JP2007505640A - 排出可能なレポーターシステム - Google Patents

Abstract

本発明は、レポーターシステムであって、インビトロまたはインビボのいずれかで生産または発現される細胞から分泌可能であり、かつこのようなシステムを含む全ての動物からの体液に排出可能なレポータータンパク質をコードするレポーター遺伝子を含むレポーターシステムを提供する。このレポーターシステムは、代謝状態の変化もしくは病気の状態または毒物学的スクリーニングにおける毒物学的ストレスの結果に関連する、またはその結果として生じる遺伝子活性化事象または生化学的変化の検出に有効である。

Description

本発明は、レポーターシステムであって、インビトロまたはインビボのいずれにおいて、生産または発現される細胞から分泌可能であり、かつこのようなシステムを含む全ての動物から排出可能なレポータータンパク質をコードするレポーター遺伝子を含むシステムに関する。このレポーターシステムは、改変された代謝状態、病気の状態または、特に毒物学的スクリーニングにおいて（これに限定されないが）用いるための、毒物学的ストレスに関連する、またはその結果として生じる遺伝子活性化事象または生化学的変化を検出するためのものである。本発明は、このようなシステムを作製する方法およびその使用をさらに提供する。

遺伝子はタンパク質をコードしている。脊椎動物のゲノムにおいては少なくとも３×１０⁴の遺伝子が存在すると推定されているが、所定の細胞については、遺伝子の全数の一部だけが活性化しており、その一部は発生および分化の異なるタイプおよび異なる段階の細胞間で異なっている（Ｃｈｏ ＆ Ｃａｍｐｂｅｌｌ Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６ ４０９−４１５（２０００）；Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６ ４２３−４２５（２０００））。それぞれの遺伝子に関連するＤＮＡ調節因子は、どの遺伝子が活性化しており、どの遺伝子がそうでないかについての決定を支配する。これらのＤＮＡ配列は、多数の定義された因子を含んでいるが、集合的にプロモーターと称される（Ｔｊｉａｎ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｃｅｌｌ ７７ ５−８（１９９４）；Ｂｏｎｉｆｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６ ３１０−３１５（２０００）；Ｍａｒｔｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １７ ４４４−４４８（２００１））。

遺伝子の活性化は主として転写レベルで生じる。ＲＮＡポリメラーセ活性、ｍＲＮＡの存在量またはタンパク質の生産を含む種々のアプローチによって、遺伝子の転写活性を測定できるかもしれない（Ｔａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００２）。これらのアプローチには、個々のｍＲＮＡまたはタンパク質産物のそれぞれに適するアッセイを開発する必要があるという制限がある。異なるプロモーター間の比較を容易にするためには、個々の遺伝子産物をアッセイするよりも、むしろレポーター遺伝子を頻繁に用いる（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８ １５７２−１５７９（２００１）；Ｆｒａｎｃｏ ｅｔ ａｌ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．３９ １６９−１９１（２００１）；Ｈａｄｊａｎｔｏｎａｋｉｓ ＆ Ｎａｇｙ，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１５ ４９−５８（２００１）；Ｇｏｒｍａｎ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２ １０４４−１０５１（１９８２）；Ｂａｒａｓｈ ａｎｄ Ｒｅｉｃｈｅｎｓｔｅｉｎ，２００２；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１）。

レポーター遺伝子の産物（ｍＲＮＡまたはタンパク質）によって、特定の遺伝子の転写活性をアッセイすることが可能となり、遺伝子活性化事象が起こった細胞、組織または器官を、遺伝子活性化事象が起こっていないものから識別するために、レポーター遺伝子の産物を用いることができる。全体的に見れば、レポーター遺伝子は宿主細胞または宿主生物にとっては異質のものであり、これらの活性を内因性遺伝子の活性から容易に識別することができる。あるいは、宿主遺伝子から識別するために、レポーターに印やタグを付けてもよい。

レポーター遺伝子は試験用プロモーターに結合され、レポーター遺伝子の産物の存在を検出することによって、プロモーター遺伝子の活性を測定することができる。従って、レポーター遺伝子の産物についての主な必要条件は、検出および定量が容易ということである。場合によっては、全てではないが、レポーター遺伝子は、基質を測定可能な産物に変換することを触媒する酵素活性を有する。

古典的な例は、細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子である。添加された非アセチル化クロラムフェニコールの、クロラムフェニコールアセチル化体への変換として、クロマトグラフィーによって細胞抽出物においてＣＡＴ活性を測定することができる（Ｇｏｒｍａｎ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２ １０４４−１０５１（１９８２））。酵素レポーターのさらなる例としては、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、チミジンキナーゼ、ネオマイシン耐性および成長ホルモンが挙げられる。同様の計画によって、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとして用いることが可能となる。しかしながら、この例において測定されるものは、ルシフェリン基質の生物発光によって生産される光である。

いくつかのレポーターは、レポーター活性のインサイチュ分析を可能とする、視覚による検出アッセイが役立つ。高い頻度で用いられる例は、β−ガラクトシダーゼ（Ｌａｃ Ｚ）であった。ここで、人工基質のＸ−ｇａｌを添加することで、サンプル中に青色が現れることによりレポーター活性を検出することが可能となった。青色は蓄積されるので、その誘導の事実上の歴史的記録が提供される。このことは、プロモーターが素早く不活性化される前のわずかな時間の間にプロモーターが活性化される場合における一時的な応答の測定に特に有効である。培養細胞およびインビボ（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０９ ２６１９−２６２５（１９９６））の両方において、このレポーターを上手に用いてきたが、いくつかの報告においては、インビボで用いるためのその適切性が疑われていた（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ−Ｍａｒｉｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．４ Ｒ５３（２００３）；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｎｏｓ ｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．９ ６５７−６６７（２０００）；Ｍｏｎｔｏｌｉｕ ｅｔ ａｌ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．９ ２３７−２３９（２０００）；Ｃｏｈｅｎ−Ｔａｎｎｏｕｄｊｉ ｅｔ ａｌ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．９ ２３３−２３５（２０００））。蛍光性基質と組み合わせたＬａｃ Ｚによって、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）を用いてレポーターを発現する細胞を分類できることが実証された（Ｆｉｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １２ ２９１−３０１（１９９１））。

その他のシステムにおいては、基質の必要性を取り除くことで、レポーター産物そのものを直接検出する。緑色蛍光タンパク質は、レポーターのこのカテゴリーの最も広く用いられた例の一つとなった（Ｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４４ １−２０（１９９７））。この自己蛍光性タンパク質は、発光クラゲのＡｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａに由来するものであった。このレポーターのカラースペクトルの変形型がいくつか開発された（Ｈａｄｊａｎｔｏｎａｋｉｓ ａｎｄ Ｎａｇｙ，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１５ ４９−５８（２００１））。

最近、エネルギー放射システムに基づく細菌のレポーターシステムが開発された。これらには、単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）およびポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）が含まれるが、これらには、続いて標的のレポーター遺伝子によって修飾されることになる、放射標識したアイソトーププローブを宿主細胞内にまたは動物内に導入する必要がある。例えば、ＰＥＴシステムは、ポジトロン放出プローブを捕捉するレポーターを測定する（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８ １５７２−１５７９（２００１））。

十分に試験された多数のレポーターシステムが開発されてきたが、それでもなお、これらは特定の制限を共有している。多くの場合、原核生物の遺伝子に基づくものは、トランスジェニック哺乳動物における発現が乏しい（Ｍｏｎｔｏｌｉｕ ｅｔ ａｌ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．９ ２３７−２３８（２０００）；Ｃｏｈｅｎ−Ｔａｎｎｏｕｄｊｉ ｅｔ ａｌ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．９ ２３３−２３５（２０００））。さらに、原核生物のＤＮＡ配列が存在することは、イントロンがないｃＤＮＡに基づく真核生物の遺伝子配列が存在するときのように、隣接する真核生物の導入遺伝子からの発現が抑制されることに関係していた（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。

最新のレポーターのほとんどは、特定の環境下の発現をモニタリングすることには有効ではあるが、特有の制限を有する。多くのものが細胞中に蓄積し、多くのものが、長期に亘るプロモーターの活性化の変化をモニタリングすることに有効ではない。恐らくより重要なことは、発現を検出するためには、培養細胞を固定すること、またはトランスジェニック動物を犠牲にすることが必要であろうことであり、従って、レポーターは侵襲的な検出計画に制限される。少数の例外はある；これらには、成長ホルモンを使用すること（Ｂｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８ ５３９−５４６（１９９１））が含まれる。しかしながら、その高い生物活性のために、その広範囲の適用性が事実上制限される。全ての動物においてＧＦＰが検出されているが、比較的弱い生物活性を有しているので、現在のところ、その利用は、体内の組織および皮膚の両方の蛍光がより容易に観察できる生まれたばかりのヌードマウスに制限されている。さらに、ＧＦＰは細胞毒性を有するという報告がある（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２６０ ７１２−７１７（１９９９））。断層撮影に基づくレポーターシステムによって、体内の組織におけるレポーターの発現をモニタリングすることが可能となるが、これには、レポーターの発現に影響を与えることによって結果が混乱する可能性がある追加の基質を、外因的に添加する必要がある。さらに、これらには、レポーターの発現を定量的に分析するために求められる感度を欠く可能性がある。

