JP2009171920A - 抗癌剤のスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

【課題】抗癌剤の標的としての転写因子Ｎｒｆ２の意義を解明し、これに基づいて抗癌剤のスクリーニングシステムを構築する。
【解決手段】転写因子Ｎｒｆ２によって制御されるプロモーター配列と、当該配列と機能的に連結されたレポーター遺伝子とを含む発現ベクターを用意し、前記発現ベクターを、Ｋｅａｐ１遺伝子に変異を有するか、又はＫｅａｐ１タンパク質の発現量が低下したヒト細胞に形質移入し、候補化合物の存在下又は非存在下において前記形質移入細胞を培養して前記レポーター遺伝子の発現量を測定し、そして前記レポーター遺伝子の発現を阻害する候補化合物をヒト肺癌の推定増殖阻害剤として選択する。
【選択図】図５

Description

本発明は、抗癌剤のスクリーニング方法及び当該方法に用いるためのヒト形質転換細胞等に関し、より詳細には、肺癌、特に抗癌剤抵抗性を示すヒト肺癌に効果のある抗癌剤のスクリーニング方法等に関する。

我が国における肺癌の死亡者数は、１９９８年に胃癌を抜いて第１位となり、現在では年間５万人を超している。早期発見によって手術可能な症例（全体の約３０％）は、その半数近くが５年以上の生存を示す。しかし、肺癌の早期発見は難しく、全体の５年生存率は約２０％と極めて低い。手術不可能な肺癌の治療方法としては、放射線治療や抗癌剤投与が行われるが、一般的に小細胞肺癌は抗癌剤の効果が比較的高いものの、非小細胞肺癌に対する抗癌剤の効果は低いことが知られている。

肺癌治療に使用される代表的な抗癌剤としては、ゲムシュタビン（代謝拮抗剤）、シスプラチン（プラチナ製剤）、マイトマイシンＣ（アルキル化剤）、イリノテカン（トポイソメラーゼ阻害剤）及びゲフィチニブ（イレッサ（登録商標）、分子標的剤）等が知られているが、肺癌の場合、これらの抗癌剤の効果はあまり大きくなく、下痢や間質性肺炎等の副作用に苦しむ患者が多いのが特徴である。このように、種々の抗癌剤が効きにくいことから、肺癌では特定の抗癌剤代謝酵素のみが活性化されているのではなく、薬剤代謝酵素群全体が活性化されているのではないかと考えられる。

抗癌剤の代謝に関する多くの遺伝子産物の中で、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのような第二相薬剤代謝酵素群及び抗酸化ストレス酵素／タンパク質がある。これらの酵素／タンパク質群は、抗酸化剤／求電子剤応答因子(antioxidant/electrophile-responsive element：ＡＲＥ／ＥｐＲＥ)と称される塩基配列モチーフによって制御されている一群の遺伝子によってコードされている（例えば、非特許文献１参照）。転写因子であるＮｒｆ２は、小さなＭａｆファミリータンパク質の１つとヘテロダイマーを形成し、この複合体がＡＲＥに結合して上記の細胞保護的な遺伝子の転写を活性化する（例えば、非特許文献２参照）。Ｋｅａｐ１は、このＮｒｆ２と相互作用するタンパク質として同定されたものであり、ＢＴＢ、ＩＶＲ及びＤＧＲドメインを含む（例えば、非特許文献３参照）。これらのドメインは、Ｋｅａｐ１の二重の機能に寄与している。Ｋｅａｐ１は、アダプタータンパク質であるキュリン３（Ｃｕｌ３）と特異的に相互作用し、Ｅ３ユビキチンリガーゼを形成して基質であるＮｒｆ２の迅速な分解を引き起こす。Ｋｅａｐ１はまた、求電子的／酸化的ストレスに対するセンサーとしても機能する。ストレス刺激がないとき、Ｎｒｆ２はＫｅａｐ１−Ｃｕｌ３Ｅ３リガーゼによるユビキチン化を用いるプロテアソーム経路により迅速に分解される。ストレスに曝されたとき、Ｋｅａｐ１が修飾され、Ｎｒｆ２は修飾Ｋｅａｐ１から遊離し核内へ移行し、種々の細胞保護的な遺伝子の転写を活性化する。Ｋｅａｐ１−Ｃｕｌ３Ｅ３リガーゼによるＮｒｆ２の迅速な分解が、ストレスに応答した細胞保護的な酵素群の適時誘導を可能にしている。従って、Ｎｒｆ２を活性化することによって、癌を含む種々の疾患の治療、予防、改善されること、及びそのような機能が付与された食品が報告されている（例えば、特許文献１参照）。

しかしながら、驚いたことに、本発明者らは日本人肺癌患者及び肺癌細胞株のＫＥＡＰ１遺伝子に体細胞変異を同定しており、これらのＫｅａｐ１遺伝子変異はＫｅａｐ１のＮｒｆ２抑制活性に影響を与え、Ｎｒｆ２の核内への蓄積を刺激して癌細胞における細胞保護的酵素の発現を誘導している。最近、他のグループによって白人の肺癌患者の１９％においてＫＥＡＰ１遺伝子の体細胞変異が検出されている（例えば、非特許文献４参照）。

ＷＯ２００６／０４３６７１Ａ１ Nguyen T, Sherratt PJ, Pickett CB. Regulatory mechanisms controlling gene expression mediated by the antioxidant response element. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2003; 43:233-60 Motohashi H, Katsuoka F, Engel JD, Yamamoto M. Small Maf proteins serves as transcriptional cofactors for keratinocyte differentiation in the Keap1-Nrf2 regulatory pathway. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101:6379-84 Adams J, Kelso R, Cooley L. The kelch repeat superfamily of proteins: propellers of cell function. Trends Cell Biol 2000; 10: 17-24 Singh A, Misra V, Thimmulappa RK, et al. Dysfunctional KEAP1-NRF2 interaction in non-small-cell lung cancer. PLos Med 2006; 3: e420

