JP2003520035A - 乳汁中にヒト顆粒球コロニー刺激因子を産生する形質転換ヤギ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 形質転換ヤギはヤギβ−カゼインプロモーターをコードするヌクレオチド配列とヒト顆粒球コロニー刺激因子(hＧ−ＣＳＦ)遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物が導入されたヤギの受精卵から発育させ、生物学的活性を有する高濃度のhＧ−ＣＳＦを含む乳汁を産生する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は、哺乳動物の乳腺組織で特異的にヒト顆粒球コロニー刺激因子(hＧ−
ＣＳＦ)を発現する遺伝子(nucleic acid:核酸)構築物(construct)を含むヤギ(go
at)の受精卵(zygote:接合体)およびhＧ−ＣＳＦを含む乳汁を産生する形質転換
ヤギに関する。

【０００２】 背景技術 ヒト顆粒球コロニー刺激因子(hＧ−ＣＳＦ)は生理活性糖タンパク質であって
、細菌の侵入または抗癌治療などの外部刺激によって発現が増加し、顆粒球また
はマクロファージのような造血幹細胞の成長および分化を促進する反面、正常の
ヒトの血液中でのその濃度は非常に低い。

【０００３】 ヒトＧ−ＣＳＦを人体から得ることは容易でないため、現在まで大腸菌または
動物細胞を用いてhＧ−ＣＳＦを調製する研究が多く試みられた。しかし、大腸
菌を用いて生産されたhＧ−ＣＳＦはインビボ活性が一定でなく、安全性にも問
題があり、また、大腸菌を用いる方法は高価な装置と複雑な精製操作が要求され
るため不経済であり、動物細胞を用いる方法もまた同様の問題がある。

【０００４】 したがって、生物学的活性を有するhＧ−ＣＳＦを経済的に産生する方法が切
実に求められている。最近、形質転換されたウシ、ヤギまたはブタなどの動物を
生体反応器として用いて生理活性タンパク質、ラクトペリンおよびコラーゲンを
成功裡に生産したことが報告されている(US Patent Nos. 5,633,076, 5,849,992
および5,895, 833)。この方法によって生産されたタンパク質は生体内で生産さ
れた天然型タンパク質と同じであるが、大腸菌または動物細胞を用いる従来方法
での生産単価を１,０００〜２,０００分の１の水準に低減させることができるた
め非常に経済的である。一方、国際特許公開第９７／１９５８９号には形質転換
矮小ヤギ(dwarf goat)の製造方法が開示されているが、この矮小ヤギから生理活
性タンパク質が実質的に産生されることは実証されていない。

【０００５】 本発明者らは、韓国特許出願第１９９７−９６０１号(公開番号第１９９８−
７３９９１号)に記載されている乳腺組織特異的発現系を用いて形質転換ヤギの
乳汁にヒトＧ−ＣＳＦを分泌させて生産する方法を開発した。

【０００６】 発明の要約 したがって、本発明の目的は、哺乳動物乳腺組織特異的にヒト顆粒球コロニー
刺激因子(hＧ−ＣＳＦ)を発現する遺伝子構築物が導入されたヤギの受精卵を提
供することである。

【０００７】 本発明の他の目的は下記のものを含む： 前記ヤギの受精卵を調製する方法； 前記遺伝子構築物が導入される受精卵をヤギから採卵する方法； 乳汁中にhＧ−ＣＳＦを分泌する形質転換ヤギ； 前記ヤギの受精卵から形質転換ヤギを生産する方法； 前記形質転換ヤギを用いてhＧ−ＣＳＦを調製する方法； 前記形質転換ヤギから産生されたhＧ−ＣＳＦを含有する乳汁組成物；および 前記方法によって調製されたhＧ−ＣＳＦを含む医薬組成物。

【０００８】 本発明の一実施態様に従って、ヤギβ−カゼインプロモーターをコードするヌ
クレオチド配列およびヒト顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)をコードするヌ
クレオチド配列を含む遺伝子構築物が導入されたヤギの受精卵が提供される。

【０００９】 また、本発明の他の実施態様は下記のものを含む： ヤギの受精卵雄性前核に前記遺伝子構築物を微量注入する段階を含む、ヤギの
受精卵の調製方法；

【００１０】 雌ヤギにノルジェストメットおよびエストラジオールを投与し、ノルジェスト
メットを含有するインプラントを挿入した後取除いて雌ヤギを発情同期化させる
段階；妊娠性雌血清ゴナドトロピン(ＰＭＳＧ)および卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)
の混合服用量、卵胞刺激ホルモンの単独服用量、ＦＳＨおよびヒト絨毛性ゴナド
トロピン(ｈＣＧ)の混合服用量を所定の間隔で連続的に投与することを特徴とす
る雌ヤギを過排卵誘起させる段階；過排卵誘起された雌ヤギを雄と交尾させる段
階；および交尾した雌ヤギから受精卵を回収する段階を含む、ヤギの受精卵の採
卵方法；

【００１１】 前記受精卵から発育させた、乳汁中にヒト顆粒球コロニー刺激因子を分泌する
形質転換ヤギ；

【００１２】 前記受精卵を雌ヤギに移植し、分娩まで発育させる段階を含む、前記形質転換
ヤギの生産方法；

【００１３】 前記形質転換ヤギから乳汁を生産した後これからhＧ−ＣＳＦを回収する段階
を含む、ヒト顆粒球コロニー刺激因子の調製方法；

【００１４】 前記形質転換ヤギから生産されたhＧ−ＣＳＦを含有する乳汁組成物；

【００１５】 前記形質転換ヤギから生産されたhＧ−ＣＳＦ；および hＧ−ＣＳＦおよび薬剤学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。

