CN103361304B - 孤雄单倍体干细胞系及其制法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及孤雄单倍体干细胞系及其制法和应用。具体地，本发明人提供了一种孤雄单倍体细胞和孤雄囊胚，所述细胞或囊胚的细胞核仅包含单倍的常染色体和性染色体，所述的性染色体为X染色体，不含Y染色体。本发明的孤雄单倍体细胞可以取代精子细胞作为配体来产生可育的动物个体；本发明的孤雄单倍体细胞有利于基因操作，并且能将遗传信息传递给后代。本发明还提供了建立孤雄单倍体细胞的制备方法及其应用。

Description

孤雄单倍体干细胞系及其制法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及孤雄单倍体干细胞系及其制法和应用。

背景技术

哺乳动物都是双倍体，即细胞中有两套染色体，一套来自父方，一套来自母方。在有性生殖个体中，单倍体配子(卵和精子)能够介导基因传递到下一代，然而，精子因为不能进行体外培养，因此大大限制了其遗传学操作；此外，由于很难确定动物的某一性状是哪一套染色体决定的，因此双倍体细胞对于基因研究是个巨大的困难。

而单倍体细胞因其仅含有一套染色体而便于基因研究。目前虽然已经得到了小鼠单倍体的胚胎，但是用这些单倍体胚胎建立得到的胚胎干细胞后来会呈现出二倍体的核型。通过孤雌激活的方法可以建立孤雌小鼠单倍体胚胎干细胞系(haESCs)，并已应用于哺乳动物细胞层面的基因筛选领域中。然而由这些单倍体胚胎干细胞是否能够获得个体的能力还有待证明。由于孤雌小鼠单倍体胚胎干细胞与卵细胞形成的双倍体孤雌胚胎不可能发育为动物个体，因此孤雌单倍体干细胞的研究目前还处于遗传基因水平。

目前本领域还没有一种可以替代精子的的单倍体细胞。因此本领域迫切需要建立一种遗传稳定的孤雄单倍体细胞(系)。

发明内容

本发明的目的就是提供一种孤雄单倍体干细胞系的建立方法及其应用。

在本发明的第一发明，提供了一种孤雄单倍体细胞系，所述细胞系的细胞核仅包含单倍的常染色体和性染色体，所述的性染色体为X染色体。

在另一优选例中，所述的孤雄单倍体细胞系不仅表达传统的胚胎干细胞标志物，体外培养能够增殖并维持单倍体核型，还具有多能性，能够在注射到两倍体囊胚中后分化成各类组织细胞包括生殖细胞。

在另一优选例中，所述的孤雄单倍体细胞系在体外能够传代超过30代。

在另一优选例中，所述的细胞来源于脊椎动物，较佳地来源于人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物选自下组：兔、鼠、牛、猴、或羊。

在另一优选例中，所述的孤雄单倍体细胞系不含Y染色体。

在另一优选例中，所述孤雄单倍体细胞系的核遗传物质来自于父本或精子。

在另一优选例中，所述的核遗传物质为DNA。

在另一优选例中，所述的孤雄单倍体细胞系能维持父本基因组印记；较佳地，所述维持父本基因组印记是指：父源表达基因上调或母源表达基因下调；或，父本印记基因甲基化水平正常，或母本印记基因甲基化水平下降。

在另一优选例中，所述的父源表达基因或母本印记基因选自下组：Snrpn、Plagl1、Peg12、Nap115、Rhox5、Ndn、或其组合。

在另一优选例中，所述的母源表达基因或父本印记基因选自下组：Phlda2、Rian、Grb10、Meg3、Ube3a、Gtl2、或其组合。

在另一优选例中，所述孤雄单倍体细胞系是孤雄单倍体胚胎干细胞系。

在本发明的第二方面，提供了一种孤雄囊胚，所述囊胚的核遗传物质仅包含单倍的常染色体和性染色体，所述的性染色体为X染色体，所述的核遗传物质来自于父本或精子。

在另一优选例中，所述的囊胚来源于人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物选自下组：兔、鼠、牛、猴、或羊。