上記従来技術についての本発明者らの分析によれば、肺癌患者のある集団におけるＫＥＡＰ１遺伝子の欠損が、細胞核内における転写因子Ｎｒｆ２を活性化して抗酸化剤や生体異物の代謝に関与する酵素及び薬剤排出ポンプの発現を誘導し、これによって癌細胞の薬剤耐性能を高めていることが示唆される。しかしながら、日本人の肺癌患者集団においても同様であるかは明らかではない。さらに、癌細胞においてＮｒｆ２機能のみを阻害したときに癌細胞の増殖にどのような影響を与えるのか、すなわち抗癌剤の標的としての転写因子Ｎｒｆ２の意義を解明する必要がある。本発明はこれらの事実を解明することによりすぐれた抗癌剤のスクリーニングシステムを構築することを目的とする。

本発明者らは、日本人の肺癌患者集団において、高い確率でＫＥＡＰ１遺伝子に変異が起こり、これによって癌細胞のＮｒｆ２が活性化されていること、及びこのようなＫＥＡＰ１欠損肺癌細胞におけるＮｒｆ２の活性化が肺癌細胞自体の増殖を促進していることを見出した。さらにＫｅａｐ１機能の低下した肺癌細胞株においてＮｒｆ２の発現を抑制することでこれらの細胞の増殖を抑制しうることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成した。

すなわち、本発明の抗癌剤のスクリーニング方法は、転写因子Ｎｒｆ２によって制御されるプロモーター配列と、当該配列と機能的に連結されたレポーター遺伝子とを含む発現ベクターを用意し、前記発現ベクターを、ＫＥＡＰ１遺伝子に変異を有するか、Ｋｅａｐ１タンパク質の発現量が低下しているか、又はＮｒｆ２タンパク質が活性化されているヒト細胞に形質移入し、候補化合物の存在下又は非存在下において前記形質移入細胞を培養して前記レポーター遺伝子の発現量を測定し、そして前記レポーター遺伝子の発現を阻害する候補化合物をヒト肺ガンの推定増殖阻害剤として選択することを含む。好ましい実施形態において、前記ＫＥＡＰ１遺伝子の変異は、Ｋｅａｐ１タンパク質のＩＶＲドメイン又はＤＧＲドメインに存在し、かつ変異体Ｋｅａｐ１タンパク質のＮｒｆ２活性抑制機能が低下するような変異である。

本発明の他の観点では、１又は複数のＮｒｆ２結合部位を含むプロモーター配列の下流に、分泌型レポーター遺伝子を連結してなる発現ベクター、及び当該発現ベクターを、ＫＥＡＰ１遺伝子に変異を有するか、又はＫｅａｐ１タンパク質の発現量が低下することによりＮｒｆ２タンパク質が活性化されているヒト細胞に形質移入してなる形質転換ヒト細胞が提供される。前記Ｎｒｆ２結合部位は、配列番号１に示した塩基配列からなることが好ましく、前記レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子であることが好ましい。従って、本発明の特に好ましい実施形態は、候補化合物の存在下又は非存在下において前記形質転換ヒト細胞をインキュベートし、それぞれの条件において培養液中に分泌されたレポーター遺伝子産物量を測定し、及び前記候補化合物の非存在下に比べて、存在下におけるレポーター遺伝子産物量が減少する場合に前記候補化合物がヒト肺ガンの増殖阻害剤であると推定すること、を含む抗癌剤のスクリーニング方法である。

さらに異なる観点において、本発明は、ヒト腫瘍組織より調製された切片を、Ｎｒｆ２抗体、Ｋｅａｐ１抗体、Ｎｑｏ１抗体、Ｍｒｐ２抗体、及び／又はＭｒｐ３抗体を用いて組織染色し、前記抗体と結合するそれぞれのタンパク質の細胞内局在性を検定し、そしてＮｒｆ２タンパク質が細胞核内に蓄積するか、Ｋｅａｐ１タンパク質が細胞質で減少するか、又はＮｑｏ１タンパク質、Ｍｒｐ２タンパク質、及びＭｒｐ３タンパク質から選択される１つ以上のタンパク質が細胞質若しくは細胞膜に局在するとき、前記腫瘍が抗癌剤に対して抵抗性を有することを示唆することを特徴とする癌細胞を特徴付ける方法を提供する。上記タンパク質の細胞内局在性と、癌細胞の薬剤耐性能との関係は、後述する実施例において詳細に示される（特に、図３参照）。

本発明のスクリーニング方法は、効率的に抗癌剤をスクリーニングすることができ、ハイスループットスクリーニングに適している。特に、本発明の発現ベクターを用いることによって細胞の培養上清中に分泌されたレポーター酵素の活性を検出することで抗癌作用のモニタリングが可能となる。したがって、リード化合物添加後１日又は２日程度で培地交換し、さらに６時間から１２時間程度培養後に、細胞の培養上清を測定するという迅速かつ容易や方法で抗癌剤のバイオアッセイ系を構築することができる。

本発明のスクリーニング方法によって得られる抗癌剤は、単独でＫＥＡＰ１遺伝子に変異を有するか、Ｋｅａｐ１タンパク質の発現量が低下しているか、又はＮｒｆ２タンパク質が活性化されているヒト肺癌又はその他の癌に対する増殖抑制等の抗腫瘍効果が期待される。さらに、これらの肺癌は転写因子Ｎｒｆ２の活性化によって抗癌剤の排出や解毒作用が亢進し、既存の抗癌剤に対して抵抗性を示すので、本発明のスクリーニング方法によって得られる抗癌剤を併用することで、既存の抗癌剤の効果を促進し、さらなる抗癌効果が期待される。

