WO2006132350A1 - 分泌型発光酵素を用いたレポーターアッセイ - Google Patents

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WO2006132350A1
WO2006132350A1 PCT/JP2006/311597 JP2006311597W WO2006132350A1 WO 2006132350 A1 WO2006132350 A1 WO 2006132350A1 JP 2006311597 W JP2006311597 W JP 2006311597W WO 2006132350 A1 WO2006132350 A1 WO 2006132350A1
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dna
secretory
reporter
dna fragment
gene
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Satoru Ohgiya
Yuki Tochigi
Takehiko Sahara
Yoshihiro Ohmiya
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National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/12—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of one atom of oxygen (internal monooxygenases or internal mixed function oxidases)(1.13.12)
    • C12Y113/12006—Cypridina-luciferin 2-monooxygenase (1.13.12.6), i.e. cypridina-luciferase

Definitions

  • the present invention relates to a reporter assay method using, for example, a secretory luminescent enzyme as a reporter protein.
  • Reporter assembly refers to, for example, a gene encoding a reporter protein (hereinafter referred to as a "reporter gene”! That is transcribed directly by the DNA sequence required for transcription initiation such as a promoter. Or it is a method for measuring indirectly.
  • reporter assembly a specific reporter gene is ligated 3 ′ downstream of a promoter, and this is inserted as a plasmid or into a chromosome to construct a transformant.
  • reporter assembly it is usually not easy to quantify mRNA synthesized by a specific reporter gene force linked 3 'downstream of the promoter. Therefore, it is often the case that the amount of protein synthesized by reading the mRNA information is used as a measurement target.
  • an enzyme is used as a reporter protein, and the enzyme activity value is generally regarded as a value representing the relative value of the initial mRNA synthesis amount. Is.
  • the reporter assembly it is generally accepted that the final measured enzyme activity is correlated with the transcriptional activity of the initial promoter.
  • a reporter assembly is used to examine the presence and amount of a specific chemical substance.
  • the dioxin receptor protein Aryl hydrocarbon receptor (AhR) is known. This receptor protein has the function of promoting the transcriptional activity of genes such as CYP1A Cytochrome P450 isozyme) when bound to dioxin. .
  • the complex of dioxin and dioxin receptor protein translocates to the nucleus, binds to a target sequence (such as a sequence called XRE), and activates transcription of the gene linked to the target sequence. . Therefore, prepare cells that express the dioxin receptor protein.
  • a reporter plasmid having a target sequence of dioxin receptor protein in a plug motor is prepared.
  • a predetermined reporter gene exists 3 ′ downstream of the promoter.
  • the reporter plasmid is then introduced into cells that express the dioxin receptor protein.
  • dioxin When dioxin is added to the culture medium, the dioxin penetrates into the cell and binds to the dioxin receptor. This complex of dioxin and dioxin receptor protein translocates to the nucleus and binds to the target sequence present in the reporter plasmid, thereby activating transcription of the reporter gene.
  • reporter protein production and production Kawanishi, M., Sakamoto, M., Ito, A "Kishi, K., Yagi, T. (2003) Mut. Res. 540, 99-105.
  • environmental hormones endocrine disruptors
  • estrogen receptors that bind to them.
  • a system that detects environmental hormones has also been developed in combination.
  • Tsuno or hybrid system As a typical method for examining the interaction between proteins, an experimental system called a Tsuno or hybrid system is widely used.
  • the experimental system also basically uses a reporter assay (Jung, J “Ishida, K., Nishihara, ⁇ . (2004) Life Sci. 74, 3065-30 74).
  • the components constituting the reporter assembly can be roughly classified into two.
  • the first component is a component for inducing transcriptional activity. Basically, a promoter or a promoter containing a DNA sequence involved in transcription activation 'suppression and promoter activation is promoted. Receptor 'coactivator and others are composed. In some cases, for example, when a reporter assay is used to detect a gene mutation as described above, a gene having an abnormal stop codon is the first component.
  • the second component is a component for making it possible to measure transcription activity, and basically also has a reporter protein force.
  • the first component varies depending on the object to be measured, but the second component is basically versatile. That is, a specific reporter protein can be commonly used for various reporter assays. In this way, if a superior reporter protein is developed, an advanced reporter protein can be developed by using it instead of the reporter protein used in the conventional reporter assay.
  • Reporter assembly has been conventionally constructed using various hosts such as Escherichia coli, yeast, and cultured cells.
  • the basic principle is the common force.
  • the special considerations in selecting a host are whether it is possible to reconstruct the activity (transcription activation) of the promoter to be analyzed, and whether the reporter protein is expressed. .
  • a transformant expressing the human dioxin receptor is constructed.
  • E. coli, a prokaryote is used as a host, the expression of human proteins is generally difficult, and the intracellular environment is significantly different from that of eukaryotic human cells.
  • cultured cells are often used as a host for reporter assembly because the environment is very similar to human cells.
  • the cultivation of cultured cells is generally more expensive due to the use of expensive urine fetal serum. Since the speed is very slow compared to microorganisms, there is a problem that the experiment takes time.
  • yeast used for culturing grows faster, and is inexpensive. Furthermore, since yeast is the same eukaryotic cell as humans, it is very similar to the human intracellular environment, and it is known that it is easy to produce human proteins. Because of these advantages, various reporter assemblies using yeast have been proposed. Typical examples include a reporter assembly for detecting dioxin and environmental hormones, and a two-hybrid method for analyzing protein interactions.
  • the reporter proteins listed above are all proteins expressed in cells.
  • cell recovery by centrifugation and disruption of cells by ultrasound, surfactant, organic solvent (or cell permeability) Enhance operation is essential. These operations are not suitable for processing many samples. That is, as long as these reporter proteins are used, a so-called high-throughput assembly that processes a large number of samples cannot be constructed.
  • reporter protein having high sensitivity and simplicity that can be used in a reporter assembly using yeast has not been reported.
  • An ideal reporter protein in terms of simplicity is a secreted protein that does not require cell collection and disruption.
  • the ideal reporter protein in terms of high sensitivity is most suitable for a protein that produces luminescence with a low background in the measurement principle.
  • Patent Document 2 a gene encoding luciferase derived from Cypridina noctiluca is cloned, and the luciferase is secreted very efficiently in mammalian cells. Is disclosed. However, in reporter assemblies using fermenters, examples of using secretory luminescent enzymes as reporter proteins, including luciferase from Cypridina noctiluca and other secreted luciferases, have been reported so far. Nah ...
  • Patent Document 1 Japanese Translation of Special Publication 2003-530106
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-187652
  • Non-patent literature l Harger, JW and Dinman JD, "RNA", 2003, VIII, p.1019-1024
  • Non-patent literature 2 Bovee, TFH, Helsdingen, RJR, Koks, PD, Kuiper, HA, Hooge nboom, R ⁇ . AP, Keijer, J., TGeneJ, 2004 ⁇ , No. 325 , p.187-200
  • Non-Patent Document 3 Leskinen P., Virtaq, M., Karp, M., “Yeast”, 2003, No. 20, p.1109-
  • Patent Document 4 Nakajima Y., Kobayasni, K., Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. [Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry J, 2004, Brother 68 ⁇ , p.565-570 Disclosure of Invention
  • the present invention has an object to provide a simple and highly sensitive reporter assembly method. Means for solving the problem
  • the present inventors examined using the culture or culture supernatant as it is for the reporter assembly.
  • a secretory luminescent enzyme as a reporter protein.
  • the present inventors introduced a gene encoding a secretory luminescent enzyme into a host, and obtained a culture or culture supernatant of the resulting transformant. After contacting with the secretory luminescent enzyme substrate, the expression, function, transcriptional activity or transcriptional control function of the foreign gene or DNA fragment introduced into the host is measured by measuring the enzyme activity of the secretory luminescent enzyme. The inventors have found that it can be evaluated efficiently and have completed the present invention.
  • the present invention includes the following.
  • [0022] First step of introducing a gene encoding a secretory luminescent enzyme into a host, and contacting the culture or culture supernatant of the transformant obtained in the first step with the substrate of the secretory luminescent enzyme A foreign gene or foreign D introduced into the host based on the enzyme activity of the secretory luminescent enzyme.
  • a reporter assay method characterized by evaluating expression, function, transcriptional activity or transcriptional control function of NA fragment.
  • the foreign gene encodes a force linked to a gene encoding the secretory luminescent enzyme, or a gene encoding a secretory signal peptide and a mature protein in the gene encoding the secretory luminescent enzyme.
  • the reporter assay method according to (1) wherein the reporter assay method is inserted between the gene and the target gene.
  • the secretory luciferase is a sea urchin luciferase
  • the secretory luminescent enzyme is a fusion protein of a secretory signal peptide that functions in the host and a mature protein of the secretory luminescent enzyme, according to (1), Reporter Atsay method.
  • a secretory luminescent enzyme comprising: a second step of contacting a culture or culture supernatant of the resulting transformant with a substrate of the secretory luminescent enzyme; and a third step of measuring the enzyme activity of the secretory luminescent enzyme.
  • a reporter assay method characterized by evaluating the secretory ability of the secretory signal peptide or secreted protein based on the enzyme activity of
  • the secretory luciferase is a sea urchin luciferase
  • the secretory luciferase is a sea urchin luciferase
  • the yeast transformant is cultured under conditions of pH 3.5 to 6.5
  • reporter assembly can be performed efficiently by using yeast and a secretory luminescent enzyme such as secretory luciferase.
  • Fig. 1 shows the results of examining the culture conditions when secreting and expressing CLuc from a transformant expressing CLuc.
  • FIG. 2A shows the results of measurement of CLuc activity using a diluted solution of Cypridina luciferin diluted with various pH buffers.
  • FIG. 2B shows the results of measuring CLuc activity using diluted solutions of Cypridina luciferin diluted with various final concentrations of Tris-HCl (pH 7.4).
  • FIG. 3 shows the results of measuring CLuc activity using culture supernatants of transformants expressing CLuc diluted stepwise against various final concentrations of luciferin in the reaction solution.
  • FIG. 4 shows the relative residual activity of CLuc activity measured after incubation of the culture supernatant of a transformant expressing CLuc at each temperature for a certain period of time.
  • FIG. 5 shows the results of examining the linearity and dynamic range in the CLuc activity measurement of the culture supernatant of a transformant expressing CLuc.
  • FIG. 6 shows the results of examining the inhibitory effects of various chemical substances on CLuc when measuring CLuc activity.
  • FIG. 7A shows the results of measurement of CLuc activity (RLU) using culture media or culture supernatants of transformants expressing CLuc having various turbidities.
  • FIG. 7B shows the results of measuring CLuc activity (RLU / OD) using a culture solution and culture supernatant of a transformant expressing CLuc.
  • Fig. 8 shows the results of measuring CLuc activity using each culture solution sample after sampling the culture solution of a transformant expressing CLuc and incubating at 25 ° C for a predetermined time. The results are shown.
  • FIG. 9 shows the results of measuring CLuc activity using a culture solution of a transformant having a CLuc-encoding DNA linked to a TDH3 promoter cultured in a 96-well deep well plate.
  • FIG. 10 shows the results of measuring mCLuc activity using a culture solution of a transformant having DNA encoding mCLuc linked to various promoters shown at the bottom.
  • FIG. 11 shows the results of measuring ⁇ -galatatosidase activity using a culture solution of a transformant having DNA encoding / 3-galatatosidase linked to various promoters shown in the lower part.
  • FIG. 12 shows the amount of mCLuc mRNA measured by the real-time PCR method and normalized by the amount of TDH3 mRNA.
  • FIG. 13A shows the use of a culture solution of a transformant having DNA encoding mCLuc linked to various promoters shown in the lower part in the presence and absence of copper ions. The result of measuring the activity is shown.
  • FIG. 13B shows the results obtained by using a culture medium of a transformant having DNA encoding j8-galatatosidase linked to various promoters shown in the lower part in the presence and absence of copper ions. -The result of having measured galatatosidase activity is shown.
  • FIG. 14A shows mCLuc activity in the presence and absence of galactose using a culture solution of a transformant having DNA encoding mCLuc linked to various promoters shown at the bottom. The measurement results are shown.
  • FIG. 14B shows ⁇ -galatatosidase activity in the presence and absence of galactose using a culture medium of a transformant having DNA encoding ⁇ -galatatosidase linked to various promoters shown at the bottom. The measurement results are shown.
  • FIG. 15 shows mCLuc ligated to various lengths of the TDH3 promoter shown in the left panel (these promoter sequences each have a known cis sequence as shown in the figure). The results of measuring the mCLuc activity using a culture solution of a transformant having DNA encoding ss are shown.
  • FIG. 16 shows GAL1 promoters of various lengths shown in the left panel.
  • the motor sequence shows the result of measuring the mCLuc activity using the culture medium of the transformant having the DNA encoding mCLuc linked to the known cis sequence as shown in the figure) .
  • FIG. 17 shows the DNA shown in the lower part (corresponding to the code region contained in the third exon of the rat ApoE gene) and the ⁇ factor secretion signal peptide DNA of a CLuc-encoding DNA.
  • ApoE (+) indicates DNA that does not contain a stop codon
  • ApoE ( ⁇ ) indicates DNA that includes a stop codon
  • ApoE (+/ ⁇ ) indicates DNA that is an equivalent mixture of both.
  • the reporter assay method is a method for evaluating the expression, function, transcriptional activity, or transcriptional control function of a foreign gene or a foreign DNA fragment using a secretory luminescent enzyme as a reporter protein.
  • a gene encoding a secretory luminescent enzyme hereinafter referred to as “secreted luminescent enzyme gene”
  • secreted luminescent enzyme gene a gene encoding a secretory luminescent enzyme
  • secreted luminescent enzyme gene a gene encoding a secretory luminescent enzyme
  • secreted luminescent enzyme gene a gene encoding a secretory luminescent enzyme
  • the culture or culture supernatant of the obtained transformant is brought into contact with the secretory luminescent enzyme substrate under conditions where an enzyme reaction of the secretory luminescent enzyme can occur, and then the secretory luminescent enzyme.
  • secretory luminescent enzyme measures enzyme activity.
  • the secretory luminescent enzyme means an enzyme that is secreted outside the cell membrane or outside the cell wall and catalyzes a reaction that emits light by decomposition of the substrate.
  • Examples of secretory luminescent enzymes / substrates that can be used in the reporter assay method according to the present invention include secreted luciferase / luciferin and secreted phosphatase / 1,2-dioxetane derivative.
  • Secretory luciferase catalyzes the oxidation of luciferin as a substrate by oxygen molecules. At this time, the acid energy product (oxyluciferin) is generated in an excited state by the generated reaction energy, and emits light when it becomes the basis.
  • luciferase derived from Cypridina noctiluca (cDNA: SEQ ID NO: 1, amino acid sequence: SEQ ID NO: 2) and luciferase derived from Vargula hilgendorfii (cDNA: SEQ ID NO: 3, amino acid sequence: SEQ ID NO: 4), etc.
  • Citrus luciferase luciferase derived from Oplophorus gracilirostris (cDNA: SEQ ID NO: 5, amino acid sequence: SEQ ID NO: 6), and luciferase derived from the copepod Metridia longa (cDNA: SEQ ID NO: 7, amino acid sequence: SEQ ID NO: 8)
  • luciferase derived from Cypridin a noctiluca is preferred because of its high secretion efficiency!
  • Secretory phosphatase catalyzes the dephosphorylation of a 1,2-dioxetane derivative (CDP-Star, CSPD; Applied Biosystems), which is a luminescent substrate. At this time, the dephosphorylated substrate is spontaneously decomposed into adamantanone and a phosphor, and emits light when the phosphor produced in the excited state by the reaction energy becomes the ground state.
  • Examples of the secretory phosphatase include human placental alkaline phosphatase (SEAP; cDNA: SEQ ID NO: 9, amino acid sequence: SEQ ID NO: 10).
  • secretory proteins including secretory luminescent enzymes are synthesized in the form of precursors having a secretory signal peptide at the N-terminus. This precursor is cleaved by a signal peptidase during the transmembrane process to become a mature protein.
  • the mature protein means a protein secreted outside the cell membrane or outside the cell wall.
  • a mature protein generally has a secretory signal peptide removed.
  • the mature protein includes a protein from which a sequence presumed to be a secretory signal peptide is excluded even when the secretory signal peptide is not removed.
  • the secretory luminescent enzyme may be a fusion protein of a secretory signal peptide and a non-secretory luminescent enzyme as long as it is actually secreted outside the cell membrane or cell wall.
  • a secretory luminescent enzyme a secretory signal peptide known to function as a secretory signal peptide in the selected host is used instead of the original secretory signal peptide.
  • a fusion protein linked to the N-terminal may be used as a secretory luminescent enzyme.
  • Saccharomyces cerevisiae ⁇ -factor secretion, signanopeptide (cDNA: SEQ ID NO: 11, amino acid sequence: SEQ ID NO: 12) is highly secreted in yeast. It is known to provide efficiency.
  • secretory signal peptides in yeast include secretory signal peptides of invertase.
  • the secretory signal peptide of the secreted luciferase derived from Cypridina noctiluca is the first to 18th amino acid sequence in the amino acid sequence of the secreted luciferase derived from Cypridina noctiluca shown in SEQ ID NO: 2.
  • a fusion protein (cDNA: SEQ ID NO: 13, amino acid sequence: sequence) in which the a-factor secretion signal peptide is linked to the N-terminus of the secreted luciferase mature protein derived from Cypridina noctiluca Number 14) can be used as a secretory luminescent enzyme.
  • the base sequence of the secretory luminescent enzyme gene and the corresponding amino acid sequence thereof are not limited to the base sequence shown in the above SEQ ID NO and the corresponding amino acid sequence.
  • Each secretory luminescent enzyme consists of an amino acid sequence in which one or several (for example, 1 to 10, 1 to 5) amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence shown in the above SEQ ID NO. What is necessary is just to be secreted and to have the enzyme activity which each enzyme has.
  • the secretory luminescent enzyme gene can be determined by optimizing the base sequence of the secretory luminescent enzyme gene shown in the above SEQ ID NO.
  • a secretory luminescent enzyme gene is a synthetic gene (cDNA: SEQ ID NO: 15) in which a luciferase gene (cDNA: SEQ ID NO: 1) derived from Cypridina noctiluca is optimized for use in Saccharomyces cerevisiae.
  • the amino acid sequence of luciferase encoded by the gene is identical to the amino acid sequence of wild-type luciferase (SEQ ID NO: 2).
  • the foreign gene in the reporter assembly method according to the present invention may be a gene encoding such a protein or peptide.
  • it can be divided into, for example, the first to third embodiments as follows.
  • a gene encoding a protein is a foreign gene.
  • a gene encoding a target protein derived from DNA or RNA prepared by a human blood sample or the like becomes a foreign gene. The In these cases, the foreign gene is inserted between the gene encoding the secretory signal peptide and the gene encoding the mature protein in the force linked to the 5 ′ upstream side of the secretory luminescent enzyme gene or the secretory luminescent enzyme gene.
  • the Rukoto it is preferable to link a foreign gene between the gene encoding the secretory signal peptide and the gene encoding the mature protein in the secretory luminescent enzyme gene from the viewpoint that it does not easily lose the function of the secretory luminescent enzyme.
  • the enzyme activity value of the secretory luminescent enzyme is correlated with the expression, activity or function of the foreign gene.
  • a gene encoding a specific normal protein is used as a control foreign gene.
  • test gene a gene that evaluates whether an abnormal stop codon or the like exists in a gene (hereinafter referred to as “test gene”) is a foreign gene. Furthermore, the enzyme activity value when using the test gene is lower or not at all compared to the enzyme activity value when using the control foreign gene. Can be evaluated without determining.
  • a gene encoding an exogenous transcription factor, transcription repressing factor or the like is mentioned as the exogenous gene.
  • the “foreign gene” may be a gene derived from the host.
  • the gene may be linked to all or part of a gene encoding another transcription factor or transcription repressor, and the gene encoding the fusion protein may be a foreign gene.
  • the reporter assembly method according to the present invention is used in a two-hybrid system using yeast, the ability to interact with a gene encoding a bait protein and a decoy protein is tested.
  • the gene that encodes the protein is a foreign gene.
  • the foreign gene is not directly linked to the secretory luminescent enzyme gene, but is present at another position on the same plasmid, on another plasmid or chromosome, and expressed in the host.
  • the enzyme activity value of the secretory luminescent enzyme is used to control the transcription of the protein itself encoded by the foreign gene, or in the two-hybrid system, the interaction between the decoy protein and the test protein. Can be evaluated.
  • the enzyme activity value of the secretory luminescent enzyme is used to determine the strength of the one-hybrid system, such as the DNA-binding ability involved in transcriptional activation and the interaction with cofactors and RNA polymerases. Can be evaluated.
  • the reporter assembly method screens a protein immobilized on the cell membrane or cell wall (hereinafter referred to as "cell membrane protein or cell wall protein”) from among a large number of proteins.
  • the gene encoding the protein to be screened becomes a foreign gene.
  • the foreign gene is linked 5 ′ upstream or 3 ′ downstream of the secretory luminescent enzyme gene.
  • the secretory luminescent enzyme gene is linked to the exogenous gene so that the secretory luminescent enzyme is immobilized on the cell membrane or cell wall outside the cell membrane or cell wall.
  • the cell membrane protein or cell wall protein is immobilized on the cell membrane or cell wall of the host together with the secretory luminescent enzyme. Based on the enzyme activity value of the immobilized secretory luminescent enzyme, a cell membrane protein or cell wall protein encoded by a foreign gene can be screened.
  • the cell membrane protein or cell wall protein in addition, only the shift at the N-terminus or C-terminus may be present outside the cell membrane or outside the cell wall. Therefore, according to the above-described screening using the reporter assay method according to the present invention, the cell membrane protein or cell wall protein has a displacement at the C-terminus or N-terminus, outside the cell membrane or cell wall. It can be evaluated by the enzyme activity value of the secretory luminescent enzyme. Furthermore, according to the above-described screening using the reporter assay method according to the present invention, the expression level of cell membrane protein or cell wall protein can be evaluated using the enzyme activity value of secretory luminescent enzyme.
  • examples of the foreign DNA fragment include a promoter, a DNA fragment containing a sequence generally referred to as a cis-sequence that activates or suppresses transcription, and a synthetic DNA. Furthermore, it may be a DNA fragment containing a sequence that contributes to mRNA stability or a sequence that affects translation efficiency.
  • the promoter used as the foreign DNA fragment is a promoter derived from any organism or an artificial cis sequence. A certain combination may be any sequence including an artificial sequence as long as it has a function as a promoter. For example, when the foreign DNA fragment is a promoter, a promoter is linked 5 ′ upstream of the secretory luminescent enzyme gene.
  • the enzyme activity value of the obtained secretory luminescent enzyme can be evaluated as the relative transcription activity value of the promoter used as the foreign DNA fragment.
  • the foreign DNA fragment is a ds sequence that causes transcriptional activity or transcriptional repression, a sequence that affects mRNA stability, or a sequence that affects translation efficiency, it is relative to the secretory luminescent enzyme gene.
  • the target position can be any position as long as it functions.
  • the transcription control function for example, transcription activation or transcription
  • the degree of contribution to mRNA stability or the degree of influence on translation efficiency.
  • other foreign DNA fragments are linked to positions that can be controlled with respect to the secretory luminescent enzyme gene.
  • the host is not particularly limited as long as it can function as a secretory luminescent enzyme gene and a foreign gene or a foreign DNA fragment in the host, but Escherichia coli such as yeast and Escherichia coli.
  • Escherichia coli such as yeast and Escherichia coli.
  • Bacillus subtilis such as Bacillus subtilis
  • Pseudomonas putida such as Pseudomonas
  • animal cells such as COS cells
  • insect cells such as S19, or Brassicaceae Plants to which it belongs.
  • the yeast may be any yeast, such as Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Candida albicans, Hansenura. 'Polymorpha (Hansenula polymorpha) is mentioned, and Saccharomyces cerevisiae is particularly preferable.
  • a secretory luminescent enzyme gene and a foreign gene or a foreign DNA fragment are prepared.
  • Secretory luminescent enzyme genes, foreign genes, and foreign DNA fragments are complementary to the nucleotide sequences at both ends of the region, for example, by using the genomic DNA of organisms having these genes as saddles. It can be easily obtained by PCR using simple primers.
  • the base sequence of a gene or the like has been determined, then, by chemical synthesis, by PCR using a cleaved probe as a cage, or using a DNA fragment having the base sequence as a probe Genes etc. can be obtained by hybridizing
  • mutants of genes and the like having the same functions as before mutation can be synthesized by site-directed mutagenesis.
  • a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method or a method equivalent thereto can be employed.
  • a mutagenesis kit for example, Mutant-K (TAKARA) or Mutant-G (TA KARA)
  • LA PCR in by TAKARA Mutations are introduced using the in vitro Mutagenesis series kit.
  • a DNA in which the foreign gene or the foreign DNA fragment is linked to a secretory luminescent enzyme gene is prepared.
  • a foreign gene or a foreign DNA fragment is inserted between a gene encoding a secretory signal peptide in a secretory luminescent enzyme gene and a gene encoding a mature protein
  • the secretory signal peptide in the secretory luminescent enzyme gene is encoded.
  • Such DNA may be the DNA itself linked or inserted as described above, or a vector containing the DNA!
  • the purified secretory luminescent enzyme gene and foreign gene or foreign DNA fragment are cleaved with an appropriate restriction enzyme and ligated.
  • the method is adopted.
  • a secretory luminescent enzyme gene and an exogenous gene or a foreign DNA fragment each having a homologous region can be linked to each other by an in vitro method using PCR or an in vivo method using yeast. It may be a method to do.
  • a foreign gene or a foreign DNA fragment between a gene encoding a secretory signal peptide in a secretory luminescent enzyme gene and a gene encoding a mature protein may be carried This can be carried out according to the method for linking genes or foreign DNA fragments.
  • a vector containing a gene or a DNA into which a foreign DNA fragment has been inserted (hereinafter referred to as “DNA according to the present invention”) can be obtained by inserting the DNA according to the present invention into an appropriate vector.
  • the vector to be used is not particularly limited as long as it is replicable in the host, and examples thereof include plasmids, shuttle vectors, helper plasmids and the like. If the vector itself does not have replication ability, it may be a DNA fragment that can be replicated by inserting it into a host chromosome.
  • Plasmid DNA includes plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB 110, pTP5, etc.), and plasmids derived from yeast ( For example, ⁇ system such as ⁇ 13, YCp system such as YCp50, etc.), and phage DNA include fly phage (Charon4A, Charon21A, EMB L3, EMBL4, gtl0, gtll, ⁇ ZAP, etc.). Furthermore, it is possible to use animal viruses such as retroviruses or mosquito viruses, and insect virus vectors such as baculoviruses.
  • animal viruses such as retroviruses or mosquito viruses
  • insect virus vectors such as baculoviruses.
  • the method of inserting the DNA according to the present invention into a vector can be performed according to the above-described method of ligating a foreign gene or a foreign DNA fragment to a secretory luminescent enzyme gene.
  • the DNA according to the present invention or a vector containing the DNA according to the present invention (hereinafter referred to as "the vector or the like according to the present invention") is introduced into the host.
  • the vector or the like according to the present invention is introduced into the host.
  • the secretory luminescent enzyme gene and the foreign gene are present in separate vectors, for example, the vector having the secretory luminescent enzyme gene and the vector having the foreign gene are introduced into the same host. To produce a transformant.
  • the method for introducing the vector according to the present invention into yeast is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into yeast.
  • electroporation electroporation (elect mouth position method), spheroplast method, acetic acid Examples include the lithium method.
  • it may be a Yip-based vector or a method of replacing yeast into a chromosome using a DNA sequence homologous to an arbitrary region in a chromosome.
  • the method of introducing the vector according to the present invention into yeast is generally Depending on the method described in the experiment or academic paper.
  • the method for introducing the vector according to the present invention into bacteria is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into bacteria. Examples thereof include a method using calcium ions and an eletroporation method.
  • monkey cells such as COS-7, Vero, Chineseno, Muster oocyte (CHO cells), mouse L cells and the like are used.
  • Examples of the method for introducing the vector according to the present invention into animal cells include the electopore position method, the calcium phosphate method, and the lipofusion method.
  • insect cells When insect cells are used as hosts, S19 cells and the like are used.
  • methods for introducing the vector according to the present invention into insect cells include the calcium phosphate method, the lipofusion method, and the electopore position method.
  • plant cultured cells When a plant is used as a host, the whole plant body, plant organ (eg, leaf, petal, stem, root, seed, etc.), plant tissue (eg, epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundle, etc.) Alternatively, plant cultured cells are used.
  • plant organ eg, leaf, petal, stem, root, seed, etc.
  • plant tissue eg, epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundle, etc.
  • plant cultured cells are used. Examples of the method for introducing a vector according to the present invention into a plant include an electroporation method, an agglomerate method, a particle gun method, and a PEG method.
  • Confirmation of the ability of the vector according to the present invention to be incorporated into the host can be performed by PCR, Southern hybridization, Northern hybridization, or the like.
  • DNA is prepared from the transformant, and DNA-specific primers are designed and PCR is performed.
  • the amplified product is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, capillary single electrophoresis, etc., stained with bromide zyme, SYBR Green solution, etc., and the amplified product is detected as a band to transform the amplified product. Confirm that it was done.
  • PCR can be performed using primers previously labeled with a fluorescent dye or the like to detect amplification products.
  • a method may be employed in which the amplification product is bound to a solid phase such as a microplate and the amplification product is confirmed by fluorescence or enzymatic reaction.
  • the obtained transformant is cultured under conditions that allow it to grow. Furthermore, in this method, when the transformant culture is directly used for enzyme activity measurement, the secretory luminescent enzyme is not inactivated!
  • the Rukoto For example, for the culture of transformed yeast into which secretory luciferase such as luciferase from Cypridina noctiluca is introduced as a secretory luminescent enzyme!
  • the temperature is set to, for example, 4 to 37 ° C, preferably 20 to 30 ° C so that the yeast grows and the luciferase is not inactivated.
  • the pH of the medium may be set to, for example, 3.5 to 6.5, preferably 5.5 to 6.0.
  • the culture time is preferably 1 to 120 hours, preferably 1 to 24 hours in the logarithmic growth phase, as long as the activity of the secretory luminescent enzyme can be measured.
  • the reporter assay method after culturing the transformant, the resulting culture or culture supernatant is subjected to secretory luminescence under conditions that can cause an enzyme reaction of secretory luminescent enzyme.
  • the condition under which the enzyme reaction occurs means a condition in which the substrate is specifically bound to the active center of the secretory luminescent enzyme to form a complex and the enzyme reaction proceeds.
  • the contact means a state in which the secretory luminescent enzyme in the culture or culture supernatant is close to the substrate and an enzyme reaction occurs.
  • the culture means a culture solution or a medium containing a transformant.
  • the culture solution or medium containing the transformant can be used as it is.
  • a culture supernatant obtained by separating a transformant by centrifugation or the like may be used.
  • the temperature is, for example, 0 to 40 ° C.
  • the temperature is preferably set to 15 to 30 ° C.
  • the pH may be set to 4.0 to 9.0, preferably 6.0 to 8.0, for example.
  • the contact time is, for example, 1 second to 30 minutes, preferably 1 second to 30 seconds.
  • the pH of the culture or culture supernatant can be shifted to a pH at which the enzyme activity of the secretory luminescent enzyme is high.
  • a Tris-HCl buffer (less than 2M (preferably 50 mM to 200 mM) and pH 3.5 to 9.0 (preferably pH 7.0 to 8.0)
  • a luciferin solution diluted with a buffer such as Tris-HC1 By adding a luciferin solution diluted with a buffer such as Tris-HC1), the pH at the time of contact described above can be set.
  • the concentration of the substrate relative to the culture or culture supernatant can be appropriately determined according to the secretory luminescent enzyme and the substrate.
  • the culture or culture supernatant of a transformant having secretory luciferase is used.
  • the luciferin, which is the substrate is added to a final concentration of 0.1 ⁇ or more, preferably 1.25 2.5 ⁇ , with respect to turbidity (eg, absorbance at 600) of 0.05 or more.
  • the enzyme activity of the secretory luminescent enzyme is measured.
  • the measuring method can be appropriately selected according to the secretory luminescent enzyme. For example, when secretory luciferase is used as the secretory luminescent enzyme, the culture of the transformant or the mixture of the culture supernatant and the substrate is subjected to luminescence measurement using a luminometer, and the relative luminescence intensity ( The enzyme activity is measured as RLU).
  • the turbidity eg, absorbance at 600 nm
  • the relative luminescence intensity is expressed as turbidity.
  • the value corrected by dividing (RLU / OD) can be used as the enzyme activity value.
  • a method of measuring the amount of ATP contained in the transformant and dividing the relative luminescence intensity by this value is also preferable.
  • another enzyme or protein may be expressed at the same time, the amount of the enzyme or protein is measured, and the relative luminescence intensity is divided by the value to correct.
  • luminescent enzymes and mutants of the secretory luminescent enzyme according to the present invention can be expressed and A method of correcting by dividing by luminescence derived from the luminescent enzyme may be used.
  • the transformant grows on an agar medium to form a colony. Therefore, for example, when secretory luciferase is used as the secretory luminescent enzyme, after adding luciferin to the agar medium containing the transformant, the luminescence intensity of the colony is measured with a luminescence detector having a CCD camera, for example.
  • the enzyme activity can be measured by measuring using.
  • the enzyme activity value of the secretory luminescent enzyme thus obtained is correlated with the expression, function, transcriptional activity, or transcriptional control function of a foreign gene or a foreign DNA fragment.
  • a simple and highly sensitive reporter assay can be performed.
  • the reporter assay method according to the present invention can efficiently use a highly sensitive luminescence measurement method having a low background, it is possible to produce a trace amount of an assay system.
  • a measurement sample can be prepared only by sampling a culture without collecting bacteria or disrupting cells. Therefore, automation by a robot is possible.
  • the reporter assembly method enables the reporter assembly to be performed as a high throughput assembly, and further allows automatic processing using robotics.
  • the reporter assay method according to the present invention, a simple quantitative evaluation of protein-protein interaction can be performed in a two-hybrid system.
  • bioassays such as dioxin and environmental hormones.
  • it can also be used for comprehensive screening of secretory proteins useful for drug discovery.
  • yeast expressing human membrane-bound receptors and nuclear receptors and coupling these receptors with the intracellular signal transduction system of yeast, high-throughput screening of new drug lead compounds is possible.
  • the conventional method can detect gene mutations, which are laborious as in one sample and one petri dish, and can simultaneously analyze 96 samples in one 96-well plate, contributing to high throughput of gene mutation analysis.
  • the reporter assembly method according to the present invention is highly sensitive, scale down is possible.
  • the transformed yeast according to the present invention is provided with a 1 m to 1 mm channel and a membrane filter, a narrow channel or a nanopillar that prevents the yeast from flowing out, and a chip or a capillary that is made so that only the medium flows.
  • Set to. is there Alternatively, it may be a chip or a fly that allows a culture solution containing bacterial cells to flow.
  • a substrate is caused to flow into the flow path with respect to the secretory luminescent enzyme released into the medium to cause an enzyme reaction.
  • the reporter assay method according to the present invention can be used for on-chip analysis called ⁇ TAS (Micro total analysis systems) or Lab-on-a-chip.
  • the secretory ability of the secretory signal peptide or secretory protein can be evaluated.
  • a DNA in which a secretory signal peptide or a gene encoding a secreted protein is linked upstream of a gene encoding a mature protein of a secretory luminescent enzyme is introduced into the host, and based on the enzyme activity of the secretory luminescent enzyme.
  • the secretory ability of the secretory signal peptide or secreted protein can be quantitatively evaluated.
  • a gene encoding a secretory signal peptide or secreted protein is linked 5 ′ upstream of the gene encoding the mature protein of the secretory luminescent enzyme.
  • the enzyme activity value of the obtained secretory phosphorescent enzyme can be evaluated as the relative secretory activity value of the secretory signal peptide.
  • the enzyme activity value it can be evaluated that it has a function as a gene encoding a secretory signal peptide.
  • the enzyme activity value of the obtained secretory luminescent enzyme can be evaluated as a relative secreted protein expression level. Alternatively, by obtaining an enzyme activity value, it can be evaluated as a gene encoding a secreted protein.
  • the chemical or physical change includes, for example, detection of chemical substances or physiologically active substances, change in concentration, and change in temperature.
  • DNA fragments involved in promoters responsive to these substances and transcriptional control are used as foreign DNA fragments.
  • a sequence that binds to a complex of dioxin receptor and dioxin is linked to a general promoter. The exogenous DNA fragment is used. These foreign DNA fragments are linked to the secretory luminescent enzyme gene.
  • a reporter assay method for detecting dioxin can be obtained by introducing the exogenous DNA fragment and a gene mutant that expresses the dioxin receptor together into a host cell.
  • the concentration of dioxin can be measured by the amount of luminescence of the secretory luminescent enzyme.
  • a reporter assay method for detecting a temperature change by using a protein that detects the temperature change, for example.
  • a high temperature can be detected based on the activity of a secretory luminescent enzyme by using a temperature-dependent transcription factor called heat shock factor (HSF).
  • HSF heat shock factor
  • a promoter responsive to the above-described chemical or physical change and a DNA fragment involved in transcriptional control are used as foreign DNA fragments.
  • DNA in which a secretory luminescent enzyme gene is linked to these foreign DNA fragments is introduced into a host and expressed.
  • the host is then exposed to a subject of chemical or physical change.
  • the activity of the secretory luminescent enzyme is measured.
  • a change in the activity of the secretory luminescent enzyme compared to the negative control indicates that the expression of the foreign DNA fragment has changed in response to the test subject.
  • the enzyme activity value of the secretory luminescent enzyme thus obtained can be evaluated as a relative measurement value of chemical or physical change.
  • a foreign DNA fragment that interacts with a protein responsive to the above-described chemical or physical change (hereinafter referred to as “responsive protein”) is introduced into a host and expressed.
  • a secretory luminescent enzyme gene is linked to the foreign DNA fragment. If the responsive protein does not exist in the host, the gene encoding the responsive protein is introduced into the host as a foreign gene and expressed. The host is then exposed to chemical or physical changes. After exposure, the activity of the secretory luminescent enzyme is measured. When the activity of the secretory luminescent enzyme changes compared to the negative control, the responsive protein detects a chemical or physical change, indicating that the interaction with the foreign DNA fragment has changed. Thus, the enzyme activity value of the obtained secretory luminescent enzyme can be evaluated as a relative measurement value of a chemical or physical change.
  • an appropriate promoter, a DNA fragment involved in transcription control, or the like can be used as a foreign DNA fragment as long as the transcription amount varies.
  • One or more responses as required Simultaneously express a gene encoding a response protein (for example, a receptor represented by dioxin receptor).
  • a method such as using a signal transduction system possessed by the host is also used.
  • a gene encoding an appropriate receptor is introduced into a host and expressed in a cell, in the nucleus, or on a cell membrane.
  • a gene encoding a protein involved in an appropriate signal transduction system is expressed in the host as necessary so that when the receptor detects a chemical substance or a physiologically active substance, the signal affects the transcriptional activity.
  • an appropriate DNA fragment or promoter involved in transcriptional regulation is linked as a foreign DNA fragment to the secretory luminescent enzyme gene, introduced into the host, and expressed.
  • the foreign DNA fragment linked to the secretory luminescent enzyme gene may be derived from the host to be introduced, foreign, or an artificially designed sequence as long as it has a transcriptional control function! /.
  • this reporter assay method can be used as a bioassay method for a large number of chemical substances or physiologically active substances.
  • many receptors on cell membranes such as histamine receptors are known.
  • the substance that originally binds can be identified, and the V, orphan receptor receptor can be used in combination with this reporter assay method to search for ligands that are extremely important for drug discovery. .
  • this reporter assay method is suitable.
  • a split assay can be performed according to the reporter assay method of the present invention. It is designed to divide the secretory luminescent enzyme into two at appropriate locations, and it is actually expressed in the host as two fragments (hereinafter referred to as “N-terminal fragment” and “C-terminal fragment”). When these two fragments are properly associated spatially, the activity of the secretory luminescent enzyme Sex is revived. In the present invention, this phenomenon is used to determine the association ability between cell membrane proteins on the cell membrane (split assembly).
  • genes encoding two types of cell membrane proteins are subject to association ability determination.
  • the first expression cassette is obtained by linking one cell membrane protein gene and a DNA fragment encoding the N-terminal fragment of a secretory luminescent enzyme. More specifically, the first expression cassette includes a fusion gene encoding a fusion protein in which an N-terminal fragment of a secretory luminescent enzyme is linked to the extracellular end of a cell membrane protein.
  • the second expression cassette is obtained by linking the other cell membrane protein gene and a DNA fragment encoding the C-terminal fragment of the secretory luminescent enzyme. Similar to the first expression cassette, the second expression cassette contains a fusion gene encoding a fusion protein in which the C-terminal fragment of a secretory luminescent enzyme is linked to the extracellular end of a cell membrane protein.
  • these two types of expression cassettes are introduced into a host to express the respective fusion genes.
  • the activity of the secretory luminescent enzyme is measured.
  • the enzyme activity of the secretory luminescent enzyme is obtained, it can be determined that two cell membrane proteins are associated with each other on the cell membrane.
  • the enzyme activity of the secretory luminescent enzyme cannot be obtained, two cell membrane proteins do not associate with each other on the cell membrane, suggesting the possibility.
  • the association ability of two kinds of cell membrane proteins can be determined.
  • the ability to associate two cell wall proteins on the cell wall is determined by using a gene encoding a cell wall protein as a foreign gene instead of a cell membrane protein gene.
  • Example 1 Secretion expression of Cypridina noctiluca secretory luciferase in yeast and examination of optimum pH of culture medium
  • CLucJ t ⁇ Cypridina noctiluca secreted luciferase
  • pcDNA-CL plasmid containing CLuc cDNA
  • the secretion signal peptide of CLuc from pcDNA-CL (in the amino acid sequence of CLuc shown in SEQ ID NO: 2)
  • a cDNA encoding a mature protein excluding the 18th amino acid sequence (hereinafter referred to as “mature CLuc cDNA”) was amplified by polymerase chain reaction (PCR).
  • a DNA encoding a budding yeast ⁇ -factor secretion signal peptide (amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12) (SEQ ID NO: 11; hereinafter referred to as “ ⁇ -factor secretion signal peptide DNAJ”) is Saccharomyces cerevisiae. S288C genomic DNA (purchased from Invitrogen) was amplified as a saddle.
  • the mature CLuc cDNA was linked to the ⁇ -factor secretion signal peptide DNA, and the mature CLuc having the a-factor secretion signal peptide at the N-terminus (amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14:
  • SEQ ID NO: 13 amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13
  • 3'Xba I-luci is the first codon ( In the CLuc amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, it corresponds to the 19th amino acid) and is linked to the downstream 20 bp.
  • 3'Xba I-luci is a 21 bp upstream sequence including the CLuc stop codon.
  • PCR to amplify mature CLuc cDNA was performed using 300 nM of each primer, dNTP (4 types of (Mixed solution of xylonucleotide triphosphate) 200 ⁇ M, MgSO 100 ⁇ , pcDNA-C as cage
  • reaction solution 50 / zl containing 10 ng of L and KOD Plus buffer (1 X) and KOD plus DNA polymerase 1U 1st step: 94 ° C for 2 minutes
  • DNA fragment A The obtained PCR product was analyzed by 1% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 1.6 kb containing mature CLuc cDNA was confirmed. In the following, this DNA fragment is called “DNA fragment A”.
  • sequences of primers (5'Sma I-alpha and alpha-luci-R) for amplifying a factor secretion signal peptide DNA of Saccharomyces cerevisiae were as follows.
  • 5'Sma I-alpha is 28 bp downstream including the initiation codon ATG of the ⁇ -factor secretion signal peptide, while alpha-luci-R is complementary to the above alpha-luci-F (SEQ ID NO: 16). It is an array.
  • DNA fragment B The obtained PCR product was analyzed by 1% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 250 bp containing ⁇ -factor secretion signal peptide DNA was confirmed.
  • this DNA fragment is referred to as “DNA fragment B”.
  • Overlap PCR is performed as a primer using 1 ⁇ l each of a PCR reaction solution containing DNA fragment A and a PCR reaction solution containing DNA fragment B diluted 100-fold each with distilled water.
  • the mature CLuc cDNA was amplified under the same conditions as described above except that the annealing temperature was 50 ° C, the extension reaction time was 2 minutes, and the third step was 3 minutes.
