JP5224100B2 - 変異型ルシフェラーゼ - Google Patents
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(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第109番目のリジン、第178番目のメチオニン及び第224番目のメチオニンから成る群より選択される1以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(b)前記(a)記載のタンパク質のアミノ酸配列において、前記第109番目、第178番目及び第224番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質であって、SeNaを基質とした場合に、配列番号2に示されるアミノ酸配列から成るタンパク質と比較して、発光強度が少なくとも1.4倍である、前記タンパク質
(c)前記(a)又は(b)記載のタンパク質のアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列から成るタンパク質
(3)前記2以上のアミノ酸が第109番目のリジンと第178番目のメチオニン、第178番目のメチオニンと第224番目のメチオニン、又は第109番目のリジンと第178番目のメチオニンと第224番目のメチオニンであることを特徴とする、(2)記載の変異型ルシフェラーゼ。
(5)前記第178番目のメチオニンがバリンに置換されていることを特徴とする、(1)〜(3)のいずれか1記載の変異型ルシフェラーゼ。
(6)前記第224番目のメチオニンがリジンに置換されていることを特徴とする、(1)〜(3)のいずれか1記載の変異型ルシフェラーゼ。
(A)前記第109番目のリジンからアスパラギンへの置換
(B)前記第178番目のメチオニンからバリンへの置換
(C)前記第224番目のメチオニンからリジンへの置換
(D)前記第109番目のリジンからアスパラギンへの置換及び前記第178番目のメチオニンからバリンへの置換
(E)前記第178番目のメチオニンからバリンへの置換及び前記第224番目のメチオニンからリジンへの置換
(F)前記第109番目のリジンからアスパラギンへの置換、前記第178番目のメチオニンからバリンへの置換及び前記第224番目のメチオニンからリジンへの置換
(9)(1)〜(7)のいずれか1記載の変異型ルシフェラーゼ又は(8)記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
(10)(9)記載の遺伝子を含む組換えベクター。
(11)(10)記載の組換えベクターを有する形質転換体。
(13)前記化学物質が蛍光タンパク質であることを特徴とする、(12)記載の発光又はエネルギー放出方法。
本発明に係る変異型ルシフェラーゼは、以下の(a)〜(c)のいずれか1つのタンパク質である。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第109番目のリジン、第178番目のメチオニン及び第224番目のメチオニンから成る群より選択される1以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質;
(b)前記(a)記載のタンパク質のアミノ酸配列において、前記第109番目、第178番目及び第224番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質であって、SeNaを基質とした場合に、配列番号2に示されるアミノ酸配列から成るタンパク質と比較して、発光強度が少なくとも1.4倍である、前記タンパク質;
(c)前記(a)又は(b)記載のタンパク質のアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列から成るタンパク質。
(I)第109番目のリジン:アスパラギン、グルタミンへの置換;
(II)第178番目のメチオニン:バリン、ロイシン、イソロイシンへの置換;
(III)第224番目のメチオニン:リジン、アルギニンへの置換。
(A)第109番目のリジンからアスパラギンへの置換;
(B)第178番目のメチオニンからバリンへの置換;
(C)第224番目のメチオニンからリジンへの置換;
(D)第109番目のリジンからアスパラギンへの置換及び第178番目のメチオニンからバリンへの置換;
(E)第178番目のメチオニンからバリンへの置換及び第224番目のメチオニンからリジンへの置換;
(F)第109番目のリジンからアスパラギンへの置換、第178番目のメチオニンからバリンへの置換及び第224番目のメチオニンからリジンへの置換。
〔実施例1〕ランダム変異導入によるSeNaに対する活性が高い変異型ルシフェラーゼの単離
1. 材料
1-1. プラスミド
プラスミドpCLuRA-TDH3は、サッカロミセス・セレビシエにおいてCLucを分泌発現させる発現ベクターとして、特許文献2に開示されている。
宿主として、サッカロミセス・セレビシエBY4743 PRB1Δ株を用いた。当該BY4743 PRB1Δ株は、サッカロミセス・セレビシエBY4741株(Invitrogen社)及びBY4742株(Invitrogen社)のそれぞれにおいて、プロテアーゼをコードする遺伝子であるPRB1をHegemannらの方法(http://mips.gsf.de/proj/yeast/info/tools/hegemann/loxp_kanmx.html)により破壊し、得られたBY4741 PRB1Δ株とBY4742 PRB1Δ株とを交接することで作製した。
形質転換は、Zymo Research社の「Frozen Yeast Transformation II」等のキットを用いて行った。
