KR20180105772A

KR20180105772A - 생물발광 강도가 증폭된 변이 가우시아 루시퍼라아제

Info

Publication number: KR20180105772A
Application number: KR1020170032655A
Authority: KR
Inventors: 김영필; 비나야쿠마르; 이진오
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2017-03-15
Filing date: 2017-03-15
Publication date: 2018-10-01
Also published as: KR102018248B1; WO2018169317A1

Abstract

본 발명은 부위 특이적 돌연변이를 이용하여 가우시아 프린셉스(Gaussia Princeps) 유래 루시퍼라아제의 생물발광 강도를 증폭시키도록 변형시킨 가우시아 루시퍼라아제 변이체에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 가우시아 루시퍼라아제(GLuc, Gaussia princeps Luciferase)의 아미노산 서열에서 60번째, 88번째, 89번째, 90번째 및 103번째 아미노산 중 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하여 제조한 가우시아 루시퍼라아제 단일 또는 다중 돌연변이체, 상기 변이체 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 형질전환체로부터 생물발광 강도가 향상된 변이 가우시아 루시퍼라아제를 제조하는 방법, 및 상기 변이 가우시아 루시퍼라아제를 포함하는 키트에 관한 것이다.
GLuc(Gaussia luciferase)는 세포 기반 리포터 분석(cell-based reporter assay)을 위해 가장 널리 사용되는 분비성 루시퍼라아제로, 다양한 종에서 유래되는 루시퍼라아제 중에서 크기가 가장 작아 다른 단백질과 결합시 단백질 구조의 영향을 최소화함으로써 효과적인 모니터링에 사용할 수 있는 장점을 가지고 있다. 그러나, 야생형(wild-type) GLuc의 경우 발광신호 크기가 충분하지 못한 단점을 가지고 있다.
따라서, 본 발명은 가우시아 루시퍼라아제의 생물발광 신호 증폭에 있어서 중요한 역할을 하는 아미노산 잔기를 돌연변이 시킴으로써, 생물발광 신호가 향상된 변이 가우시아 루시퍼라아제를 제조할 수 있으며, 이를 세포 모니터링 및 신약 스크리닝 등에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

생물발광 강도가 증폭된 변이 가우시아 루시퍼라아제{Mutant Gaussia luciferase with enhanced bioluminescence intensity}

본 발명은 부위 특이적 돌연변이를 이용하여 가우시아 프린셉스(Gaussia Princeps) 유래 루시퍼라아제의 생물발광 강도를 증폭시키도록 변형시킨 가우시아 루시퍼라아제 변이체에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 가우시아 루시퍼라아제(GLuc, Gaussia princeps Luciferase)의 아미노산 서열에서 60번째, 88번째, 89번째, 90번째 및 103번째 아미노산 중 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하여 제조한 가우시아 루시퍼라아제 단일 또는 다중 돌연변이체, 상기 변이체 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 형질전환체로부터 생물발광 강도가 향상된 변이 가우시아 루시퍼라아제를 제조하는 방법, 및 상기 변이 가우시아 루시퍼라아제를 포함하는 키트에 관한 것이다.

루시퍼라아제(luciferase)를 이용한 생물발광 분석(bioluminescence assay)은 높은 감도(sensitivity), 광범위한 선형성(extensive linearity) 및 매우 낮은 백그라운드 신호(background signals) 때문에, 이와 유사한 형광분석법(fluorescence assay) 또는 화학발광 분석법(chemiluminescence assay)을 종종 능가하는 결과가 나온다. 루시퍼라아제는 루시페린 기질(루시페린(luciferin) 또는 코엘렌테라진(coelenterazine))의 산화(oxdiation)를 촉매하여 빛을 생성한다. 지금까지, 반딧불이(firefly), 레닐라(Renilla), 갑각류(copepod) 및 박테리아(bacteria)를 포함한 다양한 종(species)으로부터 루시퍼라아제가 클로닝(cloning) 되었으며, 특성화(characterization)되었다(W.W. Lorenz et.al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA., 88: 4438-4442, 1991). 바이오어세이(bioassay)에 가장 널리 사용된 루시퍼라아제는 반딧불이 루시퍼라아제(firefly luciferase, FLuc), 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase, RLuc) 및 최근에 가우시아 루시퍼라아제(Gaussia luciferase, GLuc)이다. FLuc는 ATP, 산소(oxygen) 및 Mg² ⁺의 존재하에 루시페린(luciferin)을 산화시키는 촉매 구실을 한다. 한편, RLuc 및 GLuc는 ATP 및 마그네슘(Mg² ⁺) 비의존적이며, 기질로서 코엘렌테라진을 사용한다. RLuc는 코엘렌테라진-의존적 루시퍼라아제(coelenterazine-dependent luciferases) 중 가장 널리 사용되고 구조적으로 특징화 되어있다(A.M. Loening et.al., J. Mol . Biol ., 374: 1017-1028, 2007).

그러나, 최근 해양 갑각류(copepod)인 가우시아 프린셉스(Gaussia Princeps)로부터 동정된 가우시아 루시퍼라아제(GLuc, Gaussia princeps Luciferase)는 코엘렌테라진 의존성 생물발광 단백질로, 현재까지 다양한 종에서 유래되는 루시퍼라아제 중에서 크기가 가장 작고 생물발광이 강하며, 세포 기반 리포터 분석(cell-based repoter assay)을 위해 가장 널리 사용되는 분비성 루시퍼라아제로서 많은 주목을 받고 있는 것으로 밝혀진 바 있다(B.A. Tannous et.al., Mol . Ther ., 11: 435-443, 2005). GLuc는 라이브 이미징(live imaging), 단백질-단백질 상호작용(protein-protein interaction), 단백질 역학(protein dynamics), 종양 진행 모니터링(monitoring tumor progression) 및 고속대량 스크리닝(high-throughput screening, HTS)과 같은 바이오분석을 하는데 있어 다양한 이점을 지니고 있다(C.A. Maguire et.al., Anal. Chem ., 81: 7102-7106, 2009). 다양한 이점을 지니고 있음에도 불구하고, GLuc의 구조와 기능적 세부사항은 거의 알려져 있지 않다. 또한, 루시퍼라아제는 진화(evolutionary)와 관련이 없으며, 서열 유사성(sequence similarity)을 공유하지 않는다. 한편, 여러 보고서에서는 자연적으로 존재하는 형태보다 RLuc 변이형(variant)을 강화하고 안정화시키는 단백질 공학적 노력을 더 강조하고 있다(A.M. Loening et.al., Nat. Methods., 7: 5-6, 2010). 변형된(modified) RLuc 돌연변이체는 다양한 이분자(biomolecular) 및 고속대량 스크리닝 기반 어세이(high-throughput screening based assay)에 대한 새로운 전략 개발에 널리 사용된다(A. Dragulescu-Andrasi et.al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA., 108: 12060-12065, 2011).

GLuc의 경우에도 유전자 셔플링(gene shuffling; 유전자 재조합) 기술을 사용하여 발광 강도(intensity)를 몇 배 증폭시키기 위한 연구 개발이 이루어지고 있다(M.H. Degeling et.al., Anal. Chem ., 85: 3006-3012, 2013). Maguire CA 등은 고속대량 스크리닝(high-throughput screening, HTS)에 적합한, Triton X-100의 존재하에 글로우 타입(glow-type)의 발광(light emission) 동역학(kinetics)을 나타내는 GLuc 변이체(variant)에 대해 보고한 바 있다(C.A. Maguire et.al., Anal. Chem., 81: 7102-7106, 2009). Welsh JP 등은 야생형(wild-type) GLuc보다 연장된 발광(luminescence) 반감기(half-life)를 나타내는 이중 돌연변이 변이체(double mutant variant)에 대해 보고한 바 있다(J.P. Welsh et.al., Biochem . Biophys . Res. Commun ., 389: 563-568, 2009). 이와 같이, GLuc에 대해 유전자 공학적으로 변이를 도입한 다수의 변이체가 알려져 있지만, 발광 강도 및 안정성 면에서 만족이 가는 변이 가우시아 루시퍼라아제는 미비하다. 따라서, 생물발광 강도 및 안정성이 향상되고, 기질 특이성을 갖는 변이 가우시아 루시퍼라아제 개발이 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 갑각류 루시퍼라아제(copepod luciferase) 중, 고도로 보존되고 일치된 다양한 아미노산의 상세한 역할을 분석하고자 하였다. 동종의 갑각류 루시퍼라아제 서열을 규명하기 위해 블라스트 검색(BLAST-search)을 수행하였으며, 고도로 보존되고 일치된 아미노산을 확인하기 위해 GLuc에 대한 다중 정렬(multiple alignment)을 수행하였다. 다중 정렬에 따른 결과를 기반으로 하여, 일치된 아미노산 잔기를 변이시킨 보존된 아미노산을 이용하여 생물발광 강도 향상에 있어서의 역할을 분석하였다. 향상된 생물발광 강도를 갖는 단일 돌연변이체를 추가로 조합하여 최대 생물발광 강도를 갖는 다중 돌연변이체를 구축하였다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 생물발광 강도가 증폭된 변이 가우시아 루시퍼라아제를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 다양한 갑각류(copepod)의 루시퍼라아제 서열의 정렬을 기반으로 시퀀스-가이드 돌연변이 유발 분석(sequence-guided mutagenesis analysis)으로 생물발광 강도(bioluminescence intensity)를 현저하게 증폭시킬 수 있는 주요 후보 아미노산을 도출하고, 상기 도출된 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하여 제조한 가우시아 루시퍼라아제 단일 또는 다중 돌연변이체가 야생형(wild-type)과 비교하여 생물발광 강도가 현저히 증가됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

W.W. Lorenz et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 88: 4438-4442, 1991 A.M. Loening et.al., J. Mol. Biol., 374: 1017-1028, 2007 B.A. Tannous et.al., Mol. Ther., 11: 435-443, 2005 C.A. Maguire et.al., Anal. Chem., 81: 7102-7106, 2009 A.M. Loening et.al., Nat. Methods., 7: 5-6, 2010 A. Dragulescu-Andrasi et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 108: 12060-12065, 2011 M.H. Degeling et.al., Anal. Chem., 85: 3006-3012, 2013 J.P. Welsh et.al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 389: 563-568, 2009

본 발명의 목적은 부위 특이적 돌연변이를 이용하여 가우시아 프린셉스(Gaussia Princeps) 유래 루시퍼라아제의 생물발광 강도를 증폭시키도록 변형시킨 가우시아 루시퍼라아제 변이체를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이체 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체로부터 생물발광 강도가 향상된 변이 가우시아 루시퍼라아제를 제조하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 변이 가우시아 루시퍼라아제를 포함하는 키트를 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 가우시아 루시퍼라아제(GLuc, Gaussia princeps Luciferase)의 아미노산 서열에서 60번째, 88번째, 89번째, 90번째 및 103번째 아미노산 중 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하여 제조한 가우시아 루시퍼라아제 단일 또는 다중 돌연변이체, 상기 변이체 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 형질전환체로부터 생물발광 강도가 향상된 변이 가우시아 루시퍼라아제를 제조하는 방법, 및 상기 변이 가우시아 루시퍼라아제를 포함하는 키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 가우시아 루시퍼라아제(GLuc, Gaussia princeps Luciferase)의 아미노산 서열에서 60번째 아미노산인 메티오닌(Methionine, M), 88번째 아미노산인 리신(Lysine, K), 89번째 아미노산인 페닐알라닌(Phenylalanine, F) 및 103번째 아미노산인 세린(Serine, S) 중 하나 이상의 아미노산이 변이된 것을 특징으로 하는 가우시아 루시퍼라아제 변이체를 제공한다.

