KR100850349B1 - 재조합 인간 혈액응고인자 발현벡터, 확인용 프라이머 염기서열 및 혈액응고인자를 유즙으로 분비하는 형질전환 돼지 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유전자 재조합기술을 이용하여 인간의 혈액응고제 원료물질로 응용할 수 있는 혈소판 응집인자(hvWF)를 돼지 유즙으로 대량 분비할 수 있는 형질전환 돼지를 생산함으로써, 이를 통하여 사람의 혈우병 및 vWF질병 치료제로서 생물 의약품 생산에 유용하게 이용될 수 있도록 하기 위한 것이다.

형질전환, 혈소판, 유즙, 재조합, 발현벡터, 유전자

Description

재조합 인간 혈액응고인자 발현벡터, 확인용 프라이머 염기서열 및 혈액응고인자를 유즙으로 분비하는 형질전환 돼지{RECOMBINANT HUMAN BLOOD COAGULATION EXPRESSION VECTOR, PRIMER SEQUENCE LISTING FOR CONFIRMING INTRODUCTION OF VWF AND TRANSGENIC PIG PRODUCING HUMAN vWF PROTEIN}

도 1은 본 발명 실시예 1에서의 사람 혈액응고인자(hvWF) 유전자의 크로닝 모식도.

도 2는 상기 실시예 1에서의 소 유즙특이 프로모터(bovine α-S1-casein promoter) 크로닝 및 미세주입용 벡터 구축상태 모식도.

도 3은 본 발명 실시예 3에서 분만돼지의 PCR 및 Southern blot 검정상태도.

도 4는 본 발명 형질전환 돼지의 유즙내 vWF존재 확인 사진.

도 5는 본 발명 형질전환 돼지의 유즙내 vWF함량 검정 사진.

본 발명은 혈액응고제를 생산하는 형질전환 돼지 및 그에 관련된 발현벡터에 관한 것으로서, 유전자 재조합기술을 이용하여 인간의 혈액응고제(vWF)를 돼지의 유즙에서 대량으로 생산할 수 있는 형질전환 돼지를 개발함으로써 인간의 치료약으로서 혈액응고제 또는 vWF disease 치료용 약품의 원료물질을 가축을 통해 대량생 산이 가능하도록 하기 위한 것이다.

일반적으로, 혈류내 혈액응고 작용을 하는 vWF(von Willebrand Factor, 또는 factor VIII-related protein(VIIIR))는 혈관상피 세포에서 만들어지는 약 250kDa의 당단백질로서 2,050개의 아미노산으로 구성되어 있으며 혈류내에서 85만에서 2천만 Dalton의 분자량을 갖는 중합체 상태로 순환된다. 이는 외상에 의한 출혈 및 생리적 상태에 따라 활성을 갖게 되며, 혈액내 혈구를 상처부위로 모이게 한 후 응고작용을 일으킴으로써 출혈을 억제하는 작용을 하는데, 기본적 작용은 혈관내벽과 혈소판간의 결합매개체로서 작용한다. vWF질병의 경우 혈액내 존재하는 vWF양의 많고, 적음에 따라 3가지 Type으로 나누게 된다.

한편, 현재까지 vWF를 생산하는 방법은 인간의 혈장추출물을 이용하여 치료약으로 사용하고 있다. 정상적인 사람의 경우 혈장내 vWF농도는 5-10㎍/ml로 소량 존재하며 정제를 위한 인간의 혈장양은 제한적이다. 그러나 본 연구에 의해 개발된 vWF유전자 도입 형질전환돼지를 이용할 경우 다량의 vWF를 쉽게 확보할 수 있어 매우 경제적이며, 질병으로 곤란을 겪는 사람을 치료하는데 큰 도움이 될 것으로 기대할 수 있다.

본 발명은 인간의 혈액응고인자인 vWF를 돼지의 젖으로 생산할 수 있도록 함으로써 고부가가치의 의료용 단백질을 가축을 통해 대량생산하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 이루기 위한 본 발명에서는 소의 게놈 DNA를 주형으로 하여 유선특이 발현을 조절하는 약 6.5kb의 bovine alpha-S1-Casein promoter를 PCR을 이용 크로닝 후, 인간의 혈관상피세포 cDNA로부터 크로닝한 약 8.5kb의 hvWF cDNA (Bonthron, D.; Orr, E. C.; Mitsock, L. M.; Ginsburg, D.; Handin, R. I.; Orkin, S. H. Nucleotide sequence of pre-pro-von Willebrand factor cDNA. Nucleic Acids Res. 14: 7125-7127, 1986)와 bGH poly A 유전자를 붙여 발현벡터를 구축하였다. 이를 pBluescript 벡터에 크로닝하여, 대장균을 이용하여 형질전환시킨 후, 이 벡터가 들어가 있는 콜로니로부터 대량의 플라스미드를 추출한 후, Not I 과 Sal I 제한효소로 절단하여 상기의 미세주입용 유전자를 제작하고 돼지의 1세포기 수정란의 전핵 내 미세주입에 사용하였다. 과배란 유도제 호르몬인 PMSG 및 hCG를 근육내 주사하여 과배란을 유기하였으며, hCG주입 후 약 54시간에, one cell 수정란을 회수하여 상기에서 나타낸 DNA를 manipulator를 이용 웅성전핵에 주입한 후, 발정동기화된 대리모에 이식하였다.