本発明の実施において、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡ技術等の一般的方法及び従来技術について、実施者は、特に示されなければ、当該分野の標準的な参考書籍を参照し得る。これらには、例えば、Molecular Cloning：A Laboratory Manual 第3版（Sambrook & Russell、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2001）；Current Protocols in Molecular biology（Ausubelら編、John Wiley & Sons、1987）；Methods in Enzymologyシリーズ（Academic Press）；PCR Protocols: Methods in Molecular Biology（Bartlett & Striling編、Humana Press、2003）；Animal Cell Culture: A Practical Approach 第３版（Masters編、Oxford University Press、2000）を参照のこと。また、本明細書において参照される細胞培養、細胞生物学実験のための試薬及びキット類はSigma社やAldrich社、Invitrogen/GIBCO社、クロンテック社、タカラバイオ株式会社等の市販業者から入手可能である。

[Ｎｒｆ２の活性化阻害に基づく抗癌剤のスクリーニング方法]
本発明のＮｒｆ２活性化阻害に基づく抗癌剤のスクリーニング方法は、転写因子Ｎｒｆ２によって制御されるプロモーター配列と、当該配列と機能的に連結されたレポーター遺伝子とを含む発現ベクターを用意し、前記発現ベクターを、ＫＥＡＰ１遺伝子に変異を有するか、又はＫｅａｐ１タンパク質の発現量が低下したヒト細胞に形質移入し、候補化合物の存在下又は非存在下において前記形質移入細胞を培養して前記レポーター遺伝子の発現量を測定し、そして前記レポーター遺伝子の発現を阻害する候補化合物をヒト肺癌の推定増殖阻害剤として選択することを含む。本明細書において、「転写因子Ｎｒｆ２」とは、nuclear factor E2-related factor 2とも称され、細胞保護的遺伝子の発現を構成的に、又は酸化ストレスシグナルに応答して誘導するために、これらの遺伝子のプロモーター領域にあるＡＲＥ／ＥｐＲＥと相互作用する。Ｎｒｆ２は、保存された塩基性領域−ロイシンジッパー構造を含む転写因子のＣＮＣファミリーに属する。ヒトとトリのＮｒｆ２のアミノ酸配列を比較すると、６つの相同性の高い領域（Ｎｅｈ１〜Ｎｅｈ６ドメイン）が存在することが知られている。これらのＮｅｈドメインの中で、Ｎｅｈ１、Ｎｅｈ３及びＮｅｈ６ドメインはＮｒｆ２タンパク質のＣ末端側の半分に局在する。Ｎｅｈ１はＣＮＣ型の塩基性ロイシンジッパーＤＮＡ結合モチーフを含み、Ｎｅｈ６はセリンリッチ保存領域を含む。Ｎ末端側の半分には、２つの酸性トランス活性化ドメインであるＮｅｈ４とＮｅｈ５が存在し、この領域はトランス活性化のためにＣＢＰのＫＩＸ及びＣＨ３ドメインと相互作用する。Ｎｅｈ２はＮｒｆ２のＮ末端に局在し、Ｋｅａｐ１と相互作用して細胞ストレス応答のための制御ドメインとして作用する。すなわち、Ｎｒｆ２は、Ｋｅａｐ１−Ｎｒｆ２複合体として細胞質に存在し、そこに活性化物質が作用すると核内へ移行してsmall-Mafとヘテロ二量体を形成してＡＲＥに結合し、第二相酵素の発現を増大させると考えられる。

一方、本明細書において「Ｋｅａｐ１」とは、細胞質に存在するタンパク質であって、Kelch-like ECH-associated protein 1とも称される。Ｋｅａｐ１は、３つの機能的ドメインを有し、これらはＢＴＢ(Broad complex, Tramtrack, and Bric-a-Brac)、ＩＶＲ(intervening region)、及びＤＧＲ(double glycine repeat or Kelch repeat)である。ＢＴＢドメインは二量体形成のために働き、Ｋｅａｐ１二量体は、その有効な機能にとって重要である。ＤＧＲドメインはＮｒｆ２のＮｅｈ２ドメインと相互作用し、ユビキチン化シグナリング及びプロテアソームによる分解を介してＮｒｆ２タンパク質の代謝回転速度を制御する。

従って、本発明のスクリーニング方法は、転写因子Ｎｒｆ２によって活性化されたレポーター遺伝子の発現を指標として、これを阻害する化合物を選択することによりＮｒｆ２の活性化阻害剤をスクリーニングするシステムである。Ｎｒｆ２の活性化阻害には種々のメカニズムが考えられ、例えば、細胞質内でＮｒｆ２と相互作用して核への移行を阻害すること、細胞質内でのＮｒｆ２の分解を促進すること、及び核内におけるＮｒｆ２の転写促進作用を阻害すること等が含まれる。本発明の方法で選択される化合物は、これらの何れであってもよい。後述する実施例において詳細に示されるように、Ｎｒｆ２が活性化された肺癌細胞は増殖性が増大し、Ｎｒｆ２の機能を抑制することによって増殖を抑制することができると考えられる。従って、本発明のスクリーニング方法により得られた化合物は抗癌剤として機能するか、あるいはそのリード化合物として新規な抗癌剤開発に利用できることが期待される。

本発明のスクリーニング方法に用いることのできる候補化合物は、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアルケミストリー技術、又は通常の合成技術によって得られた化合物群、あるいは、ファージディスプレイ法などを応用して作成されたランダムペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然物質又は動物組織抽出物などもスクリーニングの候補化合物として用いることができる。さらには、本発明のスクリーニング方法により得られた化合物を化学的又は生物学的に修飾した化合物も用いることができる。

