取得した。
ＩＣＡＨＣＩから取得した２細胞期胚を、０．５ｄｐｃ（交配から０．５日後）の偽妊娠ＩＣＲマウスの各子宮内に３０〜４０個ずつ移植した。母マウスは妊娠から１９．５日後に帝王切開を行うか、自然分娩した。出生したマウスは体表の液体を除去したあと有酸素インキュベーター内に入れた。続いて、代理出産母マウスによって生存生きているマウスを養育した。
４．ウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）分析
タンパク質阻害剤を含有するＲＩＰＡ細胞溶解液（セル・シグナリング・テクノロジー社）を用いて検出対象の細胞を溶解し、ＢＣＡタンパク質濃度測定試薬キット（碧雲天（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ）社）でタンパク質濃度を測定した。次に、タンパク質サンプルをＳＤＳ／ＰＡＧＥで分離したあと、湿式法でニトロセルロース膜に移した。そして、５％のスキム粉ミルク／ＴＢＳＴを用い、室温で膜を１時間ブロッキングした。一次抗体は４度で一晩ハイブリダイズし、ＴＢＳＴで３回洗浄した。また、二次抗体は室温で１．５時間ハイブリダイズし、ＴＢＳＴで３回洗浄した。最後に、発色液（天能社）を用いて発色させ、全自動化学発光画像解析システム（天能社）で撮影した。
５．免疫蛍光分析
細胞をＰＢＳで１回洗浄したあと、４％ＰＦＡを用いて室温で１５分間固定するか、−２０度に予め冷却しておいたメタノールを直接用いて５分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。次に、０．２％トリトンＸ−１００を用いて３０分間透過処理を行った。続いて、ブロッキング溶液（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）内で１時間ブロッキングしてから、細胞及びブロッキング溶液内で希釈された一次抗体を４度で一晩インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。次に、細胞及びブロッキング溶液内で希釈された二次抗体を室温で遮光しながら１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。そして、細胞及びＰＢＳ内で希釈されたＤＡＰＩを室温で遮光しながら５〜１０分間インキュベートし、ＰＢＳで１回洗浄した。最後に、蛍光封入剤で封入し、４度で遮光して保存した。
６．Ｃｏ−ＩＰ分析
タンパク質阻害剤を含有するＴＮＥ細胞溶解液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０）を用いて検出対象の細胞を溶解し、ＢＣＡタンパク質濃度測定試薬キット（碧雲天社）でタンパク質濃度を測定した。次に、適量の磁気ビーズを用い、定量後の細胞溶解液を４度で１時間前処理（ｐｒｅ−ｃｌｅａｎ）した。そして、磁気ビーズを除去したあとに、タグ抗体と結合した磁気ビーズを添加し、４℃で回転させて一晩反応させた。続いて、タンパク質阻害剤を含有するＴＮＥ細胞溶解液を用いて磁気ビーズを４度で１０分間、３回洗浄した。これに適量体積の１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質用サンプルローディングバッファを添加し、１００℃の空気浴で１０分間加熱した。ＩＰ後のタンパク質サンプルはＳＤＳ／ＰＡＧＥで分離したあと、湿式法でニトロセルロース膜に移した。そして、５％のスキム粉ミルク／ＴＢＳＴを用い、室温で膜を１時間ブロッキングした。一次抗体は４度で一晩ハイブリダイズし、ＴＢＳＴで３回洗浄した。また、二次抗体は室温で１．５時間ハイブリダイズし、ＴＢＳＴで３回洗浄した。最後に、発色液（天能社）を用いて発色させ、全自動化学発光画像解析システム（天能社）で撮影した。
７．Ｃｈｉｐ−ｓｅｑライブラリーの構築及びデータ分析
細胞に対し、ホルムアルデヒド固定、超音波粉砕及び異なる抗体添加による精製等のステップを実施したあと、最後に、精製断片のサイズが２００〜５００ｂｐのＤＮＡをライ
ブラリー構築に用いた。各抗体は１０７個の細胞に対応していた。ライブラリー構築に合格した各サンプルライブラリーをイルミナ社のＮｏｖａＳｅｑにかけ、読み取り長１５０ｂｐのリード（ｒｅａｄｓ）を生成した。各サンプルライブラリのリード数は少なくとも２０兆よりも多かった。測定したデータをマウスのゲノムｍｍ１０と照合し、１つだけ照合された場合にはリードを保持した。また、複数位置のリードが照合された場合には、照合結果が最良であった１つの位置を任意に選択して保持した。また、タンパク質作用エンリッチ領域（Ｐｅａｋ）をデフォルトパラメータを用いて取得した。
８．ＴＡＰタグが付加されたゲノムコピー数のリアルタイム定量ＰＣＲ検出
ゲノムＤＮＡ抽出試薬キット（天根社）のフローを用い、検出対象サンプルのゲノムＤＮＡを抽出した。リアルタイム定量ＰＣＲは、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲマスターミックス（東洋紡）を用いて完了した。２０μｌの反応系のうち、ゲノムＤＮＡ鋳型は１０倍に希釈して１μｌ添加した。また、バイオ・ラッドＣＦＸ９６リアルタイム定量ＰＣＲ計で４０サイクル増幅を行った。コピー数の計算にはＴＡＰタグの値を用い、標的とする内在性ゲノムＤＮＡの値と比較して算出した。また、データはＣＦＸ９６リアルタイム定量ＰＣＲ計付属のソフトウェアで分析した。
ブロモドメインを含む４０個のマウス遺伝子に対するＴａｎｄｅｍ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＡＰ）タグの付加：
ブロモドメインを含む４０個のマウス遺伝子（表１）に対し、それぞれＴａｎｄｅｍ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＡＰ）タグを付加した。そして、ＴＡＰタグを用い、タグタンパク質と結合したタンパク質複合体又はＤＮＡ配列を抽出したあと、質量分析法ＭＳ及びＣｈｉｐ−ｓｅｑ実験を行った。類似のブロモドメインを含む４０個のマウス遺伝子についてＭＳ及びＣｈｉｐ−ｓｅｑ検出をそれぞれ実施し、これらに結合したタンパク質ネットワーク及びＤＮＡ結合ドメインの特異性を分析することで、ブロモドメインタンパク質の機能及び役割分担について研究を深めた。
Figure 2021524016
Ａ．ＴＡＰタグの配列及び付加位置の選択
Ｂｒｄ４タンパク質の場合を例示すると、Ｂｒｄ４は全部で３つのアイソフォームを有していた。アイソフォーム１、２、３はそれぞれ１４０１個、７２４個及び１４０２個のアミノ酸を発現したため（図１Ａ）、全長タンパク質のアイソフォーム３を選択してタグ
を付加した。このとき、対応するゲノムにおいてＮ末端とＣ末端にそれぞれタグを付加し、Ｂｒｄ４タンパク質に対するＴＡＰタグの付加状況を検出した（図１Ｂ）。Ｂｒｄ４のアイソフォーム１及び３のＣ末端は同じであったため、Ｃ末端のＴＡＰタグはアイソフォーム１及び３に同時に付加可能であった。また、アイソフォーム１、２、３のＮ末端は全て同じであったため、Ｎ末端のＴＡＰタグは３種類のアイソフォームに同時に付加可能であった。ＴＡＰタグについては、３×Ｆｌａｇ−ＴＥＶ−Ａｖｉ又はＨＡ−ＴＥＶ−Ａｖｉの２種類の形式を選択した（図１Ｃ）。Ｎ末端には３×Ｆｌａｇ−ＴＥＶ−Ａｖｉを付加し（Ｎ−ＡＴＦと略称）、Ｃ末端には３×Ｆｌａｇ−ＴＥＶ−Ａｖｉを付加するか（Ｃ−ＦＴＡと略称）、ＨＡ−ＴＥＶ−Ａｖｉを付加した（Ｃ−ＨＴＡと略称）。具体的なタグ配列（図２、図３及び図４参照）は、それぞれ次の通りであった。
Ｂｒｄ４−Ｎ−ＡＴＦタグのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）：
GLNDIFEAQKIEWHEENLYFQGDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK
Ｂｒｄ４−Ｃ−ＦＴＡタグのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）：
DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKENLYFQGGLNDIFEAQKIEWHE
Ｂｒｄ４−Ｃ−ＨＴＡタグのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）：
YPYDVPDYAENLYFQGGLNDIFEAQKIEWHE
Ｂ．Ｂｒｄ４ゲノムに対するＴＡＰタグの付加
上記の２で記載した実験方法に基づき、ＤＫＯ−ＡＧ−ｈａＥＳＣｓ雄性発生半数体幹細胞系において、それぞれＢｒｄ４ゲノムＤＮＡに対し、Ｂｒｄ４−Ｎ−ＡＴＦ、Ｂｒｄ４−Ｃ−ＦＴＡ及びＢｒｄ４−Ｃ−ＨＴＡターゲティングを行った。また、ホモロジーアームの増幅用鋳型はマウスのゲノムＤＮＡとした。シーケンシングで正確に検証された細胞系をＩＣＡＨＣＩ注入することでセミクローン胞胚を取得し、相応のヘテロ接合を行って二倍体ＥＳ細胞系を構築した（表２及び表３）。

