KR100408429B1 - 유즙 중에 인간 과립구 콜로니 자극인자를 생산하는형질전환 흑염소 - Google Patents
유즙 중에 인간 과립구 콜로니 자극인자를 생산하는형질전환 흑염소 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 유즙 중에 인간 과립구 콜로니 자극인자를 대량생산하는 형질전환 흑염소(Capra hircus aegagrus)에 관한 것으로, 상세하게는 흑염소 베타카제인 프로모터하에 인간 과립구 콜로니 자극인자 유전자를 포함하는 발현카세트 pGbc-hGCSF가 도입된 수정란(제 KCTC 0718BP 호), 상기 수정란으로부터 발생된 형질전환 흑염소, 상기 수정란을 대리모 흑염소의 난관에 이식하고 발생시키는 단계를 포함하는 상기 형질전환 흑염소의 제조 방법, 상기 도입에 사용되는 수정란의 채란 방법, 상기 형질전환 흑염소를 출산시킨 후 유즙 중에 포함된 형태로 인간 과립구 콜로니 자극인자를 회수하는 단계를 포함하는 인간 과립구 콜로니 자극인자의 생산 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 유즙 중에 인간 과립구 콜로니 자극인자를 생산하는 형질전환 흑염소에 관한 것이다.
인간 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)는 혈액내에서 조혈 과정에 매우 중요한 과립구, 거식 세포 등의 성장 및 분화를 촉진하는 기능을 하는 생리활성물질로서, 당단백질이며 인체내에서 미량으로 생산, 분비된다. 이러한 조혈 생장조절인자로서의 인간 G-CSF의 활성은 정상적인 인간에서 매우 제한적이지만, 세균의 침입, 항암치료 등의 외부 자극, 골수 세포의 이식 등의 특수 상황이 일어나면 인간 G-CSF의 발현이 증가되어 대량의 과립구와 거식세포의 성장 및 분화를 촉진함으로써 인체를 보호한다.
인간 G-CSF는 인체내에서 극미량으로 존재하므로 인체로부터 정제하는 것이 불가능하며, 현재까지 대장균을 이용한 방법 및 동물 세포를 이용한 방법에 따라 생산되어 왔다. 그러나 대장균을 이용하여 생산된 인간 G-CSF는 시험관내 활성이 동물 세포를 이용하여 생산된 인간 G-CSF의 경우와 동일하나, 당쇄화가 이루어지지 못해 생체내에서 활성에 많은 논란이 있고 안전성에도 문제가 있으며, 또한 대장균을 이용한 방법에는 멸균, 대규모의 발효조, 복잡한 정제 시스템 등에 높은 시설 투자비용이 소요되는 문제점이 있다. 또한 동물 세포를 이용한 방법은 생체내 활성 문제는 없으나, 배양용 혈청 및 배지가 고가이고 복잡한 정제 시스템에 높은 시설 투자비용이 소요되는 문제점이 있다.
이에 따라 생체내 활성을 갖는 인간 G-CSF를 경제적으로 생산하는 방법이 절실히 요청되고 있다. 최근 형질전환된 젖소, 염소, 돼지 등의 동물을 생체반응기로 이용하여 생리활성물질을 생산하고자 하는 시도가 계속되고 있다. 이 방법은 생체내 단백질과 동일한 단백질을 생산할 뿐 아니라, 대장균 또는 동물 세포를 사용하는 종래의 방법의 생산 단가를 1000 내지 2000분의 1 수준으로 낮출 수 있어 매우 저렴하다는 장점이 있다. 현재까지 이 방법에 따라 락토페린과 콜라겐 등이 생산된 바 있다(미국 특허 제5,633,076호, 제5,849,992호 및 제5,895,833호). 한편 국제특허공개 제97/19589호에는 형질전환 난장이 염소(dwarf goat)의 제조 방법이 개시되어 있으나, 이 난장이 염소로부터 생리활성물질을 실질적으로 생산하지 못했다.
본 발명자들은 종래 인간 G-CSF의 생산 방법의 문제점을 해결하기 위해, 유선조직 특이적 발현시스템을 이용하여 형질전환 흑염소에서 인간 G-CSF를 유즙으로 분비, 생산하는 방법을 개발하고자 연구를 거듭하였으며, 이 과정에서 흑염소의 형질전환에 사용될 수 있는 유선조직 특이적 발현 벡터 시스템을 개발하여 이미 출원한 바 있다(대한민국 특허출원 공개 제98-73991호). 그러나, 이 출원에서는 모델 동물로서 쥐에서의 인간 G-CSF의 발현을 확인하였을 뿐이었다.
따라서, 본 발명의 목적은 유선조직 특이적으로 인간 과립구 콜로니 자극인자를 발현하는 발현카세트가 도입된 수정란을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 수정란의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 도입에 사용되는 수정란의 채란 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 수정란으로부터 발생된, 유즙 중에 인간 과립구 콜로니 자극인자를 생산하는 형질전환 흑염소를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 흑염소의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 흑염소를 이용한 인간 과립구 콜로니 자극인자의 생산 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 따라 생산된 인간 과립구 콜로니 자극인자 및 이를 함유하는 유즙 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 따라 생산된 인간 과립구 콜로니 자극인자를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
도 1은 흑염소의 발정동기화와 과배란유기를 위한 처리 일정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 형질전환 흑염소의 게놈 DNA에 대한 PCR 반응 결과이다.
도 3은 형질전환 흑염소의 게놈 DNA에 대한 서던 블랏 결과이다.
도 4는 형질전환 흑염소의 유청에 대한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 5는 형질전환 흑염소의 유청에 의한 세포주 HL-60의 증식 효과를 보여주는 그래프이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 흑염소 베타카제인 프로모터하에 인간 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF) 유전자를 포함하는 발현카세트 pGbc-hGCSF가 도입된 수정란(제 KCTC 0718BP 호)을 제공한다.