  • the obtained PCR product was purified using GenElute PCR clean-up kit (Sigma). Finally, DNA was eluted from the column of the kit with distilled water 40 ⁇ 1. This DNA was cleaved with Sma I 20 U for 18 hours in a 50 ⁇ l reaction solution. After digestion with Sma I, the DNA was purified again using the GenElute PCR clean-up kit. Finally, the column force of the kit was eluted with distilled water 40 1.
  • DNA fragment C a DNA fragment in which mature CLuc cDNA was ligated downstream of the ⁇ -factor secretion signal peptide DNA was obtained.
  • this DNA fragment is referred to as DNA fragment C.
  • pUG «35 http: // mips. Gsf.de/proj/yeast/info/tools/hegemann/gfti.html
  • pUG35-MET25 + MCS was prepared by self-circularization.
  • pUG35-MET25 + MCS was cleaved with Cla I and Xho I, and a vector fragment (about 5.1 kbp) was recovered by agarose electrophoresis.
  • the following oligo DNA was synthesized and annealed to prepare a linker DNA.
  • MCS Linker F CCGCTCGAGCGGCCGCGAGCTCGTCGACATCGATGG (SEQ ID NO: 20)
  • MCS linker R CCATCGATGTCGACGAGCTCGCGGCCGCTCGAGCGG (SEQ ID NO: 21)
  • the prepared linker DNA contains a restriction enzyme site of Xhol-Notl-Sacl-Sall-Clal.
  • DNA fragment D 2 ⁇ g of pUG35—MET25—EGFP3 + MCS plasmid was cleaved with Sma I 50 U in 50 ⁇ 1 reaction solution for 18 hours. After digestion with Sma I, the DNA was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted with 40 1 of distilled water using distilled water. Subsequently, the obtained DNA was cleaved with Xba I 50U in a 50 ⁇ l reaction solution for 18 hours. After digestion with Xba I, the DNA was subjected to agarose electrophoresis, and a vector fragment (about 5 kb) of the pUG35-MET25-EGFP3 + MCS plasmid was recovered. In the following, this vector fragment is referred to as DNA fragment D.
  • pCLuRA plasmid
  • TDH3 promoter the promoter of Saccharomyces cerevisiae TDH3 (systematic gene name: YGR192C) gene (SEQ ID NO: 22: hereinafter referred to as "TDH3 promoter") is inserted into pCLuRA 5 'upstream of the DNA encoding a CLuc. Incorporated to be located at.
  • the TDH3 promoter is a 5 ′ upstream untranslated region of the TDH3 gene, that is, a region sandwiched between the TDH3 gene and the PDX1 gene, which is the 5 ′ upstream adjacent gene of the TDH3 gene (yeast genomic DNA). ⁇ Go to ⁇ Su http://www.yeastgenome.org/).
  • 5'TDH3 BamHI; GGGTGGATCCCGAGTTTATCATTATCAATAC (SEQ ID NO: 23) 3'TDH3; TCGAAACTAAGTTCTTGGTG (SEQ ID NO: 24)
  • the 5'TDH3_BamHl primer is upstream of the TDH3 open reading frame (ORF) 5 ' PDX1 This is a sequence in which a Bam HI restriction enzyme site is attached 5 ′ to the 21 bases 3 ′ downstream of the stop codon of ORF.
  • the 3′TDH3 primer is a complementary sequence of 20 bases 5 ′ upstream from the start codon of TDH3 ORF. Please refer to the yeast genome database (http://www.yeastgenome.org/) for the positions of the primers.
  • Saccharomyces cerevisiae S288C genomic DNA 1 ng was used as the saddle type, 5'TDH3_BamHI (SEQ ID NO: 23) and 3'TDH3 (SEQ ID NO: 24) were used as primers, and the annealing temperature of the second step was set.
  • the conditions were basically the same as when the mature CLuc cDNA was amplified except that the temperature was 52 ° C, the extension reaction time was 30 seconds, and the third step was 1 minute.
  • the obtained PCR product was analyzed by 1% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 650 bp was confirmed. Therefore, the obtained PCR product was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted with 40 1 of distilled water using distilled water.
  • the TDH3 promoter DNA fragment thus obtained is hereinafter referred to as “DNA fragment E”.
  • DNA fragment F 2 ⁇ g of pCLuRA was cleaved with Sma I 50 U for 18 hours in a 50 ⁇ 1 reaction solution. After digestion with Sma I, the DNA was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted from the same column with distilled water (40 ⁇ l). Next, the obtained DNA was cleaved with BamHI 50U in a 50 1 reaction solution for 18 hours and then subjected to agarose electrophoresis to recover a vector fragment (about 5 kb). Hereinafter, this vector fragment is referred to as “DNA fragment F”.
  • DNA fragment E and DNA fragment F were ligated and circularized using DNA Ligation Kit ver.2, and then introduced into E. coli DH5a.
  • the obtained transformant was cultured overnight, and then the plasmid was extracted using GenElute PI asmid MiniPrep kit. Further, by analyzing the restriction enzyme cleavage pattern and nucleotide sequence of the extracted plasmid, a transformant carrying the plasmid into which the DNA encoding the TDH3 promoter was inserted was identified.
  • a plasmid (hereinafter referred to as “pC LuRA-TDH3j t”) was prepared from a transformant derived from a plasmid into which a DNA encoding the TDH3 promoter was inserted.
  • Saccharomyces cerevisiae YPH500 strain was transformed with pCLuRA-TDH3.
  • EZ-transformation kit (BIO 101) was used for transformation.
  • the obtained transformant was synthesized from a synthetic agar medium containing no uracil (SD + KHLWade plate).
  • Yeast nitrogen base without amino acids DIFCO
  • glucose 0.02 m g / ml adenine sulfate, 0.02 mg / ml tryptophan, 0.02 mg / ml histidine, 0.03 mg / ml lysine, 0.03 mg / ml leucine, 1.5% agar
  • Transformants harboring pCLuRA-TDH3 obtained as described above were prepared using a synthetic medium without uracil (SD + KHLWade; 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids (DIFCO), 2% glucose, 0.02 mg / ml).
  • SD + KHLWade 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids
  • DIFCO Yeast nitrogen base without amino acids
  • Adenine sulfate, 0.02 mg / ml tryptophan, 0.02 mg / ml histidine, 0.03 mg / ml lysine, 0.03 mg / ml leucine (hereinafter simply referred to as “SD medium”) were inoculated and cultured at 30 ° C.
  • SD media containing 100 mM potassium phosphate buffer adjusted to various pH (pH 4.0, 5.0, 6.0, 6.5) was prepared, and similarly inoculated with a transformant carrying pCLuRA-TDH3.
  • the cells were cultured at ° C.
  • Cypridina luciferin (substrate for luciferase) for luminescence measurement was prepared by using a 66 ⁇ or 100 ⁇ ⁇ stock solution dissolved in 50% ethanol-5 mM HC1 solution with 100 mM Tris-HCl (pH 7.4). It was diluted for use at the time of use.
  • Luminescence intensity due to degradation of Cypridina luciferin by CLuc was determined by adding 80 ⁇ l of 2.5 ⁇ M Cypridina luciferin diluted solution to 20 ⁇ 1 of the culture supernatant prepared as described above, and integrating for 5 seconds. It was measured by. This measured value was divided by the absorbance at 600 ° C. of the culture solution to obtain CLuc activity corrected for the number of yeast cells. The results are shown in Figure 1.
  • RLU / OD on the vertical axis is the value obtained by dividing the relative luminescence intensity of the luminometer by the absorbance at 600 nm. Moreover, the sample of a horizontal axis shows the following samples.
  • the RLU / OD value of each sample is shown as an average value and a standard deviation.
  • the CLuc activity in the culture supernatant was the maximum value, which was optimal.
  • the CLuc activity in these culture supernatant samples was measured at pH 7.4 where the CLuc activity was maximized.
  • culture conditions must be established so that the transformant (transformed yeast) grows and CLuc is not inactivated.
  • the culture supernatant containing a CLuc secreted from the transformant carrying pCLuRA-TDH3 prepared in Example 1 was prepared in the same manner as in Example 1, and the pH of the medium was 6.0.
  • Cypridina luciferin is used as a buffer solution of various pHs (final concentration 1 OO mM phosphate buffer (KPi) or Tris-HCl buffer (Tris-HCl)) to set the pH when measuring CLuc activity.
  • KPi o mM phosphate buffer
  • Tris-HCl Tris-HCl buffer
  • a diluted solution diluted to 2.5 M was used.
  • the Cypridina luciferin diluted solution was added 4 times the culture supernatant.
  • CLuc activity was measured in the same manner as in Example 1. The results are shown in Figure 2A.
  • RLU / OD on the vertical axis is the value obtained by dividing the relative luminescence intensity of the luminometer by the absorbance at 600 nm. RLU / OD values for each sample are shown as mean and standard deviation.
  • SD is a sample using Cypridina luciferin diluted solution diluted with SD medium without buffer
  • DDW is a sample using Cypridina luciferin diluted solution diluted with water.
  • CLuc (a CLuc) was shown to change in activity depending on the salt concentration and pH of the diluted luciferin solution during activity measurement.
  • the maximum CLuc activity was obtained by using a diluted luciferin solution diluted with 100 mM Tris-HCl (pH 7.0 to 8.0).
  • the luciferin concentration at the time of measuring CLuc activity when secreting CLuc in yeast was examined.
  • the culture supernatant containing a CLuc secreted from the transformant having pCLuRA-TDH3 prepared in Example 1 was prepared in the same manner as in Example 1, and the pH of the medium was 6.0.
  • Cypridina luciferin was diluted to various concentrations with lOOmM Tris-HCl (pH 7.4) and diluted to final concentrations of 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, and 4.0 M in the reaction solution.
  • the ethanol concentration used for dissolution was adjusted to be the same as the stock solution.
  • the culture supernatant of the transformant harboring pCLuRA-TDH3 was used in an SD medium containing 100 mM phosphate buffer, stepwise from the stock solution to 10 times, 100 times, 1000 times, and 10000 times. Diluted material was used. That is, assuming that the concentration of the culture supernatant stock solution is 100%, those diluted 10-fold, 100-fold, 1000-fold, and 10000-fold have a culture supernatant concentration of 10%, 1%, 0.1%, 0.01
  • each plot is plotted against various final concentrations of luciferin in the reaction solution.
  • the results using the culture supernatant diluted stepwise with the culture supernatant stock solution as 100% are shown.
  • RLU on the vertical axis indicates the relative luminescence intensity in the luminometer.
  • CLuc activity gave a concentration-response curve that conformed to the Michaelis-Menten equation. It was found that the activity reached saturation when the final concentration of luciferin in the reaction solution was about 1 ⁇ or more.
  • CLuc activity was measured by adding the reaction solution so that the final concentration of luciferin was 2 ⁇ .
  • each plot shows the average and standard deviation of the relative residual activity of each sample for a fixed time incubation at each temperature.
  • the vertical axis represents the relative residual activity with the CLuc activity of the sample without incubation as 100%.
  • CLuc activity was measured after adding 2 ⁇ 1 of chemical substances adjusted to various concentrations to 20 ⁇ 1 of the prepared culture supernatant. The result is shown in FIG.
  • Fig. 6 shows the relative residual activity for various concentrations of chemical substances added to the culture supernatant.
  • the relative residual activity of each sample is shown as an average and standard deviation with the CLuc activity of a sample not containing a chemical substance as 100%.
  • CLuc is not a high concentration of CuSO or high concentration of ethanol.
  • the production amount of CLuc depends on the promoter activity in yeast and the number of yeast cells. Therefore, in order to measure the strength of a yeast promoter using CLuc activity, it is necessary to correct the number of yeast cells. Therefore, it is possible to prepare culture solutions with various cell densities for one type of transformed yeast, measure the activity of CLuc and correct it with turbidity (600 absorbance) as an indicator of cell density. We examined whether it was possible.
  • Example 1 The transformant carrying pCLuRA-TDH3 prepared in Example 1 was cultivated in the same manner as in Example 1. Culturing was performed at 30 ° C for about 48 hours, and a culture solution was obtained when the stationary phase was reached. This culture medium was diluted with a new medium from 1/100 to 1/1000, and the culture was continued again at 30 ° C for about 20 hours.
  • the culture supernatant was prepared and the CLuc activity was measured according to Example 1.
  • 200 1 was collected from the culture broth or culture supernatant, and the turbidity of the culture broth or culture supernatant was measured at 600 absorbance (OD) using a Tecan Sunrise Remote. The results are shown in FIGS. 7A and B.
  • FIG. 7A shows the relative luminescence concentrations for various turbid culture media or culture supernatants.
  • RLU on the vertical axis indicates the relative luminescence density in the luminometer.
  • FIG. 7B shows the average value and standard deviation of RLU / OD for all samples of the culture solution containing the cells shown in FIG. 7A and the culture supernatant obtained by centrifugation from the culture solution.
  • RLU / OD on the vertical axis is the value obtained by dividing the relative luminescence intensity of the luminometer by the absorbance at 600 nm.
  • the CLuc activity is measured while all the 96 samples of CLuc activity are measured by a luminometer after collecting the culture medium. It is required that the value does not fluctuate.
  • the transformant carrying pCLuRA-TDH3 prepared in Example 1 was cultured according to Example 1, and a portion of the yeast culture liquid was used. After collection (sampling), the cells were incubated at 25 ° C for 0, 10, 20, and 30 minutes. After incubation, CLuc activity was measured according to Example 1 in each culture sample. The results are shown in FIG.
  • FIG. 8 shows the relative residual activity with the CLuc activity of the sample measured immediately after sampling as 100%.
  • Figure 8 shows the relative residual activity of each sample as the mean and standard deviation.
  • the method according to the present invention is a reporter assembly system capable of measuring high throughput.
  • Example 9 Establishment of a high-throughput reporter assembly method including co-culture of CLuc-expressing yeast using 96-well deep well plates
  • the transformant harboring pCLuRA-TDH3 prepared in Example 1 was cultured at 30 ° C according to Example 1 to obtain a culture solution that reached the stationary phase. After diluting this culture solution to 1/100 with fresh medium, 1 ml was inoculated into all wells of a 96-well deep well plate, and the culture was continued again at 30 ° C for approximately 16 hours. After each portion of the yeast culture is collected, it is incubated for 0, 10, 20, 30 minutes at 25 ° C. The uc activity was measured according to Example 1. The results are shown in FIG.
  • Fig. 9 shows the mean value and standard deviation of RLU / OD when cultured independently in a 96-well deep well plate and measured for CLuc activity.
  • RLU / OD on the vertical axis is the value obtained by dividing the relative luminescence intensity of the luminometer by the absorbance at 600 nm.
  • the method according to the present invention is a reporter assembly system capable of high-throughput measurement.
  • CLuc As a reporter enzyme in Saccharomyces cerevisiae, the DNA encoding CLuc was redesigned.
  • the amino acid sequence of CLuc was first converted to a nucleotide sequence using the optimal codon of yeast with reference to the frequency of yeast codon usage in Akashi et al. (Genetics 164: 1291-1303 (2003)).
  • the cis sequence contained in the nucleotide sequence encoding CLuc determined in this manner and possibly binding to the yeast transcription factor is downloaded from the website Yeast Promoter Database; SCPD (http://cgsigma.cshl.org Search using / jian /).
  • mCLuc DNA has the same nucleotide sequence as that of CLuc (SEQ ID NO: 2), but has the same amino acid sequence as CLuc (SEQ ID NO: 2). However, in the following, the protein encoded by mCLuc DNA is referred to as “mCLuc”.
  • native_signal_lF is a synthetic DNA having a length of 69 bp further 3 'including the start codon of mCLuc DNA
  • CLuc_mature_lR is a synthetic DNA of the complementary strand of 7 Obp from 60 bp to 129 bp of mCLuc DNA. It is.
  • the two synthetic DNAs contain a 10 bp complementary sequence.
  • the DNA elongation reaction using these two synthetic DNAs consists of 3 ⁇ M of each synthetic DNA, 200 ⁇ M of dNTP (mixed solution of 4 types of deoxynucleotide triphosphates), 100 ⁇ M of MgSO
  • reaction solution 50 1 containing KOD Plus Buffer (IX) and DNA polymerase 1U Using a reaction solution 50 1 containing KOD Plus Buffer (IX) and DNA polymerase 1U, 1st step: 94 ° C for 2 minutes, 2nd step: 94 ° C for 15 seconds (denaturation), 42 ° C A cycle of 30 seconds (annealing) and 30 seconds (extension) at 68 ° C was performed for 35 cycles, and the third step: 68 ° C for 1 minute.
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 130 bp was confirmed.
  • the obtained PCR product was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted with 40 ⁇ 1 of distilled water using the column force of the kit. This eluate is diluted 100 times with distilled water, and this is called “DNA fragment 1”.
  • CLuc_mature_2F is a synthetic DNA having a length of 70 bp from 120 bp to 189 bp of mCLuc DNA, while CLuc_mature_3R is a 70 bp from 180 bp to 249 bp of mCLuc DNA.
  • Synthetic DNA of complementary strand The two synthetic DNAs contain lObp complementary sequences. The DNA elongation reaction using these two synthetic DNAs was performed under exactly the same conditions as the preparation of DNA fragment 1 above.
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 130 bp was confirmed.
  • the obtained PCR product was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted with 40 ⁇ 1 of distilled water using the column force of the kit. This eluate is diluted 100-fold with distilled water, and this is called “DNA fragment 2”.
  • CLuc_mature_4F is a synthetic DNA having a length of 70 bp from 240 bp to 309 bp of mCLuc DNA
  • CLuc-mature-5R is a synthetic DNA of a 70 bp complementary strand from 300 bp to 369 bp of mCLuc DNA.
  • These two synthetic DNAs contain lObp complementary sequences. The DNA elongation reaction using these two synthetic DNAs was performed under exactly the same conditions as the preparation of DNA fragment 1 above.
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 130 bp was confirmed.
  • the obtained PCR product was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted with 40 ⁇ 1 of distilled water using the column force of the kit. This eluate is diluted 100-fold with distilled water, and this is called “DNA fragment 3”.
  • CLuc_mature_6F is a synthetic DNA having a length of 70 bp from 360 bp to 429 bp of mCLuc DNA
  • CLuc-mature-7R is a synthetic DNA of a 70 bp complementary strand from 420 bp to 489 bp of mCLuc DNA.
  • These two synthetic DNAs contain lObp complementary sequences. The DNA elongation reaction using these two synthetic DNAs was performed under exactly the same conditions as the preparation of DNA fragment 1 above.
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 130 bp was confirmed.
  • the obtained PCR product was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted with 40 ⁇ 1 of distilled water using the column force of the kit. This eluate is diluted 100-fold with distilled water, and this is called “DNA fragment 4”.
  • CLuc—mature—8F is a synthetic DNA having a length of 70 bp from 480 bp to 549 bp of mCLuc DNA
  • CLuc_mature_9R is a synthetic DNA of a complementary strand of 70 bp from 540 bp to 609 bp of mCLuc DNA.
  • These two synthetic DNAs contain lObp complementary sequences. The DNA elongation reaction using these two synthetic DNAs was performed under exactly the same conditions as the preparation of DNA fragment 1 above.
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 130 bp was confirmed.
  • the obtained PCR product was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted with 40 ⁇ 1 of distilled water using the column force of the kit. This eluate is diluted 100-fold with distilled water, and this is called “DNA fragment 5”.
  • CLuc_mature_10F is a synthetic DNA having a length of 70 bp from 600 bp to 669 bp of mCLuc DNA
  • CLuc_mature_llR is a synthetic DNA of a complementary strand of 70 bp of 720 bp to 789 bp of mCLuc DNA.
  • These two synthetic DNAs contain an lObp complementary sequence. The DNA elongation reaction using these two synthetic DNAs was carried out under the same conditions as the preparation of DNA fragment 1 above.
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 130 bp was confirmed.
  • the obtained PCR product was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted with 40 ⁇ 1 of distilled water using the column force of the kit. This eluate is diluted 100-fold with distilled water, and this is called “DNA fragment 6”.
  • CLuc_mature_12F is a synthetic DNA having a length of 70 bp from 720 bp to 789 bp of mCLuc DNA
  • CLuc_mature_13R is a synthetic DNA of a complementary strand of 70 bp of 780 bp to 849 bp of mCLuc DNA.
  • These two synthetic DNAs contain an lObp complementary sequence. The DNA elongation reaction using these two synthetic DNAs was carried out under the same conditions as the preparation of DNA fragment 1 above.
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 130 bp was confirmed.
  • the obtained PCR product was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted with 40 ⁇ 1 of distilled water using the column force of the kit. This eluate is diluted 100 times with distilled water, and this is called “DNA fragment 7”.
  • CLuc_mature_14F is a synthetic DNA having a length of 70 bp from 840 bp to 909 bp of mCLuc DNA, while CLuc—mature—15R is a synthetic DNA of the complementary strand of 70 b P from 900 bp to 969 bp of mCLuc DNA. .
  • These two synthetic DNAs contain an lObp complementary sequence. The DNA elongation reaction using these two synthetic DNAs was carried out under the same conditions as the preparation of DNA fragment 1 above.
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 130 bp was confirmed.
  • the obtained PCR product was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted with 40 ⁇ l of distilled water using the column force of the kit. This eluate is diluted 100-fold with distilled water, and this is called “DNA fragment 8”.
  • CAGAAGCAGTCCGCAGCCATTAGTATTTCC SEQ ID NO: 42
  • CLuc_mature_16F is a synthetic DNA having a length of 70 bp from 960 bp to 1029 bp of mCLuc DNA
  • CLuc_mature_17R is a synthetic DNA of a complementary strand of 7 Obp from 1020 bp to 1089 bp of mCLuc DNA.
  • These two synthetic DNAs contain an lObp complementary sequence. The DNA elongation reaction using these two synthetic DNAs was performed under exactly the same conditions as the preparation of DNA fragment 1 above.
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 130 bp was confirmed.
  • the obtained PCR product was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted with 40 ⁇ 1 of distilled water using the column force of the kit. Dilute the eluate 100 times with distilled water. This is called “DNA fragment 9”.
  • CLuc_mature_18F is a synthetic DNA having a length of 70 bp from 1080 bp to 1149 bp of mCLuc DNA
  • CLuc_mature_19R is a synthetic DNA of a 70 bp complementary strand from 1140 bp to 1209 bp of mCLuc DNA.
  • the two synthetic DNAs contain a 10 bp complementary sequence. The DNA elongation reaction using these two synthetic DNAs was carried out under exactly the same conditions as the preparation of DNA fragment 1 above.
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 130 bp was confirmed.
  • the obtained PCR product was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted with 40 ⁇ 1 of distilled water using the column force of the kit. This eluate is diluted 100 times with distilled water, and this is called “DNA fragment 10”.
  • CLuc_mature_20F is a synthetic DNA having a length of 70 bp from 1200 bp to 1269 bp of mCLuc DNA
  • CLuc_mature_21R is a synthetic DNA of a complementary strand of 70 bp from 1260 bp to 1329 bp of mCLuc DNA.
  • the two synthetic DNAs contain a 10 bp complementary sequence. The DNA elongation reaction using these two synthetic DNAs was carried out under exactly the same conditions as the preparation of DNA fragment 1 above.
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 130 bp was confirmed.
  • the obtained PCR product was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted with 40 ⁇ 1 of distilled water using the column force of the kit. This eluate is diluted 100 times with distilled water and is called “DNA fragment 11”.
  • CLuc_mature_22F is a synthetic DNA having a length of 70 bp from 1320 bp to 1389 bp of mCLuc DNA
  • CLuc—mature—23R is a synthetic DNA of a 70 bp complementary strand from 1380 bp to 1449 bp of mCLuc DNA.
  • the two synthetic DNAs contain a 10 bp complementary sequence. The DNA elongation reaction using these two synthetic DNAs was carried out under exactly the same conditions as the preparation of DNA fragment 1 above.
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 130 bp was confirmed.
  • the obtained PCR product was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted with 40 ⁇ 1 of distilled water using the column force of the kit. This eluate is diluted 100 times with distilled water, and this is called “DNA fragment 12”.
  • CLuc_mature_24F is a synthetic DNA having a length of 70 bp from 1440 bp to 1509 bp of mCLuc DNA
  • CLuc_mature_25R is a synthetic DNA of a 70 bp complementary strand from 1500 bp to 1569 bp of mCLuc DNA.
  • the two synthetic DNAs contain a 10 bp complementary sequence.
  • the DNA elongation reaction using these two synthetic DNAs was carried out under exactly the same conditions as the preparation of DNA fragment 1 above. [0241]
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 130 bp was confirmed.
  • the obtained PCR product was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted with 40 ⁇ 1 of distilled water using the column force of the kit. This eluate is diluted 100-fold with distilled water, and this is called “DNA fragment 13”.
  • CLuc_mature_26F is a synthetic DNA having a length of 70 bp from 1560 bp to 1629 bp of mCLuc DNA
  • CLuc_mature_27R is a synthetic DNA of a 44 bp complementary strand containing a termination codon TAG from 1620 bp to 1663 bp of mCLuc DNA.
  • the two synthetic DNAs contain 1 Obp of complementary sequence. The DNA elongation reaction using these two synthetic DNAs was performed under exactly the same conditions as the preparation of DNA fragment 1 above.
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about lOObp was confirmed.
  • the obtained PCR product was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted with 40 ⁇ l of distilled water using the column force of the kit. This eluate is diluted 100-fold with distilled water, and this is called “DNA fragment 14”.
  • DNA fragments 1 to 14 obtained in the above (1) were ligated using the overlap PCR method.
  • DNA fragment 1 and DNA fragment 2 were ligated by PCR using native_signal_lF (SEQ ID NO: 25) and CLuc_mature_3R (SEQ ID NO: 28) as primers.
  • PCR consists of 300 nM of each primer, dNTP (mixed solution of 4 types of deoxynucleotide triphosphates) 200 ⁇ M, MgSO 100 ⁇ , and DNA fragment 1 and DNA fragment 2 as a cage 1 ⁇ 1
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 250 bp was confirmed. Subsequently, the entire amount of the obtained PCR product was electrophoresed on a 2% agarose gel, a band of about 250 bp was cut out, and a DNA fragment was extracted by a gel extraction method using phenol / chloroform. The obtained DNA fragment was dissolved in 201 distilled water and then diluted 100 times with distilled water. This is called “DNA fragment 15”.
  • DNA fragment 3 and DNA fragment 4 were ligated by PCR using CLuc_mature_4F (SEQ ID NO: 29) and CLuc_mature_7R (SEQ ID NO: 32) as primers.
  • PCR using these primers was carried out under the same conditions as PCR in 2-1 above, except that 1 ⁇ l each of DNA fragment 3 and DNA fragment 4 was used as a cage.
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 250 bp was confirmed. Subsequently, the entire amount of the obtained PCR product was electrophoresed on a 2% agarose gel, a band of about 250 bp was cut out, and a DNA fragment was extracted by a gel extraction method using phenol / chloroform. The obtained DNA fragment was dissolved in 201 distilled water and then diluted 100 times with distilled water. This is called “DNA fragment 16”.
  • DNA fragment 5 and DNA fragment 6 were ligated by PCR using CLuc_mature_8F (SEQ ID NO: 33) and CLuc_mature_llR (SEQ ID NO: 36) as primers.
  • PCR using these primers was carried out under the same conditions as in PCR 2-1, except that 1 ⁇ l each of DNA fragment 5 and DNA fragment 6 was used as a saddle type.
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 250 bp was confirmed. Subsequently, the entire amount of the obtained PCR product was electrophoresed on a 2% agarose gel, a band of about 250 bp was cut out, and a DNA fragment was extracted by a gel extraction method using phenol / chloroform. The obtained DNA fragment was dissolved in 201 distilled water and then diluted 100 times with distilled water. This is called “DNA fragment 17”. [0257] 2-4. Ligation of DNA fragment 7 and DNA fragment 8
  • DNA fragment 7 and DNA fragment 8 were ligated by PCR using CLuc_mature_12F (SEQ ID NO: 37) and CLuc_mature_15R (SEQ ID NO: 40) as primers.
  • PCR using these primers was performed under the same conditions as PCR in 2-1 above, except that 1 ⁇ l each of DNA fragment 7 and DNA fragment 8 was used as a saddle type.
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 250 bp was confirmed. Subsequently, the entire amount of the obtained PCR product was electrophoresed on a 2% agarose gel, and about
  • DNA fragment 18 A 250 bp band was cut out, and DNA fragments were extracted by gel extraction using phenol's black mouth form. The obtained DNA fragment was dissolved in 201 distilled water and then diluted 100 times with distilled water. This is called “DNA fragment 18”.
  • DNA fragment 9 and DNA fragment 10 were ligated by PCR using CLuc_mature_16F (SEQ ID NO: 41) and CLuc_mature_19R (SEQ ID NO: 44) as primers.
  • PCR using these primers was carried out under the same conditions as PCR in 2-1 above, except that 1 ⁇ l each of DNA fragment 9 and DNA fragment 10 was used as a cage.
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 250 bp was confirmed. Subsequently, the entire amount of the obtained PCR product was electrophoresed on a 2% agarose gel, and about
  • DNA fragment 19 A 250 bp band was cut out, and DNA fragments were extracted by gel extraction using phenol's black mouth form. The obtained DNA fragment was dissolved in 201 distilled water and then diluted 100 times with distilled water. This is called “DNA fragment 19”.
  • DNA fragment 11 and DNA fragment 12 were ligated by PCR using CLuc_mature_20F (SEQ ID NO: 45) and CLuc_mature_23R (SEQ ID NO: 48) as primers.
  • PCR using these primers was carried out under the same conditions as PCR in 2-1 above, except that 1 ⁇ l each of DNA fragment 11 and DNA fragment 12 was used as a saddle type.
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 250 bp was confirmed. Subsequently, the entire amount of the obtained PCR product was electrophoresed on a 2% agarose gel, and about
  • DNA fragment 20 A 250 bp band was excised, and the DNA was broken by gel extraction using phenol and black mouth form. A piece was extracted. The obtained DNA fragment was dissolved in 201 distilled water and then diluted 100 times with distilled water. This is called “DNA fragment 20”.
  • DNA fragment 13 and DNA fragment 14 were ligated by PCR using CLuc_mature_24F (SEQ ID NO: 49) and CLuc_mature_27R (SEQ ID NO: 52) as primers.
  • PCR using these primers was carried out under the same conditions as PCR in 2-1 above except that 1 ⁇ l each of DNA fragment 13 and DNA fragment 14 was used as a saddle type.
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 230 bp was confirmed. Subsequently, the entire amount of the obtained PCR product was electrophoresed on a 2% agarose gel, and about
  • DNA fragment 21 A 230 bp band was cut out, and DNA fragments were extracted by gel extraction using phenol 'Kuroguchi form. The obtained DNA fragment was dissolved in 201 distilled water and then diluted 100 times with distilled water. This is called “DNA fragment 21”.
  • DNA fragment 16 and DNA fragment 17 were ligated by PCR using CLuc_mature_4F (SEQ ID NO: 29) and CLuc_mature_llR (SEQ ID NO: 36) as primers.
  • PCR using these primers was carried out under the same conditions as PCR in 2-1 above except that 1 ⁇ l each of DNA fragment 16 and DNA fragment 17 was used as a saddle type.
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 490 bp was confirmed. Subsequently, the entire amount of the obtained PCR product was electrophoresed on a 2% agarose gel, and about
  • DNA fragment 22 A 490 bp band was cut out, and DNA fragments were extracted by gel extraction using phenol 'Kuroguchi form. The obtained DNA fragment was dissolved in 201 distilled water and then diluted 100 times with distilled water. This is called “DNA fragment 22”.
  • DNA fragment 18 and DNA fragment 19 were ligated by PCR using CLuc_mature_12F (SEQ ID NO: 37) and CLuc_mature_19R (SEQ ID NO: 44) as primers.
  • PCR using these primers was carried out under the same conditions as PCR in 2-1 above, except that 1 ⁇ l each of DNA fragment 18 and DNA fragment 19 was used as a saddle type.
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a fragment of about 490 bp was confirmed. It was. Subsequently, the entire amount of the obtained PCR product was electrophoresed on a 2% agarose gel, a band of about 490 bp was cut out, and a DNA fragment was extracted by a gel extraction method using phenol's black mouth form. The obtained DNA fragment was dissolved in 201 distilled water and then diluted 100 times with distilled water. This is called “DNA fragment 23”.
  • DNA fragment 20 and DNA fragment 21 were ligated by PCR using CLuc_mature_20F (SEQ ID NO: 45) and CLuc_mature_27R (SEQ ID NO: 52) as primers.
  • PCR using these primers was carried out under the same conditions as PCR in 2-1 above, except that 1 ⁇ l each of DNA fragment 20 and DNA fragment 21 was used as the saddle type.
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 470 bp was confirmed. Subsequently, the entire amount of the obtained PCR product was electrophoresed on a 2% agarose gel, a band of about 470 bp was cut out, and a DNA fragment was extracted by a gel extraction method using phenol'clomouth form. The obtained DNA fragment was dissolved in 201 distilled water and then diluted 100 times with distilled water. This is called “DNA fragment 24”.
  • DNA fragment 15 and DNA fragment 22 were ligated by PCR using native_signal_lF (SEQ ID NO: 25) and CLuc_mature_llR (SEQ ID NO: 36) as primers.
  • PCR was carried out using 300 nM of each primer, 200 ⁇ M of dNTP (mixed solution of 4 types of deoxynucleotide triphosphates), 100 ⁇ of MgSO, and DNA fragment 15 and DNA fragment 22 as a cage 1
  • the obtained PCR product was analyzed by 1% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 730 bp was confirmed. Subsequently, the entire amount of the obtained PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel, a band of about 730 bp was cut out, and a DNA fragment was extracted by a gel extraction method using phenol'clomouth form. The obtained DNA fragment was dissolved in 201 distilled water and then diluted 100 times with distilled water. This is called “DNA fragment 25”. [0281] 2-12. Ligation of DNA fragment 23 and DNA fragment 24
  • DNA fragment 23 and DNA fragment 24 were ligated by PCR using CLuc_mature_12F (SEQ ID NO: 37) and CLuc_mature_27R (SEQ ID NO: 52) as primers.
  • PCR using these primers was carried out under the same conditions as in PCR 2-11 above, except that 1 ⁇ l each of DNA fragment 23 and DNA fragment 24 was used as a cage.
  • the obtained PCR product was analyzed by 1% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 950 bp was confirmed. Subsequently, the entire amount of the obtained PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel, and about
  • DNA fragment 26 A 950 bp band was cut out, and DNA fragments were extracted by gel extraction using phenol 'Kuroguchi form. The obtained DNA fragment was dissolved in 201 distilled water and then diluted 100 times with distilled water. This is called “DNA fragment 26”.
  • DNA fragment 25 and DNA fragment 26 were ligated by PCR using the following primers.
  • mCLuc_3'XbaI is a sequence that includes an Xba I site on the 5 'side of a sequence complementary to 19bp 5' upstream, including the termination codon TGA of mCLuc DNA.
  • PCR was performed using 300 nM of each primer, 200 ⁇ M of dNTP (mixed solution of 4 types of deoxynucleotide triphosphates), 100 ⁇ of MgSO, and DNA fragment 25 and DNA fragment 26 as a cage 1
  • the obtained PCR product was analyzed by 1% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 1600 bp was confirmed. Subsequently, the entire amount of the obtained PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel, a band of about 1600 bp was cut out, and a DNA fragment was extracted by a gel extraction method using phenol's black mouth form. The obtained DNA fragment was dissolved in 201 distilled water. This is called “DNA fragment 2 7”. [0288] (3) Preparation of plasmid containing mCLuc DNA
  • E. coli retaining pZErO-2-mCLuc obtained in 3-1 above was inoculated into 50 ml of a liquid medium containing LB kanamycin (50 ⁇ g / ml) and cultured with shaking at 37 ° C. for 16 hours. After completion of the culture, plasmid DNA was prepared using the GeneElute Plasmid midi prep kit according to the attached protocol, the absorbance value at OD260 nm was measured, and the DNA concentration was quantified.
  • Inverse_SalI_F is a salt that matches 20 bp 3 'downstream from the position 50 bp upstream 5' from the Spe I site. It contains the base sequence, and Sal I site is attached to the 5 'side.
  • Inverse_HindIII-Sal_R contains sequences complementary to the base sequence 5 bp upstream 21 bp 5 ′ upstream from the Spe I site, 5 ′ upstream 21 bp, and Hind III site and Sal I site on the 5 ′ side. Is attached.
  • PCR was performed using 300 nM of each primer, dNTP (mixed solution of 4 deoxynucleotide triphosphates) 200 ⁇ M, MgSO 100 ⁇ , 5% DMSO, and pCLuRA 10 ng ⁇ KOD Plus.
  • dNTP mixed solution of 4 deoxynucleotide triphosphates
  • the obtained PCR product was analyzed by 1% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 7 kbp was confirmed.
  • the resulting PCR product was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the column force DNA of the kit was eluted with distilled water 401.
  • the eluted DNA solution was cleaved with Sal I 50U for 18 hours in the 50 1 reaction solution. After digestion with Sal I, purification was performed using the GenElute PCR clean-up kit. Finally, the column force of the kit was eluted with 40 1 of distilled water.
  • a portion of the resulting eluate was ligated and circularized using a DNA Ligation kit, and then introduced into E. coli DH5a.
  • the obtained transformant was cultured in anther culture, and then the plasmid was extracted using GenElute plasmid MiniPrep kit.
  • the extracted plasmid was analyzed for restriction enzyme cleavage patterns and nucleotide sequences to identify transformants that retained the plasmid with the target sequence added.
  • This plasmid DNA was cleaved with Hind III 50U for 18 hours in a 50 ⁇ l reaction solution. After digestion with Hind III, purification was performed using the GenElute PCR clean-up kit. Finally, the column force DNA of the kit was eluted with 40 ⁇ 1 of distilled water. Then, the DNA was cleaved with Sal I 50U in a 50 1 reaction solution for 18 hours, purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted from the column of the kit with distilled water 40 ⁇ 1. This is called “pCLuRA + Hind Ill-Sal I DNA fragment”.
  • SV40 poly (A) X2 DNA fragment a DNA fragment in which two SV40 poly (A) signals were linked in tandem (hereinafter referred to as “SV40 poly (A) X2 DNA fragment”), PCR was performed with the following two primer pairs.
  • polyA—HindllL F Jijiji Chome ⁇ Chome Chome ⁇ Chome ⁇ Chome Chome ⁇ (Sequence No. 57)
  • polyA_HindIII_F is a primer with a Hind III site attached to the 5 ′ side of the 20 bp sequence 3 ′ from the 5 ′ end of the SV40 poly (A) signal.
  • polyA_SacII_R is a primer with a Sac II site added to the 5 'side of the sequence complementary to the 20 bp base sequence 5' to the 3 'end of the SV40 poly (A) signal.
  • PCR was performed using 300 nM of each primer, dNTP (mixed solution of 4 types of deoxynucleotide triphosphates) 200 ⁇ M, 100 ⁇ of MgSO, SV40 genome DNA (manufactured by Invitrogen) 10 n
  • the obtained PCR product was analyzed by 1% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 500 bp was confirmed.
  • the resulting PCR product was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted with distilled water 40 1 using the column force of the kit.
  • the eluted DNA solution was cleaved in 50 1 reaction solution with Sac II 50U for 18 hours. After digestion with Sac II, purification was performed using the GenElute PCR clean-up kit. Finally, the column force of the kit was eluted with 40 1 of distilled water. This DNA fragment is called “SV40 poly (A) — 5 ′”.
  • PCR was performed using the following primers.
  • polyA SacII— F: Joji Doji 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 (SEQ ID NO: 59)
  • polyA_SacII_F is a primer with a Sac I I site attached to the 5 ′ side of the 20 bp sequence 3 ′ from the 5 ′ end of the SV40 poly (A) signal.
  • polyA_SalI_R is a primer in which a Sal I site is added to the 5 ′ side of a sequence complementary to the 20 bp base sequence on the 3 ′ end 5 ′ side of the SV40 03 ⁇ 4 ⁇ ) signal.
  • PCR consists of 300 nM of each primer, dNTP (mixed solution of 4 types of deoxynucleotide triphosphates) 200 ⁇ M, MgSO 100 ⁇ , SV40 genome DNA (manufactured by Invitrogen) 10 n
  • the obtained PCR product was analyzed by 1% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 500 bp was confirmed.
  • the resulting PCR product was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted with distilled water 40 1 using the column force of the kit.
  • the eluted DNA solution was cleaved in 50 1 reaction solution with Sac II 50U for 18 hours. After digestion with Sac II, purification was performed using the GenElute PCR clean-up kit. Finally, the column force of the kit was eluted with 40 1 of distilled water. This DNA fragment is called “SV40 poly (A) — 3 ′”.
  • the obtained SV40 poly (A) _5 'and SV40 poly (A) _3' were ligated using a DNA Ligation Kit. After completion of the ligation reaction, use the polyA_HindIILF primer (SEQ ID NO: 57) and polyA_SalI_R primer (SEQ ID NO: 60) in the vertical direction with 1 ⁇ 1 of the reaction product as in the above SV40 poly (A) _5 ′. PCR was performed under conditions.
  • the obtained PCR product was analyzed by 1% agarose electrophoresis, and a band of about lkbp that was considered to be the target DNA fragment was confirmed. All PCR products were electrophoresed with 1% agarose, a band of about 1 kbp was cut out, and a DNA fragment was extracted by gel extraction method using phenol's black mouth form. The obtained DNA fragment was dissolved in 201 distilled water.
  • This DNA fragment and the aforementioned linearized pZErO-2 plasmid 1 ⁇ l were ligated and circularized using a DNA Ligation kit, and then introduced into E. coli DH5a. After the obtained transformant was cultured for a while, the plasmid was extracted using GenElute plasmid MiniPrep kit. In addition, the extracted plasmid retains the plasmid inserted with the SV40 poly (A) X2 DNA fragment (hereinafter referred to as “pZEr ⁇ -2_SV40 poly (A) X2”) by analyzing the restriction enzyme cleavage pattern and nucleotide sequence. The transformed transformants were identified.
  • the pCLuRA + Hind Ill-Sal I DNA fragment and the SV40 poly (A) X2 DNA fragment were ligated and circularized using DNA Ligation kit, and then introduced into E. coli DH5a. After the obtained transformant was cultured in a cocoon, the plasmid was extracted using GenElute plasmid MiniPrep kit. Further, the extracted plasmid was analyzed by analyzing the restriction enzyme cleavage pattern and the nucleotide sequence, and a transformant carrying the plasmid inserted with the DNA encoding the target gene was discriminated. This plasmid DNA is called “pCLuRA + SV40 poly (A) X2j”.
  • X2 was cleaved with Sma I 50U for 18 hours in a 50 ⁇ l reaction solution. After digestion with Sma I, purification was performed using the GenElute PCR clean-up kit. Finally, DNA was eluted from the column of the kit with 40 1 distilled water. Next, the DNA was cut in 50 ⁇ 1 reaction solution with Xba I 50 U for 18 hours, purified using GenElute PCR clean-up kit, and finally the column force of the same kit was eluted with 40 ⁇ 1 of distilled water. .
  • the above-mentioned mCLuc DNA fragment and pUG35-MET25-EGFP3 + SV40 poly (A) X2 were ligated using a DNA Ligation kit and then introduced into E. coli DH5a. After the obtained transformant was cultured in a cocoon, the plasmid was extracted using the GenElute plasmid MiniPrep kit. The extracted plasmid was analyzed for restriction enzyme cleavage patterns and nucleotide sequences to identify transformants that had the plasmid inserted with the DNA encoding the gene of interest. The plasmid in which the mCLuc DNA fragment is inserted at the target position is called “pmCLuRA”.
  • pmCLuRA was cleaved with Sma I 50U for 18 hours in a 50 ⁇ l reaction. After digestion with Sma I, purification was performed using the GenElute PCR clean-up kit. Finally, DN ⁇ was eluted from the column of the kit with 40 ⁇ l of distilled water. The DNA is then cleaved with Bam HI 50U in a 50 ⁇ 1 reaction for 18 hours, purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally DNA is eluted from the column with 40 ⁇ 1 of distilled water. did.
  • the promoter of Saccharomyces cerevisiae ACT1 (systematic gene name: YFL039C) gene (SEQ ID NO: 61: “ACT1 promoter” and! ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ) was incorporated into pmCLuRA.