Ｂｒｄ４−Ｎ−ＡＴＦ ｓｇＲＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）：
TGGGATCACTAGCATGTCTA
Ｂｒｄ４−Ｃ−ＦＴＡ ｓｇＲＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）：
AATCTTTTTTGAGAGCACCC
Ｂｒｄ４−Ｃ−ＨＴＡ ｓｇＲＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）：
AATCTTTTTTGAGAGCACCC
Ｂｒｄ４−Ｎ−ＡＴＦタグの塩基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）：
GGTCTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAAgagaacctgtacttccagggcGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTACAAGGATGACGATGACAAG
Ｂｒｄ４−Ｃ−ＦＴＡタグの塩基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）：
GACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTACAAGGATGACGATGACAAGgagaacctgtacttccagggcGGTCTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAA
Ｂｒｄ４−Ｃ−ＨＴＡタグの塩基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）：
TATCCGTATGATGTGCCGGATTATGCGgagaacctgtacttccagggcGGTCTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAA

Ｂｒｄ４−Ｎ−ＡＴＦの左右ホモロジーアーム増幅プライマーの配列：
Ｂｒｄ４−ｇＮ−Ｆ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）：ggctgccatgtagttccagt
Ｂｒｄ４−ｇＮ−Ｒ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）：ggcctgcgttgtagacattt
Ｂｒｄ４−ｇＮ−Ｆ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）：ccaagcccagatagatggctagt
Ｂｒｄ４−ｇＮ−Ｒ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）：aaccattcactggggttcagatt

Ｂｒｄ４−Ｃ−ＦＴＡの左右ホモロジーアーム増幅プライマーの配列：
Ｂｒｄ４−ｇＣ−Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）：gaggagaagattcactcaccaatca
Ｂｒｄ４−ｇＣ−Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）：caagccagaatacctagttgcttca