본 발명에서 용어 "루시퍼라아제(luciferase)"는 발광 단백질로서, 생물발광에 있어 루시페린(luciferin)-발광효소(luciferase)반응(L-L반응)을 나타내는 발광반응의 발광성 효소를 총칭한다. 루시퍼라아제는 북아메리카 반디인 포티너스 파이랄리스(Photinus Pyralis)의 파이어플라이 루시퍼라아제(firefly luciferase; Fluc)가 대표적이나, 최근 가우시아 루시퍼라아제(Gaussia luciferase, GLuc)가 크기가 가장 작고 생물발광이 강하여 주목받고 있다.

본 발명에서 용어 "가우시아 루시퍼라아제(GLuc, Gaussia princeps Luciferase)"는 가우시아 프린셉스(Gaussia Princeps)로부터 동정된 루시퍼라아제로, 현재까지 다양한 종에서 유래되는 루시퍼라아제 중에서 크기가 가장 작고 생물발광(bioluminescence)이 강하며, 세포 기반 리포터 분석(cell-based repoter assay)을 위해 가장 널리 사용되는 분비성 루시퍼라아제로 알려져있다.

야생형(wild-type) 가우시아 루시퍼라아제(GLuc)는 185개의 아미노산(amino acid)으로 이루어져 있으며, GenBank accession number는 AAG54095.1이고, 본 발명에서 서열번호 1로 표시하였다. 한편, 야생형(wild-type) 가우시아 루시퍼라아제(GLuc)의 염기서열은 서열번호 14로 표시하였다.

본 발명의 "가우시아 루시퍼라아제 변이체"는 부위 특이적 돌연변이를 이용하여 가우시아 프린셉스(Gaussia Princeps) 유래 루시퍼라아제의 생물발광 강도를 증폭시키도록 변형시킨 변이체로, 야생형 가우시아 루시퍼라아제의 아미노산 서열, 즉 서열번호 1의 아미노산 서열에서 60번째, 88번째, 89번째, 90번째 및/또는 103번째 아미노산 잔기를 다른 아미노산으로 치환하여 제조한 가우시아 루시퍼라아제 단일 또는 다중 돌연변이체이다.

구체적으로, 본 발명의 "가우시아 루시퍼라아제 변이체"는 서열번호 1의 가우시아 루시퍼라아제(GLuc, Gaussia princeps Luciferase)의 아미노산 서열에서 60번째 아미노산인 메티오닌(Methionine, M), 88번째 아미노산인 리신(Lysine, K), 89번째 아미노산인 페닐알라닌(Phenylalanine, F) 및 103번째 아미노산인 세린(Serine, S) 중 하나 이상의 아미노산이 변이된 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 "가우시아 루시퍼라아제 변이체"는 상기 4개의 위치의 아미노산 외에, 서열번호 1의 가우시아 루시퍼라아제(GLuc, Gaussia princeps Luciferase)의 아미노산 서열에서 90번째 아미노산인 이소류신(Isoleucine, I)이 추가로 변이된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, 먼저 단일 위치의 아미노산 변이를 갖는 하기 가우시아 루시퍼라아제 단일 돌연변이체를 제조하였다:

서열번호 1의 아미노산 서열에서 60번째 아미노산인 메티오닌(Methionine, M)을 류신(Leucine, L)으로 치환시킨 아미노산 서열을 가지는 변이체(서열번호 2);

서열번호 1의 아미노산 서열에서 88번째 아미노산인 리신(Lysine, K)을 글루타민(Glutamine, Q)으로 치환시킨 아미노산 서열을 가지는 변이체(서열번호 3);

서열번호 1의 아미노산 서열에서 89번째 아미노산인 페닐알라닌(Phenylalanine, F)을 타이로신(Tyrosine, Y)으로 치환시킨 아미노산 서열을 가지는 변이체(서열번호 4);

서열번호 1의 아미노산 서열에서 90번째 아미노산인 이소류신(Isoleucine, I)을 류신(Leucine, L)으로 치환시킨 아미노산 서열을 가지는 변이체(서열번호 5); 또는

서열번호 1의 아미노산 서열에서 103번째 아미노산인 세린(Serine, S)을 트레오닌(Threonine, T)으로 치환시킨 아미노산 서열을 가지는 변이체(서열번호 6).

상기 단일 돌연변이체를 이용하여 생물발광 강도를 측정해 본 결과, 야생형 가우시아 루시퍼라아제와 비교하여 생물발광 신호가 향상됨을 확인하였다. 특히, 상기 단일 돌연변이체 중 M60L 및 K88Q가 가장 높은 발광 강도 증진 효과를 나타내었다(도 2).

본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 상기 단일 위치의 아미노산 변이가 하나 이상 조합된 하기 가우시아 루시퍼라아제 다중 돌연변이체를 제조하였다:

서열번호 1의 아미노산 서열에서 60번째 아미노산 메티오닌(Methionine, M)을 류신(Leucine, L)으로, 88번째 아미노산 리신(Lysine, K)을 글루타민(Glutamine, Q)으로 치환시킨 아미노산 서열을 가지는 변이체(서열번호 7);

서열번호 1의 아미노산 서열에서 60번째 아미노산인 메티오닌(Methionine, M)을 류신(Leucine, L)으로, 90번째 아미노산인 이소류신(Isoleucine, I)을 류신(Leucine, L)으로 치환시킨 아미노산 서열을 가지는 변이체(서열번호 8);

서열번호 1의 아미노산 서열에서 88번째 아미노산인 리신(Lysine, K)을 글루타민(Glutamine, Q)으로, 90번째 아미노산인 이소류신(Isoleucine, I)을 류신(Leucine, L)으로 치환시킨 아미노산 서열을 가지는 변이체(서열번호 9);

서열번호 1의 아미노산 서열에서 60번째 아미노산인 메티오닌(Methionine, M)이 류신(Leucine, L)으로, 88번째 아미노산인 리신(Lysine, K)을 글루타민(Glutamine, Q)으로, 90번째 아미노산인 이소류신(Isoleucine, I)을 류신(Leucine, L)으로 치환시킨 아미노산 서열을 가지는 변이체(서열번호 10);

서열번호 1의 아미노산 서열에서 88번째 아미노산인 리신(Lysine, K)을 글루타민(Glutamine, Q)으로, 90번째 아미노산인 이소류신(Isoleucine, I)을 류신(Leucine, L)으로, 103번째 아미노산인 세린(Serine, S)을 트레오닌(Threonine, T)으로 치환시킨 아미노산 서열을 가지는 변이체(서열번호 11);

서열번호 1의 아미노산 서열에서 60번째 아미노산인 메티오닌(Methionine, M)을 류신(Leucine, L)으로, 88번째 아미노산인 리신(Lysine, K)을 글루타민(Glutamine, Q)으로, 90번째 아미노산인 이소류신(Isoleucine, I)을 류신(Leucine, L)으로, 103번째 아미노산인 세린(Serine, S)을 트레오닌(Threonine, T)으로 치환시킨 아미노산 서열을 가지는 변이체(서열번호 12); 또는

서열번호 1의 아미노산 서열에서 60번째 아미노산인 메티오닌(Methionine, M)을 류신(Leucine, L)으로, 88번째 아미노산인 리신(Lysine, K)을 글루타민(Glutamine, Q)으로, 89번째 아미노산인 페닐알라닌(Phenylalanine, F)을 타이로신(Tyrosine, Y)으로, 90번째 아미노산인 이소류신(Isoleucine, I)을 류신(Leucine, L)으로, 103번째 아미노산인 세린(Serine, S)을 트레오닌(Threonine, T)으로 치환시킨 아미노산 서열을 가지는 변이체(서열번호 13).

상기 다중 돌연변이체를 이용하여 생물발광 강도를 측정해 본 결과, 야생형 가우시아 루시퍼라아제와 비교하여 생물발광 신호가 현저하게 증가됨을 확인하였다. 특히, 다중 돌연변이체 중 M60L과 조합된 변이체의 발광 활성 증폭이 두드러짐을 확인하였다(도 3).

본 발명의 가우시아 루시퍼라아제 변이체는 서열번호 2 내지 13의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 이들 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 전좌 등을 통하여 본 발명이 달성하고자 하는 효과를 얻는 변이체도 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.

경우에 따라, 본 발명의 가우시아 루시퍼라아제 변이체는 이들의 물리, 화학적 성질을 증가 또는 감소시키는 변형을 가질 수 있어 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation), 아밀화(amidation) 등으로 변형(modification)될 수 있으며, 이러한 변형에 의해 증가된 가우시아 루시퍼라아제 변이체의 생물발광 활성이 실질적으로 유지되는 한, 이러한 기능적 유도체도 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 가우시아 루시퍼라아제 변이체 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에서 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 상기 가우시아 루시퍼라아제 변이체 서열을 코딩(coding)하는 폴리뉴클레오티드이다.

상기 가우시아 루시퍼라아제 변이체 서열을 코딩(coding)하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 가우시아 루시퍼라아제 변이체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 상기 가우시아 루시퍼라아제 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 이에 제한되지는 않으나, 본 발명에서 가우시아 루시퍼라아제 변이체 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 15 내지 26의 염기서열 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 일 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 가우시아 루시퍼라아제 변이체 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 용어 "재조합 벡터"는 숙주세포에 가우시아 루시퍼라아제 변이체를 코딩하는 DNA를 도입하여 가우시아 루시퍼라아제 변이체를 발현시키기 위한 수단을 말하며, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 사용할 수 있으며, 벡터는 DNA 재조합 기술을 이용한 임의의 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다.