  • the ACT1 promoter is an untranslated region 5 ′ upstream of the ACT1 gene, that is, a region sandwiched between the ACT1 gene and the YPT1 gene, which is 5 ′ upstream adjacent gene of the ACT1 gene (Yeast Genome Database http (See http://www.yeastgenome.org/).
  • 3'ACT1 TGTTAATTCAGTAAATTTTCGATCTTG (SEQ ID NO: 63;)
  • the 5′ACTl_Spe I primer is a sequence in which a Spe restriction enzyme site is added 5 ′ to 17 bases 3 ′ downstream of the stop codon of YPT1 ORF upstream of ACT1 ORF 5 ′.
  • the 3′ACT1 primer is a 27-base complementary sequence 5 ′ upstream from the ACT1 0RF start codon. Please refer to the yeast genome database (http://www.yeastgenome.org/) for the location of the primer.
  • PCR was performed using Saccharomyces cerevisiae S288C genomic DNA as the saddle type, 5'ACTl_Spe I (SEQ ID NO: 62) and 3'ACT1 (SEQ ID NO: 63) as primers, and the annealing temperature in the second step was 48.
  • the procedure was basically the same as in the case of synthesizing the mature CLuc cDNA (Example 1) except that the elongation reaction time was 1 minute at 1 ° C. and the third step was 2 minutes.
  • the obtained PCR product was analyzed by 1% agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 670 bp was confirmed. Therefore, the PCR product obtained was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted with 40 1 of distilled water using distilled water.
  • the obtained DNA solution is cleaved with Spe I 50U in 50 ⁇ 1 reaction solution for 18 hours, purified using GenElute PCR clean-up kit, and finally the column force of the kit is eluted with distilled water 40 1 did.
  • This DNA fragment is referred to as “ACT1 promoter DNA fragment”.
  • ACT1 promoter DNA fragment and pmCLuRA Speto Sma I fragment were ligated and circularized using DNA Ligatiion kit, and then introduced into E. coli DH5a.
  • the plasmid was extracted using the GenElute plasmid MiniPrep kit. Further, the extracted plasmid was subjected to analysis of restriction enzyme cleavage pattern and nucleotide sequence to identify a transformant holding the plasmid inserted with the DNA encoding the ACT1 promoter.
  • a plasmid (hereinafter referred to as “pmCLuRA-ACT1” t) was prepared from a transformant having a plasmid inserted with DNA encoding the ACT1 promoter.
  • the promoter of Saccharomyces cerevisiae ADH1 (systematic gene name: YOL086C) gene (SEQ ID NO: 64, hereinafter referred to as “ADH1 promoter” !!) was incorporated into pmCLuRA.
  • the ADH1 promoter is an untranslated region 5 ′ upstream of the ADH1 gene, that is, a region sandwiched between the ADH1 gene and the YOL085C gene, which is a 5 ′ upstream adjacent gene of the ADH1 gene (Yeast Genome Database http : ⁇ www.yeastgenome.org/).
  • the sequences of the PCR primers (5'ADHl_BamHI and 3'AD HI) for isolating the ADH1 promoter were as follows.
  • 5'ADH1 BamH I: CCCAGGATCCGTATACTAGAAGAATGAGCC (SEQ ID NO: 65) 3'ADH1: TGTATATGAGATAGTTGATTGTATG (SEQ ID NO: 66)
  • the 5′ADHl_Bam HI primer is a sequence in which a Bam HI restriction enzyme site is added 5 ′ to the 20 ′ base 3 ′ downstream of the termination codon of the YOL085C ORF 5 ′ upstream of the ADH1 ORF.
  • the 3 ′ AD HI primer is a complementary sequence of 25 bases 5 ′ upstream from the ADH1 ORF start codon. Please refer to the yeast genome database (http://www.yeastgenome.org/) for the location of the primers.
  • PCR was carried out in the above 1-2 except that 5'ADHl_Bam HI (SEQ ID NO: 65) and 3'ADH1 (SEQ ID NO: 6 6) were used as primers and the annealing temperature in the second step was 52 ° C. This was performed under basically the same conditions as when the ACT1 promoter was synthesized.
  • the obtained PCR product was analyzed by 1% agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about llOObp was confirmed. Therefore, the obtained PCR product was purified using GenElute PCR clean-up kit, and finally DNA was eluted with 40 1 of distilled water using distilled water. The resulting DNA solution was cleaved with Bam HI 50U for 18 hours in a 50 ⁇ 1 reaction solution, purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the column force of the kit was eluted with 40 1 of distilled water. . This DNA fragment is called “ADH1 promoter DNA fragment”.
  • the ADH1 promoter DNA fragment and the pmCLuRA Bam HI-Sma I fragment were ligated and circularized using a DNA Ligation kit, and then introduced into E. coli DH5a.
  • the plasmid was extracted using the GenElute plasmid MiniPrep kit. Further, the extracted plasmid was analyzed for restriction enzyme cleavage patterns and nucleotide sequences to identify transformants that retained the plasmid inserted with the DNA encoding the ADH1 promoter. From form transformants which the DNA encoding the ADH1 promoter retains the inserted plasmid, plasmid (hereinafter, "P MCLuRA- ADH1" t, U) was prepared.
  • a promoter of CYC1 (systematic gene name: YJR048) of Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 67: hereinafter referred to as “CYC1 promoter”) was incorporated into pmCLuRA.
  • CYC1 promoter is an untranslated region 5 ′ upstream of the CYC1 gene, that is, a region sandwiched between the CYC1 gene and the ANB1 gene, which is the 5 ′ upstream adjacent gene of the CYC1 gene (yeast genome database). http://www.yeastgenome.org/).
  • the 5′CYCl_Bam HI primer is a sequence in which a Bam HI restriction enzyme site is added to the 5 ′ side of 20 bases 3 ′ downstream of the stop codon of ANB1 ORF upstream of CYC1 ORF 5 ′.
  • the 3′CYC1 primer is a complementary sequence of 25 bases 5 ′ upstream from the CYC1 ORF start codon. Please refer to the yeast genome database (http://www.yeastgenome.org/) for the location of the primers.
  • PCR was basically performed under the same conditions as those for the synthesis of the ADH1 promoter in 1-3 above, except that 5'CYCl_BamHI (SEQ ID NO: 68) and 3'CYC1 (SEQ ID NO: 69) were used as primers. I went there.
  • the obtained PCR product was analyzed by 1% agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 950 bp was confirmed. Therefore, the obtained PCR product was purified using GenElute PCR clean-up kit, and finally DNA was eluted with 40 1 of distilled water using distilled water. The resulting DNA solution was cleaved with Bam HI 50U for 18 hours in a 50 ⁇ 1 reaction solution, purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the column force of the kit was eluted with 40 1 of distilled water. . This DNA fragment is called “CYC1 promoter DNA fragment”.
  • the CYC1 promoter DNA fragment and the pmCLuRA Bam HI-Sma I fragment were ligated using a DNA Ligation kit and then introduced into E. coli DH5a.
  • the plasmid was extracted using the GenElute plasmid MiniPrep kit. The extracted plasmid was analyzed for restriction enzyme cleavage patterns and nucleotide sequences to identify transformants that retained the plasmid inserted with the DNA encoding the CYC1 promoter.
  • P MCLuRA- CYC1 plasmid
  • TEF1 promoter A promoter of Saccharomyces cerevisiae TEF1 (systematic gene name: YPR080W) gene (SEQ ID NO: 70, hereinafter referred to as “TEF1 promoter” !!) was incorporated into pmCLuRA.
  • the TEF1 promoter is an untranslated region 5 ′ upstream of the TEF1 gene, that is, a region sandwiched between the TEF1 gene and the MRL1 gene, which is the 5 ′ upstream adjacent gene of the TEF1 gene (Yeast Genome Database http : //www.yeastgenome.org/).
  • 5'TEF1 BamH I: CCCAGGATCCACAATGCATACTTTGTACG (SEQ ID NO: 71) 3'TEF1: TTTGTAATTAAAACTTAGATTAGATTGC (SEQ ID NO: 72)
  • the 5 ′ TEFl_Bam HI primer is a sequence in which a Bam HI restriction enzyme site is added 5 ′ to TEF1 ORF 5 and 19 bases 3 ′ downstream of the termination codon of the upstream MRL1 ORF.
  • the 3 ′ TEF1 primer is a complementary sequence of 28 bases 5 ′ upstream from the TEF1 ORF start codon. Please refer to the yeast genome database (http://www.yeastgenome.org/) for the location of the primer.
  • PCR was performed under basically the same conditions as in the case of synthesizing the ADH1 promoter in 1-3 above, except that 5'TEFl_Bam HI (SEQ ID NO: 71) and 3'TEF1 (SEQ ID NO: 72) were used as primers. went.
  • the obtained PCR product was analyzed by 1% agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 580 bp was confirmed. Therefore, the obtained PCR product was purified using GenElute PCR clean-up kit, and finally DNA was eluted with 40 1 of distilled water using distilled water. The resulting DNA solution was cleaved with Bam HI 50U for 18 hours in a 50 ⁇ 1 reaction solution, purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the column force of the kit was eluted with 40 1 of distilled water. . This DNA fragment is called “TEF1 promoter DNA fragment”.
  • the TEF1 promoter DNA fragment and the pmCLuRA Bam HI-Sma I fragment were ligated using a DNA Ligation kit and then introduced into E. coli DH5a.
  • the plasmid was extracted using the GenElute plasmid MiniPrep kit.
  • the extracted plasmid was analyzed by restriction enzyme cleavage pattern and nucleotide sequence analysis. Transformants carrying plasmids with inserted DNA encoding the EF1 promoter were identified. From form transformants which the DNA encoding the TEF1 promoter retains the inserted plasmid, plasmid (hereinafter, "P MCLuRA- TEF1" t, U) was prepared.
  • CUP1 promoter (systematic gene name: YHR053C) gene of Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 73, hereinafter referred to as “CUP1 promoter” !) was incorporated into pmCLuRA.
  • CUP1 promoter is an untranslated region 5 ′ upstream of the CUP1 gene, that is, a region sandwiched between the CUP1 gene and the YHR054C gene, which is the 5 ′ upstream adjacent gene of the CUP1 gene (Yeast Genome Database http : ⁇ www.yeastgenome.org/).
  • 5'CUP1 BamH I: CCCAGGATCCTAAGCCGATCCCATTAC (selfie column number 74)
  • the 5 ′ CUPl_Bam HI primer is a sequence in which a Bam HI restriction enzyme site is added to the 5 ′ side at 17 bases 3 ′ downstream of the stop codon of YHR054C ORF upstream of CUP1 ORF 5 ′.
  • the 3′CUP1 primer is a complementary sequence of 30 bases 5 ′ upstream from the CUP1 ORF start codon. Refer to the yeast genome database (http://www.yeastgenome.org/) for the positions of the primers.
  • PCR was performed under basically the same conditions as in the case of synthesizing the ADH1 promoter in 1-3 above, except that 5'CUPl_Bam HI (SEQ ID NO: 74) and 3'CUP1 (SEQ ID NO: 75) were used as primers. went.
  • the obtained PCR product was analyzed by 1% agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 460 bp was confirmed. Therefore, the obtained PCR product was purified using GenElute PCR clean-up kit, and finally DNA was eluted with 40 1 of distilled water using distilled water. The resulting DNA solution was cleaved with Bam HI 50U for 18 hours in a 50 ⁇ 1 reaction solution, purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the column force of the kit was eluted with 40 1 of distilled water. . This DNA fragment is called “CUP1 promoter DNA fragment”.
  • the CUP1 promoter DNA fragment and the pmCLuRA Bam HI-Sma I fragment were combined with DNA Liga
  • the mixture was introduced into E. coli DH5a.
  • the plasmid was extracted using the GenElute plasmid MiniPrep kit.
  • the extracted plasmid was analyzed for restriction enzyme cleavage patterns and nucleotide sequences to identify transformants that retained the plasmid inserted with the DNA encoding the CUP1 promoter. From form transformants which the DNA encoding the CUP1 promoter retains the inserted plasmid, plasmid (hereinafter, "P MCLuRA- CUP1" t, U) was prepared.
  • the promoter of Saccharomyces cerevisiae GAL1 (systematic gene name: YBR020W) gene (SEQ ID NO: 76: “GAL1 promoter” and! ⁇ ⁇ ) was incorporated into pmCLuRA.
  • the GAL1 promoter is an untranslated region 5 ′ upstream of the GAL1 gene, that is, a region sandwiched between the GAL1 gene and the GAL10 gene, which is the 5 ′ upstream adjacent gene of the GAL1 gene (Yeast Genome Database http: //www.yeastgenome.org/).
  • 5'GAL1 Se I: CCCAACTAGTACGGATTAGAAGCCGCCGAG (Self column number 77) 3'GAL1: GGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAG (SEQ ID NO: 78)
  • the 5′GALl_Spe I primer is a sequence in which a Spe restriction enzyme site is added 5 ′ to 20 bases 3 ′ downstream of the GAL1 ORF stop codon upstream of GAL1 ORF 5 ′.
  • the 3′GAL1 primer is a complementary sequence 24 bases 5 ′ upstream from the GAL1 ORF start codon. Please refer to the yeast genome database (http://www.yeastgenome.org/) for the location of the primer.
  • PCR was basically performed under the same conditions as those for the synthesis of the ADH1 promoter in 1-3 above, except that 5'GALl_Spe I (SEQ ID NO: 77) and 3'GAL1 (SEQ ID NO: 78) were used as primers. I went there.
  • the obtained PCR product was analyzed by 1% agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 450 bp was confirmed. Therefore, the obtained PCR product was purified using GenElute PCR clean-up kit, and finally DNA was eluted with 40 1 of distilled water using distilled water.
  • the obtained DNA solution is cleaved with Spe I 50U for 18 hours in a 50 ⁇ 1 reaction solution and then used with the GenElute PCR clean-up kit. After purification, DNA was also eluted with 40 1 of distilled water. This DNA fragment is called “GAL1 promoter DNA fragment”.
  • the GAL1 promoter DNA fragment and the pmCLuRA Spe I-Sma I fragment were ligated and circularized using a DNA Ligati on kit, and then introduced into E. coli DH5a.
  • the plasmid was extracted using the GenElute plasmid MiniPrep kit. Further, the extracted plasmid was subjected to analysis of restriction enzyme cleavage pattern and nucleotide sequence to identify a transformant holding the plasmid inserted with the DNA encoding the GA L1 promoter.
  • a plasmid (hereinafter referred to as “pmCLuRA-GAL1” t) was prepared from a transformant carrying a plasmid in which a DNA encoding the GAL1 promoter was inserted.
  • HSP12 promoter The promoter of Saccharomyces cerevisiae HSP12 (systematic gene name: YFL014W) gene (SEQ ID NO: 79: hereinafter referred to as “HSP12 promoter” !!) was incorporated into pmCLuRA.
  • HSP12 promoter is an untranslated region 5 ′ upstream of the HSP12 gene, that is, a region sandwiched between the HSP12 gene and the YFL015W-A gene, which is the 5 ′ upstream adjacent gene of the HSP12 gene (yeast genome database). http: ⁇ www.yeastgenome.org/).
  • the 5'HSP12_Bam HI primer is a sequence in which a Bam HI restriction enzyme site is added to the 5 'side of 17 bases 3' downstream of the terminal codon of the YFL015W-A ORF upstream of the HSP12 ORF 5 '.
  • the 3′H SP12 primer is a complementary sequence 30 bases 5 ′ upstream from the HSP12 ORF start codon. Please refer to the yeast genome database (http: ⁇ www.yeastgenome.org/) for the location of the primers.
  • PCR was basically performed under the same conditions as in the case of synthesizing the ADH1 promoter in 1-3 above, except that 5'HSP12_Bam HI (SEQ ID NO: 80) and 3'HSP12 (SEQ ID NO: 81) were used as primers. I went there.
  • the obtained PCR product was analyzed by 1% agarose gel electrophoresis to obtain about 610 bp of DNA. The fragment was confirmed. Therefore, the obtained PCR product was purified using GenElute PCR clean-up kit, and finally DNA was eluted with 40 1 of distilled water using distilled water. The resulting DNA solution was cleaved with Bam HI 50U for 18 hours in a 50 ⁇ 1 reaction solution, purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the column force of the kit was eluted with 40 1 of distilled water. . This DNA fragment is called “HSP12 promoter DNA fragment”.
  • the HSP12 promoter DNA fragment and the pmCLuRA Bam HI-Sma I fragment were ligated and circularized using a DNA Ligation kit, and then introduced into E. coli DH5a.
  • the plasmid was extracted using the GenElute plasmid MiniPrep kit. The extracted plasmid was analyzed for restriction enzyme cleavage patterns and nucleotide sequences to identify transformants that retained the plasmid inserted with the DNA encoding the HSP12 promoter. From form transformants which the DNA encoding the HSP12 promoter retains the inserted plasmid, plasmid (hereinafter, "P mCLuRA- HSP1 2" t, U) was prepared.
  • the TDH3 promoter DNA fragment isolated in Example 1 and the pmCLuRA Bam ⁇ -SmaI fragment were ligated using a DNA Ligation kit and then introduced into E. coli DH5a.
  • the obtained transformant was cultured in anther culture, and then the plasmid was extracted using the GenElute plasmid MiniPrep kit.
  • the extracted plasmid was analyzed for restriction enzyme cleavage patterns and nucleotide sequences to identify transformants carrying the plasmid inserted with the DNA encoding the TDH3 promoter.
  • a plasmid (hereinafter referred to as “pmCLuRA-TDH 3 ”) was prepared from a transformant retaining a plasmid inserted with DNA encoding the TDH3 promoter.
  • pmCLuRA—ACT1, pmCLuRA—ADH1, pmCLuRA—CYC1, pmCLuRA—TDH3, pmCL uRA-TEF1, pmCLuRA-CUP1, pmCLuRA-GAL1 and pmCLuRA-HSP12 did.
  • EZ-transformation (BIO101) was used for transformation.
  • the obtained transformant was applied to amber agar medium (SD + KHLadeW) without uracil.
  • the cells were cultured at 30 ° C for 3 days.
  • the mCLuc activity obtained by dividing the relative luminescence intensity by the absorbance at 600 nm means the relative value of the transcription activity of each promoter.
  • FIG. 10 “cell” was measured using mCLuc activity measured using a culture solution containing yeast cells, and “sup.” was measured using a culture supernatant obtained by centrifuging the culture solution at 15,000 rpm. Shows mCLuc activity.
  • Promoter (—) indicates the result of a transformant having V and plasmid containing no promoter.
  • -galactosidase cDNA was prepared by PCR using the following primer.
  • the LacZ_5′SmaI_F primer is a sequence in which the Sma I restriction enzyme site is attached to the 20 ′ base 3 ′ downstream of the start codon 3 ′ of the j8-galactosidase ORF.
  • the LacZ_3′XbaI_R primer is a complementary sequence of 19 bases 5 ′ upstream from the end codon of j8-galactosidase ORF.
  • PCR was performed using pJM133 DNA (Genes Develop., 7, 833-843 (1993) 10 ng as the saddle type, LacZ_5'SmaI_F (SEQ ID NO: 82) and LacZ_3'XbaI_R (SEQ ID NO: 83) as primers. Except for the 2 step annealing temperature of 52 ° C, the extension reaction time of 4 minutes, and the 3rd step of 8 minutes, basically the same conditions as in the case of the above mature CLuc cDNA synthesis (Example 1) were used. Line [0365] The obtained PCR product was analyzed by 1% agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 3.3 kbp was confirmed.
  • the obtained PCR product was purified using GenElute PCR clean-up kit, and finally DNA was eluted with 40 1 of distilled water using distilled water.
  • the obtained DNA solution was cleaved with Sma I 50U for 18 hours in a 50 ⁇ 1 reaction solution, purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted with 40 1 distilled water. .
  • the resulting DNA solution was digested in 50 ⁇ 1 reaction solution with Xba I 50 U for 18 hours, purified using GenElute PCR clean-up kit, and finally the column force of the kit was eluted with 40 1 distilled water. did. This DNA fragment is called “j8-galatatosidase DNA fragment”.
  • This 13-galatatosidase DNA fragment and pUG35-MET25-EGFP3 + SV40 poly (A) X2 1 ⁇ l were ligated using a DNA Ligation kit and then introduced into Escherichia coli DH5a. After the obtained transformant was cultured in a cocoon, the plasmid was extracted using the GenElute plasmid miniPrep kit. The extracted plasmid was analyzed for restriction enzyme cleavage patterns and nucleotide sequences to identify transformants that had the plasmid inserted with the DNA encoding ⁇ -galatatosidase. A plasmid (hereinafter referred to as “pGALuRA”) was prepared from a transformant having a plasmid in which a DNA encoding ⁇ -galatatosidase was inserted.
  • pGALuRA plasmid
  • E. coli harboring pGALuRA was inoculated into 50 ml of a liquid medium containing LB ampicillin (50 ⁇ g / ml) and cultured with shaking at 37 ° C for 16 hours. After completion of the culture, plasmid DNA was prepared using the GenElute Plasmid midi prep kit according to the attached protocol, the absorbance value at OD260 nm was measured, and the DNA concentration was quantified.
  • ACT1 promoter DNA fragment Similar to the incorporation of various promoters into pmCLuRA in (1) above, ACT1 promoter DNA fragment, ADH1 promoter DNA fragment, CYC1 promoter DNA fragment, TDH3 promoter DNA fragment, TEF1 promoter DNA fragment, CUP1 promoter DNA fragment, GAL1 promoter DNA The fragment and the HSP12 promoter DNA fragment were each incorporated into pGALu RA.
  • the resulting plasmids were ⁇ pGALuRA-ACTl '', ⁇ pGALuRA-ADH1 '', ⁇ pGALuRA-CYC1 '', ⁇ pGALuRA-TDH3 '', ⁇ pGALuRA-TEF1 '', ⁇ pGALuR A-CUP1J '', ⁇ pGALuRA-GAL1 '' It is called “pGALuRA-HSP12”.
  • pGALuRA—ACT1, pGALuRA—ADH1, pGALuRA—CYC1, pGALuRA—TDH3, pGAL uRA-TEF1, pGALuRA-CUP1, pGALuRA-GALl and pGALuRA-HSP12 using each of the Saccharomyces 500 did.
  • EZ-transformation (BIO101) was used for transformation.
  • the obtained transformant was spread on a synthetic agar medium (SD + KHLadeW) containing no uracil and cultured at 30 ° C for 3 days.
  • the absorbance at 420 nm was measured. Based on the obtained value, the promoter activity was calculated by a calculation formula of OD420 X1.7 / (0.0045 X protein amount X extract amount X time). That is, j8-galactosidase activity means the relative value of transcriptional activity of each promoter.
  • FIG. 11 “Promoter (—)” shows the result of a transformant having a promoter /! Plasmid.
  • Example 12 Comparison of the results of reporter assembly with mCLuc and the results of intracellular mRNA measurement It was examined by quantifying the amount of mCLuc mRNA that the results of the assay using the reporter plasmid pmCLuRA in Example 11 reflected the expression level of mRNA in the cells.
  • the TDH3 gene was selected as a control gene required for mRNA measurement by real-time PCR, and its ORF was cloned into pZErO-2 to serve as a control plasmid. TDH3 gene was obtained by PCR using the following primer.
  • TDH3 CDS— F: ATGGTTAGAGTTGCTATTAACGGTTTCG (SEQ ID NO: 84)
  • TDH3 CDS— R: TTAAGCCTTGGCAACGTGTTCAACCAAG (SEQ ID NO: 85)
  • the TDH3_CDS_F primer is a 28 bp sequence 3 ′ downstream from the start codon of TDH3 ORF.
  • the TDH3_CDS_R primer is a complementary sequence 28 bp 5 ′ upstream from the stop codon of TDH3 ORF.
  • PCR was performed using Saccharomyces cerevisiae S288C genomic DNA lng as the vertical type, TDH3_CDS_F (SEQ ID NO: 84) and TDH3_CDS_R (SEQ ID NO: 85) as primers, and the annealing temperature of the second step at 55 ° C and extension reaction Except for the time of 1 minute and the 3rd step of 2 minutes, the procedure was basically the same as in the case of synthesizing the mature CLuc cDNA (Example 1).
  • the obtained PCR product was analyzed by 1% agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about lkbp was confirmed. Therefore, the PCR product obtained was purified using the GenElute PCR clean-up kit. Finally, the column force of the kit was also eluted with distilled water 40 1.
  • the obtained DNA and the aforementioned linearized pZErO-2 were ligated and cyclized using a DNA Ligation kit, and then introduced into E. coli DH5a.
  • the obtained transformant was cultured overnight, and then the plasmid was extracted using the GenElute plasmid MiniPrep kit.
  • the extracted plasmid was analyzed for restriction enzyme cleavage patterns and nucleotide sequences to identify transformants that retained the plasmid inserted with DNA encoding TDH3 ORF. This plasmid is called “pZEr 0-2-TDH3 ORFJ”.
  • primers for real-time PCR were designed using Primer Express, a primer design software from ABI.
  • the mCLuc_RT_F primer has a base sequence from 1009 bp to 1025 bp, 3 ′ downstream from the start codon of mCLuc ORF.
  • the mCLuc_RT_R primer is a complementary nucleotide sequence from 1045 bp to 1066 bp, 3 ′ downstream of the starting codon force of mCLuc ORF.
  • the TDH3_RT_F primer has a base sequence from 632 bp to 653 bp, 3 ′ downstream from the start codon of TDH3 ORF.
  • the TDH3_RT_R primer is a complementary base sequence from 674 bp to 694 bp 3 ′ downstream from the start codon of TDH3 ORF.
  • Real-time PCR was performed using a Power SYBR Green PCR Master Mix manufactured by ABI in a reaction solution of 20 ⁇ 1 (10 ⁇ 1 master mix, 50 ⁇ of each primer and 5 ng of cDNA). PCR was performed in 40 cycles of the first step: 95 ° C for 10 minutes and the second step: 95 ° C for 15 seconds (denaturation) and 60 ° C for 60 seconds (anneal extension). The results are shown in FIG. The results shown in Fig. 12 are the results of relative quantification of the amount of mCLuc mRNA using the value of the control plasmid as the internal standard. It is fruit.
  • CUP1 systematic gene name: YHR053C
  • YHR053C Saccharomyces cerevisiae
  • the CUP1 promoter is a copper ion inducible promoter. Therefore, using p mCLuRA-CUPl, we examined whether induction of mCLuc! In addition, a similar experiment was performed using
  • Saccharomyces cerevisiae GAL1 (systematic gene name: YBR020W) gene is known to induce its expression in the absence of darucose galactose (West, RWJ, et al., Mol. Cell Biol, 4: 2467-2478 (1984)). That is, the GALl promoter is a galactose inducible promoter. Therefore, we examined whether the induction was observed in mCLuc using pmCLuRA-GAL1. A similar experiment was also conducted using ⁇ -galactosidase for comparison.
  • each well contains 1% 2% galactose SC + KHLadeW (SC + KHLadeW is SD + KH in Example 1) LWade excluding glucose) Inoculated into a 96-well deep well plate supplemented with 200 mM KPi synthetic liquid medium or SD + KHLadeW 2 OOmM KPi synthetic liquid medium, and cultured with shaking at 30 ° C.
  • SC + KHLadeW is SD + KH in Example 1
  • Example 14A 32 hours after the start of the culture, a part of the culture solution was collected, and according to the method of Example 1, the absorbance at 600 nm (OD600) and the relative luminescence intensity (RLU) of the luminometer were measured. From the obtained values, the activity of each promoter was numerically calculated in the same manner as in Example 11. As a control, a similar experiment was performed for a transformant having pmCLuRA-TDH3. The results are shown in FIG. 14A.
  • a promoter of the Saccharomyces cerevisiae TDH3 (systematic gene name: YGR192C) gene has several regulatory sequences important for expression regulation in its base sequence (J BC, 1994, 269: 6153-6162). And Figure 15). Therefore, when these sequences were removed, it was examined whether the corresponding promoter activity could be detected using mCLuc.
  • the TDH3 promoter (-471) is 5 'upstream from the start codon of TDH3 ORF-486 bp to-474 bp.By removing this existing Fermentable caroon source-dependent upstream activation sequence (UA Sl * l), its promoter activity is reduced. It is a promoter sequence designed to investigate how it fluctuates.
  • a TDH3 promoter (-471) was obtained by PCR using the following primers and 3'TDH3 primer (SEQ ID NO: 24).
  • TDH3-47LF AAGAGGATCCAATGGAGCCCGCTTTTTAAG (SEQ ID NO: 90)
  • TDH3- 471_F primer is Bam from 20 bases 3 'downstream from 471 bases 5' upstream of TDH3 ORF This is a sequence with an H-restricted enzyme site added to the 5 'side. Please refer to the yeast genome database (http://www.yeastgenome.org/) for the positions of the primers!
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 470 bp was confirmed. Therefore, the obtained PCR product was purified using GenElute PCR clean-up kit, and finally DNA was eluted with 40 1 of distilled water using distilled water. The resulting DNA solution was cleaved with Bam HI 50U for 18 hours in a 50 ⁇ 1 reaction solution, purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the column force of the kit was eluted with 40 1 of distilled water. . This DNA fragment is called “TDH3 promoter ( ⁇ 471) DNA fragment”.
  • the TDH3 promoter (-471) DNA fragment and the pmCLuRA Bam HI-Sma I fragment were ligated and circularized using a DNA ligation kit, and then introduced into E. coli DH5a. After the obtained transformant was cultured in a cocoon, the plasmid was extracted using the GenElute plasmid MiniPrep kit. The extracted plasmid was analyzed for restriction enzyme cleavage patterns and nucleotide sequences to identify transformants carrying the plasmid inserted with the DNA encoding the TDH3 promoter (-471). A plasmid (hereinafter referred to as “pmCLuRA-TDH3 (-471)”) was prepared from a transformant having a plasmid inserted with a DNA encoding the TDH3 promoter (-471).
  • the TDH3 promoter (-423) removes the existing Fermentable caroon source-dependent upstream activation sequence (UAS1 * 2) and the above UAS1 * 1 from 5 'upstream to 448bp to 436bp from the start codon of TDH3 ORF. Thus, it is a promoter sequence designed to investigate how its promoter activity varies.
  • TDH3 promoter motor (-423) was obtained by PCR using the following primers and 3'TDH3 primer (SEQ ID NO: 24).
  • TDH3- 423 F: AAGAGGATCCAGAATCCCAGCACCAAAATA (SEQ ID NO: 91)
  • the TDH3-423_F primer is a sequence in which a Bam H restriction enzyme site is added to the 5 ′ side of 20 bases 3 ′ downstream from the 423 bases 5 ′ upstream of the TDH3 ORF. Please refer to the yeast genome database (http://www.yeastgenome.org/) for the positions of the primers!
  • PCR was performed using Saccharomyces cerevisiae S288C genomic DNA lng as the saddle type, TDH3-423_F (SEQ ID NO: 91) and 3'TDH3 (SEQ ID NO: 24) as primers, and the annealing temperature of the second step at 54 °. C. Except for the extension reaction time of 1 minute and the third step of 2 minutes, the procedure was basically the same as in the case of synthesizing the mature CLuc cDNA (Example 1).
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 420 bp was confirmed. Therefore, the obtained PCR product was purified using GenElute PCR clean-up kit, and finally DNA was eluted with 40 1 of distilled water using distilled water. The resulting DNA solution was cleaved with Bam HI 50U for 18 hours in a 50 ⁇ 1 reaction solution, purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the column force of the kit was eluted with 40 1 of distilled water. . This DNA fragment is referred to as “TDH3 promoter (-423) DNA fragment”.
  • the TDH3 promoter (-423) DNA fragment and the pmCLuRA Bam HI-Sma I fragment were ligated and circularized using a DNA ligation kit, and then introduced into E. coli DH5a. After the obtained transformant was cultured in a cocoon, the plasmid was extracted using the GenElute plasmid MiniPrep kit. The extracted plasmid was analyzed for restriction enzyme cleavage patterns and nucleotide sequences to identify transformants carrying the plasmid inserted with the DNA encoding the TDH3 promoter (-423). A plasmid (hereinafter referred to as “pmCLuRA-TDH3 (-423)”) was prepared from a transformant having a plasmid inserted with DNA encoding the TDH3 promoter (-423).
  • TDH3 promoter removes the existing fermentable caroon source-dependent upstream repression sequence (U RS) and the above UAS1 * 1 and UAS1 * 2 from 5 'upstream to 431bp to 419bp from the start codon of TDH3 ORF Thus, it is a promoter sequence designed to investigate how the promoter activity fluctuates.
  • a TDH3 promoter motor (-411) was obtained by PCR using the following primers and 3'TDH3 primer (SEQ ID NO: 24).
  • TDH3-411 F: AAGAGGATCCTGTTTTCTTCACCAACCATC (SEQ ID NO: 92)
  • the TDH3-411_F primer is a sequence in which a Bam H restriction enzyme site is added to the 5 ′ side at 20 bases 3 ′ downstream from the 411 bases 5 ′ upstream of the TDH3 ORF. Please refer to the yeast genome database (http://www.yeastgenome.org/) for the positions of the primers!
  • PCR was performed using Saccharomyces cerevisiae S288C genomic DNA lng as the saddle type, TDH3-411_F (SEQ ID NO: 92) and 3'TDH3 (SEQ ID NO: 24) as primers, and the annealing temperature in the second step at 54 °. C. Except for the extension reaction time of 1 minute and the third step of 2 minutes, the procedure was basically the same as in the case of synthesizing the mature CLuc cDNA (Example 1).
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 410 bp was confirmed. Therefore, the obtained PCR product was purified using GenElute PCR clean-up kit, and finally DNA was eluted with 40 1 of distilled water using distilled water. The resulting DNA solution was cleaved with Bam HI 50U for 18 hours in a 50 ⁇ 1 reaction solution, purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the column force of the kit was eluted with 40 1 of distilled water. . This DNA fragment is called “TDH3 promoter ( ⁇ 411) DNA fragment”.
  • the TDH3 promoter (-411) DNA fragment and the pmCLuRA Bam HI-Sma I fragment were ligated and circularized using a DNA ligation kit, and then introduced into E. coli DH5a. After the obtained transformant was cultured in a cocoon, the plasmid was extracted using the GenElute plasmid MiniPrep kit. The extracted plasmid was analyzed for restriction enzyme cleavage patterns and nucleotide sequences to identify transformants that retained the plasmid inserted with the DNA encoding the TDH3 promoter (-411). A plasmid (hereinafter referred to as “pmCLuRA-TDH3 (-411)”) was prepared from a transformant having a plasmid inserted with DNA encoding the TDH3 promoter ( ⁇ 411).
  • the TDH3 promoter (-295) is 5 'upstream from the start codon of TDH3 ORF-305 bp to 297 bp [This non- fermentable caroon source-dependent upstream activation sequenc e (UAS2) is a promoter sequence designed to investigate how the promoter activity fluctuates by removing UAS1 * 1, UAS1 * 2 and URS.
  • a TDH3 promoter motor (-295) was obtained by PCR using the following primers and 3'TDH3 primer (SEQ ID NO: 24).
  • TDH3- 295 F: AAGAGGATCCGGAGTAAATGATGACACAAG (ia ⁇ lJ ⁇ -93)
  • the TDH3-295_F primer is a sequence in which a Bam H restriction enzyme site is added to the 5 ′ side of 20 bases 3 ′ downstream from 295 bases 5 ′ upstream of the TDH3 ORF. Please refer to the yeast genome database (http://www.yeastgenome.org/) for the positions of the primers!
  • PCR was performed using Saccharomyces cerevisiae S288C genomic DNA lng as the saddle type, TDH3-295_F (SEQ ID NO: 93) and 3'TDH3 (SEQ ID NO: 24) as primers, and the annealing temperature in the second step at 54 °. C. Except for the extension reaction time of 1 minute and the third step of 2 minutes, the procedure was basically the same as in the case of synthesizing the mature CLuc cDNA (Example 1).
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 290 bp was confirmed. Therefore, the obtained PCR product was purified using GenElute PCR clean-up kit, and finally DNA was eluted with 40 1 of distilled water using distilled water. The resulting DNA solution was cleaved with Bam HI 50U for 18 hours in a 50 ⁇ 1 reaction solution, purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the column force of the kit was eluted with 40 1 of distilled water. . This DNA fragment is called "TDH3 promoter (-295) DNA fragment".
  • the TDH3 promoter (-295) DNA fragment and the pmCLuRA Bam HI-Sma I fragment were ligated and circularized using a DNA ligation kit, and then introduced into E. coli DH5a. After the obtained transformant was cultured in a cocoon, the plasmid was extracted using the GenElute plasmid MiniPrep kit. The extracted plasmid was analyzed for restriction enzyme cleavage patterns and nucleotide sequences to identify transformants carrying the plasmid inserted with the DNA encoding the DH3 promoter (-295). From transformant DNA encoding the TDH3 promoter (-295) to hold the inserted plasmid, plasmid (hereinafter, "pmCLuRA- TDH 3 (- 295)" hereinafter) was made by the tone.
  • the obtained transformant was applied to a synthetic agar medium (SD + KHLadeW) containing no uracil and cultured at 30 ° C for 3 days.
  • the promoter of the Saccharomyces cerevisiae GAL1 (systematic gene name: YBR020W) gene has four GAL4 binding regions important for regulation of expression in the base sequence (corresponding to “GAL4” in FIG. 16).
  • GAL4 GAL4 binding regions important for regulation of expression in the base sequence
  • GAL1 promoter (-396) change its promoter activity by removing the GAL4 binding region that repeats 3 times from the start codon of GAL1 ORF 5 'upstream from -451 bp to -397 bp? Promoter sequence designed to investigate.
  • GAL1 promoter motor (-396) was obtained by PCR using the following primers and a 3'GAL1 primer (SEQ ID NO: 78).
  • GAL1- 396 F: AAGAGGATCCTGCGTCCTCGTCTTCACCGG (SEQ ID NO: 94)
  • the GAL1-396_F primer is a sequence in which a Bam HI restriction enzyme site is added 5 ′ to 20 bases 3 ′ downstream of the 396 bp position 5 ′ upstream from the GAL1 ORF start codon. Please refer to the yeast genome database (http: ⁇ www.yeastgenome.org/) for the location of the primers.
  • PCR was performed using Saccharomyces cerevisiae S288C genomic DNA lng as a saddle, GAL1-396_F (SEQ ID NO: 94) and 3'GAL1 (SEQ ID NO: 78) as primers, and the annealing temperature of the second step was 54 °. C. Except for the extension reaction time of 1 minute and the third step of 2 minutes, the procedure was basically the same as in the case of synthesizing the mature CLuc cDNA (Example 1).
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 390 bp was confirmed. Therefore, the obtained PCR product was purified using GenElute PCR clean-up kit, and finally DNA was eluted with 40 1 of distilled water using distilled water. The resulting DNA solution was cleaved with Bam HI 50U for 18 hours in a 50 ⁇ 1 reaction solution, purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the column force of the kit was eluted with 40 1 of distilled water. . This DNA fragment is called a “GAL1 promoter ( ⁇ 396) DNA fragment”.
  • the GAL1 promoter (-396) DNA fragment and the pmCLuRA Bam HI-Sma I fragment were ligated and circularized using a DNA Ligation kit, and then introduced into Escherichia coli DH5a. After the obtained transformant was cultured in a cocoon, the plasmid was extracted using the GenElute plasmid MiniPrep kit. The extracted plasmid was analyzed for restriction enzyme cleavage patterns and nucleotide sequences to identify transformants that retained the plasmid inserted with the DNA encoding the GAL1 promoter (-396).
  • a plasmid (hereinafter referred to as “pmCLuRA-GAL1 (-396)”) was prepared from a transformant having a plasmid inserted with a DNA encoding the GAL1 promoter ( ⁇ 396).
  • the promoter activity of the GAL1 promoter can be reduced by removing the GAL4 binding region that exists independently from -349 bp to -332 bp 5 'upstream from the start codon of the GAL1 ORF and the GAL4 binding region repeated three times above. It is a plug motor arrangement designed to investigate how it fluctuates.
  • a GAL1 promoter motor (-288) was obtained by PCR using the following primers and 3'GAL1 primer (SEQ ID NO: 78).
  • GAL1- 288 F: AAGAGGATCCGAAAAATTGGCAGTAACCTG (SEQ ID NO: 95)
  • the GAL1-288_F primer is a sequence in which a Bam HI restriction enzyme site is added to the 5 ′ side at 20 bases 3 ′ downstream from the 288 bp position 5 ′ upstream from the GAL1 ORF start codon.
  • a Bam HI restriction enzyme site is added to the 5 ′ side at 20 bases 3 ′ downstream from the 288 bp position 5 ′ upstream from the GAL1 ORF start codon.
  • yeast genome database http: ⁇ www.yeastgenome.org/
  • Saccharomyces cerevisiae S288C genomic DNA lng was used as the saddle type, GAL1-288_F (SEQ ID NO: 95) and 3'GAL1 (SEQ ID NO: 78) were used as primers, and the annealing temperature in the second step was 54 °. C. Except for the extension reaction time of 1 minute and the third step of 2 minutes, the procedure was basically the same as in the case of synthesizing the mature CLuc cDNA (Example 1).
  • the obtained PCR product was analyzed by 2% agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 390 bp was confirmed. Therefore, the obtained PCR product was purified using GenElute PCR clean-up kit, and finally DNA was eluted with 40 1 of distilled water using distilled water. The resulting DNA solution was cleaved with Bam HI 50U for 18 hours in a 50 ⁇ 1 reaction solution, purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the column force of the kit was eluted with 40 1 of distilled water. . This DNA fragment is called “GAL1 promoter ( ⁇ 288) DNA fragment”.
  • the GAL1 promoter (-288) DNA fragment and the pmCLuRA Bam HI-Sma I fragment were ligated and circularized using a DNA Ligation kit, and then introduced into Escherichia coli DH5a. After the obtained transformant was cultured in a cocoon, the plasmid was extracted using the GenElute plasmid MiniPrep kit. Further, the extracted plasmid was subjected to analysis of restriction enzyme cleavage pattern and nucleotide sequence to identify transformants carrying the plasmid inserted with the DNA encoding the GAL1 promoter (-288). A plasmid (hereinafter referred to as “pmCLuRA-GAL1 (-288)”) was prepared from a transformant carrying a plasmid in which DNA encoding the GAL1 promoter ( ⁇ 288) was inserted.
  • pmCLuRA-GAL1 (-396), pmCLuRA-GAL1 (-288) and pmCLuRA-GAL1 (see Fig. 16)
  • the Saccharomyces cerevisiae YPH500 strain was transformed with each of the three plasmids (corresponding to “-451”).
  • EZ-transformation (BIO101) was used for transformation.
  • the obtained transformant was applied to a sputum synthesis agar medium (SD + KHLadeW) containing uracil and cultured at 30 ° C for 3 days.
  • SD + KHLadeW sputum synthesis agar medium
  • Example 11 From the obtained values, the activity of each plug motor was numerically calculated in the same manner as in Example 11. The results are shown in FIG. For comparison, the results of measurement of CLuc activity using a culture medium of a transformant having DNA encoding mCLuc linked to the TDH3 promoter are shown.
  • the values measured using mCLuc as a reporter enzyme varied greatly depending on the presence or absence of a cis sequence considered to be involved in the transcriptional activity in the TDH3 promoter and GAL1 promoter.
  • the correlation between the measured values of this promoter fragment and mCLuc reporter assay was in good agreement with the results described in JBC, 1994, 269: 6153-6162. From these results, it was found that the method using mCLuc as a reporter enzyme can be used in experiments for examining sequences related to transcriptional activity by sequentially shortening the same promoter as in the conventional method.
  • the codon that originally encodes the amino acid is located 3 'downstream in the case of the insertion or deletion of the position or base. It may be a stop codon (called “nonsense mutation”).
  • nonsense mutation a stop codon
  • CLuc was used to establish a simpler and more sensitive method.
  • the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 97 is a sequence comprising a coding region of the third exon of the rat Apo E gene and a stop codon at the 3 'end.
  • the plasmid pCLuRA prepared in Example 1 is used to connect the ⁇ -factor secretion signal peptide DNA of the DNA encoding CLuc and the mature CLuc DNA. A restriction enzyme site was introduced between them. Therefore, PCR was performed using the following primers.
  • aCL_inv_5 is the Hind I 5 'side of the 28th base of the 2nd 68th base of DNA (SEQ ID NO: 13) encoding a CLuc (the first codon of mature CLuc). This is a sequence with restriction sites of II and Sph I.