또한, 다른 목적에 따라 본 발명에서는 흑염소(Capra hircus aegagrus)의 수정란 웅성 전핵에, 흑염소 베타카제인 프로모터하에 인간 과립구 콜로니 자극인자 유전자를 포함하는 발현카세트 pGbc-hGCSF를 미세주입하는 단계를 포함하는, 상기 수정란의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 (a) 흑염소 암컷(Capra hircus aegagrus)에 노르게스토메트 및 에스트라디올(estradiol)을 투여하고, 노르게스토메트가 함유된 임플란트를 삽입한 후 13 내지 14 일이 지난 때에 제거하여 발정동기화시키는 단계, (b) 임신성 암컷 혈청 고나도트로핀(PMSG), 난포자극호르몬(FSH) 및 장막 고나도트로핀(hGC)을 임플란트 제거하기 60 시간 전부터 12 시간 간격으로 8회 투여하며, 이때 투여 일정으로는 1회에 임신성 암컷 혈청 고나도트로핀 및 난포자극호르몬을, 2회 내지 7회에 난포자극호르몬을, 8회에는 난포자극호르몬 및 장막 고나도트로핀을 투여하여 과배란유기시키는 단계, (c) 교미시키는 단계, 및 (d) 상기 임플란트 제거후 70 내지 76 시간에 채란하는 단계를 포함하는, 상기 흑염소의 수정란의 채란 방법을 제공한다.
또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 수정란(제 KCTC 0718BP 호)으로부터 발생된, 유즙 중에 인간 과립구 콜로니 자극인자를 생산하는 형질전환 흑염소(Capra hircus aegagrus)를 제공한다.
또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 수정란(제 KCTC 0718BP 호)을 대리모 흑염소의 난관에 이식하고 발생시키는 단계를 포함하는, 상기 형질전환 흑염소의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 형질전환 흑염소를 출산시킨 후 상기 흑염소로부터 분비되는 유즙 중에 포함된 형태로 인간 과립구 콜로니 자극인자를 회수하는 단계를 포함하는, 인간 과립구 콜로니 자극인자의 생산 방법을 제공한다.
또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 방법에 따라 생산된 인간 과립구 콜로니 자극인자를 함유하는 유즙 조성물을 제공한다.
또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 방법에 따라 생산된 인간 과립구 콜로니 자극인자를 제공한다.
또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 방법에 따라 생산된 인간 과립구 콜로니 자극인자를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 수정란은 대한민국 재래종 흑염소(Capra hircus aegagrus)의 수정란에 흑염소 베타카제인 프로모터하에 인간 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF) 유전자를 포함하는 발현카세트 pGbc-hGCSF가 도입된 것이다.
본 발명에서 도입되는 발현카세트 pGbc-hGCSF는, 흑염소 베타카제인 프로모터(프로모터부터 엑손 I의 번역개시코돈 전까지의 부위) 및 그 하류에 위치하면서 이 프로모터의 조절을 받는 인간 G-CSF 유전자를 포함하며, 출산 후 흑염소 베타카제인 프로모터가 유선에서 특이적으로 활성화되어 이 프로모터의 조절을 받는 인간 G-CSF 유전자를 발현한다.
본 발명의 수정란은 다음과 같이 제조될 수 있다.
(1) 발현카세트 pGbc-hGCSF의 제작
먼저, 유선 조직에서 특이적으로 인간 G-CSF를 발현하는 발현카세트 pGbc-hGCSF를 제작한다. 즉, (i) 프로모터, 엑손 I, 인토론 및 엑손 II가 포함된 발현 벡터 pGbc_S(대한민국 특허출원 공개 제98-73991호)를 제한효소 Sac I과 Hind III로 절단하여 흑염소 베타카제인 유전자의 프로모터부터 엑손 I의 번역개시코돈 앞까지의 영역의 DNA를 얻은 후 다시 Dra I으로 절단하여 1239 bp의 DNA 단편 1을 얻고, (ii) 염소 게놈 DNA에 대해 프라이머 CAS-F1(서열번호: 1)과 CAS-R1(서열번호: 2)을 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 실시하고 PCR 산물을 제한효소 Dra I과 Hind III로 절단하여 DNA 단편 2를 얻은 후, (iii) 상기 DNA 단편 1과 2를, 제한효소 Sac I, Hind III 및 소 알칼리 포스파타제 처리하여 개환한 플라스미드 pBluescript II SK(Stratagene사)에 연결하고, (vi) 얻어진 플라스미드의 Hind III와 EcoRI 절단부위에, 사람 과립구 콜로니 자극인자 유전자와 그 하류에 소성장호르몬 전사종결부위를 포함하는 DNA 단편(pRc/RSV, Invitrogen사)을 삽입하여 벡터 pGbc-hGCSF를 얻고, (v) 이 벡터를 BssH II 및 Kpn I 등의 적합한 제한효소로 절단하여 발현카세트 pGbc-hGCSF를 얻는다.
(2) 발현카세트의 수정란에로의 미세주입
이어서 흑염소(Capra hircus aegagrus) 암컷으로부터 채란된 수정란에 발현 카세트 pGbc-hGCSF DNA를 미세주입한다. 미세주입의 방법으로는, 예를 들어, 미세조작기(micromanipulator)가 장착된 도립현미경 하에서 1세포기 수정란의 웅성 전핵에 발현카세트 DNA를 약 4 ㎍의 양으로 미세주입하는 것이다. 미세주입된 수정란은 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 1999년 12월 28일자 기탁번호 제 KCTC 0718BP 호로 기탁되었다.