Ｂｒｄ４−Ｃ−ＨＴＡの左右ホモロジーアーム増幅プライマーの配列：
Ｂｒｄ４−ｇＣ−Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）：gaggagaagattcactcaccaatca
Ｂｒｄ４−ｇＣ−Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）：caagccagaatacctagttgcttca
Figure 2021524016
Figure 2021524016
ＴＡＰタグが付加されたゲノムコピー数をリアルタイムＰＣＲにより検出した。ＴＡＰタグ配列の違いごとに２対のプライマーをそれぞれデザインし、Ｂｒｄ４のＮ末端とＣ末端の内在性ゲノムＤＮＡ配列を参照遺伝子として比較した。各雄性発生半数体胚性幹細胞は、それぞれＩＣＡＨＣＩにより構築された２〜４株のヘテロ接合ＥＳ細胞系（「＃」で表示）に対応していた。また、ターゲティングされていない雄性発生半数体胚性幹細胞をＮＣで示した。結果より、雄性発生半数体胚性幹細胞のＴＡＰタグのコピー数は約１であり、ヘテロ接合ＥＳ細胞系のＴＡＰタグのコピー数は約０．５であった。これより、ＴＡＰタグは定位置融合であって、組み換え遺伝子のランダムな導入は存在しないことが示された（表４）。
Ｂｒｄ４−Ｎ−ＡＴＦリアルタイムＰＣＲの増幅プライマーの配列：
ＦＴＡ−Ｆ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）：CAAGGATGACGATGACAAGg
ＦＴＡ−Ｒ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）：CTGAGCCTCGAAGATGTCGT
ＦＴＡ−Ｆ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）：CAAGGATGACGATGACAAGg
ＦＴＡ−Ｒ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）：TTCGTGCCATTCGATTTTCT
ＡＴＦ−Ｆ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）：CTTCGAGGCTCAGAAAATCG
ＡＴＦ−Ｒ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）：GTCTTTGTAGTCgccctgga
ＡＴＦ−Ｆ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）：AAATCGAATGGCACGAAgag
ＡＴＦ−Ｒ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）：GTCTTTGTAGTCgccctgga
ＨＴＡ−Ｆ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）：GCGgagaacctgtacttcca
ＨＴＡ−Ｒ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）：TTCGTGCCATTCGATTTTCT
ＨＴＡ−Ｆ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）：TATGATGTGCCGGATTATGC
ＨＴＡ−Ｒ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）：CTGAGCCTCGAAGATGTCGT
Ｂｒｄ４−ｇＮ−ＣＮ−Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）：gtccacagtggcctttcaat
Ｂｒｄ４−ｇＮ−ＣＮ−Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）：agctgtcttcagaccctcca
Ｂｒｄ４−ｇＣ−ＣＮ−Ｆ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）：ttgccttgaacagaccctct
Ｂｒｄ４−ｇＣ−ＣＮ−Ｒ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）：acacaggtgggaaggaactg
Ｂｒｄ４−ｇＣ−ＣＮ−Ｆ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）：acagaagcaggagccaaaaa
Ｂｒｄ４−ｇＣ−ＣＮ−Ｒ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）：aaaggtcaagaggcaggtga
Figure 2021524016
Ｃ．ＴＡＰタグが付加されたＢｒｄ４のタンパク質発現レベルの検出
Ｂｒｄ４−Ｎ−ＡＴＦ、Ｂｒｄ４−Ｃ−ＦＴＡ及びＢｒｄ４−Ｃ−ＨＴＡが付加された１〜２株の雄性発生半数体胚性幹細胞（例えば４等の単数字で示す）と、これらにそれぞれ対応するＩＣＡＨＣＩにより構築された２〜４株のＥＳ細胞系（例えば４−５等の「数字−数字」で示す）を各々選択し、サンプリングしてタンパク質電気泳動検出を行った。また、ターゲティングされていない雄性発生半数体胚性幹細胞をＮＣで示した。Ｆｌａｇ又はＨＡ抗体を用いて検出したところ、Ｃ末端のＴＡＰタグはＢｒｄ４の大きなタンパク質（約２５０ｋＤａ）を特異的に検出できるにすぎなかったが、Ｎ末端では確実にＢｒｄ４の大きなタンパク質と小さなタンパク質（約１２０ｋＤａ）を特異的に検出可能であった。ただし、タンパク質の大きさはいずれも予測よりもやや大きかった。また、ヘテロ接合ＥＳ細胞系のＴＡＰタグが付加されたＢｒｄ４の発現量は雄性発生半数体胚性幹細胞よりも明らかに少なかったが、双方ともに発現が見られた。ヘテロ接合ＥＳ細胞の発現量から見た場合には、Ｃ末端のＴＡＰタグの方が良好であった。また、Ｂｒｄ４抗体によって検出した場合には非常に強い非特異的バンド（約１５０ｋＤａ）が見られ、２５０ｋＤａ付近でのみ微弱なタンパク質信号を検出可能であった。しかし、露光を強くしたところ、バンドの大きさがＴＡＰタグの有無によって変化し、当該バンドが確かにＢｒｄ４のタンパク質であることが示された。ＷＢ（ｗｅｓｔｅｎ ｂｌｏｔ）の結果から見ると、ＦｌａｇタグとＨＡタグはいずれも成功しており、Ｂｒｄ４タンパク質のＮ末端及びＣ末端のＴＡＰタグも成功していた。ＴＡＰタグの抗体は、特異性及び感度の双方においてＢｒｄ