[本発明の組換えベクター]
１つの実施形態において、本発明の発現ベクターは、１又は複数の転写因子Ｎｒｆ２結合部位を含むプロモーター配列の下流に、分泌型レポーター遺伝子を連結して調製される。本明細書において、「Ｎｒｆ２結合部位」とは、転写因子Ｎｒｆ２が結合するＤＮＡ上の保存配列であって、上述のＡＲＥ配列（5’-RTGAG/CNNNGC-3’（配列番号１））、その相補配列、又はそれらの類似配列をいう。Ｎｒｆ２結合部位とコアプロモーター（ＴＡＴＡ配列）との連結方法は特に限定されないが、これらのプロモーター配列の下流に連結されたレポーター遺伝子がＮｒｆ２依存的に転写されるように構成されていればよい。

本発明の好ましい実施形態において、上記Ｎｒｆ２結合部位は、配列番号１に記載の塩基配列からなるか、又は当該配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ転写因子Ｎｒｆ２と結合して下流に連結された遺伝子の転写を活性化する配列である。「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは当業者において周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」とは約４５℃にて６．０×ＳＳＣ（クエン酸ナトリウムと塩化ナトリウムとの塩溶液）でハイブリダイゼーションを行った後に、５０℃で２．０×ＳＳＣで洗浄することを指す。ストリンジェンシーの選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０×ＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．２×ＳＳＣ、５０℃まで選択すること、ができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェエンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで増大させることができる。なお、当業者であれば、ＳＳＣの希釈率、ホルムアミド濃度、温度などの諸条件を適宜選択することで、上記の条件と同様のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を実現することができる。

本発明において用いられるレポーター遺伝子は、細胞内で発現し検出が容易なものであれば特に限定されるものではないが、例えば、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びエクオリン等を挙げることができる。大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）は種々の細胞の形質転換におけるレポーター遺伝子としてよく使用されている。この酵素の生体内での基質はラクトースであるが、ほぼあらゆるβガラクトシドを加水分解することができ、例えば無色の基質であるＯＮＰＧを加水分解して４２０ｎｍの光を吸収する黄色のo-nitrophenolを生成する。また、ｘ−ｇａｌはこの酵素により分解されてインディゴブルーの呈色反応を示す。

アルカリフォスファターゼは、分子触媒活性の極めて高い酵素であり、種々の蛍光及び発光基質も開発されているため高感度測定に好適である。ホタルルシフェラーゼはＡＴＰの存在下でルシフェリンの酸化を触媒し、光子を生成する化学ルミネッセンス反応を触媒する。ルシフェラーゼは単量体のタンパク質で翻訳後の修飾を必要としないから、遺伝子発現のレポーター遺伝子として適している。遺伝子発現の速度変化を迅速に検出し、感度を向上させるためにルシフェラーゼタンパク質の安定性を低下させたり、また、測定再現性を上げるために内部標準酵素とのデュアルレポーターシステム等が開発されている。ＧＦＰはオワンクラゲ（Aequorea victoria）等から発見された蛍光タンパク質であり、共存する発光タンパク質であるエクオリンの青色化学発光をエネルギー変換して緑色にすることが知られている(Prasher, D., et al., Gene 11, 229-233, 1992)。このＧＦＰは上記エクオリンやルシフェラーゼのように特殊な蛍光団を必要とせず、自らのアポタンパク質上で自動的に蛍光団を形成する。このため、クローン化されたＧＦＰのｃＤＮＡを用いてこれまでに細菌、酵母、カビ、植物、昆虫及び動物細胞等で発現されて、遺伝子発現の指標として用いられている。また、ＧＦＰ遺伝子に種々の方法により変異を導入して多くのＧＦＰ誘導体が作製され、これらの中には野生型GFPよりも強い蛍光強度を示したり、異なる波長の蛍光を発する誘導体があることが報告されている（Ehrig,T., O'Kane,D., and Prendergast,F. FEBS Lett. 367, 163-166, 1995及びCrameri,A., Whitehom, E., Tate,E., and Stemmer,W. Nature Biotech. 14, 315-319, 1996参照）。

また、本発明の発現ベクターは、前記レポーター遺伝子を発現させるための発現調節領域を含む。このような発現調節領域には、コアプロモーターのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、シグナル配列、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカーなどを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。コアプロモーターとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノン酸化還元酵素１（ＮＱＯ１）等の第二相酵素のコアプロモーターの他、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＣＭＶプロモーター等を用いてもよい。

本発明の１つの好ましい実施形態において、細胞を溶解することなくレポーター遺伝子の活性を迅速かつ簡便に検出することができる分泌型レポーター遺伝子を用いることができる。海洋性のカイアシ類からクローン化された分泌型Metridia longaルシフェラーゼ遺伝子は、Ｎ末端に分泌に必要なアミノ酸残基１７個のシグナルペプチドを含む２４ｋＤａのタンパク質をコードしている。この分泌型ルシフェラーゼ遺伝子を用いたレポーターアッセイシステム用のベクターはクロンテック社からｐＭｅｔＬｕｃ−レポーターベクターとして市販されている。このようなレポーター遺伝子を用いた本発明の典型的な発現ベクターの模式図を図５（Ａ）に示す。ＴＡＴＡ配列の上流には、１又は複数のＮｒｆ２結合部位を連結することができ、その個数は好ましくは２〜１０個、最も好ましくは３〜６個である。プロモーター配列とルシフェラーゼ遺伝子の間に挿入したＳＰはシグナルペプチドを示す。

[形質転換細胞]
本発明の発現ベクターは、宿主細胞を形質転換することができ、得られた形質転換細胞を培養することによって本発明の発現ベクターによってコードされるレポーター遺伝子産物を検出することができる。ここで、宿主としては、ＫＥＡＰ１遺伝子に変異を有するか、又はＫｅａｐ１タンパク質の発現量が低下しているか、又はＮｒｆ２タンパク質が活性化されているヒト細胞であれば特に限定されるものではないが、例えば、以下の実施例において具体的に説明した肺癌患者由来の細胞又は肺癌由来の細胞株を用いることができる。具体的には、Ｈ１４３７、Ａ５４９、ＩＩ−１８、Ｈ２１２６、ＥＢＣ１、ＬＫ２等の細胞株である。