従って、これらの制限のいくらかまたは全てを克服するレポーターシステムが必要である。第一の例においては、レポーターは（その中で発現または生産される細胞から）分泌されるべきであり、好ましくは（全ての動物から）排出されるべきである。その結果、このシステムは有利な非侵襲性となる。というのは、その検出には外部の基質を添加する必要や、またはトランスジェニック動物を犠牲にする必要が無いからである。さらに、このシステムは試験発現系に関して生物学的に中立であるべきである。その結果、システムからの情報を混乱させたり、またはトランスジェニック動物の健康状態に影響を与えるような表現型の影響はない。

このような必要条件を満足させるシステムは、今や見出された。本発明の非侵襲性のレポーターは、遺伝子産物または代謝産物の生産または発現および排出が行われる細胞から体液に、比較的安定であり、かつネイティブな分子とは区別が付くように分泌されることを好むという特徴を有する。

本発明の説明
一般的なその態様においては、本発明は、毒性の障害／ストレス、原発性のもしくは誘導された病気の状態、および／または改変された代謝状態の結果として生じる生化学的変化を非侵襲的に測定することを可能とする生物学的レポーターシステムを提供する。

本発明の第一の態様によれば、生産または発現される細胞からタンパク質または産物として分泌可能であり、かつ全ての動物から排出可能なレポータータンパク質をコードするレポーター遺伝子を含む核酸配列を含む核酸構築物が提供される。

以下に続く本明細書および請求の範囲を通して、その文脈が別のことを要求しない限り、「含んでなる」という用語、「含んでいる」または「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）などの変形は、記載された成分（ｉｎｔｅｇｅｒ）または成分の集まりを包含し、その他の任意の成分または成分の集まりを除外しないことを意味すると理解される。

本明細書において、タンパク質または産物について言及することは、タンパク質の複合体もしくは断片；酵素；酵素産物もしくは複合体；一次、二次もしくはより高次の代謝産物および／またはそれらの塩；レポーター遺伝子の産物の発現に直接もしくは二次的に影響を与えることによって放出される非生物学的な産物；ホルモン；または抗体を包含することを目的とする。

本明細書を通して、本発明のレポーターシステムタンパク質を、分泌／排出されるタンパク質または産物と適宜言及される。この用語が、それが発現されるかまたは生産される細胞から最初に分泌され、次いでそこから測定されるかもしくはモニタリングされるかまたはアッセイされてもよい体液に排出されるレポータータンパク質または産物に関するということが、当業者によって理解される。好ましくは、分泌／排出されるタンパク質／産物は、修飾された遺伝子の転写の結果として生産されてもよい。

あるいは、分泌／排出されるレポータータンパク質／産物は、ｍＲＮＡの安定性の向上または代謝回転の低下の結果などのレポーターの翻訳の増加の結果として生産され、そして分泌／排出されてもよい。

なおさらなる選択肢として、レポータータンパク質／産物が、ポリユビキノン化の除去を介してのレポーターの安定性の向上などの翻訳後修飾の結果としてのものでもよく、またはレポータータンパク質／産物が、小分子の代謝産物の蓄積もしくは排出の結果としてのものでもよい。

驚くべきことに、アルカリホスファターゼの分泌型であるＳＥＡＰの活性を、インビトロおよびインビボの両方で誘導できること、ならびにトランスジェニック動物の血液および尿などの体液中に排出されることを本発明者らが見出した。従って、ＳＥＡＰは、分泌／排出される本発明のレポータータンパク質の一例である。しかしながら、本明細書の以降に記載された特徴と同様の特徴を有するその他のレポータータンパク質も、本発明に適することも自明であろう。

従って、本発明の一つの実施形態においては、核酸構築物は、その中で発現または生産される細胞からタンパク質または産物として分泌可能であり、かつ全ての動物から排出可能なＳＥＡＰレポータータンパク質をコードするレポーター遺伝子を含む核酸配列を含む。

本発明のさらなる実施形態においては、レポータータンパク質または産物は、エピトープタグまたは基質をアッセイによって容易に検出可能な形態に変換する酵素活性を有してもよいタグなどのペプチドタグを含んでもよい。本発明のこの実施形態は、単一の細胞または単一の動物において複数のレポーターシステムを有利に提供する。

ペプチドタグの位置は、レポーターのアミノ酸配列についてのアミノ末端もしくはカルボキシ末端にあってもよく、または内部に挿入されてもよいこと、およびそれと同起源の抗体によって認識されるエピトープタグのタグの例においては、レポータータンパク質におけるその位置に無関係であることが理解される。

エピトープタグは、完全に特徴付けされた同起源の抗体のある、タンパク質に由来する定義されたアミノ酸配列でもよい。当業者であれば、抗原性を有するものとして特定された配列に基づくエピトープを選択することができる。本発明の特定の実施形態においては、エピトープタグとして、ｃ−ｍｙｃがん遺伝子（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５ ３６１０−３６１６（１９８５））に由来する下記のアミノ酸配列：
−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−（配列番号１）
でもよく、または下記に示されるシミアンウイルスＶ５タンパク質（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２ １５５１−１５５７（１９９１））に由来するアミノ酸配列：
−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−（配列番号２）
でもよい。

本発明の特定の実施形態においては、エピトープをｃ−ｍｙｃタンパク質およびＶ５タンパク質から選択してもよいが、これには限定されない。

いくつかの例においては、ペプチドタグは、基質をアッセイによって容易に検出可能な形式に変換する酵素活性を有していてもよい。このタグは、リン酸基のドナーと共に分泌されるかまたは排出される検体に添加することができる別のタンパク質基質またはペプチドの基質のリン酸化を指定するキナーゼ活性を有していてもよい。タグが付けられたレポータータンパク質のリン酸化型に特異的に認識する抗体による検出に基づく免疫学的アッセイを用いて、検出を行うことができた。このようなアッセイとしては、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＲＩＡおよび蛍光偏光が挙げられる。あるいは、³²Ｐまたは³³Ｐなどのリンのアイソトープで放射標識したリン酸塩などの放出された標識産物を用いることであり、これらは、蛍光的手段、放射性手段または比色分析手段によって測定することができた。その他の酵素による修飾としては、例えばアセチル化、硫酸化およびグリコシル化などが挙げられる。

この態様の他の実施形態としては、例えば、レクチン結合部位などの抗体以外のタンパク質と相互作用する部位またはポリリジンなどのアミノ酸多量体を添加することなどによるタグの修飾；または蛍光色素の組み込みなどが挙げられ得る。

本発明のこの態様の種々の実施形態に従えば、レポーター遺伝子をプロモーターと結合してもよい。このプロモーターとしては、哺乳動物起源のものだけでなく、非哺乳動物、植物、酵母または細菌に由来するものも好ましいだろう。このプロモーターを、次の誘導性遺伝子のプロモーターエレメントから選択してもよいが、これらに限定されるものではない。

細胞におけるＤＮＡのホメオスタティックの状態の障害に対応して、その発現が修飾を受けるもの。これらの障害としては、核酸もしくはヌクレオチド前駆体の化学変換、ＤＮＡ合成の阻害およびＤＮＡ複製の阻害またはＤＮＡに対する損傷が挙げられ得る。この配列を、ｃ−ｍｙｃ（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１ ３４１４−３４２１）、ｐ２１／ＷＡＦ−１（Ｅｌ−Ｄｉｅｒｙ Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２７ １２１−１３７（１９９８）；Ｅｌ−Ｄｉｅｒｙ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．８ １０６６−１０７５（２００１）；Ｄｏｔｔｏ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４７１ ４３−５６（２０００））、ＭＤＭ２（Ａｌａｒｃｏｎ−Ｖａｒｇａｓ ａｎｄ Ｒｏｎａｉ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２３ ５４１−５４７（２００２）；Ｄｅｂ ａｎｄ Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ７ ２３５−２４３（２００２））、Ｇａｄｄ４５（Ｓｈｅｉｋｈ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５９ ４３−４５（２０００））、ＦａｓＬ（Ｗａｊａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６ １６３５−１６３６（２００２））、ＧＡＨＳＰ４０（Ｈａｍａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８４ ４０１−４０７（２００２））、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２／ＤＲ５（Ｗｕ ｅｔ ａｌ Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６５ １４３−１５１（２０００）；Ｅｌ−Ｄｉｅｒｙ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．８ １０６６−１０７５（２００１））、ＢＴＧ２／ＰＣ３（Ｔｉｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８７ １５５−１６５（２００１））からなる群より選択することができるが、これらに限定されるものではない；

酸化的ストレスまたは低酸素症に対応して、その転写が修飾を受けるもの。この配列を、ＭｎＳＯＤおよび／またはＣｕＺｎＳＯＤ（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｒｅｓ．３１ ２６１−２７２（１９９９）；Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ ａｎｄ Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９９ １３６−１４７（２０００））、Ｉ□Ｂ（Ｇｈｏｓｈ ａｎｄ Ｋａｒｉｎ Ｃｅｌｌ １０９ Ｓｕｐｐｌ．．，Ｓ８１−９６（２００２））、ＡＴＦ４（Ｈａｉ ａｎｄ Ｈａｒｔｍａｎ Ｇｅｎｅ ２７３ １−１１（２００１））、キサンチンオキシダーゼ（Ｐｒｉｓｔｏｓ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．１２９ １９５−２０８（２０００））、ＣＯＸ２（Ｈｉｎｚ ａｎｄ Ｂｒｕｎｅ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３００ ３７６−３７５（２００２））、ｉＮＯＳ（Ａｌｄｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５７ ５９３−６１５（２００１））、Ｅｔｓ−２（Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９ ６４４３−６４５４（２０００））、ＦａｓＬ／ＣＤ９５Ｌ（Ｗａｊａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６ １６３５−１６３６（２００２））、□ＧＣＳ（Ｌｕ Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｇｕｌ．３６ ９５−１１６（２０００）；Ｓｏｌｔａｎｉｎａｓｓａｂ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８２ １６３−１７０（２０００））、ＯＲＰ１５０（Ｏｚａｗａ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１ ４２０６−４２１３（２００１）；Ｏｚａｗａ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４ ６３９７−６４０４（１９９９））からなる群より選択することができるが、これらに制限されるものではない。

