JPH09501319A

JPH09501319A - トランスジェニックブタにおけるヒトヘモグロビンの生産

Info

Publication number: JPH09501319A
Application number: JP7506467A
Authority: JP
Inventors: クマー，ラメシュ; シャーマ，アジェイ; ポーリアック，クララ; コーリ−クリスチャンソン，アナスタシア，エム．; ミダ，スニータ
Original assignee: ディーエヌエックスコーポレーション
Priority date: 1993-08-11
Filing date: 1994-07-29
Publication date: 1997-02-10
Also published as: EP0713493A1; CA2170234A1; AU700534B2; AU7477794A; US6147202A; EP0713493A4; US5922854A; WO1995004744A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒトヘモグロビンを生産するためのトランスジェニックブタの使用に関するものである。本発明のトランスジェニックブタは、ヒトへの輸血や他の医療用途において使用しうる無細胞ヒトヘモグロビンの効率的かつ経済的な供給源として用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】トランスジェニックブタにおけるヒトヘモグロビンの生産１．序文本発明はヒトヘモグロビンの生産のためのトランスジェニックブタの使用に関する。本発明のトランスジェニックブタは、ヒトの輸血や他の医学的応用に用いることのできる無細胞ヒトヘモグロビンの効率的かつ経済的な供給源として用いることができる。２．発明の背景２．１．ヘモグロビン肺を通して吸収された酸素は、輸送赤血球中のヘモグロビンによって体全体の組織に運ばれる。高酸素圧、例えば、肺付近に見られる酸素圧では、酸素はヘモグロビンに結合するが、酸素が必要とされる低酸素圧領域では放出される。それぞれのヘモグロビン分子は、２つのαグロビンと２つのβグロビンのサブユニットからなる。さらに、それぞれのサブユニットは酸素分子を輸送できる鉄含有ヘム基に非共有的に結合している。従って、それぞれのヘモグロビン４量体は４分子の酸素と結合できる。これらのサブユニットは、それぞれ肺と組織における酸素の取り込みと放出を促進する２つのコンフォメーション状態を切り換えて協同的に働く。この効果は通常ヘム−ヘム相互作用または協同作用と呼ばれている。多くの動物のヘモグロビンは酸素の結合と放出をさらに促進できる生物的なエフェクター分子との相互作用が可能である。この促進はヘモグロビンの２つのコンフォメーション状態間のアロステリックな平衡に影響を与える変化において明らかに示されている。例えば、ヒトとブタのヘモグロビンは、４量体の２つのコンフォメーション状態間の平衡に影響を与える2, 3 ジホスホグリセレート（2,3 ＤＰＧ）に結合することができ、酸素に対する全体的な親和性を組織レベルで低下させる最終的な効果を有する。その結果、2,3 −ＤＰＧは組織への酸素輸送の効率を高める。２．２．グロビン遺伝子の発現ヘモグロビンタンパク質は、赤血球細胞内で組織特異的に発現され、そこでは、全細胞タンパク質の約９０パーセントを占めている。従って、その核を失いかつ最小数のオルガネラの他はみな失った赤血球は、効果的に膜で取り囲まれた、酸素輸送の役割を担ったヘモグロビンの包みである。ヒトおよび多様な他の種は、胚、胎児、および成体の発育期間中に異なるタイプのヘモグロビンを作る。従って、グロビン遺伝子発現に影響を与える因子は、グロビン発現の組織特異的制御、量的制御、および発育に伴って調節された制御を達成できなければならない。ヒトグロビン遺伝子は、αグロビンが染色体１６上に、そしてβグロビンが染色体１１上にクラスター（群）として存在している。ヒトβグロビン遺伝子群は、εグロビンをコードする１つの胚遺伝子、γＧとγＡグロビンをコードする２つの胎児遺伝子、およびδおよびβグロビンをコードする２つの成体遺伝子をこの順序で含む約５０ｋｂのＤＮＡからなる（Fritsch et al．1980，Cell 19:959 -972）。 βグロビン翻訳開始部位の上流と下流の両方のＤＮＡ配列がβグロビン遺伝子発現の調節に関与していることが発見された（Wright et al.，1984，Cell 38:2 63）。特に、ヒトβグロビン遺伝子の約５０キロベース上流に位置する一連の４つのDnaseＩ超過敏性部位（現在は座調節領域（locus control region）またはＬＣＲと呼ばれている）は、適当に調節されたβグロビン−座発現を引き出す際に非常に重要である（Tuan et al.，1985，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，83 :1359-1363；PCT Patent Application WO 8901517 by Grosveld；Behringer et al.，1989，Science 245:971-973；Enver et al.，1989，Proc．Natl．Acad．Sc i．U.S.A.，86:7033-7037；Hanscombe et al.，1989，Genes Dev．3:1572-1581 ；Van Assendelft et al.，1989，Cell 56:967-977；Grosveld et al.，1987，C ell 51:975-985）。２．３．血液代用品の必要性最近、グロビン遺伝子発現の分子的側面はさらに大きな興味と遭遇しているが、これは提供者から得られる血液の危険性を回避する合成血液を作るために研究者が遺伝子工学を用いようとしたためである。1988年には、12,000,000〜14,000 ,000単位の血液が米国だけで用いられ（Andrews，1990年 2 月18日付けのニューヨークタイムズ）、莫大な量が不安定なボランティアの血液提供者に依存している。約５パーセントの提供血液が肝炎ウィルスにより感染されており（同新聞）、ＨＩＶ感染のスクリーニング操作は一般的に効果的ではあるものの、輸血関連エイズにかかるかなり恐ろしい可能性が依然として残っていると見込まれている。さらに、輸血血液は輸血を受ける者の血液型に適合しなければならないが、提供血液の供給では、稀な血液型を持つ個体に輸血できないかも知れない。対照的に、遺伝子工学により作られるヘモグロビンは血液型の一致を必要とせず、無ウィルスであり、潜在的に無制限の量が利用できるであろう。幾つかの研究グループが微生物内でヘモグロビンを発現する可能性を検討している。例えば、ヒトグロビンタンパク質の大腸菌内での生産を実施例で示しているHoffman と Nagaiによる国際出願 No．PCT/US88/01534を参照のこと。２．４．トランスジェニック動物トランスジェニック動物は、トランスジーンと呼ばれる少なくとも一つの外来遺伝子をその遺伝物質中に有しているヒト以外の動物である。好ましくは、トランスジーンはそれが動物の子孫に伝えられるよう動物の生殖系に含まれる。受精卵の前核内へのトランスジーンのマイクロインジェクションおよび胚幹細胞のマニピュレーションを含むがこれらに限定されない多くの技術を用いてトランスジーンを動物の遺伝物質中に導入することができる（U.S．Patent No．4,873,191 by Wagner and Hoppe；Palmiter and Brinster，1986，Ann．Rev．Genet．20:46 5-499；1987年 8 月 7 日公告の French Patent Application 2593827）。トランスジェニック動物は、すべての細胞中にトランスジーンを有してもよくまたは遺伝的にモザイクであってもよい。ほとんどの研究はトランスジェニックマウスにかかわるものであったが、他の種のトランスジェニック動物、例えばウサギ、ヒツジ、ブタ（Hammer et al.，1 985，Nature 315:680-683）およびニワトリ（Salter et al.，1987，Virology 1 57:236-240）も作られてきた。トランスジェニック動物は、有用な薬剤化合物製造用のバイオリアクターとして役立てるために現在開発されつつある(Van Brunt，1988，Bio/Te chnology 6:1149-1154；Wilmut et al.，1988，New Scientist（７月７日号）pp ．56-59)。トランスジェニック家畜による組換えタンパク質の発現方法は組換えバクテリアや酵母でのタンパク質の生産と比べて重要な理論的利点を有している。即ち、グリコシル化、リン酸化、サブユニットの組み立て等を含む翻訳後修飾が分子活性にとって非常に重要となる大きくて複雑なタンパク質を生産する能力がある。しかし、実際はトランスジェニック家畜の作製は問題があることがわかっている。トランスジェニック胚を作ることが技術的に困難なだけではなく、有意な量の組換えタンパク質を生産する成熟トランスジェニック動物は生存不能であることがわかっている。特にブタにおいては、成長ホルモンをコードするトランスジーン（本発明以前にブタに導入された唯一のトランスジーン）を有するブタは、激しい関節炎、後ろ足の共同的運動の欠如、ストレス敏感、雄ブタの無発情および雄ブタの性衝動の欠如を含む多くの健康的問題を被ったことを経験している（ Wilmut et al．の前記文献）。このことは、健康であるように見える成長ホルモントランスジーンを有するトランスジェニックマウスとは対照的である（Palmit er et al.，Nature 300:611-615）。従って、本発明以前には（トランスジーンを効率的に発現する）健康なトランスジェニックブタは作られていない。２．５．トランスジェニック動物内でのグロビン遺伝子の発現ヒトグロビントランスジーンを有するトランスジェニックマウスは、グロビン遺伝子発現の分子生物学の研究に用いられてきた。ハイブリッドマウス／ヒト成体βグロビン遺伝子は1985年にMagramらにより記載された（Natu re 313:338-340）。次いで、Kolliasらは、トランスジェニックマウス内でのヒトγ−Ａ、β、およびハイブリッドβ／γグロビン遺伝子の調節された発現を報告した（1986，Cell 46:89-94）。ヒト胎児γグロビンを発現するトランスジェニックマウスは、Enverら（1989，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，86:7033-70 37）および Constantoulakisら（1991，Blood 77:1326-1333）により研究された。トランスジェニックマウス中で切り換わるヒト胚グロビン遺伝子の自律的な発育に伴う制御は Raichらにより観察された(1990，Science 250:1147-1149)。ヘモグロビンまたはヘモグロビン発現の多様な障害のトランスジェニックマウスモデルが開発されており、それには鎌状赤血球病（Rubin et al.，1988，Am． J．Human Genet．42:585-591；Greaves et al.，1990，Nature 343:183-185；Ry an et al.，1990，Science 247:566-568；Rubin et al.，1991，J．Clin．Inves t.，87:639-647）；地中海貧血（Anderson et al.，1985，Ann．New York Acad ．Sci．（USA）445:445-451；Sorenson et al.，1990，Blood 75:1333-1336）；および胎児ヘモグロビンの遺伝的持続性（Tanaka et al.，1990，Ann．New York Acad．Sci．（USA）612:167-178）が含まれる。ヒトαおよびβグロビンの同時発現によってトランスジェニックマウス内でのヒトヘモグロビンの生産がもたらされた（Behringer et al.，1989，Science 24 5:971-973；Townes et al. ，1989，Prog．Clin．Biol．Res．316A:47-61；Hanscombe et al.，1989，Genes Dev．3:1572-1581）。αグロビンをコードするがβグロビンはコードしないトランスジーンの高コピー数を持つトランスジェニック胎児は激しい貧血を示し、誕生前に死ぬことがHanscombeら（上記文献）により観察された。βグロビンＬＣＲの制御下でヒトαグロビン遺伝子およびβグロビン遺伝子の両方を有する構築物を用いて、低コピー数の生きたマウスが得られた（同文献）。代謝標識実験では、均衡のとれたマウスグロビンの合成が示されたが、ヒトグロビンは不均衡に合成され、約0.6のα／β生合成比であった（同文献）。３．発明の要旨本発明は、ヒトヘモグロビンおよび／またはヒトグロビンの生産のためのトランスジェニックブタの使用に関する。それは、少なくとも部分的に、それらの赤血球中でヒトヘモグロビンを発現し、かつ異種ヘモグロビンの生産の結果としての有害な作用を受けずに健康であるトランスジェニックブタを生み出すことができるという発見に基づいている。