【００１６】 発明の詳細な説明 本発明に係る形質転換ヤギ受精卵の製造に用いられた遺伝子構築物はヤギβ−
カゼインプロモーターをコードするヌクレオチド配列およびhＧ−ＣＳＦをコー
ドするヌクレオチド配列を含む。hＧ−ＣＳＦの発現は哺乳動物の乳腺組織で特
異的に活性化されるヤギβ−カゼインプロモーターによって調節される。hＧ−
ＣＳＦ遺伝子およびヤギβ−カゼインプロモーター遺伝子は各々Genbankに寄託
番号X03656およびM90559として記載されており、各々ヒトおよびヤギ組織から得
られるか、通常のＤＮＡ合成方法によって合成され得る。遺伝子構築物は通常の
方法に従って製作できる(Sambrook, J. et al., Molecular cloning: a laborat
ory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, (1989
))。ヤギβ−カゼインプロモーターおよびhＧ−ＣＳＦ遺伝子とともに、前記遺
伝子構築物はさらに転写終結部位を含む。例えば、遺伝子構築物として配列番号
：１の発現カセットpＧbc−hＧＣＳＦが提供されるが、ここでヤギβ−カゼイン
プロモーターは、ヤギβ−カゼインプロモーターからヤギβ−カゼイン遺伝子の
エクソンＩの翻訳開始コドンの直前までのヌクレオチド配列を有し、その下流に
位置するhＧ−ＣＳＦ遺伝子の発現を調節する。

【００１７】 本発明の形質転換ヤギ受精卵はヤギの無処置１−細胞期の受精卵に前記遺伝子
構築物を微量注入することにより製造できる。微量注入は通常の方法に従ってマ
イクロマニピュレータ(micromanipulator)付きの倒立顕微鏡で行うことができる
(Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, New York,(1994))。本発明の受精卵の一例として、
Capra hircus aegarus embryos/pGbc-bGCSFが提供されるが、前記受精卵は韓国
の在来種であるCapra hircus aegarusに由来し、発現カセットpＧbc−hＧＣＳＦ
を含む。前記形質転換受精卵は特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブ
ダペスト条約の規定により、１９９９年１２月２８日付で韓国生命工学研究所遺
伝子銀行(Korean Collection for Type Cultures(KCTC)；住所：大韓民国大田廣
域市儒城區魚隠洞５２番地韓国生命工学研究所(Korea Research Institute of B
ioscience and Biotechnology(KRIBB))に寄託番号第ＫＣＴＣ ０７１８ＢＰ号
として寄託された。しかし、前記受精卵は本発明の形質転換受精卵を限定するも
のではない。

【００１８】 前記微量注入に用いられる１−細胞期の受精卵は雌ヤギを発情同期化および過
排卵誘起させ、雄ヤギと交尾させた後交尾した雌ヤギから受精卵を回収する段階
によって調製できる。

【００１９】 好ましくは、雌ヤギの発情同期化および過排卵誘起段階は図１に示すスケジュ
ールに従って行い得る：発情同期化段階は、一方ではノルジェストメットおよび
エストラジオールを適量筋肉注射し、他方では適量のノルジェストメットを含有
するインプラントを耳などに挿入した後１３〜１４日目にインプラントを除去し
て行われ；過排卵誘起段階は、ＰＭＳＧ、卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)およびヒト
絨毛性ゴナドトロピン(ｈＣＧ)をインプラント除去６０時間前から１２時間間隔
で８回注射投与して行われる。注射投与スケジュールとしては１回目にはＰＭＳ
ＧおよびＦＳＨを、２回〜７回目にはＦＳＨを、８回目にはＦＳＨおよびｈＣＧ
を適量各々投与することを含む。特に、８回目にＦＳＨとともに投与されるｈＣ
Ｇは排卵を効果的に誘起させるだけでなく排卵時期も調節する。前記方法は特に
Capra hircus aegagrusの受精卵を得るのに好ましい。

【００２０】 交尾および回収段階は通常の方法に従って行うことができる。過排卵誘起され
た雌ヤギを雄ヤギと自然交尾させた後、インプラント除去後７２〜７６時間が経
過したときに２４時間絶食させたヤギにキシラジン(Xylazine)、リドカイン(lid
ocaine)などの麻酔剤を注射した後あおむけにし、腹中部線を局部麻酔した後切
開して卵巣、卵管および子宮を切取った後カテーテル(catheter)を卵管漏斗部の
内側に挿入し、カテーテルを通じてウシ胎児血清が含まれたリン酸塩緩衝溶液(
ＰＢＳ)を卵管側に逆貫流させて受精卵を回収する。

【００２１】 本発明の形質転換ヤギ受精卵は通常の方法に従って雌ヤギ(レシピエント)に移
植して成体に成長させることができる。移植段階はレシピエントヤギを２４時間
絶食させた後腹中部線を局部麻酔し、切開して卵巣、卵管および子宮を切取った
後、受精卵が卵管に移植されるように形質転換受精卵が微量注入されたカテーテ
ルを卵管漏斗部に挿入して行われる。本発明に使用され得るレシピエントヤギと
しては、自然的に発情した雌ヤギまたはＰＭＳＧのようなホルモンによって発情
が誘導された雌ヤギから選ばれ、自然発情した雌ヤギが好ましい。レシピエント
ヤギ１匹当たり移植される受精卵の数は２〜４個が好ましい。レシピエントヤギ
が妊娠したか否かは移植後４０日が経ったとき超音波診断装置を用いて確認でき
る。移植された形質転換受精卵はその生殖細胞と体細胞が前記遺伝子構築物を含
み、形質転換ヤギを生むことができる形質転換ヤギを得るために一定期間成長さ
せる。