肝細胞毒性のストレスに対応して、その発現が修飾を受けるもの。この配列を、Ｌｒｇ−２１（Ｄｒｙｓｄａｌｅ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３ ９８９−９９８（１９９６））、ＳＯＣＳ−２および／またはＳＯＣＳ−３（Ｔｏｌｌｅｔ−Ｅｇｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４０ ３６９３−３７０４（１９９９）、ＰＡＩ−１（Ｆｉｎｋ ｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１ １０５−１１４（２００１））、ＧＢＰ２８／アジポネクチン（Ｙｏｄａ−Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８５ ３７２−３７７（２００１））、□−１酸性糖タンパク質（Ｋｏｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６２ １３９１−１３９７（２００１））、メタロチオネインＩ（Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３ ５２６６−５２７５（１９９３））、メタロチオネインＩＩ（Ｓｃｈｌａｇｅｒ ａｎｄ Ｈａｒｔ Ａｐｐ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０ ３９５−４０５（２０００））、ＡＴＦ３（Ｈａｉ ａｎｄ Ｈａｒｔｍａｎ Ｇｅｎｅ ２７３ １−１１（２００１））、ＩＧＦｂｐ−３（Ｐｏｐｏｖｉｃｉ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８６ ２６５３−２６３９（２００１））、ＶＤＧＦ（Ｉｄｏ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１ ３０１６−３０２１（２００１））およびＨＩＦ１α（Ｔａｃｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６３ １３９−１４８（２００２））からなる群より選択することができるが、これらに制限されるものではない。

プロアポトーシスの刺激に対応して、その発現が修飾を受けるもの。この配列を、Ｇａｄｄ ３４（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２ １３７３１−１３７３７（１９９７））、ＧＡＨＳＰ４０（Ｈａｍａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８４ ４０１−４０７（２００２））、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２／ＤＲ５（Ｗｕ ｅｔ ａｌ Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６５ １４３−１５１（２０００）；Ｅｌ−Ｄｉｅｒｙ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．８ １０６６−１０７５（２００１））、ｃ−ｆｏｓ（Ｔｅｎｇ Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１９７ １３７−２０２（２０００））、ＣＨＯＰ／Ｇａｄｄｌ５３（Ｔａｌｕｋｄｅｒ ｅｔ ａｌ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１ ４２８０−４３００（２００２））、ＡＰＡＦ−１（Ｃｅｃｃｏｎｉ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５ １６８８−１６９８（２００１））、Ｇａｄｄ４５（Ｓｈｅｉｋｈ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５９ ４３−４５（２０００（）、ＢＴＧ２／ＰＣ３（Ｔｉｒｏｎｅ Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８７ １５５−１６５（２００１））、Ｐｅｇ３／Ｐｗｌ（Ｒｅｌａｉｘ ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７ ２１０５−２１１０（２０００））、Ｓｉａｈ １ａ（Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ ＦＥＢＳＬｅｔｔ．５１２ ２２３−２２６（２００２））、Ｓ２９リボゾームタンパク質（Ｋｈａｎｎａ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７７ ４７６−４８６（２０００））、ＦａｓＬ／ＣＤ９５Ｌ（Ｗａｊａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６ １６３５−１６３６（２００２））、組織トラングルタミナーゼ（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｍｅｈｔａ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３１ ８１７−８３６（１９９９））、ＧＲＰ７８（Ｒａｏ ｅｔ ａｌ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５１４ １２２−１２８（２００２））、Ｎｕｒ７７／ＮＧＦＩ−Ｂ（Ｗｉｎｏｔｏ Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０５ ３４４−３４６（１９９４））、サイクロフィリンＤ（Ａｎｄｒｅｅｖａ ｅｔ ａｌ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．８０ ３０５−３１５（１９９９））、ｐ７３（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１８ ９０−９５（２００２））およびＢａｋ（Ｌｕｔｚ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２８ ５１−５６（２０００））からなる群より選択することができるが、これらに限定されるものではない。

化学物質もしくは薬剤またはその他の生体異物性薬剤の投与に対応して、その発現が修飾を受けるもの。異物を代謝する、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｓ、３Ａ、４Ａおよび４Ｂ遺伝子ファミリーからのシトクロムｐ４５０酵素からなるリストからこの配列を選択することができるが、これらに限定されるものではない（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ ２８ １１２９−１１６５（１９９８）；Ｈｏｎｋａｓｋｉ ａｎｄ Ｎｅｇｉｓｈｉ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１２ ３−９（１９９８）；Ｒａｕｃｙ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３０２ ４７５−４８２（２００２）；Ｑｕａｔｔｒｏｃｈｉ ａｎｄ Ｇｕｚｅｌｉａｎ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２９ ６１５−６２２（２００１））。

自然発生的な、模倣性のまたは誘導されたいずれかの病気の状態に対応して、その発現が修飾を受けるもの。肥満、免疫不全、神経変性疾患、癌、心臓病、炎症性疾患、遺伝病または代謝病からなるリストから、これらの病気を選択することができるが、これらに制限されるわけではない。

プロモーターエレメントは、近接する「野生型」配列を含んでいてもよく、または特定の刺激に対応した転写誘導性を与えることが知られている一つ以上の配列エレメントと機能するように結合した、真核生物の最小のコンセンサスプロモーターを含む合成プロモーター配列であってもよい。真核細胞の最小のコンセンサスプロモーターは、機能的プロモーターエレメント結合部位または転写調節因子結合部位を伴う場合にのみ、真核細胞のポリメラーセによる転写を導くことになるというものである。このものの一例としては、ＰｈＣＭＶ＊−１がある（Ｆｕｒｔｈ ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１ ９３０２−９３０６（１９９４））。特定の刺激に対応した転写誘導性を与えることが知られている配列エレメントとしては、プロモーターエレメント（Ｍｏｎｔｏｌｉｕ ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２ ４２４４−４２４８（１９９５））または転写調節因子結合部位が挙げられる；これらはアリール炭化水素（Ａｈ）／Ａｈ核輸送体（ＡＲＮＴ）受容体応答エレメント、抗酸化応答エレメント（ＡＲＥ）、異物反応エレメント（ＸＲＥ）を含むリストから選択されるだろうが、これらに限定されるものではない。

本発明のさらなる態様に従えば、タンパク質または産物としてそこで発現される細胞から分泌可能なレポータータンパク質であって、全ての動物から排出されるタンパク質をコードする核酸配列から、機能できるように単離されるストレス誘導性プロモーターを含む核酸構築物が提供される。ここで当該配列は、部位特異的リコンビナーゼによって認識される核酸配列に、または分泌／排出されるレポータータンパク質をコードする転写単位に関して逆向きとなるように挿入されることによって認識される核酸配列に挟まれている。このリコンビナーゼ認識部位は、アイソレーター配列が削除されるか、または逆向きのプロモーターの方向がリコンビナーゼの存在下でさらに逆転するやり方で配列している。この構築物は、部位特異的リコンビナーゼのコード配列をコードする遺伝子が機能するように結合した組織特異的プロモーターを含む核酸配列をも含む。この態様によって、特定の組織においてのみ、レポーター導入遺伝子が誘導されたことを検出することが可能になる。組織特異的プロモーターを利用してリコンビナーゼの適切な発現をコントロールすることによって、プロモーターが活性化している組織にのみ、誘導性導入遺伝子が生存できることになる。例えば、肝臓特異的プロモーターに由来するリコンビナーゼ活性を促進することによって、肝臓にのみ再配列されたレポーター構築物が含まれ、その結果、レポーターの誘導が生じ得る組織においてのみ存在することになる。

従って、リコンビナーゼが発現される組織において、活性的なレポーター転写単位を生産する組換え現象が生じてもよい。このようにして、リコンビナーゼが発現した結果、プロモーターに結合した誘導性プロモーターからなる機能的転写単位が生じるような特定の組織のタイプにおいてのみ、レポーターが発現してもよい。このような機能を有することが知られている部位特異的リコンビナーゼ系としては、バクテリオファージＰ１ ｃｒｅ−ｌｏｘ系および細菌のＦＬＩＰ系が挙げられる。従って、部位特異的リコンビナーゼ配列は、バクテリオファージＰ１の二つのｌｏｘＰ部位であってもよい。

哺乳動物の培養細胞において、部位特異的組換え系を用いて正確に規定された欠失を生じさせることは、実証されている。Ｇｕ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ ７３ １１５５−１１６４（１９９３））は、どのようにして、マウスＥＳ細胞における免疫グロブリンのスイッチ領域での欠失を、バクテリオファージＰ１の一つのｌｏｘＰ部位を切り離すＣｒｅ部位特異的リコンビナーゼを一時的に発現させることによって、ｌｏｘＰ部位の二つのコピーの間で生じさせたかについて記述している。同様に、マウス赤白血病細胞において、酵母ＦＬＰリコンビナーゼを用いて、リコンビナーゼ標的部位により選択マーカーを正確に欠失させた（Ｆｉｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０ ８４６９−８４７３（１９９３））。Ｃｒｅ ｌｏｘ系を以下に例示するが、その他の部位特異的リコンビナーゼ系を用いることもできた。