상기 "작동 가능하게 연결된"은 발현 조절 서열이 가우시아 루시퍼라아제 변이체 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 전사 및 해독을 조절하도록 연결된 것을 말하며, 발현 조절 서열(프로모터 포함)의 조절하에 폴리뉴클레오티드 서열이 발현되어 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 가우시아 루시퍼라아제 변이체가 생성되도록 정확한 해독 프레임을 유지시키는 것을 포함한다.

본 발명에서 용어 "형질전환"은 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미하며, 형질전환된 유전자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있으면 숙주세포의 염색체 내 삽입 또는 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 제한하지 않고 포함된다.

본 발명에서 제공하는 "형질전환체"는 상기 본 발명에서 제공하는 재조합 벡터를 숙주에 도입하여 형질전환시켜서 제작될 수 있다. 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 생물발광 신호를 증대시킬 수 있는 본 발명의 변이 가우시아 루시퍼라아제를 생산할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다.

또한, 상기 형질전환체의 제작에 사용되는 숙주 역시 본 발명의 변이 가우시아 루시퍼라아제를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으며, 구체적으로는 에스케리키아(Escherichia) 속, 바실러스(Bacilus) 속, 슈도모나스 속(Pseudomonas), 랄스토니아(Ralstonia) 속 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomycescerevisiae) 등의 효모 세포; 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 등의 균류 세포 등을 포함할 수 있다.

상기 형질전환체는 또한 본 발명에서 제공하는 변이 가우시아 루시퍼라아제를 생산하기 위하여 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 형질전환체의 배양물 등으로부터 상기 변이 가우시아 루시퍼라아제를 수득할 수 있다.

상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족하도록 한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 가우시아 루시퍼라아제 변이체 서열을 코딩하는 유전자가 포함된 pETGLuc_SEP 발현(expression) 플라스미드 재조합 벡터를 E. coli 균주(strain) BL21 세포로 형질전환(transformation) 시키고, 이를 배양하여 생물발광 강도가 증진된 변이 가우시아 루시퍼라아제를 제조하였다(실시예 1-3).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하고, 이의 배양물 또는 배양 상층액으로부터 가우시아 루시퍼라아제를 회수하는 단계를 포함하는, 생물발광 강도가 증진되도록 변이된 가우시아 루시퍼라아제의 제조방법을 제공한다.

이때, 상기 생물발광 강도가 증진되도록 변이된 가우시아 루시퍼라아제를 회수하는 단계는 상기 배양물로부터 수득한 배양균체 또는 배양 상층액을 균체파쇄, 추출, 친화성크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 단백질 침전, 투석 등의 공지된 정제방법을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 수행될 수 있고, 회수된 목적 단백질의 확인은 SDS-PAGE, 웨스턴 블럿 등의 공지된 통상의 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 변이된 가우시아 루시퍼라아제를 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 변이된 가우시아 루시퍼라아제는 야생형 가우시아 루시퍼라아제와 비교하여 향상된 발광성을 가지므로, 루시퍼라아제가 사용되어 왔던 종래의 분석 방법 또는 분석 키트에서 유용하게 사용될 수 있다. 루시퍼라아제는 발광 반응을 촉매하며, 그로 인해 발생하는 생물발광(bioluminescence)은 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 생물학적 과정을 모니터링 하는데 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 키트에는 루시페린이 추가로 포함될 수 있다.

상기 루시페린은, 이에 제한되지는 않으나, 천연형(native) 코엘렌테라진 또는 천연형의 2-디옥시 유도체(2-deoxy derivative)인 h-코엘렌테라진일 수 있다.

본 발명에서 용어 "루시페린(luciferin)"은 생물발광에 있어 루시페린(luciferin)-발광효소(luciferase)반응(L-L반응)을 나타내는 발광반응의 발광성 기질을 총칭하며, 종류로는 갯반디루시페린, 반디루시페린, 라티아루시페린, 코엘렌테라진 등이 있다. 발광성 효소 존재하에서 산소분자에 의해 산화되어 산화생성물(옥시루시페린)이 들뜬 상태에서 생성되며, 그것이 기저상태가 될 때에 가시광을 발생하는데 그 과정을 요약하면 루시페린＋O₂→ 옥시루시페린＋광(光)이 된다.

본 발명의 키트는 통상 이용되는 재료 및 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명의 키트는 예를 들면 샘플 튜브, 플레이트, 키트 사용자에 대한 지시서, 용액(solution), 버퍼(buffer), 시약, 표준화를 위해서 적합한 샘플 또는 대조 샘플을 포함할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 가우시아 루시퍼라아제 변이체 및 루시페린을 접촉시키는 단계를 포함하는, 생물발광 신호 측정방법을 제공한다.

상기 가우시아 루시퍼라아제 변이체 및 루시페린은 전술한 바와 같다.

상기 "접촉"은 본 발명의 가우시아 루시퍼라아제 변이체와 루시페린을 동일한 반응계(reaction system)에 존재시키는 것을 의미하며, 예를 들어, 루시페린을 수용한 용기에 본 발명의 가우시아 루시퍼라아제 변이체를 첨가하는 것, 본 발명의 가우시아 루시퍼라아제 변이체를 수용한 용기에 루시페린을 첨가하는 것, 본 발명의 가우시아 루시퍼라아제 변이체와 루시페린을 혼합하는 것을 포함한다. 반응 조건으로서는 가우시아 루시퍼라아제를 이용한 발광 반응에 통상 이용되는 조건 또는 그에 준한 조건에서 수행될 수 있다(WO99/49019, J. Biol . Chem ., 279, 3212-3217 (2004) 등).

상기 생물발광 신호 측정방법은, 본 발명의 가우시아 루시퍼라아제 변이체와 루시페린의 발광반응에 따른 발광량을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 루시페린은, 이에 제한되지는 않으나, 천연형(native) 코엘렌테라진 또는 천연형의 2-디옥시 유도체(2-deoxy derivative)인 h-코엘렌테라진일 수 있다.

구체적으로, 반응 용매로서는 Tris-HCl 완충액, NaCl 등의 완충액, 물 등이 이용될 수 있으며, 반응 온도는 통상 4 내지 40℃, 바람직하게는 4 내지 25℃일 수 있다. 반응용액의 pH는 통상 5 내지 10, 바람직하게는 6 내지 9, 보다 바람직하게는 7 내지 8일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 50mM Tris 및 50mM NaCl(pH 8.0)을 이용하여 본 발명의 가우시아 루시퍼라아제 변이체 및, 코엘렌테라진 또는 h-코엘렌테라진을 혼합하고, 플레이트 리더를 사용하여 생물발광 강도를 측정하였다(실시예 1-4).

GLuc(Gaussia luciferase)는 세포 기반 리포터 분석(cell-based reporter assay)을 위해 가장 널리 사용되는 분비성 루시퍼라아제로, 다양한 종에서 유래되는 루시퍼라아제 중에서 크기가 가장 작아 다른 단백질과 결합시 단백질 구조의 영향을 최소화함으로써 효과적인 모니터링에 사용할 수 있는 장점을 가지고 있다. 그러나, 야생형(wild-type) GLuc의 경우 발광신호 크기가 충분하지 못한 단점을 가지고 있다.

따라서, 본 발명은 가우시아 루시퍼라아제의 생물발광 신호 증폭에 있어서 중요한 역할을 하는 아미노산 잔기를 돌연변이 시킴으로써, 생물발광 신호가 향상된 변이 가우시아 루시퍼라아제를 제조할 수 있으며, 이를 세포 모니터링 및 신약 스크리닝 등에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 GLuc(Gaussia princeps Luciferase)와 다른 관련된 갑각류(copepod) 루시퍼라아제의 두 개의 반복된 촉매 도메인의 서열 정렬을 나타낸 도이다. 여기에서, 화살표는 돌연변이 유발(mutagenesis)을 위해 선택된 아미노산을 표시하여 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 (A) 천연형 코엘렌테라진(native coelenterazine)을 기질로 사용하여 측정한 GLuc 단일 돌연변이체의 상대적 생물발광 강도(bioluminescence intensity) 및 (B) h-코엘렌테라진(h-coelenterazine)을 기질로 사용하여 측정한 GLuc 단일 돌연변이체의 상대적 생물발광 강도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 (A) 천연형 코엘렌테라진(native coelenterazine)을 기질로 사용하여 측정한 GLuc 다중 돌연변이체(multiple mutant)의 상대적 생물발광 강도(bioluminescence intensity) 및 (B) h-코엘렌테라진(h-coelenterazine)을 기질로 사용하여 측정한 GLuc 다중 돌연변이체의 상대적 생물발광 강도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라, 기질로서 사용한 (A) 천연형 코엘렌테라진(native coelenterazine) 및 (B) h-코엘렌테라진(h-coelenterazine)의 구조를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 실험 재료 준비 및 실험 방법

실시예 1-1: 실험 재료

PCMV-GLuc(Gaussia princeps Luciferase) 플라스미드(plasmind)는 나노라이트 테크놀로지(Nanolight technology, USA)로부터 구입하였으며, 특이적 프라이머(primer)를 이용하여 클로닝(cloning) 하는데 사용하였다. 모든 프라이머는 마크로젠(Macrogen, Korea)에서 구입하였다. 천연형(native type) 코엘렌테라진(coelenterazine) 및 천연형의 2-디옥시 유도체(2-deoxy derivative)인 h-코엘렌테라진(h-coelenterazine)은 모두 나노라이트 테크놀로지(Nanolight technology, USA)로부터 구입하였다. 다른 모든 시약(reagents)은 상업적 출처에서 구입하였으며, 가장 높은 순도 등급을 가진 시약을 구입하여 사용하였다.

실시예 1-2: 시퀀스 -가이드 돌연변이 유발(sequence-guided mutagenesis )

먼저, 상대적인 갑각류의 루시퍼라아제(copepod luciferase) 서열을 확인하고자, GLuc(Gaussia princeps Luciferase; GenBank accession number_AAG54095.1; 서열번호 1) 아미노산 서열(amino acid sequence)을 이용하여 단백질-블라스트 검색(Protein-BLAST search)을 수행하였다. 블라스트 검색(BLAST search)으로부터 도출된 루시퍼라아제 서열(luciferase sequence)을 이용하여 다중 서열 정렬(multiple sequence alignment)을 수행하였고, 부위 특이적 돌연변이 유도(site-directed mutagenesis) 및 특성(characterization) 규명을 위해 매우 일치하는(highly consensus) 아미노산을 선택하였다. 루시퍼라아제 서열(luciferase sequences)에 대한 GenBank 수납 번호(accession number)는 다음과 같다; Metridia asymmetrica 1(MaLuc_1, BAN91823), M. asymmetric 2(MaLuc_2, BAN91824), Metridia curticauda 1(McLuc_1, BAN91825), M. curticauda 2(McLuc_2, BAN91826), Metridia pacifica 1(MpLuc_1, BAG48249), M. pacifica 2(MpLuc_2, BAG48250), Metridia okhotensis 1(MoLuc_1, BAM11213), M. okhotensis 2(MoLuc_2, BAL63033), Metridia longa 1(MlLuc_1, ABW06650), M. longa 2(MlLuc_2, AAR17541), Pleuromamma abdominalis 1(PaLuc_1, BAL63034), P. abdominalis 2(PaLuc_2, BAL63035), P. scutullata 1(PsLuc_1, BAN91827), P. scutullata 2(PsLuc_2, BAN91828), P. xiphias 1(PxLuc_1, BAN91832), P. xiphias 2(PxLuc_2, BAN91829), Lucicutia ovaliformis(LoLuc, BAN91831), Heterorhabdus tanneri 1(HtLuc_1, BAL63039), H. tanneri 2(HtLuc_2, BAL63040), Heterostylites major 1(HmLuc_1, BAL63041) 및 H. major 2(HmLuc_2, BAL63042).