【００２２】 形質転換されたヤギに本発明の遺伝子構築物が存在するか否かはゲノムＤＮＡ
に対するポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、サザーンブロットなどの通常の方法に
従って確認できる。さらに、形質転換されたヤギにhＧ−ＣＳＦが発現したか否
かは乳汁タンパク質に対するウェスタンブロットと酵素結合免疫吸着検定法(Ｅ
ＬＩＳＡ)などの通常の方法に従って確認できる。

【００２３】 このようにして得られた形質転換ヤギは哺乳動物の乳腺組織で特異的にhＧ−
ＣＳＦを生産し、乳汁に含まれた形でhＧ−ＣＳＦを分泌する。したがって、こ
のように生産されたhＧ−ＣＳＦは生体内活性をそのまま保持し、顆粒球および
マクロファージの成長および分化を促進する。また、hＧ−ＣＳＦが骨髄移植、
悪性リンパ腫、急性白血病、肺癌、卵巣癌、睾丸腫瘍、骨髄異形成症候群、再生
不良性貧血および先天性好中球減少症などの疾患の予防および治療効果を有する
ということは既に公知である。したがって、本発明によって生産されたhＧ−Ｃ
ＳＦは医薬組成物として有用である。

【００２４】 医薬製剤は、通常の方法に従って製造することができる。製剤の製造において
、活性成分を担体とともに混合または希釈するか、カプセル、におい袋(sachet)
またはその他容器形態の担体に封入することが好ましい。担体が希釈剤として働
く場合には、活性成分に対するビヒクル、賦形剤または媒質として作用する固体
、半固体または液状物質であり得る。したがって、製剤は、錠剤、丸剤、粉末、
におい袋、エリキシル、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、エーロゾル、
軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末などの形態であり得
る。

【００２５】 適切な担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース
、スクロース、ソルビトール、マンニトール、スターチ、アカシアゴム、アルギ
ン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチル
セルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香
酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムお
よび鉱物油などを挙げることができる。製剤は、充填剤、抗凝集剤、滑沢剤、湿
潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含むことができる。本発明の組成物は
、哺乳動物に投与された後、活性成分の即時、持続または遅延放出を提供するた
めに当業界で公知の方法を用いて製剤化することができる。

【００２６】 さらに、本発明の医薬組成物は、経口、経皮、皮下、静脈または筋肉内投与を
含む種々の経路を通じて投与され得る。ヒトの場合、hＧ−ＣＳＦの通常の１日
投与量は７５〜６００mg／ｋｇ体重であり、好ましくは１００〜４００mg/ｋｇ
体重の範囲であり、１回または数回に分けて投与し得る。

【００２７】 しかし、活性成分の実際の投与量は治療する疾患、選択された投与経路、患者
の年齢、性別および体重、および患者の症状を含む種々の関連因子を考慮して決
定され、したがって、前記投与量は本発明の範囲を制限するものではない。

【００２８】 以下、下記実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら
に限定されない。

【００２９】 実施例１：ベクターpＧbc−hＧＣＳＦの製作 韓国の在来種ヤギ(Capra hircus aegagrus)に由来するプロモーターからエク
ソンＩまでの範囲のβ−カゼイン遺伝子部位を含むプラスミドpＧbc−Ｓ(韓国特
許公開第９８−７３９９１号)を制限酵素ＨindIIIで切断した後、フェノールと
クロロホルムの混合溶液(１：１(ｖ／ｖ))でＤＮＡを抽出し、９５％エタノール
で沈殿させ、蒸留水に溶解させてヤギβ−カゼイン遺伝子のプロモーターからエ
クソンＩ部位を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＤraIで切断
した後１％アガロースゲルで電気泳動させた。アガロースゲルから１,２３９ｂ
ｐ断片のバンドを切取った後ジーンクリーンIIキット(Geneclean II kit, BIO10
1, USA)を用いて分離精製してＤＮＡ断片１を得た。

【００３０】 ヤギ(Capra hircus aegagrus)のゲノムＤＮＡに対してプライマーＣＡＳ−Ｆ
１(配列番号：１)とＣＡＳ−Ｒ１(配列番号：２)を用いてＰＣＲを行った後ＰＣ
Ｒ産物を制限酵素ＤraIとＨindIIIで切断し、電気的に抽出してＤＮＡ断片２を
得た。

【００３１】 ＤＮＡ断片１と２を制限酵素ＳalIとＨindIIIおよびウシアルカリホスファタ
ーゼで処理して開環したプラスミドpＢluescript II(Stratagene, USA)に挿入し
た。得られたプラスミドのＨindIIIとＥcoＲＩ切断部位に、hＧ−ＣＳＦ遺伝子
とその下流にウシ成長ホルモン転写終結部位を含むＤＮＡ断片pＲc/ＲＳＶ(Invi
trogen, Netherlands)を挿入してベクターpＧbc−hＧＣＳＦを得た。

【００３２】 ベクターpＧbc−hＧＣＳＦを制限酵素ＢssＨIIとＫpnＩで切断した後アガロー
スゲルに電気泳動させ、ジーンクリーンIIキット(Bio101)を用いて抽出した後エ
ルチップ−ディー(Elutip-d, Schleicher & Schuel, Germany)を用いて精製し、
透析溶液(10 mm Tris-Cl (pH 7.2)および0.1 mm EDTA)中で透析した後０.２２μ
mろ紙(Nalgene, USA)で濾過および精製して発現カセットpＧbc−hＧＣＳＦを得
た。このように得られた発現カセットに透析溶液を加えて最終濃度４μg／mlに
なるように稀釈した。