４自身の抗体よりも明らかに優れていた。
Ｄ．細胞内におけるＴＡＰタグが付加されたＢｒｄ４のマッピング検出
Ｂｒｄ４−Ｎ−ＡＴＦ、Ｂｒｄ４−Ｃ−ＦＴＡ及びＢｒｄ４−Ｃ−ＨＴＡが付加された１株の雄性発生半数体胚性幹細胞と、これに対応するＩＣＡＨＣＩにより構築された１株のＥＳ細胞系をそれぞれ選択し、免疫蛍光検出（ＩＦ）を実施した。ＨＡ抗体とＢｒｄ４抗体はいずれも特異的に細胞核内にマッピングされ、ＩＦ検出の感度はＨＡ＞Ｂｒｄ４であった（図６Ａ）。また、Ｆｌａｇ抗体は、細胞核内にマッピングが見られるが、細胞膜上にもマッピングが見られることを検出可能であった（図６Ｂ）。これより、Ｃ−ＨＴＡの核注入は正常であったが、Ｃ−ＦＴＡ又はＮ−ＡＴＦでは一部のタンパク質が核注入されなかったことが示された。ＩＦの結果より、ＨＡのＴＡＰタグはＦｌａｇ ＴＡＰタグよりも優れていた。
Ｅ．ＴＡＰタグが付加されたＢｒｄ４のＣｏ−ＩＰによるタンパク質結合検出
Ｂｒｄ４−Ｎ−ＡＴＦ、Ｂｒｄ４−Ｃ−ＦＴＡ及びＢｒｄ４−Ｃ−ＨＴＡが付加された１株の雄性発生半数体胚性幹細胞をそれぞれ選択し、ＴＡＰタグが付加されたＢｒｄ４のＣｏ−ＩＰによるタンパク質結合検出を行った。その結果、ＮＣ及びＢｒｄ４−Ｎ−ＡＴＦ雄性発生半数体胚性幹細胞系については、Ｂｒｄ４抗体を結合したビーズによって内在性のＢｒｄ４タンパク質を確実にＩＰ可能なことが分かった。Ｂｒｄ４抗体を用いて検出することで、２５０ｋＤａの大きなタンパク質と１１０／１２０ｋＤａの小さなタンパク質の双方を検出可能であった。また、ＬＢ３溶解液条件下では、更に１５０ｋＤａの不純タンパク質も検出可能であった。Ｂｒｄ４−Ｎ−ＡＴＦの大小のタンパク質におけるＮ末端にはＴＡＰタグが付加されているため、大小のタンパク質の分子量はいずれもＮＣよりも大きかった。一方、Ｆｌａｇ抗体で検出した場合、ＮＣ細胞は完全なネガティブコントロールとなったが、Ｂｒｄ４−Ｎ−ＡＴＦ細胞については２５０ｋＤａの大きなタンパク質と１２０ｋＤａの小さなタンパク質を検出可能であった。また、ＮＣ及びＢｒｄ４−Ｎ−ＡＴＦ細胞は、Ｃｏ−ＩＰによって既知の結合タンパク質ＣＤＫ９との結合を検出可能であった。ただし、ＩＰ前の細胞溶解液全体のｉｎｐｕｔと比べて結合効率は低く、ＬＢ１溶解液条件下の方が結合は多かった。また、ＮＣ及びＢｒｄ４−Ｎ−ＡＴＦ細胞は、Ｃｏ−ＩＰによってＨ３タンパク質との結合を検出可能であった（図７Ａ）。また、Ｂｒｄ４−Ｃ−ＦＴＡ及びＢｒｄ４−Ｎ−ＡＴＦ雄性発生半数体胚性幹細胞系は、Ｆｌａｇ抗体を結合したビーズによって内在性のＢｒｄ４タンパク質を確実にＩＰ可能であった。また、Ｆｌａｇ及びＢｒｄ４抗体を用いた場合、Ｂｒｄ４−Ｃ−ＦＴＡについては２５０ｋＤａの大きなタンパク質のみが、Ｂｒｄ４−Ｎ−ＡＴＦについては２５０ｋＤａの大きなタンパク質と１２０ｋＤａの小さなタンパク質がそれぞれ検出された。また、Ｂｒｄ４抗体のｉｎｐｕｔについては、不純タンパク質の発現量が高過ぎたため、不純タンパク質しか検出されなかった。また、Ｂｒｄ４−Ｃ−ＨＴＡ雄性発生半数体胚性幹細胞系は、ＨＡ抗体を結合したビーズで内在性のＢｒｄ４タンパク質を確実にＩＰ可能であったが、ＨＡ及びＢｒｄ４抗体では２５０ｋＤａの大きなタンパク質のみがそれぞれ検出された。ｉｎｐｕｔとの比率から見て、ＨＡ−ビーズはＦｌａｇ−ビーズよりもＢｒｄ４の回収効率が高く、ＨＴＡタグの方が良好であることが示された。また、Ｂｒｄ４−Ｃ−ＦＴＡとＢｒｄ４−Ｃ−ＨＴＡについては、Ｃｏ−ＩＰによっていずれもＨ３との結合を検出可能であり、ＬＢ１溶解液条件下では結合がより多くなった。Ｂｒｄ４−Ｃ−ＨＴＡの結合量はＢｒｄ４−Ｃ−ＦＴＡよりも多く、ＨＴＡタグの方が良好であることが示された。また、Ｂｒｄ４−Ｎ−ＡＴＦについては、Ｃｏ−ＩＰによるＨ３との結合が相対的に弱かった。これは、小さなタンパク質の作用が関係している可能性がある（図７Ｂ）。実験より、次の点が証明された。即ち、Ｂｒｄ４−Ｎ−ＡＴＦ、Ｂｒｄ４−Ｃ−ＦＴＡ及びＢｒｄ４−Ｃ−ＨＴＡの付加は正確であった。また、ＴＡＰタグが付加されたＢｒｄ４の機能は正常であり、報告されているタンパク質との結合が確実に可能であった。ＨＴＡタグはＦＴＡタグよりも優れていおり、ＬＢ１溶解液下でのＣｏ−ＩＰが条件としてはより適切であった。
Ｆ．ＴＡＰタグが付加されたその他のブロモドメイン遺伝子のタンパク質発現レベルの検出
上記の実験結果を参照して、ブロモドメイン遺伝子におけるＡｔａｄ２ｂ、Ｂａｚ２ｂ、Ｂｒｄ３、Ｃｅｃｒ２、Ｂａｚ１ｂ、Ｐｂｒｍ１に対し、ＤＫＯ−ＡＧ−ｈａＥＳＣｓ雄性発生半数体幹細胞系にＣ−ＨＴＡを付加した。ｓｇＲＮＡ及びホモロジーアームとそのプライマーのデザインには一般的なものを採用し、ＴＡＰタグが付加されたブロモドメイン遺伝子のタンパク質発現レベルを検出した。その結果、以下が明らかとなった。即ち、細胞系Ａｔａｄ２ｂ−Ｃ−ＨＴＡ−９、Ｂａｚ２ｂ−Ｃ−ＨＴＡ−４／７／１０／２６、Ｂｒｄ３−Ｃ−ＨＴＡ−２／４／１４、Ｃｅｃｒ２−Ｃ−ＨＴＡ−９／２２／２６／２８はいずれもタグ付けが正確であり、ＨＡ抗体でも発現を検出可能であったが、タンパク質の大きさは予測よりも３０ｋＤａほど大きかった。発現の強弱については、Ｂｒｄ３（露光５ｓ）＞Ｃｅｃｒ２（３０ｓ）＞Ａｔａｄ２ｂ／Ｂａｚ２ｂ（１８０ｓ）であった（図８Ａ）。また、細胞系Ｂａｚ１ｂ−Ｃ−ＨＴＡ−２２／２４、Ｐｂｒｍ１−Ｃ−ＨＴＡ−１５／２２／３０はいずれもタグ付けが正確であり、ＨＡ抗体でも発現を検出可能であった。発現の強弱については、Ｂａｚ１ｂ（ＨＡ抗体，露光１０ｓ）＞Ｐｂｒｍ１（ＨＡ，２０ｓ）＞Ｐｂｒｍ１（Ｐｂｒｍ１，２０ｓ）＞Ｂａｚ１ｂ（Ｂａｚ１ｂ，１２０ｓ）であった。また、ＨＡ抗体の感度及び特異性はいずれもタンパク質自身の抗体よりも優れていた（図８Ｂ）。且つ、当該方法によれば、ＨＡ抗体を用いるだけでこれらＴＡＰタグが付加されたタンパク質の発現量の違いを水平比較可能なため、異なる組織におけるゲノムの全タンパク質の発現プロファイルが実現される。