  • the aCL_inv_3'-Hind primer is 26 bp from the 242nd base of DNA (SEQ ID NO: 13) encoding a CLuc (26 bp from the 3 'end of a fat secretion signal peptide DNA (SEQ ID NO: 11)).
  • This is a complementary sequence with 1 base G and Hind III restriction enzyme site added to its 5 'side.
  • This 1-base G is a reporter plasmid that has not been homologously recombined with an exogenous DNA fragment (in the following, Apoe (+) or ApoE (-)) in the following in vivo recombination step (see below).
  • PCR was performed using an aCLjnv_5, -Hind-Sph primer (SEQ ID NO: 98) and an aCLjnv_3, -Hind primer (SEQ ID NO: 99) to prepare 5% DMSO in the reaction solution.
  • the obtained PCR product was analyzed by 1% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 7 kbp was confirmed. Therefore, the obtained PCR product was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was also eluted with distilled water 401 using the column force of the kit.
  • the obtained DNA solution was cleaved with 50 U of Hind III in the 50 1 reaction solution for 18 hours, purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted with distilled water 40 1 with the column strength of the kit. This DNA fragment is called “pC LuTr DNA fragment”.
  • the pCLuTr DNA fragment was ligated and self-circularized using a DNA Ligation kit, and then introduced into E. coli DH5a.
  • the obtained transformant was cultured overnight, and then the plasmid was extracted using the GenElute plas mid MiniPrep kit.
  • the extracted plasmid was analyzed by restriction enzyme digestion pattern and nucleotide sequence analysis, and the pCLuTr DNA fragment was circulated into the plasmid. Transformants that retained the host (hereinafter referred to as “pCLuTr”) were identified.
  • PCLuTr was prepared from the transformant retaining pCLuTr.
  • the ApoE-aCL_gapF primer is 39 bp from the 229th base of the DNA encoding a CLuc (SEQ ID NO: 13) (39 bp from the 3 'end of the a-factor secretion signal peptide DNA (SEQ ID NO: 1 1)).
  • the coding region (SEQ ID NO: 97) contained in the 3rd exon of the rat Apo E gene has 21 bp from the first base.
  • the ApoE-aCL_gapR primer is 268 bp from the start codon of a CLuc ORF (lbp of the first codon of mature CLuc) 3 ′ downstream of the rat Apo E gene 3 ′ downstream of the complementary sequence 40 bp
  • PCR was performed using ApoE-aCL_gapF primer (SEQ ID NO: 100) and ApoE-aCL_gapR primer. 1 (SEQ ID NO: 101), add 5% DMSO to the reaction mixture, mold 10 ng of rat genomic DNA in a cage, 1st step: 94 ° C for 2 minutes, 2nd step: 94 ° C 15 cycles (denaturation), 30 seconds at 50 ° C (single ring) and 1 minute (extension) at 68 ° C for 35 cycles, and 3rd step: 2 minutes at 68 ° C for 2 minutes
  • the above-mentioned mature CLuc cDNA was synthesized under basically the same conditions as in the case of synthesis (Example 1).
  • the obtained PCR product was analyzed by 1% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 800 bp was confirmed. Therefore, the obtained PCR product was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted with 40 1 of distilled water using distilled water. This DNA fragment was designated as “ApoE (+)”.
  • ApoE- aCL gapR— NC: GAACTGTGTTTGGTGGATCAGGTTCGTAAGGACAGTCC TGTCATTGATTCTCCAGGGGCACTG (SEQ ID NO: 102)
  • the ApoE-aCL_gapR_NC primer is the coding region (SEQ ID NO: 97) contained in the 3rd exon of the rat Apo E gene at the 3 ′ side of the complementary sequence from 268 bp to 3 ′ downstream 40 bp from the initiation codon of a CLuc ORF. It is a sequence to which a complementary sequence of the 704th to 726th base sequences has been added.
  • PCR is the same as that of Apo E (+) except that the ApoE-aCL_gapF primer (SEQ ID NO: 100) and the ApoE-aCL_gapR_NC primer (SEQ ID NO: 102) were used.
  • the obtained PCR product was analyzed by 1% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 800 bp was confirmed. Therefore, the obtained PCR product was purified using the GenElute PCR clean-up kit, and finally the DNA was eluted with 40 1 of distilled water using distilled water. This DNA fragment was designated as “ApoE ( ⁇ )”.
  • the obtained solutions containing Apo E (+) or Apo E (-) DNA fragments were each diluted stepwise and subjected to 1% agarose gel electrophoresis. Calculate the intensity of the band from the obtained electrophoretic image, and calculate Apo E (+) (not including the termination codon) and Apo E (-) (including the termination codon). Dilution was performed so that the DNA fragments had the same concentration. The OD 260 of the obtained diluted DNA fragment was measured, and the DNA concentration was quantified. Furthermore, Apo E (+) and Apo E (-) DNA fragments were mixed in equal amounts, respectively, and Apo E (+/-) (Apo E (+) and Apo E (-) were 1: 1). Was made.
  • CLuc is secreted and has activity even when expressed as a fusion protein with a protein encoded by the third exon of the rat Apo E gene. And became a force.
  • CLuc activity corrected by turbidity when using Apo E (+) was corrected by turbidity of Apo E (-) (sequence containing a stop codon).
  • the CLuc activity was very small and the CLuc activity corrected for the turbidity of Apo E (+/-) showed almost half of the value of Apo E (+).
  • the plasmid construction using yeast in vivo recombination used in this Example Z The yeast transformant preparation method is very simple.
  • reporter assembly using CLuc the promoter, It is considered that any kind of DNA such as genes can be quickly incorporated into a reporter plasmid, and it has been shown that a reporter assembly using CLuc can be used for noise throughput.
  • automation using a dispensing robot for example, Beckman BIOMEK 200 has succeeded!
  • SEQ ID NO: 13 is a gene encoding a fusion protein.
  • SEQ ID NO: 14 is a fusion protein.
  • SEQ ID NO: 15 is a synthetic gene.
  • SEQ ID NOs: 20 and 21 are oligo DNAs.
  • SEQ ID Nos: 25 to 52 are synthetic DNAs.
  • SEQ ID NO: 97 is the coding region for the third exon of the rat Apo E gene and a termination codon at the 3 'end.

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Abstract

　簡便で、且つ高感度なレポーターアッセイ方法を提供することを目的とする。 　分泌型発光酵素をレポータータンパク質として用いて、外来遺伝子又は外来DNA断片の発現、機能、転写活性又は転写制御機能を評価する。

Description

分泌型発光酵素を用いたレポーターアツセィ
技術分野
[0001] 本発明は、例えば、分泌型発光酵素をレポータータンパク質として使用するレポ一 ターアツセィ方法に関する。
背景技術
[0002] レポーターアツセィとは、例えば、プロモーターなどの転写開始に必要な DNA配列 によってレポータータンパク質をコードする遺伝子 (以下、「レポーター遺伝子」と!、う） 力も転写された mRNAの合成量を直接又は間接的に測定するための方法である。一 般的に、レポーターアツセィでは、プロモーターの 3'下流に特定のレポーター遺伝子 を連結し、これをプラスミドとして、あるいは染色体に挿入することにより、形質転換体 を構築する。
[0003] レポーターアツセィにおいて、通常、プロモーターの 3'下流に連結した特定のレポ 一ター遺伝子力 合成される mRNAを定量することは容易ではない。そこで、その mR NAの情報を読み取って合成されるタンパク質の量を測定対象にすることが多 ヽ。こ の際、合成されたタンパク質の量を簡便に測定するために、レポータータンパク質と して酵素を用い、その酵素活性値を、最初の mRNA合成量の相対値を意味する値と みなす方法が一般的である。レポーターアツセィにおいては、最終的に測定される酵 素活性が最初のプロモーターの転写活性と相関があると、一般に受け入れられてい る。
[0004] ところで、従来、レポーターアツセィの必要性のある研究は多 、。このような研究とし ては、例えば、特定のプロモーターの制御メカニズムの解明、あるいはそのプロモー ターの制御に関与するシグナル伝達の上流の因子の同定などが挙げられる。
[0005] また、特定の化学物質の存在や量を調べるために、レポーターアツセィが使用され ている。例えば、ダイォキシンレセプタータンパク質 (Aryl hydrocarbon receptor (AhR 》が知られている。当該レセプタータンパク質は、ダイォキシンに結合すると CYP1A Cytochrome P450 isozymeの 1つ)などの遺伝子の転写活性を促進する機能を有する 。ダイォキシンとダイォキシンレセプタータンパク質との複合体は、核へ移行し、ター ゲット配列 (XREと呼ばれる配列など)に結合し、当該ターゲット配列に連結した遺伝 子の転写を活性ィ匕することとなる。そこで、ダイォキシンレセプタータンパク質を発現 する細胞を用意する。一方、ダイォキシンレセプタータンパク質のターゲット配列をプ 口モーター内に有するレポータープラスミドを用意する。当該レポータープラスミドに おいては、プロモーターの 3'下流に所定のレポーター遺伝子が存在する。次いで、レ ポータープラスミドをダイォキシンレセプタータンパク質を発現する細胞に導入する。 当該細胞の培養液にダイォキシンを添加すると、ダイォキシンが細胞内へ浸透し、ダ ィォキシンレセプターと結合する。このダイォキシンとダイォキシンレセプタータンパク 質との複合体が核へ移行し、レポータープラスミドに存在するターゲット配列に結合 することで、レポーター遺伝子の転写が活性ィ匕される。このように、レポーター遺伝子 力 mRNAの転写、レポータータンパク質への翻訳というステップを経て、ダイォキシ ンの存在や量が、レポータータンパク質の生産や生産量として知りうる (Kawanishi, M. , Sakamoto, M., Ito, A" Kishi, K., Yagi, T. (2003) Mut. Res. 540, 99—105)。その他 に、内分泌撹乱物質 (以下、「環境ホルモン」という)とそれに結合するエストロジェンレ セプターの組み合わせによって、環境ホルモンを検知するシステムも開発されている
[0006] また、タンパク質間の相互作用を調べる代表的な方法として、ツーノ、イブリツドシス テムと呼ばれる実験系が広く用いられている。当該実験系も基本的にはレポーターァ ッセィを利用している (Jung, J" Ishida, K., Nishihara, Τ. (2004) Life Sci. 74, 3065-30 74)。
[0007] 以上に説明したレポーターアツセィを利用したシステムを考慮すると、細胞内で転 写活性化が弓 Iき起こされる系につ 、て、全てレポーターアツセィにより測定可能なシ ステムとすることができる。
[0008] また、遺伝子の変異をレポーターアツセィを用いて検知する方法も提案されて!、る 。まず、ヒトなど力も PCRなどによって調製した目的の遺伝子をレポーター遺伝子と融 合させる。次いで、当該融合遺伝子を発現させることで、 目的の遺伝子に存在する異 常な終止コドンなどを、レポータータンパク質の存在や酵素活性を検出することによ つて検知する (Zhang, CI., Tada, M., Kobayashi, H.， Nozaki, M., Moriuchi, T. Abe, H. (2000) Oncogene 19, 4346-4353)。さらには、分泌に必要なシグナルペプチドを 有するタンパク質を選抜するために、レポーターアツセィを用いる方法が開示されて いる (特許文献 1)。
[0009] レポーターアツセィを構成する構成要素は、大きく 2つに分類できる。第 1の構成要 素は、転写活性ィ匕を引き起こすための構成要素であり、基本的には、プロモーター 又は転写活性化'抑制に関与する DNA配列を含むプロモーター、及びプロモーター の転写活性化を促進するレセプター 'コアクチベータ一などカゝら構成される。場合に よっては、例えば、上記のように遺伝子の変異の検出にレポーターアツセィを使用す る場合には、異常な終止コドンなどを有する遺伝子が当該第 1構成要素となる。
[0010] 第 2の構成要素は、転写活性ィ匕を測定可能にするための構成要素であり、基本的 にはレポータータンパク質力もなる。第 1の構成要素は、測定する対象によって様々 であるが、第 2の構成要素は、基本的に汎用性がある。すなわち、特定のレポーター タンパク質は、様々なレポーターアツセィに共通して用いることが可能である。このよう に、より優れたレポータータンパク質を開発すれば、従来のレポーターアツセィにお いて使用されているレポータータンパク質に代えて使用することで、高度なレポータ 一アツセィを開発できる。
[0011] レポーターアツセィは、従来、大腸菌、酵母、培養細胞など様々な宿主を用いて構 築されている。基本的な原理は共通する力 宿主の選択において特に考慮すべき点 は、解析対象のプロモーター等の活性ィ匕 (転写活性化)を再構築できるかどうか、また レポータータンパク質が発現するかどうかである。例えばレポーターアツセィを用いて ヒトにおけるダイォキシン応答を調べる場合には、ヒトダイォキシンレセプターを発現 する形質転換体を構築する。その場合に、宿主として原核生物である大腸菌を用い ると、ヒトタンパク質の発現が一般に困難であることに加え、細胞内環境が真核細胞 であるヒト細胞とは大きく異なるために、レポーターアツセィに使用できる適切な形質 転換体を構築することができない。一方、培養細胞はヒト細胞と環境がよく似ているた めに、レポーターアツセィに使用する宿主としてよく用いられる。し力しながら、培養細 胞の培養には、一般に高価なゥシ胎児血清を用いるためにコストが高ぐさらに増殖 速度が微生物に比べ非常に遅いために実験に時間が力かるという問題点がある。
[0012] 一方、これら大腸菌や培養細胞に比して、酵母は増殖が早ぐ培養に使用する培 地も安価である。さらに酵母はヒトと同じ真核細胞であるため、ヒトの細胞内環境とよく 似ており、ヒトタンパク質を生産させることが容易であることが知られている。これらの 利点から、酵母を利用した様々なレポーターアツセィが提案されている。代表的なも のとしては、例えば、ダイォキシンや環境ホルモンの検出のためのレポーターアツセ ィ、タンパク質相互作用解析のためのツーハイブリッド法が挙げられる。
[0013] 酵母を利用したレポーターアツセィでは、従来よりレポータータンパク質として大腸 菌由来の ガラクトシダーゼが用いられてきた。また、最近ではホタルルシフェラー ゼゃゥミシィタケルシフェラーゼもレポータータンパク質として使用されている (非特許 文献 1)。これらレポータータンパク質はいずれも、それぞれの酵素活性を指標に、レ ポータータンパク質量を測定するものである。さらに、クラゲ由来の緑色蛍光タンパク 質（Green fluorescent protein; GFP)及びその変異体もレポータータンパク質として 使用されている。 GFPの場合には蛍光強度によって、レポータータンパク質量を測定 する (非特許文献 2)。
[0014] 上記に列挙したレポータータンパク質は、いずれも細胞内で発現するタンパク質で ある。 GFP以外の上記レポータータンパク質の生産量を酵素活性として評価するため には、遠心分離操作による細胞の回収と、超音波、界面活性剤、有機溶媒などによ る細胞の破砕 (あるいは細胞浸透性の亢進操作）が必須となる。これらの操作は、数 多くのサンプルを処理するには適していない。すなわち、これらレポータータンパク質 を用いている限り、多数のサンプルを処理する、いわゆるハイスループットアツセィを 構築することはできない。
[0015] 一方で、ホタルルシフェラーゼを細胞内あるいはペルォキシソーム内に発現させて 、培地を介して基質であるルシフェリンを取り込ませるという手法が報告されている (非 特許文献 3)。し力しながら、当該手法では、基質の取り込みが律速となり、十分な活 性を期待できない。また、 GFPをレポータータンパク質として用いたレポーターアツセ ィでは、細胞内で GFPが発現しているまま測定ができ、細胞の回収や破砕が不要で あるというメリットはある。し力しながら、 GFPをレポータータンパク質として用いると、蛍 光強度を測定する際に、その特性によりバックグランドが高いという問題がある。この バックグランドは、培地に存在する蛍光物質や酵母菌体による散乱光などである。一 方、このバックグラウンドを避ける方法としては、 FACSと呼ばれるフローサイトメーター を用いる方法が挙げられるが、装置自体が極めて高価である。
[0016] 以上に説明したように、酵母を利用したレポーターアツセィにおいて使用することが できる、高感度で且つ簡便性を備えたレポータータンパク質は現在報告されていな い。簡便性の点で理想的なレポータータンパク質は、細胞の集菌と破砕を必要としな い分泌型タンパク質である。また、高感度の点で理想的なレポータータンパク質は、 測定原理においてバックグランドが低ぐ発光を生じるタンパク質が最も適している。
[0017] ところで、特許文献 2及び非特許文献 4では、 Cypridina noctiluca由来のルシフェラ ーゼをコードする遺伝子がクロー-ングされ、当該ルシフェラーゼが哺乳動物細胞に おいて、非常に効率よく細胞外に分泌されることが開示されている。し力しながら、酵 母を利用したレポーターアツセィにおいて、 Cypridina noctiluca由来のルシフェラー ゼゃ他の分泌型ルシフェラーゼを含め、分泌型発光酵素をレポータータンパク質とし て使用した例はこれまでに報告されて ヽな 、。
特許文献 1：特表 2003-530106号公報
特許文献 2：特開 2004-187652号公報
非特許文献 l : Harger, J.W.及び Dinman J.D.,「RNA」， 2003年，第 9卷， p.1019- 1024 非特許文献 2 : Bovee, T.F.H., Helsdingen, R.J.R., Koks, P.D., Kuiper, H.A., Hooge nboom, R丄. A.P., Keijer, J., TGeneJ ,2004^,第325卷， p.187-200
非特許文献 3 : Leskinen P., Virtaq, M., Karp, M.，「Yeast」，2003年，第 20卷， p.1109-
1113
特許文献 4 : Nakajima Y., Kobayasni, K., Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. [Bioscience, Biotechnology, and BiochemistryJ , 2004年,弟 68卷, p.565- 570 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0018] 本発明は、上述した実情に鑑み、簡便で、且つ高感度なレポーターアツセィ方法を 提供することを目的とする。 課題を解決するための手段
[0019] 本発明者らは、特に培養物又は培養上清をそのままレポーターアツセィに使用する ことを検討した。培養物をそのまま使用して、レポーターアツセィを行うためには、レポ 一タータンパク質として分泌型発光酵素を使用することが必要となる。
[0020] 本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、分泌型発光酵素 をコードする遺伝子を宿主に導入し、得られた形質転換体の培養物又は培養上清を 当該分泌型発光酵素の基質と接触させた後、分泌型発光酵素の酵素活性を測定す ることで、宿主に導入した外来遺伝子又は外来 DNA断片の発現、機能、転写活性又 は転写制御機能を効率的に評価できることを見出し、本発明を完成するに至った。
[0021] 本発明は以下を包含する。
[0022] (1)分泌型発光酵素をコードする遺伝子を宿主に導入する第 1工程と、第 1工程で 得られる形質転換体の培養物又は培養上清を上記分泌型発光酵素の基質と接触さ せる第 2工程と、上記分泌型発光酵素の酵素活性を測定する第 3工程とを含み、上 記分泌型発光酵素の酵素活性に基づ!ヽて、宿主に導入した外来遺伝子又は外来 D NA断片の発現、機能、転写活性又は転写制御機能を評価することを特徴とする、レ ポーターアツセィ方法。
[0023] (2)上記外来遺伝子は、上記分泌型発光酵素をコードする遺伝子に連結されてい る力、又は上記分泌型発光酵素をコードする遺伝子における分泌シグナルペプチド をコードする遺伝子と成熟タンパク質をコードする遺伝子との間に挿入されていること を特徴とする、（1)記載のレポーターアツセィ方法。
[0024] (3)上記外来遺伝子は、上記宿主で発現していることを特徴とする、（1)記載のレ ポーターアツセィ方法。
[0025] (4)上記外来 DNA断片は、上記分泌型発光酵素をコードする遺伝子に連結されて いることを特徴とする、（1)記載のレポーターアツセィ方法。
[0026] (5)上記分泌型発光酵素が分泌型ルシフェラーゼであることを特徴とする、 (1)記 載のレポーターアツセィ方法。
[0027] (6)上記分泌型ルシフェラーゼがゥミホタルルシフェラーゼであることを特徴する、 (
5)記載のレポーターアツセィ方法。 [0028] (7)上記ゥミホタルルシフェラーゼが Cypridina noctiluca由来のルシフェラーゼであ ることを特徴とする、（6)記載のレポーターアツセィ方法。
[0029] (8)上記分泌型発光酵素が、上記宿主にお!、て機能する分泌シグナルペプチドと 分泌型発光酵素の成熟タンパク質との融合タンパク質であることを特徴とする、 (1) 記載のレポーターアツセィ方法。
[0030] (9)上記宿主が酵母であることを特徴とする、（1)記載のレポーターアツセィ方法。
[0031] (10)上記酵母がサッカロミセス 'セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae)であることを 特徴とする、（9)記載のレポーターアツセィ方法。
[0032] (11)上記酵母の形質転換体を、 pH3.5〜6.5の条件下で培養することを特徴とする 、（9)記載のレポーターアツセィ方法。
[0033] (12)分泌型発光酵素の成熟タンパク質をコードする遺伝子の上流に分泌シグナ ルペプチド又は分泌タンパク質をコードする遺伝子を連結した DNAを宿主に導入す る第 1工程と、第 1工程で得られる形質転換体の培養物又は培養上清を上記分泌型 発光酵素の基質と接触させる第 2工程と、上記分泌型発光酵素の酵素活性を測定 する第 3工程とを含み、上記分泌型発光酵素の酵素活性に基づいて、上記分泌シグ ナルペプチド又は分泌タンパク質の分泌能を評価することを特徴とする、レポーター アツセィ方法。
[0034] (13)上記分泌型発光酵素が分泌型ルシフェラーゼであることを特徴とする、 (12) 記載のレポーターアツセィ方法。
[0035] (14)上記分泌型ルシフェラーゼがゥミホタルルシフェラーゼであることを特徴する、
(13)記載のレポーターアツセィ方法。
[0036] (15)上記ゥミホタルルシフェラーゼが Cypridina noctiluca由来のルシフェラーゼで あることを特徴とする、（14)記載のレポーターアツセィ方法。
[0037] (16)上記宿主が酵母であることを特徴とする、（12)記載のレポーターアツセィ方 法。
[0038] (17)上記酵母がサッカロミセス 'セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae)であることを 特徴とする、（16)記載のレポーターアツセィ方法。
[0039] (18)上記酵母の形質転換体を、 pH3.5〜6.5の条件下で培養することを特徴とする 、（16)記載のレポーターアツセィ方法。
[0040] (19)分泌型発光酵素をコードする遺伝子を宿主に導入する第 1工程と、第 1工程 で得られる形質転換体の培養物又は培養上清を上記分泌型発光酵素の基質と接触 させる第 2工程と、上記分泌型発光酵素の酵素活性を測定する第 3工程とを含み、 上記分泌型発光酵素の酵素活性に基づ 、て、化学的又は物理的変化を測定するこ とを特徴とする、レポーターアツセィ方法。
[0041] (20)第 1工程の後に、上記形質転換体をィ匕学的又は物理的変化の対象に曝露す る工程を含むことを特徴とする、 (19)記載のレポーターアツセィ方法。
[0042] (21)上記化学的又は物理的変化応答性の外来 DNA断片が、上記分泌型発光酵 素をコードする遺伝子に連結されていることを特徴とする、（19)記載のレポーターァ ッセィ方法。
[0043] (22)上記化学的又は物理的変化応答性のタンパク質と相互作用する外来 DNA断 片が、上記分泌型発光酵素をコードする遺伝子に連結されていることを特徴とする、
(19)記載のレポーターアツセィ方法。
[0044] (23)上記化学的又は物理的変化応答性のタンパク質が外来遺伝子によってコー ドされるものであることを特徴とする、（22)記載のレポーターアツセィ方法。
[0045] (24)上記分泌型発光酵素が分泌型ルシフェラーゼであることを特徴とする、 (19) 記載のレポーターアツセィ方法。
[0046] (25)上記分泌型ルシフェラーゼがゥミホタルルシフェラーゼであることを特徴とする
、（24)記載のレポーターアツセィ方法。
[0047] (26)上記ゥミホタルルシフェラーゼが Cypridina noctiluca由来のルシフェラーゼで あることを特徴とする、（25)記載のレポーターアツセィ方法。
[0048] (27)上記宿主が酵母であることを特徴とする、（19)記載のレポーターアツセィ方 法。
[0049] (28)上記酵母がサッカロミセス ·セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae)であることを 特徴とする、（27)記載のレポーターアツセィ方法。
[0050] (29)上記酵母の形質転換体を、 pH3.5〜6.5の条件下で培養することを特徴とする
、（27)記載のレポーターアツセィ方法。 発明の効果
[0051] 本発明により、簡便で、且つ高感度なレポーターアツセィ方法が提供される。特に 本発明によれば、酵母と分泌型ルシフェラーゼ等の分泌型発光酵素とを利用するこ とで、効率的にレポーターアツセィを行うことができる。
[0052] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-169768号の明細書 及び Z又は図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0053] [図 1]図 1は、 CLucを発現する形質転換体から CLucを分泌発現させる際の培養条件 を検討した結果を示す。
[図 2A]図 2Aは、各種 pHの緩衝液で希釈した Cypridinaルシフェリン希釈溶液を用い て CLuc活性を測定した結果を示す。
[図 2B]図 2Bは、各種最終濃度の Tris-HCl(pH 7.4)で希釈した Cypridinaルシフェリン 希釈溶液を用いて CLuc活性を測定した結果を示す。
[図 3]図 3は、反応溶液において各種最終濃度のルシフェリンに対して、段階的に希 釈した CLucを発現する形質転換体の培養上清を用いて、 CLuc活性を測定した結果 を示す。
[図 4]図 4は、 CLucを発現する形質転換体の培養上清を各温度で一定時間インキュ ベーシヨンした後に測定した CLuc活性の相対残存活性を示す。
[図 5]図 5は、 CLucを発現する形質転換体の培養上清の CLuc活性測定における直 線性及びダイナミックレンジを検討した結果を示す。
[図 6]図 6は、 CLucの活性測定時における CLucに対する各種ィ匕学物質の阻害効果 を検討した結果を示す。
[図 7A]図 7Aは、様々な濁度の CLucを発現する形質転換体の培養液又は培養上清 を用いて CLuc活性 (RLU)を測定した結果を示す。
[図 7B]図 7Bは、 CLucを発現する形質転換体の培養液及び培養上清を用いて CLuc 活性 (RLU/OD)を測定した結果を示す。
[図 8]図 8は、 CLucを発現する形質転換体の培養液をサンプリング後、 25°Cで所定の 時間インキュベートした後にそれぞれの培養液サンプルを用いて CLuc活性を測定し た結果を示す。
[図 9]図 9は、 96穴ディープゥエルプレートで培養した TDH3プロモーターに連結した a CLucをコードする DNAを有する形質転換体の培養液を用いて、 CLuc活性を測定 した結果を示す。
[図 10]図 10は、下部に示された各種プロモーターに連結した mCLucをコードする DN Aを有する形質転換体の培養液を用いて、 mCLuc活性を測定した結果を示す。
[図 11]図 11は、下部に示された各種プロモーターに連結した /3 -ガラタトシダーゼを コードする DNAを有する形質転換体の培養液を用いて、 β -ガラタトシダーゼ活性を 測定した結果を示す。
[図 12]図 12は、リアルタイム PCR法によって測定され、 TDH3 mRNA量によって標準 化された mCLuc mRNA量を示す。
[図 13A]図 13Aは、下部に示された各種プロモーターに連結した mCLucをコードする DNAを有する形質転換体の培養液を用いて、銅イオン存在下及び非存在下にお!/ヽ て mCLuc活性を測定した結果を示す。
[図 13B]図 13Bは、下部に示された各種プロモーターに連結した j8 -ガラタトシダーゼ をコードする DNAを有する形質転換体の培養液を用いて、銅イオン存在下及び非存 在下にお ヽて β -ガラタトシダーゼ活性を測定した結果を示す。
[図 14A]図 14Aは、下部に示された各種プロモーターに連結した mCLucをコードする DNAを有する形質転換体の培養液を用いて、ガラクトース存在下及び非存在下にお V、て mCLuc活性を測定した結果を示す。
[図 14B]図 14Bは、下部に示された各種プロモーターに連結した β -ガラタトシダーゼ をコードする DNAを有する形質転換体の培養液を用いて、ガラクトース存在下及び 非存在下において β -ガラタトシダーゼ活性を測定した結果を示す。
[図 15]図 15は、左パネルに示された様々な長さの TDH3プロモーター（これらのプロ モーター配列には図に示されたような既知の cis配列がそれぞれ存在する）に連結し た mCLucをコードする DNAを有する形質転換体の培養液を用いて、 mCLuc活性を測 定した結果を示す。
[図 16]図 16は、左パネルに示された様々な長さの GAL1プロモーター（これらのプロ モーター配列には図に示されたような既知の cis配列がそれぞれ存在する）に連結し た mCLucをコードする DNAを有する形質転換体の培養液を用いて、 mCLuc活性を測 定した結果を示す。
[図 17]図 17は、下部に示された DNA (ラット ApoE遺伝子の第 3ェキソンに含まれるコ ード領域に相当する）を a CLucをコードする DNAの αファクター分泌シグナルぺプチ ド DNAと成熟 CLuc DNAとの間に挿入したレポータープラスミドを有する形質転換体 の培養液を用いて、 CLuc活性を測定した結果を示す。なお、 ApoE(+)は終止コドンを 含まない DNA、 ApoE (-)は終止コドンを含む DNA、 ApoE(+/-)は両者を当量混合した DNAを示す。
発明を実施するための最良の形態
[0054] 以下、本発明を詳細に説明する。
[0055] 本発明に係るレポーターアツセィ方法は、分泌型発光酵素をレポータータンパク質 として用いて、外来遺伝子又は外来 DNA断片の発現、機能、転写活性又は転写制 御機能を評価する方法である。本方法においては、先ず、分泌型発光酵素をコード する遺伝子 (以下、「分泌型発光酵素遺伝子」という)を宿主に導入する。次に、得られ た形質転換体の培養物又は培養上清を、分泌型発光酵素の酵素反応が生じうる条 件下で、当該分泌型発光酵素の基質と接触させた後、分泌型発光酵素の酵素活性 を測定する。本方法では、当該酵素活性に基づいて、宿主に導入した外来遺伝子 又は外来 DNA断片の発現、機能、転写活性又は転写制御機能を評価することとなる
[0056] ここで、分泌型発光酵素とは、細胞膜外又は細胞壁外へ分泌される酵素であって、 基質の分解により光を発する反応を触媒する酵素を意味する。本発明に係るレポ一 ターアツセィ方法で使用することができる分泌型発光酵素/基質としては、例えば、分 泌型ルシフェラーゼ /ルシフェリン、及び分泌型ホスファターゼ /1, 2-ジォキセタン誘 導体が挙げられる。
[0057] 分泌型ルシフェラーゼは、基質であるルシフェリンの酸素分子による酸化を触媒す る。この際、発生する反応エネルギーによって酸ィ匕生成物 (ォキシルシフェリン)が励 起状態で生成され、それが基底になる時に発光する。分泌型ルシフェラーゼとしては 、例えば、ゥミボタル近縁種 Cypridina noctiluca由来のルシフェラーゼ (cDNA:配列番 号 1、アミノ酸配列：配列番号 2)及び Vargula hilgendorfii由来のルシフ ラーゼ (cDNA ：配列番号 3、アミノ酸配列：配列番号 4)などのゥミホタルルシフ ラーゼ、ヒォドシェ ビ Oplophorus gracilirostris由来のルシフェラーゼ (cDNA：配列番号 5、アミノ酸配列： 配列番号 6)、並びにカイァシ類 Metridia longa由来のルシフェラーゼ (cDNA:配列番 号 7、アミノ酸配列：配列番号 8)が挙げられ、分泌効率の高さの点から、特に Cypridin a noctiluca由来のルシフェラーゼが好まし!/ヽ。
[0058] また、分泌型ホスファターゼは、発光基質である 1,2-ジォキセタン誘導体 (CDP-Star , CSPD ; Applied Biosystems社)の脱リン酸化を触媒する。この際、脱リン酸化された 基質は自発的にァダマンタノンと蛍光体とに分解され、反応エネルギーによって励起 状態で生成された蛍光体が基底状態になる時に発光する。分泌型ホスファターゼと しては、例えばヒト胎盤アルカリホスファターゼ (SEAP; cDNA :配列番号 9、アミノ酸配 列：配列番号 10)が挙げられる。
[0059] 一般的に、分泌型発光酵素を含む分泌タンパク質は、 N末端に分泌シグナルぺプ チドを有する前駆体の形態で合成される。この前駆体は、膜貫通の過程でシグナル ぺプチダーゼによって切断され、成熟タンパク質となる。本発明において、成熟タン パク質とは、細胞膜外又は細胞壁外に分泌されたタンパク質のことを意味する。成熟 タンパク質は、一般的には分泌シグナルペプチドが除去されていることが多い。なお 、本発明では、成熟タンパク質には、分泌シグナルペプチドが除去されていない場合 であっても、分泌シグナルペプチドとして推定される配列を除 ヽたものも含まれる。
[0060] 本発明に係るレポーターアツセィ方法では、分泌型発光酵素は、実際に細胞膜外 又は細胞壁外に分泌される限り、分泌シグナルペプチドと非分泌型発光酵素との融 合タンパク質であってもよい。また、分泌型発光酵素としては、本来の分泌シグナル ペプチドに置き換えて、選択した宿主にお!、て分泌シグナルペプチドとして機能する ことが知られている分泌シグナルペプチドを分泌型発光酵素の成熟タンパク質の N末 端に連結した融合タンパク質を、分泌型発光酵素として使用してもよい。例えば、サ ッカロミセス'セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae)の αファクターの分泌、シグナノレぺ プチド (cDNA:配列番号 11、アミノ酸配列：配列番号 12)は、酵母において高い分泌 効率をもたらすことが知られている。また、酵母における分泌シグナルペプチドとして は、例えば、インベルターゼの分泌シグナルペプチドが挙げられる。一方、 Cypridina noctiluca由来の分泌型ルシフェラーゼの分泌シグナルペプチドは、配列番号 2に示 される Cypridina noctiluca由来の分泌型ルシフェラーゼのアミノ酸配列において、 1番 目〜 18番目のアミノ酸配列である。そこで、例えば、宿主として酵母を選択した場合 には、 Cypridina noctiluca由来の分泌型ルシフェラーゼの成熟タンパク質の N末端に aファクターの分泌シグナルペプチドを連結した融合タンパク質 (cDNA:配列番号 13 、アミノ酸配列：配列番号 14)を分泌型発光酵素として使用することができる。
[0061] 上述した分泌型発光酵素遺伝子の塩基配列及びその対応するアミノ酸配列は、上 記の配列番号に示される塩基配列及びその対応するアミノ酸配列に限定されない。 各分泌型発光酵素は、上記の配列番号に示されるアミノ酸配列において 1又は数個 ( 例えば 1〜10個、 1〜5個)のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列から なり、且つ分泌され、各酵素が有する酵素活性を有するものであればよい。また、形 質転換対象の宿主のコドン利用頻度等を参照し、上述の配列番号に示される分泌 型発光酵素遺伝子の塩基配列を最適化したものを分泌型発光酵素遺伝子とするこ とができる。このような分泌型発光酵素遺伝子としては、例えば Cypridina noctiluca由 来のルシフェラーゼ遺伝子 (cDNA：配列番号 1)をサッカロミセス ·セレピシェにおける 使用に最適化した合成遺伝子 (cDNA :配列番号 15)が挙げられる。なお、当該遺伝 子によりコードされるルシフェラーゼのアミノ酸配列は、野生型ルシフェラーゼのァミノ 酸配列 (配列番号 2)と同一である。
[0062] 本発明に係るレポーターアツセィ方法における外来遺伝子は、 、かなるタンパク質 、ペプチドをコードする遺伝子であっても良い。本発明では、外来遺伝子の種類に応 じて、以下のように、例えば第 1実施形態〜第 3実施形態に分けることができる。
[0063] 第 1実施形態として、アミノ酸配列における異常な終止コドンの存在や欠失、置換、 付加等の変異の存在によるタンパク質の安定性、機能などを評価した場合には、当 該評価対象のタンパク質をコードする遺伝子が外来遺伝子となる。また、タンパク質 をコードする遺伝子の異常を評価した ヽ場合には、ヒトの血液サンプルなどカゝら調製 した DNAや RNAに由来する目的のタンパク質をコードする遺伝子が外来遺伝子とな る。これらの場合、外来遺伝子は、分泌型発光酵素遺伝子の 5'上流側に連結される 力 又は分泌型発光酵素遺伝子における分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子 と成熟タンパク質をコードする遺伝子との間に挿入されることとなる。特に、分泌型発 光酵素の機能を失いにくいという点から、分泌型発光酵素遺伝子において分泌シグ ナルペプチドをコードする遺伝子と成熟タンパク質をコードする遺伝子との間に外来 遺伝子を連結することが好ましい。本発明に係るレポーターアツセィ方法では、分泌 型発光酵素遺伝子と外来遺伝子がこのような位置関係にあることにより、分泌型発光 酵素の酵素活性値を外来遺伝子の発現、活性又は機能と相関させることができる。 例えば、特定の正常なタンパク質をコードする遺伝子を対照の外来遺伝子とする。一 方、遺伝子に異常な終止コドンなどが存在するか否かを評価する遺伝子 (以下、「試 験遺伝子」という)を外来遺伝子とする。そして、対照の外来遺伝子を用いた際の酵 素活性値に比べ、試験遺伝子を用いた際の酵素活性値が低 、か又は全くな 、こと によって、試験遺伝子に異常が存在することが塩基配列を決定することなく評価する ことができる。
第 2実施形態では、外来の転写因子や転写抑制因子などをコードする遺伝子が当 該外来遺伝子として挙げられる。なお、この場合、転写調節機能を調べたいタンパク 質が宿主由来である場合には、「外来遺伝子」は宿主由来の遺伝子であっても良い 。あるいは、該遺伝子を他の転写因子又は転写抑制因子をコードする遺伝子の全部 あるいは一部と連結し、融合タンパク質をコードする遺伝子を外来遺伝子としてもよ い。例えば、本発明に係るレポーターアツセィ方法を酵母を用いたツーハイブリッドシ ステムに使用する場合には、おとり (bait)タンパク質をコードする遺伝子と、おとりタン パク質と相互作用するか否力試験されるタンパク質 (試験タンパク質)をコードする遺 伝子とが外来遺伝子となる。この場合には、外来遺伝子は、分泌型発光酵素遺伝子 とは直接連結されることなく、同一プラスミドの別の位置、別のプラスミド又は染色体 上に存在し、宿主で発現することとなる。本発明に係るレポーターアツセィ方法では、 分泌型発光酵素の酵素活性値を用いて、外来遺伝子によりコードされるタンパク質 自身の転写調節機能、あるいはツーハイブリッドシステムにおいてはおとりタンパク質 と試験タンパク質との相互作用の強さを評価することができる。さらに、本発明に係る レポーターアツセィ方法では、分泌型発光酵素の酵素活性値を用いて、ワンハイプリ ッドシステムにお 、ては転写活性化に係わる DNA結合能、コファクターや RNAポリメラ ーゼとの相互作用などの強さを評価することができる。
[0065] 第 3実施形態として、本発明に係るレポーターアツセィ方法を、多数のタンパク質の 中から細胞膜又は細胞壁に固定されるタンパク質 (以下、「細胞膜タンパク質又は細 胞壁タンパク質」という)をスクリーニングする際に使用する場合には、スクリーニング 対象のタンパク質をコードする遺伝子が外来遺伝子となる。これらの場合、外来遺伝 子は、分泌型発光酵素遺伝子の 5'上流側又は 3'下流側に連結される。ここでは、分 泌型発光酵素が細胞膜又は細胞壁外で細胞膜又は細胞壁に固定されるように、外 来遺伝子に対して分泌型発光酵素遺伝子を連結する。当該外来遺伝子が細胞膜タ ンパク質又は細胞壁タンパク質をコードする遺伝子である場合には、分泌型発光酵 素と共に細胞膜タンパク質又は細胞壁タンパク質が宿主の細胞膜又は細胞壁に固 定されることとなる。固定された分泌型発光酵素の酵素活性値に基づいて、外来遺 伝子によりコードされる細胞膜タンパク質又は細胞壁タンパク質をスクリーニングする ことができる。
[0066] また、細胞膜タンパク質又は細胞壁タンパク質は、 N末端又は C末端の 、ずれかの みが細胞膜外又は細胞壁外に存在する場合がある。そこで、上述した本発明に係る レポーターアツセィ方法を用いたスクリーニングに準じて、細胞膜タンパク質又は細 胞壁タンパク質にお!/ヽて C末端又は N末端の 、ずれが細胞膜又は細胞壁の外側に 存在するかを、分泌型発光酵素の酵素活性値によって評価することができる。さらに は、上述した本発明に係るレポーターアツセィ方法を用いたスクリーニングに準じて、 分泌型発光酵素の酵素活性値を用いて細胞膜タンパク質又は細胞壁タンパク質の 発現レベルを評価することができる。
[0067] 一方、外来 DNA断片としては、例えばプロモーター、一般に cis-配列と呼ばれる転 写を活性ィ匕又は抑制する配列を含む DNA断片及び合成 DNAが挙げられる。さらに は、 mRNAの安定性に寄与する配列や翻訳効率に影響を与える配列を含む DNA断 片であってよい。本発明に係るレポーターアツセィ方法において、外来 DNA断片とし て使用するプロモーターは、いずれの生物由来のプロモーター又は人工の cis配列 の組み合わせであっても良 、し、ある ヽはプロモーターとしての機能を有する限り、 人工的な配列を含めていかなる配列であってもよい。例えば、外来 DNA断片がプロ モーターである場合には、分泌型発光酵素遺伝子の 5'上流側にプロモーターを連結 する。この場合、本発明に係るレポーターアツセィ方法では、得られた分泌型発光酵 素の酵素活性値を外来 DNA断片として用いたプロモーターの相対的な転写活性ィ匕 値として評価することができる。また、外来 DNA断片が転写活性ィ匕又は転写抑制を引 き起こす ds配列、 mRNAの安定性に関わる配列、翻訳効率に影響を与える配列であ る場合には、分泌型発光酵素遺伝子との相対的位置は機能する限り、いかなる位置 であってもよい。この場合、本発明に係るレポーターアツセィ方法では、得られた分泌 型発光酵素の酵素活性値を用いて、外来 DNA断片として用いた上述した配列の転 写制御機能 (例えば、転写活性化又は転写抑制)、 mRNAの安定性への寄与度又は 翻訳効率への影響度を評価することができる。なお、他の外来 DNA断片は、分泌型 発光酵素遺伝子に対して制御しうる位置に連結する。
[0068] 宿主としては、宿主内で分泌型発光酵素遺伝子及び外来遺伝子又は外来 DNA断 片が機能できるものであれば特に限定されるものではないが、酵母、大腸菌 (Escheri chia coli)等のエッシェリヒァ属、バチルス'ズブチリス (Bacillus subtilis)等のバチルス 属、又はシユードモナス 'プチダ (Pseudomonas putida)等のシユードモナス属等に属 する細菌、 COS細胞等の動物細胞、 S19等の昆虫細胞、あるいはアブラナ科等に属 する植物が挙げられる。また酵母としては、いずれの酵母であってもよいが、例えば、 サッカロミセス.セレビシェ、シゾサッカロミセス 'ボンべ (Shizosaccharomyces pombe)、 ピチア'パストリス（Pichia pastoris)、カンジダ 'アルビカンス（Candida albicans)、ハン セヌラ 'ポリモルファ（Hansenula polymorpha)が挙げられ、特にサッカロミセス'セレビ シェが好ましい。
[0069] 本発明に係るレポーターアツセィ方法では、先ず分泌型発光酵素遺伝子及び外来 遺伝子又は外来 DNA断片を準備する。分泌型発光酵素遺伝子、外来遺伝子及び 外来 DNA断片 (以下、「遺伝子等」という)は、例えば、これら遺伝子等を有する生物の ゲノム DNA等を铸型として、該領域の両端の塩基配列に相補的なプライマーを用い た PCRによって容易に得ることができる。 [0070] ー且、遺伝子等の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はクロ 一ユングされたプローブを铸型とした PCRによって、あるいは該塩基配列を有する DN A断片をプローブとしてハイブリダィズさせることによって遺伝子等を得ることができる