부위 특이적 돌연변이 유도(site-directed mutagenesis)는 C-말단(C-terminal)에 SEP-태그(tag)를 갖는 GLuc 유전자(gene)를 운반하는 pETGLuc-SEP 플라스미드(plasmid)를 사용하여 수행하였다. pETGLuc-SEP는 시판중인 PCMV-GLuc 벡터(vector)로부터 GLuc 서열(sequence)을 클로닝(cloing)하여 제조하였다. PCR을 수행하여, T. Rathnayaka et.al., Biochim . Biophys . Acta ., 1814, 1775-1778 (2011)에 기재되어 있는 방법에 따라 용해도(solubility)를 증가시키기 위해 C-말단(C-terminus)에 SEP-태그(SEP-tag; 6개의 Asp 잔기(Aspartic acid residues)) 서열을 첨가하고, 결과적으로 생성된 GLuc-SEP를 pET-28 벡터(vector)로 클로닝(cloning) 하였다. 모든 야생형(wild-type) 및 돌연변이체(mutant)의 서열(sequence)은 마크로젠(Macrogen, Korea)의 시퀀싱 서비스(sequencing service)를 이용하여 분석하였다.

실시예 1-3: G Luc ( Gaussia princeps Luciferase ) 돌연변이체의 발현 및 정제

E. coli 균주(strain) BL21 세포로 pETGLuc_SEP 발현(expression) 플라스미드를 형질전환(transformation) 시키고, 500 g/㎖의 카나마이신(kanamycin)이 포함되어 있는, 250㎖의 LB 배지(Luria-Bertani broth)를 이용하여 600nm에서 OD(optical density) 값이 0.7에 도달할 때까지 상기 형질전환시킨 균주(bacteria)를 37℃에서 배양하였다. 0.5 mM IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도하고, 25℃에서 5시간 더 배양하였다. 세포를 7000 rpm에서 10분간 원심분리하여 수확(harvest)하였다.

상기 수확된 세포 펠렛(pellet)은 12.5㎖의 용해 버퍼(lysis buffer; 50mM Tris, 300mM NaCl, 1 ㎎/㎖ 라이소자임(lysozyme), 1mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride) 및 0.5 % Triton X-100, pH 8.0)로 재현탁(resuspension) 시키고, 초음파처리(ultrasonication)하여 파쇄하였다. 상기 파쇄한 조세포 추출물(crude cell extract)을 14,000 rpm에서 20분간 원심분리하고, 상층액(supernatant)을 여과하여, 1㎖의 Ni-NTA 비드(bead)와 4℃에서 1시간 동안 쉐이킹(shaking) 하면서 인큐베이션(incubation) 하였다. 통과액(flow-through)을 제거하고 비드를 세척 버퍼(wash buffer; 50mM Tris, 300mM NaCl 및 20mM 이미다졸(imidazole), pH 8.0)로 3회 세척하였다. 세척 버퍼 내 이미다졸의 농도를 0 내지 0.5M로 하여 결합된 단백질, 즉 가우시아 루시퍼라아제를 선형 구배(linear gradient)로 용출(elution)시켰다. 발현된 단백질, 즉 가우시아 루시퍼라아제를 포함하는 분획(fraction)을 투석(dialysis)하고, 50mM Tris 및 50mM NaCl(pH 8.0)로 농축(concetration)시켰다. 돌연변이 단백질(mutant protein) 또한 유사한 방법으로 정제하였다.

실시예 1-4: G Luc ( Gaussia princeps Luciferase ) 돌연변이체의 특성 평가

생물발광 분석(bioluminescence assay)은 정제한 GLuc 단백질(GLuc protein)과 코엘렌테라진(coelenterazine) 기질(substrate)이 포함되어 있는, 100㎕의 50mM Tris 및 50mM NaCl(pH 8.0)를 이용하여 수행하였다. 간단히, 천연형(native type) 코엘렌테라진(coelenterazine) 또는 천연형의 2-디옥시 유도체(2-deoxy derivative)인 h-코엘렌테라진(h-coelenterazine) 용액(solution) 50㎕를 각각 정제한 GLuc 50㎕(최종 농도 250 nM)와 혼합하고, 플레이트 리더(plate reader)를 사용하여 400-600 nm 파장에서 생물발광 강도(bioluminescence intensity)를 즉시 측정하였다. 생물발광 강도 분석(analysis)을 위해 482 nm(최대 강도 파장(maximum intensity wavelength), λ_max)에서 돌연변이 단백질(mutant protein) 강도를 야생형(wild-type)과 비교하고, 추가 특성 분석을 위해 생물발광 강도가 증폭된 후보물질(candidate)을 선택하였다.

실시예 2: G Luc ( Gaussia princeps Luciferase ) 돌연변이체의 선정 및 정제

널리 사용되고 있음에도 불구하고, GLuc의 주요 구조 및 기능적 특징은 여전히 잘 알려져 있지 않다. 개별적으로 발현될 때 활성화되는, 2개의 반복된 촉매 도메인(repeated catalytic domain)의 존재가 GLuc에서 확인되었다(S. Inouye. et.al., Biochem . Biophys . Res. Commun ., 365: 96-101, 2008). 소수성 검색(hydrophobicity search)을 사용하여 GFP(green fluorescent protein)와 코엘렌테라진(coelenterazine)의 발색단 영역(chomophore region)의 서열 유사성(sequence similarity)을 비교함에 따라, GLuc의 활성 사이트(active site)가 친수성 도메인(hydrophilic domain)인 아미노산(amino acid) 71-140 사이에 위치하고 있는 것으로 가설화 되었다. 또한, 생물발광 강도가 향상된 몇 가지 돌연변이(I90L(90번째의 Isoleucine을 Leucine으로 치환) 및 8990)를 제안하였다(S.B. Kim et.al., Anal. Chem ., 83: 8732-8740, 2011). 최근, GLuc에 관한 분자 방향성 진화(molecular directed evolution; 특정 유전자나 단백질의 효능을 향상) 연구 또한 글로우 타입(glow-type)의 발광(light emission) 동역학(kinetics)을 나타내는 돌연변이체(M60I(60번째의 Methionine을 Isoleucine으로 치환))를 보고하였다(C.A. Maguire et.al., Anal. Chem ., 81: 7102-7106, 2009; M.H. Degeling et.al., Anal. Chem ., 85: 3006-3012, 2013). 이러한 연구에서 모든 돌연변이는 첫 번째 도메인(domain)에만 국한되었으며, 두 번째 도메인에서 상응(corresponding)하는 아미노산을 돌연변이 시키면 추가적인 효과가 없는 것으로 보고되었다(M.H. Degeling et.al., Anal. Chem ., 85: 3006-3012, 2013).

이에, 본 발명자들은 GLuc의 블라스트 검색(BLAST-search)을 사용하여 기능 연구를 계속하였으며, ~37-73%의 동일성(identity)을 지닌 21종의 갑각류(copepod) 계통(family)으로부터 밀접하게 관련된 루시퍼라아제(luciferase)를 확인하였다(도 1). GLuc(Gaussia princeps Luciferase)와 관련된 갑각류(copepod) 루시퍼라아제(luciferase)의 다중 서열 정렬(multiple sequence alignment)을 통해 몇몇 고도로 보존되고 일치된 위치(consensus position)가 나타남을 확인하였다(도 1). 또한, 첫 번째 반복된 도메인(27-97)에 초점을 맞추었으며, 일치된 위치(consensus position)를 돌연변이 유발(mutagenesis)을 위한 위치(하기 도 1에 화살표로 표시)로 선정하였다. 박테리아 발현 시스템(bacterial expression system)에서 GLuc의 발현은 5개의 이황화 결합(five-disulfide bonds) 형성에 의해 저해되는 것으로 알려져 있다. GLuc에 존재하는 10개의 시스테인 잔기(cysteine residues)는 5개의 이황화 결합을 형성하는 것으로 알려져 있으며, 갑각류(copepod)의 루시퍼라아제(luciferase) 중 가장 높게 보존되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 시스테인 잔기의 돌연변이가 Gluc 활성의 유의적인 손실을 일으키는 것으로 알려져 있다(A.R. Goerke et.al., Metab. Eng., 10: 187-200, 2008).

박테리아 시스템(bacterial system)에서 GLuc의 수용성 발현(soluble expression) 및 정제를 향상시키기 위한 몇 가지 시도가 수행되었다(T. Rathnayaka et.al., Biochim . Biophys . Acta ., 1814: 1775-1778, 2011; A.R. Goerke et.al., Metab. Eng ., 10: 187-200, 2008; T. Rathnayaka et.al., Biochim . Biophys . Acta., 1804: 1902-1907, 2010). 그 중에서 Rathnayaka T 등은 C-말단(C-terminus)에 SEP-태그(SEP-tag; 9개의 아스파트산(Aspartic acid, Asp) 잔기)를 삽입하여 수용성 발현을 현저하게 증가시킨다고 보고하였다(T. Rathnayaka et.al., Biochim . Biophys. Acta ., 1814: 1775-1778, 2011).