特定の態様においては、本発明はヒトグロビン遺伝子を発現するトランスジェニックブタを提供する。かかる動物は、（i）ブタの妊娠と性的成熟の期間が比較的短いこと；（ii）同産児の大きさと数；（iii）ブタの大きさが比較的大きく比較的高い収率でヘモグロビンを供給すること；および（iv）酸素結合親和性の調節においてブタヘモグロビンとヒトヘモグロビンの間で機能的に類似性があり高レベルのヒトヘモグロビンの存在下でトランスジェニックブタが健康であり続けることが可能である、という観点から特に効率的かつ経済的なヒトヘモグロビン供給源として用いることができる。本発明はトランスジェニックブタを生み出すために用いることのできる組換え核酸構築物も提供する。限定するものではない、特定の態様においては、かかる構築物は、(i)ヒトαおよびβグロビン遺伝子を同一のプロモーター下に置き；( ii)ブタβグロビン遺伝子のプロモーターまたは３’領域を含むブタ成体βグロビン遺伝子調節領域を有し；および／または(iii)ヒトグロビン遺伝子をブタ座調節領域（ＬＣＲ）の制御下に含む。本発明はまた、ヒトβグロビン遺伝子が野生型ヒトβグロビンのアミノ酸配列を変えることなくブタβグロビン遺伝子に類似するように遺伝子操作されて、最適化されているヒトβグロビン遺伝子を含む構築物を提供する。かかる構築物はｍＲＮＡの構造、安定性または翻訳速度に影響を及ぼすことによりトランスジェニックブタ内でのヒトβグロビンのレベルを高めることができる。更なる態様においては、本発明はヒトαグロビンおよびブタβグロビンを含むハイブリッドヘモグロビンを提供する。このハイブリッドヘモグロビンを発現するトランスジェニックブタからの全血は、天然のヒトまたはブタ血液よりも有利に高いＰ₅₀を示すようである。本発明は、(i)適当な１つのプロモーターまたは複数のプロモーターの制御下でヒトαグロビンとヒトβグロビンの遺伝子をブタの遺伝物質に導入して、少なくとも一部のその赤血球中でヒトヘモグロビンを発現するトランスジェニックブタを作り；(ii)このトランスジェニックブタから赤血球を採集し；(iii)採集した赤血球の内容物を放出させ；そして（iv）赤血球の放出された内容物を、ヒトヘモグロビンとブタヘモグロビンとに実質的に分離する精製操作に供することを含む、ヒトヘモグロビンの製造方法も提供する。本発明の好ましい態様においては、ヒトヘモグロビンをＤＥＡＥ陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによりブタヘモグロビンから分離することができる。４．図面の説明図１．組換え核酸構築物Ａ．構築物ααβ（“１１６”構築物）；Ｂ．構築物αｐβ（“１８５”構築物）；Ｃ．構築物βｐα（“２９０”構築物）；Ｄ．構築物εｐζβα；Ｅ．構築物ζｐεαｐβ；Ｆ．β１０８Ａｓｎ→Ａｓｐ変異を有する構築物αｐβ（“ ヘモグロビンヨシズカ構築物”）；Ｇ．β１０８Ａｓｎ→Ｌｙｓ変異を有する構築物αｐβ（“ヘモグロビンプレスビテリアン構築物”）；Ｈ．ＬＣＲαが共に注入された構築物αｐβ（Δα）（“２８５”構築物）；Ｉ．α１３４Ｔｈｒ→ Ｃｙｓ変異を有する構築物αｐβ（“２２７”構築物）；Ｊ．α１０４Ｃｙｓ→ Ｓｅｒ変異（“２２７”構築物）、β９３Ｃｙｓ→Ａｌａ変異、およびβ１１２Ｃｙｓ→Ｖａｌ変異（“２２８”構築物）を有する構築物αｐβ；Ｋ．構築物α ｐδ（“２６３”構築物）；およびＬ．ＬＣＲαが共に注入された構築物αｐδ （Δα）（“２７４”構築物）；Ｍ．ＬＣＲεβが共に注入された構築物ＬＣＲ α（“２４０”構築物）；Ｎ．β６１Ｌｙｓ→Ｍｅｔ変異を有する構築物αｐβ （“ヘモグロビンボログナ構築物”）；Ｏ．構築物ＬＣＲεαβ（“３１８”構築物）；Ｐ．構築物ＬＣＲαεβ（“３１９”構築物）；Ｑ．構築物ＬＣＲααεβ（“３２９”構築物）；Ｒ．構築物ＬＣＲαε（^pigβｐ）β（“３３９”構築物）；Ｓ．α７５Ａｓｐ→Ｃｙｓ変異を有する構築物αｐβ（“３４０”構築物）；Ｔ． α４２Ｔｙｒ→Ａｒｇ変異を有する構築物αｐβ（“３４１”構築物）；Ｕ．構築物ＬＣＲεβαα（“３４３”構築物）；Ｖ．構築物ＬＣＲεβα（“３４７ ”構築物）；Ｗ．α４２Ｔｙｒ→Ｌｙｓ変異を有する構築物αｐβ；Ｘ．α４２Ｔｙｒ→Ａｒｇ変異およびβ９９Ａｓｐ→Ｇｌｕ変異を有する構築物αｐβ；Ｙ．α４２Ｔｙｒ→Ｌｙｓ変異およびβ９９Ａｓｐ→Ｇｌｕ変異を有する構築物α ｐβ。図２．トランスジェニックブタ。図３．トランスジェニックブタ内でのヒトヘモグロビン発現の証明。Ａ．等電点電気泳動ゲル分析。Ｂ．ヒト血液（レーン１）；トランスジェニックブタ１２− １からの血液（レーン２）、９−３からの血液（レーン３）、および６−３からの血液（レーン４）；およびブタ血液（レーン５）を代表する赤血球の溶血産物のトリトン−酸性尿素ゲルは、トランスジェニック動物内でのヒトαグロビンに対するヒトβグロビンの発現不十分(under-expression)を示す。図４．ヒトヘモグロビンとブタヘモグロビンのＤＥＡＥクロマトグラフィーによる分離。Ａ．ヒトとブタの赤血球の溶血混合物；Ｂ．トランスジェニックブタ６ −３から採集した赤血球の溶血産物。Ｃ．ヒトとマウスのヘモグロビンはこれらの条件下ではＤＥＡＥクロマトグラフィーにより分離しない。Ｄ．ブタヘモグロビンから精製されたヒトヘモグロビンの等電点電気泳動。図５．再結合したブタヘモグロビンの等電点電気泳動ゲル（レーン１）；再結合したブタ／ヒトヘモグロビン混合物（レーン２とレーン４）；再結合したヒトヘモグロビン（レーン３）；およびトランスジェニックブタヘモグロビン（レーン５）。図６．ヒトヘモグロビンのＱＣＰＩクロマトグラフィーによる分離。図７．トランスジェニックヘモグロビンの酸素親和性。図８．プロモーター領域を含むブタ成体βグロビン遺伝子調節領域のＤＮＡ配列（配列番号１）。ブタβグロビン遺伝子のＡＴＧ開始コドン（ボックス内）の上流８６９塩基対まで伸びる配列を示す。ｍＲＮＡの開始位置、つまりキャップ部位を矢印で示してある。ＧＡＴＡ転写因子結合部位に相当する配列は下線が引いてある。図９．ブタβグロビン調節配列（配列番号１）（上方）とヒトβグロビン調節配列（配列番号２＆３）（下方）の比較。これら２つの配列の相違点に星印を付してある。図１０．ブタとヒトの成体βグロビン遺伝子調節配列間の相同性（％）を描いたグラフ。開始コドンからの塩基対距離を横座標にとった。マウスとヒトの配列の比較も示す（誤差帯を伴う破線）。図１１．図８に示したＤＮＡ配列を含むプラスミドｐｇｅｍ５／ＰｉｇβＰｒ（ｋ）の地図。図１２．トランスジェニックブタ内でのヒトヘモグロビン生産のための３３９および３５４カセットを表す。図１３．ブタε遺伝子を含有するプラスミドｐＳａｆ／Ｐｉｇε（ｋ）の地図。図１４．トランスジェニックブタ内でのε^pig、β^humanおよびα^humanヘモグロビンの生産のための４２６および４２７発現カセットを表す。図１５．３３９構築物を有するトランスジェニックブタ７０−３により、および１１６構築物を有するトランスジェニックブタ６−３により生産されたヘモグロビンの等電点電気泳動ゲル。ヒトヘモグロビンを標準として泳動させている。図１６．ブタβグロビン遺伝子の３’末端を含有するプラスミドｐｉｇ３'βの地図。図１７．構築物“３３９”（図１Ｒを参照のこと）から得られたトランスジェニックブタ。ヒトヘモグロビン発現のレベルおよびコピー数を示す。図１８．構築物“３３９”を用いて得られたトランスジェニックブタ内のヘモグロビンレベルの等電点電気泳動ゲル。図１９．“１８５”構築物（またはαｐβ構築物；図１Ｂを参照のこと）を有する代表的トランスジーン陽性３８−４子孫内でのヘモグロビン発現のレベルを示す等電点電気泳動ゲル。図２０．ハイブリッドヒトα／ブタβおよびヒトα／ヒトβヘモグロビン分子の分子モデリング。βサブユニットは青色であり、αサブユニットは赤色である。 βヒト（青色）の中央のヘリックスの上に緑色で縁取りしたギャップを見ることができる（矢印のところ）。ハイブリッドではこのギャップが修復されている。この相違はβ１１２Ｃｙｓ→Ｖａｌにおける変化のためであり、バリンがより大きな疎水性相互作用に貢献している。図２１．位置１１２にＣｙｓを含有するβグロビン（黄色分子）と位置１１２にＶａｌを有するβグロビン（白色分子）間のα₁β₂界面における相違を示す分子モデリング。Ｃｙｓは黄色で、Ｖａｌは白色であり、相対するα界面は赤色である。Ｖａｌはフレキシブルである。その枝の１つのアームは、αサブユニット残基に対してほぼ完全に適合するために容易に動くことができる。黄色のＣｙｓは、僅かに更なる小さなギャップ（矢印のところ）の余地を残している。バイオシン・スタンダード・デフォールト・ファンデルワールス間隔（Biosyn's standar d default Van der Waal's distance）を用いた。図２２．トランスジェニックブタ溶血産物からのＨｂプレスビテリアンの精製。図２３．ヘム部分、ブタαグロビン（“ｐα”）、ヒトβグロビン（“ｈβ”）、ヒトαグロビン（“ｈα”）およびブタβグロビン（“ｐβ”）の分離を示すＨＰＬＣによる精製Ｈｂプレスビテリアンの特徴付け。図２４．Ｈｂプレスビテリアンについての酸素結合曲線。図２５．トランスジェニックブタ溶血産物からのＨｂヨシズカの精製。図２６．ブタβＬＣＲクローン。（Ａ）ラムダファージクローンPhage L および Phage H の制限分析。挿入図はブタβグロビン遺伝子の最も有望な配置を示す。ライブラリーのスクリーニングに用いたプローブの位置を示してある。（Ｂ）ヒトε遺伝子からのヒトＬＣＲの距離とブタε遺伝子からのブタＬＣＲの距離の比較。図２７．（Ａ）ＰＨ１−ＴＡ１（配列番号４）：プラスミドＰＨ１の３’末端の配列。これはブタLCR Iの部分である。（Ｂ）ＰＨ１−ＴＡ１と染色体１１上のヒトβグロビン領域（配列番号５）との比較。ヒト配列(12499-12901)がLCR Iの部分である。図２８．接合ｐｌｃｒ２：プラスミドＰＨ１の５’末端の４７７ｂｐ配列がプラスミドＰＨ２の３’末端の５３４ｂｐ配列と接合された。これがブタLCR IIの部分である。図２９．接合ｐｌｃｒ２（配列番号６）と染色体１１上のヒトβグロビン領域（配列番号７、８＆９）との比較。ヒト配列(7276-8017)がLCR IIの部分である。図３０．ＰＨ２−Ｔ７。（Ａ）プラスミドＰＨ２−Ｔ７の５’末端の配列（配列番号１０）。（Ｂ）ＰＨ２−Ｔ７と染色体１１上のヒトβグロビン領域（配列番号１１）との比較。ヒト配列(1450-1487)がLCR IIIの部分である。図３１．構築に用いた重要な制限部位を含む、最適化されたβグロビン遺伝子の模式図。プロモーター領域、介在配列ＩおよびII(IVS I，IVS II)、そしてポリＡおよび３’ＵＴＲ領域はブタ配列である。エキソン１、２および３はブタ系での使用のために最適化されたコドンを有するヒトβグロビンをコードしている。図３２．最適化配列とヒト配列とブタ配列間の相同性（％）を示す、最適化βグロビン遺伝子とヒトβグロビン遺伝子とブタβ グロビン遺伝子のコーディング配列の比較。最適化配列中の直線はヒト配列からのコドンの変更を示すものである。図３３．構築物５０５：この構築物はヒト座調節配列（ＬＣＲ）、それ自体のプロモーターによって作動されるヒトαグロビン遺伝子、やはりそれ自体のプロモーターによって作動されるヒトεグロビン遺伝子、および最適化βグロビン遺伝子（最適化コーディング配列を有し、ブタイントロン、ポリＡおよび３’ＵＴＲを含み、ブタプロモーターによって作動される）を含んでいる。この構築物中の遺伝子順序はＬＣＲαεβ^*（＊は最適化β遺伝子を表す）である。図３４．構築物５１５：この構築物はヒト座調節配列、それ自体のプロモーターによって作動されるヒトαグロビン遺伝子、やはりそれ自体のプロモーターによって作動されるヒトε遺伝子、および最適化βグロビン遺伝子（最適化コーディング配列を有し、ブタイントロン、ポリＡおよび３’ＵＴＲを含み、ブタプロモーターによって作動される）を含んでいる。この構築物中の遺伝子順序はＬＣＲ εβ^*αα（＊は最適化β遺伝子を表す）である。図３５．ヒトβグロビンコーディング配列（配列番号１２、１３＆１４）とブタ βグロビンコーディング配列（配列番号１５、１６＆１７）の比較。図面はエキソン１、２および３に分割してある。相違はブタ（下方）配列中に小文字で表してある。変更を伴うコドンには下線が引いてある。図３６．ヒトβグロビンコーディング配列（配列番号１２、１３＆１４）と最適化βグロビンコーディング配列（配列番号１８、２０＆２２）の比較。図面はエキソン１、２および３に分割してある。相違は最適化（下方）配列中に小文字で表してある。変更を伴うコドンには下線が引いてある。図３７．最適化βグロビンコーディング配列（配列番号１８、２０＆２２）とブタβグロビンコーディング配列（配列番号１５、１６＆１７）の比較。図面はエキソン１、２および３に分割してある。相違はブタ（下方）配列中に小文字で表してある。変更を伴うコドンには下線が引いてある。図３８．最適化βグロビン遺伝子のコーディング配列（配列番号１８、２０＆２２）およびアミノ酸配列（配列番号１９、２１＆２３）。エキソン間には３つのダッシュ記号（−）を挿入してある。図３９．ヒトβグロビンアミノ酸配列（配列番号２４、２５＆２６）と最適化β グロビンアミノ酸配列（配列番号１９、２１＆２３）が同一であることを示す、これらのアミノ酸配列の比較。