本発明の発現ベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等がある。得られた形質転換細胞を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地が用いられる。培養は、通常５％ＣＯ_２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。また、血清の共存が望ましくない場合には目的に応じた無血清培地を使用してもよい。

[抗癌剤を含む医薬組成物]
本発明のスクリーニング方法により選択することのできる抗癌剤は、Ｎｒｆ２が活性化されることによって他の化学療法剤に対する抵抗性が増大した癌細胞、特に肺癌細胞の増殖を抑制するための治療及び／又は予防剤の候補物質として有用である。このような抗癌剤は、それ単独で、あるいは、薬剤学的又は獣医学的に許容される通常の担体又は希釈剤と共に、そのような治療の必要な被験者、例えば、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。

本発明の医薬組成物を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等の何れのものであってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の医薬組成物を非経口投与する場合は、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐剤等の製剤形態を選択することができ、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。

これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等を適宜選択し、常法により製造することができる。

以下に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

［組織サンプル及び細胞株］
肺癌細胞株ＳＱ−１９、Ｈ２１２６、Ｈ１４３７、Ｈ１３９５及びＡ５４９はアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から、ＩＩ−１８は理研バイオリソースセンター（ＢＲＣ）から、及びＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳはＪＣＲＢ細胞バンクから入手した。すべての細胞株は、１０％牛血清、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）又はＦ−１２栄養混合物を含む２０％ＦＢＳと共にダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦｓ）は胎生期１３．５日の個体胚から調製した。頭部及び内部器官を除去し、胴体を刻み０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡに分散した。ＭＥＦｓは１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で維持した。

［ＫＥＡＰ１の塩基配列決定］
肺癌患者のＫＥＡＰ１遺伝子における体細胞変異を調べるために、当該遺伝子のタンパク質コード領域及びエキソン−イントロン境界領域のシークエンスを行った。２９人の腺癌(adenocarcinoma)、２６人の扁平上皮癌(squamous cell carcinoma)、８人の小細胞癌、及び2人の大細胞癌を含む６５人の原発性肺癌組織と、複数の肺癌由来細胞株からＤＮＡを抽出し、正確性の高いＤＮＡポリメラーゼＫＯＤプラス（東洋紡）を用いて連結反応介在ＰＣＲによってＤＮＡを増幅した。塩基配列の決定に用いたプライマーセットは以下のとおりである。

エキソン２正方向プライマー：5’-TGCAAATGGATTCTGCTTCACCTACTTTGCAGGAA-3’（配列番号２）、エキソン２逆方向プライマー：5’-TGAGCCCAGAACCTCCTTTTTCTCCAGTTTC-3’（配列番号３）；
エキソン３正方向プライマー：5’-TATTTGAATCCCCATTTAGCAGATAAGGAAGCTGA-3’ （配列番号４）、エキソン３逆方向プライマー：5’-TAGAACTCTCCAAGGAGCTTAGCTTCATCCTGAG-3’ （配列番号５）；
エキソン４正方向プライマー：5’-ATGAGCCATCGCGCCGGATGAACCTGTCTCTTTAA-3’ （配列番号６）、エキソン４逆方向プライマー：5’-CTCTATCAGAATCCAGGGCTTCTGTGGTTA-3’ （配列番号７）；
エキソン５正方向プライマー：5’-TTCTGAGGGTGAGAAGGGAGAGGAGAGAGGAAA-3’ （配列番号８）、エキソン５逆方向プライマー：5’-AGCTGGGCAACAGAGCGAGACCTTGTTTCTAA-3’ （配列番号９）；
エキソン６正方向プライマー：5’-TGCCTCAGCCCTGCAAAGTGCTAGGATTATAGG-3’ （配列番号１０）、エキソン６逆方向プライマー：5’-CTTTGGACTTCTTTTGAGATGTCATTTTAACACTG-3’ （配列番号１１）

その結果、アミノ酸置換を伴う５つの体細胞変異を同定した（表１及び図１参照）。図１（Ａ）に示したＫＥＡＰ１遺伝子において、数字はコードするアミノ酸の位置を、星印は肺癌患者のＫＥＡＰ１遺伝子で同定された位置を示す。図１（Ｂ）は、肺癌組織及び細胞株のＩＶＲ及びＤＧＲドメインにおけるＫＥＡＰ１変異体の塩基配列を示す。Ｎは正常組織のＫＥＡＰ１配列であり、Ｔは腫瘍組織又は細胞のＫＥＡＰ１配列である。図１（Ｃ）は、ヒト（Ｈ）、マウス（Ｍ）及びラット（Ｒ）のＩＶＲ及びＤＧＲドメインにおける変異の位置を示す。配列の上部に赤字で示した文字が肺癌のＫＥＡＰ１で同定された変異である。これらの結果は、日本人の肺癌患者の約８％（５／６５）がＫｅａｐ１タンパク質に変異を有することを意味する。この結果から得られたすべての変異はＫｅａｐ１タンパク質のＩＶＲドメインとＤＧＲドメインに局在した。ＩＶＲドメインはＮｒｆ２のユビキチン化に関与し、ＤＧＲドメインはＮｒｆ２と相互作用することが知られている。