그리고, 유전자가 도입된 수정란을 이식 후 태어난 자돈의 꼬리조직으로부터 genomic DNA를 추출하여 인간의 vWF(Von Willebrand Factor;폰 빌레브란트 인자) DNA를 코드하는 DNA가 전이된 것을 확인하기 위해, 자체 디자인한 인간의 vWF유전자 증폭용 프라이머를 이용하여 PCR를 수행하였으며, 형질전환에 사용된 유전자를 재차 확인하기 위해 Southern분석을 수행하였다. 결과적으로 유전자가 도입된 형질전환된 돼지의 유즙을 회수하여 westhern bloting 방법으로 분석한 결과, 형질전환 된돼지의 유즙대 사람 vWF의 분비량이 같은 일령의 일반돼지나 정상적인 인간의 혈장내 vWF량에 비해 월등이 많이 존재하는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명은 사람 혈액응고인자(hvWF) 유전자를 이용하여 재조합 발현벡터를 구축하고, 구축된 유전자를 돼지의 1세포기 수정란 전핵에 미세주입하여 외과적 수정란 이식방법에 따라 이식 후 생산된 자돈에 대한 유전자 검정에 의해 사람 혈액응고인자(hvWF) 유전자가 형질전환된 돼지를 확인하고 유전자 검정된 형질전환돼지 유즙에서 인간의 vWF 단백질을 분비하는 형질전환돼지 생산 방법 및 그 내용에 관한 것으로 그 구체적인 실시예를 살펴보기로 한다.

< 실시예 1> 사람 혈액응고인자( hvWF ) 재조합 발현벡터 구축

먼저, 소(bovine)의 게놈 DNA를 주형으로 하여 유선조직 특이 발현을 조절하는 6.4kb의 bovine α-S1-casein promoter를 PCR을 이용하여 증폭하고 크로닝하였다.

그리고, 소(bovine) 유선 조직에서 genomic DNA 추출은 MagExtractor- Genome-(Toyobo NPK-101)키트를 이용하였으며, 소 유선 특이발현 프로모터(bovine α-S1-casein promoter)를 크로닝 하기 위해 bovine genomic DNA를 얻었고, gene bank에 보고된 염기서열 정보를 이용해서 promoter부위를 3개의 단편으로 증폭할 수 있는 primer를 고안했다. 이들을 이용하여 PCR방법으로 3개의 단편 DNA를 얻고, promoter내에 존재하는 단일 제한 효소인 Hind III, SphI을 이용하여 3개의 단편을 연결하였다.

상기 연결된 promoter를 제한 효소 및 sequencing으로 확인하였으며, 6.3kb의 bovine α-S1-casein promoter를 포함하는 pBluescript - α-S1-casein vector를 얻었다.

사람 혈액응고인자(hvWF)는 인간 태아 간 조직 유래 mRNA로부터 RT-PCT을 이용하여 얻기 위하여 설계한 프라이머 1은 forward 5'- CCT TGG AGA TAG CCG CAG -3', reverse 5'- TTT GCT GCG ATG AGA CAG GG -3', 프라이머 2는 forward 5'-TGC CCC TGT TAC TAT GAC GGT GAG-3', reverse 5'-TGA CAC CTG AGT GAG ACG AGG C-3'이며, 프라이머 3은 forward 5'-CTG GAC GTG ATC CTT CTC CTG G-3', reverse 5'-GCA GCA GCA GGC ACC CT-3'를 이용하고 PCR로 증폭하여 8.4kb의 유전자 단편을 얻어 pCR2.1 크로닝 벡터(Invitrogen)에 삽입하여 크로닝을 완료하였다(도 1 참조).