５．発明の詳細な説明本発明は、トランスジェニックブタを利用したヒトヘモグロビンの生産方法、グロビンをコードする新規核酸構築物、そしてヒトヘモグロビンを発現するトランスジェニックブタを提供するものである。限定するためではなく、記述を明確にする目的で、発明の詳細な記述を以下の分節に分ける：（ｉ）グロビン遺伝子構築物の作製；（ii）トランスジェニックブタの作製；（iii）ヒトヘモグロビンの調製およびブタヘモグロビンからのヒトヘモグロビンの分離；そして（iv）ヒト／ブタハイブリッドヘモグロビンの作製。５．１．グロビン遺伝子構築物の作製本発明は、トランスジェニックブタ内でヒトグロビンおよび／またはヘモグロビンを生産する方法を提供する。ここではヒトヘモグロビンを、ヒトグロビン遺伝子（アルファ、ベータ、デルタ、ガンマ、イプシロンおよびゼータ遺伝子を含む）によってコードされたグロビン鎖により形成された天然のまたは遺伝子工学の産物としてのヘモグロビンまたはその変異型として定義する。これらの変異型は天然のヒトヘモグロビンに対しアミノ酸配列において少なくとも90％の相同性を有するものである。好ましい態様において、本発明のヒトヘモグロビンはヒトアルファグロビンおよびヒトベータグロビン鎖を含むものである。本発明のヒトヘモグロビンは少なくとも２つの異なるグロビン鎖を含むが、２つ以上のグロビン鎖を含んでもよく、例えば４量体分子、８量体分子などを形成することができる。本発明の好ましい態様においては、ヒトヘモグロビンは２本のヒトアルファグロビン鎖および２本のヒトベータグロビン鎖からなっている。以下に述べるように、本発明はヒトαグロビンとブタβグロビンからなるハイブリッドヘモグロビンをも提供する。本発明の特定の態様によれば、ブタの遺伝物質中に、ヒトアルファおよび／またはヒトベータグロビン遺伝子などの、少なくとも１つのヒトグロビン遺伝子を、適当な１以上のプロモーターの制御下に挿入し、少なくとも一部の赤血球中にヒトグロビンを保有するトランスジェニックブタを作製する。これには相当する組み換え核酸配列の作製が必要となる。本発明の好ましい態様において、ヒトα およびヒトβ遺伝子の両方が発現される。別の態様では、ヒトαグロビンまたはヒトβグロビンのみが発現される。さらに別の態様では、ヒト胚または胎児グロビン遺伝子が発現され、またはこれらが成体遺伝子の発育に伴う発現の調節剤として使用される。ヒトアルファおよびベータグロビン遺伝子は、例えばSwanson et al．,1992， Bio/Technol.10:537-559に記載されているような一般に入手できるクローンから得ることができる。ヒトアルファおよびベータグロビンタンパク質をコードする核酸配列は、１つはヒトアルファグロビンをコードし、もう１つはヒトベータグロビンをコードする、２つの異種の組換え構築物によって、ある動物中に導入しうる。または、そしてこの方が好ましいが、アルファおよびベータの両方をコードする配列が同じ組換え構築物中に含まれるものでもよい。ブタイプシロングロビン遺伝子は、ATCC に寄託され受託番号第 75373号を受けているプラスミドpSaf/Pigε(k)（図13）中に含まれている。本発明によれば、好適なプロモーターは、赤血球中でヒトアルファおよび／またはベータグロビン遺伝子の転写を支配し得るプロモーターである。このプロモーターは赤芽細胞中で選択的に活性であるものが好ましい。これには、ヒトアルファ、ベータ、デルタ、イプシロンまたはゼータプロモーターなどのグロビン遺伝子プロモーター、あるいは他の種からのグロビンプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、ブタグロビンプロモーター配列を使用するのも有用であろう。実例を上げると、下記第10節において検討するように、ATCCに寄託され受託番号第 75371号を受け、図８に示す配列を有するプラスミドpGem5/Pigβpr(K)に含まれているような、内在性ブタβグロビン遺伝子制御領域の利用が特に効果的に作用することがわかった。ヒトアルファおよびベータグロビン遺伝子を異なるプロモーターの制御下においてもよいが、大幅に異なるレベルのグロビン鎖の生成は致命性に関わると考えられてきているので、ヒトアルファおよびベータグロビン遺伝子は同一のプロモーター配列の制御下に置くほうが好ましい。不適正な細胞型中に存在する構成βグロビンプロモーター活性による鎖不均衡および／または転写因子のタイトレーションを避けるため、ヒトアルファおよびベータグロビン遺伝子が発育中の同時期にまた量的に同レベルで同調的に発現されるような構築物を設計することが望ましい。本発明の、限定するわけではないが、特定の態様として、ααβ構築物を含む構築物（“116”構築物とも称される；Swanson et al．,1992，Bio/Technol.10:557-559；図１Ａ参照）が利用され得る。この構築物は、高コピー数のトランスジーンとして存在すると、マウス中で有害な影響を及ぼすことがわかっているにもかかわらず、健康なトランスジェニックブタを作製するのに使用された（下記第６節の実施例参照）。本発明の、限定するわけではない、別の特定の態様として、αｐβ配列を含む構築物（“185”構築物とも称される；図１Ｂ参照）が使用され得る。この構築物は、アルファおよびベータグロビンの両方をコードする配列を同じプロモーター（アルファグロビンプロモーター）の制御下に置くことができるという利点を有している。本発明の、限定するわけではない、別の特定の態様として、アルファグロビン２量体様のポリペプチドをコードする構築物を導入して、２量体化が減少し半減期が増加したヒトヘモグロビンを生産するトランスジェニックブタを作製することができる（ＷＯ特許第 9013645号）。本発明のさらに別の限定するわけではない特定の態様として、ヒト成体アルファグロビンおよびイプシロングロビン遺伝子、ブタベータグロビン遺伝子制御領域およびヒトベータグロビン遺伝子を含む構築物（“339”構築物、図１Ｒ参照）を使用することができる。さらに、この構築物にヒトまたはブタイプシロングロビン遺伝子を組み込むことによって、ヘモグロビンの高レベル生産が助長され得る。ブタイプシロングロビン遺伝子は成体βグロビン遺伝子の発育に伴う正しい調節を行なわせる。導入された成体アルファグロビン遺伝子（群）の高レベル発現は、トランスジェニックブタの胚の子宮内発育中（構築物中の成体ベータグロビン遺伝子はまだ発現されないはずであるから）、鎖の不均衡化障害をもたらし、そのため胚の生存を危うくすることがある。発育中に高レベルの胚グロビンを供給することによって、これらの胚の生存度が改善される。ATCCに寄託され受託番号第 75373号を受けているプラスミドpS af/Pigεに含まれている、ブタイプシロングロビン遺伝子を図13に示す。さらに特定の態様において、本発明は以下の構築物を提供する：（ｉ）ヒトアルファおよびベータグロビン遺伝子がヒトベータグロビンプロモーターの別々のコピー数によって作動される構築物βｐα（図１Ｃ）；（ii）イプシロンプロモーターの制御下にヒト胚遺伝子ゼータおよびイプシロンを、そしてベータプロモーターの制御下にアルファおよびベータ遺伝子の両方を含むεｐζβｐα構築物（図１Ｄ）；（iii）ゼータプロモーターの制御下にヒト胚遺伝子ゼータおよびイプシロンを、そしてアルファプロモーターの制御下にアルファおよびベータ遺伝子の両方を含むζｐεαｐβ構築物（図１Ｅ）；（iv）βグロビンタンパク質のアミノ酸番号108が（アスパラギン残基の代わりに）アスパラギン酸残基に変わった変異を保有し、ヘモグロビン・ヨシズカ（Yoshizuka）を生成するαｐβ 構築物（図１Ｆ、構築物“294”）；（ｖ）βグロビンタンパク質のアミノ酸番号108が（アスパラギン残基の代わりに）リシン残基に変わった変異を保有し、ヘモグロビン・プレスビテリアン（Presbyterian）を生成するαｐβ構築物（図１Ｇ、構築物“293”）；（vi）ＬＣＲαがともに注入されたもので、ヒトαグロビンプロモーターの制御下にヒトβグロビン遺伝子を、そしてそれ自体のプロモーターの制御下にヒトαグロビン遺伝子を含む別個の核酸フラグメントを含むαｐβ（Δα）構築物（図１Ｈ）；（vii）αグロビンタンパク質のアミノ酸番号134が（トレオニン残基の代わりに）システイン残基に変わった変異を保有するαｐβ構築物（図１Ｉ）；（viii）αグロビンタンパク質のアミノ酸番号104が（システイン残基の代わりに）セリン残基に、βグロビンタンパク質のアミノ酸番号93が（システイン残基の代わりに）アラニン残基に、そしてβグロビンタンパク質のアミノ酸番号112が、（システイン残基の代わりに）バリン残基に変わった変異を保有するαｐβ構築物（図１Ｊ）；（ix）ヒト成体 αグロビン遺伝子をそれ自体のプロモーター下に、そしてヒト成体αグロビンプロモーターの制御下にヒトδグロビン遺伝子を含むαｐδ構築物（図１Ｋ）；（ｘ）ＬＣＲαがともに注入されたもので、ヒトαグロビンプロモーターの制御下にヒトδグロビン遺伝子を、そしてそれ自体のプロモーターの制御下にヒトαグロビン遺伝子を含む別個の核酸フラグメントを含む構築物αｐδ（Δα）（図１Ｌ）；（xi）ＬＣＲεβがともに注入されたもので、ヒトαグロビン遺伝子をそれ自体のプロモーターの制御下に、ヒト胚εグロビン遺伝子とヒト成体βグロビン遺伝子をそれら自体のプロモーターの制御下に含む別個の核酸フラグメントを含む構築物ＬＣＲα（図１Ｍ）；（xii）αグロビンタンパク質のアミノ酸番号6 1が（リシン残基の代わりに）メチオニン残基に変わった変異を保有するαｐβ 構築物（図１Ｎ）；（xiii）５’から３’に縦列に連鎖したヒト胚イプシロン遺伝子とヒト成体アルファグロビン遺伝子およびヒト成体ベータグロビン遺伝子を含むεαβ構築物（図１Ｏ）；(xiv)５’から３’に縦列に連鎖したヒト成体アルファグロビン遺伝子、ヒト胚イプシロングロビン遺伝子およびヒト成体ベータグロビン遺伝子を含むαεβ構築物（図１Ｐ）；（xv）５’から３’に縦列に連鎖した、２コピーのヒト成体アルファグロビン遺伝子、ヒト胚イプシロングロビン遺伝子およびヒト成体ベータグロビン遺伝子を含むααεβ構築物（図１Ｑ）；（xvi）すべて５’から３’に縦列に連鎖した、ヒト成体アルファグロビン遺伝子、ヒト胚イプシロングロビン遺伝子およびヒト成体ベータグロビン遺伝子を内在性ブタ成体ベータグロビンプロモーターの制御下に含むαε（^pigβｐ）β構築物（図１Ｒ）；(xvii)αグロビンタンパク質のアミノ酸番号75が（アスパラギン酸残基の代わりに）システイン残基に変わった変異を保有するαｐβ構築物（図１Ｓ）；(x viii)αグロビンタンパク質のアミノ酸番号42が（チロシン残基の代わりに）アルギニン残基に変わった変異を保有するαｐβ構築物（図１Ｔ）；（xix）５’ から３’に縦列に連鎖した、ヒト胚イプシロングロビン遺伝子、ヒト成体ベータグロビン遺伝子および２コピーのヒト成体アルファグロビン遺伝子を含むＬＣＲ εβαα構築物（図１Ｕ）；（xx）５’から３’に縦列に連鎖した、ヒト胚イプシロングロビン遺伝子、ヒト成体ベータグロビン遺伝子およびヒト成体アルファグロビン遺伝子を含むＬＣＲεβα構築物（図１Ｖ）；（xxi）αグロビンタンパク質のアミノ酸番号42が（チロシン残基の代わりに）リシン残基に変わった変異を保有するαｐβ構築物（図１Ｗ）；（xxii）αグロビンタンパク質のアミノ酸番号42 が（チロシン残基の代わりに）アルギニン残基に、そしてβグロビンタンパク質のアミノ酸番号99が（アスパラギン酸残基の代わりに）グルタミン酸残基に変わった変異を保有するαｐβ構築物（図１Ｘ）；（xxiii）αグロビンタンパク質のアミノ酸番号42が（チロシン残基の代わりに）リシン残基に、そしてβグロビンタンパク質のアミノ酸番号99が（アスパラギン酸残基の代わりに）グルタミン酸残基に変わった変異を保有するαｐβ構築物（図１Ｙ）；および（xxiv）ブタイプシロングロビン遺伝子およびベータグロビン制御領域を含むα^pigε(^pigβ ｐ)β構築物（構築物426および427、図14）。ヒトヘモグロビンを発現するトランスジェニックブタ中には、ブタα／ブタβ 、ヒトα／ヒトβ、そしてヒトα／ブタβハイブリッドの３つのタイプのヘモグロビン２量体が検出される。本発明のいくつかの態様では、ハイブリッドヘモグロビンの量を減少させることが望ましいかもしれない。そのため、分子モデル研究によって、ハイブリッドヘモグロビンを形成する分子基準が検討された。これらの研究から導かれた知見に基づいて、ヒトアルファおよびベータグロビンの構造をヒトα／ヒトβ２量体レベルを増加させるように改変することができる（第 11節参照）ので、本発明の別の態様では、αｐβ配列を含む構築物を、トランスジェニックブタ中のヒトα／ヒトβヘモグロビン２量体レベルを増加させるようなアミノ酸変化を有しているαまたはβグロビンタンパク質をコードするように改変する場合もある。本発明はαグロビン分子中に１またはそれ以上の以下に示す変異を保有するようなヒトαグロビンおよびヒトβグロビンをコードする構築物を提供する：(i)30番目のGluの代わりにThr；(ii)36番目のPheの代わりにTyr；（iii ）106番目のLeuの代わりにPhe；（iv）107番目のValの代わりにSerまたはCys；および／または(v)111番目のAlaの代わりにCys。