【００３３】 実施例２：ヤギの受精卵の回収 図１に示すスケジュールに従って、１〜３年齢の雌ヤギ(韓国在来種(Capra hi
rcus aegagrus)、公州サビソン牧場から入手)にノルジェストメット３.０mgおよ
びエストラジオール５.０mgを含む胡麻油２mlを筋肉注射した。ヤギの耳の毛を
取除き、消毒した後この部位の皮下層にインプラントシンクロメート−Ｂ(Syncr
omate-B, Sanofi Animal Health,米国)を注入器(Syncromate-B Gun, PETS社、米
国)を用いて挿入し、１３または１４日経過後、外科的に取除いて発情同期化さ
せた。

【００３４】 また、図１に示すスケジュールに従い、ＦＳＨ(Ovagen, Immuno-Chemical Pro
ducts, New Zealand)５.６mgを耳インプラント除去６０時間前から１２時間間隔
で８回に分けて注射して投与した。この際の注射スケジュールとして、１回目に
はＦＳＨ ０.７mgとさらにＰＭＳＧ(Pregnecol, Horizon Technology, Austral
ia)１５０ＩＵ、２回〜７回目にはＦＳＨ ０.７mgずつ、そして８回目にはＦＳ
Ｈ ０.７mgとさらにhＣＧ(Sigma, USA)１００ＩＵを各々投与した。その後過排
卵誘起された雌ヤギ(Capra hircus aegagrus)を１２時間雄ヤギと自然交尾させ
た。

【００３５】 耳インプラントの除去７２〜７６時間経過後、２４時間絶食させた雌ヤギに２
％キシラジン(Rompun, Bayer, Korea)溶液を筋肉注射し、あおむけにした。次い
で、２％リドカイン１０mlを補正されたヤギの腹部の正中線に注射して局部麻酔
した後腹部の正中線４〜６cmを切開し、卵巣、卵管および子宮を切取った。内径
１.０mmのポリエチレンチューブであるカテーテル(catheter)を卵管漏斗部の内
側に挿入して固定し、１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)が含まれたＰＢＳを子宮から
卵管側に逆貫流させて受精卵を回収した。得られたヤギの受精卵を微量注入前ま
で修正合成卵管液(m−ＳＯＦ, Takahashi Y. et al., Theriogenology 37, 963-
978, 1992)に保管した。

【００３６】 試験例１：ＦＳＨとｈＣＧの併用投与が過排卵誘起および受精卵の回収時期に
及ぼす影響 (１)ＦＳＨとｈＣＧの併用投与がヤギの過排卵誘起に及ぼす影響 ＦＳＨとｈＣＧの併用投与が韓国在来種ヤギの過排卵誘起に及ぼす影響を調査
するために、８回目にｈＣＧなしにＦＳＨ ０.７mgを投与したことを除いては
、同様の方法で準備された対照群と一緒に実施例２の手順を繰り返した。インプ
ラント除去７０〜７６時間経過後の排卵誘起率(総ヤギのうち排卵されたヤギの
比率)、排卵点(排卵されたヤギ一匹当たりの平均排卵卵胞の数)、回収率(排卵卵
胞の数に対する回収された卵子の数)および受精率(回収された卵子のうち前核が
観察された受精卵の比率)を調査した。

【００３７】 その結果を下記表１に示す。

【表１】 ＦＳＨとｈＣＧの併用投与が過排卵に及ぼす影響 ^ａ,ｂ 統計的な有意性を示す(ｐ＜０.０５)

【００３８】 表１から分かるように、ｈＣＧとＦＳＨの併用投与群の排卵誘起率(１００％)
はＦＳＨ単独投与群(３６.４％)より非常に高かったが、このような結果はＦＳ
ＨとｈＣＧの併用投与が排卵を誘導するのに非常に効果的であることを示す。こ
れに対し、ＦＳＨとｈＣＧの併用投与群とＦＳＨ単独投与群において同じような
受精率が観察されたが、このような結果はｈＣＧが受精率に悪い影響を及ぼさな
いことを示す。したがって、ｈＣＧは受精を妨げず、かつ排卵誘起率を高めるの
に効果的に利用できることが分かる。

【００３９】 他品種の山ヤギにおいては、ＦＳＨの単独投与のみでも排卵を効果的に誘導で
きる(Selgrath J. P. et al., Theriogenology 34, 1195-1205, 1990; Ebert, K
. M. et al., Bio/Technology 12, 699-702, 1994;およびGootwine, E. et al.,
Theriogenology 48, 485-499, 1997)ことが知られているが、これとは異なり、
ＦＳＨによる韓国在来種ヤギの排卵誘起率は３６.４％にとどまった。韓国在来
種ヤギのみから観察されるｈＣＧとＦＳＨの併用投与によって増大した過排卵は
韓国在来種ヤギの遺伝的な生理的特異性に起因するとみられる。

【００４０】 (２)ＦＳＨとｈＣＧの併用投与時受精卵回収の最適時期の決定 微量注入に適切な前核(pronuclei)を有する１−細胞期受精卵を回収する最適
時期を決定するために、耳インプラントを除去６２〜６８時間後、７０〜７６時
間および７８〜８４時間と様々に変えて採卵したことを除いては実施例２の手順
を繰り返した。受精卵の発達段階を解剖顕微鏡で観察して調査した。

【００４１】 その結果を下記表２に示す。

【表２】 ＦＳＨとｈＣＧの併用投与群における回収時期による受精卵の発達段階 註)^c ：インプラント除去後経過時間

【００４２】 表２から分かるように、耳のインプラント除去後６２〜６８時間が経過したと
き採卵した受精卵はすべて１−細胞期であり、受精率は３０％と非常に低かった
。７０〜７６時間が経過したとき採卵した受精卵は２−細胞期および４−細胞期
の受精卵が形成されたにもかかわらず、受精率が遥かに高かった(７０％)。７０
〜７６時間に採卵した受精卵は遥かに少ない１−細胞期の受精卵を含んでいた。