在另一优选例中，所述的核遗传物质为DNA。

在另一优选例中，所述的孤雄囊胚不含Y染色体。

在另一优选例中，所述的囊胚为单倍体孤雄囊胚。

在本发明的第三方面，提供了一种孤雄囊胚的制备方法，所述方法包括步骤：

(i)获得不含雌原核的合子细胞；和

(ii)培养所述的合子细胞，获得孤雄囊胚。

在另一优选例中，步骤(i)中不含雌原核的合子细胞是用选自下组的方法制备的：

(1)将精子细胞与去核的卵母细胞结合，获得重构的不含雌原核的合子细胞；或

(2)去除合子细胞中的雌原核，获得不含雌原核的合子细胞。

在另一优选例中，(2)中所述的合子细胞为PN3时期的合子细胞。

在本发明的第四方面，提供了一种孤雄单倍体细胞的制备方法，包括步骤：培养本发明的第二方面所述的孤雄囊胚，从获得孤雄单倍体细胞。

在另一优选例中，使用流式细胞分选的方法根据DNA含量从孤雄囊胚中获得孤雄单倍体细胞。

在另一优选例中，使用流式细胞分选的方法根据DNA含量从获得的孤雄单倍体细胞中进一步富集该细胞。

在另一优选例中，所述孤雄单倍体细胞系是孤雄单倍体胚胎干细胞系。

在本发明的第五方面，提供了第一方面所述孤雄单倍体细胞系的用途，孤雄单倍体细胞系用于：

(a)基因打靶；和/或

(b)取代配子，支持胚胎发育。

在另一优选例中，所述的配子为精子。

在另一优选例中，所述孤雄单倍体细胞系是孤雄单倍体胚胎干细胞系。

在本发明的第六方面，提供了一种制备动物的方法，包括步骤：

(a)提供一合子细胞，所述的合子细胞是本发明第一方面所述的孤雄单倍体细胞与卵母细胞融合形成的；和

(b)将所述的合子细胞再生为动物体，从而获得动物体。

在另一优选例中，所述的孤雄单倍体细胞是经过遗传转化的。

在另一优选例中，所述的遗传转化包括基因敲除、基因突变、导入外源基因。

在另一优选例中，所述孤雄单倍体细胞系是孤雄单倍体胚胎干细胞系。

在本发明的第七方面，提供了一种制备转基因动物的方法，包括步骤：

(i)对本发明第一方面所述的孤雄单倍体细胞系进行遗传转化，获得转化的孤雄单倍体细胞；

(ii)将转化的孤雄单倍体细胞与卵母细胞结合，获得转化的合子细胞；和

(iii)将转化的合子细胞再生为动物体，从而获得转基因动物。

在另一优选例中，所述的转基因动物是基因敲除的转基因动物。

在另一优选例中，所述的遗传转化包括基因敲除、基因突变、导入外源基因。

在另一优选例中，所述孤雄单倍体细胞系是孤雄单倍体胚胎干细胞系。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了AG-haESCs的建立流程及鉴定结果，其中，图1A为从孤雄囊胚中建立AG-haESCs示意图，精子携带Oct4-EGFP转基因；图1B为重构胚激活1h后，通过Hoechst染色可以看到精子头开始解聚；图1C为精子注入去核卵母细胞后形成的雄原核的表观遗传修饰结果，左图显示，在受精卵中，5hmc和5mc分别富集在雄原核和雌原核中，右图显示，精子注入去核卵母细胞后形成的雄原核同样有5hmc的富集；图1D为携带Oct4-EGFP转基因的精子注入去核卵母细胞后，形成的孤雄桑葚和囊胚荧光和相差图，标尺为100μm；图1E为通过几轮流式分选富集单倍体细胞后建立haES细胞系(以AGH-OG-3为例)，用DAPI通道分选经Hoechst染色的DNA，congtrol为两倍体ES的流式图；图1F为AG-haESC细胞系(AGH-OG-1)的克隆形态，标尺为50μm；图1G为针对性染色体的PCR结果，AG-haESC细胞系只有X染色体，没有Y染色体；图1H为核型分析结果，显示AGH-OG-3有20条染色体；图1I为haESCs(AGH-OG-3)与雄小鼠肾细胞(C57BL/6)的CGH分析结果，上面一排为haESCs vs.肾细胞，下面一排为肾细胞vs.肾细胞。

图2显示了AG-haESCs的多能性；其中，图2A显示ES marker在AG-haESCs中的表达，标尺为50μm；图2B显示AG-haESCs的基因表达谱，Pearson相关系数。diploid表示二倍体；图2C：上图为Actin-EGFP标记的AGH-EG-1ES细胞注入正常二倍体囊胚后产生的嵌合体小鼠，胚外组织(左)来源于母体，因此没有绿色荧光，下图为来自于嵌合体的卵巢(右)与来自于对照组的卵巢(左)的比较；图2D为AGH-OG-2haESCs(C57BL/6，黑)注入正常ICR(白)囊胚后产生的7周大的嵌合体小鼠；图2E为流式分析GFP阳性和GFP阴性细胞在新生嵌合小鼠皮肤中的分布，E-Texas-Red和FITC通道分别用来检测PI与GFP信号。

图3显示了AG-haESCs父系印迹状态，其中，图3A为定量反转录PCR(qPCR)检测印迹基因表达，*：0.01<p<0.05；**：0.001<p<0.01；图3B为小鼠尾巴，精子和AG-haESCs(AGH-OG-3，p15)中Gtl2，H19，和Snrpn基因DMRs的甲基化检测，空圆和实心圆分别代表非甲基化与甲基化。

图4显示AG-haESCs注入卵细胞后胚胎发育结果；其中，图4A为ICAHCI产生SC小鼠的示意图，重构胚激活后，由卵细胞产生的第二极体(PB)和由M期haESC产生的假极体(PPB)分别排出后，形成一个二倍体胚胎，AG-haESCs携带EGFP转基因，PPN为来自于haESC的假原核；图4B显示AG-haESC的重编程，左边和中间为重构胚激活0h和1h的Hoechst染色图，右边是重构胚激活6h后的染色图，5hmc和5mc分别富集在假原核和雌原核中；图4C显示ICAHCI与ICSI生成的囊胚图，供体haESCs和精子携带Oct4-EGFP转基因，标尺为100μm；图4D显示来自于AGH-OG-3haESCs的ICAHCI产生的半克隆(SC)小鼠，图中显示的是在假孕母鼠妊娠19.5天时剖腹产所获得的小鼠和胎盘，星号所标示的是生长阻滞SC小鼠，在出生后一小时内死亡；图4E显示SC小鼠出生时体重和胎盘重量，对照组小鼠由ICSI获得，“正常”SC小鼠体重(1.4±0.18g，n=21)与对照组(1.4±0.2g，n=17)接近，前者能活到成年，而“阻滞”SC小鼠出生时则个体偏小(0.6±0.13g，n=22)，在出生后一小时内死亡，值为平均值±标准差，***：p<0.001；图4F显示对照ICSI小鼠(上)、正常SC小鼠(中)和阻滞SC小鼠(小)的H19DMR的甲基化状态；图4G显示由ICAHCI方法操作AGH-OG-2获得的两只八周龄大的SC小鼠。