Ｃｒｅ ｌｏｘ系において用いられる構築物は、通常は次の三つの機能エレメントを有することになる。
１．発現カセット；
２．遍在的に発現するプロモーター（例えばホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｓｏｒｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６４ ６９３−７０２（１９９１））の制御下で発現されるネガティブ選択マーカー（例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子）；および
３．ＤＮＡ断片のいずれかの末端に位置する、バクテリオファージＰ１部位特異的組換え部位ｌｏｘＰ（Ｂａｕｂｏｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１ ２０２５−２０２９（１９９３））のコピーを二つ。

この構築物を、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質によって仲介される二つのｌｏｘＰ部位の間の部位特異的組換えを利用することによって、それを含む宿主細胞または細胞株から削除することができ、ここで、このタンパク質はリポフェクションによって細胞内に導入することができる（Ｂａｕｂｏｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１ ２０２５−２０２９（１９９３））。二つのｌｏｘＰ部位の間のＤＮＡが欠失している細胞を、適切な薬剤（ＴＫの場合はガンシクロビル）を含む培地で培養することによって、ＴＫ遺伝子（またはその他のネガティブ選択マーカー）が失われていることについて選択する。

本発明のさらなる態様に従えば、本発明の前記態様のいずれか一つに記載の核酸構築物の少なくとも一つによりトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。細胞のタイプは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物起源のものが好ましいが、その他の動物、植物、酵母または細菌起源のものを用いてもよい。

この宿主細胞を本発明による複数のレポーターシステムによりトランスフェクトしてもよいことが理解される。

本発明のなおさらなる態様に従えば、その非ヒト動物の細胞が、本発明の前記の態様のいずれか一つによる核酸構築物によってコードされるタンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト動物が提供される。このトランスジェニック動物はマウスが好ましいが、その他の哺乳動物種、例えばラットもしくはモルモットなどのその他のげっ歯類、またはウサギもしくはイヌもしくはネコなどの別の種、またはヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギ、ウシなどの有蹄類の種、または鳥類（ニワトリもしくはシチメンチョウなどの家禽類など）などの非哺乳動物の種であってもよい。

本発明の動物を改変して、本発明による二以上のレポーターシステムを含んでもよいことが理解される。

前記の核酸構築物の使用を含む、トランスフェクトされた宿主細胞またはトランスジェニック非ヒト動物を作製することに関する本発明の実施形態においては、細胞または非ヒト動物をさらなる遺伝子導入に付してもよい。ここで、この遺伝子導入とは、追加の単数もしくは複数の遺伝子またはタンパク質をコードする単数もしくは複数の核酸配列を導入することである。遺伝子導入は、細胞もしくは細胞株の一時的なもしくは安定的なトランスフェクト、細胞もしくは細胞株におけるエピソームの発現系、または胚幹性（ＥＳ）細胞における組換え現象を介するか、または核移植クローニング手段におけるその核をドナーの核として用いる細胞のトランスフェクトによる、前核のマイクロインジェクションによるトランスジェニック非ヒト動物の作製であってもよい。

トランスジェニック細胞もしくは細胞株またはトランスジェニック非ヒト動物を作製する方法、ここで、細胞もしくは細胞株の一時的なもしくは安定的なトランスフェクト、細胞もしくは細胞株におけるエピソーム発現系の発現、または前核のマイクロインジェクション、ウイルスベクターによる細胞もしくは細胞株の感染、ＥＳ細胞もしくはその他の細胞株における組換え現象、または異なる発生経路に分化してその核が核伝達のためのドナーとして使用される細胞株のトランスフェクトによるものを含む；ここで、核酸配列または構築物の追加的な発現を利用して、本発明の態様のいずれかによるトランスフェクトまたは遺伝子導入についてのスクリーニングを行う。例としては、細胞の成長培地に添加される、例えばＧ４１８に対する耐性を与えるネオマイシン耐性マーカーなどの抗生物質に対する耐性を与える選択マーカーを用いることが挙げられる。さらなる例としては、本発明の第一の、第二の、第三のまたは第四の態様による核酸配列とハイブリッド形成するかまたはその成分である相補的配列の核酸配列を用いて検出することが挙げられる。例としては、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析およびＰＣＲが挙げられ得る。

本発明の代替的な実施形態においては、宿主細胞またはトランスジェニック動物を改変して、読み取られた情報または区別可能な同時に読み取られた情報の選択ができるように、二以上の構築物を含んでもよい。

分泌／排出されるレポーター産物または代謝産物としては、トランスジェニック動物の体液中に排出される産物が好ましい。例えば、それが存在することによって、非侵襲性の有利な方法でその体液中で容易にアッセイおよび定量されるような尿、唾液、涙、乳汁、脳脊髄液および精液などの体液が挙げられるが、これに限定されることはない。あるいは、死後に血清、全血または組織を取り去った後に、または手段として、トランスジェニック動物を犠牲にしない場合における研究の間のいずれかで遺伝子活性化事象が検出できるように、遺伝子産物は、トランスジェニック動物の血清、全血または組織においてアッセイできるものでもよい。

本発明のレポーター産物もしくはタンパク質または分子をコードするレポーター遺伝子は、レポーター部分の尿の排出に有利に働く特徴を有するものが好ましい。

レポーター部分は比較的低い分子量であることが好ましく、典型的には１２０ｋＤａ未満の範囲であり、９０ｋＤａ未満の範囲がより好ましく、６０ｋＤａ未満の範囲がさらに好ましい。理想的には、レポーター部分は、親水性の球状三次構造を有し、対生物作用が小さく、尿または体液において安定的であり、天然の分子との区別が明瞭であり、容易に検出および定量可能なものが理想的である。

我々は、本発明にとってＳＥＡＰが適切な分泌／排出されるレポーター遺伝子であることを見出したが、上記の基準を満たすその他のレポーター部分も本発明の全ての態様において有用であることが理解される。

例えば、本発明に包含されるその他の分泌／排出される分子は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンまたはＦＳＨなどのホルモン分子；γ軽鎖およびλ軽鎖（Ｂｅｎｃｅ Ｊｏｎｅｓ）タンパク質などの抗体、ここで本発明のこの特定の実施形態においては、恐らく単鎖が排出され、次いでその結合がエクスビボでのみ検出可能なパートナー鎖でエクスビボにて組換えられる；ならびにネコの尿のカルボキシルエステラーゼなどの酵素分子からなる群より選択される。

本発明の構築物の一つとして、修飾されたβヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）分子を含むものが好ましい。さらには、ストラチフィン遺伝子のプロモーターも挙げられ得る。修飾することによって、ｍｙｃ−タグなどのタグが付いた形になってもよい。

本発明のなおさらなる態様によれば、インビトロまたはインビボでの細胞における改変された代謝状態の変化を生じさせる遺伝子活性化事象を検出するために、本発明の前記の態様のいずれか一つによる核酸構築物の使用が提供される。

この遺伝子活性化事象は、毒物学的ストレス、代謝状態の変化、ウイルス、細菌、真菌もしくは寄生虫の感染の結果であっても結果でなくてもよい病気による誘導の結果でもよい。

本発明のなおさらなる態様によれば、インビトロまたはインビボでの細胞における改変された代謝状態の変化を生じさせる遺伝子活性化事象を検出するために、分泌／排出されるタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸構築物であって、発現される当該タンパク質が細胞に対して異種である核酸構築物の使用が提供される。

この遺伝子活性化事象は、毒物学的ストレス、代謝状態の変化、ウイルス、細菌、真菌もしくは寄生虫の感染の結果であっても結果でなくてもよい病気による誘導の結果であってもよい。

本発明の種々の態様による使用を、標的細胞または組織のタイプの範囲内での遺伝子発現の特性の変化が病気の結果として改変される細胞、細胞株またはトランスジェニック非ヒト動物における、病気の状態の検出または疾患モデルの特徴にも拡大適用する。開示された方法で検出可能な疾患であって、本発明のこの態様との関連での疾患を、感染症、癌、炎症性疾患、心疾患、代謝病、神経疾患および遺伝子に基づく疾患と定義してもよい。

本発明のこの態様によるさらなる使用には、ヌードマウスなどの免疫力がない適切なマウス系統においてトランスフェクトされた細胞株の増殖（異種移植と称される）が挙げられ、本発明のその他の態様において記述されたレポーターの発現の改変を、毒物学的ストレス、代謝状態の変化、遺伝子に基づく病気、またはウイルス、細菌、真菌もしくは寄生虫の感染の結果によるかもしれない病気の結果としての、宿主の改変された代謝状態の指標として用いてもよい。この使用の適用範囲には、外因性の化学物質または薬剤がレポーター構築物の発現に与える影響をモニタリングする際の使用があってもよい。

本発明の態様を、インビトロまたはインビボで遺伝子活性化事象を検出する方法に拡大する。

本発明の代替的な実施形態においては、方法は、本発明の核酸構築物により安定的にトランスフェクトされた宿主細胞または本発明のトランスジェニック非ヒト動物をアッセイするステップであって、細胞または動物を、ペプチドのタグが付けられた分泌／排出されるレポーター遺伝子の発現によって合図される遺伝子活性化事象に供するステップを含む。