【００４３】 したがって、微量注入に適した１−細胞期の受精卵を得るためには、耳インプ
ラントを取除いた後７０〜７６時間が経過したとき受精卵を採卵することが効果
的であることが分かる。

【００４４】 実施例３：発現カセットのヤギ受精卵への微量注入 実施例２で得られた受精卵を１２,０００rpmで７分間遠心分離して１−細胞期
受精卵の前核が可視化されるようにした。マイクロマニピュレータ(Leitz, Germ
any)付きの倒立顕微鏡(DIC Inverted microscope, Leitz, Germany)の下で１−
細胞期受精卵の前核に実施例１で得られた発現カセットpＧbc−hＧＣＳＦ ＤＮ
Ａ４μg／mlを含む溶液の約１〜２plを微量注入した。微量注入時ｐＨの変化を
減らすため、TL-HEPES培養液(Hagen, D. R., J. Anim. Sci. 69, 1147-1150, 19
91)を用いた。微量注入された受精卵は移植前までm−ＳＯＦ培養液で３７℃、５
％ ＣＯ_２の条件下で培養した。微量注入後破裂せずに生存した１−細胞期の正
常の受精卵を選別した。

【００４５】 選別された受精卵をCapra hircus aegagrus embryos/pGbc-bGCSFと命名し、韓
国生命工学研究所遺伝子銀行(住所：大韓民国大田廣域市儒城區魚隠洞５２番地
韓国生命工学研究所(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnol
ogy(KRIBB))に１９９９年１２月２８日付で寄託番号第KCTC 0718BP号として寄託
した。

【００４６】 実施例４：微量注入された受精卵のレシピエントヤギへの外科的移植 自然発情した１〜３年齢のレシピエントヤギ(Capra hircus aegagrus)を２４
時間絶食させた後各レシピエント腹部の正中線を局部麻酔し、切開して卵巣、卵
管および子宮を切取った。前記卵管に実施例３で得られた１〜４−細胞期の受精
卵を滅菌された内径０.５mm、外径０.８mmおよび長さ２０cmのポリエチレンチュ
ーブ、カテーテルを用いて卵管漏斗部を通じて移植した。レシピエントヤギ１匹
当たり受精卵２〜４個を移植した。移植後３０日が経過したときレシピエントヤ
ギが妊娠したか否かを超音波診断装置(Sonorex, Medison, Korea)を用いて調査
した。受精卵は成熟させてヤギの産子２５匹を得た。

【００４７】 試験例２：自然発情レシピエントとホルモン誘導レシピエントにおける妊娠率
と産子生産率の比較 実施例３で得られた、遺伝子が微量注入された受精卵を実施例４と同様の方法
を繰り返して自然発情レシピエントおよびホルモン誘導レシピエントに各々移植
した。この際、ホルモン誘導レシピエントは実施例２と同様の方法で行って発情
同期化させ、耳のインプラント除去後４８時間が経過したときのホルモンの反応
状態によってＰＭＳＦ４００〜６００ＩＵを筋肉注射して得た。各レシピエント
妊娠率および産子生産率を調査した。その結果を下記表３に示す。

【００４８】

【表３】 遺伝子が微量注入された受精卵の移植後妊娠および産子生産率

【００４９】 表３から分かるように、自然発情群のヤギの平均排卵点はホルモン処理群の場
合より低かったが、自然発情群の妊娠率はホルモン処理群の場合より高かった。

【００５０】 実施例５：形質転換ヤギの確認 (１)ゲノムＤＮＡの分離 前記実施例４から得られた１０〜３０日齢のヤギ産子の耳から直径約０.５cm
サイズの組織を切取って１５ml試験管に移し、これにライシス溶液４ml(10 mm T
ris-Cl (pH 8.0)、0.1 mm EDTAおよび0.5% SDS)を加えた。前記混合物を５５℃
の恒温槽に約１６時間入れて組織を溶解させた。

【００５１】 溶解させた組織細胞を公知の方法(Sambrook, J. et al., Molecular cloning:
a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harber Laboratory Press, New Y
ork, 1989)に従ってフェノールとエタノールで順次処理して純水ゲノムＤＮＡを
分離精製した。精製されたＤＮＡを蒸留水に溶解させて最終濃度０.５μg／μl
になるようにした。

【００５２】 (２)ＰＣＲ (１)で得られた産子のゲノムＤＮＡ溶液１μlに対してプライマーＧＢ２(配列
番号：３)とＧＣＳＦ２(配列番号：４)またはプライマーＧＢ２(配列番号：３)
とＧＣＳＦ３(配列番号：５)を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は９４℃で４
分間処理してゲノムＤＮＡを変性させた後、９４℃で１分間、５５℃で１分およ
び７２℃で１分の過程を３０回繰り返した。このようにして得られたＰＣＲ産物
を６％ポリアクリルアミド配列分析ゲルに電気泳動させ、自動Ｘ線撮影(autorad
iography)を行った。用いられたプライマーＧＢ２(配列番号：３)はβ−カゼイ
ン遺伝子のセンス鎖の５'−末端部位(１,６２１〜１,６４０番)に該当するヌク
レオチド配列を有し、プライマＧＣＳＦ２およびＧＣＳＦ３(配列番号：４およ
び５)は各々hＧ−ＣＳＦのセンス鎖の３'−末端部位(各々５１１〜５３０および
６８１〜６９８番)に相補的なヌクレオチド配列を有する。