상기 미세주입에 사용되는 수정란은, 대한민국 재래종 흑염소(Capra hircus aegagrus) 암컷(공란 흑염소)을 발정동기화 및 과배란유기화시키고 교미시킨 후 다수의 수정란을 회수하는 단계를 포함하는 채란 방법에 따라 얻을 수 있다. 흑염소암컷의 발정동기화 및 과배란유기는 문헌(윤 우식 등, 한국재래산양에서 FSH 및 hCG 투여가 과배란유기 및 배란 시간에 미치는 영향, 한국가축번식학회지, 21 (4): 373-379 (1997))에 기재되어 있다. 발정동기화 방법으로는 크게 두가지가 있는데, 첫 번째 방법은 황체들의 퇴행시기를 일치시켜 프로게스테론에 의한 시상하부-뇌하수체의 부 피드백(negative feedback action)을 해제시킴으로써 발정과 배란이 동일한 시기에 일어나게 하는 것으로, 이 방법에는 황체 퇴행 효과를 갖는 프로스타글란딘 F2α 또는 이의 합성 유연 물질이 사용될 수 있다. 발정동기화의 두 번째 방법으로는 난포의 발육과 성숙을 인위적으로 억제하여 동일한 상태로 일치시킴과 동시에 억제를 해제시킴으로써 발정과 배란을 집중적으로 유도하는 것으로, 이 방법에는 배란 억제 작용을 갖는 프로게스테론, 이의 유도체로서 메틸아세톡실프로게스테론, 플루오로게스테론 아세테이트 등이 사용되는데, 상세하게는 메틸아세톡실프로게스테론 또는 플루오로게스테론 아세테이트를 흑염소 질 내부에 삽입하고 10 내지 18일이 지난 후 제거하거나, 노르게스토메트(norgestomet)가 함유된 귀 임플란트를 흑염소 귀의 피하층에 삽입하고 10 내지 18일이 지난 후에 제거하는 방식으로 사용된다.
또한 과배란유기 방법으로는, 임신성 암컷 혈청 고나도트로핀(Pregnant mare serum gonadotropin, PMSG)을 500 내지 1,500 IU의 양으로 1 또는 2회 근육 또는 피하에 투여하는 방법과, FSH를 18 내지 24 ㎎의 양으로 3 내지 4 일 동안 투여하는 것이며, 필요에 따라 고나도트로핀 방출 호르몬(GnRH), 인간 장막 고나도트로핀 등을 FSH와 함께 사용하기도 한다.
본 발명에서는 발정동기화 및 과배란유기를 위하여, 도 1에 도시된 바와 같이, 한편으로는 노르게스토메트 및 에스트라디올 적당량을 근육 주사하고 다른 한편으로는 적당량의 노르게스토메트가 함유된 임플란트를 귀 등에 삽입한 후 13 내지 14 일째에 제거하여 발정동기화하고, 동시에 PMSG, 난포자극호르몬(FSH) 및 장막 고나도트로핀(hCG)을 임플란트 제거하기 60 시간전부터 12시간 간격으로 8회 주사투여하여 과배란유기시키는데, 이때 주사투여 일정으로는 1회에 PMSG 및 FSH를, 2회 내지 7회에 FSH를, 8회에는 FSH 및 hCG를 적당량으로 투여하는 것이다. 특히, 8회에 FSH와 함께 투여되는 hCG는 배란을 효과적으로 유기시키고 배란시기도 조절한다.
이어서 과배란유기된 흑염소 암컷을 흑염소 수컷과 자연 교미시킨 후, 임플란트 제거 후 72 내지 76 시간이 지난 때에 24 시간 절식시킨 흑염소에 질라진(Xylazine), 리도카인(lidocaine) 등의 마취제를 주사한 후 앙천자세로 보정하고 복정중선을 국부마취시킨 다음 절개하여 난소, 난관 및 자궁을 드러낸 후 관류관을 난관누두부 안쪽에 삽입하고 관류관을 통해 소태아혈청이 포함된 인산완충염수(PBS)를 자궁으로부터 난관쪽으로 역관류시켜 수정란을 회수한다.
또한, 본 발명에 따른 형질전환 흑염소(산양)는 발현카세트 pGbc-hGCSF가 미세주입된 수정란(제 KCTC 0718BP 호)으로부터 발생되며, 출산 후 유선조직에서 인간 G-CSF를 대량으로 발현하여 유즙에 포함된 형태로 분비한다.
본 발명에 따른 형질전환 흑염소는 다음과 같이 제조될 수 있다.
(A) 수정란의 대리모에로의 이식
상기 (2)에서 미세주입된 수정란을 공지된 외과적 수술 방법에 따라 대리모 흑염소(수란 흑염소)의 난관에 이식하는데, 대표적인 예로는 대리모 흑염소를 24 시간 절식시킨 후 복정중선을 국부마취시키고 절개하여 난소, 난관 및 자궁을 드러낸 후, 미세주입된 수정란을 폴리에틸렌 튜브를 사용하여 난관누두부를 통해 난관에 이식하는 것이다. 이때, 대리모 흑염소로는 자연적으로 발정된 흑염소 암컷 또는 PMSG 호르몬에 의해 발정이 유도된 흑염소 암컷을 사용할 수 있으며, 자연 발정된 흑염소 암컷이 바람직하다. 호르몬에 의한 발정 유도 방법은 상기 채란 방법과 유사하게 노르게스토메트 및 에스트라디올(estradiol) 적당량을 근육 주사하고 다른 한편으로는 적당량의 노르게스토메트가 함유된 임플란트를 귀 등에 삽입한 후 13 내지 14 일째에 제거하여 발정동기화하고, 귀 임플란트 제거하기 48 시간 전에 PMSF 약 400 IU를 근육 주사하는 것이다.
대리모 흑염소 1 마리 당 이식되는 수정란의 수는 2 내지 4 개가 바람직하다. 대리모 흑염소의 임신 여부는 이식 후 40 일이 지난 때에 초음파 진단기를 사용하여 확인할 수 있다.
(B) 형질전환 흑염소의 확인
대리모 흑염소로부터 태어난 흑염소(산자)의 형질전환 여부는 게놈 DNA에 대한 PCR, 서던 블랏 등의 통상적인 방법에 따라 확인할 수 있다. 형질전환 흑염소로 확인된 산자에서 인간 G-CSF의 발현 여부는 유즙 단백질에 대한 웨스턴 블랏과 ELISA 등의 통상적인 방법에 따라 확인할 수 있다.