图5显示基因性状从AG-haESCs传递至SC小鼠后代；其中，图5A显示，从携带Oct4-EGFP转基因的AGH-OG-1而来的新生SC小鼠和四周大SC小鼠中分离出来的卵巢(上)和GV卵细胞(下)，绿色荧光标示的是表达Oct4-EGFP的生殖细胞，标尺为200μm(上)和100μm(下)；图5B显示由AGH-OG-1获得的SC母鼠的后代；图5C显示对后代的基因型分析，该SC母鼠的后代中50%(8/16)为Oct4-EGFP阳性；图5D显示SC母鼠后代雌雄两种性别的后代均有AG-haESC的生殖系遗传，左边两图显示一周大的雄性F2幼鼠的输精管中有Oct4-EGFP转基因的表达，Oct4会在这只新生雄鼠的整个生殖母细胞群中均有Oct4的表达，右边两图显示从两周大雌性F2幼鼠中分离出的GV卵细胞中有Oct4-EGFP报告基因表达，EGFP信号说明了在发育中的卵母细胞中存在着Oct4表达，标尺为100μm。

图6显示在AG-haESCs中进行基因操作，其中，图6A为针对Vwce基因的同源重组打靶策略，编码外显子由黑色方框标示，1号外显子的5’非编码区部分由空白方框标示，位于neo筛选标志一侧的Frt位点用空白三角标示，靶向区域旁的loxP位点用灰色三角标示，用于AG-haESCs克隆基因型鉴定的引物在图中用水平箭头标示，打靶正确的haESC克隆用引物1(P1)和引物2(P2)(跨越左臂区域)或者引物3(P3)和引物4(P4)(跨越右臂区域)将会产生4.9kb和5.6kb的片段；图6B显示药物筛选获得的AG-haESC细胞株中抽提出DNA后PCR鉴定其基因型的结果，左边标示的是所用的引物，一个正常的被打靶的两倍体ES被作为对照来展示两条等位基因(第一列)，一个未打靶的AG-haESC细胞株被做为阴性对照(第二列)，其中，targeted diploid表示被打靶的两倍体，untargeted为未被打靶；图6C显示扩增打靶成功的AG-haESC-Vwce细胞株，以获得稳定的单倍体细胞群。

图7显示本发明的孤雄单倍体干细胞能够制备基因修饰动物；其中，图7A显示，将带有被打靶等位基因的AG-haESC-Vwce细胞注射入卵母细胞可获得基因敲除的半克隆小鼠，所述半克隆小鼠的胎盘和胎儿均为EGFP阳性，表明注射的AG-haESC-Vwce细胞株带有EGFP基因；图7B为用引物（P1-P6）对小鼠不同部位（tail（尾部）、ovary（卵巢）、placenta（胎盘））基因型的鉴定结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次建立了一种稳定的孤雄单倍体细胞系，并提供所述细胞系的制法和及其应用。

具体地，本发明人提供了一种孤雄单倍体细胞系和孤雄囊胚，所述细胞系或囊胚的细胞核仅包含单倍的常染色体和性染色体，所述的性染色体为X染色体，不含Y染色体。本发明的孤雄单倍体细胞可以取代精子细胞作为配体来产生可育的动物个体；本发明的孤雄单倍体细胞有利于基因操作，并且能将遗传信息传递给后代。本发明还提供了建立孤雄单倍体细胞的制备方法及其应用。在此基础上完成了本发明。

术语

单倍体细胞及双倍体细胞

如本文所用，术语“单倍体细胞”是指体细胞染色体数为本物种配子染色体数的细胞。配子细胞为一种单倍体细胞。术语“双倍体细胞”是指含有两组染色体的细胞。雌、雄配子结合后通常发育为二倍体生物。

桑葚胚、囊胚及孤雄囊胚

如本文所用，术语“桑葚胚”是指动物胚胎发育的早期阶段，一个受精卵经过多次分裂，形成具有数十至数百个细胞，这个细胞团组成的早期胚胎即为桑椹胚。桑椹胚进一步发育，细胞开始出现分化，聚集在胚胎一侧，个体较大的细胞为将来发育成胎儿的各种组织的内细胞团，沿透明带内壁扩展和排列的个体较小的细胞为将来发育成胚膜和胎盘的滋养层细胞。随着胚胎的进一步发育，胚胎的内部开始出现含有液体的囊胚。本发明提供了一种孤雄囊胚，所述囊胚的核遗传物质仅包含单倍的常染色体和性染色体，性染色体为X染色体，核遗传物质来自于父本或精子，孤雄囊胚不含Y染色体；较佳地，囊胚来源于人或非人哺乳动物，核遗传物质为DNA。

孤雄单倍体细胞

本发明提供了一种由孤雄囊胚中获得的孤雄单倍体细胞，将其命名为孤雄单倍体干细胞(AG-haESCs)，如本文所用，术语“AG-haESCs”、“孤雄单倍体干细胞”、或“孤雄单倍体胚胎干细胞”可以互换使用。所述细胞不仅具有传统的胚胎干细胞的典型形态，表达传统的胚胎干细胞标志物，还具有多能性，能够在注射到两倍体囊胚中后分化成各类组织细胞包括生殖细胞。

在本发明的一个优选例中，将小鼠的孤雄单倍体细胞注射入小鼠卵母细胞中，可以获得存活的小鼠个体。这些小鼠不但携带了单倍体干细胞本身所具有的遗传性状，而且还可以成长为具有生育能力的成体。

本发明提供的孤雄单倍体细胞具备典型的雄性生殖系特有的印记，能够代替精子补充胚胎的发育，并维持雄性印记；还可以通过同源重组进行基因打靶操作。

孤雄单倍体细胞的建立方法

本发明提供了两种建立孤雄单倍体细胞的方法，包括步骤：(i)获得不含雌原核的合子细胞；和(ii)培养所述的合子细胞，获得孤雄囊胚；较佳地，步骤(i)中不含雌原核的合子细胞是用选自下组的方法制备的：(1)将精子细胞与去核的卵母细胞结合，获得重构的不含雌原核的合子细胞；或(2)去除合子细胞中的雌原核，获得不含雌原核的合子细胞。