平板培養には、ウラシルを含まない合成寒天培地(0.67% Yeast nitrogen base without amino acids(ベクトンディッキンソン)、40μg/mlアデニン、20μg/ml L-アルギニン一塩酸塩、100μg/ml L-アスパラギン酸、100μg/ml L-グルタミン酸ナトリウム一水和物、20μg/ml L-ヒスチジン、60μg/ml L-ロイシン、30μg/ml L-リジン塩酸塩、20μg/ml L-メチオニン、50μg/ml L-フェニルアラニン、375μg/ml L-セリン、200μg/ml L-トレオニン、40μg/ml L-トリプトファン、30μg/ml L-チロシン、150μg/ml L-バリン、2%グルコース及び2.0%寒天:以下では単に「SD-ura寒天培地」という)を用いた。
基質であるSeNaは、乾固状態のものを0.005N塩酸-50%エタノールに1mMになるように溶解し、-80℃で保存し、要時さらに緩衝液(100mMトリス塩酸、pH7.5)で希釈したものを用いた。
2-1. N領域変異型ライブラリーの作製
プラスミドpCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]のαP21L-CLuc-HTコード領域にError Prone PCR(誤りがちPCR)を用いてランダム点突然変異を導入した。
mut-CLuc-F: 5'-ATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAG-3'(配列番号10)
mut-CLuc-NR2: 5'-CACGTGTGAGGCTCGCTCGTCTCCACCCAT-3'(配列番号11)
vec-CLuc-R: 5'-GCTTCAGCCTCTCTTTTCTCGAGAG-3'(配列番号12)
SQ-CLuc-NF2: 5'-TTCTCGAGCCGTACAAGGACAGCTGCCGCA-3'(配列番号13)
N領域断片溶液と補N領域断片溶液とを、それぞれ5μlずつ混合し、サッカロミセス・セレビシエBY4743 PRB1Δ株を形質転換した。形質転換に供した菌体を、SD-ura寒天培地に塗沫し、30℃で48時間〜72時間保温した。出現した多数のコロニーを、N領域変異型ライブラリーとした。
上述のN領域変異型ライブラリーの作製と同様の手法により、αP21L-CLuc-HTコード領域のほぼ後半部分を変異を導入する対象領域としたC領域変異型ライブラリーを作製した。
mut-CLuc-CF1: 5'-TCTCTGGCCTCTGTGGAGATCTTAAAATGA-3'(配列番号14)
mut-CLuc-R: 5'-AACTCCTTCCTTTTCGGTTAGAGCGGATGT-3'(配列番号15)
vec-CLuc-F: 5'-TCTAGAGGGCCGCATCATGTAATTA-3'(配列番号16)
SQ-CLuc-CR1: 5'-TGGACAACCGTCAAACTCCTGGTTGATCTT-3'(配列番号17)
サッカロミセス・セレビシエBY4743 PRB1Δ株を形質転換した。形質転換した菌体を、SD-ura寒天培地に塗沫し、30℃で48時間〜72時間保温した。出現した多数のコロニーを、C領域変異型ライブラリーとした。
96穴ディープウェルプレート(ウェル容積2ml)に、1mlずつbuffered SD-ura液体培地を分注し、N領域変異型ライブラリー又はC領域変異型ライブラリーのコロニーをそれぞれのウェルに植菌した。なお、対照として、6ウェルには、変異が導入されていないヒスチジンタグ付きCLuc(野生型CLuc)を分泌発現するサッカロミセス・セレビシエ(pCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]で形質転換されたBY4743 PRB1Δ株のコロニー)を植菌した。
上記第3節のK109N/T148A二重変異体に基づき、K109N単独変異体とT148A単独変異体を以下のように作製した。
(a) PCR A
鋳型:pCLuRA-TDH3[αP21L,K109N,T148A,-(GS)3H6]
プライマー1:mut-CLuc-F(配列番号10)
プライマー2:4037/4063-R:5'-CAGCACAGCCCCCTTGGTTCCATCCAG-3'(配列番号18)
(b) PCR B
鋳型:pCLuRA-TDH3[αP21L,K109N,T148A,-(GS)3H6]
プライマー1:4037/4063-F:5'-CTGGATGGAACCAAGGGGGCTGTGCTG-3'(配列番号19)
プライマー2:SQ-CLuc-CR1(配列番号17)
(c) PCR C
鋳型:pCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]
プライマー1:mut-CLuc-F(配列番号10)
プライマー2:4037/4063-R(配列番号18)
(d) PCR D
鋳型:pCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]
プライマー1:4037/4063-F(配列番号19)
プライマー2:SQ-CLuc-CR1(配列番号17)
鋳型:上記PCR A のPCR断片とPCR DのPCR断片の混合物
プライマー1:mut-CLuc-F(配列番号10)
プライマー2:SQ-CLuc-CR1(配列番号17)
伸長反応時間:1分
(f) PCR F
鋳型:上記PCR BのPCR断片とPCR CのPCR断片の混合物
プライマー1:mut-CLuc-F(配列番号10)
プライマー2:SQ-CLuc-CR1(配列番号17)
伸長反応時間:1分
(g) PCR G
鋳型:プラスミドpCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]溶液(150ng/μl)
プライマー1:vec-CLuc-R(配列番号12)
プライマー2:mut-CLuc-CF1(配列番号14)
伸長反応時間:7分30秒
M224K単独変異体に対してさらにランダム変異を導入して、より高い活性を示す変異体を得ることを試みた。ランダム変異導入とスクリーニングの手法は、上記第2節及び第3節に記載した方法に準じた。ただし、Error Prone PCR の鋳型には、pCLuRA-TDH3[αP21L,M224K,-(GS)3H6]を用いた。またSeNa溶液の濃度は2.5μMとした。