이렇게 얻어진 형질전환 흑염소는 출산(분만)에 의해 유선 조직에서 특이적으로 인간 G-CSF의 발현을 유도할 수 있으며, 이때 발현된 인간 G-CSF는 유즙에 포함된 형태로 분비된다. 또한 본 발명의 방법에 따르면 인간 G-CSF가 흑염소에서 생산되므로 생체내 활성을 그대로 유지하는 장점을 가진다.
본 발명에 따라 생산된 인간 G-CSF는, 과립구 및 거식 세포의 성장 및 분화를 촉진한다. 또한 인간 G-CSF가 골수 이식, 악성 임파종, 급성 백혈병, 폐암, 난소암, 고환종양, 골수이형성 증후군, 재생불량성 빈혈 및 선천성 특발성 호구증 감소증 등의 질환의 예방 및 치료 효과를 가진다는 점은 이미 공지되어 있다. 따라서 본 발명에 따라 생산된 인간 G-CSF는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 약학 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 통상적인 방법에 의하여 정제, 캡셀제, 산제, 과립, 현탁액, 유화액 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여형 제제로 제형화할 수 있다. 인간 G-CSF는 사람을 포함하는 포유동물에 대해 75 내지 600 ㎎/㎏(체중)의 양으로 1일 1회 또는 분할하여 투여할 수 있다.
본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 벡터 pGbc-hGCSF의 제작
흑염소 베타카제인 유전자의 프로모터부터 엑손 II 까지의 부위를 포함하는 플라스미드 pGbc_S(대한민국 특허출원 공개 제98-73991호)를 제한효소 Sac I과Hind III로 절단한 후 페놀과 클로로포름의 혼합 용액(1:1(v/v))으로 DNA를 추출하고 95% 에탄올로 침전시킨 다음 증류수에 녹여, 흑염소 베타카제인 유전자의 프로모터부터 엑손 I의 번역개시코돈 앞까지 영역의 DNA 단편을 얻었다. 이 DNA 단편을 제한효소 Dra I으로 절단한 후 1 % 아가로스 겔에서 전기영동하고 1239 bp 단편 부위를 잘라낸 다음 바이오101(BIO101)사의 진클린 II 키트(Geneclean II kit)를 이용하여 분리정제하여 DNA 단편 1을 얻었다.
한편 염소 게놈 DNA에 대해 프라이머 CAS-F1(서열번호: 1)과 CAS-R1(서열번호: 2)를 사용하여 PCR을 실시한 후 PCR 산물을 제한효소 Dra I과 Hind III로 절단하고 전기적으로 추출하여, DNA 단편 2를 얻었다.
DNA 단편 1과 2를, 제한효소 Sac I과 Hind III 및 소 알칼리 포스파타제로 처리하여 개환한 플라스미드 pBluescript II SK(Stratagene사)에 삽입하였다. 얻어진 플라스미드의 Hind III와 EcoRI 절단부위에, 인간 과립구 콜로니 자극인자(hGCSF) 유전자와 그 하류에 소성장호르몬 전사종결부위를 포함하는 DNA 단편(pRc/RSV, Invitrogen사)을 삽입하여 벡터 pGbc-hGCSF를 얻었다.
벡터 pGbc-hGCSF를 제한효소 BssH II와 Kpn I으로 절단한 후 아가로스 겔에 전기영동하고 바이오101사의 진클린 II 키트를 이용하여 추출한 다음 슐라이서 앤드 쉘(Schleicher Schuell)사의 일루팁-디(Elutip-d)를 이용하여 정제하고 투석용액(10 mM Tris-Cl(pH 7.2) 및 0.1 mM EDTA)중에서 투석한 다음 0.22 ㎛ 여과지(Nalgene사)로 여과 및 정제하여 발현카세트 pGbc-hGCSF를 회수하였다. 여기에 투석용액을 가하여 최종 농도 4 ㎍/㎖가 되도록 희석하였다.
실시예 2: 흑염소 수정란의 회수
도 1에 도시된 일정에 따라, 1 내지 3 연령의 흑염소 암컷(공주 사비성 목장에서 입수함)에 노르게스토메트 3.0 ㎎ 및 에스트라디올 5.0 ㎎이 함유된 참기름 2 ㎖를 근육 주사하고, 흑염소 귀의 털을 제거하고 소독한 후 이 부위의 피하층에 노르게스토메트 6 ㎎이 함유된 귀 임플란트(Syncromate-B, Sanofi Animal Health, 미국)를 주입기(Syncromate-B Gun, PETS사, 미국)를 이용하여 삽입한 후 13 또는 14일이 지난 때에 외과적으로 제거하여 발정동기화시켰다.
또한 도 1에 도시된 일정에 따라, FSH(Ovagen, Immuno-Chemical Products, 뉴질랜드) 5.6 ㎎을 귀 임플란트 제거하기 60 시간 전부터 12 시간 간격으로 8회에 나누어 주사투여하였다. 이때 주사 일정으로는 1 회에 FSH 0.7 ㎎와 추가로 PMSG(Pregnecol, Horizon Technology, 호주) 150 IU를, 2회 내지 7회에 FSH 0.7 ㎎씩을, 그리고 8회에 FSH 0.7 ㎎과 추가로 hCG(Sigma사, 미국) 100 IU를 투여하였다. 이 후 과배란 유기된 흑염소 암컷을 12 시간 동안 흑염소 수컷과 자연 교미시켰다.