具体地，在本发明的一个优选例中，使用通用的核移植方法，将用精子头部替代体细胞作为遗传物质的供体。具体地，对小鼠进行绒毛膜促性腺激素注射处理，获取卵细胞并进行培养；用压电驱动的钝头的习惯进行去核；去核后，把单个精子的头部注入到卵细胞胞质中，从而形成重构的卵细胞；培养重构的卵细胞，在激活培基中进行激活处理，获得孤雄单倍体细胞系。

在本发明的另一个优选例中，所述方法包括步骤：将雌鼠与雄鼠进行交配，获得合子，收集PN3时期的合子；在PN3-4时期通过用脉冲驱动在雌原核的透明带上打孔，雌原核有雄原核在大小上存在区别，并且远离极体，用显微操作仪去除雌原核，获得只含有雄原核的合子；将该合子进行培养，获得孤雄单倍体细胞系。

在另一优选例中，使用流式细胞分选的方法根据DNA含量从孤雄囊胚中获得孤雄单倍体细胞。

在另一优选例中，使用流式细胞分选的方法根据DNA含量从获得的孤雄单倍体细胞中进一步富集该细胞。

非人灵长类孤雄单倍体胚胎干细胞系的建立方法

本发明还提供了非人灵长类孤雄单倍体胚胎干细胞系的建立方法。采取猴核移植的标准程序（参考Nature.2007Nov22;450(7169):497-502.Epub2007Nov14.），将成熟的MII期猴卵母细胞的核去除，然后注入精子头部。重构卵通过以下程序进行激活处理：在含5mM ionomycin的TALP/HEPES培养液中处理5分钟，然后移入含2mM6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)的TALP/HEPES培养液中处理5分钟，最后移入含2mM DMAP的HECM-9的培养液处理5小时。重构胚胎在含有10%FBS和12mM b-巯基乙醇(BME)的HECM-9培养液中培养不超过十天以获得囊胚，培养液每天进行更换。囊胚用于建立胚胎干细胞系，参考Mitalipov等的方法（Stem Cells.2006Oct;24(10):2177-86.Epub2006Jun1；Nature.2007Nov22;450(7169):497-502.Epub2007Nov14.）。

具体为：囊胚在含0.5%pronase的标准ESC建立培养液中处理50秒去除透明带。通过两种方法获得内细胞团细胞（inner cell mass,ICM）。第一是机械法，即通过机械的方法将滋养外胚层细胞去掉；第二是免疫手术法，囊胚先置于兔抗后血清（Axell Labs,Westbury,New York,USA）中30分钟，然后在豚鼠补体（sigma）中处理30分钟，最后通过轻微的吹打分离出ICM。分离的ICM转移到4孔板的一个孔中，在含有1%非必需氨基酸,2mM L-谷氨酰胺,0.1mM b-巯基乙醇和15%FBS的DMEM/F12培养液中培养。ICM粘附到MEF上并长出细胞团后，通过机械法将细胞团分成小细胞团并转移到新的MEF上。第一次传代后，长出标准的猴子胚胎干细胞形态的克隆用于进一步的传代培养。为了筛选出单倍体细胞，先用胰酶消化ES细胞，然后用DPBS洗涤，而后在37°C水浴与15ug/ml Hoechest33342共培养。随后，大部分单倍体就可以通过BD FACS Ariall纯化出来，进行后续培养。为了对单倍体进行分析，经过在70%乙醇固定之后，细胞用20ug/ml RNA酶A处理，并用50ug/ml PI染色。分析图谱用BD LSRIISORP软件记录。

在非人灵长类孤雄单倍体细胞系的建立中，对猴的种属没有特别的要求。在具体实施方式中，本发明利用食蟹猴(Macaca Fascicularis)，但也可以用猕猴(rhesus macaques)，还可以用其它种属的猴。此外，本领域技术人员还应理解，在上文所述的方法中，小鼠的种属也没有特别的要求。

孤雄单倍体细胞的应用

AG-haESCs能够更快更可靠的得到F1代(只局限于雌性)，避免了等待二倍体胚胎干细胞得到的嵌合体进行生殖系传递，而这种得到嵌合体的传统方法是基因打靶的限速步骤。对于大型动物(包括猪、牛和猴子等)，目前没有胚胎干细胞系可以用于有效的嵌合体形成和生殖系传递。大型动物即使得到了嵌合体，也很难有足够的嵌合体交配用于生殖系传递的筛选。相比之下，AG-haESCs直接获得的杂合F1代能够确保在有限的交配内发生可信的生殖系传递，因为一半的后代可以继承基因的改造。AG-haESCs可以潜在地从诊断有各种突变的雄性个体中获得。这些细胞的突变被纠正后，可将其用于与健康的个体进行体外受精。

本发明还提供了一种制备转基因动物的方法，包括步骤：

(i)对孤雄单倍体细胞进行遗传转化，获得转化的孤雄单倍体细胞；(ii)将转化的孤雄单倍体细胞与卵母细胞结合，获得转化的合子细胞；和(iii)将转化的合子细胞再生为动物体，从而获得转基因动物。在另一优选例中，所述的转基因动物是基因敲除的转基因动物。所述的遗传转化包括基因敲除、基因突变、导入外源基因。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明的孤雄单倍体细胞具备典型的雄性生殖系特有的印记，能够代替精子补充胚胎的发育，并维持雄性印记；

(2)本发明的孤雄单倍体细胞可以通过同源重组进行基因打靶操作；

(3)本发明的孤雄单倍体干细胞能够制备基因修饰动物，有利于基因操作，并且能将遗传信息传递给后代。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料与方法