［ＫＥＡＰ１遺伝子の変異とＮｒｆ２活性化］
これらのＫＥＡＰ１変異が、Ｋｅａｐ１のＮｒｆ２に対する抑制活性にどのような影響を与えているかを調べるために、レポーター共形質転換−トランス活性化解析を行った。
３コピーのＮｒｆ２結合因子を含むルシフェラーゼレポータープラスミドｐＲＢＧ２と、Ｎｒｆ２の発現プラスミドと、野生型及び各変異を有するＫｅａｐ１発現プラスミドとをＮＩＨ３Ｔ３細胞に共形質転換した。その結果を図２に示す。野性型又はＨ２００Ｐ変異を有するＫｅａｐ１を同時に形質転換した場合はルシフェラーゼ活性が有意に抑制された（図２Ａ、レーン３及び４）。一方、Ｒ２７２Ｃ、Ｒ４１５Ｇ又はＧ４３０Ｃ変異を有するＫｅａｐ１との共形質転換（図２Ａ、レーン５〜７）は、ルシフェラーゼ活性に影響を与えなかった。このことは、後者の３つの変異はＫｅａｐ１のＮｒｆ２抑制活性に何らかの影響を与えることを意味する。Ｒ４１５ＧとＧ４３０Ｃの２つの変異によるＮｒｆ２抑制活性の欠失は、これらのＫｅａｐ１変異体のＮｒｆ２結合能の欠失と相関していた。肺癌患者におけるＲ４１５ＧとＧ４３０Ｃとの変異はヘテロ接合性である（表１参照）ことから、このＫｅａｐ１変異が野生型Ｋｅａｐ１活性に影響を与えるかどうか調べた。上記と同様の実験において、野生型Ｋｅａｐ１及び段階的な量のＲ４１５Ｇ又はＧ４３０Ｃ変異体Ｋｅａｐ１で共形質転換した後に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるｐＲＢＧＰ２レポーター活性を調べた。その結果を図２Ｂに示す。野性型Ｋｅａｐ１の抑制活性は、Ｒ４１５Ｇ又はＧ４３０Ｃ変異体の増加と共に低下した（図２Ｂ、レーン３〜５及び６〜８参照）。このことは、これらの変異体は野生型Ｋｅａｐ１をドミナントネガティブな様式で抑制することを示す。したがって、ＫＥＡＰ１遺伝子のヘテロ接合性変異においても、そのドミナントネガティブな機能によってＮｒｆ２を活性化しうることが分かった。

Ｒ４１５Ｇ又はＧ４３０Ｃ変異体とは異なり、Ｒ２７２Ｃ変異体Ｋｅａｐ１はＮｒｆ２への結合能を維持しているが、Ｎｒｆ２活性の抑制機能を欠失している（図２Ａ参照）。この理由を解明するために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞にＮｒｆ２と、野生型又はＲ２７２Ｃ変異体Ｋｅａｐ１とを共発現させてＮｒｆ２タンパク質の安定性を調べた。その結果、野生型Ｋｅａｐ１を発現させた細胞中でのＮｒｆ２量が極めて低いのに対し、Ｒ２７２Ｃ変異体を共形質転換した細胞内におけるＮｒｆ２量は増加していた。Ｋｅａｐ１タンパク質のＩＶＲドメインはＮｒｆ２のユビキチン化を介する分解に関与していることから、Ｒ２７２Ｃ変異体は確かにＮｒｆ２の分解を阻害することが分かった。

［肺癌細胞におけるＫＥＡＰ１遺伝子の発現低下と薬剤耐性能の獲得］
次に、腺癌患者からの原発性肺癌組織と正常組織におけるＫＥＡＰ１遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲにより解析した。細胞から全ＲＮＡをトリゾル試薬(Trizol reagent、インビトロジェン)を用いて単離した。５μｇの全ＲＮＡからスーパースクリプトファーストストランドシステム（インビトロジェン）によりファーストストランドｃＤＮＡを合成した。続いて、以下のプライマーセットを用いてＡＢＩ７０００によりリアルタイムＰＣＲを行った。

ＫＥＡＰ１正方向プライマー：5’-TACGATGTGGAAACAGAGACGTGGACTTTCGTA-3’ （配列番号１２）、ＫＥＡＰ１逆方向プライマー：5’-TCAACAGGTACAGTTCTGGTCAATCTGCTT-3’ （配列番号１３）；
ＮＱＯ１正方向プライマー：5’-AGGAAGAGCTAATAAATCTCTTCTTTGCTG-3’ （配列番号１４）、ＮＱＯ１逆方向プライマー：5’-TCATATTGCAGATGTACGGTGTGGATTTAT-3’ （配列番号１５）；
ＭＲＰ３正方向プライマー：5’-GACCATCGCACACCGGCTTAACACTATCATGGA-3’ （配列番号１６）、ＭＲＰ３逆方向プライマー：5’-TCAGTACTCCCATTTTTAATGGATTCAGGCAGCA-3’ （配列番号１７）；
ＰＲＤＸ１正方向プライマー：5’-AAGTGATTGGTGCTTCTGTGGATTCTCACT-3’ （配列番号１８）、ＰＲＤＸ１逆方向プライマー：5’-TCACTTCTGCTTGGAGAAATATTCTTTGCTC-3’ （配列番号１９）

その結果を図３に示す。図３Ａは、５人の日本人肺腺癌患者から採取した正常肺組織と肺癌組織におけるＫＥＡＰ１の発現を示す。それぞれの正常組織における発現量を１．０とした。肺癌組織の中の１つ（Ｐ＃４）はＫｅａｐ１の発現が低下していた。図３Ｂは、６つの肺癌細胞株のＫＥＡＰ１遺伝子の発現を示す。レーン１はＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳ株、レーン２はＩＩ−１８株、レーン３はＳＱ−１９株、レーン４はＡ５４９株、レーン５はＨ１４３７株、及びレーン６はＨ１３９５株である。６種類の肺癌細胞株の中で、２つの肺腺癌細胞株、Ｈ１４３７及びＩＩ−１８においてＫＥＡＰ１遺伝子の発現が低下していた（レーン２及び５）。これらの結果は、ＫＥＡＰ１遺伝子の発現低下が肺癌において頻繁に起こっていることを示唆する。