本発明の代替的な実施形態においては、方法は、分泌／排出されるタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸構築物の少なくとも一つにより安定的にトランスフェクトされた宿主細胞をアッセイするステップであって、当該タンパク質が発現される細胞において異種であるステップ、またはその細胞がそのような構築物を発現するトランスジェニック非ヒト動物をアッセイするステップを含み、ここで、細胞もしくは動物を、ペプチドのタグが付けられたレポーター遺伝子の発現によって合図される遺伝子活性化事象に供する。

従って、上記の核酸構築物によりトランスフェクトされたかまたはそれを保持する細胞、細胞株または非ヒト動物の使用を含む、細胞もしくは細胞株または非ヒト動物における毒物学的に誘導されたストレスをスクリーニングまたはモニタリングする方法が提供される。

毒物学的ストレスは、ＤＮＡの損傷、酸化的ストレス、低酸素症、細胞性タンパク質の翻訳後の化学的修飾、細胞性核酸の化学的修飾、アポトーシス、細胞周期の停止、異常増殖、免疫学的な変化、ホルモンレベルの変化もしくはホルモンの化学的修飾の結果の影響、または細胞損傷に至り得るその他の因子と定義してもよい。

本発明は非侵襲性であるため有利である。というのは、レポーター部分は最終的に排出されて、検死を請求されることがないからである。

従って、上記の核酸構築物によりトランスフェクトされたかまたはそれを保持する細胞、細胞株または非ヒト動物の使用を含む、ウイルス、細菌、真菌および寄生虫の感染をスクリーニングし特徴付けるための方法も提供される。

従って、上記の核酸構築物によりトランスフェクトされたかまたはそれを保持する細胞、細胞株または非ヒト動物の使用を含む、癌、炎症性疾患、心疾患、代謝病、神経疾患および遺伝子に基づく病気をスクリーニングするための方法もさらに提供される。

これらの文脈において、エピソームに一時的に上記の核酸構築物を維持しつつ、細胞を一時的にトランスフェクトしてもよい。あるいは、核酸構築物を永久にかつ安定的にトランスフェクトされた細胞の染色体ＤＮＡ内に組み込むことによって、細胞を安定的にトランスフェクトする。

さらに本文脈において、トランスジェニック動物は、好ましくは、その細胞の全てまたはいくつかにおいてそのゲノムＤＮＡ内に組み込まれた、上記に規定の核酸構築物を有するトランスジェニック非ヒト動物と定義される。

細胞培養培地内または精製もしくは一部精製したその画分内のタンパク質のレベルを測定することによって、タグが付けられたペプチド、好ましくはエピトープタグが付いた分泌／排出されるタンパク質の発現をアッセイすることができる。

当業者にとって公知の多数の方法を用いることで、培養細胞から組織培養培地内またはトランスジェニック非ヒト動物体液内に分泌される分泌／排出されるタンパク質の検出および定量を実施してもよい。例えば、ＥＬＩＳＡもしくは競合的ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット分析または蛍光偏光などの免疫学的方法。例えば放射的（ＣＡＴ）または蛍光的、比色的に標識した基質の放出。質量分析または核磁気共鳴（ＮＭＲ）などによる複数の基質の検出。

本発明のさらなる実施形態においては、次のステップを含むレポーター遺伝子の活性化事象を検出する方法が提供される。
１．細胞をトランスフェクトすることまたは分泌／排出されるタンパク質をコードする核酸配列によるマウス受精卵の前核のマイクロインジェクションを行うステップ、ここで、このタンパク質は任意選択的に上記のペプチドまたはタンパク質のタグが付けられてもよく、任意で、マイクロインジェクションがなされた卵細胞またはトランスフェクトされたマウスのＥＳ細胞株を用いてもよい、
２．トランスフェクトされた細胞、細胞株またはトランスジェニック非ヒト動物に、遺伝子発現を改変させる代謝状態に変化を与えても与えなくてもよい刺激を与えるステップ、及び、
３．適切なアッセイを用いて、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、質量分析、ＮＭＲ、遠隔的方法などの検出方法を用いて、任意選択的にタグが付けられてもよい分泌／排出されるレポータータンパク質の発現レベルを測定するステップ。

ステップ（１）においては、検出可能な分泌／排出されるタンパク質は、核酸構築物が発現される細胞に対して異種のタンパク質であってもよい。従って、このような「タグがない」ＳＥＡＰレポータータンパク質には、検出のためのペプチドまたはタンパク質のタグが必要でないかもしれない。

本発明による方法および使用によって、修飾された遺伝子の発現が意味のある役割を演じるあらゆる分野の研究に顕著な進歩が与えられる。

このようなレポーター遺伝子を細胞およびトランスジェニック動物に用いて、種々の選択されたその他の遺伝子の活性を検出できる。具体的な適用例としては次のものが挙げられるが、これらに制限されるわけではない。
１．化学物質の潜在的な毒作用について評価するための迅速で頑丈なインビボスクリーニング系を提供する。
２．毒性のメカニズムについての情報を提供する。このような情報を用いて選択プロセスから化合物を除去したり、または化合物に生じ得る修飾を示唆できるかもしれない。
３．化合物の結合の影響についての情報を与える。
４．異なる時間間隔での尿における単数（または複数）のレポーターのレベルを測定することによって、長期に亘るレポーター遺伝子の発現の変化のモニタリングを可能にする。
５．病原菌の感染に伴う遺伝子発現の変化の評価。
６．神経疾患、心臓病および代謝病に伴う遺伝子発現の変化の評価。
７．癌に伴う遺伝子発現の変化の評価。
８．例えばそのメカニズムが規定され理解されている毒作用にレポーター発現の特性を当てはめることによって、薬剤の標的を選択することの検証を可能とする情報を与える。
９．毒性の表現型、代謝の表現型または退化性の表現型を無効にすることを対象とする治療計画としての化合物を査定するための使用。
１０．環境の変化および／または行動の変化に起因する遺伝子発現の変化の評価。

ここで、例示のみを目的として提示される例であって、本発明に関して限定されるべきではない次の実施例を参照して本発明を記載する。本出願においては、下記の図面についての言及もなされる。
本発明の詳細な説明

ｐＣＷ２の調製
まず、３’−オーバーハング配列を除去してＢｇｌＩＩリンカーを追加することによってＢｓｍＩ制限酵素認識部位を変換し、次いでＢｇｌＩＩで切断することによって、ＧＰＩアンカーを欠く胎盤のアルカリホスファターゼ酵素の切断型で分泌される５５．５ｋＤのアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードした配列を、ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）から切り出した。ＢｇｌＩＩのＳＥＡＰ断片を線状のｐＡＨＩＲ１（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１０９，２６１９−２６２５（１９９６））内に挿入し、それによって、８．５ｋｂの５’−フランキング配列、第一のエクソンおよびイントロンならびに第二のエクソンに２５４８のラットのＣｙｐ１Ａ１プロモーターが加えられたものの下流にこのレポーター遺伝子を位置させた。図１は、ｐＣＷ２についてのプラスミドマップを示す。

３ＭＣで誘導されたＣｙｐ１Ａ１−ＳＥＡＰベクターによりトランスフェクトされた細胞における発現。
（１０％のＦＣＳ、２ｍＭの１−グルタミンが追加されたＤＭＥＭにおいて５％のＣＯ₂で培養された）Ｈｅｐａ−Ｃ１Ｃ７細胞を、リン酸カルシウム共沈法を利用して、ｐＣＷ２により一時的にまたは安定的に（ｐＳＶＮｅｏと一緒に）トランスフェクトした。手短に言えば、５μｇのプラスミド（＋安定的なトランスフェクトのための１μｇのｐＳＶＮｅｏ）を塩化カルシウムおよびＨＥＰＥＳ緩衝化塩溶液と混合して、細胞と一緒に５時間インキュベートをした後に分離されるリン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿物を作製した。次いで、培地を新鮮な成長培地または選択培地（安定的なトランスフェクトのために４００μｇ／ｍＬのＧ４１８が追加された成長培地）と交換した。一時的にトランスフェクトされた細胞を６ウェルプレート内に注入し、３ＭＣを増量して培養培地に溶解させたものでインキュベートした。安定的なトランスフェクトのために、個々のコロニーをプレート上で同定できると、すぐにそのコロニーを集めて２μｇ／ｍＬの３ＭＣでインキュベートした。３ＭＣとのインキュベートから４８時間後に、この培地についてのＳＥＡＰ活性をアッセイした。

「ＳＥＡＰ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｓｓａｙ，ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ」（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ＳＥＡＰ活性を測定した。このキットのからのまたはＳｉｇｍａからのヒト胎盤アルカリホスファターゼを、ポジティブコントロールとして用いた。手短に言えば、サンプルおよび標準（０．８ｐｇ−８μｇ／ｍＬ）を希釈緩衝液で希釈し、６５℃で３０分間加熱した。遠心分離後、沈殿物を除去してサンプルを氷上に置き、次いでインキュベート緩衝液と共に黒色の９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）内にピペットで分注し、５分間インキュベートした。次いで、基質の１０分間のインキュベートと、照度計（ＥＧ ａｎｄ Ｇ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ９６Ｖマイクロプレートルミノメーター）による発光を読み取った後に、それぞれのサンプルにおけるＳＥＡＰの活性を明らかにした。図２は、Ｈｅｐａ１細胞内に一時的にトランスフェクトされたｐＣＷ２の３ＭＣによる誘導を示し、図３は、Ｈｅｐａ１細胞内に安定的にトランスフェクトされたｐＣＷ２の３ＭＣによる誘導を示す。