核型分析

首先，胚胎干细胞(ES细胞)与0.4μg/ml秋水酰胺(购于Sigma公司)共培养；然后用胰酶消化，之后把ES细胞在0.075M KCl低渗液中37°C重悬30min，处理后的细胞在甲醇：醋酸(3:1)的混合液中固定30min，再滴在预洗的载玻片上；接着在5M HCl中处理后，用吉姆萨染料染15min；分析中期伸展的细胞。

免疫染色(免疫荧光分析)

载玻片上的细胞在室温下用含有4%多聚甲醛的PBS固定15min；然后在室温下用含0.2%Triton X-100的PBS进行渗透15min；再用含有1%BSA的PBS封闭30min；第一抗体为：抗Oct4(sc-5279，购自Santa Cruz)，Nanog(RCAB002P-F,购自Reprocell)，SSEA-1(mab4301，购自Millipore)，Sox2(ab5603，购自Millipore)，都稀释于同样的封闭缓冲液，与样品4°C共培养过夜；这些细胞用荧光偶联的第二抗体处理，并室温下孵育1h；细胞核则用Hoechest33342(购自sigma公司)在室温下染色5min。用SZX7奥林巴斯体视镜进行显微观察。

细胞大小的测量

单倍体胚胎干细胞和二倍化的单倍体胚胎干细胞在中期进行同步化，而后用FACS进行纯化；同样数目的细胞重悬在10μl ES培基中，然后与10μl0.2%台盼蓝混合来区别并死细胞。这些细胞的大小用Invitrogen公司的Countess CellCounter仪器进行测量。

雄性单倍体胚胎干细胞注射到二倍体囊胚

从交配3.5d超排卵的雌鼠的子宫中收集两倍体胚胎，培养在含有氨基酸的KSOM培基中；在囊胚注射之前，需用胰酶消化雄性单倍体胚胎干细胞，然后重悬在无白血病抑制因子(LIF)的DMEM中，并置于冰上；用于进行ES细胞注射是平头显微注射吸管；在注射吸管的末端吸气超过100个ES细胞，约10-15个ES细胞注入一个囊胚腔中；在胚胎移植之前一直都培养在含有氨基酸的KSOM中；在胚胎移植时，8-10个注射后的囊胚移入假孕2.5天的ICR雌鼠的子宫角；怀孕的受体在妊娠19.5天后进行剖腹产。

定量反转录PCR

总RNA用Trizol试剂(购于Introgen公司)从细胞中提取得到。1mg的总RNA用第一条链cDNA生成试剂盒(购于TOYOBO公司)反转录。实时定量PCR反应用SYBR Green实时RCR混合液进行三组重复，并在仪器(Bio-Rad CFX96)上进行；所有的基因表达水平均校对内标基因Gapdh。

亚硫酸测序法

为了得到小鼠精子DNA和尾部基因组DNA，样品用二硫苏糖醇进行预处理3h(仅适合精子)，而后用蛋白酶K裂解，并进行酚氯仿抽提；对于FACS得来的雄性单倍体胚胎干细胞、卵丘细胞和卵细胞的DNA甲基化分析，亚硫酸的转变在琼脂球上进行(方法如Hajkova et al.,2002所述)然后PCR产物克隆到pMD19-T载体(购于TAKARA公司)上，克隆的测序由上海Introgen公司完成。

卵胞浆内雄性单倍体胚胎干细胞注射

为得到半克隆胚胎，用处于G1或M期的雄性单倍体胚胎干细胞进行卵胞浆内注射；先用胰酶消化雄性单倍体胚胎干细胞，再用HEPES-CZB培基洗涤三次，而后悬浮在含3%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的HEPES-CZB中；在第一轮实验中，选择已处于G1期或FACS获得的处于G1期的小雄性单倍体胚胎干细胞用来注射；在第二轮实验中，雄性单倍体胚胎干细胞通过培养在含0.05μg/ml秋水酰胺内8h，阻滞在M期；来自G1期供体细胞的细胞核或者出去M期的细胞的M期染色体用压电钻口显微操作仪注射到处于MII停滞的卵细胞；这些重构细胞在CZB培基中培养1h，然后在无CB的激活培基中激活5-6h；激活后，所有的重构胚胎在37°C，5%CO₂环境下在含氨基酸的KSOM培基中培养。

胚胎移植和剖腹产

卵胞浆内雄性单倍体胚胎干细胞注射的胚胎在KSOM培基中培养直到两细胞或者囊胚时期；15-20个两细胞胚胎或8-10个囊胚移入假孕0.5d或者2.5d的ICR雌鼠的输卵管或子宫中；受体母鼠在妊娠19.5d实行安乐死，并把胎儿尽快从子宫中取出；在去除其呼吸道内液体后，胎儿安置的供氧的热盒中，存活的胎儿由哺乳的母鼠喂养。

芯片分析

来自3组同样的两倍体ES细胞(E14)，5株独立获得的单倍体ES细胞(AGH-OG-1P14、AGH-OG-2P15、AGH-OG-3P12、AGH-OG-4P14、AGH-EG-1P15)，和两组小鼠胚胎成纤维细胞的RNA用RNeasy试剂盒(购于Qiagen公司)抽提。Affymetrix Genechip4302.0芯片的基因表达分析由Imagenes公司进行。数据用Genespring GX软件分析(Agilent技术公司)。标记与杂交是依照AffymetrixGeneChip3’ITV Express试剂盒用户手册相应的方案在上海生物芯片公司进行的。转录图谱的相关性是通过计算Pearson相关系数确定的。用来做比较基因组杂交实验的DNA样品(来自AGH-OG-2，AGH-OG-3和AGH-OG-1)提取出来后，送到首都生物公司(昌平区，北京)做比较基因组杂交分析，所用的芯片是NimbleGen3×720K小鼠全基因组芯片，探针平均跨度3.5Kb。用成年C57BL/6雄鼠的肾脏作为参照。