【００５３】 ＰＣＲ産物をアガロースゲルに電気泳動させ、その結果を図２に示す。図２に
おいて、第１列〜第７列は各々ヤギの産子の場合であり、(−)列は正常のヤギの
場合であり、(＋)列は正常のヤギのゲノムＤＮＡとプラスミドpＧbc−hＧＣＳＦ
を混合した場合である。図２から分かるように、第６列においては、プライマー
ＧＢ２とＧＣＳＦ２(配列番号：４と５)を用いてＰＣＲを行うことにより得られ
た４８０ｂｐのバンドと、プライマーＧＢ２とＧＣＳＦ３ (配列番号：４と６)
を用いてＰＣＲを行うことにより得られた５４０ｂｐのバンドをすべて観察でき
た。このような結果から、第６列のヤギの産子は発現カセットpＧbc−hＧＣＳＦ
が挿入された形質転換ヤギであることを確認できる。

【００５４】 (３)サザーンブロット分析 (１)で得られた産子のゲノムＤＮＡ １０μgを制限酵素ＨindIIIで切断し、
０.８％アガロースゲルで電気泳動させた後Sambrookらの方法(Sambrook, J. et
al.)に従ってナイロン膜に転移させた。ＤＮＡが吸着されたナイロン膜を前ハイ
ブリッド溶液(6 x SSC, 5x Denhardt's reagent, 0.5 % SDS)中で６８℃で２時
間処理した後、hＧ−ＣＳＦ遺伝子を制限酵素ＨindIIIとＮaeＩで切断して得た
断片に対して[α-³²P]dＣＴＰを用いて無作為プライミング(random priming)方
法で製作した^３２Ｐ−標識hＧ−ＣＳＦプローブを用いてハイブリダイズさせた
。

【００５５】 反応終了後ナイロン膜を２ｘＳＳＣ／０.１ ＳＤＳ溶液で室温で連続洗浄し
、同じ溶液で６５℃で１０分間洗浄した後さらに１ｘＳＳＣ／０.０１％ ＳＤ
Ｓ溶液で６５℃で１０分間洗浄した。前記ナイロン膜上にＸ線フィルムを載せ、
−７０℃で３日間感光させた後現像した。

【００５６】 その結果を図３に示す。図３において、第１例〜第７列は各々ヤギの産子のゲ
ノムＤＮＡを示し、(−)列は正常のヤギの場合であり、(＋)列は正常のヤギのゲ
ノムＤＮＡとプラスミドpＧbc−hＧＣＳＦを混合した場合である。図３の結果か
ら、第６列のヤギの産子は発現カセットpＧbc−hＧＣＳＦが挿入された形質転換
ヤギであることが分かる。

【００５７】 このような方法を繰り返して、ヤギの産子２５匹のうち２匹がヒトＧ−ＣＳＦ
に形質転換されたヤギであることを確認した。

【００５８】 実施例６：形質転換ヤギの乳汁中に含まれたヒトＧ−ＣＳＦのウェスタンブロ
ット分析 実施例５で得られた形質転換ヤギが産子を出産した後２日(初乳)および５日に
乳汁を採取した。得られた乳汁に同一容積の１ｘＰＢＳを加え、４℃で１時間放
置した後１３,０００rpmで１５分間遠心分離した後上澄液(乳清)を回収した。上
澄液２μlに対して１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。比較群として市販の大
腸菌由来のrＨuＧ−ＣＳＦ (Kirin, Japan)およびＣＨＯ細胞株由来のrＨuＧ−
ＣＳＦ(Jugai, Japan)を用い、対照群としては形質転換されていないヤギの乳清
を用いて同様の方法で行った。ゲル状に分離されたタンパク質を公知の方法(Pro
teinmethods, Daniel M Bollag and Stuart J. Edelstein, Wiley-Liss, 1991)
に従ってニトロセルロース膜(Amersham pharmacia biotech, USA)に移した。こ
の膜を遮断緩衝溶液(脱脂粉乳３％を含む１ｘＰＢＳ)中で振盪機で１時間処理し
た。次いで、前記膜を抗hＧ−ＣＳＦマウスIgG(R&D systems, USA)を遮断緩衝溶
液１０mlで１,０００倍稀釈した溶液中で室温で１時間攪拌した後１ｘＰＢＳ
３００ml中で５分間３回攪拌した。この膜を、西洋わさびペルオキシダーゼの結
合した抗マウスＩｇＧ抗体を遮断緩衝溶液１０mlで１,０００倍稀釈した溶液中
で室温で１時間攪拌した。この膜を１ｘＰＢＳ中で５分間３回攪拌した後ＥＣＬ
キット(Amersham pharmacia biotech, USA)を用いて発色させた。

【００５９】 その結果を図４に示す。図４において、第１列は大腸菌 rＨuＧ−ＣＳＦ ５
０ngであり、第２列は大腸菌rＨuＧ−ＣＳＦ １００ngであり、第３列はＣＨＯ
rＨuＧ−ＣＳＦ ５０ngであり、第４列はＣＨＯ rＨuＧ−ＣＳＦ １００ngで
あり、第５列は本発明の形質転換ヤギの２日目乳清１μlであり、第６列は本発
明の形質転換ヤギの５日目乳清１μlであり、Ｓ列はタンパク質分子量標識であ
り、(−)は形質転換されていないヤギの乳清である。図４から分かるように、形
質転換ヤギの乳清においては、市販のhＧ−ＣＳＦと同じように約１８kＤa位置
でバンドとして発色することが確認できた。また、５日目に採取した乳清バンド
の濃度と厚さが２日目に採取した乳清の場合より強く、約５０〜１００μg／ml
の量と推定された。したがって、本発明の形質転換ヤギは乳汁中にhＧ−ＣＳＦ
を多量分泌することが分かる。