特定の態様において、１以上のこれらの変異を保有している構築物はαｐβ構築物である。別の態様において、本発明はβグロビン分子中に１またはそれ以上の以下に示す変異を保有するようなヒトαグロビンおよびヒトβグロビンをコードする構築物を提供する：(i)33 番目のValの代わりにLeu；(ii)112番目のCysの代わりにValまたはIle；（iii）1 15番目のAlaの代わりにValまたはLeu；(iv)119番目のGlyの代わりにHis；(v)125 番目のProの代わりにMet；（vi）128番目のAlaの代わりにIle；および／または( vii)131番目のGlnの代わりにGlu。特定の態様において、１以上のこれらの変異を保有している構築物はαｐβ構築物である。更なる態様において、トランスジェニックブタ内での発現を最適化するためにヒトβグロビン遺伝子を修飾することが望ましい。例えば、プロモーター領域からコーディング配列を通ってポリアデニル化部位および３’非翻訳領域までの、ヒトβグロビン遺伝子は、ブタβグロビン遺伝子に類似したものとなるように遺伝子操作しうる。しかし、そのアミノ酸配列は真正の野生型ヒトβグロビンのアミノ酸配列と異ならないようにする。このような最適化遺伝子は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に寄託されて受託番号第 75520号を指定された、pGEM3β^*Δ3'と称するプラスミド中に含まれている。最適化されたヒトβグロビン遺伝子を含む構築物は、トランスジェニック動物において発現されるβグロビンのレベルを高めるために使用しうる（構築物505および515、それぞれ図34および35）。更なる態様において、トランスジェニックブタ内でのグロビンタンパク質の発現を増大させるために、pPH1よびpPH2（ATCCに寄託され、受託番号第 75518号および第 75519号を指定された）と称するプラスミド中に含まれるブタＬＣＲ領域（図26A）がプラスミド構築物中で使用される。ブタＬＣＲはブタ赤血球内での非グロビンタンパク質の発現にも有用である。別の態様において、ATCCに寄託され、受託番号第75372号を有するプラスミドｐPig3'β（図16）中に含まれる、ブタベータグロビン遺伝子の非翻訳３’末端を構築物中に含むものが望ましい場合がある（例えば図12中の構築物354および図14中の構築物426および構築物427参照）。これらの構築物はまたブタ赤血球中での非グロビンタンパク質の発現において有用であると考えられる。別の態様において、図８および９に示すブタベータグロビン制御領域を非グロビンタンパク質をコードする構築物中に入れて、トランスジェニックブタまたはその他の非ヒトの赤血球中でのそのタンパク質の発現のために使用することができる。上記の組換え核酸構築物は、例えばManiatis et al.,1989，Molecular Clonin g：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.に記載されているような、当分野で既知の方法を用いて、増幅用の適当なプラスミド、バクテリオファージまたはウィルスベクターに挿入し、そして増殖させることができる。下記の実施例においては、ｐＵＣベクター（Yanish-Perron et al.,1985，Ge ne103-119）が利用された。本発明はさらに、プラスミドｐGem５／Pigβｐr(K)（ATCC受託番号第75371号）、ｐPig 3'β（ATCC受託番号第75372号）、およびｐSaf／pigε(k)（ATCC受託番号第75373号）のそれぞれに含まれる、ブタ成体ベータグロビンプロモーター調節領域、ブタ3'ベータグロビン領域およびブタイプシロングロビン遺伝子を含む核酸の単離精製物を提供する。トランスジェニックブタの作製のためには、構築物を直鎖状化することが望ましい。ベクター配列は除去する方が望ましい。５．２．トランスジェニックブタの作製トランスジェニックブタを作製するために、上記の組換え構築物を、マイクロインジェクション、胚性幹（ＥＳ）細胞操作法、エレクトロポレーション、セルガン、トランスフェクション、トランスダクション、レトロウィルス感染その他を含む当分野で既知の方法のいずれによっても使用することができるが、これに限定されるわけではない。各種構築物は個別にまたは２種またはそれ以上の構築物のグループとして導入することができる。本発明の好ましい特定の態様として、下記第６節の実施例で述べる方法によって、トランスジェニックブタが作製される。簡単に述べると、性的に成熟した若い未妊娠の雌ブタ（＞７ヵ月令）に、１２から１４日間経口的に活性のプロゲストーゲン（アリルトレンボロン (allyl trenbolone)、ＡＴ：15mg／ブタ／日）を与えることにより、発情期を一致させる。ＡＴ投与の最終日、８時および１６時に、すべての雌ブタに、プロスタグランジンＦ_2a（ルタリーゼ(Lutalyse)：10 mg／ｌ注射）を筋肉注射（ＩＭ）する。ＡＴ摂取の最終日の２４時間後、すべてのドナー雌ブタに、妊娠した雌ウマの血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ：1500ＩＵ）を１回ＩＭ注射する。ＰＭＳＧ後80時間目、すべてのドナーにヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ＨＣＧ：750ＩＵ）を投与する。ＡＴ停止後、ドナーおよびレシピエント雌ブタを、成熟雄ブタを使って発情のサインを１日２回チェックする。ＨＣＧ投与後36時間以内に発情を示したドナーに、発情の始まりから12時間目と24時間目に、（それぞれ）人工および自然受精によって妊娠させる。ＨＣＧ投与後59から66時間の間に、以下の操作を使用して、妊娠したドナーから手術によって、１および２細胞卵を取り出す。耳部末梢静脈からのアセプロマジン0.5mg／体重１kgおよびケタミン1.3mg／体重１kgの投与によって全身麻酔を行なう。麻酔に続いて、腹部中心開腹手術によって、生殖管を露出させる。引き伸ばしたガラスカニューレ（外径5mm、長さ８cm）を卵管孔に挿入し、絹糸（２ −０）１本でロート部に固定する。卵管連結部の２cm前方の卵管の内腔中に20ｇ針を挿入することにより、卵を逆方向に流しだす。0.4％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充した無菌ダルベッコリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を卵管内に注入し、ガラスカニューレの方に流す。内液を17x100mm滅菌ポリスチレン管に集める。流出液を10x60mmのペトリ皿に移し、ワイルド（Wild）Ｍ３立体顕微鏡を使用して、低倍率(50x)で探索する。すべての１または２細胞卵を1.5%ＢＳＡを補充したブリンスター（Brinster）改変卵培養−３液（ＢＭＯＣ−３）で２回洗浄し、油の下のＢＭＯＣ−３の50μl液滴中に移す。マイクロインジェクションを実施するまで、卵を38℃、90％Ｎ₂、５％Ｏ₂、５％ＣＯ₂雰囲気下で保存する。１および２細胞卵を、1.5％ＢＳＡを補充したＨＥＰＥＳ培養液１mlを含むエッペンドルフ管中に入れ（１管あたり15個の卵）、１細胞卵中の前核および２細胞卵中の核を可視化するため、14000ｘｇで６分間遠心する。さらに、卵をデプレッション（depression）スライド上の油下のＨＥＰＥＳ培地５−10μl液滴中に移す。ノマルスキ(Nomarski)光学系および２つのライツ(Leitz)ミクロマニピュレーターを備えたラボールー(Laborlux)顕微鏡を使用して、マイクロインジェクションを行なう。ＤＮＡ構築物（トリス−ＥＤＴＡ緩衝液１μlあたり約１ng の濃度で直鎖状化）10-1700コピーを１細胞卵の１つの前核中にまたは２細胞卵の両方の核中に注入する。マイクロインジェクションされた卵は、適当なレシピエントに移される前に、油下のＢＭＯＣ−３培養液の微小液滴内に戻し、38℃、90％Ｎ₂、５％ＣＯ₂、５％Ｏ₂雰囲気下に保持する。卵は好ましくは摘出後10時間以内に移入される。ドナーと同日または24時間後に発情を示すレシピエントのみを胚の移入に使用することが望ましい。レシピエントを、前述したように麻酔する。１つの卵管を外に出した後、注入を受けた１および／または２細胞卵を少なくとも30個と対照卵４−６個を、以下の方法によって移入する。21ｇｘ３／４バタフライ注入セットから管を１ccの注射器に接続する。卵と１−２mlのＢＭＯＣ−３培養液とを管中に吸引する。さらにその管を卵管孔に通し、先端が卵管の下方３分の１または狭窄部に達するように入れる。管をゆっくり引抜くとともに、卵が発射される。生殖管の露出部分を、無菌の10％グリセロール−0.9％生理食塩水に浸し、体腔中に戻す。白線（linea alba）を取り囲む結合組織、脂肪および皮膚を３つの別々の層として縫合する。白線を閉じるのに、連続したハルステッド（Halstead ）縫合法を使用することができる。脂肪および皮膚はそれぞれ単純な連続Ｕ字縫合によって閉じる。そして切開部位に、局所抗菌剤（例えばフラゾリドン(Furaz olidone))を投与する。レシピエントはおよそ４つのグループに分け、標準16％粗タンパク質のコーン −大豆ペレット飼料1.8kgを与える。18日目（０日目＝発情の開始）から、成熟雄ブタを使って、すべてのレシピエントの発情のサインを毎日チェックする。35 日目に、超音波を使用して妊娠の検査を実施する。妊娠107日目に、レシピエントを分娩施設に移動させる。分娩時に確実に立合うため、妊娠112日目の８時および14時にプロスタグランジンＦ_2a（１回の注射あたり10mg）を投与して、分娩を誘導する。レシピエントのすべての場合において、ＰＧＦ2aの投与後34時間以内に分娩がおこると予想される。出生後24時間目に、すべての子ブタは次のような処置を受ける。すなわち、耳に切り込みを入れる、とがった歯を切る、１ccのデキストラン鉄を投与する等である。尾部の生検および血液も各ブタから採取する。この方法によって作製したブタは下記第６節の実施例に述べられ、そして図２に示される。これらのブタは健康であり、貧血ではなく、そして同腹の非トランスジェニック子ブタと同程度の成長をとげるようである。これらのブタはそのトランスジーンをその子孫に伝えることができる。ある特定の性質を有するブタはヒトヘモグロビンの生産に特に有用でありうる。こうしたブタの例として本発明の特定の好ましい、しかしこれに限定するわけではない態様を以下に示す。本発明の好ましい具体例の１つによれば、トランスジェニックブタは少なくとも20コピーのグロビントランスジーンを含む。２番目の具体例によれば、高度(altitude)、酸素濃度、妊娠、ヘモグロビンの変異型の存在その他の要因を考慮して、本発明のトランスジェニックブタの全血のＰ₅₀は、同様の非トランスジェニックブタのＰ₅₀よりも、少なくとも10％増大している。こうして、本発明は、ヒトグロビントランスジーンを保有および発現し、トランスジェニックブタの全血のＰ₅₀が、同高度において、同様の妊娠していない非トランスジェニックブタのＰ₅₀よりも、少なくとも10％大きい、非妊娠トランスジェニックブタを提供する。他の好ましい特定の態様において、本発明は、生産されるヒトグロビン量が、総ヘモグロビンに対して、少なくとも２％、より好ましくは少なくとも５％、最も好ましくは少なくとも10％であるトランスジェニックブタを提供する。下記第６節に、本発明の好ましい、しかし限定しない具体例に使用される、トランスジェニックブタについて記載する。 5.3.ヒトヘモグロビンの調製とブタヘモグロビンからのその分離本発明は、ヒトアルファグロビンとヒトベータグロビン遺伝子等のヒトヘモグロビンをコードする１以上のトランスジーンを適当な１以上のプロモーターの制御下にブタの遺伝物質中に導入して、ヒトヘモグロビンを少なくとも一部の血液細胞中で発現するトランスジェニックブタを作製することを含むヒトヘモグロビンの生産方法を提供する。本発明はまた、（ｉ）ヒトアルファグロビンとヒトベータグロビンの遺伝子を適当な１以上のプロモーターの制御下にブタの遺伝物質中に導入して、ヒトヘモグロビンを少なくとも一部の赤血球中で発現するトランスジェニックブタを作製し、（ii）トランスジェニックブタから赤血球を集め、（iii）集めた赤血球の内容物を放出させて溶解物を形成し、（iv）その赤血球溶解物を、ヒトヘモグロビンをブタヘモグロビンから実質的に分離させる精製法に供し、そして（ｖ）精製ヒトヘモグロビンを含有するフラクションを集める、ことからなるヒトヘモグロビンの生産方法を提供する。そのようなフラクションは等電点電気泳動により適当な標準品と平行させて同定することができる。本発明の好適な実施態様において、ヒトヘモグロビンはブタヘモグロビンからDEAE陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離することができる。ヒトヘモグロビンを上記のトランスジェニックブタから調製するにあたって、赤血球をブタから公知の方法を用いて採取する。