统计分析

不同组间基因表达分析水平的差异用student t-test的方法进行分析。所有的标准分析都是利用SPSS软件13.0完成的。

实施例1建立孤雄单倍体干细胞

雄性单倍体胚胎的准备工作：

精子：参考文献(Kimura and Yanagimachi，1995；Yang et al.,2011)，收集Oct4-EGFP转基因老鼠(购自南京模式动物研究所)的精子，为卵胞浆内单个精子注射技术(ICSI)做准备。

卵细胞：卵细胞供体来自B6D2F1(C57BL/6×DBA2)雌鼠，B6D2F1雌鼠购自南京模式动物研究所。

采用以下方法制备雄性单倍体胚胎：

第一种方法，标准的核移植方法(参考n et al.,2011;Wakayama et al.,1998)，其中，用精子头部替代体细胞供体。具体地，先是在小鼠注射绒毛膜促性腺激素(HCG)14h之后，获取卵细胞，而后于含有5μg/ml细胞松弛素B的HEPES-CZB培基液中培养；用压电驱动的钝头的习惯进行去核；去核后，把单个精子的头部注入到卵细胞胞质中，从而形成重构的卵细胞；重构后的卵细胞在CZB的培基中培养1h，再在含有10nM Sr2+的激活培基中激活5-6h。在激活之后，所有的重构胚胎培养在37°C，5%CO₂环境下含有氨基酸的KSOM培基中(图1A)。

结果，通过Hochest染色和免疫荧光的方法，可以观察到精子头部发生去凝集，形成原核，并且胞嘧啶出现5-羟甲基化的信号(图1B，图1C)，表明在去核的卵细胞中，供体细胞核发生了激烈的重塑过程，在重构的909枚卵细胞中，194(21%)枚能在体外发育至囊胚(图1D)。去除透明带后，囊胚被培养于在添加了2i因子的标准ES培养系统中，用通用的方法获得胚胎干细胞。在获得的34株干细胞系中，4株(名为AGH-OG-1至AGH-OG-4)被鉴定出为单倍体，并通过多轮流式分选富集单倍体细胞过程来进行维持(图1E、图1F)。

第二种方法，B6D2F1雌鼠与Actin-EGFP转基因小鼠交配(C57BL/6遗传背景)(两种鼠均购自南京模式动物研究所)，合子在PN3时期进行收集；雌原核在PN3-4时期通过用脉冲驱动在透明带上打孔，而后用显微操作仪去除；雌原核有雄原核在大小上存在区别，并且远离极体，只含有雄原核的合子培养在37°C，5%CO₂环境下含有氨基酸的KSOM培基中。最后把在3.5天到达桑葚胚或囊胚的重构胚胎转移到ES培基中。

结果，从490枚操作过的受精胚中，获得了82枚囊胚,并建系五株。经过几轮流式分选和体外传代，最终获得一株单倍体干细胞(名为AGH-EG-1)。

综上所述，发明人在本实施例中，总共获得五株孤雄单倍体干细胞，在体外能培养传代超过30代，没有发现一株含有Y染色体(带单倍或双倍Y染色体的孤雄胚胎均不能发育到囊胚阶段)。核型分析发现，无论多少代，这几株干细胞均只有一套20条染色体的基因组(图1H)；图1G为针对性染色体的PCR结果，AG-haESC细胞系只有X染色体，没有Y染色体；比较基因组杂交实验(CGH)结果表明，这些单倍体细胞保持着基因稳定性(图1I)。

实施例2AG-haESCs的多能性

AG-haESCs具有和正常二倍体小鼠胚胎干细胞的克隆形态，对其进行免疫荧光分析，结果发现ES细胞的标记(包括Nanog、Oct4、Sox2、和Ssea1)在haES克隆(图2A)和FACS得到的只有单份DNA含量的细胞(表1)中均表达。

表1

比较正常ES细胞和雄性个体的胚胎成纤维细胞(MEFs)与AG-haESCs的基因表达图谱。为了避免二倍体化细胞对表达图谱的影响，通过FACS收集处于G1/G0期的样品。根据微矩阵表达数据得到这些细胞的聚类分析，结果表明AG-haESCs和二倍体ES细胞具有很高的相似性，但与MEFs没有相似性(图2B)。

为了检测AG-haESCs的发育潜能，将Actin-EGFP标记的单倍体细胞(AGH-EG-1)注入到ICR来源的二倍体囊胚中，得到了ES贡献很高的嵌合小鼠，并且其对生殖细胞系的贡献也很大(图2C、图2D)。从嵌合小鼠中分离的GFP阳性细胞具有二倍体的DNA含量(图2E)。

以上结果说明，从孤雄囊胚中得到的haESCs表现出于正常二倍体ESCs相似的多能性。

实施例3AG-haESCs父本基因组印记的部分维持

由于建立在原始生殖细胞阶段的父本印记普及于整个受精过程，并且持续于整个胚胎发育过程。本实施例中发明人检测这些AG-haESCs是否维持着父本印记。

首先比较单倍体和对照二倍体ESCs之间印记基因的表达，结果发现，孤雄来源的AG-haESCs所有父本基因被印记，并且母源表达的基因被下调，除了H19基因；相反，母源印记基因(表达于父本等位基因)被上调(表1和图3A)。说明AG-haESCs很大程度上维持着一个典型的父本印记背景。

为了进一步评估其表观遗传的情况，通过亚硫酸氢盐测序的方法分析两个父本印记基因Gtl2和H19以及一个母源印记基因Snrpn的甲基化背景。Gtl2分化的甲基化结构域(DMR)甲基化水平很大程度上保持完整，而H19DMR的甲基化保持在一个下降的水平；相反，Snrpn基因的DMR不被甲基化(图3B)。说明单倍体细胞是孤雄来源的。H19DMR的甲基化在培养的AG-haESCs中看起来像是动态的，因为甲基化水平在不同的细胞代数中会发生波动。