이에, 본 발명자들은 C-말단(C-terminus)에 6개의 아스파트산(Aspartic acid, Asp) 잔기가 있는 GLuc를 PET-28 벡터(vector)에 클로닝(cloning) 하여 발현(expression) 및 돌연변이 유발(mutagenesis)에 사용하였다. 돌연변이 유발은 pET-GLuc_SEP로 수행한 다음, 모든 서열(sequence)이 적합하다는 것을 확인하였다. SEP-태그(SEP-tag)의 포함은 E. coli 세포에서 GLuc의 수용성 발현을 이끌어 내었다. 야생형(wild-type) 단백질과 돌연변이(mutant) 단백질의 정제는 T. Rathnayaka et.al., Biochim . Biophys . Acta ., 1814, 1775-1778 (2011)에 기재되어 있는 방법에 따라 수행하였다. 간단히, 250㎖의 세포 펠렛(pellet)을 초음파 처리(sonication) 하여 용해 버퍼(lysis buffer)로 용해시키고, 원심분리 후 상층액(supernatant)은 Ni-NTA 컬럼(column)에 로딩(loading)하였다. 컬럼을 세척 버퍼(wash buffer)로 세척하고, 결합된 단백질을 이미다졸(imidazole) 농도 구배(gradient)로 용출(elution)시켰다. 단백질 함유 분획(fraction)을 투석(dialysis)하고, 10% 글리세롤(glycerol)로 농축하여 이후 사용하였다. SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis) 겔에서 관찰 된 정제된 GLuc의 분자량(molecular weight)은 ~ 24 kDa으로, 서열(sequence)에서 계산된 분자량과 유사하였다. 평균 수율은 7.0 mg/ℓ이었다. 야생형과 마찬가지로, 모든 돌연변이 단백질(mutant protein) 또한 수용성 형태(soluble form)로 발현되었으며, 고순도로 정제되었다.

실시예 3: 단일 돌연변이체(single mutant)의 특성 평가

모든 발광(luminescence) 측정은 250 nM의 루시퍼라아제(luciferase)가 포함되어 있는 100㎕의 반응 버퍼(reaction buffer; 50mM Tris 및 50 mM NaCl, pH 8.0)로 Thermo Scientific^™ Varioskan^™ Flash Multimode Reader를 사용하여 수행하였다. 먼저, 250 nM의 야생형 단백질과 돌연변이 단백질을 100㎕의 반응 버퍼(reaction buffer)에 준비하였다. 발광 강도(luminescence intensity)는 1㎕의 천연형(native type) 코엘렌테라진(coelenterazine)을 첨가한 직후 400-600 nm 파장 사이에서 측정하였다.

상기 실시예 2에서 선정한 돌연변이체들(mutants)의 발광 강도를 측정한 결과, 그 중, 5개의 돌연변이체(mutant) M60L(GLuc의 60번째 위치의 메티오닌(Methionine, M)을 류신(Leucine, L)으로 치환), K88Q(GLuc의 88번째 위치의 리신(Lysine, K)을 글루타민(Glutamine, Q)으로 치환), F89Y(GLuc의 89번째 위치의 페닐알라닌(Phenylalanine, F)을 타이로신(Tyrosine, Y)으로 치환), I90L(GLuc의 90번째 위치의 이소류신(Isoleucine, I)을 류신(Leucine, L)으로 치환) 및 S103T(GLuc의 103번째 위치의 세린(Serine, S)을 트레오닌(Threonine, T)으로 치환)의 발광 강도가 야생형(wild-type) GLuc보다 약 2-7배 증폭된 강도를 나타내었다(도 2의 A). 특히, 5개의 후보 돌연변이체(mutant) 중, K88Q 및 M60L이 가장 높은 발광 강도 증진 효과를 나타내었다. GLuc의 60번째 위치(M60)에서 이소류신(Isoleucine, I)의 치환(M60I)은, Triton X-100의 존재하에서, 2.4분(야생형)에서 9.1분까지 연장된 발광(light emission) 반감기(half life)를 나타내는 것으로 알려져 있다(C.A. Maguire. et.al., Anal. Chem ., 81: 7102-7106, 2009). F89W와 I90L은 또한 GLuc에서 생물발광(bioluminescence) 향상에 대해 이전에 보고된 바 있다(S.B. Kim et.al., Anal. Chem ., 83: 8732-8740, 2011). 비교를 위해, 482 nm(λ_max)에서의 야생형 GLuc의 강도(intensity)를 1로 간주하였다.

또한, 상기 실시예 2에서 선정한 돌연변이체들(mutants)의 발광 강도를 천연형의 2-디옥시 유도체(2-deoxy derivative)인 h-코엘렌테라진(h-coelenterazine)을 기질로 하여 측정해 본 결과, 5개의 돌연변이체(mutant) M60L, K88Q, F89Y, I90L 및 S103T의 발광 강도가 천연형(native type) 코엘렌테라진(coelenterazine)을 기질로 사용한 경우와 마찬가지로 야생형(wild-type) GLuc보다 증폭된 강도를 나타내었다(도 2의 B). 그러나, 야생형 및 돌연변이형 루시퍼라아제 모두 천연형의 2-디옥시 유도체(2-deoxy derivative)인 h-코엘렌테라진(h-coelenterazine) 보다 천연형(native type) 코엘렌테라진(coelenterazine)을 기질로 사용한 경우 상대적으로 훨씬 더 높은 발광 강도를 나타내었다.

단일 돌연변이체 (individual mutant)	기질(substrate)
	천연형 코엘렌테라진 (native-type coelenterazine)	h-코엘렌테라진 (h-coelenterazine)
	발광 강도(luminescence intensity)
야생형(wild-type)	1.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00
L52M(Leu52Met)	0.98 ± 0.29	0.80 ± 0.43
P53S(Pro53Ser)	0.43 ± 0.20	0.30 ± 0.13
E59I(Glu59Ile)	1.43 ± 0.22	1.04 ± 0.22
M60L(Met60Leu)	5.90 ± 0.87	9.13 ± 0.12
R65F(Arg65Phe)	0.52 ± 0.10	0.44 ± 0.09
R65Q(Arg65Gln)	0.92 ± 0.20	0.80 ± 0.22
H79K(His79Lys)	0.53 ± 0.11	0.74 ± 0.10
P84A(Pro84Ala)	0.62 ± 0.02	0.50 ± 0.11
K88E(Lys88Glu)	1.33 ± 0.48	1.50 ± 0.32
K88N(Lys88Asn)	1.92 ± 0.63	1.80 ± 0.52
K88Q(Lys88Gln)	6.80 ± 0.62	5.86 ± 0.76
K88R(Lys88Arg)	0.82 ± 0.12	0.90 ± 0.04
F89Y(Phe89Try)	4.33 ± 0.32	3.30 ± 0.10
I90L(Ile90Leu)	3.99 ± 0.28	3.46 ± 0.40
T96D(Thr96Asp)	1.42 ± 0.33	1.23 ± 0.41
T96S(Thr96Ser)	1.09 ± 0.13	0.92 ± 0.21
S103T(Ser103Thr)	1.43 ± 0.38	2.13 ± 0.32

실시예 4: 다중 돌연변이체(multiple mutnat )의 특성 평가

상기 실시예 3에서 분석한 M60L, K88Q, F89Y, I90L 및 S103T의 단일 돌연변이체의 발광 강도 증폭 효과에 대해 더 입증하고자, 상기 돌연변이에 대해 다양한 조합(combination)을 구축하여 평가하였다(도 3).

천연형(native type) 코엘렌테라진(coelenterazine)을 기질로 사용한 경우, 트리플 돌연변이체(triple mutant; M60L-K88Q-I90L)는 테스트한 조합 중 가장 높은 발광 강도(~ 7배)를 나타내었는데, 이는 단일 돌연변이 K88Q보다 약간 높은 발광 강도 값을 나타내었다(도 3의 A). 한편, 상기 5개의 모든 돌연변이(M60L, K88Q, F89Y, I90L 및 S103T)를 포함하는 GLuc_5 돌연변이는 야생형(wild-type) GLuc와 비교하여 약 3배 증가된 발광 활성을 나타내었다(도 3의 A). 또한, 다중 돌연변이(multiple mutation) 발광 강도 값이 단일 돌연변이(single mutation) 발광 강도 값, 예컨대, M60L 및 K88Q 단일 돌연변이체 발광 강도 값보다 다소 감소하는 경우도 확인되었다(도 3의 A). 특히, 모든 다중 돌연변이(multiple mutation)는 천연형의 2-디옥시 유도체(2-deoxy derivative)인 h-코엘렌테라진(h-coelenterazine)을 기질로 사용한 경우, 단일 돌연변이(individual mutation)보다 현저하게 우수한 발광 활성이 향상됨을 확인하였다(도 3의 B). K88Q-I90L 및 K88Q-I90L-S103T 조합(combination)으로부터 보통의 발광 활성 증가가 확인되었으며, M60L(GLuc의 60번째 위치의 메티오닌(Methionine, M)을 류신(Leucine, L)으로 치환)를 포함한, 모든 다중 돌연변이체(multiple mutants)는 천연형(native type) 코엘렌테라진(coelenterazine) 보다 h-코엘렌테라진(h-coelenterazine)을 기질로 사용한 경우에 발광 강도가 현저하게 증가되었다. 이를 통해, M60L의 조합이 중요한 발광 활성 증폭을 위한 주요 돌연변이(key mutation)인 것으로 확인되었다(도 3의 B). 특히, h-코엘렌테라진(h-coelenterazine)을 기질로 사용한 경우, 상기 5개의 모든 돌연변이(M60L, K88Q, F89Y, I90L 및 S103T)를 포함하는 GLuc_5 돌연변이는 야생형(wild-type) GLuc와 비교하여 약 29배 더 높은 발광 활성을 나타내었다(도 3의 B). 하기 도 4에 나타난 바와 같이, 천연형 코엘렌테라진(native coelenterazine)과 h-코엘렌테라진(h-coelenterazine) 간의 유일한 차이가 천연형에 -OH기(-OH group)가 추가된 점을 고려해 볼 때, 돌연변이 된 부위가 기질 특이성(substrate specificity)에 있어서 중요하며, 따라서, 생물발광 강도 증폭에 있어서도 중요한 역할을 함을 알 수 있었다. 다른 루시퍼라아제(luciferase)와 달리, GLuc는 코엘렌테라진 유도체(coelenterazine derivative)에 대한 좁은 기질 특이성(narrow substrate specificity)을 나타내는 것으로 알려져 있다(S. Inouye et.al., Protein. Expr . Purif., 88: 150-156, 2013). 천연형 코엘렌테라진(native coelenterazine)에 의해서는 아니지만, h-코엘렌테라진(h-coelenterazine)에 의한 GLuc_5(M60L-K88Q-F89Y-I90L-S103T)의 강력한 생물 발광(bioluminescence)의 증폭은 천연형 코엘렌테라진(native coelenterazine)과 다른 코엘렌테라진 유사체(analogue) 간에 GLuc의 기질 특이성이 높음을 의미한다. 또한, 이전에 보고된 바 있는 소수성 검색(hydrophobicity search)을 기반으로 아미노산(amino acid) 71-140 사이에 GLuc 활성 사이트(active site)가 존재함에 대한 가설을 상기 결과를 통해 재입증하였다(S.B. Kim et.al., Anal. Chem ., 83: 8732-8740, 2011).