。さらに、部位特異的突然変異誘発法等によって遺伝子等の変異型であって変異前 と同等の機能を有するものを合成することができる。
[0071] なお、遺伝子等に変異を導入するには、 Kunkel法、 Gapped duplex法等の公知の 手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘 発法を利用した変異導入用キット（例えば Mutant- K(TAKARA社製)や Mutant- G(TA KARA社製)）などを用いて、あるいは、 TAKARA社の LA PCR in vitro Mutagenesisシ リーズキットを用いて変異の導入が行われる。
[0072] 次 ヽで、分泌型発光酵素遺伝子に外来遺伝子又は外来 DNA断片を連結する場合 には、分泌型発光酵素遺伝子に外来遺伝子又は外来 DNA断片を連結した DNAを準 備する。また、分泌型発光酵素遺伝子における分泌シグナルペプチドをコードする 遺伝子と成熟タンパク質をコードする遺伝子との間に外来遺伝子又は外来 DNA断片 を挿入する場合には、分泌型発光酵素遺伝子における分泌シグナルペプチドをコー ドする遺伝子と成熟タンパク質をコードする遺伝子との間に外来遺伝子又は外来 DN A断片を挿入した DNAを準備する。このような DNAは、上述のように連結又は挿入し た DNA自体であってもよぐ当該 DNAを含むベクターなどであってよ!、。
[0073] 分泌型発光酵素遺伝子に外来遺伝子又は外来 DNA断片を連結する方法は、それ ぞれ精製された分泌型発光酵素遺伝子及び外来遺伝子又は外来 DNA断片を適当 な制限酵素で切断し、連結する方法が採用される。また分泌型発光酵素遺伝子と外 来遺伝子又は外来 DNA断片のそれぞれ一部に相同な領域を持たせることにより、 PC Rなどを用いた in vitro法または酵母などを用いた in vivo法によって両者を連結する 方法であってもよい。
[0074] また、分泌型発光酵素遺伝子における分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子と 成熟タンパク質をコードする遺伝子との間への外来遺伝子又は外来 DNA断片の挿 入は、上述した分泌型発光酵素遺伝子に外来遺伝子又は外来 DNA断片を連結する 方法に準じて行うことができる。 [0075] 分泌型発光酵素遺伝子と外来遺伝子又は外来 DNA断片とが連結した DNA又は分 泌型発光酵素遺伝子における分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子と成熟タン ノ ク質をコードする遺伝子との間に外来遺伝子又は外来 DNA断片を挿入した DNA( 以下、「本発明に係る DNA」という)を含むベクターは、適当なベクターに本発明に係 る DNAを挿入すること〖こより得ることができる。使用するベクターは、宿主中で複製可 能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミド、シャトルベクター、へルパープ ラスミドなどが挙げられる。また該ベクター自体に複製能がない場合には、宿主の染 色体に挿入することなどによって複製可能となる DNA断片であってもよい。
[0076] プラスミド DNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば pBR322、 pBR325、 pUC118 、 pUC119、 pUC18、 pUC19、 pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば pUB 11 0、 pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えば ΥΕρ13などの ΥΕρ系、 YCp50などの YCp系 等)などが挙げられ、ファージ DNAとしてはえファージ（Charon4A、 Charon21A、 EMB L3、EMBL4、 gtl0、 gtll、 λ ZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はヮ クシニアウィルスなどの動物ウィルス、バキュロウィルスなどの昆虫ウィルスベクターを 用いることちでさる。
[0077] ベクターに本発明に係る DNAを挿入する方法は、上述した分泌型発光酵素遺伝子 に外来遺伝子又は外来 DNA断片を連結する方法に準じて行うことができる。
[0078] さらに、本発明に係るレポーターアツセィ方法では、本発明に係る DNA又は本発明 に係る DNAを含むベクター (以下、「本発明に係るベクター等」と!、う)を宿主中に導入 することにより形質転換体を作製する。同様に、分泌型発光酵素遺伝子と外来遺伝 子とが例えば別個のベクター等に存在する場合には、分泌型発光酵素遺伝子を有 するベクター及び外来遺伝子を有するベクターをそれぞれ同じ宿主中に導入するこ とにより形質転換体を作製する。
[0079] 酵母への本発明に係るベクター等の導入方法は、酵母に DNAを導入する方法であ れば特に限定されず、例えば電気穿孔法 (エレクト口ポレーシヨン法)、スフエロプラスト 法、酢酸リチウム法等が挙げられる。また、 Yip系などのベクターあるいは染色体中の 任意の領域と相同な DNA配列を用いた染色体への置換 '挿入型の酵母の形質転換 法であっても良い。さらに酵母への本発明に係るベクター等の導入方法は、一般的 実験書または学術論文などに記載された ヽかなる方法によってもょ ヽ。
[0080] 細菌への本発明に係るベクター等の導入方法は、細菌に DNAを導入する方法であ れば特に限定されるものではな 、。例えばカルシウムイオンを用いる方法およびエレ タトロポレーシヨン法等が挙げられる。
[0081] 動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞 COS-7、 Vero、チャイニーズノ、ムスター卵 巣細胞 (CHO細胞）、マウス L細胞などが用いられる。動物細胞への本発明に係るベ クタ一等の導入方法としては、例えばエレクト口ポレーシヨン法、リン酸カルシウム法、 リポフエクシヨン法等が挙げられる。
[0082] 昆虫細胞を宿主とする場合は、 S19細胞などが用いられる。昆虫細胞への本発明に 係るベクター等の導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法 およびエレクト口ポレーシヨン法等が挙げられる。
[0083] 植物を宿主とする場合は、植物体全体、植物器官 (例えば葉、花弁、茎、根、種子 等)、植物組織 (例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等)又は植物培養細胞など が用いられる。植物への本発明に係るベクター等の導入方法としては、例えばエレク トロポレーシヨン法、ァグロバタテリゥム法、パーティクルガン法および PEG法等が挙げ られる。
[0084] 本発明に係るベクター等が宿主に組み込まれた力否かの確認は、 PCR法、サザン ハイブリダィゼーシヨン法及びノーザンハイブリダィゼーシヨン法等により行うことがで きる。例えば、形質転換体から DNAを調製し、 DNA特異的プライマーを設計して PCR を行う。その後は、増幅産物についてァガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動又はキヤビラリ一電気泳動等を行い、臭化工チジゥム、 SYBR Green液等 により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出することにより、形質転換されたこと を確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いて PCRを行い、 増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結 合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。
[0085] 次 、で、本発明に係るレポーターアツセィ方法では、得られた形質転換体を生育可 能な条件下で培養する。さら〖こ、本方法において、形質転換体の培養物をそのまま 酵素活性の測定に供する場合には、分泌型発光酵素が失活しな!ヽ条件下で培養す ることとなる。例えば、分泌型発光酵素として Cypridina noctiluca由来のルシフェラー ゼなどの分泌型ルシフェラーゼを導入した形質転換酵母の培養にお！、て、酵母が生 育し且つ当該ルシフェラーゼが失活しないように、温度は、例えば 4〜37°C、好ましく は 20〜30°Cに設定する。また培地の pHは、例えば 3.5〜6.5、好ましくは 5.5〜6.0に設 定すればよい。培養時間は、分泌型発光酵素の活性が測定可能であれば良ぐ例え ば 1〜 120時間、好ましくは対数増殖期である 1〜24時間である。
[0086] さらに、本発明に係るレポーターアツセィ方法では、形質転換体の培養後、得られ る培養物又は培養上清を、分泌型発光酵素の酵素反応が生じうる条件下で、分泌 型発光酵素の基質と接触させる。ここで、酵素反応が生じる条件とは、分泌型発光酵 素の活性中心に基質が特異的に結合して複合体が生成され、酵素反応が進む条件 を意味する。また、ここで、接触とは、培養物又は培養上清中の分泌型発光酵素と基 質とが近接し、酵素反応が生じる状態を意味する。また、本発明に係るレポーターァ ッセィ方法において培養物とは、形質転換体を含む培養液や培地を意味する。本発 明に係るレポーターアツセィ方法では、分泌型発光酵素が培地中に分泌されるため 、形質転換体を含む培養液や培地をそのまま使用することができる。あるいは、本発 明に係るレポーターアツセィ方法において、形質転換体を遠心分離等によって分離 した培養上清を使用してもよい。
[0087] 例えば、 Cypridina noctiluca由来のルシフェラーゼなどの分泌型ルシフェラーゼを 有する形質転換体の培養物又は培養上清と基質 (ルシフェリン)とを接触させる条件と して、温度は、例えば 0〜40°C、好ましくは 15〜30°Cに設定する。また pHは、例えば 4. 0〜9.0、好ましくは 6.0〜8.0に設定すればよい。接触時間 (反応時間)は、例えば 1秒 〜30分間、好ましくは 1秒〜 30秒間である。特に種々の緩衝液で希釈した基質溶液 を培養物又は培養上清に添加することで、培養物又は培養上清の pHを分泌型発光 酵素の酵素活性が高い pHにシフトすることができる。例えば、分泌型ルシフェラーゼ を含む培養物又は培養上清に対して、 2M以下 (好ましくは 50mM〜200mM)で、且つ p H3.5〜9.0(好ましくは pH7.0〜8.0)のトリス塩酸緩衝液 (Tris- HC1)などの緩衝液で希 釈したルシフェリン溶液を添加することで、上述した接触時の pHを設定することがで きる。 [0088] 培養物又は培養上清に対する基質の濃度は、分泌型発光酵素と基質に応じて適 宜決定することができるが、例えば分泌型ルシフェラーゼを有する形質転換体の培 養物又は培養上清の濁度 (例えば 600 における吸光度) 0.05以上に対して、基質 であるルシフェリンを 0.1 μ Μ以上、好ましくは 1.25 2.5 μ Μの終濃度となるように添 加する。
[0089] 次 、で、本発明に係るレポーターアツセィ方法では、分泌型発光酵素の酵素活性 を測定する。測定方法は、分泌型発光酵素に応じて適宜選択することができる。例え ば、分泌型ルシフェラーゼを分泌型発光酵素として使用した場合には、形質転換体 の培養物又は培養上清と基質との混合物を、ルミノメーターを用いた発光測定に供 し、相対発光強度 (RLU)として酵素活性を測定する。また、好ましくは、活性測定時に 酵素活性を補正して測定値を標準化するために、培養液又は培養上清の濁度 (例 えば 600 nmにおける吸光度）を測定し、相対発光強度を濁度で除することによって補 正した値 (RLU/OD)を、酵素活性値とすることができる。あるいは、相対発光強度を標 準化するために、形質転換体に含まれる ATP量を測定し、この値で相対発光強度を 除する方法も好ましい。さらに、形質転換体において、同時に別の酵素やタンパク質 を発現させて、その酵素又はタンパク質量を測定し、その値で相対発光強度を除し て補正する方法でもよい。また、基質が異なったり、発光スペクトルが異なるなどの性 質を利用して、発光を見分けることができる限り、他の発光酵素や本発明に係る分泌 型発光酵素の変異体を発現させて、その発光酵素由来の発光で除して補正する方 法でもよい。
[0090] また、例えば、宿主がサッカロミセス ·セレピシェなどの微生物である場合、形質転 換体は寒天培地において生育し、コロニーを形成する。そこで、例えば分泌型ルシフ エラーゼを分泌型発光酵素として使用した場合には、形質転換体を含む寒天培地に ルシフェリンを添加した後、コロニーの発光強度を、例えば CCDカメラなどを有する発 光検出器を用いて測定することによって酵素活性を測定することができる。
[0091] 本発明に係るレポーターアツセィ方法では、このようにして得られた分泌型発光酵 素の酵素活性値を外来遺伝子又は外来 DNA断片の発現、機能、転写活性又は転 写制御機能と相関させる。 [0092] 以上に説明したように、本発明に係るレポーターアツセィ方法によれば、簡便且つ 高感度なレポーターアツセィを行うことができる。また、本発明に係るレポーターアツ セィ方法ではバックグランドが低い高感度な発光測定法を効率よく使用できるので、 アツセィ系の微量ィ匕が可能となる。本発明に係るレポーターアツセィ方法では、集菌 や細胞破砕を行うことなく培養物のサンプリングのみで測定サンプルを調製できる。 そのため、ロボットによる自動化が可能である。すなわち、例えば 96穴ディープゥエル プレートを用いて、 1プレート当たり 96種の形質転換体を培養し、マニュアルあるいは ロボットにより培養物の一部を発光測定用プレートに分注することにより、そのままマ イク口プレート対応のルミノメーターで酵素活性を測定できる。また、補正のための濁 度は、同じ 96穴ディープゥエルプレートから吸光度測定用プレートに培養物を一部分 注し、マイクロプレートリーダーにて測定可能である。他の補正方法を利用する場合 においても、発光、蛍光又は吸光マイクロプレートリーダーを用いることができる。この ように、本発明に係るレポーターアツセィ方法によって、レポーターアツセィをハイス ループットアツセィとして行うことが可能になり、さらにロボテイクスによる自動処理も可 能となる。さらに、本発明に係るレポーターアツセィ方法を用いれば、ツーハイブリッド システムにおいてタンパク質間相互作用の簡便な定量的評価が可能となる。また、ダ ィォキシンや環境ホルモンなどの安価で高感度なバイオアツセィの開発が可能となる 。さらに、創薬上有用な分泌タンパク質の網羅的スクリーニングにも利用できる。また 、ヒト膜結合型レセプターや核内レセプターなどを発現させた酵母を利用し、これらの レセプターと酵母の細胞内シグナル伝達系をカップリングさせることにより、新薬のリ ード化合物のハイスループットスクリーニングにも利用できる。また、従来の方法では 1 サンプル 1シャーレのように手間が力かった遺伝子変異検出も、 1枚の 96穴プレート で 96サンプル同時に解析できるなど、遺伝子変異解析のハイスループット化にも寄 与できる。
[0093] さらに、本発明に係るレポーターアツセィ方法は、高感度であるために、スケールダ ゥンが可能である。例えば、本発明における形質転換酵母を、 1 mから 1 mm程度の 流路と酵母が流出するのを防ぐメンブランフィルター、狭窄流路あるいはナノピラーを 設け、培地のみが流れるように作製したチップあるいはキヤビラリ一にセットする。ある いは、菌体を含む培養液を流れるようにしたチップ又はキヤビラリ一でもよい。次いで 、培地に放出された分泌型発光酵素に対して基質を流路に流入させ、酵素反応を生 じさせる。このように、本発明に係るレポーターアツセィ方法を、 μ TAS(Micro total an alysis systems)や Lab-on-a-chipと呼ばれるオンチップ分析に利用することが可能で ある。
[0094] また、以上に説明した本発明に係るレポーターアツセィ方法に準じて、分泌シグナ ルペプチド又は分泌タンパク質の分泌能を評価することができる。すなわち、分泌型 発光酵素の成熟タンパク質をコードする遺伝子の上流に分泌シグナルペプチド又は 分泌タンパク質をコードする遺伝子を連結した DNAを宿主に導入し、当該分泌型発 光酵素の酵素活性に基づ ヽて、分泌シグナルペプチド又は分泌タンパク質の分泌 能を定量的に評価することができる。この場合、分泌型発光酵素の成熟タンパク質を コードする遺伝子の 5'上流側に、分泌シグナルペプチド又は分泌タンパク質をコード する遺伝子を連結する。
[0095] 分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子を用いた場合には、得られた分泌型発 光酵素の酵素活性値を分泌シグナルペプチドの相対的な分泌活性値として評価す ることができる。あるいは、酵素活性値が得られることによって、分泌シグナルぺプチ ドをコードする遺伝子として機能を有すると評価することができる。
[0096] また、分泌タンパク質をコードする遺伝子を用いた場合には、得られた分泌型発光 酵素の酵素活性値を相対的な分泌タンパク質発現量として評価できる。あるいは、酵 素活性値が得られることによって、分泌タンパク質をコードする遺伝子であると評価す ることがでさる。
[0097] さらに、本発明に係るレポーターアツセィ方法に準じて、化学的又は物理的変化を 測定することができる。ここで、化学的又は物理的変化としては、例えば、化学物質 又は生理活性物質の検出及び濃度変化並びに温度変化が挙げられる。例えば、環 境ホルモン等の生理活性物質を検出するか、あるいは当該物質の濃度変化を測定 する際には、これらの物質に応答性のプロモーターや転写制御に関与する DNA断片 を外来 DNA断片とする。例えば、ダイォキシンを検出する際には、ダイォキシンレセ プターとダイォキシンとの複合体が結合する配列と一般的なプロモーターとを連結し たものを外来 DNA断片とする。これら外来 DNA断片を分泌型発光酵素遺伝子に連 結する。次 、で当該外来 DNA断片とダイォキシンレセプターを発現する遺伝子ュ- ットとを共に宿主細胞に導入することによって、ダイォキシンを検知するためのレポ一 ターアツセィ方法とすることができる。この場合、分泌型発光酵素の発光量によって、 ダイォキシンの濃度を測定できる。同様に、例えば温度変化についても、それを検知 するタンパク質を利用することによって、温度変化を検知するためのレポーターアツ セィ方法を確立することが可能である。例えば、高温の検知は Heat shock factor(HS F)と呼ばれる温度依存性転写因子を利用することで、分泌型発光酵素の活性に基 づいて検知可能である。
[0098] 本方法では、上述した化学的又は物理的変化に応答性のプロモーターや転写制 御に関与する DNA断片を外来 DNA断片とする。これら外来 DNA断片に分泌型発光 酵素遺伝子を連結した DNAを宿主に導入し、発現させる。次いで、化学的又は物理 的変化の対象に宿主を曝露する。曝露後、分泌型発光酵素の活性を測定する。陰 性対照と比較して、分泌型発光酵素の活性が変動した場合には、供試対象に応答し て外来 DNA断片の発現が変化したことを示す。このようにして得られた分泌型発光酵 素の酵素活性値は、化学的又は物理的変化の相対的な測定値として評価すること ができる。あるいは、上述した化学的又は物理的変化に応答性のタンパク質 (以下、「 応答性タンパク質」という)と相互作用する外来 DNA断片を宿主に導入し、発現させる 。なお、外来 DNA断片には、分泌型発光酵素遺伝子が連結されている。また、応答 性タンパク質が宿主に存在しな ヽ場合には、応答性タンパク質をコードする遺伝子を 外来遺伝子として宿主に導入し、発現させる。次いで、化学的又は物理的変化の対 象に宿主を曝露する。曝露後、分泌型発光酵素の活性を測定する。陰性対照と比較 して、分泌型発光酵素の活性が変動した場合には、応答性タンパク質が化学的又は 物理的変化を検出し、外来 DNA断片との相互作用が変化したことを示す。このように して、得られた分泌型発光酵素の酵素活性値は、化学的又は物理的変化の相対的 な測定値として評価することができる。
[0099] 本方法では、転写量の変動を伴う限り、適切なプロモーターや転写制御に関与す る DNA断片などを外来 DNA断片として使用できる。必要に応じて 1つ又は複数の応 答性タンパク質 (例えばダイォキシンレセプターに代表されるようなレセプター）をコー ドする遺伝子を同時に発現させる。あるいは、宿主が有するシグナル伝達系を利用 するなどの方法を併用する。
[0100] 化学物質又は生理活性物質の検知 ·測定の場合には、適切なレセプターをコード する遺伝子を宿主に導入し、細胞内、核内又は細胞膜上に発現させる。また、それら レセプターが化学物質又は生理活性物質を検知した際にそのシグナルが転写活性 に影響を与えるように、必要に応じて適切なシグナル伝達系に関与するタンパク質を コードする遺伝子を宿主で発現させる。さらに転写調節に関与する適切な DNA断片 又はプロモーターを外来 DNA断片として分泌型発光酵素遺伝子に連結し、宿主に 導入し、発現させる。これらのレセプターやシグナル伝達因子等は、宿主由来のもの 、外来のもの、他のタンパク質との融合タンパク質、又は機能を有する限り人工的に 作出したタンパク質でもよい。また、分泌型発光酵素遺伝子に連結する外来 DNA断 片は、転写調節の機能を有する限り、導入すべき宿主に由来するもの、外来のもの、 人工的に設計された配列の 、ずれでもよ!/、。
[0101] これまでにダイォキシンレセプター、環境ホルモンレセプター（ェストロジェンレセプ ター)、 Peroxisome proliferator— activated receptor(PPAR)など数多くのィ匕学物質に対 するレセプターが知られている。すなわち、極めて多くの化学物質又は生理活性物 質のバイオアツセィ法として、本レポーターアツセィ方法は利用が可能である。さらに は、ヒスタミンレセプターなどの細胞膜上のレセプターも数多く知られている。よって、 例えば本来結合する物質が特定できて ヽな 、、 V、わゆるォーファンレセプターを本レ ポーターアツセィ方法と組み合わせることにより、創薬上極めて重要なリガンド探索な どに用いることができる。このようなリガンド探索では、膨大な数の候補物質を試す必 要があり、ハイスループット性を要求されることから、本レポーターアツセィ方法が適し ている。
[0102] さらにまた、本発明に係るレポーターアツセィ方法に準じて、スプリットアツセィを行う ことができる。分泌型発光酵素を適切な場所で 2つに分割するようにデザインをし、実 際に 2つの断片 (以下では、「N末端側断片」と「C末端側断片」という)として宿主で発 現させた場合、これら 2つの断片が空間的に適切に会合すると分泌型発光酵素の活 性が復活する。本発明ではこの現象を用いて、細胞膜上での細胞膜タンパク質間の 会合能を判定する (スプリットアツセィ)。
[0103] 本方法では、外来遺伝子として 2種の細胞膜タンパク質をコードする遺伝子 (以下、 「細胞膜タンパク質遺伝子」という)を会合能の判定対象とする。まず、 2種の発現カセ ットを作製する。第 1の発現カセットは、一方の細胞膜タンパク質遺伝子と分泌型発光 酵素の N末端側断片をコードする DNA断片とを連結したものである。より具体的には 、第 1の発現カセットには、細胞膜タンパク質の細胞外末端に分泌型発光酵素の N末 端側断片が連結した融合タンパク質をコードする融合遺伝子が含まれて 、る。第 2の 発現カセットは、他方の細胞膜タンパク質遺伝子と分泌型発光酵素の C末端側断片 をコードする DNA断片とを連結したものである。第 1の発現カセットと同様に、第 2の発 現カセットには、細胞膜タンパク質の細胞外末端に分泌型発光酵素の C末端側断片 が連結した融合タンパク質をコードする融合遺伝子が含まれている。
[0104] 次いで、これら 2種の発現カセットを宿主に導入し、それぞれの融合遺伝子を発現さ せる。次に、分泌型発光酵素の活性を測定する。分泌型発光酵素の酵素活性が得 られた場合には、細胞膜上で 2種の細胞膜タンパク質が互いに会合したと判定するこ とができる。一方、分泌型発光酵素の酵素活性が得られない場合には、細胞膜上で 2種の細胞膜タンパク質が互 ヽに会合しな 、可能性が示唆される。
[0105] 以上のようにして、本発明に係るレポーターアツセィ方法によれば、 2種の細胞膜タ ンパク質の会合能を判定することができる。なお、本発明に係るレポーターアツセィ方 法では、細胞膜タンパク質遺伝子に代えて、細胞壁タンパク質をコードする遺伝子を 外来遺伝子とすることで、細胞壁上での 2種の細胞壁タンパク質の会合能を判定する ことちでさる。
実施例
[0106] 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施 例にその技術的範囲が限定されるものではない。
[0107] 〔実施例 1〕 Cypridina noctiluca分泌型ルシフェラーゼの酵母における分泌発現と培 養液の至適 pHの検討
(1) Cypridina noctiluca分泌型ルシフェラーゼを有する形質転換体 (形質転換酵母） の作製
Cypridina noctiluca分泌型ルシフヱラーゼ (配列番号 2に示すアミノ酸配列：以下、「 CLucJ t\、う)をコードする cDNA (配列番号 1)を用いて、出芽酵母サッカロミセス ·セレ ピシェにおいて当該酵素を分泌発現させた。また、 CLucを分泌発現させるための培 地の pHの条件につ!、て検討した。
[0108] まず、 CLuc cDNAを含むプラスミド (以下、「pcDNA- CL」と!、う)を用いて、 pcDNA- C Lから CLucの分泌シグナルペプチド (配列番号 2に示す CLucのアミノ酸配列において 、 1〜18番目のアミノ酸配列)を除く成熟タンパク質をコードする cDNA (以下、「成熟型 CLuc cDNA」という)を polymerase chain reaction(PCR)法によって増幅した。
[0109] 一方、出芽酵母の αファクターの分泌シグナルペプチド (配列番号 12に示すアミノ 酸配列)をコードする DNA (配列番号 11:以下、「 αファクター分泌シグナルペプチド D NAJという)は、サッカロミセス'セレピシェ S288Cゲノム DNA (Invitrogen社より購入）を 铸型として増幅した。
[0110] 次!、で、成熟型 CLuc cDNAと αファクター分泌シグナルペプチド DNAとを連結し、 aファクター分泌シグナルペプチドを N末端に有する成熟型 CLuc (配列番号 14に示 されるアミノ酸配列：以下、「 ex CLucj t ヽぅ）をコードする遺伝子 (配列番号 13)を作製 するために、 overlap PCR法を行った。
[0111] 成熟型 CLuc cDNAを増幅するためのプライマー (alpha-luci-F及び 3'Xba I-luci)の 配列は、以下の通りであった。 列番号 16)
3'Xba I-luci； CCCTGTCTAGACTATTTGCATTCATCTGGTAC (配列番号 17) alpha-luci-Fは、 aファクター分泌シグナルペプチドをコードする DNAの 3，末端から 19bpの DNA配列の下流に、成熟型 CLucの最初のコドン（配列番号 2に示す CLucの アミノ酸配列において、 19番目のアミノ酸に相当）を含めて下流 20 bpを連結した配列 である。また、 3'Xba I-luciは CLucの終止コドンを含めて上流 21bpの相補的な配列で ある。
[0113] 成熟型 CLuc cDNAを増幅する PCRは、各々のプライマー 300nM、 dNTP(4種のデォ キシヌクレオチド三リン酸の混合溶液) 200 μ M、 MgSO 100 μ Μ、铸型として pcDNA- C
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L 10 ng並びに KOD Plus buffer (1 X)及び KOD plus DNAポリメラーゼ 1Uを含む反応 溶液 50 /z lを用いて、第 1ステップ: 94°Cで 2分、第 2ステップ: 94°Cで 15秒 (変性)、 48°C で 30秒 (アニーリング)及び 68°Cで 2分 (伸長)のサイクルを 35サイクル並びに第 3ステツ プ： 68°Cで 3分で行った。
[0114] 得られた PCR産物を 1 %ァガロース電気泳動によって分析し、成熟型 CLuc cDNAを 含む約 1.6 kbの DNA断片を確認した。以下では、この DNA断片を「DNA断片 A」と呼
[0115] 一方、出芽酵母の aファクター分泌シグナルペプチド DNAを増幅するためのプライ マー (5 'Sma I-alpha及び alpha-luci-R)の配列は以下の通りであつた。
[0116] 5'Smaト alpha； GGGTCCCGGGATGAGATTTCCTTCAATTT (配列番号 18) 番号 19)
5'Sma I-alphaは、 αファクター分泌シグナルペプチドの開始コドン ATGを含めて下 流 28 bpであり、一方、 alpha-luci-Rは上記 alpha-luci-F (配列番号 16)の相補的な配 列である。
[0117] αファクター分泌シグナルペプチド DNAを増幅する PCRは、铸型としてサッカロミセ ス 'セレビシェ S288Cゲノム DNA 1 ng、プライマーとして 5'Sma I- alphaと alpha- luci-R を用い、第 2ステップの伸長反応時間を 30秒、第 3ステップを 1分としたこと以外は、上 記成熟型 CLuc cDNAを増幅した時と基本的に同じ条件で行った。
[0118] 得られた PCR産物を 1 %ァガロース電気泳動によって分析し、 αファクター分泌シグ ナルペプチド DNAを含む約 250 bpの DNA断片を確認した。以下では、この DNA断片 を「DNA断片 B」と呼ぶ。
[0119] DNA断片 Bの下流に DNA断片 Aを連結するために、プライマー 5'Sma I-alpha (配列 番号 18)と 3'Xba Huci (配列番号 17)を用いて overlap PCR法を行った。
[0120] overlap PCRは、铸型として上記 DNA断片 Aを含む PCR反応液及び DNA断片 Bを含 む PCR反応液をそれぞれ蒸留水で 100倍に希釈した溶液 1 μ 1ずつを用い、プライマ 一として 5'Sma I-alpha (配列番号 18)と 3'Xba Huci (配列番号 17)を用い、第 2ステップ のアニーリング温度を 50°C、伸長反応時間を 2分、第 3ステップを 3分とした以外は、上 記成熟型 CLuc cDNAを増幅した時と基本的に同じ条件で行った。
[0121] 得られた PCR産物を、 GenElute PCR clean-up kit (Sigma)を用いて精製し、最後に 蒸留水 40 μ 1で同キットのカラムから DNAを溶出した。この DNAを 50 μ 1反応液中、 Sma I 20 Uで 18時間切断した。 Sma Iで切断後、 DNAを再度 GenElute PCR clean-up kit を用いて精製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。
[0122] 次!、で、溶出した DNAを 50 μ 1反応液中、 Xba I 20Uで 18時間切断した。 Xba Iで切 断後、 DNAを GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同 キットのカラム力 DNAを溶出した。このようにして、 αファクター分泌シグナルぺプチ ド DNAの下流に成熟型 CLuc cDNAが連結した DNA断片が得られた。以下では、この DNA断片を DNA断片 Cと呼ぶ。
[0123] 一方、 pUG«35(http:// mips. gsf.de/proj/yeast/info/tools/hegemann/ gfti.html) 、 Xb a Iと Sac Iで切断し、 T4 DNA polymeraseで平滑末端ィ匕した後、自己環状ィ匕させること によって pUG35- MET25+MCSを作製した。次いで、 pUG35- MET25+MCSを Cla I及び Xho Iで切断し、ァガロース電気泳動により、ベクター断片（約 5.1 kbp)を回収した。一 方、このベクター断片を環状ィ匕させるため、下記のオリゴ DNAを合成し、アニーリング させることでリンカ一 DNAを作製した。
[0124] MCSリンカ一 F: CCGCTCGAGCGGCCGCGAGCTCGTCGACATCGATGG (配列 番号 20)
MCSリンカ一 R: CCATCGATGTCGACGAGCTCGCGGCCGCTCGAGCGG (配列 番号 21)
なお、作製したリンカ一 DNAは、 Xhol-Notl-Sacl-Sall-Clalの制限酵素サイトを含ん でいる。
[0125] アニーリングの後、 Xhol及び Clalで該リンカ一 DNAの両末端を切断した。ついで、 上記ベクター断片とリンカ一 DNAとを、 DNA Ligation Kit ver.2を用いて連結させ、大 腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転換体をー晚培養した後、 QuantumPrep Plas mid MiniPrep Kitを用いてプラスミドを抽出し、制限酵素の切断パターンと配列解析 により、 目的のプラスミドを保有した形質転換体を判別した。この形質転換体より目的 のプラスミド（以下、「pUG35— MET25— EGFP3+MCSJと!、う）を調製した。
[0126] さらに、 pUG35— MET25— EGFP3+MCSプラスミド 2 μ gを 50 μ 1反応液中、 Sma I 50 U で 18時間切断した。 Sma Iで切断後、 DNAを GenElute PCR clean-up kitを用いて精 製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。次いで、得られた DNAを 50 μ 1反応液中、 Xba I 50Uで 18時間切断した。 Xba Iで切断後、 DNAをァガロ ース電気泳動に供し、 pUG35- MET25- EGFP3+MCSプラスミドのベクター断片（約 5 k b)を回収した。以下では、このベクター断片を DNA断片 Dと呼ぶ。
[0127] DNA断片 Cと DNA断片 Dとを、 DNA Ligation Kit ver.2.1(タカラバイオ)を用いて連結
'環状化させた後、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した 後、 GenElute Plasmid MiniPrep kit (Sigma)を用いてプラスミドを抽出した。また、抽出 したプラスミドの Spe I及び Xba Iの切断パターンにより、 a CLucをコードする DNAが揷 入されたプラスミドを保有した形質転換体を判別した。
[0128] さらに、得られたプラスミド溶液にっ ヽて、 BigDye Terminator Cycle Sequencing Re ady Reaction kit ver.3.1 (アプライドバイオシステムズ）を用いて塩基配列の解析を行 い、プラスミド力 予想される a CLucをコードする塩基配列と一致する塩基配列を有 することを確認した。そこで、 a CLucをコードする塩基配列を含むプラスミドが由来す る形質転換体より、プラスミド (以下、「pCLuRA」という）を調製した。
[0129] 次に、 pCLuRAにサッカロミセス.セレピシェの TDH3(系統的遺伝子名： YGR192C) 遺伝子のプロモーター (配列番号 22 :以下、「TDH3プロモーター」という)を、 a CLuc をコードする DNAの 5'上流側に位置するように組み込んだ。ここで、 TDH3プロモータ 一とは、 TDH3遺伝子の 5 '上流側の非翻訳領域、すなわち、 TDH3遺伝子と TDH3遺 伝子の5 '上流隣接遺伝子である PDX1遺伝子とに挟まれる領域である (酵母ゲノムデ ~~ へ. ~~ス http://www.yeastgenome.org /参照)。
[0130] TDH3プロモーターを単離するための PCRのプライマー (5'TDH3_BamHI及び 3'TDH 3)の配列は以下の通りであった。
[0131] 5'TDH3— BamHI； GGGTGGATCCCGAGTTTATCATTATCAATAC (配列番号 23) 3'TDH3； TCGAAACTAAGTTCTTGGTG (配列番号 24)
5'TDH3_BamHlプライマーは、 TDH3オープンリーディングフレーム (ORF) 5'上流の PDX1 ORFの終始コドンの 3'下流 21塩基に Bam HI制限酵素サイトを 5'側に付カ卩した 配列である。一方、 3'TDH3プライマーは TDH3 ORF開始コドンより 5'上流 20塩基の 相補的な配列である。なお、プライマーの位置については酵母ゲノムデータベース（ http://www.yeastgenome.org/)を参照 れた ヽ。
[0132] PCRは、铸型としてサッカロミセス'セレピシェ S288Cゲノム DNA 1 ng、プライマーと して 5'TDH3_BamHI (配列番号 23)と 3'TDH3(配列番号 24)を用い、第 2ステップのァ ニーリング温度を 52°C、伸長反応時間を 30秒、第 3ステップを 1分とした以外は、上記 成熟型 CLuc cDNAを増幅した時と基本的に同じ条件で行った。
[0133] 得られた PCR産物を 1%ァガロース電気泳動によって分析し、約 650 bpの DNA断片 を確認した。そこで、得られた PCR産物を、 GenElute PCR clean-up kitを用いて精製 し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。このようにして得られ た TDH3プロモーターの DNA断片を、以下では「DNA断片 E」と呼ぶ。
[0134] 一方、 pCLuRA 2 μ gを 50 μ 1反応液中、 Sma I 50 Uで 18時間切断した。 Sma Iで切断 後、 DNAを GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キッ トのカラムから DNAを溶出した。次いで、得られた DNAを 50 1反応液中、 BamHI 50U で 18時間切断した後、ァガロース電気泳動に供し、ベクター断片 (約 5 kb)を回収し た。以下では、このベクター断片を「DNA断片 F」と呼ぶ。
[0135] DNA断片 Eと DNA断片 Fとを、 DNA Ligation Kit ver.2を用いて連結 ·環状化させた 後、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、 GenElute PI asmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドの制限酵 素の切断パターン及び塩基配列の解析により、 TDH3プロモーターをコードする DNA が挿入されたプラスミドを保有した形質転換体を判別した。 TDH3プロモーターをコー ドする DNAが挿入されたプラスミドが由来する形質転換体より、プラスミド (以下、「pC LuRA-TDH3j t 、う）を調製した。
[0136] pCLuRA-TDH3を用いてサッカロミセス'セレピシェ YPH500株を形質転換した。形 質転換には、 EZ- transformation kit (BIO 101)を用いた。
[0137] 得られた形質転換体を、ゥラシルを含まない合成寒天培地 (SD+KHLWadeプレート
;0.67% Yeast nitrogen base without amino acids (DIFCO)、 2%グルコース、 0.02 m g/ml硫酸アデニン、 0.02 mg/mlトリプトファン、 0.02 mg/mlヒスチジン、 0.03 mg/ml リシン、 0.03 mg/mlロイシン、 1.5%寒天）に塗布し、 30°Cで 3日間培養した。
[0138] 3日間の培養後、 pCLuRA- TDH3を保有する形質転換体を得た。当該 pCLuRA- TD
H3を保有する形質転換体が、 oc CLucを発現することとなる。
[0139] (2)形質転換体からの Cypridina noctiluca分泌型ルシフェラーゼの分泌発現と培養 液の至適 pHの検討
上記のように得られた pCLuRA-TDH3を保有する形質転換体を、ゥラシルを含まな い合成培地 (SD+KHLWade;0.67% Yeast nitrogen base without amino acids (DIFCO )、 2%グルコース、 0.02 mg/ml硫酸アデニン、 0.02 mg/mlトリプトファン、 0.02 mg/m 1ヒスチジン、 0.03 mg/mlリシン、 0.03 mg/mlロイシン）（以下では単に「SD培地」という )に接種して 30°Cで培養した。また、種々の pH (pH4.0、 5.0、 6.0、 6.5)に調整した 100 mMリン酸カリウム緩衝液を含む SD培地を調製し、同様に pCLuRA-TDH3を保有する 形質転換体を接種して 30°Cにて培養した。
[0140] 培養後、 600 應における吸光度がおよそ 0.4〜0.6に達した時点で、培養液を一部 採取し、遠心分離により菌体を除去し、培養上清を調製した。この培養上清に pCLuR A-TDH3を保有する形質転換体力ゝら分泌された CLucが存在していると考えられるの で、培養上清中の CLuc活性を測定した。
[0141] CLuc活性測定にはベルトールド社 LB960ルミノメーターを用いた。発光測定用の C ypridinaルシフェリン (ルシフェラーゼに対する基質)は、 50%エタノール- 5 mM HC1溶 液に溶解された 66 μ Μ又は 100 μ Μの保存液を 100 mM Tris- HCl (pH 7.4)で 2.5 μ Μ に用時希釈して用いた。
[0142] CLucによる Cypridinaルシフェリンの分解による発光強度は、上記のように調製され た培養上清 20 μ 1に対し、 2.5 μ M Cypridinaルシフェリン希釈溶液 80 μ 1を添カ卩し、 5 秒間の積算により測定した。この測定値を、培養液の 600 應における吸光度で除す ること〖こよって、酵母菌体数を補正した CLuc活性とした。結果を図 1に示す。
[0143] 図 1にお!/、て、縦軸の RLU/ODはルミノメーターの相対発光強度を 600 nmの吸光 度で除した値である。また、横軸のサンプルは、以下のサンプルを示す。
[0144] 「緩衝液なし」： 100 mMリン酸カリウム緩衝液をカ卩えな!/、SD培地にお!、て pCLuRA- T DH3を保有する形質転換体を培養したサンプル。
[0145] 「pH4.0」、「pH5.0」、「pH6.0」及び「pH6.5」：それぞれ、 pH4.0、 pH5.0、 pH6.0、 pH6.5 に調整した 100 mMリン酸カリウム緩衝液を含む SD培地で pCLuRA-TDH3を保有する 形質転換体を培養したサンプル。
[0146] さらに図 1においては、各サンプルの RLU/ODの値は平均値と標準偏差で示してい る。
[0147] 図 1に示すように、緩衝液 (100 mMリン酸カリウム緩衝液)をカ卩えず、 pHが次第に低 下する通常の SD培地にぉ 、ては、 pCLuRA-TDH3を保有する形質転換体は増殖す るものの、培養上清中において CLuc活性は検出されな力つた。また、 pH6.5に調整し た緩衝液を含む SD培地にぉ ヽては、 pCLuRA-TDH3を保有する形質転換体は生育 又は増殖しなかった。一方で、培地の pHが変動しないように pH4.0、 pH5.0又は pH6.0 の緩衝液をカ卩えた SD培地にぉ ヽては、培養上清中の CLuc活性を検出することが可 能であった。特に、 pH6.0の緩衝液をカ卩えた SD培地、すなわち、培地の pHが 6.0であ る場合、培養上清中の CLuc活性が最大値であり、最適であった。なお、これらの培 養上清サンプル中の CLuc活性測定は、 CLucの活性が最大となる pH 7.4で行った。 以上のように、形質転換体 (形質転換酵母)が増殖し、 CLucが失活しない培養条件を 確 レ 7こ。
[0148] 〔実施例 2〕 CLuc活性測定時における pH及び塩濃度の検討
CLucを酵母において分泌発現させた際の CLuc活性測定時における pH及び塩濃 度の条件について検討した。
[0149] 実施例 1で作製した pCLuRA-TDH3を保有する形質転換体から分泌された a CLuc を含む培養上清の調製は、実施例 1と同様に行い、培地の pHは 6.0とした。
[0150] CLuc活性測定時の pHを設定するために、 Cypridinaルシフェリンは種々の pHの緩 衝液 (最終濃度 1 OOmMのリン酸力リウム緩衝液 (KPi)又はトリス塩酸緩衝液 (Tris-HCl)) で 2.5 Mに希釈した希釈溶液を用いた。なお、当該 Cypridinaルシフェリン希釈溶液 は、培養上清に対して 4倍量加えた。 CLuc活性測定は、実施例 1と同様に行った。結 果を図 2Aに示す。
[0151] あるいは、各種の最終濃度の1¾3-1"^1( 1"[7.4)で希釈した2.5 μ m Cypridinaルシフ エリン希釈溶液を培養上清に対して 4倍量加えて、実施例 1と同様に CLuc活性測定 を行った。結果を図 2Bに示す。
[0152] 図 2A及び Bにおいて、縦軸の RLU/ODはルミノメーターの相対発光強度を 600 nm の吸光度で除した値である。各サンプルの RLU/ODの値は平均値と標準偏差で示し ている。また、図 2Aにおいて、「SD」は緩衝液を含まない SD培地で希釈した Cypridin aルシフェリン希釈溶液を用いたサンプル、「DDW」は水で希釈した Cypridinaルシフエ リン希釈溶液を用 、たサンプルである。
[0153] 図 2A及び B力も判るように、 CLuc( a CLuc)は、活性測定時のルシフェリン希釈溶 液の塩濃度や pHによって活性が変化することが示された。特に、 100 mM Tris-HCl ( pH7.0〜8.0)で希釈したルシフェリン希釈溶液を用いることにより、最大の CLuc活性を 得られた。
[0154] 〔実施例 3〕 CLuc活性測定時におけるルシフェリン濃度の検討
CLucを酵母において分泌発現させた際の CLuc活性測定時におけるルシフェリン 濃度について検討した。
[0155] 実施例 1で作製した pCLuRA-TDH3を保有する形質転換体力ゝら分泌された a CLuc を含む培養上清の調製は、実施例 1と同様に行い、培地の pHは 6.0とした。 Cypridina ルシフェリンは lOOmM Tris-HCl (pH 7.4)で種々の濃度に希釈したものを用い、反応 溶液において最終濃度 0.25、 0.5、 1.0、 2.0、 4.0 Mになるように希釈した。なお、各 種 Cypridinaルシフェリン希釈溶液中では、保存液とする際に溶解に使用したェタノ ールの濃度が同濃度になるように調整した。
[0156] 一方、 pCLuRA-TDH3を保有する形質転換体の培養上清は 100 mMリン酸緩衝液 を含む SD培地を用いて、原液から 10倍、 100倍、 1000倍、 10000倍に段階的に希釈し たものを用いた。すなわち、培養上清原液の濃度を 100%とした場合、 10倍、 100倍、 1000倍、 10000倍希釈したものは、それぞれ培養上清濃度が 10%、 1%、 0.1%、 0.01
%となる。
[0157] 以上のように調製した培養上清に対して各種 Cypridinaルシフェリン希釈溶液を 4倍 量加えて、実施例 1と同様に CLuc活性測定を行った。結果を図 3に示す。
[0158] 図 3において、各プロットは、反応溶液において各種最終濃度のルシフェリンに対 する、培養液上清原液を 100%として、段階的に希釈した培養上清を用いた結果を 示す。縦軸の RLUはルミノメーターにおける相対発光強度を示す。
[0159] 図 3に示したとおり、 CLuc活性は、ミカエリス-メンテン式に合致する濃度反応曲線 が得られた。その活性は反応溶液中のルシフェリン最終濃度約 1 μ Μ以上で飽和に 達することが分力つた。
[0160] そこで、以下の実施例において、反応溶液においてルシフェリン最終濃度が 2 μ Μ となるように添カ卩して、 CLuc活性測定を行うこととした。
[0161] 〔実施例 4〕酵母培養上清中の CLucの安定性の検討
CLucを酵母にぉ 、て分泌発現させた際の酵母培養上清中における CLucの安定 性について検討した。
[0162] 実施例 1で作製した pCLuRA-TDH3を保有する形質転換体力ゝら分泌された a CLuc を含む培養上清の調製及び CLuc活性の測定は実施例 1に従った。調製した培養上 清は 0°C、 25°C、 40°C又は 50°Cにてそれぞれ 0分、 15分、 30分、 60分インキュベートし 、その後、 CLuc活性を測定した。結果を図 4に示す。
[0163] 図 4において、各プロットは、各温度における一定時間のインキュベーションに対す る各サンプルの相対残存活性の平均と標準偏差を示す。縦軸は、インキュベーショ ンなしのサンプルの CLuc活性を 100%とした相対残存活性である。
[0164] 図 4に示したとおり、 CLucの酵素としての安定性は極めて高ぐ本発明におけるハ イスループットアツセィ法において必要とされるサンプリング後 15分を過ぎても室温保 存の状態において安定であることが証明された。
[0165] 〔実施例 5〕 CLuc活性測定における測定可能範囲の検討
CLucを酵母にぉ ヽて分泌発現させた際の酵母培養上清中における CLuc活性の 測定可能範囲 (ダイナミックレンジ）について検討した。
[0166] 実施例 1で作製した pCLuRA- TDH3を保有する形質転換体力も分泌された a CLuc を含む培養上清の調製および CLuc活性の測定は実施例 1に従った。なお、調製し た培養上清を、 100 mMリン酸緩衝液を含む SD培地を用いて 1000倍まで段階希釈し 、 CLuc活性測定に使用した。すなわち、培養上清原液の濃度を 100%とした場合、 培養上清濃度が 0.01%となる培養上清までを調製した。結果を図 5に示す。 [0167] 図 5において、各プロットは、段階的に希釈した培養上清サンプル (培養上清濃度 %)に対する RLUの平均と標準偏差を示す。縦軸の RLUはルミノメーターにおける相 対発光強度を示す。なお、図に示す CV値は、 3回の繰り返し測定における変動係数 ( 標準偏差/平均 X 100)である。
[0168] 図 5に示したとおり、 CLucの活性は、 103の範囲において直線性が成立することが分 かった。これにより、 CLucを利用したレポーターアツセィ系では最大 1000倍までの変 化を定量的に測定することが可能であると証明された。
[0169] 〔実施例 6〕 CLuc活性測定における各種ィ匕学物質の影響の検討
CLucを酵母にお ヽて分泌発現させた際の酵母培養上清と共に、 CLuc活性測定に お 、て共存する化学物質の CLuc活性測定に与える影響にっ 、て検討した。
[0170] 検討に用いた各種化学物質 (DTT、 CuSO、メナジオン (Menadione)、ジアミド、 H 0
4 2 2
、エタノール、 NaCl、ソルビトール、ガラクトース、ラフイノース、スクロース、マンノース） は、酵母の遺伝子発現を誘導できることが知られている (Audrey P. Gasch, Paul T. S pellman, Camilla M. Kao Orna Carmel-Harel, Michael B. Eisen, Gisela Storz, David Botstein及び Patrick O. Brown (2000) Mol. Biol. Cell. 11 ,4241-4257、 Varela JC, Pr aekelt UM, Meacock PA, Planta RJ, Mager WH" (1995) Mol Cell Biol. 15:6232—45、 Macreadie IG, Horaitis O, Verkuylen AJ, Savin KW.(1991) Gene. l04: 107- 11)。本実 施例では、各種化学物質を酵母の遺伝子発現を十分に誘導できることが知られて!/ヽ る濃度より段階希釈して使用した。
[0171] 実施例 1で作製した pCLuRA-TDH3を保有する形質転換体力ゝら分泌された a CLuc を含む培養上清の調製および CLuc活性の測定は実施例 1に従った。
[0172] 調製した培養上清 20 μ 1に各種濃度に調整した化学物質を 2 μ 1添加した後 CLuc活 性を測定した。結果を図 6に示す。