귀 임플란트를 제거한 후 72 내지 76 시간이 지난 때에, 24 시간 절식시킨 흑염소에 2% 질라진(Rompun, Bayer, 대한민국) 용액을 0.3 ㎖/10 ㎏의 양으로 근육주사하고 앙천자세로 보정하였다. 이어서 2% 리도카인 10 ㎖를 보정된 흑염소의 복정중선에 주사하여 국부마취시킨 후 복정중선 4 내지 6 ㎝를 절개하고 난소, 난관 및 자궁을 드러낸 후 내경 1.0 ㎜의 폴리에틸렌 튜브인 관류관을 난관누두부 안쪽으로 삽입하여 고정시키고 10% 소태아혈청(FBS)이 포함된 PBS를 자궁으로부터 난관쪽으로 역관류시켜 수정란을 회수하였다. 얻어진 흑염소 수정란을 미세주입 전까지 변형된 합성 난관액(m-SOF, Takahashi Y. et al., Theriogenology, 37, 963-978 (1992))에 보관하였다.
시험예 1: FSH와 hCG 병용 투여가 과배란 유기 및 수정란 회수 시기에 미치는 효과
(1) FSH와 hCG 병용 투여가 흑염소의 과배란유기에 미치는 영향
실시예 2에서 과배란유기를 위한 FSH 투여시 8회에 FSH와 hCG 병용 투여가 과배란유기에 미치는 영향을 알아보기 위해, 8회에 FSH 0.7 ㎎과 hCG 100 IU, 또는 FSH 0.7 ㎎(비교군)을 투여한다는 점을 제외하고는 실시예 2에서와 동일하게 실시하였다. 임플란트 제거 후 70 내지 76 시간이 지난 때의 배란유기율(처리 염소 중 배란된 염소의 비율), 배란점(배란된 염소 한 마리 당 평균 배란 난포의 수), 회수율(배란 난포의 수에 대한 회수된 난자의 수) 및 수정률(회수된 난자 중 전핵이 관찰된 수정란의 비율)을 조사하였다.
그 결과는 하기 표 1과 같다.
처리 | 흑염소의 수(마리) | 배란 흑염소의 수(배란유기율 %) | 배란점의 수(배란점 평균값) | 회수된 난자의 수(회수율 %) | 수정란 수(수정률%) |
FSH | 44 | 16(36.4%)a | 127(7.9) | 70(55.1) | 31(44.3) |
FSH+hCG | 36 | 36(100.0%)b | 309(8.6) | 267(86.4) | 126(47.2) |
a,b통계적인 유의성을 보임(P<0.05) |
표 1에서 보듯이, hCG와 FSH의 병용 투여구의 배란유기율은 100%로써, FSH 단독 투여구의 경우(36.4%)보다 매우 높아, FSH와 hCG의 병용 투여가 배란을 유도하는 데 매우 효과적이다. 반면, hCG와 FSH의 병용 투여구의 수정률은 FSH 단독 투여구의 경우와 차이가 없어, hCG는 수정률에 나쁜 영향을 미치지 않음을 알 수 있다. 그러므로 hCG는 수정을 방해하지 않으면서 배란유기율을 높이는데 효과적으로 이용될 수 있음을 알 수 있다.
다른 품종의 산양에서는 FSH의 단독 투여만으로도 배란을 효과적으로 유도할 수 있다(Selgrath J.P. et al.,Theriogenology,34, 1195-1205 (1990); Ebert, K.M. et al.,Bio/Technology,12, 699-702 (1994); 및 Gootwine, E. et al.,Theriogenology,48, 485-499 (1997))고 알려진 것과는 달리, 재래 흑염소에서는 FSH 단독 투여에 의해 배란율이 36.4%에 그치고 있으며, hCG와 FSH의 병용 투여에 의하여만 효과적으로 과배란되는 것으로 확인되었다. 이러한 차이는 재래 흑염소의 생리적 독특성에 기인하는 것으로 보이며, 재래 흑염소에서 hCG와 FSH의 병용 투여가 매우 중요함을 알 수 있다.
(2) FSH와 hCG의 병용 투여시 수정란 회수의 최적 시기 결정
미세주입에 적합한 전핵기 수정란을 회수하는 최적 시기를 결정하기 위해, FSH와 hCG의 병용 투여구의 흑염소에서 귀 임플란트를 제거한 후 62 내지 68 시간, 70 내지 76 시간, 및 78 내지 84 시간에 채란한 다음 수정란의 발달 단계를 실체 현미경하에서 관찰하여 조사하였다.
그 결과는 하기 표 2와 같다.
채란 시기(귀 임플란트 제거후 경과시간) | 회수한 난자의 수 | 수정란의 수(수정률 %) | 발달단계 (%) | |||
1 세포기 | 2 세포기 | 4 세포기 | ≥ 8 세포기 | |||
62-68 | 10 | 3(30.0) | 3(100.0) | - | - | - |
70-76 | 183 | 126(68.9) | 106(84.1) | 17(13.5) | 3(2.4) | - |
78-84 | 17 | 14(82.4) | 8(57.1) | 4(28.6) | 2(14.3) | - |
표 2에서 보듯이, 귀 임플란트 제거 후 62 내지 68 시간이 지난 때에 채란된 경우에는 모두 1 세포기 수정란이었으나 수정율이 30%로 매우 저조하였다. 이에 반해, 70 내지 76 시간이 경과한 때에 채란된 경우에는 수정율이 약 70%로, 1 세포기, 2 세포기 및 4 세포기 수정란이 각각 84.1%, 13.5% 및 2.4%의 비로 얻어졌으며, 78 내지 84 시간이 경과한 때에 채란된 경우에는 수정률이 80% 이상으로 높았으나 2 세포기 및 4 세포기의 수정란의 비율이 증가하였다.
따라서 한국 재래 흑염소로부터 미세주입에 적합한, 수정율이 높은 1 세포기 수정란을 얻기 위해서는 귀 임플란트 제거 후 70 내지 76 시간이 지난 때에 수정란을 채란하는 것이 효과적임을 알 수 있다.
이상의 결과들을 종합하면, 귀 임플란트를 사용하여 발정동기화를 유도하는 경우, FSH 단독 투여보다는 FSH-hCG의 병용 투여가 채란 효율을 높이며 채란 시기는 귀 임플란트 제거 후 70 내지 76 시간이 지난 때가 적절함을 알 수 있다.