그리고, bovine α-S1-casein promoter와 bovine growth hormone polyadenylation signal sequence(bGHpA)사이에 vWF를 붙이는 과정을 수행하였다(도 2 참조).

pCR2.1-vWF는 EcoRI으로 자르고, Bluescript-α-S1-casein vector는 SacII로 절단 후 blunt ligation을 통해 연결하였다. 이렇게 구축된 재조합 유전자인 b-α-S1-casein-hvWF-bGHpA는 pCR2.1벡터에 삽입 후, 대장균(Ecoli: TOTO 10F:Invitrogen사)에 형질전환시켜, 이 벡터가 들어가 있는 콜로니로부터 대량의 플라스미드를 추출한 후, Not I과 Sal I 제한효소로 절단하여 상기의 미세주입용 유전자를 돼지 1세포기 수정란의 전핵 내 미세주입에 사용하였다.

< 실시예 2> 돼지 수정란의 채란 및 이식

Altrenogest를 발정주기 12일부터 14일 사이에 매일 두당 사료 2kg에 20mg을 혼합하여 9일간 급여하였으며 그후 과배란은 PMSG를 1000IU 근육주사한 후 72시간 이 경과되었을 때 750IU의 hCG를 근육주사하여 과배란을 실시한다.

hCG 투여후 매일 09시와 18시에 2회씩 육안적 관찰을 실시하여 점액의 유무, 음부의 상태 및 부동자세 등 발정 초기증상이 나타난 종빈돈에 한하여 성성숙된 수퇘지를 접촉시켜 최초 수퇘지 허용시 1회 자연교배를 실시하였으며 1회 자연교배 후 종빈돈은 개체사육을 실시하여 수술시까지 사료를 절식시키고 물은 자유채식할 수 있게 관리를 실시하며 종빈돈의 사료는 DE 3,300㎉ 및 CP 14%인 사료를 이용하고 기타 성분은 NRC 사양표준에 준하여 사양관리를 실시한다.

마취제로는 하이프노딜(JANSSEN, German) 7~8㎖를 돼지 귀의 정맥에 주입하여 1차 마취를 실시하고, 그 후 가연성 흡입마취제인 할로탄 가스(신성신약) 3~5%를 산소(600~1,000㎖/분)순환 시스템에 연결하여 마취상태를 유지시키면서 공란돈의 난관은 자궁-난관접합부에 18gage주사바늘을 이용하여 1회용 주사기로 1% BSA(Sigma, USA)와 항생제를 혼합한 25㎖의 PBS(DifcoㆍLabaratories, USA)를 이용 난관 관류시킴으로써 난자를 회수한다.

관류된 액체는 멸균시험튜브에 수집하여 실온에서 난자를 회수하여 검란 을 실시하며 1세포기 난자를 이용한다. 회수된 1세포기 수정란은 약 15,000rpm으로 5분간 원심분리 함으로써 수정란의 전핵을 관찰할 수 있게 한 후 즉시 미세주입장치가 부착된 현미경하에서 약 4-7ng/㎕의 유전자를 돼지 수정란의 전핵에 미세주입 한다. 다음으로 돼지의 수정란을 이식하여 산자를 생산할 목적으로 외과적인 방법에 의해서 수정란 이식을 실시한다.

먼저 호르몬 처리에 의해서 발정이 동기화된 수란돈 또는 자연적으로 발정주 기가 동기화된 수란돈을 전신마취를 실시한다. 마취된 수란돈의 정중선을 중심으로 광범위하게 면도기를 이용하여 털을 제거하고 소독을 실시 한 다음 정중선을 약 10~15cm를 절개하여 생식기를 노출시킨다. 난소표면의 황체의 존재를 확인한 후, 수정란 20~50개가 함유된 배양액의 채워진 polycatether (Cook, Austraila)를 난관 팽대부에 넣고, 수정란이 함유된 배양액을 주입하여 이식을 실시한다. 이식이 완료된 자궁은 복강내로 밀어넣은 다음, Sodium chondroitin sulfate 1%가 함유된 생리식염수를 뿌려줌으로서 생식기의 건조 및 장간흡착을 방지하여야 한다. 그리고 절개부위를 봉합한 뒤 항생제를 투여한 후, 보온이 잘되는 돈방에서 마취가 깰 때까지 보호를 하여야 한다.

< 실시예 3> 분만자돈 돼지꼬리로부터 게놈 DNA 추출 및 PCR 검정

재조합 발현벡터가 도입된 돼지 1세포기 수정란이 이식된 대리모로부터 112~116일후 분만된 신생 자돈의 꼬리조직에서 게놈 DNA를 추출하고 사람 혈액응고인자(hvWF) 유전자를 코드하는 DNA가 전이된 것을 PCR 방법을 통하여 확인하였고, 도 3의 PCR 검정결과로 나타내었으며, hvWF 유전자 증폭에 사용된 프라이머 염기서열은 하기의 표 1 및 서열목록 3 내지 10과 같다.