実験で使用した関連配列：
Ａｔａｄ２ｂ−Ｃ−ＨＴＡ ｓｇＲＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）：
ACTCAGCATGAGAAGTTCAT
Ｂａｚ２ｂ−Ｃ−ＨＴＡ ｓｇＲＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）：
ACAACTTCAGCTCACTTTGA
Ｂｒｄ３−Ｃ−ＨＴＡ ｓｇＲＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）：
ACTCAGAGTGAACTCGGACT
Ｃｅｃｒ２−Ｃ−ＨＴＡ ｓｇＲＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）：
TGTACTTTCAGAGCTAGTCC
Ｂａｚ１ｂ−Ｃ−ＨＴＡ ｓｇＲＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）：
CGGAGACAGAAGAAGTAAAG
Ｐｂｒｍ１−Ｃ−ＨＴＡ ｓｇＲＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）：
GATGTGATTAAACATTTTCT

Ａｔａｄ２ｂ−Ｃ−ＨＴＡの左右ホモロジーアーム増幅プライマーの配列：
Ａｔａｄ２ｂ−ｇＣ−Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）：
AGGAGCCGCCAGAAATGAAA
Ａｔａｄ２ｂ−ｇＣ−Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）：
TTTGCCTCTTTGCAACTGCC

Ｂａｚ２ｂ−Ｃ−ＨＴＡの左右ホモロジーアーム増幅プライマーの配列：
Ｂａｚ２ｂ−ｇＣ−Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）：
CGGGCGTGACTCGTCTATTA
Ｂａｚ２ｂ−ｇＣ−Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）：
TCTATGTGCCTCCAACAGGC

Ｂｒｄ３−Ｃ−ＨＴＡの左右ホモロジーアーム増幅プライマーの配列：
Ｂｒｄ３−ｇＣ−Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）：
CAGATGACAGGTCGTAGCCC
Ｂｒｄ３−ｇＣ−Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）：
GAACAGGGACCCGTGTCAAA

Ｃｅｃｒ２−Ｃ−ＨＴＡの左右ホモロジーアーム増幅プライマーの配列：
Ｃｅｃｒ２−ｇＣ−Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）：
AACAGTTGCCACCGCATAAG
Ｃｅｃｒ２−ｇＣ−Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）：
GAGGGAAAACTCCATTGACCCC

Ｂａｚ１ｂ−Ｃ−ＨＴＡの左右ホモロジーアーム増幅プライマーの配列：
Ｂａｚ１ｂ−ｇＣ−Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）：
TTGATCGCGGCATCACTTCA
Ｂａｚ１ｂ−ｇＣ−Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）：
GATGCTGACACTCCGCTAGA

Ｐｂｒｍ１−Ｃ−ＨＴＡの左右ホモロジーアーム増幅プライマーの配列：
Ｐｂｒｍ１−ｇＣ−Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）：
AGTCTGCCAAGCTGTTCACT
Ｐｂｒｍ１−ｇＣ−Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）：
ACCACCCAAGCAGGTTCAAA
Ｐｈｆ７のＮ末端にＫＩ Ｆｌａｇが付加されたマウスの構築：
市場には使用しやすいＰｈｆ７抗体が存在しないため、当該遺伝子の機能を研究するために、雄性発生半数体胚性幹細胞のＰｈｆ７内在性ゲノムにおけるＮ末端に３×Ｆｌａｇ配列を挿入し（図９Ａ）、ＩＣＡＨＣＩ注入によってＰｈｆ７−ＫＩ−Ｆｌａｇヘテロ接合マウスＦ０を取得した。そして、Ｆ１ヘテロ接合マウス同士を交配させ、Ｐｈｆ７−ＫＩ−Ｆｌａｇホモ接合雄マウスを取得した（図９Ｂ）。