실시예 3: 발현 카세트의 흑염소 수정란에의 미세주입
실시예 2에서 얻은 수정란을 12,000 rpm에서 7 분 동안 원심분리하여 1 세포기 수정란의 전핵이 가시화되도록 하였다. 미세조작기(Leitz사, 독일)가 장착된 도립 현미경(DIC Inverted microscope, Leitz사, 독일)하에서 1 세포기 수정란의 전핵에 실시예 1에서 얻은 4 ㎍/㎖의 발현카세트 pGbc-hGCSF DNA를 약 1-2 pℓ 정도의 양으로 미세주입하였다. 미세주입시 pH 변화를 줄이기 위해 TL-HEPES 배양액(Hagen, D.R., J. Anim. Sci., 69, 1147-1150 (1991))에서 사용하였다. 미세주입된 수정란은 이식 전까지 m-SOF 배양액에서 37 ℃, 5 % CO2조건하에 배양하였다. 미세주입 후 파열되지 않고 생존한 1 세포기의 정상적인 수정란을 선별하였다. 선별된 수정란은 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 1999년 12월 28일자 기탁번호 제 KCTC 0718BP 호로 기탁하였다.
실시예 4: 수정란의 대리모 흑염소에의 외과적 이식
자연발정된 1 내지 3 연령의 대리모 흑염소를 24 시간 절식시킨 후 실시예 2에 기재된 방법으로 복정중선을 국부마취시키고 절개하여 난소, 난관 및 자궁을 드러낸 후, 이 난관에 실시예 3에서 얻은 1 내지 4 세포기의 수정란을, 멸균된 내경 0.5 ㎜, 외경 0.8 ㎜ 및 길이 20 ㎝의 폴리에틸렌 튜브(하목제작소, 일본)를 사용하여 난관누두부를 통해 이식하였다. 대리모 흑염소 1 마리당 수정란 2 내지 4개를 이식하였다. 이식 후 30일이 지난 때에 대리모 흑염소들의 임신 여부를 초음파 진단기(Sonorex, Medison, 대한민국)를 사용하여 조사하였다.
시험예 2: 자연 발정 대리모와 호르몬 유도 대리모에서 임신율과 산자 생산율의 비교
유전자가 미세주입된 수정란을 실시예 4에서와 동일한 방법으로 자연 발정 대리모 및 호르몬 유도 대리모에 각각 이식하였다. 이때 호르몬 유도 대리모는 실시예 2에서와 동일한 방법으로 실시하여 발정동기화시키고, 귀 임플란트 제거 후 48 시간이 지난 때의 호르몬의 반응 상태에 따라 PMSF 400 내지 600 단위를 근육 주사하여 얻었다. 각 대리모의 임신율 및 산자 생산율을 조사하였다. 그 결과는 하기 표 3과 같다.
대리모 | 대리모의 수 | 평균 배란점 | 이식한 수정란의 평균수 | 임신된 수(임신율 %) | 산자수 |
호르몬 처리구 | 35 | 5.3 | 2.7 | 9(25.7) | 10 |
자연 발정구 | 36 | 1.8 | 2.6 | 14(38.9) | 15 |
표 3에서 보듯이, 자연 발정구의 흑염소의 평균 배란점은 호르몬 처리구의 경우보다 낮지만 임신율은 호르몬 처리구의 경우보다 높다. 따라서 자연 발정된 대리모가 수정란을 이식하는 것이 산자 생산에 유리함을 알 수 있다.
실시예 5: 형질전환 흑염소의 확인
(1) 게놈 DNA의 분리
대리모 흑염소로부터 태어난 생후 10 내지 30 일령된 산자 흑염소의 귀에서직경 약 0.5 ㎝ 크기의 조직을 떼어내어 15 ㎖ 시험관에 옮기고 여기에 4 ㎖의 용해 용액(10 mM Tris-Cl(pH 8.0), 0.1 mM EDTA 및 0.5% SDS)을 가한 후 55 ℃ 항온조에 약 16 시간 동안 넣어 조직을 용해시켰다.
용해된 조직 세포들을 공지된 방법(Sambrook, J. et al.,Molecular cloning: a laboratory manual,2nd ed. Cold Spring Harber Laboratory Press, New York, (1989))에 따라 페놀과 에탄올로 차례로 처리하여 게놈 DNA를 분리 정제하였다. 정제된 DNA를 증류수에 녹여 최종 농도 0.5 ㎍/㎕가 되도록 하였다.
(2) PCR
(1)에서 얻은 게놈 DNA 용액 0.1 ㎕에 대해 프라이머 GB2(서열번호: 3)와 GCSF2(서열번호: 4) 또는 프라이머 GB2(서열번호: 3)와 GCSF3(서열번호: 5)을 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94 ℃에서 4 분간 처리하여 게놈 DNA를 변성시킨 후, 94 ℃에서 1분 동안, 55 ℃에서 1분, 및 72 ℃에서 1 분의 과정을 30 회 반복하였다. 사용된 프라이머 GB2(서열번호: 3)는 센스 가닥의 5'쪽으로 베타 카제인 부위(1621 내지 1640 번)에 해당하며, 프라이머 GCSF2 및 GCSF3(서열번호: 4 및 5)는 각각 센스 가닥의 3' 쪽으로 인간 과립구 콜로니 자극인자 유전자 부위(각각 511 내지 530 및 681 내지 698 번)에 해당한다.
PCR 산물을 2% 아가로스 겔에 전기영동하였으며, 그 결과는 도 2와 같다. 도 2에서 제1열 내지 제7열은 각각 산자 흑염소의 경우이고, (-)열은 정상 흑염소의 경우이고, (+)열은 정상 흑염소의 게놈 DNA와 플라스미드 pGbc-hGCSF를 혼합한경우이다. 도 2에서 보듯이, 제6열에서는 프라이머 GB2와 GCSF2(서열번호: 3과 4)에 의해 얻어진 480 bp 크기의 밴드와, 프라이머 GB2와 GCSF3(서열번호: 3과 5)에 의해 얻어진 540 bp 크기의 밴드가 모두 나타났다. 따라서 제6열의 산자 흑염소가 발현카세트 pGbc-hGCSF가 삽입된 형질전환 흑염소임을 알 수 있다.