프라이머	염기서열	증폭크기
BVWFF-1 BVWFR-1	5'-GGGTCACAAAGAACTGGACACGAC-3' 5'-CAAGATACACGGAGAGGCTCACTC-3'	981 bp
BVWFF-2 BVWFR-2	5'-GCAGTATGTCAAGGTGGGAAGC-3' 5'-CAAACAACAGATGGCTGGCAAC-3'	376 bp
vWFF-3 vWFR-3	5'-AAA ACg TgC CAg AAC TAT gAC-3' 5'-TTC TCC Tgg TAT gTC TgC TTC-3'	605 bp
vWFF-4 vWFR-4	5'-TCC CAg CTT CTT ATT TTg ATg-3' 5'-Tgg AgT gAA TgT gAA gAT gTg-3'	1085 bp

이에 사용된 PCR 반응액 제조는 총량 25㎕로 하였으며, 템플레이트 DNA는 25~100ng을 사용하였으며 프라이머는 각 10pmole 농도를 사용하였고 Taq 중합효소량은 1unit를 첨가하였다.

또한 PCR 수행 조건은 전처리를 95℃에서 5분간 수행한 후 본 처리를 하였다.

본 처리는 총 30회 반복하였으며 98℃에서 20초, 58℃에서 30초 그리고 72℃에서 1분간 수행하였다. 이의 PCR 수행으로 얻어진 증폭산물은 2.5% 아가로즈겔(05.X TBE 전기영동용 버퍼)을 이용하여 전기영동 후 유전자 삽입 유무를 검정하게 된다.

< 실시예 4> 형질전환돼지 혈액응고인자( hvWF ) 단백질 함유검정

일반돼지와 형질전환돼지의 유즙을 회수하여 유즙내 hvWF 농도를 확인하기 위하여 Elisa(american diagnostica)방법으로 분석한 결과를 도 5에 나타내었다.

일반돼지와 형질전환돼지의 유즙은 분만 후 약 40일간 분비된 유즙을 곧바로 회수하여 -80℃에 냉동 저장하였다가 Elisa 측정을 위하여 4℃에서 서서히 녹인 후 사용된 Elisa(american diagnostica) 키트의 설명서에 나타난 것과 동일한 과정을 거쳐 돼지 유즙내 사람 혈액응고인자(hwWF) 농도를 측정하였다.

그 결과 일반돼지의 유즙내에는 거의 검출되지 않았으나 형질전환돼지의 유즙에서는 hvWF의 농도가 약 280㎍/ml로 나타났다. 이는 건강한 성인의 혈장내 hvWF 농도가 5-10㎍/ml이라는 보고와 비교하여 볼 때 형질전환돼지 유즙내 사람 혈액응고인자(hvWF)의 농도가 월등이 높다고 판단할 수 있었으며 이러한 결과를 토대로 돼지 유즙으로 사람 혈액응고인자(hvWF)를 분비하는 형질전환돼지가 생산되었음을 도 4 및 도 5를 통해 최종 확인할 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명은, 소 유선특이 발현 프로모터(bovine α-S1-casein promoter)를 이용하여 사람 혈액응고인자(hvWF)를 돼지 유즙으로 분비할 수 있도록 형질전환용 재조합 발현벡터를 구축하는 방법 및 재조합체의 확보를 통하여 재조합 유전자 구축 기법이 확립되었음을 확인할 수 있다.

또한 이를 이용하여 돼지 형질전환돼지를 생산하고 이러한 형질전환돼지 유즙에서 사람 혈액응고인자(hvWF) 분비를 확인함으로써 형질전환 동물을 이용한 사람의 치료용 의약품 원료로 이용될 수 있는 생물의약품 원료 생산 방법의 기틀이 확립될 수 있는 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (3)

1. 서열목록 1의 염기서열을 가지며, 제한효소 사이트 Not I와 Sal I를 갖고 있는 소의 유선에서 유래한 alpha-S1-casein 프로모터와 bGH(Bovine Growth Hormone; 소 성장 호르몬) Poly A의 중간에 인간의 vWF(Von Willebrand Factor;폰 빌레브란트 인자) 유전자를 결합시켜 구축된, 인간 혈액응고인자를 생산하기 위한 재조합 발현벡터.
2. 상기 청구항 1의 발현벡터가 도입된 형질전환돼지의 genomic DNA내에서 vWF(Von Willebrand Factor;폰 빌레브란트 인자) 유전자의 도입여부를 확인할 수 있는 서열목록 3 내지 10의 프라이머 염기서열.
3. 청구항 1의 발현벡터가 도입되어 유즙으로 인간 혈액응고인자 vWF를 분비하는 형질전환 돼지.

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