Ｐｈｆ７−Ｎ−Ｆｌａｇ ｓｇＲＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）：
TTCTAGATAGGAAGGACAGA

Ｐｈｆ７−Ｎ−Ｆｌａｇの左右ホモロジーアーム増幅プライマーの配列：
Ｐｈｆ７−ｇＮ−Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）：aaagtagatccccgtggggacac
Ｐｈｆ７−ｇＮ−Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）：gtttgtacggctgacaaggagc
Ｐｈｆ７−ＫＩ−Ｆｌａｇホモ接合雄マウスから分離した異なる生殖細胞から、Ｐｈｆ７−Ｆｌａｇの発現を検出した（図９Ｃ）。且つ、Ｃｏ−ＩＰによってＰｈｆ７−ＫＩ−Ｆｌａｇホモ接合雄マウスの生殖細胞におけるＰｈｆ７−Ｆｌａｇの発現を検出した（図９Ｄ）。また、Ｆｌａｇ抗体を用いてＰｈｆ７をｃｈｉｐ−ｓｅｑ検出し、エクソン／イントロン／インタージェニック（ｅｘｏｎ／ｉｎｔｒｏｎ／ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ）領域におけるエンリッチメント状況をＨ３Ｋ４ｍｅ３ ｃｈｉｐ−ｓｅｑ及びｕｂＨ２Ａ Ｃｈｉｐ−ｓｅｑの結果と比較した（図９Ｅ）。また、ベン図は、Ｐｈｆ７ ｃｈｉｐ−ｓｅｑとＨ３Ｋ４ｍｅ３ ｃｈｉｐ−ｓｅｑの結合領域におけるｐｅａｋｓが高度に重なり合ったことを示している（図９Ｆ）。また、ヒートマップは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３＆Ｐｈｆ７ ｃｏｍｍｏｎ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ ｕｎｉｑｕｅ、Ｐｈｆ７ ｕｎｉｑｕｅの結果におけるｕｂＨ２Ａの信号分布状況を示しており（図９Ｇ）、ｕｂＨ２Ａの信号結果の値を具体的に統計している（図９Ｈ）。実験より、Ｐｈｆ７−ＫＩ−Ｆｌａｇが付加されたマウスの構築はＰｈｆ７抗体による限界から解放され、Ｆｌａｇ抗体を用いることで、タグ付けされ
たマウス体内の内在性Ｐｈｆ７タンパク質の機能研究を完了可能であることが明らかとなった。
Ｈｓｐｇ２のＣ末端にＫＩ Ｆｌａｇが付加されたマウスの構築：
市場には使用しやすいＨｓｐｇ２抗体が存在しない。そこで、当該遺伝子の機能を研究するために、Ｈｓｐｇ２タンパク質のＮ末端にシグナルペプチドが存在することを考慮して、雄性発生半数体胚性幹細胞のＨｓｐｇ２内在性ゲノムにおけるＣ末端に３×ｆｌａｇ配列を挿入し、ＩＣＡＨＣＩ注入によってＨｓｐｇ２−ＫＩ−Ｆｌａｇヘテロ接合マウスを取得した。

Ｈｓｐｇ２−Ｃ−Ｆｌａｇ ｓｇＲＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）：
TCATAGGCACCCACCTGCCT

Ｈｓｐｇ２−Ｃ−Ｆｌａｇの左右ホモロジーアーム増幅プライマーの配列：
Ｈｓｐｇ２−ｇＣ−Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）：GTCCTAATGTGGCGGTCAAC
Ｈｓｐｇ２−ｇＣ−Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）：ACCTCTTCCAGTCCCCTTGTC
胚期Ｅ１５．５日目のＨｓｐｇ２−ＫＩ−Ｆｌａｇヘテロ接合マウスの胚を採取し、全ての胚サンプルにつきタンパク質電気泳動を行ってＨｓｐｇ２−Ｆｌａｇの発現を検出した。その結果、Ｈｓｐｇ２タンパク質のＣ末端のタグ付けに成功したことが示された（図１０）。
上記の実施例は本発明の原理と効果を例示的に説明するものにすぎず、本発明を制限するものではない。本技術を熟知する者であれば、本発明の精神及び範囲を逸脱しないことを前提に、上記の実施例を補足又は変形可能である。従って、本発明で開示した精神及び技術的思想から逸脱することなく当業者が遂行するあらゆる等価の補足又は変形もまた本発明の特許請求の範囲に含まれる。

Claims (15)