【００６０】 実施例７：形質転換ヤギの乳汁中のヒトＧ−ＣＳＦ濃度 形質転換ヤギ乳汁中のhＧ−ＣＳＦの濃度を決定するために、実施例６で得ら
れた形質転換ヤギ乳汁を緩衝溶液(20 mm Trizma base pH 7.4および1 mm EDTA)
で４倍稀釈した後２７,０００ｇを４℃で２０分ずつ３回遠心分離して脂質と糖
成分を取除いた。上澄液(乳清)中のhＧ−ＣＳＦの濃度を市販のＧ−ＣＳＦ ＥＬ
ＩＳＡキット(Cat # DCS50, R&D systems, USA)を用いて決定した。

【００６１】 実施例８：形質転換ヤギの乳汁に含まれたヒトＧ−ＣＳＦの活性 ヒト骨髄起源の細胞株ＨＬ−６０(ATCC CCL-240)を１０％ウシ胎児血清を含む
ＲＰＭＩ １６４０培地で３７℃、５％二酸化炭素の条件下で培養した。細胞数
を計数して約２.２ｘ１０^５細胞／mlになるように調整した後、ＤＭＳＯを最終
濃度１.２５％(ｖ／ｖ)になるように加えた。この細胞株を低蒸発９６ウェルプ
レート(low evaporation 96 well plate, NUNC, Denmark)の各ウェルに９０μl
ずつ入れてウェル当たり約２ｘ１０^４細胞になるようにした後、５％二酸化炭素
が供給される３７℃培養器で約４８時間培養した。

【００６２】 実施例６で得られた形質転換ヤギの乳清、形質転換されていないヤギ乳清およ
び市販のhＧ−ＣＳＦ(中外製薬)を各々ＲＰＭＩ １６４０培地中に稀釈してＧ
−ＣＳＦ相当量で最終濃度５００ng／mlになるようにした。この稀釈液をＲＰＭ
Ｉ １６４０培地を用いて２倍ずつ１０回連続稀釈した。

【００６３】 市販のhＧ−ＣＳＦ(中外製薬)２μgを形質転換されていないヤギの乳清稀釈液
１０mlに加えて得た混合液の１０μl量を、培養中である細胞株ＨＬ−６０が入
っている各ウェルに加えた後３７℃培養器で４８時間培養した。

【００６４】 培養液中の細胞株の増殖程度を調査するために、培養液をCell Titer96^TM (ca
t # G4100, Promega, USA)を用いて処理し、６７０nmの波長で吸光度を測定した
。

【００６５】 その結果を図５に示す。図５において、-●-は市販のhＧ−ＣＳＦであり、-■
-は市販のhＧ−ＣＳＦと形質転換されていないヤギ乳清の混合液であり、-▲-は
形質転換ヤギ乳清であり、-▼-は形質転換されていないヤギの乳汁である。図５
から分かるように、形質転換ヤギの乳清は現在市販のhＧ−ＣＳＦと同様な細胞
増殖活性を有するのに対し、形質転換されていない正常のヤギの乳清は細胞増殖
に全く影響を及ぼさない。また、細胞株ＨＬ−６０の増殖は形質転換ヤギの乳汁
に含まれたhＧ−ＣＳＦによるものであり、その生物学的活性も既存のhＧ−ＣＳ
Ｆと同等である。

【００６６】 本発明を前記特定実施態様と関連させて記述したが、添付の特許請求範囲によ
って定義される本発明の範囲内で、当該分野の熟練者が本発明を多様に変形およ
び変化させ得ることは明白である。

【００６７】 特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約 国際様式 受領人：Hanmi Pharm. Company Ltd. 大韓民国445-910京畿道華城郡八灘面下楮里893-5番地 下記国際寄託機関により、規則7.1に基づいて発行された原寄託に関する受託証