[0173] 図 6では、培養上清に添加した各種濃度の化学物質に対する相対残存活性を示 す。各サンプルの相対残存活性は、化学物質をカ卩えないサンプルの CLuc活性を 100 %として、平均及び標準偏差で示している。
[0174] 図 6に示したとおり、 CLucは、高濃度の CuSOや高濃度のエタノール以外、酵母の
4
遺伝子発現を活性化するような化学物質に対し酵素活性が抑制されないことが明ら 力となった。これにより CLucをレポータータンパク質としたレポーターアツセィ系が広 範囲にわたる化学物質に対応することが証明された。
[0175] 〔実施例 7〕濁度による CLuc生産量の補正方法の検討
CLucの生産量は、酵母内のプロモーター活性と酵母細胞数に依存する。従って、 酵母のプロモーターの強さを、 CLuc活性を用いて測定するには、酵母細胞数を補正 する必要がある。そこで、一種類の形質転換酵母について、様々な菌体密度の培養 液を調製し、 CLucの活性を測定すると共に菌体密度の指標である濁度 (600 應の吸 光度)で補正することができるかどうか検討した。
[0176] 実施例 1で作製した pCLuRA-TDH3を保有する形質転換体を実施例 1と同様に培 養した。 30°Cで約 48時間培養し、定常期に達した時点で培養液を得た。この培養液 を、 1/100から 1/1000に新しい培地で希釈し、再び 30°Cでおよそ 20時間培養を続け た。
[0177] 培養後、培養上清の調製および CLuc活性の測定を、実施例 1に従って行った。ま た、培養液又は培養上清から 200 1を採取し、培養液又は培養上清の濁度をテカン 社サンライズリモートを用いて 600 應の吸光度 (OD)にて測定した。結果を図 7A及び Bに示す。
[0178] 図 7Aは、様々な濁度の培養液又は培養上清に対する相対発光濃度を示す。縦軸 の RLUは、ルミノメーターにおける相対発光濃度を示す。
[0179] 一方、図 7Bは、図 7Aに示した菌体を含む培養液及び培養液から遠心分離して得 た培養上清の全てのサンプルに対する RLU/ODの平均値と標準偏差を示す。縦軸 の RLU/ODはルミノメーターの相対発光強度を 600 nmの吸光度で除した値である。
[0180] 図 7Bに示したとおり、培養液又は培養上清の RLUを濁度で補正することによって、 同一のプロモーター (TDH3プロモーター)を有する酵母を培養した培養液又は培養 上清からは、ほぼ同じ値の RLU/ODの結果を得ることができた。すなわち、酵母の増 殖フェーズを揃えることなぐ酵母の増殖フェーズが多少異なっていても、本発明に 係る方法を用いてプロモーター活性を評価できることが示された。さらに、培養上清 における測定結果と、菌体を含む培養液の測定結果とには良好な相関が認められ、 本測定系は菌体の遠心分離を必要としないことが証明された。 [0181] 〔実施例 8〕培養液サンプリング後の CLuc活性の安定性
本発明に係る方法を用いて、 96穴フォーマットによるハイスループットアツセィを実 施するためには、培養液を採取した後、ルミノメーターによる CLuc活性を 96サンプル 全て測定している間に、 CLuc活性値が変動しないことが求められる。
[0182] そこで培養液サンプリング後の CLuc活性の安定性を検討するために、実施例 1で 作製した pCLuRA-TDH3を保有する形質転換体を、実施例 1に従って培養し、酵母 培養液を一部採取した (サンプリング)後、 25°Cで 0、 10、 20、 30分インキュベートした。 インキュベーション後、それぞれの培養液サンプルにおいて、 CLuc活性を実施例 1 に従って測定した。結果を図 8に示す。
[0183] 図 8にお!/、ては、サンプリング後すぐに測定したサンプルの CLuc活性を 100%として 、相対残存活性で示した。図 8では、各サンプルの相対残存活性を平均と標準偏差 で示している。
[0184] 図 8に示したように、サンプリング後、培養液を 25°Cで 30分間インキュベーションして も、 CLuc活性はほとんど変化しなかった。すなわち、ルミノメーターで 96サンプルを測 定するために必要な時間である 30分間、サンプリング後、室温で放置しても、培養液 中の CLucの活性はほとんど変化しな力つた。従って、本発明に係る方法はハイスル 一プット測定が可能なレポーターアツセィ系であることが示された。
[0185] 〔実施例 9〕 96穴ディープゥエルプレートを用いた CLuc発現酵母の同時培養を含めた ハイスループットレポーターアツセィ法の確立
本発明に係る方法をハイスループットアツセィ化するには、形質転換酵母の培養も 96穴フォーマットで行う必要がある。そこで、同一の形質転換酵母を 96穴ディープゥ エルプレートで 96サンプル個々に培養し、それらが示す濁度で補正された CLucの活 性が一致するかどうかを調べた。
[0186] 実施例 1で作製した pCLuRA-TDH3を保有する形質転換体を実施例 1に従って 30 °Cで培養して、定常期に達した培養液を得た。この培養液を新しい培地で 1/100に 希釈した後、 96穴ディープゥエルプレートの全てのゥエルに 1 mlずつ植菌し、再び 30 °Cでおよそ 16時間培養を続けた。各ゥエル力 酵母培養液を一部採取した後、 25°C で 0、 10、 20、 30分インキュベートした後に、それぞれの培養液サンプルにおいて、 CL uc活性を実施例 1に従って測定した。結果を図 9に示す。
[0187] 図 9は、 96穴ディープゥエルプレートにおいて独立に培養し、 CLuc活性を測定した 場合の RLU/ODの平均値と標準偏差を示す。図 9において、縦軸の RLU/ODはルミ ノメーターの相対発光強度を 600 nmの吸光度で除した値である。
[0188] 図 9に示したとおり、 96穴ディープゥエルプレートを培養に用いることにって多数の サンプルを同時培養した場合においても濁度で補正された CLucの活性値はほとん ど同じであった。したがって、本発明に係る方法はハイスループット測定が可能なレ ポーターアツセィ系であることが示された。
[0189] 〔実施例 10〕塩基配列を酵母用に改変した CLucをコードする DNAの調製
CLucを出芽酵母サッカロミセス'セレピシェにおいてレポーター酵素として用いるた めに、 CLucをコードする DNAを再デザインした。そのためにまず、 Akashiらの論文（G enetics 164: 1291-1303 (2003))における酵母のコドン利用頻度を参考にして、 CLuc のアミノ酸配列を酵母の最適コドンを用いて塩基配列に変換した。次いで、このように 決められた CLucをコードする塩基配列内に含まれる、酵母転写因子が結合する可能 '性のある cis配列をウェブサイト Yeast Promoter Database;SCPD(http://cgsigma.cshl. org/jian/)を用いて検索した。この検索により見いだされた酵母転写因子が結合する 可能性がある cis配列について、コードするアミノ酸配列が変わらないように 1又は数 個の塩基を置換した。同様な潜在的 cis配列の探索を Genomatix社が提供する制御 領域解析用ウェブサイト (http：〃 www.genomatix.de/)を用いて行った。これら 2種の cis 配列データベースを繰り返し用いて、潜在的 cis配列の探索と塩基置換による除去を 繰り返し、最終的に可能な限り潜在的転写因子結合配列を減らした CLucをコードす る DNAの配列をデザインした (配列番号 15)。以下、この配列を「mCLuc DNA」と呼ぶ 。 mCLuc DNAは、 CLuc cDNA (配列番号 1)と塩基配列が異なる力 コードされるタン パク質のアミノ酸配列は、 CLuc (配列番号 2)と同一である。ただし、以下では、 mCLuc DNAによりコードされるタンパク質を「mCLuc」と呼ぶ。
[0190] (l) mCLuc DNAの各 DNA断片の作製
mCLuc DNAを構成する二本鎖の全ての DNA配列を、以下に示す 28本の合成 DNA として依頼合成により作製した。これらは、 14組の一部相補的な配列を有する一本鎖 DNAのペアであり、これらのペアごとにァニールさせ、 DNAポリメラーゼを用いて伸長 反応により二本鎖とした。
[0191] 1組目の合成 DNAペアの配列は以下の通りであった。
CTACTGTTCACTGTCAAGACTGTCCATAC (配列番号 25)
TGTTCGGTGGGTCTGGTTCGTATGGACAG (配列番号 26)
native_signal_lFは、 mCLuc DNAの開始コドンを含めてより 3'側に 69bpの長さを有す る合成 DNAであり、一方、 CLuc_mature_lRは、 mCLuc DNAの 60bpから 129bpまでの 7 Obpの相補鎖の合成 DNAである。この 2つの合成 DNAには、 10bpの相補的な配列が 含まれている。この 2つの合成 DNAを用いた DNA伸長反応は、各々の合成 DNA 3 μ M、 dNTP(4種のデォキシヌクレオチド三リン酸の混合溶液) 200 μ M、 MgSO 100 μ Μ
4
、 KOD Plus Buffer (IX)及び DNAポリメラーゼ 1Uを含む反応溶液 50 1を用いて、第 1 ステップ： 94°Cで 2分、第 2ステップ: 94°Cで 15秒 (変性）、 42°Cで 30秒 (アニーリング） 及び 68°Cで 30秒（伸長）のサイクルを 35サイクル、並びに第 3ステップ： 68°Cで 1分で 行った。
[0193] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 130bpの DNA断片を 確認した。
[0194] 得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で 100倍に希釈し、こ れを「DNA断片 1」と呼ぶ。
[0195] 2組目の合成 DNAペアの配列は以下の通りであった。
TATTGTCTGACGGTTTGTGTGAAAACAAG (配列番号 27)
TACAACAAGTCTTGCCAGGCTTGTTTTCA (配列番号 28)
CLuc_mature_2Fは、 mCLuc DNAの 120bpより 189bpまでの 70bpの長さを有する合成 DNAであり、一方、 CLuc_mature_3Rは、 mCLuc DNAの 180bpから 249bpまでの 70bpの 相補鎖の合成 DNAである。この 2つの合成 DNAには、 lObpの相補的な配列が含まれ ている。この 2つの合成 DNAを用いた DNA伸長反応は、上記 DNA断片 1の作製と全く 同じ条件で行った。
[0197] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 130bpの DNA断片を 確認した。
[0198] 得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で 100倍に希釈し、こ れを「DNA断片 2」と呼ぶ。
[0199] 3組目の合成 DNAペアの配列は以下の通りであった。
[0200]
TCCAATTCCAAGAACCAGGTACTTACGTC (配列番号 29)
CTTTGGTACCTTGGCCTAAGACGTAAGTA (配列番号 30)
CLuc_mature_4Fは、 mCLuc DNAの 240bpより 309bpまでの 70bpの長さを有する合成 DNAであり、一方、 CLuc— mature— 5Rは、 mCLuc DNAの 300bpから 369bpまでの 70bpの 相補鎖の合成 DNAである。この 2つの合成 DNAには lObpの相補的な配列が含まれて いる。この 2つの合成 DNAを用いた DNA伸長反応は上記 DNA断片 1の作製と全く同じ 条件で行った。
[0201] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 130bpの DNA断片を 確認した。
[0202] 得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で 100倍に希釈し、こ れを「DNA断片 3」と呼ぶ。
[0203] 4組目の合成 DNAペアの配列は以下の通りであった。
[0204] CLuc— mature— 6F:
GGTTAGAAGTCGCTGGTGATATTATCGAC (配列番号 31)
CLuc— mature— 7R:GGCGATGATAGGATCAGCACCACCATT7
1^1^ 〇丁 〇じ丁丁〇 〇じ〇 丁〇1^〇 丁^丁 （配列番号32) CLuc_mature_6Fは、 mCLuc DNAの 360bpより 429bpまでの 70bpの長さを有する合成 DNAであり、一方、 CLuc— mature— 7Rは、 mCLuc DNAの 420bpから 489bpまでの 70bpの 相補鎖の合成 DNAである。この 2つの合成 DNAには lObpの相補的な配列が含まれて いる。この 2つの合成 DNAを用いた DNA伸長反応は上記 DNA断片 1の作製と全く同じ 条件で行った。
[0205] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 130bpの DNA断片を 確認した。
[0206] 得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で 100倍に希釈し、こ れを「DNA断片 4」と呼ぶ。
[0207] 5組目の合成 DNAペアの配列は以下の通りであった。
[0208]
CCGTCGTTGAGATGCCAGGCTTTAACATT (配列番号 33)
TGAAGAACTCGATTACGGTAATGTTAAAG (配列番号 34)
CLuc— mature— 8Fは、 mCLuc DNAの 480bpより 549bpまでの 70bpの長さを有する合成 DNAであり、一方、 CLuc_mature_9Rは、 mCLuc DNAの 540bpから 609bpまでの 70bpの 相補鎖の合成 DNAである。この 2つの合成 DNAには lObpの相補的な配列が含まれて いる。この 2つの合成 DNAを用いた DNA伸長反応は上記 DNA断片 1の作製と全く同じ 条件で行った。
[0209] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 130bpの DNA断片を 確認した。
[0210] 得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で 100倍に希釈し、こ れを「DNA断片 5」と呼ぶ。
[0211] 6組目の合成 DNAペアの配列は以下の通りであった。 1^1^丁〇〇丁丁丁〇丁〇丁〇〇じ0 1^1^ 〇 丁〇（配列番号35) GTGAAATCAGTGTCCTCCATCATCTTGAGA (配列番号 36)
CLuc_mature_10Fは、 mCLuc DNAの 600bpより 669bpまでの 70bpの長さを有する合 成 DNAであり、一方、 CLuc_mature_llRは、 mCLuc DNAの 720bpから 789bpまでの 70b Pの相補鎖の合成 DNAである。この 2つの合成 DNAには lObpの相補的な配列が含ま れて 、る。この 2つの合成 DNAを用いた DNA伸長反応は上記 DNA断片 1の作製と全 く同じ条件で行った。
[0213] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 130bpの DNA断片を 確認した。
[0214] 得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で 100倍に希釈し、こ れを「DNA断片 6」と呼ぶ。
[0215] 7組目の合成 DNAペアの配列は以下の通りであった。
AATCCTGATGACGTCGCTTACTGTAAAGGC (配列番号37)
CTTTGTATGGTTCCAACAAGCCTTTACAG (配列番号 38)
CLuc_mature_12Fは、 mCLuc DNAの 720bpより 789bpまでの 70bpの長さを有する合 成 DNAであり、一方、 CLuc_mature_13Rは、 mCLuc DNAの 780bpから 849bpまでの 70b Pの相補鎖の合成 DNAである。この 2つの合成 DNAには lObpの相補的な配列が含ま れて 、る。この 2つの合成 DNAを用いた DNA伸長反応は上記 DNA断片 1の作製と全 く同じ条件で行った。
[0217] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 130bpの DNA断片を 確認した。
[0218] 得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で 100倍に希釈し、こ れを「DNA断片 7」と呼ぶ。
[0219] 8組目の合成 DNAペアの配列は以下の通りであった。 〇 。〇 〇。〇丁〇。 1^1^ 丁〇丁丁丁丁〇丁丁〇0 。（配列番号39)
GCAGCACAAGTCTCTCTGTAGTCCAACAAA (配列番号 40)
CLuc_mature_14Fは、 mCLuc DNAの 840bpより 909bpまでの 70bpの長さを有する合 成 DNAであり、一方、 CLuc— mature— 15Rは、 mCLuc DNAの 900bpから 969bpまでの 70b Pの相補鎖の合成 DNAである。この 2つの合成 DNAには lObpの相補的な配列が含ま れて 、る。この 2つの合成 DNAを用いた DNA伸長反応は上記 DNA断片 1の作製と全 く同じ条件で行った。
[0221] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 130bpの DNA断片を 確認した。
[0222] 得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で 100倍に希釈し、こ れを「DNA断片 8」と呼ぶ。
[0223] 9組目の合成 DNAペアの配列は以下の通りであった。
CAATTCCAAGGGCCGTGCAAGGAAATACTA (配列番号 41)
CAGAAGCAGTCCGCAGCCATTAGTATTTCC (配列番号 42)
CLuc_mature_16Fは、 mCLuc DNAの 960bpより 1029bpまでの 70bpの長さを有する合 成 DNAであり、一方、 CLuc_mature_17Rは、 mCLuc DNAの 1020bpから 1089bpまでの 7 Obpの相補鎖の合成 DNAである。この 2つの合成 DNAには lObpの相補的な配列が含 まれている。この 2つの合成 DNAを用いた DNA伸長反応は上記 DNA断片 1の作製と 全く同じ条件で行った。
[0225] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 130bpの DNA断片を 確認した。
[0226] 得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で 100倍に希釈し、こ れを「DNA断片 9」と呼ぶ。
[0227] 10組目の合成 DNAペアの配列は以下の通りであった
[0228] CLuc— mature—
CGTAAGCAGTCCACTGTCGTCGAATTGATC (配列番号 43)
AAGATTTGCTTACCGTCAACGATCAATTCG (配列番号 44)
CLuc_mature_18Fは、 mCLuc DNAの 1080bpより 1149bpまでの 70bpの長さを有する 合成 DNAであり、一方、 CLuc_mature_19Rは、 mCLuc DNAの 1140bpから 1209bpまで の 70bpの相補鎖の合成 DNAである。この 2つの合成 DNAには 10bpの相補的な配列 が含まれている。この 2つの合成 DNAを用いた DNA伸長反応は上記 DNA断片 1の作 製と全く同じ条件で行った。
[0229] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 130bpの DNA断片を 確認した。
[0230] 得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で 100倍に希釈し、こ れを「DNA断片 10」と呼ぶ。
[0231] 11組目の合成 DNAペアの配列は以下の通りであった。
[0232]
ATCTTAACCACTGCTATCTTGCCAGAAGCC (配列番号 45)
AAGTTGAACTTGACGACCAAGGCTTCTGGC (配列番号 46)
CLuc_mature_20Fは、 mCLuc DNAの 1200bpより 1269bpまでの 70bpの長さを有する 合成 DNAであり、一方、 CLuc_mature_21Rは、 mCLuc DNAの 1260bpから 1329bpまで の 70bpの相補鎖の合成 DNAである。この 2つの合成 DNAには 10bpの相補的な配列 が含まれている。この 2つの合成 DNAを用いた DNA伸長反応は上記 DNA断片 1の作 製と全く同じ条件で行った。
[0233] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 130bpの DNA断片を 確認した。 [0234] 得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で 100倍に希釈し、こ れを「DNA断片 11」と呼ぶ。
[0235] 12組目の合成 DNAペアの配列は以下の通りであった。
[0236]
AATCAGGACTTCTCTGACGATTCTTTCGAC (配列番号 47)
GATCGCAAGCACCTTCAGCGTCGAAAGAA (配列番号 48)
CLuc_mature_22Fは、 mCLuc DNAの 1320bpより 1389bpまでの 70bpの長さを有する 合成 DNAであり、一方、 CLuc— mature— 23Rは、 mCLuc DNAの 1380bpから 1449bpまで の 70bpの相補鎖の合成 DNAである。この 2つの合成 DNAには 10bpの相補的な配列 が含まれている。この 2つの合成 DNAを用いた DNA伸長反応は上記 DNA断片 1の作 製と全く同じ条件で行った。
[0237] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 130bpの DNA断片を 確認した。
[0238] 得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で 100倍に希釈し、こ れを「DNA断片 12」と呼ぶ。
[0239] 13組目の合成 DNAペアの配列は以下の通りであった。
[0240]
GCTGGTCAATCCGATTTGGACCAAAAGTGT (配列番号 49)
AGATGTATGTACGAATACTGTTTGAGAGGT (配列番号 50)
CLuc_mature_24Fは、 mCLuc DNAの 1440bpより 1509bpまでの 70bpの長さを有する 合成 DNAであり、一方、 CLuc_mature_25Rは、 mCLuc DNAの 1500bpから 1569bpまで の 70bpの相補鎖の合成 DNAである。この 2つの合成 DNAには 10bpの相補的な配列 が含まれている。この 2つの合成 DNAを用いた DNA伸長反応は上記 DNA断片 1の作 製と全く同じ条件で行った。 [0241] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 130bpの DNA断片を 確認した。
[0242] 得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で 100倍に希釈し、こ れを「DNA断片 13」と呼ぶ。
[0243] 14組目の合成 DNAペアの配列は以下の通りであった。
[0244]
TTCAAGAAGGAGTGCTATATCAAGCACGGC (配列番号 51) じ丁丁0 (配列番号52)
CLuc_mature_26Fは、 mCLuc DNAの 1560bpより 1629bpまでの 70bpの長さを有する 合成 DNAであり、一方、 CLuc_mature_27Rは、 mCLuc DNAの 1620bpから 1663bpまで の終始コドン TAGを含む 44bpの相補鎖の合成 DNAである。この 2つの合成 DNAには 1 Obpの相補的な配列が含まれて 、る。この 2つの合成 DNAを用いた DNA伸長反応は 上記 DNA断片 1の作製と全く同じ条件で行った。
[0245] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 lOObpの DNA断片を 確認した。
[0246] 得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この溶出液を蒸留水で 100倍に希釈し、こ れを「DNA断片 14」と呼ぶ。
[0247] (2) mCLuc DNA断片の連結
上記（1)で得られた DNA断片 1〜14を、オーバーラップ PCR法を用いて連結した。
[0248] 2-1. DNA断片 1と DNA断片 2との連結
上記 native_signal_lF (配列番号 25)と CLuc_mature_3R (配列番号 28)とをプライマー として用いた PCRにより DNA断片 1と DNA断片 2とを連結した。
[0249] PCRは、各々のプライマー 300nM、 dNTP (4種のデォキシヌクレオチド三リン酸の混 合溶液） 200 μ M、 MgSO 100 μ Μ、铸型として DNA断片 1及び DNA断片 2を各々 1 μ 1
4
ずつ、並びに KOD Plus Buffer (IX)及び DNAポリメラーゼ 1Uを含む反応溶液 50 μ 1を 用いて、第 1ステップ： 94°Cで 2分、第 2ステップ: 94°Cで 15秒 (変性）、 42°Cで 30秒 (ァ ニーリング)及び 68°Cで 30秒（伸長）のサイクルを 35サイクル、並びに第 3ステップ： 68 °Cで 1分で行った。
[0250] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 250bpの DNA断片を 確認した。続いて、得られた PCR産物全量を 2%ァガロースゲルにより電気泳動し、約 250bpのバンドを切り出し、フエノール'クロ口ホルムを用いたゲル抽出法により DNA断 片を抽出した。得られた DNA断片を 20 1の蒸留水に溶解した後、蒸留水により 100 倍に希釈した。これを「DNA断片 15」と呼ぶ。
[0251] 2-2. DNA断片 3と DNA断片 4との連結
上記 CLuc_mature_4F (配列番号 29)と CLuc_mature_7R (配列番号 32)とをプライマー として用いた PCRにより DNA断片 3と DNA断片 4とを連結した。
[0252] これらプライマーを用いた PCRは、铸型として DNA断片 3及び DNA断片 4を各々 1 μ 1 ずつ用いた以外は、上記 2-1の PCRと同様の条件で行った。
[0253] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 250bpの DNA断片を 確認した。続いて、得られた PCR産物全量を 2%ァガロースゲルにより電気泳動し、約 250bpのバンドを切り出し、フエノール'クロ口ホルムを用いたゲル抽出法により DNA断 片を抽出した。得られた DNA断片を 20 1の蒸留水に溶解した後、蒸留水により 100 倍に希釈した。これを「DNA断片 16」と呼ぶ。
[0254] 2-3. DNA断片 5と DNA断片 6との連結
上記 CLuc_mature_8F (配列番号 33)と CLuc_mature_llR (配列番号 36)とをプライマ 一として用いた PCRにより DNA断片 5と DNA断片 6とを連結した。
[0255] これらプライマーを用いた PCRは、铸型として DNA断片 5及び DNA断片 6を各々 1 μ 1 ずつ用いた以外は、上記 2-1の PCRと同様の条件で行った。
[0256] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 250bpの DNA断片を 確認した。続いて、得られた PCR産物全量を 2%ァガロースゲルにより電気泳動し、約 250bpのバンドを切り出し、フエノール'クロ口ホルムを用いたゲル抽出法により DNA断 片を抽出した。得られた DNA断片を 20 1の蒸留水に溶解した後、蒸留水により 100 倍に希釈した。これを「DNA断片 17」と呼ぶ。 [0257] 2-4. DNA断片 7と DNA断片 8との連結
上記 CLuc_mature_12F (配列番号 37)と CLuc_mature_15R (配列番号 40)とをプライマ 一として用いた PCRにより DNA断片 7と DNA断片 8とを連結した。
[0258] これらプライマーを用いた PCRは、铸型として DNA断片 7及び DNA断片 8を各々 1 μ 1 ずつ用いた以外は、上記 2-1の PCRと同様の条件で行った。
[0259] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 250bpの DNA断片を 確認した。続いて、得られた PCR産物全量を 2%ァガロースゲルにより電気泳動し、約
250bpのバンドを切り出し、フエノール'クロ口ホルムを用いたゲル抽出法により DNA断 片を抽出した。得られた DNA断片を 20 1の蒸留水に溶解した後、蒸留水により 100 倍に希釈した。これを「DNA断片 18」と呼ぶ。
[0260] 2-5. DNA断片 9と DNA断片 10との連結
上記 CLuc_mature_16F (配列番号 41)と CLuc_mature_19R (配列番号 44)とをプライマ 一として用いた PCRにより DNA断片 9と DNA断片 10とを連結した。
[0261] これらプライマーを用いた PCRは、铸型として DNA断片 9及び DNA断片 10を各々 1 μ 1ずつ用いた以外は、上記 2-1の PCRと同様の条件で行った。
[0262] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 250bpの DNA断片を 確認した。続いて、得られた PCR産物全量を 2%ァガロースゲルにより電気泳動し、約
250bpのバンドを切り出し、フエノール'クロ口ホルムを用いたゲル抽出法により DNA断 片を抽出した。得られた DNA断片を 20 1の蒸留水に溶解した後、蒸留水により 100 倍に希釈した。これを「DNA断片 19」と呼ぶ。
[0263] 2-6. DNA断片 11と DNA断片 12との連結
上記 CLuc_mature_20F (配列番号 45)と CLuc_mature_23R (配列番号 48)とをプライマ 一として用いた PCRにより DNA断片 11と DNA断片 12とを連結した。
[0264] これらプライマーを用いた PCRは、铸型として DNA断片 11及び DNA断片 12を各々 1 μ 1ずつ用いた以外は、上記 2-1の PCRと同様の条件で行った。
[0265] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 250bpの DNA断片を 確認した。続いて、得られた PCR産物全量を 2%ァガロースゲルにより電気泳動し、約
250bpのバンドを切り出し、フエノール'クロ口ホルムを用いたゲル抽出法により DNA断 片を抽出した。得られた DNA断片を 20 1の蒸留水に溶解した後、蒸留水により 100 倍に希釈した。これを「DNA断片 20」と呼ぶ。
[0266] 2-7. DNA断片 13と DNA断片 14との連結
上記 CLuc_mature_24F (配列番号 49)と CLuc_mature_27R (配列番号 52)とをプライマ 一として用いた PCRにより DNA断片 13と DNA断片 14とを連結した。
[0267] これらプライマーを用いた PCRは、铸型として DNA断片 13及び DNA断片 14を各々 1 μ 1ずつ用いた以外は、上記 2-1の PCRと同様の条件で行った。
[0268] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 230bpの DNA断片を 確認した。続いて、得られた PCR産物全量を 2%ァガロースゲルにより電気泳動し、約
230bpのバンドを切り出し、フエノール'クロ口ホルムを用いたゲル抽出法により DNA断 片を抽出した。得られた DNA断片を 20 1の蒸留水に溶解した後、蒸留水により 100 倍に希釈した。これを「DNA断片 21」と呼ぶ。
[0269] 2-8. DNA断片 16と DNA断片 17との連結
上記 CLuc_mature_4F (配列番号 29)と CLuc_mature_llR (配列番号 36)とをプライマ 一として用いた PCRにより DNA断片 16と DNA断片 17とを連結した。
[0270] これらプライマーを用いた PCRは、铸型として DNA断片 16及び DNA断片 17を各々 1 μ 1ずつ用いた以外は、上記 2-1の PCRと同様の条件で行った。
[0271] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 490bpの DNA断片を 確認した。続いて、得られた PCR産物全量を 2%ァガロースゲルにより電気泳動し、約
490bpのバンドを切り出し、フエノール'クロ口ホルムを用いたゲル抽出法により DNA断 片を抽出した。得られた DNA断片を 20 1の蒸留水に溶解した後、蒸留水により 100 倍に希釈した。これを「DNA断片 22」と呼ぶ。
[0272] 2-9. DNA断片 18と DNA断片 19との連結
上記 CLuc_mature_12F (配列番号 37)と CLuc_mature_19R (配列番号 44)とをプライマ 一として用いた PCRにより DNA断片 18と DNA断片 19とを連結した。
[0273] これらプライマーを用いた PCRは、铸型として DNA断片 18及び DNA断片 19を各々 1 μ 1ずつ用いた以外は、上記 2-1の PCRと同様の条件で行った。
[0274] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 490bpの断片を確認し た。続いて、得られた PCR産物全量を 2%ァガロースゲルにより電気泳動し、約 490bp のバンドを切り出し、フエノール'クロ口ホルムを用いたゲル抽出法により DNA断片を 抽出した。得られた DNA断片を 20 1の蒸留水に溶解した後、蒸留水により 100倍に 希釈した。これを「DNA断片 23」と呼ぶ。
[0275] 2-10. DNA断片 20と DNA断片 21との連結
上記 CLuc_mature_20F (配列番号 45)と CLuc_mature_27R (配列番号 52)とをプライマ 一として用いた PCRにより DNA断片 20と DNA断片 21とを連結した。
[0276] これらプライマーを用いた PCRは、铸型として DNA断片 20及び DNA断片 21を各々 1 μ 1ずつ用いた以外は、上記 2-1の PCRと同様の条件で行った。
[0277] 得られた PCR産物を 2%ァガロース電気泳動により分析し、約 470bpの DNA断片を 確認した。続いて、得られた PCR産物全量を 2%ァガロースゲルにより電気泳動し、約 470bpのバンドを切り出し、フエノール'クロ口ホルムを用いたゲル抽出法により DNA断 片を抽出した。得られた DNA断片を 20 1の蒸留水に溶解した後、蒸留水により 100 倍に希釈した。これを「DNA断片 24」と呼ぶ。
[0278] 2-11. DNA断片 15と DNA断片 22との連結
上記 native_signal_lF (配列番号 25)と CLuc_mature_llR (配列番号 36)とをプライマー として用いた PCRにより DNA断片 15と DNA断片 22とを連結した。
[0279] PCRは、各々のプライマー 300nM、 dNTP(4種のデォキシヌクレオチド三リン酸の混 合溶液） 200 μ M、 MgSO 100 μ Μ、铸型として DNA断片 15及び DNA断片 22を各々 1
4
μ 1ずつ、並びに KOD Plus Buffer (IX)及び DNAポリメラーゼ 1Uを含む反応溶液 50 μ 1を用いて、第 1ステップ: 94°Cで 2分、第 2ステップ: 94°Cで 15秒 (変性）、 42°Cで 30秒（ アニーリング)及び 68°Cで 1分（伸長）のサイクルを 35サイクル、並びに第 3ステップ： 68 °Cで 2分で行った。
[0280] 得られた PCR産物を 1%ァガロース電気泳動により分析し、約 730bpの DNA断片を 確認した。続いて、得られた PCR産物全量を 1%ァガロースゲルにより電気泳動し、約 730bpのバンドを切り出し、フエノール'クロ口ホルムを用いたゲル抽出法により DNA断 片を抽出した。得られた DNA断片を 20 1の蒸留水に溶解した後、蒸留水により 100 倍に希釈した。これを「DNA断片 25」と呼ぶ。 [0281] 2-12. DNA断片 23と DNA断片 24との連結
上記 CLuc_mature_12F (配列番号 37)と CLuc_mature_27R (配列番号 52)とをプライマ 一として用いた PCRにより DNA断片 23と DNA断片 24とを連結した。
[0282] これらプライマーを用いた PCRは、铸型として DNA断片 23及び DNA断片 24を各々 1 μ 1ずつ用いた以外は、上記 2-11の PCRと同様の条件で行った。
[0283] 得られた PCR産物を 1%ァガロース電気泳動により分析し、約 950bpの DNA断片を 確認した。続いて、得られた PCR産物全量を 1%ァガロースゲルにより電気泳動し、約
950bpのバンドを切り出し、フエノール'クロ口ホルムを用いたゲル抽出法により DNA断 片を抽出した。得られた DNA断片を 20 1の蒸留水に溶解した後、蒸留水により 100 倍に希釈した。これを「DNA断片 26」と呼ぶ。
[0284] 2-13. DNA断片 25と DNA断片 26との連結
下記のプライマーを用いた PCRにより DNA断片 25と DNA断片 26とを連結した。
[0285] nativeCLuc— 5'SmaI:CATACCCGGGATGAAGACCTTGATTTTGGC (配列番号 53) mCLuc— 3'XbaI:CCCTGTCTAGACTACTTGCACTCATCTG (配列番号 54) nativeCLuc_5'SmaIは、 5'側に Sma Iサイトを付カロし、 mCLuc DNAの開始コドン ATG を含み、 3'側に 20bpの配列である。 mCLuc_3'XbaIは、 mCLuc DNAの終始コドン TGA を含め 5 '上流側 19bpに相補的な配列の 5 '側に Xba Iサイトを付カ卩した配列である。
[0286] PCRは、各々のプライマー 300nM、 dNTP(4種のデォキシヌクレオチド三リン酸の混 合溶液） 200 μ M、 MgSO 100 μ Μ、铸型として DNA断片 25及び DNA断片 26を各々 1
4
μ 1ずつ、並びに KOD Plus Buffer (IX)及び DNAポリメラーゼ 1Uを含む反応溶液 50 μ 1を用いて、第 1ステップ: 94°Cで 2分、第 2ステップ: 94°Cで 15秒 (変性）、 42°Cで 30秒（ アニーリング)及び 68°Cで 2分（伸長）のサイクルを 35サイクル、並びに第 3ステップ： 68 °Cで 4分で行った。
[0287] 得られた PCR産物を 1%ァガロース電気泳動により分析し、約 1600bpの DNA断片を 確認した。続いて、得られた PCR産物全量を 1%ァガロースゲルにより電気泳動し、約 1600bpのバンドを切り出し、フエノール'クロ口ホルムを用いたゲル抽出法により DNA 断片を抽出した。得られた DNA断片を 20 1の蒸留水に溶解した。これを「DNA断片 2 7」と呼ぶ。 [0288] (3) mCLuc DNAを含むプラスミドの作製
3-1. DNA断片 27の pZErO-2プラスミドへの糸且み込み
添付プロトコルに従って、 pZErO- 2プラスミド (Invitrogen製) 1 μ gを EcoR Vで直鎖化 し、フエノール'クロ口ホルム抽出後、 20 1の蒸留水に溶解し、使用した。
[0289] 上記直鎖化した pZErO- 2プラスミドと DNA断片 27とを、 DNA Ligation kitを用いて連 結'環状化させた後、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転換体を一晩培養し た後、 GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。次いで、抽出し たプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、 DNA断片 27が 挿入されたプラスミド (以下、「pZErO- 2- mCLuc」 、う)を保持した形質転換体を判別 した。
[0290] 3-2. mCLuc DNA断片の調製
上記 3-1により得られた pZErO- 2-mCLucを保持する大腸菌を、 LBカナマイシン（50 μ g/ml)含有液体培地 50mlに接種し、 37°Cで 16時間振盪培養した。培養終了後、 Ge nElute Plasmid midi prep kitを用いて、添付プロトコルに従いプラスミド DNAを調製し 、 OD260nmの吸光値を測定して、 DNA濃度を定量した。
[0291] 得られた DNAのうち 5 μ gを 50 μ 1反応液中、 Sma I 50Uで 18時間切断した。 Sma Iで 切断後、 GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 1で同キット のカラムから DNAを溶出した。次いで、 DNAを 50 μ 1反応液中、 Xba I 50Uで 18時間切 断し、 GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キットの カラムから DNAを溶出した。これを「mCLuc DNA断片」と呼ぶ。
[0292] 3-3. pCLuRA+Hind III- Sal Iの調製
pCLuRAの MCSの最も 5'端に位置する Spe Iサイトより 5'側 50bpの位置に Hind III及 び Sal Iサイトを付加するため、以下のプライマーを用いて、 pCLuRAを铸型としたイン バース PCRを行った。
[0293] Inverse— Sail— F:CCCTGTCGACAAGCGCGCAATTAACCCTC (配列番号 55) C (配列番号 56)
Inverse_SalI_Fは、 Spe Iサイトより 5'側 50bp上流の位置より 3'下流 20bpに一致する塩 基配列を含んでおり、その 5'側に Sal Iサイトを付カ卩してある。また、 Inverse_HindIII-Sal _Rは、 Spe Iサイトより 5'側 50bp上流の位置より 5'上流 21bpの塩基配列に相補的な配 列を含んでおり、その 5'側に Hind IIIサイトと Sal Iサイトを付カ卩してある。
[0294] PCRは、各々のプライマー 300nM、 dNTP (4種のデォキシヌクレオチド三リン酸の混 合溶液） 200 μ M、 MgSO 100 μ Μ、 5% DMSO、铸型として pCLuRA 10ngゝ KOD Plus
4
Buffer (IX)及び DNAポリメラーゼ 1Uを含む反応溶液 50 μ 1を用いて、第 1ステップ： 94 °Cで 2分、第 2ステップ： 94°Cで 15秒（変性）、 52°Cで 30秒（アニーリング)及び 68°Cで 8 分 (伸長）のサイクルを 35サイクル、並びに第 3ステップ： 68°Cで 10分で行った。
[0295] 得られた PCR産物を 1 %ァガロース電気泳動により分析し、約 7kbpの DNA断片を確 認した。得られた PCR産物は GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸 留水 40 1で同キットのカラム力 DNAを溶出した。溶出された DNA溶液は 50 1反応 液中、 Sal I 50Uで 18時間切断した。 Sal Iで切断後、 GenElute PCR clean-up kitを用 いて精製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。
[0296] 得られた溶出液の一部を DNA Ligation kitを用いて連結 ·環状化させた後、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転換体をー晚培養した後、 GenElute plasmid MiniP rep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パ ターン及び塩基配列の解析により、 目的の配列の付加されたプラスミドを保持した形 質転換体を判別した。
[0297] このプラスミド DNAを 50 μ 1反応液中、 Hind III 50Uで 18時間切断した。 Hind IIIで切 断後、 GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キットの カラム力 DNAを溶出した。次いで、 DNAを 50 1反応液中、 Sal I 50Uで 18時間切断 し、 GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キットのカラ ムから DNAを溶出した。これを「pCLuRA+Hind Ill-Sal I DNA断片」と呼ぶ。
[0298] 3-4. SV40 poly(A)X2 DNA断片の調製
SV40 poly(A)シグナルをタンデムに 2つ連結した DNA断片 (以下、「SV40 poly(A)X2 DNA断片」という)を作製するために、以下の 2種類のプライマーペアにより PCRを行つ た。
[0299] polyA— HindllL F:じじじ丁 〇じ丁丁 〇 じ 丁〇 丁 〇 丁 じ 丁丁〇（配列番号57) polyA— SacII— R: CCTACCGCGGTTACCACATTTGTAGAGG (配列番号 58) polyA_HindIII_Fは、 SV40 poly(A)シグナルの 5'端より 3'側に 20bpの配列の 5'側に Hin d IIIサイトを付カ卩したプライマーである。 polyA_SacII_Rは、 SV40 poly(A)シグナルの 3' 端より 5'側に 20bpの塩基配列に相補的な配列の 5'側に Sac IIサイトを付加したプライ マーである。
[0300] PCRは、各々のプライマー 300nM、 dNTP(4種のデォキシヌクレオチド三リン酸の混 合溶液） 200 μ M、 MgSO 100 μ Μ、铸型として SV40 genome DNA (Invitrogen製） 10n
4
g、 KOD Plus Buffer (IX)及び DNAポリメラーゼ 1Uを含む反応溶液 50 μ 1を用いて、第 1ステップ： 94°Cで 2分、第 2ステップ: 94°Cで 15秒 (変性）、 52°Cで 30秒 (アニーリング） 及び 68°Cで 1分（伸長）のサイクルを 35サイクル、並びに第 3ステップ： 68°Cで 2分で行 つた o
[0301] 得られた PCR産物を 1%ァガロース電気泳動により分析し、約 500bpの DNA断片を 確認した。得られた PCR産物は GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に 蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。溶出された DNA溶液は 50 1反 応液中、 Sac II 50Uで 18時間切断した。 Sac IIで切断後、 GenElute PCR clean-up kit を用いて精製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この DN A断片を「SV40 poly(A)_5'」と呼ぶ。
[0302] また、以下のプライマーを用いて PCRを行った。
[0303] polyA— SacII— F:じじ丁 じじ0じ0〇 0 じ 丁〇 丁 0 丁 じ 丁丁0 (配列番号59) polyA— Sail— R: CCCTGTCGACTTACCACATTTGTAGAGG (配列番号 60)
polyA_SacII_Fは、 SV40 poly(A)シグナルの 5'端より 3'側に 20bpの配列の 5'側に Sac I Iサイトを付カ卩したプライマーである。 polyA_SalI_Rは、 SV40 0¾< )シグナルの3'端ょり 5'側に 20bpの塩基配列に相補的な配列の 5'側に Sal Iサイトを付加したプライマーで ある。
[0304] PCRは、各々のプライマー 300nM、 dNTP(4種のデォキシヌクレオチド三リン酸の混 合溶液） 200 μ M、 MgSO 100 μ Μ、铸型として SV40 genome DNA (Invitrogen製） 10n
4
g、 KOD Plus Buffer (IX)及び DNAポリメラーゼ 1Uを含む反応溶液 50 μ 1を用いて、第 1ステップ： 94°Cで 2分、第 2ステップ: 94°Cで 15秒 (変性）、 52°Cで 30秒 (アニーリング） 及び 68°Cで 1分（伸長）のサイクルを 35サイクル、並びに第 3ステップ： 68°Cで 2分で行 つた o
[0305] 得られた PCR産物を 1 %ァガロース電気泳動により分析し、約 500bpの DNA断片を 確認した。得られた PCR産物は GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に 蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。溶出された DNA溶液は 50 1反 応液中、 Sac II 50Uで 18時間切断した。 Sac IIで切断後、 GenElute PCR clean-up kit を用いて精製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この DN A断片を「SV40 poly(A)_3'」と呼ぶ。
[0306] 得られた SV40 poly(A)_5 '及び SV40 poly(A)_3 'を、 DNA Ligation Kitを用いて連結し た。ライゲーシヨン反応終了後、反応産物 1 μ 1を铸型として、 polyA_HindIILFプライマ 一 (配列番号 57)及び polyA_SalI_Rプライマー (配列番号 60)を用いて、上記 SV40 poly (A)_5 'を作製するときと同様の条件で PCRを行った。
[0307] 得られた PCR産物を 1 %ァガロース電気泳動により分析し、 目的の DNA断片と思わ れる約 lkbpのバンドを確認した。全ての PCR産物を 1 %ァガロース電気泳動し、約 lkb pのバンドを切り出し、フエノール'クロ口ホルムを用いたゲル抽出法により DNA断片を 抽出した。得られた DNA断片を 20 1の蒸留水に溶解した。
[0308] この DNA断片と前述の直鎖化した pZErO- 2プラスミド 1 μ 1とを、 DNA Ligation kitを 用いて連結 ·環状化させた後、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転換体を一 晚培養した後、 GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、 抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、 SV40 pol y(A)X2 DNA断片が挿入されたプラスミド (以下、「pZEr〇-2_SV40 poly(A)X2」という） を保持した形質転換体を判別した。
[0309] pZErO-2-SV40 poly(A)X2を 50 μ 1反応液中、 Hind III 50Uで 18時間切断した。 Hind
IIIで切断後、 GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同 キットのカラムから DNAを溶出した。次いで、 DNAを 50 1反応液中、 Sal I 50Uで 18時 間切断し、 GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キッ トのカラム力も DNAを溶出した。この溶出液の全てを 1 %ァガロース電気泳動し、約 lk bpのバンドを切り出し、フエノール'クロ口ホルムを用いたゲル抽出法により DNA断片 を抽出した。得られた DNA断片を 20 /z lの蒸留水に溶解した。この DNA断片を「SV40 poly(A)X2 DNA断片」とした。