  1. タンパク質のハイスループット分析法であって、
    タグ付きセミクローンマウスライブラリーを使用し、１又は複数のタグタンパク質抗体で複数の興味のある異なる標的タンパク質を並行的に特定して分析し、上記のタグ付きセミクローンマウスライブラリーにおいて、各セミクローンマウスは雄性発生半数体胚性幹細胞を卵子に注入し、培養して取得したセミクローンマウス又はその有性生殖の子孫であり、前記雄性発生半数体胚性幹細胞には、興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現する遺伝子が含まれており、前記セミクローンマウスは、興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現可能である分析法。
  2. 前記分析法は、更に、
    Ａ１）前記興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質において、前記タグタンパク質の全部又は一部は融合タンパク質の表面から露出しており、
    Ａ２）前記興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質において、前記タグタンパク質は興味のある標的タンパク質のＮ末端又はＣ末端に位置しており、
    Ａ３）前記タグタンパク質は、Ｆｌａｇ、ＨＡ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ、ＧＳＴ、Ｓｔｒｅｐ、ＣＢＰ、ＭＢＰ、ｉＤｉｍｅｒｉｚｅ、ＰｒｏｔｅｏＴｕｎｅｒ、Ｓｈｉｅｌｄ１、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＡＣＰタグ、ＭＣＰタグ、Ｈａｌｏタグ、Ａｖｉタグ、ＴＡＰタグ、Ｌｕｍｉｏ（登録商標）タグのうちの１又は複数から選択され、
    Ａ４）前記雄性発生半数体胚性幹細胞のＨ１９ ＤＭＲ及びＩＧ−ＤＭＲはノックアウトされ、
    Ａ５）前記雄性発生半数体胚性幹細胞は、タグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーに由来し、前記タグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーにおいて、各雄性発生半数体胚性幹細胞には、興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現する遺伝子が含まれており、
    Ａ６）前記タグ付きセミクローンマウスライブラリーにおいて、各興味のある標的タンパク質と融合発現するタグタンパク質は全て同じであるか、或いは、各興味のある標的タンパク質と融合発現するタグタンパク質がタグタンパク質の組み合わせを構成し、
    Ａ７）まず、タグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーを用いてタグ付きセミクローンマウスライブラリーを構築し、前記タグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーにおいて、各雄性発生半数体胚性幹細胞には、興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現する遺伝子が含まれている、
    のうちの１又は任意の複数の特徴を含むことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質のハイスループット分析法。
  3. 前記タグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーにおいて、各興味のある標的タンパク質と融合発現するタグタンパク質は全て同じであるか、或いは、各興味のある標的タンパク質と融合発現するタグタンパク質がタグタンパク質の組み合わせを構成することを特徴とする請求項２に記載のタンパク質のハイスループット分析法。
  4. 前記分析法は、生体内におけるリアルタイムで動的な分析に適していることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質のハイスループット分析法。
  5. 前記タンパク質の分析法には、興味のある標的タンパク質の抗体の調製又は使用は含まれないことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質のハイスループット分析法。
  6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質のハイスループット分析法に適用され
    るタグ付きセミクローンマウスライブラリーの構築方法であって、
    １）興味のある標的タンパク質の組み合わせを決定し、前記組み合わせに対応するタグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーを提供し、前記タグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーにおいて、各雄性発生半数体胚性幹細胞には、興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現する遺伝子が含まれており、
    ２）タグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーにおける各雄性発生半数体胚性幹細胞をそれぞれ卵子に注入し、培養してセミクローンマウスを取得し、興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現可能なセミクローンマウスをスクリーニングし、スクリーニングした初代のセミクローンマウス又はその有性生殖子孫によってタグ付きセミクローンマウスライブラリーを構築する、とのステップを含む構築方法。
  7. 前記タグ付きセミクローンマウスライブラリーは、更に、
    Ｂ１）前記興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質において、前記タグタンパク質の全部又は一部は融合タンパク質の表面から露出しており、
    Ｂ２）前記興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質において、前記タグタンパク質は興味のある標的タンパク質のＮ末端又はＣ末端に位置しており、
    Ｂ３）前記タグタンパク質は、Ｆｌａｇ、ＨＡ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ、ＧＳＴ、Ｓｔｒｅｐ、ＣＢＰ、ＭＢＰ、ｉＤｉｍｅｒｉｚｅ、ＰｒｏｔｅｏＴｕｎｅｒ、Ｓｈｉｅｌｄ１、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＡＣＰタグ、ＭＣＰタグ、Ｈａｌｏタグ、Ａｖｉタグ、ＴＡＰタグ、Ｌｕｍｉｏ（登録商標）タグのうちの１又は複数から選択され、
    Ｂ４）前記雄性発生半数体胚性幹細胞のＨ１９ ＤＭＲ及びＩＧ−ＤＭＲはノックアウトされ、
    Ｂ５）前記雄性発生半数体胚性幹細胞は、タグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーに由来し、前記タグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーにおいて、各雄性発生半数体胚性幹細胞には、興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現する遺伝子が含まれており、
    Ｂ６）前記タグ付きセミクローンマウスライブラリーにおいて、各興味のある標的タンパク質と融合発現するタグタンパク質は全て同じであるか、或いは、各興味のある標的タンパク質と融合発現するタグタンパク質がタグタンパク質の組み合わせを構成する、
    のうちの１又は任意の複数の特徴を含むことを特徴とする請求項６に記載のタグ付きセミクローンマウスライブラリーの構築方法。
  8. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質のハイスループット分析法に適用されるタグ付きセミクローンマウスライブラリーであって、
    前記タグ付きセミクローンマウスライブラリーにおいて、各セミクローンマウスが発現する興味のある標的タンパク質はいずれもタグタンパク質と融合発現し、各セミクローンマウスは、雄性発生半数体胚性幹細胞を卵子に注入し、培養して取得したセミクローンマウス又はその有性生殖の子孫であり、前記雄性発生半数体胚性幹細胞には、興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現する遺伝子が含まれているタグ付きセミクローンマウスライブラリー。