다중 돌연변이체 (multiple mutant)	기질(substrate)
	천연형 코엘렌테라진 (native-type coelenterazine)	h-코엘렌테라진 (h-coelenterazine)
	발광 강도(luminescence intensity)
야생형(wild-type)	1.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00
M60L-K88Q (Met60Leu-Lys88Gln)	3.30 ± 0.57	8.61 ± 0.86
M60L-I90L (Met60Leu-Ile90Leu)	3.25 ± 0.21	14.82 ± 0.26
K88Q-I90L (Lys88Gln-Ile90Leu)	2.55 ± 0.21	2.80 ± 0.28
M60L-K88Q-I90L (Met60Leu-Lys88Gln-Ile90Leu)	6.83 ± 1.15	26.00 ± 1.15
M60L-K88Q-S103T (Met60Leu-Lys88Gln-Ser103Thr)	N/A	14.85 ± 0.49
K88Q-I90L-S103T (Lys88Gln-Ile90Leu-Ser103Thr)	3.00 ± 0.14	4.30 ± 0.42
M60L-K88Q-I90L-S103T (Met60Leu-Lys88Gln-Ile90Leu- Ser103Thr)	3.70 ± 1.40	19.27 ± 1.97
Gluc_5 (M60L-K88Q-F89Y-I90L-S103T; Met60Leu-Lys88Gln-Phe89Try- Ile90Leu-Ser103Thr)	3.00 ± 0.40	29.00 ± 3.29