以上结果表明，父本基因组印记尽管在特定的位点上不断变化，但是整体上在AG-haESCs中是被很好维持。

实施例4孤雄单倍体干细胞注射入卵母细胞后能支持胚胎后续发育

采用胞浆内孤雄单倍体干细胞注射(ICAHCI)(图4A)，研究孤雄单倍体干细胞在注射入成熟的卵母细胞后是否能够取代精子的作用，支持胚胎的完全发育。发明人使孤雄单倍体干细胞同步化在中期，然后选择偏小细胞来进行ICAHCI，这些细胞几乎都是处于M期的单倍体细胞。

结果表明，注入的单倍体干细胞核会形成一个假原核，类似于雄原核一样，说明其在进行着重编程过程(图4B)；此外，第二极体和假极体也会分别从纺锤体—染色体复合物和供体中期细胞核中排出，故而形成一个含两倍体DNA的重构胚来，注射后的卵细胞发育至囊胚的效率约为51%(图4C)，与对照的ICSI实验效率相近。

为了检测这些囊胚是否具有正常的整倍性，从40个囊胚中建立了19株胚胎干细胞系，并且通过流式方法检测其DNA含量，其中，17株干细胞含有两倍体显示ICAHCI过程很成功，另外两株细胞系为三倍体，意味着一些两倍体化了的孤雄单倍体干细胞在注射的时候被误选。

通过将2-细胞和囊胚分别移入假孕母鼠的输卵管和子宫的实验来检验ICAHCI胚胎的发育潜能。由所有的五株孤雄单倍体干细胞(从第七代到第22代)获得的451枚2细胞胚胎和424枚囊胚，移植后最终在妊娠的第19.5天剖腹产出生43只活的小鼠(图4D)。所有的小鼠均为雌性，与注射了这些带有X染色体的孤雄干细胞的预期判断相符。基因型鉴定结果显示，它们均带有来源于孤雄单倍体干细胞的GFP转基因，由于是由孤雄单倍体干细胞和正常的卵细胞相结合而获得的，因此将这些小鼠称为半克隆(SC)小鼠。半克隆小鼠的出生率按移植的囊胚数和移植的2细胞数来算分别为4.5%和5.3%，与传统的胚胎干细胞核移植率相当。然而，不同于胚胎干细胞核移植动物所表现出的过度生长表型，半克隆小鼠既有与普通新生小鼠体重相当的正常表型，也有发育阻滞型(图4D，图4E)。所有阻滞的后代都在出生后一个小时内死亡，由完全生长卵母细胞和未生长卵母细胞两者重构获得的双亲小鼠，无论是单敲除H19差异甲基化区域(DMR)还是双敲H19和Dlk1-Dio3基因间生殖来源的差异甲基化区域(IG-DMR)都有此类表型。

随后发明人检测了出生小鼠的印迹基因甲基化状态，发现在阻滞型小鼠中H19的DMR甲基化丢失而在存活小鼠中却是正常的(图4F)。同样，基因表达分析结果显示，正常的半克隆小鼠中两组相关印迹基因(Igf2与H19，Dlk1与Gtl2)与对照野生型老鼠有相似的表达模式，而在生长阻滞的后代中，主要的器官中Igf2表达量显著低于对照组。正常体重的半克隆小鼠很顺利的被养母所接受并喂养，并且大部分(14/18)长到了成年(图4G)。

为了检测这些半克隆老鼠是否能够把Oct4-EGFP转基因表型通过生殖系细胞传递到下一代，本发明人解剖由AGH-OG-1而来的一只刚出生和一只四周大半克隆小鼠，发现卵巢和生发泡卵母细胞均为GFP阳性(图5A)，此外，超排一只半克隆小鼠并让其与正常的一只B6D2F1公鼠交配，获得了一窝16只小鼠(图5B)，Oct4-EGFP阳性小鼠占50%，符合孟德尔定律比值(图5C)，因为这只半克隆母鼠是Oct4-EGFP杂合子，重要的是，转基因阳性后代中雌雄都有(图5D)，说明从孤雄单倍体胚胎干细胞而来的雌性半克隆小鼠能够有正常的配子生成。

以上结果表明，孤雄单倍体胚胎干细胞在注射入卵细胞后，能够将遗传性状传给出生的半克隆小鼠，半克隆小鼠则能进一步传给它的后代。

实施例5在孤雄单倍体胚胎干细胞中进行基因打靶

本实施例中本发明人将对孤雄单倍体胚胎干细胞中进行基因打靶。为了避免潜在对细胞自身功能有干扰，使用通用的条件性基因打靶策略来修饰基因Vwce，该基因参了Wnt信号通路。方法如下(图6A)：

为了获得Vwce打靶载体，5’和3’端同源的DNA两侧是通过标准的基因重组工程技术从小鼠基因组DNA的BAC克隆得到的。打靶载体包含了大小分别为4.9kb和5.6kb的左右同源臂，一个PGK-neo药物筛选表达盒和长为3.5kb的包含外显子2-4的基因组区域序列。负选择基因疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因置于目的基因片段的外侧。重组转化细胞具有G418和ganciclovir的双重抗性，非同源重组的靶细胞，因含有通过末端插入而整合的HSV-tk基因，在ganciclovir选择培养基中不能存活。