  9. 前記タグ付きセミクローンマウスライブラリーは、更に、
    Ｃ１）前記興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質において、前記タグタンパク質の全部又は一部は融合タンパク質の表面から露出しており、
    Ｃ２）前記興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質において、前記タグタンパク質は興味のある標的タンパク質のＮ末端又はＣ末端に位置しており、
    Ｃ３）前記タグタンパク質は、Ｆｌａｇ、ＨＡ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ
    、ＧＳＴ、Ｓｔｒｅｐ、ＣＢＰ、ＭＢＰ、ｉＤｉｍｅｒｉｚｅ、ＰｒｏｔｅｏＴｕｎｅｒ、Ｓｈｉｅｌｄ１、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＡＣＰタグ、ＭＣＰタグ、Ｈａｌｏタグ、Ａｖｉタグ、ＴＡＰタグ、Ｌｕｍｉｏ（登録商標）タグのうちの１又は複数から選択され、
    Ｃ４）前記雄性発生半数体胚性幹細胞のＨ１９ ＤＭＲ及びＩＧ−ＤＭＲはノックアウトされ、
    Ｃ５）前記雄性発生半数体胚性幹細胞は、タグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーに由来し、
    Ｃ６）前記タグ付きセミクローンマウスライブラリーにおいて、各興味のある標的タンパク質と融合発現するタグタンパク質は全て同じであるか、或いは、各興味のある標的タンパク質と融合発現するタグタンパク質がタグタンパク質の組み合わせを構成し、
    Ｃ７）前記タグ付きセミクローンマウスライブラリーは、請求項６又は７に記載の方法で構築して取得される、
    のうちの１又は任意の複数の特徴を含むことを特徴とする請求項８に記載のタグ付きセミクローンマウスライブラリー。
  10. タンパク質の分析、タンパク質の機能研究又は薬物研究分野に適用される請求項８又は９に記載のタグ付きセミクローンマウスライブラリー又は前記ライブラリー由来のセミクローンマウスの用途。
  11. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質のハイスループット分析法に適用されるタグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーの構築方法であって、
    １）興味のある標的タンパク質の組み合わせを決定し、前記興味のある標的タンパク質の組み合わせにおける各興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現する遺伝子をそれぞれ含むよう、各雄性発生半数体胚性幹細胞をそれぞれ遺伝子改造し、
    ２）興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現可能な雄性発生半数体胚性幹細胞をスクリーニングし、
    ３）スクリーニングした雄性発生半数体胚性幹細胞の初代細胞又はその継代半数体細胞を品種保全し、ライブラリーを構築してタグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーを取得する、とのステップを含む構築方法。
  12. 更に、
    Ｄ１）前記興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質において、前記タグタンパク質の全部又は一部は融合タンパク質の表面から露出しており、
    Ｄ２）前記興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質において、前記タグタンパク質は興味のある標的タンパク質のＮ末端又はＣ末端に位置しており、
    Ｄ３）前記タグタンパク質は、Ｆｌａｇ、ＨＡ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ、ＧＳＴ、Ｓｔｒｅｐ、ＣＢＰ、ＭＢＰ、ｉＤｉｍｅｒｉｚｅ、ＰｒｏｔｅｏＴｕｎｅｒ、Ｓｈｉｅｌｄ１、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＡＣＰタグ、ＭＣＰタグ、Ｈａｌｏタグ、Ａｖｉタグ、ＴＡＰタグ、Ｌｕｍｉｏ（登録商標）タグのうちの１又は複数から選択され、
    Ｄ４）前記雄性発生半数体胚性幹細胞のＨ１９ ＤＭＲ及びＩＧ−ＤＭＲはノックアウトされ、
    Ｄ５）前記雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーにおいて、各興味のある標的タンパク質と融合発現するタグタンパク質は全て同じであるか、或いは、各興味のある標的タンパク質と融合発現するタグタンパク質が複数のタグタンパク質を含む組み合わせを構成する、
    のうちの１又は任意の複数の特徴を含むことを特徴とする請求項１１に記載のタグ付き
    雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーの構築方法。
  13. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質のハイスループット分析法に適用されるタグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーであって、
    前記タグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーにおいて、各雄性発生半数体胚性幹細胞には、興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現する遺伝子が含まれており、前記雄性発生半数体胚性幹細胞を卵子に注入し、培養して取得したセミクローンマウスは、興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質を発現可能であるタグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリー。
  14. 前記タグ付きセミクローンマウスライブラリーは、更に、
    前記興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質において、前記タグタンパク質の全部又は一部は融合タンパク質の表面から露出しており、
    Ｅ１）前記興味のある標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質において、前記タグタンパク質は興味のある標的タンパク質のＮ末端又はＣ末端に位置しており、
    Ｅ２）前記タグタンパク質は、Ｆｌａｇ、ＨＡ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ、ＧＳＴ、Ｓｔｒｅｐ、ＣＢＰ、ＭＢＰ、ｉＤｉｍｅｒｉｚｅ、ＰｒｏｔｅｏＴｕｎｅｒ、Ｓｈｉｅｌｄ１、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＡＣＰタグ、ＭＣＰタグ、Ｈａｌｏタグ、Ａｖｉタグ、ＴＡＰタグ、Ｌｕｍｉｏ（登録商標）タグのうちの１又は複数から選択され、
    Ｅ３）前記雄性発生半数体胚性幹細胞のＨ１９ ＤＭＲ及びＩＧ−ＤＭＲはノックアウトされ、
    Ｅ４）前記タグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーにおいて、各興味のある標的タンパク質と融合発現するタグタンパク質は全て同じであるか、或いは、各興味のある標的タンパク質と融合発現するタグタンパク質がタグタンパク質の組み合わせを構成し、
    Ｅ５）前記タグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリーは、請求項１０又は１１に記載の方法で構築して取得される、
    のうちの１又は任意の複数の特徴を含むことを特徴とする請求項１３に記載のタグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリー。
  15. タンパク質の分析、タンパク質の機能研究又は薬物研究分野に適用される請求項１３又は１４に記載のタグ付き雄性発生半数体胚性幹細胞ライブラリー又は前記ライブラリー由来の雄性発生半数体胚性幹細胞の用途。
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