次に、蒸留水等の低張液中での溶血などの方法を用いるか、またはMethods in Enzymology，Vol.76（1981）に記載の方法および／または接線流動濾過（tangential flow filtration）を用いて赤血球を溶解する。ヒトヘモグロビンが特定のトランスジェニックブタにより生産されているかどうかを確認するためには、溶血物の小規模電気泳動による分析、例えば標準的な技術を用いる等電点電気泳動の実施が有用であろう。これとは別に、または大規模精製のために、イオン交換クロマトグラフィーを用いてヒトヘモグロビンをブタヘモグロビンから分離してもよい。驚くべきことに、第７節で記載するように、ヒトヘモグロビンはイオン交換クロマトグラフィーを用いてブタヘモグロビンから容易に分離することが観察された一方で、マウスヘモグロビンとヒトヘモグロビンはそのような方法では分離することはできなかった。当業者に公知のまたは開発されているいかなるイオン交換樹脂も利用することができ、例えばジエチルアミノエチル、Q-セファロース、QCPI（I.B.F.）、Zephyr、Spherodex、ectiola、カルボキシメチルセルロース等を含む樹脂を挙げることができるが、その樹脂がDEAE樹脂を用いて達成される分離に匹敵するヒトおよびブタのヘモグロビンの分離をもたらすのであれば、これらに限定されるものではない。限定を目的とするものではない本発明の特定の実施態様にしたがって、ブタヘモグロビン（ヒト／ブタヘモグロビンハイブリッドを含む）からヒトヘモグロビンを分離して実質的に純粋なヒトヘモグロビンを得るために、上記のように調製したトランスジェニックブタ赤血球の溶血物を、pH 7.8の0.2 Mグリシン緩衝液で平衡化しておいたDEAE陰イオン交換カラムにかけて、これを5 mM NaClを含むpH 7.8の0.2 Mグリシン緩衝液で洗浄し、次に5〜30mMのNaCl勾配またはそれと同等な溶出液（例えば下記第９節を参照されたい）で溶出する。驚いたことに、ヒトとブタのグロビン鎖間の約85パーセントの相同性にもかかわらず、こうした処理の際にヒトヘモグロビンはブタヘモグロビンよりも速く溶出して、ヒトとブタのヘモグロビンは容易に分離する。溶出を405 nmの吸光度および／または連続フラクションから分取したアリコートの電気泳動によりモニターしてもよい。ブタヘモグロビンならびにブタとヒトのグロビン鎖とで形成されたヘテロ２量体からなる４量体ヘモグロビンは、この方法によりヒトヘモグロビンから分離できる。トランスジェニックブタで生産され、この方法でブタヘモグロビンから分離されたヒトヘモグロビンは、天然のヒトヘモグロビンと同様の酸素結合能を有している。限定を目的とするものではない本発明のもう一つの特定の実施態様によれば、ヒトヘモグロビンはブタヘモグロビン（ヒト／ブタヘモグロビンハイブリッドを含む）からQCPIイオン交換樹脂を用いて例えば以下のように分離することができる。トランスジェニックブタの赤血球から調製した約10 mgのヘモグロビンを20 ml の緩衝液Ａ（緩衝液Ａ＝10 mMトリス、20 mMグリシン、pH 7.5）で希釈する。次に、この20 mlの試料を緩衝液Ａで平衡化しておいたQCPIカラム（10 ml）に約5m l／分の流速でかける。次に、このカラムを２倍容量の緩衝液Ａで洗浄し、次に2 0カラム容量の0〜50 mMのNaCl勾配（10カラム容量の緩衝液Ａ＋10カラム容量の1 0 mMトリス、20 mMグリシン、50 mM NaCl、pH 7.5）で溶出するか、または６カラム容量の10 mMトリス、20 mMグリシン、15 mM NaCl、pH 7.5で溶出して、O.D.₂₈₀で吸収を示す物質を各フラクションに集めることで分離ヘモグロビンを得て、ヒトヘモグロビンを例えば等電点電気泳動により適当な標準品を用いて同定する。前記QCPIカラムは２カラム容量の10 mMトリス、20 mMグリシン、１M NaCl、pH 7.5による溶出で浄化できる。ある種の変異型ヘモグロビンに関しては、改良された精製方法を用いるのが望ましい。よって、ブタHbからHbプレスビテリアンを分離するためには、後記第12 .1節に記載の方法を用いることができ、Hbヨシズカの分離には後記第12.2節に記載の方法を用いることができる。 5.4.ヒト／ブタハイブリッドヘモグロビンの調製さらに、本発明は本質的に精製され単離されたヒト／ブタハイブリッドヘモグロビン、特にヒトα／ブタβハイブリッドヘモグロビンを提供する。ブタα／ヒトβハイブリッドの形成は再会合実験においてin vitroでもトランスジェニックブタにおいてin vivoでも、これまで観察されたことはない。本発明はハイブリッドヘモグロビンおよび代用血液としてのその利用、ならびに適当な製剤上の担体中に本質的に精製され単離されたヒト／ブタヘモグロビンハイブリッドを含有する医薬組成物を提供する。ハイブリッドヘモグロビンは、ここに記載するように、トランスジェニックブタから調製することができ、次にこれをクロマトグラフィー、免疫沈殿または当業者に知られている他の方法により精製できる。等電点電気泳動を用いるヘモグロビンハイブリッドの分離を図３と図５に示す。もしくは、ヒトとブタの両方のグロビン配列を有する核酸構築物を用いて、これを任意の適当な微生物、細胞またはトランスジェニック動物中で発現させてハイブリッドヘモグロビンを調製してもよい。例えば、適当なプロモーターの制御下にあるヒトαグロビン遺伝子とブタβグロビン遺伝子を含む核酸構築物を発現させてハイブリッドヘモグロビンを得てもよい。一つの具体的な例として、サイトメガロウィルスプロモーターの制御下にあるヒトαグロビン遺伝子とブタβグロビン遺伝子をCOS細胞等の哺乳類の細胞にトランスフェクトさせて、ハイブリッドヘモグロビンをそれら細胞から採取してもよい。もしくは、そのような構築物を酵母または細菌に発現させてもよい。ヘモグロビンハイブリッドを非免疫原性とするため、例えばポリエチレングリコールに結合させるか、またはヘモグロビンを膜中に、例えばリポソーム中に包接させることによりハイブリッドを修飾することも望ましい。 6.実施例：ヒトヘモグロビンを生産するトランスジェニックブタの創製 6.1.材料と方法 6.1.1.核酸構築物トランスジェニックブタを作るために、116構築物（ααβ構築物）、185構築物（αｐβ構築物）、263構築物（αｐδ構築物）、339、293および294構築物を上記のようにブタの卵にマイクロインジェクションした。 6.1.2.トランスジェニックブタの生産性的に成熟した雌ブタ（＞７カ月齢）に経口で活性のあるプロゲストゲン（アリルトレンボロン（allyl trenbolone(AT)：15mg/一匹/日）を12〜14日間与えることにより発情を同時に誘発させた。AT給餌の最後の日にすべての雌ブタにプロスタグランジンF_2a（Lutalyse：10 mg/注射）を0800と1600で筋内注射を行なった。AT消費の最後の日から24時間後にすべてのドナー雌ブタに妊馬血清性腺剌激ホルモン（ゴナドトロピン）（PMSG：1500 IU）を筋内に１回注射した。ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（HCG：750 IU）をPMSG注射の80時間後にすべてのドナーに投与した。 AT給餌中止後、ドナーの雌ブタとレシピエント雌ブタを成熟雄ブタを用いて発情の徴候を毎日２回チェックした。HCGの投与後3 6時間以内に発情を示したドナーを発情開始の12時間後と24時間後にそれぞれ人工および自然の授精を用いて妊娠させた。 HCG投与の59〜66時間後に以下の方法を用いて妊娠ドナーから１細胞卵と２細胞卵を外科的に回収した。体重１kgにつき0.5 mgのアセプロマジンと1.3 mgのケタミンをそれぞれ耳の末梢血管からの投与により全身麻酔を行なった。麻酔後、中央腹部の開腹に続いて生殖管を摘出した。機械引き板ガラスのカニューレ（5 mmのO.D.、8 cmの長さ）を卵管口に挿入し、これを一本の絹糸（2-0）を用いて縫合して漏斗に固定した。子宮管結合部分から2 cm前方の卵管の内腔に20 gの注射針を挿入して卵を逆流させて流した。0.4 %ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補った無菌のダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）を卵管に注入してガラスカニューレに向けて流入させた。その媒質を無菌の17×100 mmポリスチレン管に集めた。流入液を10×60 mmのペトリ皿に移し、Wild M3立体顕微鏡を用いて低倍率（50×）で調べた。すべての１細胞卵と２細胞卵を１．5%のBSAを補ったB rinster's Modified Ova Culture-3 培地（BMOC-3）中で二回洗浄し、油下の50 μlの液滴形態のBMOC-3培地に移した。マイクロインジェクションを行なうまで卵を38℃で90% N₂、5% O₂、5% CO₂雰囲気下に保存した。１細胞卵と２細胞卵を1.5 % BSAを補った1 mlのHEPES媒質を含有するエッペンドルフチューブ（１チューブあたり15卵）に入れ、６分間14000×gで遠心し、１細胞卵中の前核と２細胞卵中の核を目で見て確認できるようにした。次に押し下げスライド上で油下の5〜10μlのHEPES媒質の液滴に卵を移した。マイクロインジェクションをNomarski光学素子と二つのLeitzマイクロマニピュレーターを有するLaborlux顕微鏡を用いて行なった。DNA 構築物の10〜1700コピー（Tris-EDT A緩衝液中１ ng/μl）を１細胞卵中の一つの前核または２細胞卵中の両方の核に注入した。マイクロインジェクトした卵を油下のBMOC-3培地の微小液滴に戻し、それらを適当なレシピエントに移植する前に、90% N₂、5% CO₂、5% O₂雰囲気下、38℃で維持した。卵は回収後10時間以内に移植した。ドナーと同じ日かまたは24時間遅れて発情を示したレシピエントのみを胚の移植のために利用した。レシピエントはすでに記載したように麻酔した。一つの卵管を摘出した後に、少なくとも30個のインジェクトした１細胞卵および／または２細胞卵と４〜６個の対照卵を以下の方法で移植した。21 g×3/4バタフライ注入セットの管を1 ccの注射器につないだ。上記の卵と１〜２ミリリットルのBMOC -3培地をその管に吸引した。次にその管をその先が卵管の底部1/3または狭窄部に達するまで卵管の開口部に挿入した。次にその管をゆっくりと引き出しながら、卵を注入した。生殖管の露出部分を無菌の10 %グリセリン／0.9 %生理食塩水溶液に浸し、体腔に戻した。白線をおおう結合組織、脂肪および皮膚を３つの分離層として縫合した。とぎれのないHalstead縫合を用いて白線を閉じた。脂肪と皮膚は単純で連続的なマットレス縫合を用いてそれぞれ閉じた。次に、局所的な抗菌剤（フラゾリドン）を切開領域に投与した。レシピエントを４つのグループに分けて囲いに入れ、1.8 kgの標準16％粗タンパク質コーン大豆ペレット餌を与えた。18日目（０日目＝発情の開始）から始めて、すべてのレシピエントが発情の徴候について成熟雄ブタを用いて毎日チェックされた。35日目に妊娠の検出を超音波を用いて行なった。妊娠の107日目にレシピエントを分娩室に移した。分娩時の世話を確実とするために、妊娠の112日目、0800と1400時にプロスタグランジンＦ_2aの投与（10 mg/1回の注射）により分娩を誘導した。すべての場合に、レシピエントはPGF_2aの投与後34時間以内に分娩した。生まれて24時間後に、すべての子ブタについて耳に刻印し、尖った歯を短くし、１ccの鉄デキストランの投与を行なう、等の処置を行なった。尾の生検サンプルと血液も各ブタから得た。 6.2.結果と考察 3566個の注入された卵のうち、ヒトヘモグロビンを発現する13匹のトランスジェニックブタが生まれ、このうち２匹がトランスジェニックブタであることとは全く関係のない通常の分娩に関連する出来事のために誕生後にすぐに死んだ（表Ｉ）。残りの11匹は健康であるように見えた。一匹のトランスジェニックブタの写真を図２に示す。作られたブタの特徴と「真正」ヒトヘモグロビンと「ハイブリッド」ヒトヘモグロビン（"HB"）のパーセントの概略を下記の表IIに示す。全ヘモグロビンは、ヒトαβにヒトαブタβハイブリッドの２分の１を足した合計として計算された。図３は、これらのうち３匹のブタ（12-1、9-3および6-3）により生産されたヘモグロビンの等電点電気泳動とトリトン酸尿素ゲルの結果を示し、これらの動物におけるヒトαおよびβグロビンの発現が示されている。表IIIはブタ番号9-3の子孫の特徴を示すもので、トランスジェニックブタのＦ１世代はヘモグロビンを発現することができることを示している。注意すべきことに、ブタ番号9-3の子孫のどれもがトランスジェニックではないことがわかったが、これはおそらくこの動物の生殖組織にトランスジーンが欠如しているためであろう。表IVは、"185"構築物を有するブタ38-4の子孫のヘモグロビン発現データを示す（"αｐβ"構築物；図1Bを参照）。表Vはブタ番号38-4の子孫の特徴の要約を示し、ここで高パーセント（37.1 %）をしめる子孫がヒトヘモグロビンの発現に陽性であり、トランスジーンの生殖系列伝達を示している。図19は、トランスジーンが陽性である代表的な38-4の子孫におけるヘモグロビン発現レベルを示す等電点電気泳動の結果を示す。