次に、Ｋｅａｐ１の低発現細胞内におけるＮｒｆ２の局在性を調べるために、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて内在性Ｎｒｆ２を染色した。図３Ｃは、ＫＥＡＰ１の低発現又は変異を有する肺癌細胞におけるＮｒｆ２の核局在性を示す。ＳＱ−１９（正常ＫＥＡＰ１）、ＩＩ−１８（ＫＥＡＰ１低発現）、Ｈ１４３７（ＫＥＡＰ１低発現）又はＡ５４９（ＫＥＡＰ１のG３３３C変異）の各細胞内のＮｒｆ２を抗−Ｎｒｆ２抗体にて染色した。内在性Ｎｒｆ２は、Ｈ１３４７及びＩＩ−１８細胞内では核に局在し、Ｋｅａｐ１変異を有するＡ５４９細胞（Ｇ３３３Ｃ変異）においても核に局在していたが、正常なＫｅａｐ１を有するＳＱ−１９細胞では局在が認められなかった。この結果とよく一致して、Ｈ１３４７、ＩＩ−１８２、及びＡ５４９細胞内においてＮＱＯ１及びＭＲＰ３の２つの遺伝子の高発現がリアルタイムＰＣＲ解析により検出されたが、ＳＱ−１９細胞内では発現していなかった（データ示さず）。Ｎｑｏ１及びＭｒｐ３の発現量は、野生型Ｋｅａｐ１遺伝子をＩＩ−１８、及びＡ５４９細胞へ形質転換することによって低下した。これらの結果は、これらの細胞内におけるＫｅａｐ１活性の欠失がＮｒｆ２の核内蓄積を促進し、細胞保護酵素／タンパク質の発現増加に寄与することが分かった。

Ｎｒｆ２は解毒酵素や多剤耐性ポンプを誘導することから、Ｋｅａｐ１の低発現細胞株が化学療法剤に対する耐性を有することが予想された。そこで、これらの細胞株のシスプラチンに対する感受性を調べた。図３Ｄは、ＳＱ−１９、ＩＩ−１８、Ｈ１４３７及びＡ５４９の各細胞を、それぞれ０、３、６及び１２μＭのシスプラチンで処理した後１０日間培養後に生存細胞数を計測したものである。その結果、Ｋｅａｐ１の低発現細胞株（Ｈ１４３７及びＩＩ−１８）とＫｅａｐ１変異細胞株（Ａ４５９）は、正常なＫｅａｐ１を有するＳＱ−１９よりも強いシスプラチン抵抗性を示すことが分かった。このことは、Ｎｒｆ２の構成的な活性化は化学療法剤に対する抵抗性を誘発することが示された。

［Ｎｒｆ２の活性化と肺癌細胞の増殖］
上記結果より、癌細胞における構成的なＮｒｆ２の活性化が癌細胞の増殖を選択的に有利にしているかもしれないという可能性が示唆された。そこで、ＫＥＡＰ１遺伝子に変異を有するか又はその発現量が低下した癌細胞の増殖に対するＮｒｆ２発現ノックダウンの影響を調べるために、低分子干渉ＲＮＡを用いた解析を行った。２０ｎＭのコントロールｓｉＲＮＡ（キアゲン）とＮｒｆ２特異的ｓｉＲＮＡ（ＳＩ０３２４６９５０；キアゲン）を用いてＳＱ−１９細胞（正常Ｋｅａｐ１）、ＩＩ−１８細胞（Ｋｅａｐ１低発現）及びＡ５４９細胞（Ｋｅａｐ１変異）にトランスフェクションを行い、３日後に逆転写ＰＣＲと７日後に細胞数を計測した。その結果を図４に示す。図４Ａは、コントロールｓｉＲＮＡ（レーン１、３及び５）と、Ｎｒｆ２特異的ｓｉＲＮＡ（レーン２、４及び６）とをトランスフェクトして３日後にＮＲＦ２、ＮＱＯ１及びＭＲＰ３遺伝子の発現レベルを逆転写ＰＣＲで解析した結果である。同じ条件でコントロールｓｉＲＮＡ（レーン１、３及び５）と、Ｎｒｆ２特異的ｓｉＲＮＡトランスフェクトして７日後に増殖した細胞数を測定した結果を図４Ｂに示す。Ｎｒｆ２の発現をノックダウンすることによって、ＩＩ−１８細胞及びＡ５４９細胞の増殖が抑制されたが（図４Ｂ、レーン３〜６参照）、ＳＱ−１９細胞の増殖は抑制されなかった（図４Ｂ、レーン１、２）。

［Ｎｒｆ２活性化阻害剤のスクリーニングシステムの構築］
（1）発現ベクターの作成方法：
以下のＴＲＥ３配列及びＴＲＥ６配列をｐＭｅｔＬｕｃ−レポーターベクター（クロンテック社）の制限酵素ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ領域に挿入し、各々ＴＲＥ３−ｐＭｅｔＬｕｃ、及びＴＲＥ６−ｐＭｅｔＬｕｃと命名した（図５Ａ参照）。
TRE3配列：5’-agatctcgacaggtaccgagctcttacgcgtgctagctcgacccgaaaggagctgactcatgctagccctcgacccgaaaggagctgactcatgctagccctcgacccgaaaggagctgactcatgctagccctcgagatcttgggcataaaaggcagagcactgcagctgctgcttaagcttggatcc-3’ （配列番号２０）
TRE6配列：5’-agatctcgacaggtaccgagctcttacgcgtgctagctcgacccgaaaggagctgactcatgctagccctcgacccgaaaggagctgactcatgctagccctcgacccgaaaggagctgactcatgctagcctcgacaggtaccgagctcttacgcgtgctagctcgacccgaaaggagctgactcatgctagccctcgacccgaaaggagctgactcatgctagccctcgacccgaaaggagctgactcatgctagccctcgagatcttgggcataaaaggcagagcactgcagctgctgcttaagcttggatcc-3’ （配列番号２１）