(3) 서던 블랏
(1)에서 얻은 산자 흑염소 게놈 DNA 10 ㎍을 제한효소 Hind III로 절단하고 0.8 % 아가로스 겔에서 전기영동한 후 공지된 모세관 전이 방법(Sambrook, J. et al., 1989,Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)에 따라 나일론 막에 진이시켰다. DNA가 흡착된 나일론 막을 전하이브리드화 용액(6x SSC, 5x Denhardt's reagent, 0.5 % SDS)중에서 68 ℃로 2 시간 동안 처리한 다음, 인간 G-CSF 유전자를 제한효소 Hind III와 Nae I로 절단하여 얻은 단편에 대해 [α-32P]dCTP를 사용하여 무작위 프라임밍(random priming) 방법으로 제작한 프로브를 가하고 동일 온도에서 22 시간 동안 반응시켰다.
반응 종료 후 나일론 막을 2x SSC/0.1% SDS 용액으로 상온에서 1 회 세척하고, 동일한 용액으로 65 ℃에서 10 분 동안 세척한 다음 다시 1x SSC/0.1% SDS 용액으로 65 ℃에서 10 분 동안 세척하였다. 이 막위에 X선 필름을 올려놓고 -70 ℃에서 3일 동안 감광시킨 후 현상하였다.
그 결과는 도 3과 같다. 도 3에서 제1열 내지 제7열은 각각 산자 흑염소의 경우이고, (-)열은 정상 흑염소의 경우이고, (+)열은 정상 흑염소의 게놈 DNA와 플라스미드 pGbc-hGCSF를 혼합한 경우이다. 도 3에서 보듯이, 제6열의 산자 흑염소는 발현카세트 pGbc-hGCSF가 삽입된 형질전환 흑염소임을 알 수 있다.
이러한 방식으로 25 마리의 산자 중 2 마리의 산자가 인간 G-CSF로 형질전환된 흑염소로 확인되었다.
실시예 6: 형질전환 흑염소 유즙의 인간 G-CSF의 웨스턴 블랏
실시예 5에서 얻은 형질전환 흑염소가 산자를 출산한 후 2일(초유) 및 5일에 유즙을 채취하였다. 얻어진 유즙에 동일 부피의 1xPBS를 가하고 4 ℃에서 1 시간 동안 방치한 후 13,000 rpm으로 15 분 동안 원심분리한 다음 상층액(유청)을 회수하였다. 상층액 2 ㎕에 대해 15% SDS-PAGE를 수행하였다. 비교구로서 시판되는 대장균 유래의 rHuG-CSF(Kirin사) 및 CHO 세포주 유래의 rHuG-CSF(쥬가이사)를 사용하고 대조구로는 형질전환되지 않은 흑염소의 유청을 사용하여 동일하게 수행하였다. SDS-PAGE로 분리된 단백질을 공지의 방법(Protein Methods, Daniel M Bollag and Stuart J. Edelstein, Wiley-Liss, 1991)에 따라 니트로셀룰로즈 막(Amersham pharmacia biotech사)에 옮겼다. 이 막을 차단 완충용액(탈지분유를 1xPBS중에 최종 농도 3%로 녹인 용액)중에서 상온에서 1 시간 동안 교반하였다. 이어서 이 막을, 항 인간 G-CSF 마우스 IgG(RD systems사)를 차단 완충용액 10 ㎖로 1,000 배 희석한 용액중에서 상온에서 1 시간 동안 교반한 후 1x PBS 300 ㎖ 중에서 5 분씩 3회 교반하였다. 이 막을, 호스라디쉬 퍼옥시다제가 결합된 항 마우스 IgG 항체를 차단 완충용액 10 ㎖로 1,000 배 희석한 용액중에서 상온에서 1 시간 동안 교반하였다. 이 막을 1x PBS 중에서 5 분씩 3회 교반한 후 애머샴 파마시아 바이오텍(Amersham pharmacia biotech)사의 ECL 키트를 사용하여 발색시켰다.
그 결과는 도 4와 같다. 도 4에서 제1열은 대장균 rHuG-CSF 50 ng이고, 제2열은 대장균 rHuG-CSF 100 ng이며, 제3열은 CHO rHuG-CSF 50 ng이고, 제4열은 CHO rHuG-CSF 100 ng이며, 제5열은 본 발명의 형질전환 흑염소의 2일째 유청 1 ㎕이고, 제6열은 본 발명의 형질전환 흑염소의 5일째 유청 1 ㎕이며, S는 단백질 분자량 표지이고, (-)은 형질전환되지 않은 흑염소의 유청이다. 도 4에서 보듯이, 형질전환 흑염소의 유청에서는 시판되는 인간 G-CSF와 동일하게 약 18 kDa 위치에서 밴드로 발색됨을 확인할 수 있었다. 또한 5일째 채취한 유청의 밴드의 농도와 두께가 2일째에 채취한 유청의 경우보다 강하고, 약 50 내지 100 ㎍/㎖의 양으로 추정되었다. 따라서, 본 발명의 형질전환 흑염소는 유즙 중에 인간 G-CSF를 다량으로 분비함을 알 수 있다.
실시예 7: 형질전환 흑염소 유즙 중 인간 G-CSF 농도
형질전환 흑염소의 유즙 중 인간 G-CSF의 농도를 결정하기 위해, 실시예 6에서 얻은 형질전환 흑염소 유즙을 완충용액(20mM Trizma base pH 7.4 및 1mM EDTA)으로 4배 희석한 후 4℃에서 27,000xg로 20 분씩 3회 원심분리하여 지질과 당 성분을 제거하고 상층액(유청)을 얻은 다음, 상업적으로 시판되는 G-CSF ELISA키트(Cat # DCS50, R D사, 미국)를 이용하여 유청 중 인간 G-CSF의 농도를 결정하였다.