[0310] 3-5. pCLuRA+SV40 poly(A)X2の作製
pCLuRA+Hind Ill-Sal I DNA断片と SV40 poly(A)X2 DNA断片とを、 DNA Ligation k itを用いて連結 ·環状化させた後、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転換体を ー晚培養した後、 GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また 、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、 目的の 遺伝子をコードする DNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を判別した。 このプラスミド DNAを「pCLuRA+SV40 poly(A)X2jと呼ぶ。
[0311] 3-6. pUG35-MET25-EGFP3+SV40 poly(A)X2の作製
pCLuRA+SV40 poly(A)X2を 50 μ 1反応液中、 Sma I 50Uで 18時間切断した。 Sma Iで 切断後、 GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 1で同キット のカラムから DNAを溶出した。次いで、 DNAを 50 μ 1反応液中、 Xba I 50Uで 18時間切 断し、 GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キットの カラム力も DNAを溶出した。この溶出液の全てを 1 %ァガロース電気泳動し、約 6kbp のバンドを切り出し、フエノール'クロ口ホルムを用いたゲル抽出法により DNA断片を 抽出した。得られた DNA断片を 20 1の蒸留水に溶解した。この DNA断片を「pUG35- MET25-EGFP3+SV40 poly(A)X2jと呼ぶ。
[0312] 3-7. pmCLuRAの構築
前述の mCLuc DNA断片と pUG35- MET25- EGFP3+SV40 poly(A)X2とを、 DNA Liga tion kitを用いて連結'環状ィ匕させた後、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転 換体をー晚培養した後、 GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した 。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、 目的の遺伝子をコードする DNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を判別 した。 目的の位置に mCLuc DNA断片が挿入されたプラスミドを「pmCLuRA」と呼ぶ。
[0313] 〔実施例 11〕 mCLucを用いたレポーターアツセィと 13 -ガラタトシダーゼを用いたレポ 一ターアツセィとの比較
( 1) mCLuc DNAの 5'上流側に各プロモーターを連結したプラスミド (レポータープラス ミド)の作製
1-1. pmCLuRAの切断
pmCLuRAを 50 μ 1反応液中、 Sma I 50Uで 18時間切断した。 Sma Iで切断後、 GenEl ute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キットのカラムから DN Αを溶出した。次いで、 DNAを 50 μ 1反応液中、 Bam HI 50Uで 18時間切断し、 GenElu te PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キットのカラムから DN Aを溶出した。この溶出液の全てを 1%ァガロース電気泳動し、約 7kbpのバンドを切り 出し、フエノール'クロ口ホルムを用いたゲル抽出法により DNA断片を抽出した。得ら れた DNA断片を 20 μ 1の蒸留水に溶解した。この DNA断片を「pmCLuRA Bam ΗΙ-Sm a I断片」と呼ぶ。
[0314] また、同様に、 pmCLuRA 5 μ gを 50 μ 1反応液中、 Sma I 50Uで 18時間切断した。 Sm a Iで切断後、 GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同 キットのカラムから DNAを溶出した。次いで、 DNAを 50 1反応液中、 Spe I 50Uで 18時 間切断し、 GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キッ トのカラム力も DNAを溶出した。この溶出液の全てを 1%ァガロース電気泳動し、約 7k bpのバンドを切り出し、フエノール'クロ口ホルムを用いたゲル抽出法により DNA断片 を抽出した。得られた DNA断片を 20 1の蒸留水に溶解した。この DNA断片を「pmCL uRA Speト Sma I断片」と呼ぶ。
[0315] 1-2. ACT1プロモーターの単離及びその pmCLuRAへの組み込み
pmCLuRAにサッカロミセス'セレピシェの ACT1 (系統的遺伝子名： YFL039C)遺伝 子のプロモーター（配列番号 61：以下、「ACT1プロモーター」と!ヽぅ）を組み込んだ。 ここで、 ACT1プロモーターとは、 ACT1遺伝子の 5'上流側の非翻訳領域、すなわち、 ACT1遺伝子と ACT1遺伝子の 5'上流隣接遺伝子である YPT1遺伝子とに挟まれる領 域である（酵母ゲノムデータベース http://www.yeastgenome.org/参照)。
[0316] ACT1プロモーターを単離するための PCRのプライマー（5'ACTl_Spe I及び 3'ACT1 )の配列は以下の通りであった。
[0317] 5'ACT1— Spe I: CCCATTACTAGTACAAGCGCGCCTCTACC (配列番号 62)
3'ACT1: TGTTAATTCAGTAAATTTTCGATCTTG (配列番号 63；) 5'ACTl_Spe Iプライマーは、 ACT1 ORF 5'上流の YPT1 ORFの終始コドンの 3'下流 17塩基に Spe淛限酵素サイトを 5'側に付加した配列である。一方、 3'ACT1プライマ 一は、 ACT1 0RF開始コドンより 5'上流 27塩基の相補的な配列である。なお、プライ マーの位置にっ ヽては酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/)を 参照されたい。
[0318] PCRは、铸型としてサッカロミセス'セレピシェ S288Cゲノム DNA lng、プライマーと して 5'ACTl_Spe I (配列番号 62)及び 3'ACT1 (配列番号 63)を用い、第 2ステップの ァニール温度を 48°C、伸長反応時間を 1分、第 3ステップを 2分とした以外は、上記成 熟型 CLuc cDNAを合成した場合 (実施例 1)と基本的に同じ条件で行った。
[0319] 得られた PCR産物を 1%ァガロースゲル電気泳動によって分析し、約 670bpの DNA断 片を確認した。そこで、得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精製 し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。得られた DNA溶液は 50 μ 1反応液中、 Spe I 50Uで 18時間切断し、 GenElute PCR clean-up kitを用いて精 製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この DNA断片を「A CT1プロモーター DNA断片」と呼ぶ。
[0320] 次!、で、 ACT1プロモーター DNA断片と pmCLuRA Speト Sma I断片とを DNA Ligati on kitを用いて連結 ·環状ィ匕させた後、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転換 体をー晚培養した後、 GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。 また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、 AC T1プロモーターをコードする DNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を判 別した。 ACT1プロモーターをコードする DNAが挿入されたプラスミドを保持する形質 転換体より、プラスミド (以下、「pmCLuRA- ACT1」 t 、う）を調製した。
[0321] 1-3. ADH1プロモーターの単離及びその pmCLuRAへの組み込み
pmCLuRAにサッカロミセス'セレピシェの ADH1 (系統的遺伝子名： YOL086C)遺伝 子のプロモーター（配列番号 64：以下、「ADH1プロモーター」と!、う）を組み込んだ。 ここで、 ADH1プロモーターとは、 ADH1遺伝子の 5'上流側の非翻訳領域、すなわち、 ADH1遺伝子と ADH1遺伝子の 5'上流隣接遺伝子である YOL085C遺伝子とに挟まれ る領域である (酵母ゲノムデータベース http：〃 www.yeastgenome.org/参照）。 [0322] ADH1プロモーターを単離するための PCRのプライマー（5'ADHl_BamH I及び 3'AD HI)の配列は以下の通りであった。
[0323] 5'ADH1— BamH I： CCCAGGATCCGTATACTAGAAGAATGAGCC (配列番号 65) 3'ADH1: TGTATATGAGATAGTTGATTGTATG (配列番号 66)
5'ADHl_Bam HIプライマーは、 ADH1 ORF 5'上流の YOL085C ORFの終始コドン の 3'下流 20塩基に Bam HI制限酵素サイトを 5'側に付加した配列である。一方、 3'AD HIプライマーは、 ADH1 ORF開始コドンより 5'上流 25塩基の相補的な配列である。な お、プライマーの位置にっ ヽては酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome .org/)を参照されたい。
[0324] PCRは、プライマーとして 5'ADHl_Bam HI (配列番号 65)及び 3'ADH1 (配列番号 6 6)を用い、第 2ステップのァニール温度を 52°Cとした以外は、上記 1-2において ACT1 プロモーターを合成した場合と基本的に同じ条件で行った。
[0325] 得られた PCR産物を 1%ァガロースゲル電気泳動によって分析し、約 llOObpの DNA 断片を確認した。そこで、得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精 製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。得られた DNA溶液 は 50 μ 1反応液中、 Bam HI 50Uで 18時間切断し、 GenElute PCR clean-up kitを用い て精製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この DNA断片 を「ADH1プロモーター DNA断片」と呼ぶ。
[0326] 次!、で、 ADH1プロモーター DNA断片と pmCLuRA Bam HI- Sma I断片とを DNA Lig ation kitを用いて連結 ·環状ィ匕させた後、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転 換体をー晚培養した後、 GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した 。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、 A DH1プロモーターをコードする DNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を 判別した。 ADH1プロモーターをコードする DNAが挿入されたプラスミドを保持する形 質転換体より、プラスミド (以下、「PmCLuRA- ADH1」 t 、う）を調製した。
[0327] 1-4. CYC1プロモーターの単離及びその pmCLuRAへの組み込み
pmCLuRAにサッカロミセス'セレピシェの CYC1 (系統的遺伝子名： YJR048)遺伝子 のプロモーター（配列番号 67 :以下、「CYC1プロモーター」という）を組み込んだ。こ こで、 CYC1プロモーターとは、 CYC1遺伝子の 5'上流側の非翻訳領域、すなわち、 C YC1遺伝子と CYC1遺伝子の 5'上流隣接遺伝子である ANB1遺伝子とに挟まれる領 域である（酵母ゲノムデータベース http://www.yeastgenome.org/参照）。
[0328] CYC1プロモーターを単離するための PCRのプライマー（5'CYCl_BamH I及び 3'CY C1)の配列は以下の通りであった。
[0329] 5'CYC1— BamH I： CCCAGGATCCGTTTTAGTGTGTGAATGAAA (配列番号 68) 3'CYC1: TATTAATTTAGTGTGTGTATTTGTG (配列番号 69；)
5'CYCl_Bam HIプライマーは、 CYC1 ORF 5'上流の ANB1 ORFの終始コドンの 3' 下流 20塩基に Bam HI制限酵素サイトを 5'側に付加した配列である。一方、 3'CYC1プ ライマーは、 CYC1 ORF開始コドンより 5'上流 25塩基の相補的な配列である。なお、 プライマーの位置にっ 、ては酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org /)を参照されたい。
[0330] PCRは、プライマーとして 5'CYCl_Bam HI (配列番号 68)及び 3'CYC1 (配列番号 6 9)を用いた以外は、上記 1-3において ADH1プロモーターを合成した場合と基本的 に同じ条件で行った。
[0331] 得られた PCR産物を 1%ァガロースゲル電気泳動によって分析し、約 950bpの DNA 断片を確認した。そこで、得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精 製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。得られた DNA溶液 は 50 μ 1反応液中、 Bam HI 50Uで 18時間切断し、 GenElute PCR clean-up kitを用い て精製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この DNA断片 を「CYC1プロモーター DNA断片」と呼ぶ。
[0332] 次!、で、 CYC1プロモーター DNA断片と pmCLuRA Bam HI- Sma I断片とを DNA Liga tion kitを用いて連結'環状ィ匕させた後、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転 換体をー晚培養した後、 GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した 。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、 C YC1プロモーターをコードする DNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を 判別した。 CYC1プロモーターをコードする DNAが挿入されたプラスミドを保持する形 質転換体より、プラスミド (以下、「PmCLuRA- CYC1」 t 、う）を調製した。 [0333] 1-5. TEF1プロモーターの単離及びその pmCLuRAへの組み込み
pmCLuRAにサッカロミセス'セレピシェの TEF1 (系統的遺伝子名： YPR080W)遺伝 子のプロモーター（配列番号 70：以下、「TEF1プロモーター」と!、う）を組み込んだ。 ここで、 TEF1プロモーターとは、 TEF1遺伝子の 5'上流側の非翻訳領域、すなわち、 T EF1遺伝子と TEF1遺伝子の 5'上流隣接遺伝子である MRL1遺伝子とに挟まれる領域 である（酵母ゲノムデータベース http://www.yeastgenome.org/参照）。
[0334] TEF1プロモーターを単離するための PCRのプライマー（5'TEFl_BamH I及び 3'TEF 1)の配列は以下の通りであった。
[0335] 5'TEF1— BamH I: CCCAGGATCCACAATGCATACTTTGTACG (配列番号 71) 3'TEF1 : TTTGTAATTAAAACTTAGATTAGATTGC (配列番号 72)
5'TEFl_Bam HIプライマーは、 TEF1 ORF 5，上流の MRL1 ORFの終始コドンの 3'下 流 19塩基に Bam HI制限酵素サイトを 5'側に付加した配列である。一方、 3'TEF1ブラ イマ一は、 TEF1 ORF開始コドンより 5'上流 28塩基の相補的な配列である。なお、プラ イマ一の位置にっ ヽては酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/)を 参照されたい。
[0336] PCRは、プライマーとして 5'TEFl_Bam HI (配列番号 71)及び 3'TEF1 (配列番号 72 )を用いた以外は、上記 1-3において ADH1プロモーターを合成した場合と基本的に 同じ条件で行った。
[0337] 得られた PCR産物を 1 %ァガロースゲル電気泳動によって分析し、約 580bpの DNA 断片を確認した。そこで、得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精 製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。得られた DNA溶液 は 50 μ 1反応液中、 Bam HI 50Uで 18時間切断し、 GenElute PCR clean-up kitを用い て精製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この DNA断片 を「TEF1プロモーター DNA断片」と呼ぶ。
[0338] 次!、で、 TEF1プロモーター DNA断片と pmCLuRA Bam HI- Sma I断片とを DNA Liga tion kitを用いて連結'環状ィ匕させた後、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転 換体をー晚培養した後、 GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した 。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、 T EF1プロモーターをコードする DNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を 判別した。 TEF1プロモーターをコードする DNAが挿入されたプラスミドを保持する形 質転換体より、プラスミド (以下、「PmCLuRA- TEF1」 t 、う）を調製した。
[0339] 1-6. CUP1プロモーターの単離及びその pmCLuRAへの組み込み
pmCLuRAにサッカロミセス'セレピシェの CUP1 (系統的遺伝子名： YHR053C)遺伝 子のプロモーター（配列番号 73：以下、「CUP1プロモーター」と!、う）を組み込んだ。 ここで、 CUP1プロモーターとは、 CUP1遺伝子の 5'上流側の非翻訳領域、すなわち、 CUP1遺伝子と CUP1遺伝子の 5'上流隣接遺伝子である YHR054C遺伝子とに挟まれ る領域である（酵母ゲノムデータベース http：〃 www.yeastgenome.org/参照）。
[0340] CUP1プロモーターを単離するための PCRのプライマー（5'CUPl_BamH I及び 3'CU PI)の配列は以下の通りであった。
[0341] 5'CUP1— BamH I: CCCAGGATCCTAAGCCGATCCCATTAC (酉己列番号 74)
3'CUP1: TTTATGTGATGATTGATTGATTGATTGTAC (配列番号 75)
5'CUPl_Bam HIプライマーは、 CUP1 ORF 5'上流の YHR054C ORFの終始コドンの 3'下流 17塩基に Bam HI制限酵素サイトを 5'側に付加した配列である。一方、 3'CUP1 プライマーは、 CUP1 ORF開始コドンより 5'上流 30塩基の相補的な配列である。なお 、プライマーの位置にっ 、ては酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.o rg/)を参照されたい。
[0342] PCRは、プライマーとして 5'CUPl_Bam HI (配列番号 74)及び 3'CUP1 (配列番号 75 )を用いた以外は、上記 1-3において ADH1プロモーターを合成した場合と基本的に 同じ条件で行った。
[0343] 得られた PCR産物を 1%ァガロースゲル電気泳動によって分析し、約 460bpの DNA 断片を確認した。そこで、得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精 製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。得られた DNA溶液 は 50 μ 1反応液中、 Bam HI 50Uで 18時間切断し、 GenElute PCR clean-up kitを用い て精製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この DNA断片 を「CUP1プロモーター DNA断片」と呼ぶ。
[0344] 次!、で、 CUP1プロモーター DNA断片と pmCLuRA Bam HI- Sma I断片とを DNA Liga tion kitを用いて連結'環状ィ匕させた後、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転 換体をー晚培養した後、 GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した 。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、 C UP1プロモーターをコードする DNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を 判別した。 CUP1プロモーターをコードする DNAが挿入されたプラスミドを保持する形 質転換体より、プラスミド (以下、「PmCLuRA- CUP1」 t 、う）を調製した。
[0345] 1-7. GAL1プロモーターの単離及びその pmCLuRAへの組み込み
pmCLuRAにサッカロミセス'セレピシェの GAL1 (系統的遺伝子名： YBR020W)遺伝 子のプロモーター（配列番号 76：以下、「GAL1プロモーター」と!ヽぅ）を組み込んだ。 ここで、 GAL1プロモーターとは、 GAL1遺伝子の 5'上流側の非翻訳領域、すなわち、 GAL1遺伝子と GAL1遺伝子の 5'上流隣接遺伝子である GAL10遺伝子とに挟まれる 領域である（酵母ゲノムデータベース http://www.yeastgenome.org/参照）。
[0346] GAL1プロモーターを単離するための PCRのプライマー（5'GALl_Spe I及び 3'GAL1 )の配列は以下の通りであった。
[0347] 5'GAL1— Spe I: CCCAACTAGTACGGATTAGAAGCCGCCGAG (酉己列番号 77) 3'GAL1: GGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAG (配列番号 78)
5'GALl_Spe Iプライマーは、 GAL1 ORF 5'上流の GAL1 ORFの終始コドンの 3'下流 20塩基に Spe淛限酵素サイトを 5'側に付加した配列である。一方、 3'GAL1プライマ 一は、 GAL1 ORF開始コドンより 5'上流 24塩基の相補的な配列である。なお、プライ マーの位置にっ ヽては酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/)を 参照されたい。
[0348] PCRは、プライマーとして 5'GALl_Spe I (配列番号 77)及び 3'GAL1 (配列番号 78) を用いた以外は、上記 1-3において ADH1プロモーターを合成した場合と基本的に同 じ条件で行った。
[0349] 得られた PCR産物を 1%ァガロースゲル電気泳動によって分析し、約 450bpの DNA 断片を確認した。そこで、得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精 製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。得られた DNA溶液 は 50 μ 1反応液中、 Spe I 50Uで 18時間切断し、 GenElute PCR clean-up kitを用いて 精製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この DNA断片を 「GAL1プロモーター DNA断片」と呼ぶ。
[0350] 次!、で、 GAL1プロモーター DNA断片と pmCLuRA Spe I- Sma I断片とを DNA Ligati on kitを用いて連結 ·環状ィ匕させた後、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転換 体をー晚培養した後、 GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。 また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、 GA L1プロモーターをコードする DNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を判 別した。 GAL1プロモーターをコードする DNAが挿入されたプラスミドを保持する形質 転換体より、プラスミド (以下、「pmCLuRA- GAL1」 t 、う）を調製した。
[0351] 1-8. HSP12プロモーターの単離及びその pmCLuRAへの組み込み
pmCLuRAにサッカロミセス'セレピシェの HSP12 (系統的遺伝子名： YFL014W)遺伝 子のプロモーター（配列番号 79：以下、「HSP12プロモーター」と!、う）を組み込んだ。 ここで、 HSP12プロモーターとは、 HSP12遺伝子の 5'上流側の非翻訳領域、すなわち 、 HSP12遺伝子と HSP12遺伝子の 5'上流隣接遺伝子である YFL015W- A遺伝子とに 挟まれる領域である（酵母ゲノムデータベース http：〃 www.yeastgenome.org/参照）。
[0352] HSP12プロモーターを単離するための PCRのプライマー（5'HSP12_BamH I及び 3'H SP12)の配列は以下の通りであった。
[0353] 5'HSP12_BamH I: GGGTGGATCCGATCCCACTAACGGCCCAG (酉己列番号 80) 3'HSP12: TGTTGTATTTAGTTTTTTTTGTTTTGAG (配列番号 81；)
5'HSP12_Bam HIプライマーは、 HSP12 ORF 5'上流のYFL015W-A ORFの終始コド ンの 3'下流 17塩基に Bam HI制限酵素サイトを 5'側に付加した配列である。一方、 3'H SP12プライマーは、 HSP12 ORF開始コドンより 5'上流 30塩基の相補的な配列である。 なお、プライマーの位置にっ 、ては酵母ゲノムデータベース（http：〃 www.yeastgeno me.org/)を参照されたい。
[0354] PCRは、プライマーとして 5'HSP12_Bam HI (配列番号 80)及び 3'HSP12 (配列番号 8 1)を用いた以外は、上記 1-3において ADH1プロモーターを合成した場合と基本的 に同じ条件で行った。
[0355] 得られた PCR産物を 1%ァガロースゲル電気泳動によって分析し、約 610bpの DNA 断片を確認した。そこで、得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精 製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。得られた DNA溶液 は 50 μ 1反応液中、 Bam HI 50Uで 18時間切断し、 GenElute PCR clean-up kitを用い て精製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この DNA断片 を「HSP12プロモーター DNA断片」と呼ぶ。
[0356] 次!、で、 HSP12プロモーター DNA断片と pmCLuRA Bam HI- Sma I断片とを DNA Lig ation kitを用いて連結 ·環状ィ匕させた後、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転 換体をー晚培養した後、 GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した 。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、 H SP12プロモーターをコードする DNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を 判別した。 HSP12プロモーターをコードする DNAが挿入されたプラスミドを保持する形 質転換体より、プラスミド (以下、「PmCLuRA- HSP12」 t 、う）を調製した。
[0357] 1-9. TDH3プロモーターの pmCLuRAへの組み込み
実施例 1において単離された TDH3プロモーター DNA断片と pmCLuRA Bam ΗΙ-Sm a I断片とを DNA Ligation kitを用いて連結'環状ィ匕させた後、大腸菌 DH5 aに導入し た。得られた形質転換体をー晚培養した後、 GenElute plasmid MiniPrep kitを用いて プラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基 配列の解析により、 TDH3プロモーターをコードする DNAが挿入されたプラスミドを保 持した形質転換体を判別した。 TDH3プロモーターをコードする DNAが挿入されたプ ラスミドを保持する形質転換体より、プラスミド (以下、「pmCLuRA- TDH3」という）を調 製した。
[0358] (2) mCLuc DNAを含む各レポータープラスミドを用いた酵母（サッカロミセス 'セレビ シェ YPH500株）の开質転換
pmCLuRA— ACT1、 pmCLuRA— ADH1、 pmCLuRA— CYC1、 pmCLuRA— TDH3、 pmCL uRA- TEF1、 pmCLuRA- CUP1、 pmCLuRA- GAL1及び pmCLuRA- HSP12の 8つのプ ラスミドを用いて、それぞれサッカロミセス'セレピシェ YPH500株を形質転換した。形 質転換には、 EZ- transformation (BIO101)を用いた。
[0359] 得られた形質転換体をゥラシルを含まな ヽ合成寒天培地 (SD+KHLadeW)に塗布し 、 30°Cで 3日間培養した。
[0360] 3日間の培養後、それぞれのプラスミドを保有する形質転換体を得た。
[0361] (3) mCLucによる各プロモーターの活性測定
上記（2)で得られたそれぞれのプラスミドを保有する形質転換体 1クローン当たり 3コ 口-一を、 SD+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地に接種し、ー晚培養した。一晩の 培養により Stationary phaseに達した培養液を、各ゥエルに lmlずつの同培地を添カロし た 96穴ディープゥエルプレートにそれぞれ 5 1ずつ接種し、 30°Cで振盪培養した。培 養開始から 16時間後に、培養液の一部を回収し、実施例 1の方法に従い、 600nmの 吸光度（OD600)及びルミノメーターの相対発光強度 (RLU)を測定した。得られた値 力も各プロモーターの活性を数値ィ匕した。すなわち、相対発光強度を 600nmの吸光 度で除して得られる mCLuc活性が各プロモーターの転写活性の相対値を意味する。 結果を図 10に示す。図 10において、「cell」は酵母細胞を含んだ培養液を用いて測 定した mCLuc活性を、「sup.」は培養液を 15,000 rpmで遠心分離して得た培養上清を 用いて測定した mCLuc活性を示す。また、「Promoter (—)」は、プロモーターを含まな V、プラスミドを有する形質転換体の結果を示す。
[0362] (4) β -ガラタトシダーゼレポータープラスミド (pGALuRA)の構築
β -ガラタトシダーゼを用いたレポータープラスミドを構築するため、以下のプライマ 一を用いた PCRにより、 -ガラクトシダーゼ cDNAの調製を行った。
[0363] LacZ— 5'SmaI— F: GGGTCCCGGGATGACCGGTTCCGGAGCTTG(ia^lJ ^-82) LacZ— 3'XbaI— R: CCCTGTCTAGATTACGCGAAATACGGGCAG (配列番号 83)
LacZ_5'SmaI_Fプライマーは、 j8 -ガラクトシダーゼ ORFの開始コドン 3'下流 20塩基 に Sma I制限酵素サイトを 5'側に付カ卩した配列である。一方、 LacZ_3'XbaI_Rプライマ 一は、 j8 -ガラクトシダーゼ ORF終始コドンより 5'上流 19塩基の相補的な配列である。
[0364] PCRは、铸型として pJM133 DNA(Genes Develop., 7, 833-843 (1993》 10ng、プライ マーとして LacZ_5'SmaI_F (配列番号 82)及び LacZ_3'XbaI_R (配列番号 83)を用い、 第 2ステップのァニール温度を 52°C、伸長反応時間を 4分、第 3ステップを 8分とした以 外は、上記成熟型 CLuc cDNAを合成した場合 (実施例 1)と基本的に同じ条件で行つ [0365] 得られた PCR産物を 1 %ァガロースゲル電気泳動によって分析し、約 3.3kbpの DNA 断片を確認した。そこで、得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精 製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。得られた DNA溶液 は 50 μ 1反応液中、 Sma I 50Uで 18時間切断し、 GenElute PCR clean-up kitを用いて 精製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。得られた DNA溶 液は 50 μ 1反応液中、 Xba I 50Uで 18時間切断し、 GenElute PCR clean-up kitを用い て精製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この DNA断片 を「 j8 -ガラタトシダーゼ DNA断片」と呼ぶ。
[0366] この 13 -ガラタトシダーゼ DNA断片と pUG35- MET25- EGFP3+SV40 poly(A)X2 1 μ 1 とを DNA Ligation kitを用いて連結'環状ィ匕させた後、大腸菌 DH5 aに導入した。得 られた形質転換体をー晚培養した後、 GenElute plasmid miniPrep kitを用いてプラス ミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の 解析により、 β -ガラタトシダーゼをコードする DNAが挿入されたプラスミドを保持した 形質転換体を判別した。 β -ガラタトシダーゼをコードする DNAが挿入されたプラスミ ドを保持する形質転換体より、プラスミド (以下、「pGALuRA」という）を調製した。
[0367] 続ヽて、 pGALuRAを保持する大腸菌を、 LBアンピシリン (50 μ g/ml)含有液体培地 50mlに接種し、 37°Cで 16時間振盪培養した。培養終了後、 GenElute Plasmid midi pr ep kitを用いて、添付プロトコールに従ってプラスミド DNAを調製し、 OD260nmの吸光 値を測定して、 DNA濃度を定量した。
[0368] 得られた DNAのうち 5 μ gを 50 μ 1反応液中、 Sma I 50Uで 18時間切断した。 Sma Iで 切断後、 GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 1で同キット のカラムから DNAを溶出した。次いで、 DNAを 50 1反応液中、 Bam HI 50Uで 18時間 切断し、 GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キット のカラムから DNAを溶出した。この溶出液の全てを 1 %ァガロース電気泳動し、約 7kb pのバンドを切り出し、フエノール'クロ口ホルムを用いたゲル抽出法により DNA断片を 抽出した。得られた DNA断片を 20 1の蒸留水に溶解した。この DNA断片を「pGALu RA Bam ΗΙ-Sma I断片」と呼ぶ。
[0369] また、同様に pGALuRA 5 μ gを 50 μ 1反応液中、 Sma I 50Uで 18時間切断した。 Sma Iで切断後、 GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 1で同キ ットのカラムから DNAを溶出した。次いで、 DNAを 50 1反応液中、 Spe I 50Uで 18時 間切断し、 GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キッ トのカラム力も DNAを溶出した。この溶出液の全てを 1%ァガロース電気泳動し、約 7k bpのバンドを切り出し、フエノール'クロ口ホルムを用いたゲル抽出法により DNA断片 を抽出した。得られた DNA断片を 20 1の蒸留水に溶解した。この DNA断片を「pGAL uRA Spe I-Sma I断片」と呼ぶ。
[0370] (5) pGALuRAへの各種プロモーターの組み込み
上記（1)の pmCLuRAへの各種プロモーターの組み込みと同様に、 ACT1プロモー ター DNA断片、 ADH1プロモーター DNA断片、 CYC1プロモーター DNA断片、 TDH3 プロモーター DNA断片、 TEF1プロモーター DNA断片、 CUP1プロモーター DNA断片 、 GAL1プロモーター DNA断片及び HSP12プロモーター DNA断片をそれぞれ pGALu RAに組み込んだ。得られたプラスミドを、それぞれ「pGALuRA-ACTl」、 「pGALuRA- ADH1」、 「pGALuRA- CYC1」、 「pGALuRA- TDH3」、 「pGALuRA- TEF1」、 「pGALuR A-CUP1J、 「pGALuRA- GAL1」及び「pGALuRA- HSP12」と呼ぶ。
[0371] (6) β -ガラタトシダーゼをコードする DNAを含む各レポータープラスミドを用いた酵 母（サッカロミセス ·セレピシェ YPH500株）の形質転換
pGALuRA— ACT1、 pGALuRA— ADH1、 pGALuRA— CYC1、 pGALuRA— TDH3、 pGAL uRA- TEF1、 pGALuRA- CUP1、 pGALuRA- GALl及び pGALuRA- HSP12の 8つのプラ スミドを用いて、それぞれサッカロミセス'セレピシェ YPH500株を形質転換した。形質 転換には、 EZ- transformation (BIO101)を用いた。
[0372] 得られた形質転換体をゥラシルを含まな ヽ合成寒天培地 (SD+KHLadeW)に塗布し 、 30°Cで 3日間培養した。
[0373] 3日間の培養後、それぞれのプラスミドを保有する形質転換体を得た。
[0374] (7)細胞破砕上清サンプルの調製
上記 (6)で得られたそれぞれのプラスミドを保有する形質転換体 1クローン当たり 3コ 口-一を、 SD+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地に接種し、ー晚培養した。一晩の 培養により Stationary phaseに達した培養液 100 μ 1を、 20mlの同培地に添カ卩し、 30°C で振盪培養した。培養開始から 16時間後に、培養液の一部を回収し、 OD600を測定 し、対数期に達した細胞を回収した。回収された細胞を 500 1の CelLytic (Sigma)に 再撹拌し、タングステンビーズ存在下で約 1時間、 4°Cでボルテックスし、細胞の破砕 を行った。細胞の破砕後、遠心分離により上清を得た。得られた上清 (抽出液)を Lowr yら 0. Biol. Chem., 193, 265-275 (1951》の変法を用いてタンパク質濃度の定量を行 つた o
[0375] (8) β -ガラタトシダーゼアツセィ
上記（7)で得られた抽出液を使用し、 |8 -ガラクトシダーゼアツセィを Rose and Botei n (1983, Methods Enzymol. 101: 167-180)の方法を用いて行った。抽出液に対し、 Z バッファーを加え、ブレーキングバッファーで液量を合わせた。 28°Cで 5分間インキュ ベート後〖こ ONPG (0-二トロフエ-ル- β -D-ガラタトピラノシド)溶液を添加して反応を 開始した。反応液が黄色を呈すまで 28°Cでインキュベートした後、 Na CO溶液で反
2 3 応を呈させ、 420nmの吸光値を測定した。得られた値に基づいて、 OD420 X1.7 / (0. 0045 Xタンパク質量 X抽出液量 X時間)の計算式によりプロモーター活性を算出し た。すなわち、 j8 -ガラクトシダーゼ活性が各プロモーターの転写活性の相対値を意 味する。結果を図 11に示す。図 11において、「Promoter (—)」は、プロモーターを含 まな!/ヽプラスミドを有する形質転換体の結果を示す。
[0376] (9) mCLucを用いたレポーターアツセィと 13 -ガラタトシダーゼを用いたレポーターァ ッセィとの比較
図 10及び図 11から判るように、 mCLucをレポーター酵素として測定した各プロモー ターの相対活性は、 j8 -ガラタトシダーゼをレポーター酵素として用いた従来型の方 法で測定したそれらのプロモーターの相対活性とよく相関していた。この結果から、 m CLucをレポーター酵素として用いる方法は、 13 -ガラタトシダーゼをレポーター酵素と して用いた従来法と同様な結果を与え、代替できることがわ力つた。さらには必要な 培養液の量、測定プロトコルの簡便さにおいて、従来の j8 -ガラクトシダーゼ法よりも ハイスループットアツセィに適していることがわかった。
[0377] 〔実施例 12〕 mCLucによるレポーターアツセィの結果と細胞内 mRNA量測定結果との 比較 実施例 11におけるレポータープラスミド pmCLuRAを用いたアツセィ結果が細胞内 での mRNAの発現量を反映した結果であることを、 mCLuc mRNA量を定量することで 検討した。
[0378] (1)サンプルの調製
実施例 11で得られた pmCLuRA- ACT1、 pmCLuRA- ADH1、 pmCLuRA- CYC1、 pm CLuRA— TDH3、 pmCLuRA— TEF1、 pmCLuRA— CUP1、 pmCLuRA— GAL1及び pmCLu RA-HSP12のそれぞれのプラスミドを保有する形質転換体 1クローン当たり 3コロニー を、 SD+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地に接種し、ー晚培養した。一晩の培養 により Stationary phaseに達した培養液 100 μ 1を、 20mlの同培地に接種し、 30°Cで約 1 6時間振盪培養した。 OD600の値が mid-log phaseに達したところで、培養をやめ、細 胞を回収し、 - 80°Cで保管した。 RNAを、 QIAGEN社の RNeasy mini kitを用いて調製 した。得られた total RNAを、 TOYOBO社の ReverTra Aceを用いて逆転写を行い、 cD NAを合成した。
[0379] (2)対照プラスミドの作製
リアルタイム PCRでの mRNAの測定に必要な対照遺伝子として TDH3遺伝子を選択 し、その ORFを pZErO- 2にクローユングし、対照プラスミドとした。下記に示すプライマ 一を用いた PCRにより、 TDH3遺伝子を得た。
[0380] TDH3— CDS— F: ATGGTTAGAGTTGCTATTAACGGTTTCG (配列番号 84)
TDH3— CDS— R: TTAAGCCTTGGCAACGTGTTCAACCAAG (配列番号 85)
TDH3_CDS_Fプライマーは、 TDH3 ORFの開始コドンから 3'下流 28bpの配列である 。一方、 TDH3_CDS_Rプライマーは、 TDH3 ORFの終始コドンから 5'上流 28bpの相補 的な配列である。
[0381] PCRは、铸型としてサッカロミセス ·セレピシェ S288Cゲノム DNA lng、プライマーとし て TDH3_CDS_F (配列番号 84)及び TDH3_CDS_R (配列番号 85)を用い、第 2ステツ プのァニール温度を 55°C、伸長反応時間を 1分、第 3ステップを 2分とした以外は、上 記成熟型 CLuc cDNAを合成した場合 (実施例 1)と基本的に同じ条件で行った。
[0382] 得られた PCR産物を 1%ァガロースゲル電気泳動によって分析し、約 lkbpの DNA断 片を確認した。そこで、得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精製 し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。
[0383] 得られた DNAと前述の直鎖化した pZErO-2とを、 DNA Ligation kitを用いて連結.環 状化させた後、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、 GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミ ドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、 TDH3 ORFをコードする D NAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換体を判別した。このプラスミドを「pZEr 0-2-TDH3 ORFJと呼ぶ。
[0384] (3)リアルタイム PCR
以下のリアルタイム PCR用の 2つのプライマーは、 ABI社のプライマー設計用ソフトゥ エア Primer Expressを用いて設計した。
[0385] mCLuc— RT— F: GGGCCGTGCAAGGAAAT (配列番号 86)
mCLuc— RT— R: GACGTCCCAAGTGTTCCAGAA (配列番号 87)
mCLuc_RT_Fプライマーは、 mCLuc ORFの開始コドンから 3'下流、 1009bpから 1025 bpまでの塩基配列である。一方、 mCLuc_RT_Rプライマーは、 mCLuc ORFの開始コド ン力 3'下流、 1045bpから 1066bpまでの相補的な塩基配列である。
[0386] これに対し、対照プラスミドの定量に用いた TDH3遺伝子検出用の以下の 2つのプ ライマーもまた、 ABI社のプライマー設計用ソフトウェア Primer Expressを用いて設計 した。
[0387] TDH3— RT— F: CTGCTAAGGCTGTCGGTAAGGT (配列番号 88)
TDH3— RT— R: TGAAAGCCATACCGGTCAACT (配列番号 89)
TDH3_RT_Fプライマーは、 TDH3 ORFの開始コドンから 3'下流、 632bpから 653bpま での塩基配列である。一方、 TDH3_RT_Rプライマーは、 TDH3 ORFの開始コドンから 3'下流、 674bpから 694bpまでの相補的な塩基配列である。
[0388] リアルタイム PCRは、 ABI社の Power SYBR Green PCR Master Mixを用いて、反応 液 20 μ 1(10 μ 1のマスターミックス、各々のプライマー 50ηΜ及び cDNA 5ng)で行った。 PCRは、第 1ステップ： 95°Cで 10分、並びに第 2ステップ： 95°Cで 15秒（変性)及び 60°C で 60秒（ァニール ·伸長）の 40サイクルで行った。結果を図 12に示す。図 12に示す結 果は、対照プラスミドの値を内部標準とし、 mCLuc mRNAの量の相対定量を行った結 果である。
[0389] 図 10及び 12から判るように、 mCLucをレポーター酵素として得られた結果は、リア ルタイム PCRによって測定した mCLuc mRNA量とよく相関していた。このことから、 mC Lucをレポーター酵素としたレポーターアツセィは転写活性を測定するために優れた 測定系であることが示された。
[0390] 〔実施例 13〕 mCLucを用いたレポーターアツセィにおける化学物質によるプロモータ 一誘導の測定
(D CuSO誘導実験
4
サッカロミセス'セレピシェの CUP1 (系統的遺伝子名： YHR053C)遺伝子は銅イオン の存在下においてその発現が誘導されることが知られている (Gene, 48, 13-22 (1986 ))。すなわち、 CUP1プロモーターは、銅イオン誘導性プロモーターである。そこで、 p mCLuRA-CUPlを用いて、 mCLucにお!/、てその誘導が観察されるかどうか検討を行 つた。また、 |8 -ガラクトシダーゼを用いて同様の実験を行い、比較検討した。
[0391] 上記に示した pmCLuRA-CUPl及び pGALuRA-CUPlをそれぞれ有する形質転換 体を、各 3クローンずつ SD+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地に接種し、ー晚、 30 °Cで Stationary phaseに達するまで振盪培養した。
[0392] 次!、で、 pmCLuRA-CUPlを有する形質転換体を含む培養液 5 μ 1を、各ゥエルに lm 1ずつ 0.025mM CuSO含有 SD+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地又は CuSO非含
4 4 有 SD+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地を添加した 96穴ディープゥエルプレート に接種し、 30°Cで振盪培養した。培養開始から 8時間後に、培養液の一部を回収し、 実施例 1の方法に従い、 600nmの吸光度（OD600)及びルミノメーターの相対発光強 度 (RLU)を測定した。得られた値から、実施例 11と同様に各プロモーターの活性を 数値化した。なお、対照として、 pmCLuRA-TDH3を有する形質転換体についても同 様の実験を行った。結果を図 13Aに示す。
[0393] 一方、 pGALuRA-CUPlを有する形質転換体を含む培養液 100 μ 1を、 0.025mM Cu SO含有 SD+LHLadeW 200mM KPi合成液体培地又は CuSO非含有 SD+LHLadeW 2
4 4
OOrnM KPi合成液体培地 20mlに接種し、 30°Cで振盪培養した。培養開始から 16時間 後に、培養液の一部を回収し、 OD600を測定することで、対数期に達した細胞を回 収した。次いで、実施例 11と同様に、 j8 -ガラクトシダーゼアツセィを行い、プロモー ター活性を数値化した。なお、対照として、 pGALuRA-TDH3を有する形質転換体に ついても同様の実験を行った。結果を図 13Bに示す。
[0394] (2)ガラクトース誘導実験
サッカロミセス'セレピシェの GAL1 (系統的遺伝子名： YBR020W)遺伝子は、ダルコ ース非存在'ガラクトース存在下においてその発現が誘導されることが知られている（ West, R.W.J, et al., Mol. Cell. Biol, 4: 2467-2478 (1984))。すなわち、 GALlプロモ 一ターは、ガラクトース誘導性プロモーターである。そこで、 pmCLuRA- GAL1を用い て mCLucにおいてその誘導が観察されるかどうか検討を行った。また、 β -ガラク シ ダーゼを用いても同様の実験を行い、比較検討した。