ｐＣＷ２によるトランスジェニックマウスの作製。
Ｃｙｐ１Ａ１プロモーター、ＳＥＡＰおよびポリアデニル化配列を含むｐＣＷ２に由来する１０ｋｂのＮｏｔＩ制限断片をゲル電気泳動によって精製してプラスミドの配列を除去し、マウス受精卵（Ｆ１ Ｃ５７／ＢＬ６×ＣＢＡ）の雄性前核内に、１．５ｎｇ／μＬの濃度で注入した。二細胞期に培養して生存している注入された卵細胞を、出産可能な偽妊娠した雌（Ｆ１）に移植した。トランスジェニックの状態についての遺伝子型の決定を、フォワードプライマー５’−ＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＣＴＣＡＴＣＡＴＣＴ−３’（配列番号３）およびリバースプライマー５’−ＣＧＴＣＡＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＴＧＧＡＧ−３’（配列番号４）を認識するＳＥＡＰのｃＤＮＡ配列を用いての、４〜６週齢の尾の生検材料（Ｗｈｉｔｅｌａｗ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ １，３−１３（１９９１））から抽出されたＤＮＡ上でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行った。

注入された６８３の卵細胞からの一つの研究において、１２７匹の子ネズミが生まれた。これらの子ネズミのうちの１２匹（６８３匹の２％）を、ＰＣＲによってトランスジェニックとして同定した；７匹が雌で５匹が雄。

３ＭＣで誘導されたＣｙｐ１Ａ１−ＳＥＡＰベクターの、トランスジェニックマウスにおける発現。
Ｃｙｐ１Ａ１−ＳＥＡＰの、インビボでの発現についての誘導を実証するために、マウスを３−メチルコラントレン（３ＭＣ）で処理した。ラットＣＹＰ１Ａ１−ＬａｃＺトランスジェニックマウスについて既に評価されたやり方（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１０９，２６１９−２６２５（１９９６））に従って、誘導を行った。Ｍａｚｏｌａブランドのコーンオイルでの懸濁液として３ＭＣを（少なくとも８週齢の）雌および雄のマウスの腹膜内に注入することによって投与した。試験動物は、トランスジェニック動物または同じ遺伝子型を有し年齢が適合する非トランスジェニック動物のいずれかであり、コーンオイル中の３−メチルコラントレン（３ＭＣ）を４０ｍｇ／ｋｇ体重または０．４ｍｇ／ｋｇ体重のいずれかにて、２４時間ごとに１回ずつ、連続して三回、腹膜内に注入することによって投与した。対照動物には、同量の担体のコーンオイルのみを投与した。最後の投与から２４時間後に、全ての動物の首を脱臼して殺した。

肝臓および腎臓のサンプルを取り出し、一旦リン酸塩緩衝化塩溶液で洗浄し、次いで加圧型のガラス製ホモジナイザーを用いて、ＨＢ緩衝液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で、滑らかな溶液が得られるまでホモジナイズした。不溶性タンパク質を１３０００ｒｐｍにて５分間の遠心分離によって除去し、清澄な上清のタンパク質含有量について、Ｐｉｅｒｃｅタンパク質測定キットを用いてアッセイした。それぞれの組織について、ＳＥＡＰアッセイにおける０．８ｍｇ／ｍＬの最終濃度を用いた。

尿および血液のサンプルを５０００ｒｐｍにて５分間の遠心分離にかけて、（尿からの）あらゆる固形廃棄物または（血液からの）凝集した細胞を除去し、そして直ちにＳＥＡＰ活性についてアッセイした。アッセイにおいては、尿は希釈せずに用いたのに対して、血液サンプルはＳＥＡＰアッセイの前に、蒸留水で１：１００および１：５００に希釈した。実施例２に記載のようにして、ＳＥＡＰ活性をアッセイした。図４は、分析された４匹の確立されたトランスジェニックマウス（ＣＹＳ４８、ＣＹＳ５０、ＣＹＳ３１、ＣＹＳ７４）のうちの３匹の尿および血液において検出される、４０ｍｇ／ｋｇの３ＭＣで誘導されたＣｙｐ１ａ１−ＳＥＡＰ活性を示し、図５は、トランスジェニックマウスの尿において検出される、３ＭＣで誘導されたＳＥＡＰ活性を示す。図６は、トランスジェニックマウスＣＹＳ３１の尿において、０．４ｍｇ／ｋｇの３ＭＣを投与した後に現れるＳＥＡＰを示す。

ストラチフィンプロモーターの制御下において、エピトープタグが付いたヒトβ−絨毛性ゴナドトロピンタンパク質をコードするレポーター遺伝子の作製。
・エピトープタグが付いたヒトβ−絨毛性ゴナドトロピンコード配列
（「ｍｙｃ」と指定された）次のオリゴヌクレオチド配列：
ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＡＡＡ ＣＴＣ ＡＴＣ ＴＣＴ ＧＡＡ ＧＡＧ ＧＡＴ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＡＧ（配列番号５）を、天然のｈＣＧ配列のアミノ酸残基Ｖａｌ６７およびＧｌｙ６８についてのコドンの間にある、ヒトβ−絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）コード配列の内部ループにおけるＰｓｔＩ制限酵素認識部位に挿入し、それによって、全配列が、内部の１４アミノ酸のエピトープタグを保持するｈＣＧをコードするようになる。

・プロモーターの選択
（１４−３−３σとしても知られている）ストラチフィン（ＳＦＮ）遺伝子のプロモーターは、ＤＮＡの損傷の結果として生じるＧ２／Ｍ期停止のマーカーである。ＳＦＮ遺伝子は、γ−照射後またはドキソルビシンとしても知られているアドリアマイシンによる処理後のヒトの腫瘍に由来する細胞株において、Ｇ２／Ｍ期停止の間のｐ５３依存性メカニズムを介して転写的に上方制御されることが示されている（Ｈｅｒｍｅｋｉｎｇ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １：３−１１，１９９７）。ＳＦＮの発現は、その発現によってＧ２／Ｍ期チェックポイントを経た進行が停止するという理由で、Ｇ２／Ｍ期停止に機能的に関与しているように見える（Ｈｅｒｍｅｋｉｎｇ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １：３−１１，１９９７）。さらに、腫瘍抑制タンパク質ＢＲＣＡ１に対応したＳＦＮプロモーターの転写の活性化が生じ得る。このタンパク質が転写を活性化させる機能は、ＤＮＡの損傷によって活性化する（Ｓｏｍａｓｕｎｄａｒａｎ，Ｋ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，８８：１０８４−１０９１，２００３）。ＳＦＮの誘導はｐ５３発現の変化よりも先であるという事実（Ａｐｒｅｌｉｋｏｖａ Ｏ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６：２５６４７−２５６５０，２００１）、ｐ５３を欠損するＨＣＣ１９３７細胞におけるＧ２／Ｍ期停止およびＳＦＮの誘導にとって、ＢＲＣＡ１の発現が必要かつ十分であるという事実（Ｙａｒｄｅｎ Ｒ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３０：２８５−２８９，２００２）は、誘導のこの経路がｐ５３依存性であることを示唆する。従って、ＤＮＡの損傷によるＳＦＮの誘導は、ｐ５３依存性経路およびｐ５３独立性経路の両方を介して生じるようである（Ｈｅｒｍｅｋｉｎｇ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １：３−１１，１９９７；Ａｐｒｅｌｉｋｏｖａ Ｏ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６：２５６４７−２５６５０，２００１；Ｙａｒｄｅｎ Ｒ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３０：２８５−２８９，２００２）。

・ＳＦＮ−ｈＣＧ構築物の作製
１０ｋｂの上流の調節プロモーターＤＮＡと９ｋｂの下流配列とを含むゲノムＳＦＮ配列のＡＴＧ開始コドンの直後にｈＣＧ（ｍｙｃ）コード配列が挿入された人工遺伝子構築物を作製した。ｈＣＧ（ｍｙｃ）配列は終止コドンを含むため、この構築物は、ＳＦＮプロモーターの制御下でｈＣＧ（ｍｙｃ）を発現することになる。Ｒｅｄ／ＥＴ相同組換え系（Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ）を利用した組換えクローニングを用いてこのレポーター構築物を組み立てた。

（Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅが支援する）Ｈｕｍａｎ Ｅｎｓｅｍｂｌサイトのｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓを利用して、ＳＦＮ（ｓｆｎタンパク質｝のゲノムクローンを同定した。ヒトＰＡＣクローンＲＰＣＩ−５０ｏ２４が全コード領域およびプロモーターを含むことが確認され、調節領域が正常な調節にとって必須であると判断した。ＰＣＲによって、ＰＡＣクローンが５’非翻訳配列および３’非翻訳配列の両方を含むことをさらに検証した。スクリーニングに用いられたＳＦＮオリゴ体は次のものであった。

４８，６７１−４８，６９０ｂｐの位置のＳＦＮ検証済みオリゴ体
フォワードＳＦＮ ＡＴＧ ＧＴＣ ＣＴＧ ＴＧＴ ＧＴＧ ＴＣＡ Ｃ（配列番号６）
リバースＳＦＮ ＣＡＧ ＧＧＧ ＡＡＣ ＴＴＴ ＡＴＴ ＧＡＧ Ａ（配列番号７）