トランスジェニックブタの誕生体重は、トランスジェニックではない同腹の子の誕生重量にほぼ等しいものであった。トランスジェニックブタは成熟しても、体重は対照動物の体重に匹敵し続けた。 7.実施例： DEAEクロマトグラフィーによるブタヘモグロビンからのヒトヘモグロビンの分離 7.1.材料と方法 7.1.1.DEAEクロマトグラフィーによる精製精製のために、赤血球をエッペンドルフマイクロ遠心機により5000 rpmで３分間遠心して集め、（元の血液と）等量の0.9% NaClで３回洗浄した。赤血球を1.5 倍容量の脱イオンH₂Oで溶血させ、15,000 rpmで遠心し、その上清を陰イオン交換クロマトグラフィーで分画した。DEAEセルロースクロマトグラフィー（Whatma n社製造のDE-SE）をW．A．SchroederとT．H．J．Huismanの「ヘモグロビンのクロマトグラフィー」（"The Chromatography of Hemoglobin"）、Dekker社、ニューヨーク、74〜77ページにしたがって行なった。上記の赤血球溶血物0.25 mlをp H 7.8の0.2 Mグリシンで平衡化しておいた1 cm×7cmのDE-52カラムにかけて、５カラム容量の0.2 Mグリシン、pH 7.8／5 mM NaClで洗浄した。ヘモグロビンは20 0 mlの5〜30 mM NaCl／0.2 Mグリシン、pH 7.8勾配で溶出した。ブタヘモグロビンの溶出を終わらせるために、さらに50〜100 mlの30 mM CaCl／グリシン、pH 7 .8をカラムに加えた。ヘモグロビンの溶出を415 nmの吸光度とカラム画分のIEF 分析によりモニターした。 7.1.2.グロビン鎖の再会合グロビン鎖の再会合は、実質的には、メソッドインエンザイモロジー、76巻、 126〜133ページに記載されたように実施した。25ラムダのブタ血液、25ラムダのヒト血液、または12.5ラムダのヒト血液と12.5ラムダのブタ血液の混合物25ラムダを以下のとおり処理した。それら血液をマイクロ遠心機に５検体セットして2 分間の遠心でペレット化し、次に100ラムダの0.9パーセントのNaClで３回洗浄した。この細胞を50ラムダのH₂Oで溶解させ、次に高速度で回転させて溶解を確実にした。次に、50ラムダの細胞溶解物を50ラムダの0.2 M酢酸ナトリウム、pH 4. 5と一緒にして、氷中に置き低温室で一晩インキュベートした。1.9 mlの0.1 M N aH₂PO₄、pH 4.5を添加した後、各サンプルをセントリコン（centricon）管中で約0.5 mlが残るまで4℃および5Kで回転させた。次に、1 mlの0.1 M NaH₂PO₄、pH 7.4を添加して約0.2 ml容量が残るまで約5Kで回転させた。次にヘモグロビンをセントリコン管の壁から洗って、エッペンドルフアダプターを取り付け、テーブルトップ型マイクロ遠心機を用いてそのセントリコン管から各サンプルを除去した。次にそれらサンプルを等電点電気泳動で分析した。 7.2.結果と考察 7.2.1.ヒトヘモグロビンとブタヘモグロビンがヒトおよびブタ血液の溶血混合物から分離されたヒトとブタの血液を等量で混合し溶解して得られた溶血物を上記のようにDEAE クロマトグラフィーに供した。図4Aに示すように、ブタヘモグロビンはヒトヘモグロビンから事実上完全に分離した。この完全な分離はヒトとブタのヘモグロビンの構造的類似性、すなわちブタとヒトのαグロビン鎖は84.4パーセントの相同性があり、ブタとヒトのβグロビン鎖は84.9パーセントの相同性があることに鑑みれば驚くべきことである。このことは、さらに図4Cに示されているように、ヒトとマウスの血液を上記第7.1.1.節に示す方法にしたがって混合し、溶血させDEAEカラムにかけて溶出した場合、マウスとヒトのαグロビン鎖は約85.5パーセントの相同性があり、マウスとヒトのβグロビン鎖は約80.1パーセントの相同性があるにもかかわらず、ヒトとマウスのヘモグロビンの分離が観察されなかったので、驚くべきことである。DEAE樹脂によるヒトとブタのヘモグロビンの分離の容易さは十分でありしかも経済的であるように思える。興味深いことに、陰イオン交換カラムからのタンパク質の溶出の順序は予想されたとおりではなかった。IEFゲルから推定されるタンパク質の相対的なｐＩに基づけば、溶出の予想される順序は最初にハイブリッド（ヒトα／ブタβ）、次に真正のヒトα／ヒトβとなるはずである。その後に陰イオン交換カラムから溶出する最後のタンパク質は内在性のブタα／ブタβタンパク質となるはずである。しかし、今回試みられたすべての条件下では、溶出の順序が変わってヒトヘモグロビンが最初に溶出した。第二のピークはハイブリッドに富む画分で、次に非常に接近しながらブタヘモグロビンが溶出した。 7.2.2.ヒトとブタのヘモグロビンおよびヒト／ブタの異種ヘモグロビンがトランスジェニックブタから調製された溶血物から分離されたトランスジェニックブタ6-3（上記第6節に記載）の血液を低張での膨潤により溶解して得られた溶血物を上記のようにDEAEクロマトグラフィーに供した。図4Bに示すように、ヒトヘモグロビンは、ブタヘモグロビンから分離され、かつヒトαグロビン／ブタβグロビン異種ヘモグロビンからも分離された。図4Dに示すように、ヒトヘモグロビンはこの方法により実質的に精製された。 7.2.3.再会合データに基づけば、ブタアルファグロビン／ヒトベータグロビン異種ヘモグロビンは形成されないと思われるブタアルファグロビン鎖とヒトベータグロビン鎖との異種会合は、ヒトヘモグロビンを発現するトランスジェニックブタから得られた溶血物には検出されなかった。しかし、この観察は比較的低いレベルのヒトβグロビンの発現によるものと説明することも可能である。もしくは、ブタアルファグロビンとヒトベータグロビンとの会合は化学的に有利ではないのかもしれない。この可能性を調べるために、ブタおよびヒトのヘモグロビンを混合して、解離させ、次にグロビン鎖を再会合させる再会合実験を行なった。図５に示す等電点電気泳動ゲルに示されているように、ブタα／ブタβ、ヒトα／ヒトβ、それにヒトα／ブタβの会合が観察されたが、ブタαグロビンとヒトβグロビンとの間の会合は起こらなかったようであった。したがって、ブタα／ヒトβ異種ヘモグロビンは、トランスジェニックブタからのヒトヘモグロビンの精製に面倒をひきおこすことはないと予想される。 8.実施例：QCPIクロマトグラフィーによるブタヘモグロビンからのヒトヘモグロビンの分離 8.1.材料と方法トランスジェニックブタ6-3からの清澄溶血物13 mg/ml；緩衝液Ａ（10 mMトリス、20 mMグリシン、pH 7.5）、緩衝液Ｂ（10 mMトリス、20 mMグリシン、15mM NaCl、pH 7.5）；緩衝液Ｃ（10 mMトリス、20 mMグリシン、1 M NaCl、pH7.5）；緩衝液Ｄ（10 mMトリス、20 mMグリシン、50 mM NaCl、pH 7.5）；緩衝液Ａで平衡化させた10 mlのQCPIカラム；トリオ精製システム。トランスジェニックブタ6-3から調製した10 mgのヘモグロビンを 20 mlの緩衝液Ａに希釈した。20 mlのサンプル溶液をQCPIカラムに5 ml/分の流速でかけて、２倍容量の緩衝液Ａで洗浄した。次に、このカラムを20倍容量の0 〜50 mMのNaCl勾配で洗浄した。（10カラム容量の緩衝液Ａ＋10カラム容量の緩衝液Ｄ）およびO.D.₂₈₀吸収物質を集めた。次にカラムを２カラム容量の緩衝液Ｃで浄化し、次に２カラム容量の緩衝液Ａで再平衡化した。 8.2.結果 UVモニターによる分析（勾配体積に対するピーク）（図６）により、ヒトヘモグロビンが15 mM NaClで溶出したことが明らかとなった。それに続く精製は勾配溶出によらず６倍容量の緩衝液Ｂ（15 mM NaCl）のみを用いて上記と同じ方法で実施してヒトヘモグロビンを溶出させた。さらに、この方法によるクロマトグラフィーでは、トランスジェニックではないブタのヘモグロビンは緩衝液ＢではQC PIから溶出しない一方で、天然のヒトヘモグロビンは溶出する。15 mMのNaClで溶出したタンパク質を分離等電点電気泳動システムで分析したところ、実質的に純粋でブタヘモグロビンもハイブリッドヘモグロビンも夾雑していないことがわかった。 9.実施例：ヒトアルファ／ブタベータグロビンハイブリッドヘモグロビンは増大したＰ₅₀を示す上記の表IIと表IIIに示されているように、本発明のトランスジェニックブタはすべて有意な量のヒトα／ブタβグロビンハイブリッドヘモグロビンを生産することがわかった（ブタα／ヒトβハイブリッドは観察されなかった）。重要なことに、高いパーセントのハイブリッドを発現したブタはその全血に関しても増大したＰ₅₀値を示すように思われた（図７）。 10．実施例：ブタβグロビンの調節配列を用いる増強発現ブタ成体βグロビン遺伝子プロモーター領域（図８）を含む339構築物（図1R と図12）を用いて、上記第6.1.2.節に記載の方法にしたがってトランスジェニックブタを作った。図15はブタ70-3により生産されたヘモグロビンの等電点電気泳動ゲル分析を示し、116構築物（図1A）を有するトランスジェニックブタ6-3からの等量のヘモグロビンと等量のヒトヘモグロビンを比較のために隣接するレーンで泳動した。（ブタ6-3ヘモグロビンを含有するレーンに比較して）ヒトヘモグロビンとハイブリッドヘモグロビンに対応する位置においてブタ70-3ヘモグロビン含有レーンで観察される明るいバンドにより示されるように、ブタ70-3により生産されるヒトヘモグロビンの量はブタ6-3により生産される量よりも多い。ブタ70-3により作られた全ヘモグロビンの38パーセントがヒトヘモグロビンと算出されたのに対し、ブタ6-3により生産された全ヘモグロビンの10パーセントがヒトヘモグロビンと算出された（データと計算に関しては、上記の表IIと第6.2.節を参照されたい）。このことは、ブタβグロビンプロモーター領域は、トランスジェニックブタにおいてヒトβグロビンプロモーターよりも効率的であることを示唆するものである。別の一連の実験において、ヒトヘモグロビンを発現するさらに２匹のトランスジェニックブタが"339"構築物を用いて得られた（ブタ80-4とブタ81-3）（図17 ）。これらのトランスジェニックブタにおけるヒトヘモグロビンの量は等電点電気泳動ゲルとその各バンドのデンシトメータ走査により測定した（図18）。図17 に示されているように、ブタ70-3とブタ80-4の両方が高レベルの真正ヒトヘモグロビンを発現した。トランスジーンのコピー数を得るために、ゲノムDNA（その尾から単離したもの）をEcoR Iで消化し、サザンブロットを行なった。用いられたプローブは、第一エキソン、第一イントロンおよび第二エキソンの一部を含むヒトβグロビン遺伝子の427 bp NcoI/Bam HI断片であった。 11．実施例：ブタヘモグロビンの分子モデルとブタβグロビンとヒトαグロビンとのハイブリッドのα₁β₁境界面ハイブリッドのヒトα／ブタβヘモグロビンの量はヒトヘモグロビンの量をしばしば超えることがわかった。この観察の分子的基礎を分子モデルと分子生物学を用いて調べた。ハイブリッド分子のモデル構造はヒトヘモグロビンの公知の構造とヒトおよびブタのヘモグロビン構造間の構造的相同性に基づいている（A．M ．Lesk，1991，Protein Architecture：A Practical Approach，Oxford Univers ity Press，N.Y．）。ブタヘモグロビン構造とハイブリッドヘモグロビン構造を、以下の４ステップを用いてモデル化した。すなわち、(1)水素原子をｘ線モデルに加えてそれらの位置をエネルギー最小化を用いて変更する；(2)アミノ酸残基置換を導入して、対象とするブタとハイブリッドの構造をモデル化し（鎖の整合は必要ではない）；(3)これらの修飾残基の側鎖位置をエネルギー的に最小化させ；そして(4)その結果を目でみて調べて確かであるとわかったという４ステップである。すべての該当する接触を詳細に調べることで、いくつかの残基で著しい差異が示された。例えば、β112の位置で、ヒトヘモグロビンはシステイン残基を有するが、そのハイブリッドはバリン残基を有する。このバリンは反対のサブユニットに明らかに近い位置で接触（図20の矢印）しているため、そのα₁β₁境界面の安定化により効果的と思われる（図21）。 HINTにより予想される疎水性および極性の相互作用に対するα₁β₁境界面でのアミノ酸置換の効果を表VIに示す。HINTは、バージニア州リッチモンドのバージニア医科大学からライセンスされたバージニアコモンウェルス大学のソフトウェアであり、実験物理化学測定より公知の親和および反発の相互作用により測定された正と負のスコアを分析することができる。表VIに未修飾の二量体と特定の置換を有する二量体との差異を示す。表VIIは表VIと同じ形式であるが、次の２点で異なっている：（１）各置換が加えられる時、その前のものが保存され、そして（２）報告されている差異は現在の二量体とその前の列で表されている二量体との比較である。変化が続いて起こるにしたがって、境界面において予想された親和力が増加する。各欄を合計すれば、未修飾二量体と７つの変化を有する二量体との全体の差異が得られる。