<110> HANYANG HAK WON CO LTD <120> Mutant Gaussia luciferase with enhanced bioluminescence intensity <130> P17U10C0207 <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc_wild type <400> 1 Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu 1 5 10 15 Ala Lys Pro Thr Glu Asn Asn Glu Asp Phe Asn Ile Val Ala Val Ala 20 25 30 Ser Asn Phe Ala Thr Thr Asp Leu Asp Ala Asp Arg Gly Lys Leu Pro 35 40 45 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Lys Glu Met Glu Ala Asn Ala 50 55 60 Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile 65 70 75 80 Lys Cys Thr Pro Lys Met Lys Lys Phe Ile Pro Gly Arg Cys His Thr 85 90 95 Tyr Glu Gly Asp Lys Glu Ser Ala Gln Gly Gly Ile Gly Glu Ala Ile 100 105 110 Val Asp Ile Pro Glu Ile Pro Gly Phe Lys Asp Leu Glu Pro Met Glu 115 120 125 Gln Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr Thr Gly Cys 130 135 140 Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Gln Cys Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp 145 150 155 160 Leu Pro Gln Arg Cys Ala Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Gly Gln Val 165 170 175 Asp Lys Ile Lys Gly Ala Gly Gly Asp 180 185 <210> 2 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc_M60L <400> 2 Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu 1 5 10 15 Ala Lys Pro Thr Glu Asn Asn Glu Asp Phe Asn Ile Val Ala Val Ala 20 25 30 Ser Asn Phe Ala Thr Thr Asp Leu Asp Ala Asp Arg Gly Lys Leu Pro 35 40 45 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Lys Glu Leu Glu Ala Asn Ala 50 55 60 Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile 65 70 75 80 Lys Cys Thr Pro Lys Met Lys Lys Phe Ile Pro Gly Arg Cys His Thr 85 90 95 Tyr Glu Gly Asp Lys Glu Ser Ala Gln Gly Gly Ile Gly Glu Ala Ile 100 105 110 Val Asp Ile Pro Glu Ile Pro Gly Phe Lys Asp Leu Glu Pro Met Glu 115 120 125 Gln Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr Thr Gly Cys 130 135 140 Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Gln Cys Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp 145 150 155 160 Leu Pro Gln Arg Cys Ala Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Gly Gln Val 165 170 175 Asp Lys Ile Lys Gly Ala Gly Gly Asp 180 185 <210> 3 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc_K88Q <400> 3 Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu 1 5 10 15 Ala Lys Pro Thr Glu Asn Asn Glu Asp Phe Asn Ile Val Ala Val Ala 20 25 30 Ser Asn Phe Ala Thr Thr Asp Leu Asp Ala Asp Arg Gly Lys Leu Pro 35 40 45 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Lys Glu Met Glu Ala Asn Ala 50 55 60 Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile 65 70 75 80 Lys Cys Thr Pro Lys Met Lys Gln Phe Ile Pro Gly Arg Cys His Thr 85 90 95 Tyr Glu Gly Asp Lys Glu Ser Ala Gln Gly Gly Ile Gly Glu Ala Ile 100 105 110 Val Asp Ile Pro Glu Ile Pro Gly Phe Lys Asp Leu Glu Pro Met Glu 115 120 125 Gln Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr Thr Gly Cys 130 135 140 Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Gln Cys Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp 145 150 155 160 Leu Pro Gln Arg Cys Ala Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Gly Gln Val 165 170 175 Asp Lys Ile Lys Gly Ala Gly Gly Asp 180 185 <210> 4 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc_F89Y <400> 4 Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu 1 5 10 15 Ala Lys Pro Thr Glu Asn Asn Glu Asp Phe Asn Ile Val Ala Val Ala 20 25 30 Ser Asn Phe Ala Thr Thr Asp Leu Asp Ala Asp Arg Gly Lys Leu Pro 35 40 45 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Lys Glu Met Glu Ala Asn Ala 50 55 60 Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile 65 70 75 80 Lys Cys Thr Pro Lys Met Lys Lys Tyr Ile Pro Gly Arg Cys His Thr 85 90 95 Tyr Glu Gly Asp Lys Glu Ser Ala Gln Gly Gly Ile Gly Glu Ala Ile 100 105 110 Val Asp Ile Pro Glu Ile Pro Gly Phe Lys Asp Leu Glu Pro Met Glu 115 120 125 Gln Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr Thr Gly Cys 130 135 140 Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Gln Cys Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp 145 150 155 160 Leu Pro Gln Arg Cys Ala Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Gly Gln Val 165 170 175 Asp Lys Ile Lys Gly Ala Gly Gly Asp 180 185 <210> 5 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc_I90L <400> 5 Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu 1 5 10 15 Ala Lys Pro Thr Glu Asn Asn Glu Asp Phe Asn Ile Val Ala Val Ala 20 25 30 Ser Asn Phe Ala Thr Thr Asp Leu Asp Ala Asp Arg Gly Lys Leu Pro 35 40 45 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Lys Glu Met Glu Ala Asn Ala 50 55 60 Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile 65 70 75 80 Lys Cys Thr Pro Lys Met Lys Lys Phe Leu Pro Gly Arg Cys His Thr 85 90 95 Tyr Glu Gly Asp Lys Glu Ser Ala Gln Gly Gly Ile Gly Glu Ala Ile 100 105 110 Val Asp Ile Pro Glu Ile Pro Gly Phe Lys Asp Leu Glu Pro Met Glu 115 120 125 Gln Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr Thr Gly Cys 130 135 140 Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Gln Cys Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp 145 150 155 160 Leu Pro Gln Arg Cys Ala Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Gly Gln Val 165 170 175 Asp Lys Ile Lys Gly Ala Gly Gly Asp 180 185 <210> 6 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc_S103T <400> 6 Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu 1 5 10 15 Ala Lys Pro Thr Glu Asn Asn Glu Asp Phe Asn Ile Val Ala Val Ala 20 25 30 Ser Asn Phe Ala Thr Thr Asp Leu Asp Ala Asp Arg Gly Lys Leu Pro 35 40 45 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Lys Glu Met Glu Ala Asn Ala 50 55 60 Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile 65 70 75 80 Lys Cys Thr Pro Lys Met Lys Lys Phe Ile Pro Gly Arg Cys His Thr 85 90 95 Tyr Glu Gly Asp Lys Glu Thr Ala Gln Gly Gly Ile Gly Glu Ala Ile 100 105 110 Val Asp Ile Pro Glu Ile Pro Gly Phe Lys Asp Leu Glu Pro Met Glu 115 120 125 Gln Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr Thr Gly Cys 130 135 140 Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Gln Cys Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp 145 150 155 160 Leu Pro Gln Arg Cys Ala Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Gly Gln Val 165 170 175 Asp Lys Ile Lys Gly Ala Gly Gly Asp 180 185 <210> 7 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc_M60L_K88Q <400> 7 Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu 1 5 10 15 Ala Lys Pro Thr Glu Asn Asn Glu Asp Phe Asn Ile Val Ala Val Ala 20 25 30 Ser Asn Phe Ala Thr Thr Asp Leu Asp Ala Asp Arg Gly Lys Leu Pro 35 40 45 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Lys Glu Leu Glu Ala Asn Ala 50 55 60 Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile 65 70 75 80 Lys Cys Thr Pro Lys Met Lys Gln Phe Ile Pro Gly Arg Cys His Thr 85 90 95 Tyr Glu Gly Asp Lys Glu Ser Ala Gln Gly Gly Ile Gly Glu Ala Ile 100 105 110 Val Asp Ile Pro Glu Ile Pro Gly Phe Lys Asp Leu Glu Pro Met Glu 115 120 125 Gln Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr Thr Gly Cys 130 135 140 Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Gln Cys Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp 145 150 155 160 Leu Pro Gln Arg Cys Ala Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Gly Gln Val 165 170 175 Asp Lys Ile Lys Gly Ala Gly Gly Asp 180 185 <210> 8 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc_M60L_I90L <400> 8 Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala 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Glu Asp Phe Asn Ile Val Ala Val Ala 20 25 30 Ser Asn Phe Ala Thr Thr Asp Leu Asp Ala Asp Arg Gly Lys Leu Pro 35 40 45 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Lys Glu Met Glu Ala Asn Ala 50 55 60 Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile 65 70 75 80 Lys Cys Thr Pro Lys Met Lys Gln Phe Leu Pro Gly Arg Cys His Thr 85 90 95 Tyr Glu Gly Asp Lys Glu Ser Ala Gln Gly Gly Ile Gly Glu Ala Ile 100 105 110 Val Asp Ile Pro Glu Ile Pro Gly Phe Lys Asp Leu Glu Pro Met Glu 115 120 125 Gln Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr Thr Gly Cys 130 135 140 Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Gln Cys Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp 145 150 155 160 Leu Pro Gln Arg Cys Ala Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Gly Gln Val 165 170 175 Asp Lys Ile Lys Gly Ala Gly Gly Asp 180 185 <210> 10 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc_M60L_K88Q_I90L <400> 10 Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu 1 5 10 15 Ala Lys Pro Thr Glu Asn Asn Glu Asp Phe Asn Ile Val Ala Val Ala 20 25 30 Ser Asn Phe Ala Thr Thr Asp Leu Asp Ala Asp Arg Gly Lys Leu Pro 35 40 45 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Lys Glu Leu Glu Ala Asn Ala 50 55 60 Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile 65 70 75 80 Lys Cys Thr Pro Lys Met Lys Gln Phe Leu Pro Gly Arg Cys His Thr 85 90 95 Tyr Glu Gly Asp Lys Glu Ser Ala Gln Gly Gly Ile Gly Glu Ala Ile 100 105 110 Val Asp Ile Pro Glu Ile Pro Gly Phe Lys Asp Leu Glu Pro Met Glu 115 120 125 Gln Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr Thr Gly Cys 130 135 140 Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Gln Cys Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp 145 150 155 160 Leu Pro Gln Arg Cys Ala Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Gly Gln Val 165 170 175 Asp Lys Ile Lys Gly Ala Gly Gly Asp 180 185 <210> 11 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc_K88Q_I90L_S103T <400> 11 Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu 1 5 10 15 Ala Lys Pro Thr Glu Asn Asn Glu Asp Phe Asn Ile Val Ala Val Ala 20 25 30 Ser Asn Phe Ala Thr Thr Asp Leu Asp Ala Asp Arg Gly Lys Leu Pro 35 40 45 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Lys Glu Met Glu Ala Asn Ala 50 55 60 Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile 65 70 75 80 Lys Cys Thr Pro Lys Met Lys Gln Phe Leu Pro Gly Arg Cys His Thr 85 90 95 Tyr Glu Gly Asp Lys Glu Thr Ala Gln Gly Gly Ile Gly Glu Ala Ile 100 105 110 Val Asp Ile Pro Glu Ile Pro Gly Phe Lys Asp Leu Glu Pro Met Glu 115 120 125 Gln Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr Thr Gly Cys 130 135 140 Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Gln Cys Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp 145 150 155 160 Leu Pro Gln Arg Cys Ala Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Gly Gln Val 165 170 175 Asp Lys Ile Lys Gly Ala Gly Gly Asp 180 185 <210> 12 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc_M60L_K88Q_I90L_S103T <400> 12 Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu 1 5 10 15 Ala Lys Pro Thr Glu Asn Asn Glu Asp Phe Asn Ile Val Ala Val Ala 20 25 30 Ser Asn Phe Ala Thr Thr Asp Leu Asp Ala Asp Arg Gly Lys Leu Pro 35 40 45 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Lys Glu Leu Glu Ala Asn Ala 50 55 60 Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile 65 70 75 80 Lys Cys Thr Pro Lys Met Lys Gln Phe Leu Pro Gly Arg Cys His Thr 85 90 95 Tyr Glu Gly Asp Lys Glu Thr Ala Gln Gly Gly Ile Gly Glu Ala Ile 100 105 110 Val Asp Ile Pro Glu Ile Pro Gly Phe Lys Asp Leu Glu Pro Met Glu 115 120 125 Gln Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr Thr Gly Cys 130 135 140 Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Gln Cys Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp 145 150 155 160 Leu Pro Gln Arg Cys Ala Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Gly Gln Val 165 170 175 Asp Lys Ile Lys Gly Ala Gly Gly Asp 180 185 <210> 13 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc_5 <400> 13 Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu 1 5 10 15 Ala Lys Pro Thr Glu Asn Asn Glu Asp Phe Asn Ile Val Ala Val Ala 20 25 30 Ser Asn Phe Ala Thr Thr Asp Leu Asp Ala Asp Arg Gly Lys Leu Pro 35 40 45 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Lys Glu Leu Glu Ala Asn Ala 50 55 60 Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile 65 70 75 80 Lys Cys Thr Pro Lys Met Lys Gln Tyr Leu Pro Gly Arg Cys His Thr 85 90 95 Tyr Glu Gly Asp Lys Glu Thr Ala Gln Gly Gly Ile Gly Glu Ala Ile 100 105 110 Val Asp Ile Pro Glu Ile Pro Gly Phe Lys Asp Leu Glu Pro Met Glu 115 120 125 Gln Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr Thr Gly Cys 130 135 140 Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Gln Cys Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp 145 150 155 160 Leu Pro Gln Arg Cys Ala Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Gly Gln Val 165 170 175 Asp Lys Ile Lys Gly Ala Gly Gly Asp 180 185 <210> 14 <211> 555 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc sequence_wilde type <400> 14 atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcatcgctg tggccgaggc caagcccacc 60 gagaacaacg aagacttcaa catcgtggcc gtggccagca acttcgcgac cacggatctc 120 gatgctgacc gcgggaagtt gcccggcaag aagctgccgc tggaggtgct caaagagatg 180 gaagccaatg cccggaaagc tggctgcacc aggggctgtc tgatctgcct gtcccacatc 240 aagtgcacgc ccaagatgaa gaagttcatc ccaggacgct gccacaccta cgaaggcgac 300 aaagagtccg cacagggcgg cataggcgag gcgatcgtcg acattcctga gattcctggg 360 ttcaaggact tggagcccat ggagcagttc atcgcacagg tcgatctgtg tgtggactgc 420 acaactggct gcctcaaagg gcttgccaac gtgcagtgtt ctgacctgct caagaagtgg 480 ctgccgcaac gctgtgcgac ctttgccagc aagatccagg gccaggtgga caagatcaag 540 ggggccggtg gtgac 555 <210> 15 <211> 555 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc sequence_M60L <400> 15 atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcatcgctg tggccgaggc caagcccacc 60 gagaacaacg aagacttcaa catcgtggcc gtggccagca acttcgcgac cacggatctc 120 gatgctgacc gcgggaagtt gcccggcaag aagctgccgc tggaggtgct caaagagctg 180 gaagccaatg cccggaaagc tggctgcacc aggggctgtc tgatctgcct gtcccacatc 240 aagtgcacgc ccaagatgaa gaagttcatc ccaggacgct gccacaccta cgaaggcgac 300 aaagagtccg cacagggcgg cataggcgag gcgatcgtcg acattcctga gattcctggg 360 ttcaaggact tggagcccat ggagcagttc atcgcacagg tcgatctgtg tgtggactgc 420 acaactggct gcctcaaagg gcttgccaac gtgcagtgtt ctgacctgct caagaagtgg 480 ctgccgcaac gctgtgcgac ctttgccagc aagatccagg gccaggtgga caagatcaag 540 ggggccggtg gtgac 555 <210> 16 <211> 555 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc sequence_K88Q <400> 16 atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcatcgctg tggccgaggc caagcccacc 60 gagaacaacg aagacttcaa catcgtggcc gtggccagca acttcgcgac cacggatctc 120 gatgctgacc gcgggaagtt gcccggcaag aagctgccgc tggaggtgct caaagagatg 180 gaagccaatg cccggaaagc tggctgcacc aggggctgtc tgatctgcct gtcccacatc 240 aagtgcacgc ccaagatgaa gcagttcatc ccaggacgct gccacaccta cgaaggcgac 300 aaagagtccg cacagggcgg cataggcgag gcgatcgtcg acattcctga gattcctggg 360 ttcaaggact tggagcccat ggagcagttc atcgcacagg tcgatctgtg tgtggactgc 420 acaactggct gcctcaaagg gcttgccaac gtgcagtgtt ctgacctgct caagaagtgg 480 ctgccgcaac gctgtgcgac ctttgccagc aagatccagg gccaggtgga caagatcaag 540 ggggccggtg gtgac 555 <210> 17 <211> 555 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc sequence_F89Y <400> 17 atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcatcgctg tggccgaggc caagcccacc 60 gagaacaacg aagacttcaa catcgtggcc gtggccagca acttcgcgac cacggatctc 120 gatgctgacc gcgggaagtt gcccggcaag aagctgccgc tggaggtgct caaagagatg 180 gaagccaatg cccggaaagc tggctgcacc aggggctgtc tgatctgcct gtcccacatc 240 aagtgcacgc ccaagatgaa gaagtacatc ccaggacgct gccacaccta cgaaggcgac 300 aaagagtccg cacagggcgg cataggcgag gcgatcgtcg acattcctga gattcctggg 360 ttcaaggact tggagcccat ggagcagttc atcgcacagg tcgatctgtg tgtggactgc 420 acaactggct gcctcaaagg gcttgccaac gtgcagtgtt ctgacctgct caagaagtgg 480 ctgccgcaac gctgtgcgac ctttgccagc aagatccagg gccaggtgga caagatcaag 540 ggggccggtg gtgac 555 <210> 18 <211> 555 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc sequence_I90L <400> 18 atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcatcgctg tggccgaggc caagcccacc 60 gagaacaacg aagacttcaa catcgtggcc gtggccagca acttcgcgac cacggatctc 120 gatgctgacc gcgggaagtt gcccggcaag aagctgccgc tggaggtgct caaagagatg 180 gaagccaatg cccggaaagc tggctgcacc aggggctgtc tgatctgcct gtcccacatc 240 aagtgcacgc ccaagatgaa gaagttcctc ccaggacgct gccacaccta cgaaggcgac 300 aaagagtccg cacagggcgg cataggcgag gcgatcgtcg acattcctga gattcctggg 360 ttcaaggact tggagcccat ggagcagttc atcgcacagg tcgatctgtg tgtggactgc 420 acaactggct gcctcaaagg gcttgccaac gtgcagtgtt ctgacctgct caagaagtgg 480 ctgccgcaac gctgtgcgac ctttgccagc aagatccagg gccaggtgga caagatcaag 540 ggggccggtg gtgac 555 <210> 19 <211> 555 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc sequence_S103T <400> 19 atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcatcgctg tggccgaggc caagcccacc 60 gagaacaacg aagacttcaa catcgtggcc gtggccagca acttcgcgac cacggatctc 120 gatgctgacc gcgggaagtt gcccggcaag aagctgccgc tggaggtgct caaagagatg 180 gaagccaatg cccggaaagc tggctgcacc aggggctgtc tgatctgcct gtcccacatc 240 aagtgcacgc ccaagatgaa gaagttcatc ccaggacgct gccacaccta cgaaggcgac 300 aaagagaccg cacagggcgg cataggcgag gcgatcgtcg acattcctga gattcctggg 360 ttcaaggact tggagcccat ggagcagttc atcgcacagg tcgatctgtg tgtggactgc 420 acaactggct gcctcaaagg gcttgccaac gtgcagtgtt ctgacctgct caagaagtgg 480 ctgccgcaac gctgtgcgac ctttgccagc aagatccagg gccaggtgga caagatcaag 540 ggggccggtg gtgac 555 <210> 20 <211> 555 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc sequence_M60L_K88Q <400> 20 atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcatcgctg tggccgaggc caagcccacc 60 gagaacaacg aagacttcaa catcgtggcc gtggccagca acttcgcgac cacggatctc 120 gatgctgacc gcgggaagtt gcccggcaag aagctgccgc tggaggtgct caaagagctg 180 gaagccaatg cccggaaagc tggctgcacc aggggctgtc tgatctgcct gtcccacatc 240 aagtgcacgc ccaagatgaa gcagttcatc ccaggacgct gccacaccta cgaaggcgac 300 aaagagtccg cacagggcgg cataggcgag gcgatcgtcg acattcctga gattcctggg 360 ttcaaggact tggagcccat ggagcagttc atcgcacagg tcgatctgtg tgtggactgc 420 acaactggct gcctcaaagg gcttgccaac gtgcagtgtt ctgacctgct caagaagtgg 480 ctgccgcaac gctgtgcgac ctttgccagc aagatccagg gccaggtgga caagatcaag 540 ggggccggtg gtgac 555 <210> 21 <211> 555 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc sequence_M60L_I90L <400> 21 atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcatcgctg tggccgaggc caagcccacc 60 gagaacaacg aagacttcaa catcgtggcc gtggccagca acttcgcgac cacggatctc 120 gatgctgacc gcgggaagtt gcccggcaag aagctgccgc tggaggtgct caaagagctg 180 gaagccaatg cccggaaagc tggctgcacc aggggctgtc tgatctgcct gtcccacatc 240 aagtgcacgc ccaagatgaa gaagttcctc ccaggacgct gccacaccta cgaaggcgac 300 aaagagtccg cacagggcgg cataggcgag gcgatcgtcg acattcctga gattcctggg 360 ttcaaggact tggagcccat ggagcagttc atcgcacagg tcgatctgtg tgtggactgc 420 acaactggct gcctcaaagg gcttgccaac gtgcagtgtt ctgacctgct caagaagtgg 480 ctgccgcaac gctgtgcgac ctttgccagc aagatccagg gccaggtgga caagatcaag 540 ggggccggtg gtgac 555 <210> 22 <211> 555 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc sequence_K88Q_I90L <400> 22 atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcatcgctg tggccgaggc caagcccacc 60 gagaacaacg aagacttcaa catcgtggcc gtggccagca acttcgcgac cacggatctc 120 gatgctgacc gcgggaagtt gcccggcaag aagctgccgc tggaggtgct caaagagatg 180 gaagccaatg cccggaaagc tggctgcacc aggggctgtc tgatctgcct gtcccacatc 240 aagtgcacgc ccaagatgaa gcagttcctc ccaggacgct gccacaccta cgaaggcgac 300 aaagagtccg cacagggcgg cataggcgag gcgatcgtcg acattcctga gattcctggg 360 ttcaaggact tggagcccat ggagcagttc atcgcacagg tcgatctgtg tgtggactgc 420 acaactggct gcctcaaagg gcttgccaac gtgcagtgtt ctgacctgct caagaagtgg 480 ctgccgcaac gctgtgcgac ctttgccagc aagatccagg gccaggtgga caagatcaag 540 ggggccggtg gtgac 555 <210> 23 <211> 555 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc sequence_M60L_K88Q_I90L <400> 23 atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcatcgctg tggccgaggc caagcccacc 60 gagaacaacg aagacttcaa catcgtggcc gtggccagca acttcgcgac cacggatctc 120 gatgctgacc gcgggaagtt gcccggcaag aagctgccgc tggaggtgct caaagagctg 180 gaagccaatg cccggaaagc tggctgcacc aggggctgtc tgatctgcct gtcccacatc 240 aagtgcacgc ccaagatgaa gcagttcctc ccaggacgct gccacaccta cgaaggcgac 300 aaagagtccg cacagggcgg cataggcgag gcgatcgtcg acattcctga gattcctggg 360 ttcaaggact tggagcccat ggagcagttc atcgcacagg tcgatctgtg tgtggactgc 420 acaactggct gcctcaaagg gcttgccaac gtgcagtgtt ctgacctgct caagaagtgg 480 ctgccgcaac gctgtgcgac ctttgccagc aagatccagg gccaggtgga caagatcaag 540 ggggccggtg gtgac 555 <210> 24 <211> 555 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc sequence_K88Q_I90L_S103T <400> 24 atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcatcgctg tggccgaggc caagcccacc 60 gagaacaacg aagacttcaa catcgtggcc gtggccagca acttcgcgac cacggatctc 120 gatgctgacc gcgggaagtt gcccggcaag aagctgccgc tggaggtgct caaagagatg 180 gaagccaatg cccggaaagc tggctgcacc aggggctgtc tgatctgcct gtcccacatc 240 aagtgcacgc ccaagatgaa gcagttcctc ccaggacgct gccacaccta cgaaggcgac 300 aaagagaccg cacagggcgg cataggcgag gcgatcgtcg acattcctga gattcctggg 360 ttcaaggact tggagcccat ggagcagttc atcgcacagg tcgatctgtg tgtggactgc 420 acaactggct gcctcaaagg gcttgccaac gtgcagtgtt ctgacctgct caagaagtgg 480 ctgccgcaac gctgtgcgac ctttgccagc aagatccagg gccaggtgga caagatcaag 540 ggggccggtg gtgac 555 <210> 25 <211> 555 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLuc 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cccggaaagc tggctgcacc aggggctgtc tgatctgcct gtcccacatc 240 aagtgcacgc ccaagatgaa gcagtacctc ccaggacgct gccacaccta cgaaggcgac 300 aaagagaccg cacagggcgg cataggcgag gcgatcgtcg acattcctga gattcctggg 360 ttcaaggact tggagcccat ggagcagttc atcgcacagg tcgatctgtg tgtggactgc 420 acaactggct gcctcaaagg gcttgccaac gtgcagtgtt ctgacctgct caagaagtgg 480 ctgccgcaac gctgtgcgac ctttgccagc aagatccagg gccaggtgga caagatcaag 540 ggggccggtg gtgac 555