次いで、正確なＰＣＲ産物を与えるクローンを、次のように処理した。検証されたＰＡＣクローンを、プラスミドｐＳＣ１０１ＢＡＤｇｂａＡ（Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ）で形質転換した。このプラスミドは、組換えプロセスに必須のリコンビナーゼを提供する。制限分析によって、ＰＡＣ／ｐＳＣ１０１ＢＡＤｇｂａＡクローンにｐＳＣ１０１ＢＡＤｇｂａＡが存在するかについて、さらに検証した。正確な制限パターンを与えるクローンのみを使用した。

ｈＣＧ（ｍｙｃ）の作製：Ａｍｐ標的構築物を次のように処理した。ｐＸＥＮバックボーンに相当するものの上には、ｈＣＧ（ｍｙｃ）：Ａｍｐテンプレートが予めクローニングされていた。このものを消化してテンプレートを線状にし、バックグラウンドを低減した。次のオリゴヌクレオチド（Ｂｉｏ Ｓｐｒｉｎｇ）を用いて標的分子を作製した。

ＵＳ−ＳＦＮｈＣＧ
ＴＧＧＴＣＣＣＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＴＡＧＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＴＧＴＧＴＧＴＣＣＣＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧ（配列番号８）
ＬＳ−ＳＦＮａｍｐ
ＴＡＧＣＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＡＣＴＧＧＣＴＣＴＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡ（配列番号９）

次の反応条件を用いた。３９．５μＬのｄＨ₂Ｏ、５μＬの１０×Ｔｕｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、２μＬの１０ｍＭのｄＮＴＰＳ（Ｒｏｃｈｅ）、１μＬのＵＳ−ＳＦＮｈＣＧ（１００ｐｍｏｌ）、１μＬのＬＳ−ＳＦＮａｍｐ（１００ｐｍｏｌ）、０．５μＬのＴｒｉｐｌｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｔａｑポリメラーセ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、ＰＣＲブロック条件（ＭＷＧ）：９４℃で１分間×１サイクル、９３℃で３０秒間、５６℃で３０秒間×３０サイクル、７２℃で２分３０秒間および７２℃で５分間×１サイクル。

メチル化されたテンプレートＤＮＡが優先的に切断されるように、ＤｐｎｌによるＰＣＲ反応混合物の消化を行った。消化されたＰＣＲ反応物をエタノールで沈殿させ、そして水で再懸濁して最終ＤＮＡ濃度を０．５μｇ／μＬとした。ＰＡＣ（ＲＰＣＩ−５０ｏ２４）を含むｐＳＣ１０１ＢＡＤｇｂａＡを次のように培養した；１ｍＬ（７０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび３μｇ／ｍＬのテトラサイクリンが追加された）のＬＢ培地で、３０℃にて１０００ｒｐｍで振盪させながら一晩培養した。その翌日、上記のように追加された三つの１．４ｍＬのＬＢ培地を設定し、３０μＬの一晩培養したものを接種して、３０℃で２時間、振盪しながら培養した。２時間後、培養物のうちの二つを３０μＬのＬ−アラビノース（１０％）で誘導し、そして三つの培養物の全てを３７℃に変更して、振盪しながらさらに１時間培養した（これによってリコンビナーゼが誘導され、ｐＳＣ１０１ＢＡＤプラスミドのさらなる複製が停止した）。次いで、得られた培養物を、１ｍＬの氷冷滅菌水で三回洗浄する処理を行って、これらをエレクトロコンピテントなものとした。次いで、ＰＣＲｅｄ標的分子で細胞のエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの後で、１ｍＬのＬＢブロスを用いて３７℃で７０分間かけて細胞を回収した。次いで、回収された細胞を、（７０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび２０μｇ／ｍＬのアンピシリンでの）選択を伴うＬＢ寒天上に広げ、そして３７℃で一晩培養した。得られたコロニーについて、正確な組換え事象（５’末端についてのｈＣＧおよびＳＦＮの連結と、３’末端についてのＡｍｐおよびＳＦＮの連結）についてのスクリーニングを行った。ポジティブクローンの確認時に、修飾されたＰＡＣ内にｐＳＣ１０１ＢＡＤｇｂａＡプラスミドを再導入し、上記のように検証した。次の段階は、修飾されたＳＦＮ遺伝子を、１０Ｋｂの上流配列およびいくつかの９Ｋｂの下流配列でｐＡＣＹＣ１８４バックボーン上にサブクローニングすることであった。組換えクローニングを利用してこのことが再び達成された。サブクローニングする標的構築物を、次のオリゴ体を用いてＰＣＲで作製した。

ＳＦＮサブクローニング用オリゴ体
サブクローンフォワードＳＦＮ
ＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＣＴＣＧＣＣＡＣＴＧＣＡＣＴＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＣＴＴＡＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＴＣ（配列番号１０）
サブクローンリバースＳＦＮ
ＧＧＡＴＡＴＧＧＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＴＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＡＴＧＡＡＣＡＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＧＡＡＴＴＡＣＡＡ（配列番号１１）

ＰＣＲ条件は、テンプレートの線状ｐＡＣＹＣ１８４を用いたこと以外は既述のとおりとした。ＰＣＲ産物を、既述のように処理した。

修飾されたＳＦＮ ｈＣＧ（ｍｙｃ）：ｐＳＣ１０１ＢＡＤｇｂａＡを含むＡｍｐを既述のようにしてエレクトロコンピテントなものとし、ＳＦＮサブクローンの中間型でエレクトロポレーションを行った。１５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールおよび２０μｇ／ｍＬのアンピシリンを追加したＬＢ寒天プレート上に広げる前に、得られた形質転換体を１ｍＬのＬＢで回収した。多数の診断用の制限消化によって潜在的な形質転換体をスクリーニングし、正確な制限パターンを与えることによって評価した。４００ｍＬの液体培地（１５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールおよび２０μｇ／ｍＬのアンピシリンを追加したＬＢブロス）で培養することによって調製された、正確な制限パターンを与えるクローンは大量であった。そしてＱｉａｇｅｎ Ｍａｘｉキットを用いてマキシを調製した（キットに含まれるプロトコールに従った）。

ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）−Ａｍｐレポーター構築物を含む細胞株の作製
前立腺腫瘍の細胞株ＰＣ３は、インビトロでは単層で増殖することが可能なｐ５３−／−細胞株であり、先天的無胸腺ヌードマウスにおいて異種移植片として増殖する皮下の腫瘍を形成する。重要なことは、それが抗癌剤での処理後にＧ２／Ｍ期停止を経験する能力を有することである（Ａｒａｎｈａ Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２２：７８７−７９４，２００３）。

実施例５に記載のようにして作製されたＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）−Ａｍｐレポーター構築物により、ＦｕＧｅｎｅ試薬（Ｒｏｃｈｅ，Ｌｅｗｅｓ，Ｅａｓｔ Ｓｕｓｓｅｘ）を用いて、６ウェル組織培養プレート上でＰＣ３細胞をトランスフェクトした。（１μｇ／ウェルに相当する）ＤＮＡ構築物をＦｕＧｅｎｅ試薬（３μＬ／ウェル）に添加し、血清を含まない培地で１００μＬ／ウェルに作製した。この細胞が増殖した培地を吸引し、ウェルあたり１００μＬの上記の混合物で置換した。２４時間後、細胞をトリプシンで消化し、１０ｃｍの組織培養用シャーレ（１０ｃｍのシャーレあたり６ウェルのプレートがあるうちの１ウェル）に移した。選択の前に、細胞をこれらのシャーレ上で７日間増殖させた。この後、Ｇ４１８（２０ｎｇ／ｍＬ細胞培養培地）を添加し、コロニーが目視できるまで（約１週間）シャーレを維持した。トリプシンに浸したクローニング用ディスクを用いて個々のコロニーを選択し、２４ウェルプレートの個々のウェルに移した。次いで、これらのコロニーを６ウェルプレートに展開し、次いでインビトロでの誘導実験と異種移植実験で用いるために十分な量の細胞が存在するようになるまで、Ｔ２５フラスコで培養した。

異種移植された細胞株から誘導されたＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）導入遺伝子の発現のインビボでの検出。
実施例６に記載のようにして、ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）−Ａｍｐレポーター構築物により安定的にトランスフェクトしたＰＣ３細胞を、先天的無胸腺ヌードマウスにおける皮下の固形腫瘍として増殖させた。次いで、このマウスをＧ２／Ｍ期停止を導く機能を有する抗癌剤で処理した。この例示で選択された薬剤は、カンプトセシン（ＭｃＤｏｎａｌｄ Ａ．Ｃ．ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ Ｒ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７８：７４５−７５１，１９９８）であった。この実験のために、（ｈＣＧを発現または分泌しない）野生型のＰＣ３細胞と、ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）−Ａｍｐレポーター構築物を含む安定的な細胞株とを用いた。野生型および改変されたＰＣ３腫瘍細胞株を、１０％〜１５％の加熱不活性化させたウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン（５０ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を追加したＲＰＭＩ培地で培養した。ＰＣ３／ＳＦＮ細胞についての培養培地は、Ｇ４１８（２００μｇ／ｍＬ）も含んでいた。加湿インキュベーター内で３７℃、５％のＣＯ₂にて培養物をインキュベートした。細胞を回収し、集め、遠心分離にかけ、そして冷却した培地で再懸濁させた。腫瘍細胞注入溶液が、それぞれの細胞株に対して腫瘍細胞／培地およびＭａｔｒｉｇｅｌの５０：５０の混合物となるように、このものを等量の冷却したＭａｔｒｉｇｅｌと混合した。野生型ＰＣ３細胞またはトランスフェクトされたＰＣ３細胞を、動物あたり２．５×１０⁶個注入した。全ての細胞株を、右腕の側面にのみ１００μＬの容量を注入した。