この合計は疎水性に関して+1340であり、極性に関して+660である。 12．実施例：トランスジェニック動物における遺伝的に修飾されたヘモグロビンの発現公知のヒトヘモグロビン変異体のうち、およそ24のものが低い酸素親和性を示し、これらは臨床的応用に有利でありうる。これらの変異体の多くが不安定なヘモグロビン分子をもたらすが、いくつかの変異体は望ましい生化学的性質を有し、これらを用いて組換えDNA技術により代用血液を作ることができる。これらの変異体のうち２つ、すなわちHbプレスビテリアン（108 Asn→Lys、図1G）および Hbヨシズカ（108 Asn→Asp、図1F）を発現するトランスジェニックブタを作った。そして発現されたヒトグロビンの精製と特性付けを以下に記載する。 12.1．Hbプレスビテリアンの精製と特性付け Hbプレスビテリアン（β108 Asn→Lys）に生じているアミノ酸置換の結果として、等電点電気泳動ゲル上でHbプレスビテリアンはハイブリッド（ｈαｐβ）ヘモグロビンと同じ泳動を示す。ハイブリッドヘモグロビンとブタヘモグロビンからのヒトヘモグロビンの精製に関する以前の結果およびそれらよりも陽電荷を帯びたHbプレスビテリアンの性質に基づけば、この変異体ヘモグロビンは陰イオン交換樹脂により精製するのがより容易であるに相違ない。約500 mlの血液をトランスジェニックブタ57-10から得た。この血液を等張生理食塩溶液で数回洗浄し、次に水中で低張膨潤させて溶解させた。細胞膜を10000×gで遠心して最終濃度が約100 mg/mlのヘモグロビンが得られた。Hbプレスビテリアンをハイブリッドヘモグロビンとブタヘモグロビンから以下のとおり精製した。1〜2.5gの溶血物を20 mMグリシンを含むpH 8.1の10m Mトリス塩酸（緩衝液Ａ）で平衡化させておいた450 mlのBiorad Macroprep High Q樹脂を充填したXK 50/30カラムにかけた。タンパク質を10 ml/分の流速で緩衝液Ｂ（250 mM NaClを含有する緩衝液Ａ）の9〜16 %の直線塩勾配で3000 mlにわたって溶出させた。最初のピークはHbプレスビテリアンで、その次にハイブリッドヘモグロビンとブタヘモグロビンが一緒に溶出すると考えられた（図20）。最初のピークがHbプレスビテリアンであってハイブリッドヘモグロビンではないことを確かめるために、タンパク質サンプルを逆相HPLCで分析した（図21）。陰イオン交換樹脂カラムからの最初のピークはHbプレスビテリアンであり、通常のヒトα鎖と同時に溶出するα鎖と通常のヒトβ鎖よりもわずかに速く溶出するβ鎖を有している。これは、ブタヘモグロビンがカラム分画物中に夾雑しているかどうかを決定する優れた方法であることもわかった。この精製方法とHPLCによるこの分析を用いて、トランスジェニックブタ58-10に由来する組換えHbプレスビテリアンが95 %以上の純度を有することがわかった。精製Hbプレスビテリアンを50 mM HEPES、および100mM NaCl、pH 7.4に対して透析し、酸素平衡曲線をHemoxアナライザー（TCS社製造、ペンシルバニア州、サウサンプトン、PA）を用いて決定した。このHemoxアナライザーは、アナログデータをデジタルデータに変換できるように一部改良して酸素結合の計算を容易にした。これらの条件下で、Hbプレスビテリアンは、Hb Aの13.3 mmHg（ヒル係数 n = 2.9）に対して25.8 mmHg（n = 2.3）のＰ₅₀を有し、Hbプレスビテリアンは天然Hbよりも低い親和性で酸素に結合することを示している。ボーア効果（酸素親和性に対するpHの影響）を測定するための予備結果では、Hbプレスビテリアンに関して通常のボーア効果が示された（図22）。 12.2．Hbヨシズカの精製と特性付け Hbヨシズカを発現するトランスジェニックブタ（68-3および68-2）の採血サンプルを実質的には上記と同じように処理した。溶血物の最終濃度は約100 mg/ml であった。しかし、このタンパク質の精製にはいくぶん異なる方法が必要であった。68-3からの溶血サンプル（約10 mg）を20 mMグリシンを含むpH 8.7の10 mM トリス塩酸（緩衝液Ａ）で平衡化させておいたHR 10/30 Biorad Macroprep High Q樹脂カラムにかけた。ヘモグロビンは2.5 ml/分で緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋250 m M NaCl）の5〜30 %の直線勾配により500 mlにわたって溶出させた（図23）。各画分を集めてIEFにより分析して純度を評定したところ約75 %以上と測定された。 13．実施例：ブタβグロビン座調節領域(LCR)のクローニングブタβグロビン座調節領域(LCR)をクローン化し、配列決定した。増強されたヘモグロビン発現を有するトランスジェニックブタを作出するために、ブタLCR の制御下にあるヒトグロビン遺伝子を含む構築物を使用することができる。 EMBL-3(Clonetech社、CA)中のブタゲノムライブラリーをプレートし、200 万個のプラークをスクリーニングした。ε遺伝子の12 Kb SALI断片由来の3 kbのSa l I−Eco HI断片（ブタε遺伝子の-1.9 kbから-4.9 kbまで伸びる）をプロープとして使用した。2個の陽性クローン(Phage LおよびPhage H)が単離された。制限酵素で処理したPhage LおよびPhage Hのサザン分析は、これらの2つのクローンが重なり合うことを示唆した(図26A)。Phage Hの7 kbおよび4 kb SSt1断片をプラスミドpGem3にサブクローン化し、プラスミドpPH2およびpPH1を得て、それぞれATCCに寄託し、pPH2は受託番号75519を、pPHIは受託番号75518を受けた。これらのプラスミドを配列決定し（Sp6およびT7プロモーターから）、その配列をヒトゲノム配列と比較した。一致する部分は全て染色体11に位置する、全βグロビン遺伝子座を含有するヒトβグロビン領域の配列であった。別のプライマーを用いて、PH1についてさらに配列決定を実施した。配列分析は、クローンPH1（PH1-TA1，図27A）の3’末端はヒトLCRI(図27B)に69%相同であることを示した。PH1の5’末端とPH2 の3’末端の配列を接合したところ(接合pl cr2、図28)、これがヒトLCRII（図29）に類似していることが判明した。PH2 の5 ’末端(PH2-T7、図30A)は、ヒトLCRIV(図30B)の配列に78.9% 相同性の38bpの領域を有する。 14．実施例：ヒトβグロビン遺伝子の最適化ヒトヘモグロビン遺伝子を有するトランスジェニックブタ由来の血液サンプルの分析は、ヒトαグロビンがヒトβグロビンよりも高レベルで発現されることを示している。トランスジェニック動物におけるヒトヘモグロビン４量体の全般的生産は、ヒトβグロビン遺伝子の発現を最適化することにより増加させることができる。このような最適化は、ｍＲＮＡの構造、安定性、または翻訳速度に作用することによってβグロビンの発現を向上させることが可能である。 βグロビンの発現レベルを増大させる１つのアプローチは、プロモーター領域からコード領域を通り、そしてポリアデニル化部位および３’非翻訳領域へと、ブタβグロビン遺伝子に類似しているが、真正な野生型ヒトβグロビンからのアミノ酸配列の変更が全く無い、ヒトβグロビン遺伝子を遺伝子工学的に作成することである。ポリメラーゼチェーンリアクション法、合成オリゴヌクレオチド及び制限酵素消化産物を用いて、構築物を遺伝子工学的に作成してヒトβグロビン遺伝子のブタにおける発現を最適化した。図３１に示すように、プロモーター領域、介在配列ＩおよびII(IVSIおよびIVSII)、ならびにポリＡおよび3’非翻訳領域はブタの配列で、ブタβグロビン遺伝子由来の制限酵素消化産物から得られたものである。エキソン１、エキソン２およびエキソン３はポリメラーゼチェーンリアクションまたはオリゴヌクレオチド合成（エキソン2 SfaN1からBam HI，およびエキソン3の全部）によって作成された。最適化配列とヒト配列とブタ配列のコーディング配列の比較を図３２に図示する。最適化配列中の線は、ヒト配列からの核酸変化を示す。表VIIIは、ヒト、最適化及びブタコーディング配列の間の変化数を示す。表は３つのエキソンに分割されており、ヌクレオチド、コドン、およびアミノ酸レベルでの変化を示す。ヒトおよびブタβグロビンコーディング配列の比較を図３５に示す。差異は、小文字でブタ（下方）配列に示してあり、またヌクレオチド変化を有するコドンには下線を引いてある。ヒトβグロビンと最適化βグロビンのコーディング配列、および最適化βグロビンとブタβグロビンのコーディング配列の比較は、図36 および図37にそれぞれ示す。最適化βグロビン遺伝子のコーディング配列及びアミノ酸配列を図38に示す。pGEM3β*△3'と称する、最適化βグロビン遺伝子を含有するプラスミドはATCCに寄託され、75520という受託番号を受けた。最適化βグロビン遺伝子を発現するため、多数の構築物が遺伝子工学的に作成された。構築物505(図33）はヒト座調節領域、それ自体のプロモーターによって作動されるヒトαグロビン遺伝子、これもまたそれ自体のプロモーターによって作動されるヒトξグロビン遺伝子、および最適化されたコーディング領域を有する最適化βグロビン遺伝子を含有する。この構築物中の遺伝子の順番は、LCR α εβ* である（ここで* は最適化β遺伝子を表す）。構築物515と称する第2の構築物（図34）は、ヒト座調節領域、それ自体のプロモーターによって作動されるヒトαグロビン遺伝子、これもまたそれ自体のプロモーターによって作動されるヒトξグロビン遺伝子、およびブタプロモーターによって作動されるブタイントロン、ポリＡ及び3’非翻訳領域を含む最適化βグロビン遺伝子を含有する。この構築物中の遺伝子の順番は、LCR εβ* ααである（ここで* は最適化β遺伝子を表す）。構築物505または515は、ヒトヘモグロビンを発現するトランスジェニックブタを作出するのに使用することができる。 15．微生物の寄託以下のプラスミドを20852メリーランド州、ロックビル、パークローン・ドライブ12301所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に寄託した。種々の文献をここで挙げたが、これらは参照として全文をここに組み入れる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 21/02 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ (72)発明者シャーマ，アジェイアメリカ合衆国 08648 ニュージャージー州ローレンスヴィル，フェイラーコート 24番地 (72)発明者ポーリアック，クララアメリカ合衆国 08542 ニュージャージー州プリンストン，マディソンストリート 22番地 (72)発明者コーリ−クリスチャンソン，アナスタシア，エム. アメリカ合衆国 19146 ペンシルバニア州フィラデルフィア，サウス 21エスティーストリート 622番地 (72)発明者ミダ，スニータアメリカ合衆国 08810 ニュージャージー州デイトン，ジェフリーコート 30 番地

Claims

【特許請求の範囲】１．ブタの生殖細胞および体細胞が、該ブタの赤血球内でのヒトαグロビン遺伝子の発現のために効果的なプロモーターに機能しうる状態で連結されたヒトαグロビン遺伝子を含んでおり、ヒトαグロビン遺伝子が胚形成期の段階で該ブタまたは該ブタの祖先に導入されたものである、トランスジェニックブタ。２．ブタの生殖細胞および体細胞が、該ブタの赤血球内でのヒトαグロビン遺伝子とヒトβグロビン遺伝子の発現のために効果的なプロモーターに機能しうる状態で連結されたヒトαグロビン遺伝子およびヒトβグロビン遺伝子を含んでおり、これらのヒトグロビン遺伝子が胚形成期の段階で該ブタまたは該ブタの祖先に導入されたものである、トランスジェニックブタ。３．ブタの生殖細胞および体細胞が、該ブタの赤血球内でのヒトδグロビン遺伝子の発現のために効果的なプロモーターに機能しうる状態で連結されたヒトδグロビン遺伝子を含んでおり、ヒトδグロビン遺伝子が胚形成期の段階で該ブタまたは該ブタの祖先に導入されたものである、トランスジェニックブタ。４．ヒトグロビン遺伝子が図１Ａに示した核酸１１６構築物を用いて導入されたものである、９−３と称する請求項２に記載のトランスジェニックブタまたはその子孫。５．ヒトグロビン遺伝子が図１Ｂに示した核酸１８５構築物を用いて導入されたものである、３８−４と称する請求項２に記載のトランスジェニックブタまたはその子孫。６．ヒトαグロビン遺伝子がヒトαグロビン遺伝子をそれ自体のプロモーターの制御下に含んでいるＬＣＲα核酸構築物を用いて導入されたものである、請求項１に記載のトランスジェニックブタ。７．ヒトαグロビンおよびβグロビン遺伝子が、ヒトαグロビン遺伝子をそれ自体のプロモーターの制御下に、そしてヒトεグロビン遺伝子とヒトβグロビン遺伝子をそれぞれそれら自体のプロモーターの制御下に含んでいる、ＬＣＲαおよびＬＣＲεβ核酸構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。８．