Claims

서열번호 1의 가우시아 루시퍼라아제(GLuc, Gaussia princeps Luciferase)의 아미노산 서열에서 60번째 아미노산인 메티오닌(Methionine, M), 88번째 아미노산인 리신(Lysine, K), 89번째 아미노산인 페닐알라닌(Phenylalanine, F) 및 103번째 아미노산인 세린(Serine, S) 중 하나 이상의 아미노산이 변이된 것을 특징으로 하는 가우시아 루시퍼라아제 변이체.
제1항에 있어서, 상기 변이체는 90번째 아미노산인 이소류신(Isoleucine, I)이 추가로 변이된 것을 특징으로 하는 가우시아 루시퍼라아제 변이체.
제1항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서
a) 60번째 아미노산인 메티오닌(Methionine, M)이 류신(Leucine, L)으로 치환;
b) 88번째 아미노산인 리신(Lysine, K)이 글루타민(Glutamine, Q)으로 치환;
c) 89번째 아미노산인 페닐알라닌(Phenylalanine, F)이 타이로신(Tyrosine, Y)으로 치환;
d) 103번째 아미노산인 세린(Serine, S)이 트레오닌(Threonine, T)으로 치환; 또는
e) 60번째 아미노산 메티오닌(Methionine, M)이 류신(Leucine, L)으로, 88번째 아미노산 리신(Lysine, K)이 글루타민(Glutamine, Q)으로 치환된 아미노산 서열을 가지는 것인 가우시아 루시퍼라아제 변이체.
제2항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서
a) 60번째 아미노산인 메티오닌(Methionine, M)이 류신(Leucine, L)으로, 90번째 아미노산인 이소류신(Isoleucine, I)이 류신(Leucine, L)으로 치환;
b) 88번째 아미노산인 리신(Lysine, K)이 글루타민(Glutamine, Q)으로, 90번째 아미노산인 이소류신(Isoleucine, I)이 류신(Leucine, L)으로 치환;
c) 60번째 아미노산인 메티오닌(Methionine, M)이 류신(Leucine, L)으로, 88번째 아미노산인 리신(Lysine, K)이 글루타민(Glutamine, Q)으로, 90번째 아미노산인 이소류신(Isoleucine, I)이 류신(Leucine, L)으로 치환;
d) 88번째 아미노산인 리신(Lysine, K)이 글루타민(Glutamine, Q)으로, 90번째 아미노산인 이소류신(Isoleucine, I)이 류신(Leucine, L)으로, 103번째 아미노산인 세린(Serine, S)이 트레오닌(Threonine, T)으로 치환;
e) 60번째 아미노산인 메티오닌(Methionine, M)이 류신(Leucine, L)으로, 88번째 아미노산인 리신(Lysine, K)이 글루타민(Glutamine, Q)으로, 90번째 아미노산인 이소류신(Isoleucine, I)이 류신(Leucine, L)으로, 103번째 아미노산인 세린(Serine, S)이 트레오닌(Threonine, T)으로 치환; 또는
f) 60번째 아미노산인 메티오닌(Methionine, M)이 류신(Leucine, L)으로, 88번째 아미노산인 리신(Lysine, K)이 글루타민(Glutamine, Q)으로, 89번째 아미노산인 페닐알라닌(Phenylalanine, F)이 타이로신(Tyrosine, Y)으로, 90번째 아미노산인 이소류신(Isoleucine, I)이 류신(Leucine, L)으로, 103번째 아미노산인 세린(Serine, S)이 트레오닌(Threonine, T)으로 치환된 아미노산 서열을 가지는 것인 가우시아 루시퍼라아제 변이체.
제3항에 있어서, 상기 가우시아 루시퍼라아제 변이체는 서열번호 2, 3, 4, 6 또는 7의 아미노산 서열로 이루어진 것인 가우시아 루시퍼라아제 변이체.
제4항에 있어서, 상기 가우시아 루시퍼라아제 변이체는 서열번호 8, 9, 10, 11, 12 또는 13의 아미노산 서열로 이루어진 것인 가우시아 루시퍼라아제 변이체.
제1항 또는 제2항의 가우시아 루시퍼라아제 변이체 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제7항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 15 내지 26의 염기서열 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것인 폴리뉴클레오티드.
제7항의 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 재조합 벡터.
제9항의 재조합 벡터가 도입된 형질전환체.
제10항의 형질전환체를 배양하고, 이의 배양물 또는 배양 상층액으로부터 가우시아 루시퍼라아제를 회수하는 단계를 포함하는, 생물발광 강도가 증진되도록 변이된 가우시아 루시퍼라아제 제조방법.
제11항에 따른 변이된 가우시아 루시퍼라아제를 포함하는 키트.
제12항에 있어서, 루시페린이 추가로 포함되는 것인 키트.
제13항에 있어서, 상기 루시페린은 코엘렌테라진 또는 h-코엘렌테라진인 것인 키트.
제1항 또는 제2항의 가우시아 루시퍼라아제 변이체 및 루시페린을 접촉시키는 단계를 포함하는, 생물발광 신호 측정방법.