（2）発現ベクターの細胞への形質転換方法：
ＴＲＥ３−ｐＭｅｔＬｕｃ及びＴＲＥ６−ｐＭｅｔＬｕｃを制限酵素ＤｒａＩＩＩで切断して直鎖状ＤＮＡとしたものを、それぞれ肺癌由来細胞Ｈ１４３７及びＡ５４９細胞にリポフェクトアミン試薬（インビトロジェン社）を用いて導入した。Ｈ１４３７細胞およびＡ５４９細胞は４００μｇ／ｍｌあるいは４５０μｇ／ｍｌのＧ１４８（カルビオケム社）で選択し、形質転換細胞を得た。

（３−１）ルシフェラーゼの検出方法１：
１×１０^４個の形質転換細胞を０．５ｍｌの培養液で培養し４８時間後に培地を回収した。回収された培養液５０μｌをレポーター解析試薬（クロンテック社）と混合し、ルミノメーター（ベルトールド社）により測定した。その結果を図５（Ｂ）に示す。レーン１及びレーン４は形質転換前の細胞を用いたコントロールである。ＴＲＥ３−ｐＭｅｔＬｕｃ及びＴＲＥ６−ｐＭｅｔＬｕｃの何れを形質転換した細胞も培養液中にルシフェラーゼを分泌することが分かった。

（３−２）ルシフェラーゼの検出方法２：
コントロールｓｉＲＮＡ（キアゲン）あるいはＮＲＦ２ｓｉＲＮＡ（キアゲン）をエレクトロポレーション（デジタルバイオ）で導入した１×１０^４個の形質転換細胞を０．５ｍｌの培養液で培養した。４８時間後に培養液を交換し、１２時間後に培地を回収した。回収された培養液５０μｌをレポーター解析試薬と混合し、ＩＶＩＳイメージングシステム（ジェノジェン社）により測定した。その結果を図５（Ｃ）に示す。ＮＲＦ２ｓｉＲＮＡによって特異的にＮｒｆ２の発現が抑制された細胞は培養液中に分泌するルシフェラーゼの量が減少し、マイクロタイタープレートを用いて容易に検出できることが分かった。

肺癌におけるＫｅａｐ１の構造変化を示した模式図である。 Ｋｅａｐ１変異体のＮｒｆ２抑制活性を調べた結果である。 Ｋｅａｐ１の発現量の低下と癌細胞の薬剤耐性能との関係を調べた結果である。 活性化されたＮｒｆ２が肺癌細胞の増殖を促進することを示す結果である。 本発明の１つの実施形態にかかる発現ベクターの構造及びそのレポーター活性を示す。

Claims (8)

1. 転写因子Ｎｒｆ２によって制御されるプロモーター配列と、当該配列と機能的に連結されたレポーター遺伝子とを含む発現ベクターを用意し、
   前記発現ベクターを、ＫＥＡＰ１遺伝子に変異を有するか、Ｋｅａｐ１タンパク質の発現量が低下しているか、又はＮｒｆ２タンパク質が活性化されているヒト細胞に形質移入し、
   候補化合物の存在下又は非存在下において前記形質移入細胞を培養して前記レポーター遺伝子の発現量を測定し、そして
   前記レポーター遺伝子の発現を阻害する候補化合物をヒト肺癌の推定増殖阻害剤として選択することを含む抗癌剤のスクリーニング方法。
2. 前記ＫＥＡＰ１遺伝子の変異が、Ｋｅａｐ１タンパク質のＩＶＲドメイン又はＤＧＲドメインに存在し、かつ変異体Ｋｅａｐ１タンパク質のＮｒｆ２活性抑制機能が低下するような変異である請求項１に記載の方法。
3. １又は複数のＮｒｆ２結合部位を含むプロモーター配列の下流に、分泌型レポーター遺伝子を連結してなる発現ベクター。
4. 前記Ｎｒｆ２結合部位が、配列番号１に記載の塩基配列からなる請求項３に記載の発現ベクター。
5. 前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子である請求項３又は４に記載の発現ベクター。
6. 請求項３〜５何れか記載の発現ベクターを、ＫＥＡＰ１遺伝子に変異を有するか、又はＫｅａｐ１タンパク質の発現量が低下することによりＮｒｆ２タンパク質が活性化されているヒト細胞に形質移入してなる形質転換ヒト細胞。
7. 候補化合物の存在下又は非存在下において請求項６に記載の形質転換ヒト細胞をインキュベートし、
   前記それぞれの条件において培養液中に分泌されたレポーター遺伝子産物量を測定し、そして
   前記候補化合物の非存在下に比べて、存在下におけるレポーター遺伝子産物量が減少する場合に前記候補化合物がヒト肺ガンの増殖阻害剤であると推定すること、
   を含む抗癌剤のスクリーニング方法。
8. ヒト腫瘍組織より調製された切片を、Ｎｒｆ２抗体、Ｋｅａｐ１抗体、Ｎｑｏ１抗体、Ｍｒｐ２抗体、及び／又はＭｒｐ３抗体を用いて組織染色し、
   前記抗体と結合するそれぞれのタンパク質の細胞内局在性を検定し、そして
   Ｎｒｆ２タンパク質が細胞核内に蓄積するか、Ｋｅａｐ１タンパク質が細胞質で減少するか、又はＫｅａｐ１、Ｎｑｏ１、Ｍｒｐ２、及びＭｒｐ３から選択される１つ以上のタンパク質が細胞質若しくは細胞膜に局在するとき、前記腫瘍が抗癌剤に対して抵抗性を有することを示唆することを特徴とする癌細胞を特徴付ける方法。

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