ヒトグロビン遺伝子が図１Ａに示した核酸１１６構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。９．ヒトグロビン遺伝子が図１Ｂに示した核酸１８５構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 10．ヒトグロビン遺伝子が図１Ｃに示した核酸βｐα構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 11．ヒトグロビン遺伝子が図１Ｆに示した核酸ヨシズカ(Yoshizuka)構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 12．ヒトグロビン遺伝子が図１Ｇに示した核酸プレスビテリアン(Presbyterian) 構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 13．ヒトグロビン遺伝子が図１Ｈに示した核酸αｐβ（Δα）構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 14．ヒトグロビン遺伝子が図１Ｉに示した核酸２２７構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 15．ヒトグロビン遺伝子が図１Ｊに示した核酸２２８構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 16．ヒトグロビン遺伝子が図１Ｎに示したヘモグロビンボログナ(Hemoglobin Bo logna)構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 17．ヒトグロビン遺伝子が図１０に示した核酸３１８構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 18．ヒトグロビン遺伝子が図１Ｐに示した核酸３１９構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 19．ヒトグロビン遺伝子が図１Ｑに示した核酸３２９構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 20．ヒトグロビン遺伝子が図１Ｒに示した核酸３３９構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 21．ヒトグロビン遺伝子が図１Ｓに示した核酸３４０構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 22．ヒトグロビン遺伝子が図１Ｔに示した核酸４１構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 23．ヒトグロビン遺伝子が図１Ｕに示した核酸３４３構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 24．ヒトグロビン遺伝子が図１Ｖに示した核酸３４７構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 25．ヒトグロビン遺伝子が図１Ｗに示した核酸構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 26．ヒトグロビン遺伝子が図１Ｘに示した核酸構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 27．ヒトグロビン遺伝子が図１Ｙに示した核酸構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 28．ヒトグロビン遺伝子が図１Ｋに示した核酸２６３構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 29．ヒトグロビン遺伝子が図１Ｌに示した核酸２７４構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 30．１個の細胞中に２０以上で１００よりは少ないコピー数のグロビントランスジーンを含んでいる、請求項１、２または３に記載のトランスジェニックブタ。 31．妊娠していないトランスジェニックブタの全血のＰ₅₀が、同じ高度において、妊娠していない非トランスジェニックブタの全血のＰ₅₀よりも少なくとも１０％増大している、請求項１、２または３に記載のトランスジェニックブタ。 32．生産されたヒトグロビンの量が総ヘモグロビンに対して少なくとも２％である、請求項１、２または３に記載のトランスジェニックブタ。 33．生産されたヒトグロビンの量が総ヘモグロビンに対して少なくとも５％である、請求項１、２または３に記載のトランスジェニックブタ。 34．生産されたヒトグロビンの量が総ヘモグロビンに対して少なくとも１０％である、請求項１、２または３に記載のトランスジェニックブタ。 35．生産されたヒトグロビンの量が総ヘモグロビンに対して少なくとも２０％である、請求項１、２または３に記載のトランスジェニックブタ。 36．ヒトグロビン遺伝子が図３３に示した核酸５０５構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 37．ヒトグロビン遺伝子が図３４に示した核酸５１５構築物を用いて導入されたものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 38．ヒトαグロビンおよびブタβグロビンを含む、本質的に精製されかつ単離されたヒト／ブタヘモグロビンハイブリッド。 39．ヒトグロビン遺伝子とブタβグロビン遺伝子を適当なプロモーター配列の制御下に含む核酸構築物。 40．請求項38の本質的に精製されかつ単離されたヒト／ブタヘモグロビンハイブリッドを適当な製剤上の担体とともに含有してなる医薬組成物。 41．ブタの生殖細胞および体細胞が、ある遺伝子（ブタ成体βグロビンをコードするものではない）に機能しうる状態で連結されたプラスミド pGem5/Pigβpr(K )（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、受託番号 7537 1を有する）中に含まれるブタ成体βグロビン調節領域からなるＤＮＡ配列を含んでおり、上記の遺伝子が該ブタの少なくとも一部の赤血球において発現されるものである、トランスジェニックブタ。 42．前記の遺伝子がヒトβグロビンをコードする、請求項41に記載のトランスジェニックブタ。 43．前記の遺伝子が非グロビンタンパク質をコードする、請求項41に記載のトランスジェニックブタ。 44．ブタの生殖細胞および体細胞が、ある遺伝子（ブタ成体βグロビンをコードするものではない）に機能しうる状態で連結されたプラスミドpPig3'β（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、受託番号 75372を有する）中に含まれるブタ成体βグロビン遺伝子の３’領域からなるＤＮＡ配列を含んでおり、上記の遺伝子が該ブタの少なくとも一部の赤血球において発現されるものである、トランスジェニックブタ。 45．前記の遺伝子がヒトβグロビンをコードする、請求項44に記載のトランスジェニックブタ。 46．前記の遺伝子が非グロビンタンパク質をコードする、請求項44に記載のトランスジェニックブタ。 47．アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、受託番号 753 71を有するプラスミドpGem5/Pigβpr(K)中に含まれるブタ成体βグロビン調節領域を含んでなる、精製および単離された核酸。 48．アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、受託番号 753 73を有するプラスミドpSaf/pigε(K)中に含まれるブタεグロビン遺伝子を含んでなる、精製およびさ単離れた核酸。 49．アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、受託番号 753 72を有するプラスミドpPig3'β中に含まれるブタ成体βグロビン遺伝子の３’領域を含んでなる、精製およびさ単離れた核酸。 50．ヒトαグロビンまたはヒトβグロビンをコードする核酸がトランスジェニックブタ内での真正なヒト／ヒト２量体のレベルを増大させる変異を含むものである、請求項２に記載のトランスジェニックブタ。 51．ヒトαヘモグロビンの変異が次のα鎖変異：３０位のＧｌｕの代わりにＴｈｒ；３６位のＰｈｅの代わりにＴｙｒ；１０６位のＬｅｕの代わりにＰｈｅ；１０７位のＶａｌの代わりにＳｅｒまたはＣｙｓ；および１１１位のＡｌａの代わりにＣｙｓ；の群から選ばれる、請求項50に記載のトランスジェニックブタ。 52．ヒトβヘモグロビンの変異が次のβ鎖変異：３３位のＶａｌの代わりにＬｅｕ；１１２位のＣｙｓの代わりにＶａｌまたはＩｌｅ；１１５位のＡｌａの代わりにＶａｌまたはＬｅｕ；１１９位のＧｌｙの代わりにＨｉｓ；１２８位のＰｒｏの代わりにＭｅｔ；および１３１位のＧｌｎの代わりにＧｌｕ；の群から選ばれる、請求項50に記載のトランスジェニックブタ。 53．ヒトβヘモグロビンの変異が１１２位のＣｙｓからＶａｌへの変化である、請求項52に記載のトランスジェニックブタ。 54．ヒトヘモグロビンとブタヘモグロビンとヒト／ブタハイブリッドヘモグロビンの混合物からヒトヘモグロビンを精製する方法であって、（ｉ）プロモーター要素に機能しうる状態で連結されたヒトαグロビンおよびヒトβグロビンのＤＮＡ配列を保有するトランスジェニックブタ（該ブタの少なくとも一部の赤血球内でヒトヘモグロビンが生産される）から赤血球を採取し、（ii）採取した赤血球の内容物を放出させて溶解物を調製し、（iii）段階（ii）から得られた溶解物を、約ｐＨ７．８に平衡化したＤＥＡＥセルロース陰イオン交換カラムにかけ、（iv）該カラムを5 mM-30 mM NaClの塩勾配で溶出し、そして（ｖ）精製されたヒトヘモグロビンを含む画分を回収する、ことを含んでなる方法。 55．ヒトヘモグロビンとブタヘモグロビンとヒト／ブタハイブリッドヘモグロビンの混合物からヒトヘモグロビンを精製する方法であって、（ｉ）プロモーター要素に機能しうる状態で連結されたヒトαグロビンおよびヒトβグロビンのＤＮＡ配列を保有するトランスジェニックブタ（該ブタの少なくとも一部の赤血球内でヒトヘモグロビンが生産される）から赤血球を採取し、（ii）採取した赤血球の内容物を放出させて溶解物を調製し、（iii）段階（ii）から得られた溶解物を、約ｐＨ７．８に平衡化した陰イオン交換カラムにかけ、（iv）該カラムを塩勾配で溶出し、そして（ｖ）精製されたヒトヘモグロビンを含む画分を回収する、ことを含んでなる方法。 56．ヒトヘモグロビンとブタヘモグロビンとヒト／ブタハイブリッドヘモグロビンの混合物からヒトプレスビテリアン(Presbyterian)ヘモグロビンを精製する方法であって、（ｉ）請求項10に記載のトランスジェニックブタから赤血球を採取し、（ii）採取した赤血球の内容物を放出させて溶解物を調製し、（iii）段階（ii）から得られた溶解物を、20 mM Tris-Clおよび20 mM グリシンでｐＨ８．１に平衡化したHigh Q 樹脂カラムにかけ、（iv）該カラムを10 mM Tris-Cl，20 mMグリシン，250 mM NaClを含む緩衝液（pH 8.1）中の９−１６％の直線塩勾配で溶出し、そして（ｖ）精製されたヒトプレスビテリアンヘモグロビンを含む画分を回収する、ことを含んでなる方法。 57．ヒトヘモグロビンとブタヘモグロビンとヒト／ブタハイブリッドヘモグロビンの混合物からヒトヨシズカ(Yoshizuka)ヘモグロビンを精製する方法であって、（ｉ）請求項９に記載のトランスジェニックブタから赤血球を採取し、（ii）採取した赤血球の内容物を放出させて溶解物を調製し、（iii）段階（ii）から得られた溶解物を、10 mM Tris-Clおよび20 mM グリシンでｐＨ８．７に平衡化したHigh Q 樹脂カラムにかけ、（iv）該カラムを10 mM Tris-Cl，20 mMグリシン，250 mM NaClを含む緩衝液（pH 8.7）中の５−３０％の直線塩勾配で溶出し、そして（ｖ）精製されたヒトヨシズカヘモグロビンを含む画分を回収する、ことを含んでなる方法。 58．アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、受託番号 755 18を有するプラスミドpPH1中に含まれるブタβグロビンＬＣＲを含んでなる、精製およびさ単離れた核酸。 59．アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、受託番号 755 19を有するプラスミドpPH2中に含まれるブタβグロビンＬＣＲを含んでなる、精製およびさ単離れた核酸。 60．アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、受託番号 755 20を有するプラスミドpGEM3β^*Δ3'中に含まれる最適化ヒトβグロビン遺伝子を含んでなる、精製およびさ単離れた核酸。