做基因打靶的细胞是AG-EG-1(第25代)单倍体ES细胞系，在更换培基后三个小时，用胰酶消化ES细胞成单细胞，然后用不含Ca²⁺/Mg²⁺的PBS以浓度每毫升1×10⁷个进行重悬，再在含有2.5μg的pL253-Vwice的打靶载体的0.4cm宽的无菌小槽内进行电穿孔，单脉冲的条件是260V，500μE。这些细胞在室温下放置5min后，铺就在有新霉素抗性的MEF滋养细胞的10cm培养皿中。24小时后，药物筛选开始，用含有大约200μg/ml的G418和2μM的ganciclovir的ES选择培基替代普通ES培基，并每天更换选择培基。10天之后挑ES克隆。收集的克隆先用胰酶消化，然后转移到含ES选择培基的24孔板中，此时的选择培基含有100μg/ml的G418和2μM的ganciclovir。经过3-5天的培养之后，G418抗性克隆通过跨越左右重组臂的引物(P1-4)做大范围PCR来筛选同源重组。

结果：获得90个双抗克隆，用引物进行鉴定，结果有43个阳性克隆(图6B)。其中12个克隆(13%)仅含有打靶的等位基因，而其余的用PCR鉴定后发现有野生型的等位基因。从4个随机挑选的打靶克隆中，通过多次传代和流式分选富集单倍体的方法获得孤雄单倍体胚胎干细胞(图6C)。

被鉴定出来稳定的克隆含有大量单倍体细胞群，其中带有被打靶的等位基因，而没有野生型的，表明电转打靶载体后同源重组能够在单倍体细胞中发生，表明孤雄单倍体胚胎干细胞能被应用于标准的基因打靶操作中。

实施例6

将实施例5制备的带有被打靶等位基因的AG-haESC-Vwce细胞注射入卵母细胞，经培养，获得基因敲除的杂合子小鼠（半克隆小鼠）。

图7A显示，出生后的半克隆小鼠，其胎盘和胎儿均为EGFP阳性，表明注射的AG-haESC-Vwce细胞株带有EGFP基因；图7B为用引物（P1-P6）对小鼠不同部位（tail（尾部）、ovary（卵巢）、placenta（胎盘））基因型的鉴定结果。

结果表明，本发明的孤雄单倍体干细胞能够成功地制备基因修饰动物。

实施例7.非人灵长类孤雄单倍体细胞系的建立

采取猴核移植的标准程序（参考Nature.2007Nov22;450(7169):497-502.Epub2007Nov14.），将成熟的MII期猴卵母细胞的核去除，然后将实验动物-食蟹猴(Macaca Fascicularis)(可购自广东蓝岛生物技术有限公司，广州市，广东省)的精子头部注入上述卵母细胞中。重构卵通过以下程序进行激活处理：在含5mM ionomycin的TALP/HEPES培养液中处理5分钟，然后移入含2mM6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)的TALP/HEPES培养液中处理5分钟，最后移入含2mMDMAP的HECM-9的培养液处理5小时。重构胚胎在含有10%FBS和12mM b-巯基乙醇(BME)的HECM-9培养液中培养不超过十天以获得囊胚，培养液每天进行更换。囊胚用于建立胚胎干细胞系，参考Mitalipov等的方法（Stem Cells.2006Oct;24(10):2177-86.Epub2006Jun1；Nature.2007Nov22;450(7169):497-502.Epub2007Nov14.）。

具体为，囊胚在含0.5%pronase的标准ESC建立培养液中处理50秒去除透明带。通过免疫手术法获得内细胞团细胞（inner cell mass,ICM：囊胚先置于兔抗后血清（Axell Labs,Westbury,New York,USA）中30分钟，然后在豚鼠补体（sigma）中处理30分钟，最后通过轻微的吹打分离出ICM。分离的ICM转移到4孔板的一个孔中，在含有1%非必需氨基酸,2mM L-谷氨酰胺,0.1mM b-巯基乙醇和15%FBS的DMEM/F12培养液中培养。ICM粘附到MEF上并长出细胞团后，通过机械法将细胞团分成小细胞团并转移到新的MEF上。第一次传代后，长出标准的猴子胚胎干细胞形态的克隆用于进一步的传代培养。为了筛选出单倍体细胞，先用胰酶消化ES细胞，然后用DPBS洗涤，而后在37°C水浴与15ug/ml Hoechest33342共培养。随后，大部分单倍体就可以通过BD FACS Ariall纯化出来，进行后续培养。为了对单倍体进行分析，经过在70%乙醇固定之后，细胞用20ug/ml RNA酶A处理，并用50ug/ml PI染色。分析图谱用BD LSRIISORP软件记录。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献

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Claims (4)

1.一种孤雄单倍体细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(i)获得不含雌原核的合子细胞；

(ii)培养所述的合子细胞，获得孤雄囊胚；和

(iii)培养(ii)所述的孤雄囊胚，从而获得孤雄单倍体细胞；

其中，步骤(i)中不含雌原核的合子细胞是用选自下组的方法制备的：

(1)将精子细胞与去核的卵母细胞结合，获得重构的不含雌原核的合子细胞；或

(2)去除合子细胞中的雌原核，获得不含雌原核的合子细胞；

所述孤雄单倍体细胞系是非人哺乳动物的孤雄单倍体胚胎干细胞系。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括根据DNA含量使用流式细胞分选的方法获得孤雄单倍体细胞。

3.权利要求1或2所述方法制备的孤雄单倍体细胞系的用途，其特征在于，孤雄单倍体细胞系用于：

(a)基因打靶；和/或

(b)取代配子，支持胚胎发育；

其中，所述孤雄单倍体细胞系是非人哺乳动物的孤雄单倍体胚胎干细胞系。

4.一种制备转基因动物的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)对权利要求1或2所述方法制备的孤雄单倍体细胞系进行遗传转化，获得转化的孤雄单倍体细胞；

(ii)将转化的孤雄单倍体细胞与卵母细胞结合，获得转化的合子细胞；和

(iii)将转化的合子细胞再生为动物体，从而获得转基因动物；

其中，所述孤雄单倍体细胞系是非人哺乳动物的孤雄单倍体胚胎干细胞系。