[0395] 上記に示した pmCLuRA-GALl及び pGALuRA-GALlをそれぞれ有する形質転換 体を、各 3クローンずつ SD+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地に接種し、ー晚、 30 °Cで Stationary phaseに達するまで振盪培養した。
[0396] 次!、で、 pmCLuRA-GALlを有する形質転換体を含む培養液 20 μ 1を、各ゥエルに 1 mlずつ 2%ガラクトース含有 SC+KHLadeW(SC+KHLadeWは実施例 1における SD+KH LWadeからグルコースを除いたもの） 200mM KPi合成液体培地又は SD+KHLadeW 2 OOmM KPi合成液体培地を添カ卩した 96穴ディープゥエルプレートに接種し、 30°Cで振 盪培養した。培養開始カゝら 32時間後に、培養液の一部を回収し、実施例 1の方法に 従 ヽ、 600nmの吸光度（OD600)及びルミノメーターの相対発光強度（RLU)を測定し た。得られた値から、実施例 11と同様に各プロモーターの活性を数値ィ匕した。なお、 対照として、 pmCLuRA-TDH3を有する形質転換体についても同様の実験を行った。 結果を図 14Aに示す。
[0397] 一方、 pGALuRA- GAL1を有する形質転換体を含む培養液 500 μ 1を、 2%ガラクトー ス含有 SC+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地又は SD+KHLadeW 200mM KPi合成 液体培地 20mlに接種し、 30°Cで振盪培養した。培養開始カゝら 32時間後に、培養液の 一部を回収し、 OD600を測定することで、対数期に達した細胞を回収した。次いで、 実施例 11と同様に、 j8 -ガラクトシダーゼアツセィを行い、プロモーター活性を数値ィ匕 した。なお、対照として、 pGALuRA-TDH3を有する形質転換体についても同様の実 験を行った。結果を図 14Bに示す。
[0398] (3)化学物質によるプロモーター誘導の測定結果
図 13A及び B並びに図 14A及び Bに示されたとおり、 CUP1プロモーターの銅ィォ ンによる転写誘導と GAL1プロモーターのガラクトースによる転写誘導では、 mCLucを レポーター酵素として測定した測定法と、 β -ガラタトシダーゼをレポーター酵素とし て用いた従来法でよい相関を示した。この結果から、 mCLucをレポーター酵素として 用いる方法は、 β -ガラタトシダーゼをレポーター酵素として用いた従来法と同様な化 学物質によるプロモーターの転写誘導結果を与え、代替できることがわ力つた。さら には必要な培養液の量、測定プロトコルの簡便さにおいて、従来の j8 -ガラクトシダ ーゼ法よりもハイスループットアツセィに適していることがわかった。
[0399] 〔実施例 14〕 mCLucを用いたレポーターアツセィにおけるプロモーター内の転写活性 化に関わる cis配列探索
(1) TDH3プロモーター欠失突然変異体の作製
サッカロミセス.セレピシェの TDH3 (系統的遺伝子名： YGR192C)遺伝子のプロモ 一ターは、その塩基配列の中に、発現調節に重要ないくつかの制御配列を有する (J BC, 1994, 269: 6153-6162及び図 15参照）。そこで、それらの配列を除去したときに 、それに対応したプロモーター活性を、 mCLucを用いて検出できるかどうか検討した
[0400] 1-1. mCLuc DNAの 5'上流側に TDH3プロモーター (-471)を連結したプラスミドの作 製
TDH3プロモーター (-471)は、 TDH3 ORFの開始コドンより 5'上流- 486bpから- 474bp 【こ存在する Fermentable caroon source-dependent upstream activation sequence(UA Sl*l)を除去することで、そのプロモーター活性がどのように変動するかを調査するた めに設計されたプロモーター配列である。
[0401] 以下のプライマーと 3'TDH3プライマー (配列番号 24)を用いた PCRにより TDH3プロ モーター (-471)を得た。
[0402] TDH3-47LF: AAGAGGATCCAATGGAGCCCGCTTTTTAAG (配列番号 90)
TDH3- 471_Fプライマーは、 TDH3 ORFの 5'上流 471塩基より 3'下流 20塩基に Bam H淛限酵素サイトを 5'側に付加した配列である。なお、プライマーの位置については 酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/)を参照された!ヽ。
[0403] PCRは、铸型としてサッカロミセス ·セレピシェ S288Cゲノム DNA lng、プライマーとし て TDH3-471_F (配列番号 90)及び 3'TDH3 (配列番号 24)を用い、第 2ステップのァ ニール温度を 54°C、伸長反応時間を 1分、第 3ステップを 2分とした以外は、上記成熟 型 CLuc cDNAを合成した場合 (実施例 1)と基本的に同じ条件で行った。
[0404] 得られた PCR産物を 2%ァガロースゲル電気泳動によって分析し、約 470bpの DNA 断片を確認した。そこで、得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精 製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。得られた DNA溶液 は 50 μ 1反応液中、 Bam HI 50Uで 18時間切断し、 GenElute PCR clean-up kitを用い て精製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この DNA断片 を「TDH3プロモーター（-471) DNA断片」と呼ぶ。
[0405] TDH3プロモーター（-471) DNA断片と pmCLuRA Bam HI- Sma I断片とを DNA Ligat ion kitを用いて連結 ·環状ィ匕させた後、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転 換体をー晚培養した後、 GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した 。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、 T DH3プロモーター (-471)をコードする DNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転 換体を判別した。 TDH3プロモーター（-471)をコードする DNAが挿入されたプラスミド を保持する形質転換体より、プラスミド（以下、「pmCLuRA- TDH3(- 471)」という）を調 製した。
[0406] 1-2. mCLuc DNAの 5'上流側に TDH3プロモーター (-423)を連結したプラスミドの作 製
TDH3プロモーター (-423)は、 TDH3 ORFの開始コドンより 5'上流- 448bpから- 436bp 【こ存在する Fermentable caroon source-dependent upstream activation sequence (U AS1*2)と上記 UAS1*1とを除去することで、そのプロモーター活性がどのように変動す るかを調査するために設計されたプロモーター配列である。
[0407] 以下のプライマーと 3'TDH3プライマー（配列番号 24)とを用いた PCRにより TDH3プ 口モーター (-423)を得た。 [0408] TDH3- 423— F: AAGAGGATCCAGAATCCCAGCACCAAAATA (配列番号 91)
TDH3- 423_Fプライマーは、 TDH3 ORFの 5'上流 423塩基より 3'下流 20塩基に Bam H淛限酵素サイトを 5'側に付加した配列である。なお、プライマーの位置については 酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/)を参照された!ヽ。
[0409] PCRは、铸型としてサッカロミセス ·セレピシェ S288Cゲノム DNA lng、プライマーとし て TDH3-423_F (配列番号 91)及び 3'TDH3 (配列番号 24)を用い、第 2ステップのァ ニール温度を 54°C、伸長反応時間を 1分、第 3ステップを 2分とした以外は、上記成熟 型 CLuc cDNAを合成した場合 (実施例 1)と基本的に同じ条件で行った。
[0410] 得られた PCR産物を 2%ァガロースゲル電気泳動によって分析し、約 420bpの DNA 断片を確認した。そこで、得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精 製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。得られた DNA溶液 は 50 μ 1反応液中、 Bam HI 50Uで 18時間切断し、 GenElute PCR clean-up kitを用い て精製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この DNA断片 を「TDH3プロモーター（-423) DNA断片」と呼ぶ。
[0411] TDH3プロモーター（-423) DNA断片と pmCLuRA Bam HI- Sma I断片とを DNA Ligat ion kitを用いて連結 ·環状ィ匕させた後、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転 換体をー晚培養した後、 GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した 。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、 T DH3プロモーター (-423)をコードする DNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転 換体を判別した。 TDH3プロモーター（-423)をコードする DNAが挿入されたプラスミド を保持する形質転換体より、プラスミド（以下、「pmCLuRA- TDH3(- 423)」という）を調 製した。
[0412] 1-3. mCLuc DNAの 5'上流側に TDH3プロモーター (-411)を連結したプラスミドの作 製
TDH3プロモーター (-411)は、 TDH3 ORFの開始コドンより 5'上流- 431bpから- 419bp 【こ存在する Fermentable caroon source-dependent upstream repression sequence (U RS)と上記 UAS1*1及び UAS1*2とを除去することで、そのプロモーター活性がどのよう に変動するかを調査するために設計されたプロモーター配列である。 [0413] 以下のプライマーと 3'TDH3プライマー（配列番号 24)とを用いた PCRにより TDH3プ 口モーター (-411)を得た。
[0414] TDH3-411— F: AAGAGGATCCTGTTTTCTTCACCAACCATC (配列番号 92)
TDH3- 411_Fプライマーは、 TDH3 ORFの 5'上流 411塩基より 3'下流 20塩基に Bam H淛限酵素サイトを 5'側に付加した配列である。なお、プライマーの位置については 酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/)を参照された!ヽ。
[0415] PCRは、铸型としてサッカロミセス ·セレピシェ S288Cゲノム DNA lng、プライマーとし て TDH3-411_F (配列番号 92)及び 3'TDH3 (配列番号 24)を用い、第 2ステップのァ ニール温度を 54°C、伸長反応時間を 1分、第 3ステップを 2分とした以外は、上記成熟 型 CLuc cDNAを合成した場合 (実施例 1)と基本的に同じ条件で行った。
[0416] 得られた PCR産物を 2%ァガロースゲル電気泳動によって分析し、約 410bpの DNA 断片を確認した。そこで、得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精 製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。得られた DNA溶液 は 50 μ 1反応液中、 Bam HI 50Uで 18時間切断し、 GenElute PCR clean-up kitを用い て精製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この DNA断片 を「TDH3プロモーター（-411) DNA断片」と呼ぶ。
[0417] TDH3プロモーター（-411) DNA断片と pmCLuRA Bam HI- Sma I断片とを DNA Ligat ion kitを用いて連結 ·環状ィ匕させた後、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転 換体をー晚培養した後、 GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した 。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、 T DH3プロモーター (-411)をコードする DNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転 換体を判別した。 TDH3プロモーター（-411)をコードする DNAが挿入されたプラスミド を保持する形質転換体より、プラスミド（以下、「pmCLuRA- TDH3(- 411)」という）を調 製した。
[0418] 1-4. mCLuc DNAの 5'上流側に TDH3プロモーター (-295)を連結したプラスミドの作 製
TDH3プロモーター (-295)は、 TDH3 ORFの開始コドンより 5'上流- 305bpから- 297bp 【こ存在する Non— fermentable caroon source-dependent upstream activation sequenc e (UAS2)と上記 UAS1*1、 UAS1*2及び URSとを除去することで、そのプロモーター活 性がどのように変動するかを調査するために設計されたプロモーター配列である。
[0419] 以下のプライマーと 3'TDH3プライマー（配列番号 24)とを用いた PCRにより TDH3プ 口モーター (-295)を得た。
[0420] TDH3- 295— F: AAGAGGATCCGGAGTAAATGATGACACAAG(ia^lJ ^-93)
TDH3- 295_Fプライマーは、 TDH3 ORFの 5'上流 295塩基より 3'下流 20塩基に Bam H淛限酵素サイトを 5'側に付加した配列である。なお、プライマーの位置については 酵母ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/)を参照された!ヽ。
[0421] PCRは、铸型としてサッカロミセス'セレピシェ S288Cゲノム DNA lng、プライマーとし て TDH3-295_F (配列番号 93)及び 3'TDH3 (配列番号 24)を用い、第 2ステップのァ ニール温度を 54°C、伸長反応時間を 1分、第 3ステップを 2分とした以外は、上記成熟 型 CLuc cDNAを合成した場合 (実施例 1)と基本的に同じ条件で行った。
[0422] 得られた PCR産物を 2%ァガロースゲル電気泳動によって分析し、約 290bpの DNA 断片を確認した。そこで、得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精 製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。得られた DNA溶液 は 50 μ 1反応液中、 Bam HI 50Uで 18時間切断し、 GenElute PCR clean-up kitを用い て精製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この DNA断片 を「TDH3プロモーター（-295) DNA断片」と呼ぶ。
[0423] TDH3プロモーター（-295) DNA断片と pmCLuRA Bam HI- Sma I断片とを DNA Ligat ion kitを用いて連結 ·環状ィ匕させた後、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転 換体をー晚培養した後、 GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した 。また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、 T DH3プロモーター（-295)をコードする DNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転 換体を判別した。 TDH3プロモーター（-295)をコードする DNAが挿入されたプラスミド を保持する形質転換体より、プラスミド（以下、「pmCLuRA- TDH3(- 295)」という）を調 製した。
[0424] (2)各欠失突然変異体 TDH3プロモーターを有するレポータープラスミドを用いた酵 母（サッカロミセス ·セレピシェ YPH500株）の形質転換 pmCLuRA- TDH3(- 471)、 pmCLuRA- TDH3(- 423)、 pmCLuRA- TDH3(- 411)、 pmCL uRA- TDH3(- 295)及び pmCLuRA- TDH3(図 15では、「-698」に相当する)の 5つのプ ラスミドを用いて、それぞれサッカロミセス'セレピシェ YPH500株を形質転換した。形 質転換には、 EZ- transformation (BIO101)を用いた。
[0425] 得られた形質転換体をゥラシルを含まな ヽ合成寒天培地 (SD+KHLadeW)に塗布し 、 30°Cで 3日間培養した。
[0426] 3日間の培養後、それぞれのプラスミドを保有する形質転換体を得た。
[0427] (3)各突然変異体 TDH3プロモーターの活性測定
上記（2)で得られたそれぞれのプラスミドを保有する形質転換体 1クローン当たり 3コ 口-一を、 SD+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地に接種し、ー晚培養した。一晩の 培養により Stationary phaseに達した培養液を、各ゥエルに lmlずつの同培地を添カロし た 96穴ディープゥエルプレートにそれぞれ 5 1ずつ接種し、 30°Cで振盪培養した。培 養開始から 16時間後に、培養液の一部を回収し、実施例 1の方法に従い、 600nmの 吸光度（OD600)及びルミノメーターの相対発光強度 (RLU)を測定した。得られた値 から、実施例 11と同様に各プロモーターの活性を数値ィ匕した。結果を図 15に示す。
[0428] (4) GAL1プロモーター欠失突然変異体の作製
サッカロミセス'セレピシェの GAL1 (系統的遺伝子名： YBR020W)遺伝子のプロモ 一ターは、その塩基配列の中に、発現調節に重要な 4つの GAL4結合領域 (図 16で は、「GAL4」に相当する)を有する（Giniger, E. et al" Cell, 40: 767-774 (1985); John ston and Davis, Mol. Cell. Biol. 4: 1440-1448 (1984); Yocum, R. R. et al., Mol. Cell . Biol. 4: 1985-1998 (1984)及び図 16参照）。そこで、これらの配列を除去したときに 、それに対応したプロモーター活性を mCLucを用いて検出できるかどうか検討した。
[0429] 4-1. mCLuc DNAの 5'上流側に GAL1プロモーター (-396)を連結したプラスミドの作製
GAL1プロモーター (-396)は、 GAL1 ORFの開始コドンより 5'上流- 451bpから- 397bp に 3回繰り返し配列になっている GAL4結合領域を除去することで、そのプロモーター 活性がどのように変動するかを調査するために設計されたプロモーター配列である。
[0430] 以下のプライマーと 3'GAL1プライマー (配列番号 78)とを用いた PCRにより GAL1プ 口モーター (-396)を得た。 [0431] GAL1- 396— F: AAGAGGATCCTGCGTCCTCGTCTTCACCGG (配列番号 94)
GAL1- 396_Fプライマーは、 GAL1 ORF開始コドンより 5'上流 396bpの位置より 3'下 流 20塩基に Bam HI制限酵素サイトを 5'側に付加した配列である。なお、プライマーの 位置にっ 、ては酵母ゲノムデータベース（http：〃 www.yeastgenome.org/)を参照さ れたい。
[0432] PCRは、铸型としてサッカロミセス ·セレピシェ S288Cゲノム DNA lng、プライマーとし て GAL1-396_F (配列番号 94)及び 3'GAL1 (配列番号 78)を用い、第 2ステップのァ ニール温度を 54°C、伸長反応時間を 1分、第 3ステップを 2分とした以外は、上記成熟 型 CLuc cDNAを合成した場合 (実施例 1)と基本的に同じ条件で行った。
[0433] 得られた PCR産物を 2%ァガロースゲル電気泳動によって分析し、約 390bpの DNA 断片を確認した。そこで、得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精 製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。得られた DNA溶液 は 50 μ 1反応液中、 Bam HI 50Uで 18時間切断し、 GenElute PCR clean-up kitを用い て精製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この DNA断片 を「GAL1プロモーター（-396) DNA断片」と呼ぶ。
[0434] GAL1プロモーター（-396) DNA断片と pmCLuRA Bam HI- Sma I断片とを DNA Ligati on kitを用いて連結 ·環状ィ匕させた後、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転換 体をー晚培養した後、 GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。 また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、 GA L1プロモーター (-396)をコードする DNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換 体を判別した。 GAL1プロモーター（-396)をコードする DNAが挿入されたプラスミドを 保持する形質転換体より、プラスミド (以下、「pmCLuRA- GAL1(- 396)」という）を調製 した。
[0435] 4-2. mCLuc DNAの 5'上流側に GAL1プロモーター (-288)を連結したプラスミドの作製
GAL1プロモーター (-288)は、 GAL1 ORFの開始コドンより 5'上流- 349bpから- 332bp に独立して存在する GAL4結合領域と上記 3回繰り返し GAL4結合領域を除去するこ とで、そのプロモーター活性がどのように変動するかを調査するために設計されたプ 口モーター配列である。 [0436] 以下のプライマーと 3'GAL1プライマー (配列番号 78)とを用いた PCRにより GAL1プ 口モーター (-288)を得た。
[0437] GAL1- 288— F: AAGAGGATCCGAAAAATTGGCAGTAACCTG (配列番号95)
GAL1- 288_Fプライマーは、 GAL1 ORF開始コドンより 5'上流 288bpの位置より 3'下 流 20塩基に Bam HI制限酵素サイトを 5'側に付加した配列である。なお、プライマーの 位置にっ 、ては、酵母ゲノムデータベース（http：〃 www.yeastgenome.org/)を参照さ れたい。
[0438] PCRは、铸型としてサッカロミセス ·セレピシェ S288Cゲノム DNA lng、プライマーとし て GAL1-288_F (配列番号 95)及び 3'GAL1 (配列番号 78)を用い、第 2ステップのァ ニール温度を 54°C、伸長反応時間を 1分、第 3ステップを 2分とした以外は、上記成熟 型 CLuc cDNAを合成した場合 (実施例 1)と基本的に同じ条件で行った。
[0439] 得られた PCR産物を 2%ァガロースゲル電気泳動によって分析し、約 390bpの DNA 断片を確認した。そこで、得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精 製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。得られた DNA溶液 は 50 μ 1反応液中、 Bam HI 50Uで 18時間切断し、 GenElute PCR clean-up kitを用い て精製し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この DNA断片 を「GAL1プロモーター（-288) DNA断片」と呼ぶ。
[0440] GAL1プロモーター（-288) DNA断片と pmCLuRA Bam HI- Sma I断片とを DNA Ligati on kitを用いて連結 ·環状ィ匕させた後、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転換 体をー晚培養した後、 GenElute plasmid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。 また、抽出したプラスミドを制限酵素の切断パターン及び塩基配列の解析により、 GA L1プロモーター (-288)をコードする DNAが挿入されたプラスミドを保持した形質転換 体を判別した。 GAL1プロモーター（-288)をコードする DNAが挿入されたプラスミドを 保持する形質転換体より、プラスミド (以下、「pmCLuRA- GAL1(- 288)」という）を調製 した。
[0441] (5)各欠失突然変異体 GAL1プロモーターを有するレポータープラスミドを用いた酵 母（サッカロミセス ·セレピシェ YPH500株）の形質転換
pmCLuRA- GAL1(- 396)、 pmCLuRA- GAL1(- 288)及び pmCLuRA- GAL1 (図 16にお いて、「-451」に相当する)の 3つのプラスミドを用いて、それぞれサッカロミセス'セレビ シェ YPH500株を形質転換した。形質転換には、 EZ- transformation (BIO101)を用い た。
[0442] 得られた形質転換体をゥラシルを含まなヽ合成寒天培地 (SD+KHLadeW)に塗布し 、 30°Cで 3日間培養した。
[0443] 3日間の培養後、それぞれのプラスミドを保有する形質転換体を得た。
[0444] (6)各欠失突然変異体 GAL1プロモーターの活性測定
上記（5)で得られたそれぞれのプラスミドを保有する形質転換体 1クローン当たり 3コ 口-一を、 SD+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地に接種し、ー晚培養した。一晩の 培養により Stationary phaseに達した培養液を、各ゥエルに lmlずつの 2%ガラクトース 含有 SC+KHLadeW 200mM KPi合成液体培地を添加した 96穴ディープゥエルプレー トにそれぞれ 20 1ずつ接種し、 30°Cで振盪培養した。培養開始カゝら 32時間後に、培 養液の一部を回収し、実施例 1の方法に従い 600nmの吸光度（OD600)及びルミノメ 一ターの相対発光強度 (RLU)を測定した。得られた値から、実施例 11と同様に各プ 口モーターの活性を数値ィ匕した。結果を図 16に示す。比較として、 TDH3プロモータ 一に連結した mCLucをコードする DNAを有する形質転換体の培養液を用いて、 CLu c活性を測定した結果を示す。
[0445] (7)プロモーター内の転写活性ィ匕に関わる ds配列探索の結果
図 15及び 16に示されたとおり、 TDH3プロモーター及び GAL1プロモーター内の転 写活性ィ匕に関わると考えられる cis配列の有無により、 mCLucをレポーター酵素として 測定した値が大きく変化した。このプロモーター断片と mCLucレポーターアツセィの 測定値の相関は、 JBC, 1994, 269: 6153-6162記載の結果とよく一致した。この結果 から、 mCLucをレポーター酵素として用いる方法は従来法と同様なプロモーターを順 次短縮することによって転写活性ィ匕に関わる配列を検討する実験に用いることができ ることがわかった。
[0446] 〔実施例 15〕 CLucを用いた遺伝子変異検査法の確立
遺伝子に突然変異が起こった際に、時としてその結果として、その位置あるいは塩 基の挿入や欠失の場合には 3'下流において、本来アミノ酸をコードしているコドンが 終止コドンとなる場合がある（「nonsense変異」と呼ばれる)。その結果、本来のタンパ ク質の全長ではなぐその一部のみが生産されることがあり、これが疾病の原因となる ケースが多数知られている。これは多くの場合、タンパク質の一部のみでは、十分に 本来の機能を果たさないためである。ヒトを初めとして様々な動物の個体において、 このような nonsense変異などタンパク質の正常な翻訳を妨げる遺伝子異常を検査す る方法として、 CLucを用いて、より簡便で測定感度の高い方法を確立した。
[0447] 具体的には、 CLucを用いたレポーターアツセィによって、ラットの Apo E遺伝子（配 列番号 96 : J. Biol. Chem. 261, 13777-13783 (1986))の第 3ェキソン（配列番号 96に 示す塩基配列において第 2567番目〜第 3402番目の塩基配列）に起こった nonsense 変異を検出する方法を開発した。
[0448] 配列番号 97に示す塩基配列は、ラットの Apo E遺伝子の第 3ェキソンのコード領域 と 3'末端に終止コドンを含む配列である。
[0449] 以下の実験では、ラットの Apo E遺伝子の第 3ェキソンに含まれるコード領域の全ァ ミノ酸配列をコードする DNA (配列番号 97に示す塩基配列において第 1番目〜第 723 番目の塩基配列；以下、「ApoE(+)」と呼ぶ）を正常 DNAモデルとして、 ApoE(+)に終止 コドンを付加した DNA (配列番号 97に示す塩基配列にぉ 、て第 1番目〜第 726番目 の塩基配列；以下、「ApoE (-)」と呼ぶ）を nonsense変異モデル DNAとして用いて、 2本 の相同染色体上の ApoE遺伝子が双方 ApoE(+)である場合、双方 ApoE (-)である場合 、一方が ApoE(+)で他方が ApoE (-)である場合の 3ケースを判別した。
[0450] (1)プラスミド pCLuTrの構築
遺伝子異常を検査するためのプラスミドベクターの確立のため、実施例 1で作製し たプラスミド pCLuRAにお!/、て、 a CLucをコードする DNAの αファクター分泌シグナ ルペプチド DNAと成熟型 CLuc DNAとの間に制限酵素サイトを導入した。そこで、以 下のプライマーを用いた PCRを行った。
[0451] aCL— inv— 5'— Hind— Sph: CCCTAAGCTTATCGCATGCCAGGACTGTCCTTACGAA CCTGATCCAC (配列番号 98)
aCL— inv— 3'— Hind: GGGTAAGCTTGAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCGAGAG (配列 番号 99) aCL_inv_5，- Hind- Sphプライマーは、 a CLucをコードする DNA (配列番号 13)の第 2 68番目の塩基（成熟型 CLucの最初のコドンの lbp目 )力 28bpの配列の 5'側に Hind I IIと Sph Iの制限酵素サイトを付カ卩した配列である。一方、 aCL_inv_3'-Hindプライマー は、 a CLucをコードする DNA (配列番号 13)の第 242番目の塩基から 26bp ( aファタ ター分泌シグナルペプチド DNA (配列番号 11)の 3'末端側から 26bp)の相補的な配 列で、その 5'側に 1塩基 Gと Hind III制限酵素サイトを付加した配列である。この 1塩基 の Gは、下記の in vivo recombinationステップにおいて外来 DNA断片（下記では、 Ap oE(+)又は ApoE(-))との間で相同組換えが起こらず、開環したレポータープラスミド（ 下記では、 rpCLuTr Hind Ill-Sph I DNA断片」）が自己環状化した際に CLucが発現 しないようフレームシフトを起こさせるために配置した。 in vivo recombinationステップ において外来 DNA断片との間で相同組換えが起こった場合には、この 1塩基の Gは プラスミドには残らな 、ために、 CLucの融合タンパク質が発現する。
[0452] PCRは、 aCLjnv_5，- Hind- Sphプライマー（配列番号 98)及び aCLjnv_3，- Hindプラ イマ一（配列番号 99)を用いて、反応液中に 5% DMSOをカ卩え、铸型として pCLuRA-T DH3プラスミド lOngを用いて、第 1ステップ: 94°Cで 2分、第 2ステップ： 94°Cで 15秒 (変 性）、 52°Cで 30秒（アニーリング）及び 68°Cで 8分（伸長）のサイクルを 35サイクル、並 びに第 3ステップ： 68°Cで 10分で行った以外は成熟型 CLuc cDNAを合成した場合 ( 実施例 1)と基本的に同じ条件で行った。
[0453] 得られた PCR産物を 1%ァガロース電気泳動により分析し、約 7kbpの DNA断片を確 認した。そこで、得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最 後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。得られた DNA溶液は 50 1 反応液中、 Hind III 50Uで 18時間切断し、 GenElute PCR clean-up kitを用いて精製 し、最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この DNA断片を「pC LuTr DNA断片」と呼ぶ。
[0454] 次!、で、 pCLuTr DNA断片を DNA Ligation kitを用いて連結 ·自己環状化させた後 、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転換体を一晩培養した後、 GenElute plas mid MiniPrep kitを用いてプラスミドを抽出した。また、抽出したプラスミドを制限酵素 の切断パターン及び塩基配列の解析により、 pCLuTr DNA断片が環状ィ匕したプラスミ ド (以下、「pCLuTr」と呼ぶ)を保持した形質転換体を判別した。この pCLuTrを保持し た形質転換体より、 pCLuTrを調製した。
[0455] pCLuTr 5 μ gを 50 μ 1反応液中、 Hind III 50Uで 18時間切断した。 Hind IIIで切断後 、 GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キットのカラム 力も DNAを溶出した。次いで、 DNAを 50 μ 1反応液中、 Sph I 50Uで 18時間切断し、 Ge nElute PCR clean-up kitを用いて精製し、最後に蒸留水 40 μ 1で同キットのカラムから DNAを溶出した。この溶出液全てを 1 %ァガロース電気泳動し、約 7kbpのバンドを切 り出し、フエノール'クロ口ホルムを用いたゲル抽出法により DNA断片を抽出した。この DNA断片を「pCLuTr Hind III- Sph I DNA断片」と呼ぶ。
[0456] (2)ラット Apo E遺伝子の第 3ェキソンに存在するコード領域のモデル DNAの調製 酵母の in vivo recombinationを利用して、ラット Apo E遺伝子の第 3ェキソンに存在 するコード領域を pCLuTr Hind ΙΙΙ-Sph I DNA断片に組み込むことができるように、以 下のプライマーを用いた PCRにより、 pCLuTr Hind III- Sph I DNA断片の両末端約 40 bpと相同な配列を有するラット Apo E遺伝子の第 3ェキソンに存在するコード領域を調 製した。
TACTGATGGAGGACACTATG (配列番号 100)
TTGATTCTCCAGGGGCACTG (配列番号 101 )
ApoE- aCL_gapFプライマーは、 a CLucをコードする DNA (配列番号 13)の第 229番 目の塩基から 39bp ( aファクター分泌シグナルペプチド DNA (配列番号 1 1)の 3'末端 側から 39bp)の 3'側にラット Apo E遺伝子の第 3ェキソンに含まれるコード領域 (配列 番号 97)第 1番目の塩基から 21bpを付カ卩した配列である。一方、 ApoE-aCL_gapRプラ イマ一は、 a CLuc ORFの開始コドンより 268bp (成熟型 CLucの最初のコドンの lbp目 )力 3'下流 40bpの相補的な配列の 3'側にラット Apo E遺伝子の第 3ェキソンに含ま れるコード領域 (配列番号 97)の第 704番目〜第 723番目の塩基配列の相補的な配 列を付加した配列である。
[0458] PCRは、 ApoE- aCL_gapFプライマー（配列番号 100)及び ApoE- aCL_gapRプライマ 一（配列番号 101)を用い、反応液には 5% DMSOをカ卩え、ラットゲノム DNA 10 ngを铸 型とし、第 1ステップ: 94°Cで 2分、第 2ステップ: 94°Cで 15秒 (変性）、 50°Cで 30秒 (ァ- 一リング)及び 68°Cで 1分（伸長）のサイクルを 35サイクル、並びに第 3ステップ： 68°C で 2分で行った以外は、上記成熟型 CLuc cDNAを合成した場合 (実施例 1)と基本的 に同じ条件で行った。
[0459] 得られた PCR産物を 1%ァガロース電気泳動により分析し、約 800bpの DNA断片を 確認した。そこで、得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、 最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この DNA断片を「ApoE ( +)」とした。
[0460] 次に、 ApoE-aCL_gapFプライマー（配列番号 100)及び以下のプライマーを用いた PCRにより、 pCLuTr Hind Ill-Sph I DNA断片の両末端約 40bpと相同な配列を有する ラット Apo E遺伝子の第 3ェキソンに存在するコード領域 (終止コドンを含む)を調製し た。
[0461] ApoE- aCL— gapR— NC: GAACTGTGTTTGGTGGATCAGGTTCGTAAGGACAGTCC TGTCATTGATTCTCCAGGGGCACTG (配列番号 102)
ApoE- aCL_gapR_NCプライマーは、 a CLuc ORFの開始コドンより 268bpから 3'下流 40bpの相補的な配列の 3'側にラット Apo E遺伝子の第 3ェキソンに含まれるコード領 域 (配列番号 97)の第 704番目〜第 726番目の塩基配列の相補的な配列を付加した 配列である。
[0462] PCRは、 ApoE- aCL_gapFプライマー（配列番号 100)及び ApoE- aCL_gapR_NCブラ イマ一（配列番号 102)を用いた以外は、上記 Apo E(+)の PCRと同様である。
[0463] 得られた PCR産物を 1%ァガロース電気泳動により分析し、約 800bpの DNA断片を 確認した。そこで、得られた PCR産物を GenElute PCR clean-up kitを用いて精製し、 最後に蒸留水 40 1で同キットのカラム力も DNAを溶出した。この DNA断片を「ApoE ( -)」とした。
[0464] 次 、で、得られた Apo E(+)又は Apo E (-)の DNA断片を含む溶液を、それぞれ段階 希釈して、 1%ァガロースゲル電気泳動を行った。得られた電気泳動像よりバンドの 強度を数値ィ匕し、 Apo E(+)(終始コドンを含まない)及び Apo E(- )(終始コドンを含む)の DNA断片が同濃度になるように希釈を行った。得られた希釈 DNA断片の OD 260を 測定し、 DNA濃度の定量を行った。さらに、 Apo E(+)及び Apo E (-)の DNA断片をそれ ぞれ等量混合し、 Apo E(+/-)(Apo E(+)と Apo E (-)とが 1対 1)を作製した。
[0465] (3) CLucを用いた遺伝子異常検査法の確立
サッカロミセス.セレピシェ YPH500株 1コロニーを、 2倍濃縮 YPD液体培地に植菌し 、 30°Cでー晚振盪培養した。さら〖こ、その培養液 10 1を YPD培地 100mlに接種し、 30 °Cで振盪培養した。 OD600の値が 0.6に達したところで培養をやめ、細胞を回収し、 蒸留水に再撹拌した後、再び細胞を回収した。得られた細胞を、直前に調製した LiA c-TE Buffer(100 mM Tris— HCl/10mM EDTA (pH8.0) : 1M Li acetate:water= l : 1 : 8 ) 1 mlにピペットにて懸濁した。これを酵母コンビテントセルとした。
[0466] コンビテントセル lmlに対し、 pCLuTr Hind ΙΙΙ-SphI DNA断片 3 μ gと herring sperm D NA(Clontech社) 100 μ 1を加え、よく混和し、 96穴 PCRチューブの各ゥエルに 10 μ 1ず つ分注した。加えて、 10-50 ng/ zz 1に調製した上記 ΑροΕ(+)、 ΑροΕ( -)、又は ΑροΕ(+/ -)溶液を 1 1添カ卩した。また、陰性コントロールとして、いずれの DNA溶液も加えない サンプルを用いた。直前に調製した PEG溶液（100 mM Tris-HCl/lOmM EDTA (pH8 .0) ： 1M Li acetate： 50% Polyethylene glycol 4000 = 1 : 1 : 8)を 60 μ 1ずつ、 96穴 PCR チューブの各ゥエルに分注し、よく混和した。 30°Cで 30分間のインキュベーション後、 DMSO 7 1を添カ卩してよく混和し、 42°Cで 15分間インキュベーションした。次いで、速 やかに氷中にて冷却した。この溶液に SD+WKHLade 200mM KPi pH6.0培養液を 1ゥ エルあたり 130 μ 1添加し、よく攪拌した（これを「トランスフォーメーションミックス」と呼ぶ ；)。 96穴ディープゥエルプレートに SD+WKHLade 200mM KPi pH6.0培養液 lmlを添カロ しておき、そこに上記トランスフォーメーションミックスを 50 1接種し、 30°Cにおいて 16 0r/minで 5日間培養した。
[0467] 次!、で、全てのゥエルが stationary phaseに達したのを確認し、別の 96穴ディープゥ エルプレートに SD+WKHLade 200mM KPi pH6.0培養液 lmlを添カ卩しておき、上記培 養液を 10 1接種して、約 16時間培養した。この培養液の一部を回収し、実施例 1の 方法に従 ヽ、 600nmの吸光度（OD600)及びルミノメーターの相対発光強度（RLU)を 測定した。得られた値から、相対発光強度 (RLU)を 600nmの吸光度で除して得られる 値を計算した。結果を図 17に示す。なお、図 17において、「No insert」は、陰性コント ロールの結果を示す。
[0468] 図 17に示すように、 CLucは、ラット Apo E遺伝子の第 3ェキソンにコードされるタンパ ク質との融合タンパク質として発現させても、分泌され、且つその活性を有しているこ とが分力つた。また、 Apo E(+)(終始コドンを含まない配列)を用いたときの濁度で補正 された CLuc活性に対し、 Apo E(-)(終始コドンを含む配列)の濁度で補正された CLuc 活性は非常に小さぐまた Apo E(+/-)の濁度で補正された CLuc活性は Apo E(+)のほ ぼ半分の値を示した。この結果より、 CLucを用いたレポーターアツセィによって、 Apo E遺伝子の第 3ェキソンの遺伝子異常に関して情報がないラットゲノム DNAを出発材 料として用い、上記のモデル DNAを用いた場合と比較することによって、 Apo E遺伝 子の第 3ェキソンに含まれるコード領域の遺伝子変異を簡便に検出することが可能で あることがわかった。
[0469] また、本実施例で用 、た酵母の in vivo recombinationを利用したプラスミド構築 Z 酵母形質転換体作製法は、非常に簡便であり、 CLucを用いたレポーターアツセィに おいて、プロモーター、遺伝子などいかなる DNAであっても、多数'多種類の DNAを 迅速にレポータープラスミドに組み込むことができると考えられ、 CLucを用いたレポ一 ターアツセィをノヽィスループットィ匕できることが示された。また、上記の操作は基本的 に分注操作のみから構成されているため、分注ロボット（例えばベックマン社 BIOMEK 200)を用いた自動化にも成功して!/、る。
配列表フリーテキスト
[0470] 配列番号 13は、融合タンパク質をコードする遺伝子である。
[0471] 配列番号 14は、融合タンパク質である。
[0472] 配列番号 15は、合成遺伝子である。
[0473] 配列番号 16〜19、 23、 24、 53〜60、 62、 63、 65、 66、 68、 69、 71、 72、 74、 7
5、 77、 78、 80〜95及び 98〜102は、プライマーである。
[0474] 配列番号 20及び 21は、オリゴ DNAである。
[0475] 配列番号 25〜52は、合成 DNAである。
[0476] 配列番号 97は、ラットの Apo E遺伝子の第 3ェキソンのコード領域と 3'末端に終止コ ドンを含む配列である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
[1] 分泌型発光酵素をコードする遺伝子を宿主に導入する第 1工程と、
第 1工程で得られる形質転換体の培養物又は培養上清を上記分泌型発光酵素の 基質と接触させる第 2工程と、
上記分泌型発光酵素の酵素活性を測定する第 3工程とを含み、
上記分泌型発光酵素の酵素活性に基づ!ヽて、宿主に導入した外来遺伝子又は外 来 DNA断片の発現、機能、転写活性又は転写制御機能を評価することを特徴とする 、レポーターアツセィ方法。
[2] 上記外来遺伝子は、上記分泌型発光酵素をコードする遺伝子に連結されているか 、又は上記分泌型発光酵素をコードする遺伝子における分泌シグナルペプチドをコ ードする遺伝子と成熟タンパク質をコードする遺伝子との間に挿入されていることを 特徴とする、請求項 1記載のレポーターアツセィ方法。
[3] 上記外来遺伝子は、上記宿主で発現して!/ヽることを特徴とする、請求項 1記載のレ ポーターアツセィ方法。
[4] 上記外来 DNA断片は、上記分泌型発光酵素をコードする遺伝子に連結されている ことを特徴とする、請求項 1記載のレポーターアツセィ方法。
[5] 上記分泌型発光酵素が分泌型ルシフェラーゼであることを特徴とする、請求項 1記 載のレポーターアツセィ方法。
[6] 上記分泌型ルシフェラーゼがゥミホタルルシフェラーゼであることを特徴する、請求 項 5記載のレポーターアツセィ方法。
[7] 上記ゥミホタルルシフェラーゼが Cypridina noctiluca由来のルシフェラーゼであるこ とを特徴とする、請求項 6記載のレポーターアツセィ方法。
[8] 上記分泌型発光酵素が、上記宿主にお!、て機能する分泌シグナルペプチドと分泌 型発光酵素の成熟タンパク質との融合タンパク質であることを特徴とする、請求項 1 記載のレポーターアツセィ方法。
[9] 上記宿主が酵母であることを特徴とする、請求項 1記載のレポーターアツセィ方法。
[10] 上記酵母がサッカロミセス ·セレピシェ (Saccharomyces cerevisiae)であることを特徴 とする、請求項 9記載のレポーターアツセィ方法。
[11] 上記酵母の形質転換体を、 pH3.5〜6.5の条件下で培養することを特徴とする、請 求項 9記載のレポーターアツセィ方法。
[12] 分泌型発光酵素の成熟タンパク質をコードする遺伝子の上流に分泌シグナルぺプ チド又は分泌タンパク質をコードする遺伝子を連結した DNAを宿主に導入する第 1ェ 程と、
第 1工程で得られる形質転換体の培養物又は培養上清を上記分泌型発光酵素の 基質と接触させる第 2工程と、
上記分泌型発光酵素の酵素活性を測定する第 3工程とを含み、
上記分泌型発光酵素の酵素活性に基づ!、て、上記分泌シグナルペプチド又は分 泌タンパク質の分泌能を評価することを特徴とする、レポーターアツセィ方法。
[13] 上記分泌型発光酵素が分泌型ルシフェラーゼであることを特徴とする、請求項 12 記載のレポーターアツセィ方法。
[14] 上記分泌型ルシフェラーゼがゥミホタルルシフェラーゼであることを特徴する、請求 項 13記載のレポーターアツセィ方法。
[15] 上記ゥミホタルルシフェラーゼが Cypridina noctiluca由来のルシフェラーゼであるこ とを特徴とする、請求項 14記載のレポーターアツセィ方法。
[16] 上記宿主が酵母であることを特徴とする、請求項 12記載のレポーターアツセィ方法
[17] 上記酵母がサッカロミセス ·セレピシェ (Saccharomyces cerevisiae)であることを特徴 とする、請求項 16記載のレポーターアツセィ方法。
[18] 上記酵母の形質転換体を、 pH3.5〜6.5の条件下で培養することを特徴とする、請 求項 16記載のレポーターアツセィ方法。
[19] 分泌型発光酵素をコードする遺伝子を宿主に導入する第 1工程と、
第 1工程で得られる形質転換体の培養物又は培養上清を上記分泌型発光酵素の 基質と接触させる第 2工程と、
上記分泌型発光酵素の酵素活性を測定する第 3工程とを含み、
上記分泌型発光酵素の酵素活性に基づ!、て、化学的又は物理的変化を測定する ことを特徴とする、レポーターアツセィ方法。
[20] 第 1工程の後に、上記形質転換体をィ匕学的又は物理的変化の対象に曝露するェ 程を含むことを特徴とする、請求項 19記載のレポーターアツセィ方法。
[21] 上記化学的又は物理的変化応答性の外来 DNA断片が、上記分泌型発光酵素をコ ードする遺伝子に連結されていることを特徴とする、請求項 19記載のレポーターアツ セィ方法。
[22] 上記化学的又は物理的変化応答性のタンパク質と相互作用する外来 DNA断片が
、上記分泌型発光酵素をコードする遺伝子に連結されていることを特徴とする、請求 項 19記載のレポーターアツセィ方法。
[23] 上記化学的又は物理的変化応答性のタンパク質が外来遺伝子によってコードされ るものであることを特徴とする、請求項 22記載のレポーターアツセィ方法。
[24] 上記分泌型発光酵素が分泌型ルシフェラーゼであることを特徴とする、請求項 19 記載のレポーターアツセィ方法。
[25] 上記分泌型ルシフェラーゼがゥミホタルルシフェラーゼであることを特徴とする、請 求項 24記載のレポーターアツセィ方法。
[26] 上記ゥミホタルルシフェラーゼが Cypridina noctiluca由来のルシフェラーゼであるこ とを特徴とする、請求項 25記載のレポーターアツセィ方法。
[27] 上記宿主が酵母であることを特徴とする、請求項 19記載のレポーターアツセィ方法
[28] 上記酵母がサッカロミセス ·セレピシェ (Saccharomyces cerevisiae)であることを特徴 とする、請求項 27記載のレポーターアツセィ方法。
[29] 上記酵母の形質転換体を、 pH3.5〜6.5の条件下で培養することを特徴とする、請 求項 27記載のレポーターアツセィ方法。
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