【配列表】

【図面の簡単な説明】

本発明の前記および他の目的および特徴は、下記の図面を伴う本発明の詳細な
説明によって明白になる。

【図１】 図１は、ヤギの発情同期化と過排卵誘起のための処置スケジュー
ルを示す模式図である。

【図２】 図２は、形質転換ヤギのゲノムＤＮＡへの発現カセットの導入を
示すＰＣＲ反応結果を示す。

【図３】 図３は、形質転換ヤギのゲノムＤＮＡへの発現カセットの導入を
示すサザーンブロット結果を示す。

【図４】 図４は、形質転換ヤギ乳清中のhＧ−ＣＳＦの発現を示すウェス
タンブロット結果を示す。

【図５】 図５は、形質転換ヤギ乳清によって促進された細胞株HL−６０の
増殖効果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 コリア アドバンスト インスティテュー ト オブ サイエンス アンド テクノロ ジー 大韓民国 タエジョン ユサン−ク クサ ン−ドン 373−１ (72)発明者 ジン・ソンウォン 大韓民国449−840キョンキド、ヨンイン シ、スジウプ、ドンチョンリ・ナンバー46 −１番 (72)発明者 リー・ドソ 大韓民国339−820チュンチョンナムド、ヨ ンイグン、ナムミョン、ヨンイリ・ナンバ ー１−27番 (72)発明者 ソン・テフン 大韓民国302−162デジョン、ソグ、ドマ２ ドン・ナンバー135−15番 (72)発明者 チョイ・インヨン 大韓民国463−480キョンキド、ソンナム シ、ブンダング、クムゴクドン、チョンソ ルマウル・ナンバー105−1102番 (72)発明者 ヨ・オクジョン 大韓民国463−050キョンキド、ソンナム シ、ブンダング、ソヒュンドン・ナンバー 92番、ヒュンダイシボム・アパートメント 417−504 (72)発明者 コ・ジュンホ 大韓民国302−122デジョン、ソグ、ドゥン サン２ドン・ナンバー1204番、ノクウォ ン・アパートメント107−505 (72)発明者 コ・ジャシン 大韓民国305−390デジョン、ユソング、ジ ョンミンドン、チョングナレ・アパートメ ント109−1201 (72)発明者 シン・サンテ 大韓民国305−345デジョン、ユソング、シ ンソンドン・ナンバー152−１番、ドゥ レ・アパートメント106−906 (72)発明者 リー・チュルサン 大韓民国306−060デジョン、デドゥクグ、 ボブドン、ボラム・アパートメント105− 705 (72)発明者 ファン・ナン・ジュ 大韓民国305−335デジョン、ユソング、ク ンドン・ナンバー288番 (72)発明者 コ・ドグボン 大韓民国305−345デジョン、ユソング、シ ンソンドン・ナンバー153番、ラッキーハ ナ・アパートメント110−308 (72)発明者 オー・コンボン 大韓民国361−272チュンチョンブクド、チ ョンジュシ、ホンドゥクグ、ボクデ２ド ン・ナンバー2087番 (72)発明者 パク・ジュンスン 大韓民国305−345デジョン、ユソング、シ ンソンドン、デリムドゥレ・アパートメン ト105−403 (72)発明者 ヨン・ウシク 大韓民国467−840キョンキド、イチョン シ、シンドゥンミョン、ジソクリ・ナンバ ー28−13番 (72)発明者 ジェン・グオ・ドン 大韓民国301−131デジョン、ジュング、ム ンファ１ドン・ナンバー６番 (72)発明者 キム・スンジュン 大韓民国305−335デジョン、ユソング、ク ンドン、ダソル・アパートメント103−303 (72)発明者 ハン・ヨンマン 大韓民国305−345デジョン、ユソング、シ ンソンドン、ハヌル・アパートメント110 −305 (72)発明者 リー・キュンクワン 大韓民国300−200デジョン、ドング、ヨン ジョンドン、シンドンガ・アパートメント ６−1101 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA30 CA02 DA02 FA02 GA12 HA17 4B065 AA90X AA93Y AB01 BA01 CA24 CA44 4H045 AA10 AA20 BA10 CA40 DA10 EA20 FA74

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヤギβ−カゼインプロモーターをコードするヌクレオチド配
   列およびヒト顆粒球コロニー刺激因子(hＧ−ＣＳＦ)をコードするヌクレオチド
   配列を含む遺伝子構築物が導入されたヤギの受精卵。
2. 【請求項２】 前記ヤギがCapra hircus aegagrusである、請求項１記載の
   ヤギの受精卵。
3. 【請求項３】 前記遺伝子構築物が発現ベクターpＧbc−hＧＣＳＦ (配列番
   号：1)である、請求項１記載のヤギの受精卵。
4. 【請求項４】 前記受精卵がCapra hircus aegagrus embtyos/pＧbc−hＧＣ
   ＳＦ (KCTC 0718 BP)である、請求項３記載のヤギの受精卵。
5. 【請求項５】 無処置のヤギの受精卵にβ−カゼインプロモーターをコード
   するヌクレオチド配列およびヒト顆粒球コロニー刺激因子(hＧ−ＣＳＦ)をコー
   ドするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を微量注入する段階を含む、請求項
   １に記載のヤギの受精卵の調製方法。
6. 【請求項６】 雌ヤギを同期化させ、雌ヤギを過排卵誘起させ、過排卵誘起
   雌ヤギを雄ヤギと交尾させ、交尾した雌ヤギから受精卵を回収することを含む、
   無処置ヤギ受精卵の採卵方法であって、同期化の段階が、雌ヤギにノルジェスト
   メットおよびエストラジオール投与し、雌ヤギにノルジェストメットを含有する
   インプラントを挿入し、インプラントを回収することによって行われ；および過
   排卵誘起の段階が、雌ヤギに所定の間隔で連続して妊娠雌血清ゴナドトロピン(
   ＰＭＳＧ)および卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)の混合服用量、ＦＳＨの分割服用量
   、およびＦＳＨおよびヒト絨毛性ゴナドトロピン(ｈＣＧ)の混合服用量を投与す
   ることによって行われる；ことを特徴とする方法。
7. 【請求項７】 前記ヤギがCapra hircus aegagrusであり；同期化段階での
   ＰＭＳＧおよびＦＳＨの投与がインプラント除去６０時間前に行われ、ＦＳＨ投
   与がＰＭＳＧおよびＦＳＨ投与後毎１２時間ごとに行われ、ＦＳＨおよびｈＣＧ
   の投与がその１２時間後に行われる、請求項６記載の採卵方法。
8. 【請求項８】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のヤギの受精卵から発育
   させた、hＧ−ＣＳＦ含有乳汁を産生する形質転換ヤギ。
9. 【請求項９】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のヤギの受精卵を雌ヤギ
   に移植し、分娩まで発育させる段階を含む、請求項８に記載の形質転換ヤギの生
   産方法。
10. 【請求項１０】 請求項８に記載の形質転換ヤギから乳汁を生産し、乳汁か
    らhＧ−ＣＳＦを回収する段階を含む、hＧ−ＣＳＦの調製方法。
11. 【請求項１１】 請求項８に記載の形質転換ヤギから調製されたhＧ−ＣＳ
    Ｆを含む乳汁組成物。
12. 【請求項１２】 請求項１０に記載の方法に従って調製されたhＧ−ＣＳＦ
    。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載のhＧ−ＣＳＦおよび薬剤学的に許容可
    能な担体を含む医薬組成物。