以下の各プラスミドで、サッカロミセス・セレビシエBY4743 PRB1Δ株を形質転換した。
(a) pCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]
(b) pCLuRA-TDH3[αP21L,K109N,-(GS)3H6]
(c) pCLuRA-TDH3[αP21L,M178V,-(GS)3H6]
(d) pCLuRA-TDH3[αP21L,M224K,-(GS)3H6]
(e) pCLuRA-TDH3[αP21L,M178V,M224K,-(GS)3H6]
(f) pCLuRA-TDH3[αP21L,K109N,M178V,M224K,-(GS)3H6]
K109N/M178V/M224K三重変異体に対してさらにランダム変異を導入して、より高い活性を示す変異体を得ることを試みた。ランダム変異導入とスクリーニングの手法は上記第2節及び第3節に記載した方法に準じた。ただし、Error Prone PCR の鋳型にはpCLuRA-TDH3[αP21L,K109N,M178V,M224K,-(GS)3H6]を用いた。また、SeNa溶液の濃度は12.5μMとした。
以下の各プラスミドで、サッカロミセス・セレビシエBY4743 PRB1Δ株を形質転換した。
(a) pCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]
(b) pCLuRA-TDH3[αP21L,K109N,-(GS)3H6]
(c) pCLuRA-TDH3[αP21L,M178V,-(GS)3H6]
(d) pCLuRA-TDH3[αP21L,M224K,-(GS)3H6]
(e) pCLuRA-TDH3[αP21L,M178V,M224K,-(GS)3H6]
(f) pCLuRA-TDH3[αP21L,K109N,M178V,M224K,-(GS)3H6]
(g) pCLuRA-TDH3[αP21L,K109N,M178V,-(GS)3H6]
Claims (9)
- 以下の(a)〜(c)のいずれか1つのタンパク質から成る変異型ルシフェラーゼ。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第109番目のリジンからアスパラギンへの置換及び第224番目のメチオニンからリジンへの置換から成る群より選択される1以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列から成るタンパク質
(b)前記(a)記載のタンパク質のアミノ酸配列において、前記第109番目及び第224番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質であって、2-(1-メチルプロピル)-6-(ナフタレン-2-イル)-8-(3-グアニジノプロピル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オンを基質とした場合に、配列番号2に示されるアミノ酸配列から成るタンパク質と比較して、発光強度が少なくとも1.4倍である、前記タンパク質
(c)前記(a)又は(b)記載のタンパク質のアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列から成るタンパク質 - さらに、配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第178番目のメチオニンからバリンへのアミノ酸置換を含む、請求項1記載の変異型ルシフェラーゼ。
- 以下の(A)〜(E)のいずれか1つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする、請求項1記載の変異型ルシフェラーゼ。
(A)前記第109番目のリジンからアスパラギンへの置換
(B)前記第224番目のメチオニンからリジンへの置換
(C)前記第109番目のリジンからアスパラギンへの置換及び前記第178番目のメチオニンからバリンへの置換
(D)前記第178番目のメチオニンからバリンへの置換及び前記第224番目のメチオニンか
らリジンへの置換
(E)前記第109番目のリジンからアスパラギンへの置換、前記第178番目のメチオニンからバリンへの置換及び前記第224番目のメチオニンからリジンへの置換 - 外来タンパク質又はペプチドと請求項1〜3のいずれか1項記載の変異型ルシフェラーゼとが連結された融合タンパク質。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載の変異型ルシフェラーゼ又は請求項4記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
- 請求項5記載の遺伝子を含む組換えベクター。
- 請求項6記載の組換えベクターを有する形質転換体。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載の変異型ルシフェラーゼ又は請求項4記載の融合タンパク質を2-(1-メチルプロピル)-6-(ナフタレン-2-イル)-8-(3-グアニジノプロピル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オンと接触させる工程と、
前記工程で生成した励起状態の2-(2-メチルブタンアミド)-3-(3-グアニジノプロピル)-5-(ナフタレン-2-イル)-ピラジンを化学物質に作用させる工程と、
を含み、前記化学物質の励起に基づき発光させるか又はエネルギーを放出させることを特徴する、発光又はエネルギー放出方法。 - 前記化学物質が蛍光タンパク質であることを特徴とする、請求項8記載の発光又はエネルギー放出方法。
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