실시예 8: 형질전환 흑염소 유즙의 인간 G-CSF의 활성
인간 골수 기원의 세포주 HL-60(ATCC CCL-240)을 10% 소태아혈청이 포함된 RPMI 1640 배지에서 37 ℃, 5 % 이산화탄소 조건하에 배양하였다. 세포수를 계수하여 약 2.2x105세포/㎖가 되도록 조정한 후, DMSO를 최종 농도 1.25 %(v/v)가 되도록 가하였다. 이 세포주를, 저증발 96 웰 플레이트(low evaporation 96 well plate, 코닝사)의 각 웰에 90 ㎕씩 넣어 웰 당 약 2x104세포가 되도록 한 후, 5% 이산화탄소가 공급되는 37 ℃ 배양기에서 약 48 시간 동안 배양하였다.
실시예 6에서 얻은 형질전환 흑염소의 유청, 형질전환되지 않은 흑염소 유청과, 중외제약에서 시판하는 인간 G-CSF를 각각 RPMI 1640 배지중에 희석하여 G-CSF 해당량으로 최종 농도 500 ng/㎖가 되도록 하였다. 이 희석액을 RPMI 1640 배지를 사용하여 두 배씩 10회 연속 희석하였다.
또한, 시판 G-CSF(중외제약) 2 ㎍을 형질전환되지 않은 흑염소의 유청 희석액 10 ㎖에 가하여 얻은 혼합액을 10 ㎕의 양으로, 배양중인 세포주 HL-60이 들어있는 각 웰에 가한 다음 37 ℃ 배양기에서 48 시간 동안 배양하였다.
배양액 중 세포주의 증식 정도를 조사하기 위해, 배양액을 프로메가(Promega)사의 CellTiter96TM(cat # G4100)을 이용하여 처리하고 670 ㎚의파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과는 도 5와 같다. 도 5에서 -●-는 시판 G-CSF이고, -■-는 시판 G-CSF와 형질전환되지 않은 흑염소 유청의 혼합액이며, -▲-는 형질전환 흑염소 유청이고, -▼-는 형질전환되지 않은 흑염소의 유즙이다. 도 5에서 보듯이, 형질전환 흑염소의 유청은 현재 시판되는 G-CSF와 동일한 세포 증식 활성을 가지는데 반해, 형질전환되지 않은 정상 흑염소의 유청은 세포 증식에 전혀 영향을 미치지 않는다. 또한 세포주 HL-60의 증식은 형질전환 흑염소의 유즙에 포함된 인간 G-CSF에 의한 것이며 그 생물학적 활성도 기존의 G-CSF와 대등하다.
본 발명에 따른 형질전환 흑염소는 생체내 활성을 갖는 인간 G-CSF를 유즙 중에 대량생산하며, 이로부터 생산된 인간 G-CSF는 생리활성을 그대로 유지하므로 골수 이식, 악성 임파종, 급성 백혈병, 폐암, 난소암, 고환종양, 골수이형성 증후군, 재생불량성 빈혈 및 선천성 특발성 호구증 감소증 등의 질환의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (9)
- 흑염소(Capra hircus aegagrus) 베타카제인 프로모터하에 인간 과립구 콜로니 자극인자 유전자를 포함하는 발현카세트 pGbc-hGCSF가 도입된 수정란(제 KCTC 0718BP 호).
- 흑염소(Capra hircus aegagrus)의 수정란 웅성 전핵에, 흑염소 베타카제인 프로모터하에 인간 과립구 콜로니 자극인자 유전자를 포함하는 발현카세트 pGbc-hGCSF를 미세주입하는 단계를 포함하는, 제 1 항에 따른 수정란(제 KCTC 0718BP 호)의 제조 방법.
- (a) 흑염소 암컷(Capra hircus aegagrus)에 노르게스토메트 및 에스트라디올을 투여하고, 노르게스토메트가 함유된 임플란트를 삽입한 후 13 내지 14 일이 지난 때에 제거하여 발정동기화시키는 단계, (b) 임신성 암컷 혈청 고나도트로핀(PMSG), 난포자극호르몬 및 장막 고나도트로핀을 임플란트 제거하기 60 시간 전부터 12 시간 간격으로 8회 투여하며, 이때 투여 일정으로는 1회에 임신성 암컷 혈청 고나도트로핀 및 난포자극호르몬을, 2회 내지 7회에 난포자극호르몬을, 8회에는 난포자극호르몬 및 장막 고나도트로핀을 투여하여 과배란유기시키는 단계, (c) 교미시키는 단계, 및 (d) 상기 임플란트 제거 후 70 내지 76 시간에 채란하는 단계를 포함하는, 흑염소 수정란의 채란 방법.
- 제 1 항에 따른 수정란으로부터 발생된, 유즙 중에 인간 과립구 콜로니 자극인자를 생산하는 형질전환 흑염소(Capra hircus aegagrus).
- 제 1 항에 따른 수정란을 대리모 흑염소의 난관에 이식하고 발생시키는 단계를 포함하는, 제 4 항에 따른 형질전환 흑염소의 제조 방법.
- 제 4 항에 따른 형질전환 흑염소를 출산시킨 후 상기 흑염소로부터 분비되는 유즙 중에 포함된 형태로 인간 과립구 콜로니 자극인자를 회수하는 단계를 포함하는, 인간 과립구 콜로니 자극인자의 생산 방법.
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JP2004298196A (ja) | mC26遺伝子発現制御領域を用いてトランスジェニック動物乳腺において物質を生産する新規製造法 |
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Date | Code | Title | Description |
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E902 | Notification of reason for refusal | ||
AMND | Amendment | ||
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AMND | Amendment | ||
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B701 | Decision to grant | ||
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