本研究は、全体で、各４匹の動物を含む４群からなるものであった。マウスの一つの群には野生型のＰＣ３細胞を移植し、残りの３群には改変された細胞を移植した。細胞を移植した後、腫瘍の直径が２〜５ｍｍに達するまで、腫瘍の成長を週に二回測定した。式：Ｖ＝４／３π（（ｄ１＋ｄ２）／４）³（ここでｄ＝平均径（ｎ＝２）である）を用いて、腫瘍の体積（Ｖ）を計算した。

腫瘍移植から５週間後に処理を開始した。野生型のＰＣ３−異種移植されたマウスは処理されないままであった；その他の全てのマウスには、媒体のみ（ＤＭＳＯ／塩溶液）を投与または１５ｍｇ／ｋｇ体重のカンプトセシンを腹膜内に単回投与した。薬剤投与から２４時間後に、尿サンプルを回収した。ｍｙｃタグ配列に対するモノクローナル抗体（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．）をコーティングしたプラスチック製のウェルの表面上でｈＣＧ（ｍｙｃ）が捕捉されるようなサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって、尿のｈＣＧ（ｍｙｃ）をアッセイした。次いで、ヒツジ抗ｈＣＧポリクローナル抗血清と一緒にインキュベートし、次いでセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が結合した抗ヒツジＩｇＧで標識化して、個々のウェルのｈＣＧ（ｍｙｃ）含有量をアッセイした。次いで、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と反応させ、そして４５０ｎｍでの吸収値を測定することによって、結合したＨＲＰの量を測定した。野生型のＰＣ３細胞を注入したことによって、異種移植腫瘍を保持するマウスの尿にはｈＣＧ（ｍｙｃ）は検出されなかった。しかしながら、異種移植腫瘍を保持するマウスの尿において、ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）レポーター構築物によりトランスフェクトされたＰＣ３細胞を注入したことによって、ｈＣＧ（ｍｙｃ）が検出された。図７は、カンプトセシンの投与から２４時間後の異種移植マウスからの尿における、および媒体溶液のみが与えられたマウスからのコントロールの尿における、（４５０ｎｍでの吸収値で示される）ｈＣＧ（ｍｙｃ）の濃度の情報を示す。カンプトセシンを投与した結果、尿のｈＣＧ（ｍｙｃ）が増加し、ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）遺伝子の転写の活性化が誘導された。

ｐＣＷ２についてのプラスミドマップを図解する。 ｐＣＷ２により一時的にトランスフェクトされたＨｅｐａ１細胞の３ＭＣによる誘導を示す。 ｐＣＷ２により安定的にトランスフェクトされたＨｅｐａ１細胞の３ＭＣによる誘導を示す。 確立されたトランスジェニック動物の尿および血液において検出されるＣｙｐ１Ａ１−ＳＥＡＰ活性の３ＭＣによる誘導を示す。 トランスジェニック動物の尿における３ＭＣで誘導されたＳＥＡＰ活性を示す。 ３ＭＣを０．４ｍｇ／ｋｇ投与された後のＣｙｐ１Ａ１−ＳＥＡＰトランスジェニック動物の尿における３ＭＣで誘導されたＳＥＡＰ活性を示す。 ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）レポーター導入遺伝子を匿っているＰＣ３細胞の異種移植腫瘍を保持するヌードマウスの尿における、カンプトセシンで誘導されたｈＣＧ（ｍｙｃ）濃度の上昇を示す。

Claims (33)

1. 生産または発現される細胞からタンパク質または産物として分泌可能であり、かつ全ての動物から排出可能であるレポータータンパク質をコードするレポーター遺伝子を含む核酸配列を含む核酸構築物。
2. 分泌／排出可能なタンパク質または産物が、修飾された遺伝子の転写によって生産される、請求項１に記載の核酸構築物。
3. 分泌／排出可能なタンパク質または産物が、レポーターの翻訳の増加によって生産される、請求項１に記載の核酸構築物。
4. レポーターの翻訳の増加が、ｍＲＮＡの安定性の向上または代謝回転の低下の結果である、請求項３に記載の核酸構築物。
5. 分泌／排出可能なタンパク質または産物が、翻訳後の調節によって生産される、請求項１に記載の核酸構築物。
6. 翻訳後の調節が、ポリユビキノン化の除去を介してのレポーターの安定性の向上、または小分子の代謝産物の蓄積もしくは排出の結果である、請求項５に記載の核酸構築物。
7. エピトープタグの形式でもよいペプチドタグをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸構築物。
8. （ｉ）分泌／排出されるタンパク質をコードする核酸配列および／または（ｉｉ）ペプチドタグをコードする核酸配列の上流にプロモーターエレメントをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸構築物。
9. 分泌／排出されるレポータータンパク質がＳＥＡＰである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸構築物。
10. 構築物がＣｙｐＡ１プロモーターをさらに含む、請求項９に記載の核酸構築物。
11. 分泌／排出されるレポータータンパク質が、修飾されたヒトβ絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）分子である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸構築物。
12. 構築物がストラチフィン遺伝子のプロモーターをさらに含む、請求項１１に記載の核酸構築物。
13. ｈＣＧにタグが付けられている、請求項１１または１２のいずれかに記載の核酸構築物。
14. ｈＣＧにｍｙｃ−タグが付けられている、請求項１３に記載の核酸構築物。
15. 分泌／排出されるレポータータンパク質／産物が、ホルモン分子、抗体および酵素分子からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれかに記載の核酸構築物。
16. ホルモン分子がＦＳＨである、請求項１５に記載の核酸構築物。
17. 抗体がγ鎖または軽鎖（Ｂｅｎｃｅ Ｊｏｎｅｓ）タンパク質である、請求項１５に記載の核酸構築物。
18. 酵素分子がネコの尿のカルボキシラーゼである、請求項１５に記載の核酸構築物。
19. 請求項１〜１８のいずれか一項に記載の核酸構築物の少なくとも一つによりトランスフェクトされた宿主細胞。
20. 請求項１〜１８のいずれか一項に記載の核酸構築物の少なくとも一つによりトランスフェクトされた細胞株。
21. トランスジェニック非ヒト動物であって、前記非ヒト動物の細胞が、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の核酸構築物にコードされたタンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト動物。
22. 哺乳動物である、請求項２１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
23. 哺乳動物がマウスである、請求項２２に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
24. 分泌／排出されるレポーター産物もしくはレポータータンパク質または分子が、尿、唾液、涙、乳汁、脳脊髄液および精液からなる群より選択される体液に排出される、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
25. 分泌／排出されるレポーター産物もしくはレポータータンパク質または分子が、尿に排出される、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
26. 分泌／排出されるレポーター部分が、６０〜１２０ｋＤａ未満の範囲の比較的低分子量である、請求項１９に記載の宿主細胞、請求項２０に記載の細胞株または請求項２１〜２５のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
27. 分泌／排出されるレポーター部分が、親水性の球状三次構造を有し、その生物活性が低く、そして容易に検出し定量できるように天然の分子と明瞭に区別できるものである、請求項１９に記載の宿主細胞、請求項２０に記載の細胞株または請求項２１〜２５のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
28. 請求項１〜１８に記載の二以上の核酸構築物を含む、請求項１９に記載の宿主細胞、請求項２０に記載の細胞株または請求項２１〜２５のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
29. インビトロまたはインビボでの細胞における改変された代謝状態の変化に起因する遺伝子活性化事象を検出するための、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の核酸構築物の使用。
30. 遺伝子活性化事象が、毒物学的ストレス、代謝状態の変化またはウイルス、細菌、真菌もしくは寄生虫の感染による誘導である、請求項２９に記載の使用。
31. 請求項１〜１８のいずれか１項に記載の核酸構築物により安定的にトランスフェクトされた宿主細胞または請求項２１〜２５のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物をアッセイするステップを含む細胞における遺伝子活性化事象をインビトロまたはインビボで検出する方法であって、前記細胞または動物は、任意選択的に前記タンパク質にエピトープのタグが付けられた分泌／排出されるレポータータンパク質の発現によって合図される遺伝子活性化事象を受けている、方法。
32. 請求項１〜１８のいずれか一項に記載の核酸構築物によりトランスフェクトされたかまたは請求項１〜１８のいずれか一項に記載の核酸構築物を保持する細胞、細胞株または非ヒト動物の使用を含む、細胞もしくは細胞株または非ヒト動物における毒物学的に誘導されたストレスをスクリーニングまたはモニタリングする方法。
33. 請求項１〜１８のいずれか一項に記載の核酸構築物によりトランスフェクトされたかまたは請求項１〜１８のいずれか一項に記載の核酸構築物を保持する細胞、細胞株または非ヒト動物の使用を含む、ウイルス、細菌、真菌および寄生虫の感染をスクリーニングし特徴付けするための方法、または癌、炎症性疾患、心疾患、代謝病、神経疾患および遺伝子に基づく病気をスクリーニングするための方法。
    

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