CZ20022514A3

CZ20022514A3 - Transgenní koza produkující mléko obsahující faktor stimulující kolonie lidských granulocytů

Info

Publication number: CZ20022514A3
Application number: CZ20022514A
Authority: CZ
Inventors: Seung Won Jin; Doo Soo Lee; Tae Hun Song; In Young Choi; Ook Joon Yoo; Jung Ho Ko; Ja Shin Koo; Sang Tae Shin; Chul Sang Lee; Nan Zhu Fang; Deog Bon Koo; Keon Bong Oh; Jung Sun Park; Woo Sik Youn; Guo Dong Zheng; Sun Jung Kim; Yong Mahn Han; Kyung Kwang Lee
Original assignee: Hanmi Pharm. Co., Ltd.; Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology
Priority date: 2000-01-24
Filing date: 2001-01-26
Publication date: 2002-10-16
Also published as: RU2225106C1; CN1203092C; HUP0301067A3; AU2001232363B2; AU3236301A; NZ520259A; US20030051257A1; EP1250039A1; JP2003520035A; RU2002122725A; HUP0301067A2; MXPA02006657A; CN1396805A; KR20010073966A; CA2396969A1; KR100408429B1; EP1250039A4; WO2001052643A1

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká kozí zygoty obsahující konstrukt nukleové kyseliny, která v mléčné žláze tkáňově specifickým způsobem exprimuje gen faktoru stimulujícího kolonie lidských granulocytů (hG-CSF) a transgenní kozy produkující mléko obsahující hG-CSF.

Dosavadní stav techniky hG-CSF je biologicky aktivní glykoprotein, jehož exprese se spustí vnějším podnětem, např. bakteriální infekcí nebo léčbou rakoviny, kdy se stimuluje růst a diferenciace hematopoetických kmenových buněk, například granulocytů nebo makrofágů, přičemž jeho koncentrace v krvi hostitele je velmi malá, když je hostitel zdráv.

Protože získávat hG-CSF z lidského těla není možné, byly činěny pokusy připravit hG-CSF pomocí E. coli nebo živočišných buněk. hG-CSF vyrobený pomocí E. coli měl proměnlivé účinky in vivo a neověřenou bezpečnost. Navíc je způsob výroby hG-CSF pomocí E. coli neekonomický, a to kvůli požadavku drahého vybavení a kvůli komplikovaných přečišťovacím postupům, přičemž totéž platí pro způsob výroby hG-CSF pomocí živočišných buněk.

Proto existuje potřeba vyvinout ekonomický způsob výroby biologicky aktivního hG-CSF. Nedávno byly popsány úspěšné pokusy vyrobit biologicky aktivní proteiny, laktoperin a kolagen (US patenty č. 5 633 076, 5 849 992 a

895 833) pomocí transgenního skotu, kozy nebo vepře jako bioreaktoru. Proteiny vyrobené tímto způsobem jsou identické s odpovídajícími divokými typy produkovanými v lidském těle, přičemž jejich výrobní cena je tisíckrát až dvoutisíckrát nižší, než způsob pomocí E. coli nebo pomocí živočišné buňky. WO 97/19 589 popisuje způsob získání transgenní trpasličí kozy, ale aktuální produkce biologicky aktivních proteinů nebyla prokázána.

Současní vynálezci usilovali o vyvinutí způsobu výroby hG-CSF pomocí transgenní kozy, a to cestou využití tkáňově specifického systému exprese mléčnou žlázou, který je předkladateli vynálezu popsán v korejské patentové přihlášce č. 97-9601 (zveřejněná korejská patentová přihláška č. 98-73 991).

Podstata vynálezu

Předmět předloženého vynálezu se týká kozí zygoty obsahující konstrukt nukleové kyseliny, která tkáňově specifickým způsobem provádí expresi genu hG-CSF mléčnou žlázou.

Další předměty předloženého vynálezu zahrnují způsob získání uvedené kozí zygoty, způsob vyjmutí neporušené zygoty z kozy, do kteréžto zygoty se vnese konstrukt nukleové kyseliny, transgenní kozu produkující mléko obsahující hG-CSF, způsob získání transgenní kozy z kozí zygoty, způsob výroby hG-CSF pomocí transgenní kozy, složení mléka obsahujícího hG-CSF, produkované transgenní kozou a farmaceutický přípravek obsahující takto vyrobený uvedený hG-CSF.

• · · • · · ··«· 9 9 9 <· ♦· *· t* »*

V souladu s jedním aspektem předloženého vynálezu je zde popsána kozí zygota, která obsahuje konstrukt nukleové kyseliny s nukleotidovou sekvencí promotoru kozího β-kaseinu a sekvenci nukleové kyseliny kódující hG-CSF.

Další aspekty předloženého vynálezu zahrnují způsob získání kozí zygoty, který zahrnuje mikroinjikování konstruktu nukleové kyseliny do neporušené kozí zygoty, způsob získání neporušené kozí zygoty, který zahrnuje synchronizaci estru kozy, superovulaci kozy, připuštění superovulující kozy kozlem a odebrání zygoty od připuštěné kozy, kterýžto způsob je charakterizován tím, že synchronizační krok se provede podáním norgestometu a estradiolu koze, a to zavedením implantátu obsahujícího norgestomet do kozy a odstraněním implantátu a superovulaění krok se provede postupným podáváním kombinované dávky sérového gonadotropinu březích klisen (PMSG) a folikulostimulačního hormonu (FSH) v předem určených intervalech koze, rozdělených dávkách FSH a kombinované dávce FSH a lidského choriového gonadotropinu (hCG), transgenní kozu získanou z kozí zygoty, kterážto koza produkuje mléko obsahující hG-CSF, způsob získání transgenní kozy, který zahrnuje přenesení kozí zygoty do kozy a ponechání kozí zygoty, aby se vyvíjela až do normálního termínu porodu, způsob výroby hG-CSF, který zahrnuje produkci mléka transgenní kozou a získávání hG-CSF z mléka, složení mléka obsahujícího hG-CSF, které je produkováno transgenní kozou, hG-CSF, který je produkován transgenní kozou a farmaceutický přípravek, který obsahuje hG-CSF a farmaceuticky přijatelný nosič.

Stručný popis obrázků • 9 v

• ·

a *· ♦· 9-9 *9 9 * 9 99 · 9 99 • 9 9 99 < «

999 9« 9 9 999 9

9 9 *9 99 « 9

99

Výše uvedené předměty a rysy předloženého vynálezu se ozřejmí z následujícího popisu zvýhodněných provedení vynálezu, a to v kombinaci s doprovodnými obrázky, ve kterých obrázek 1 je schematickým diagramem znázorňujícím rozvrh pro synchronizaci estru a superovulaci kozy, obrázek 2 ukazuje výsledky polymerázové řetězové reakce (PCR) znázorňující vnesení úseku DNA pro genovou expresi do DNA genomu transgenní kozy, obrázek 3 ukazuje výsledky analýzy metodou Southern blotting znázorňující vnesení úseku DNA pro genovou expresi do DNA genomu transgenní kozy, obrázek 4 ukazuje výsledky analýzy metodou western blotting znázorňující expresi hG-CSF v mléčné syrovátce transgenní kozy a obrázek 5 je grafem znázorňujícím proliferaci buněk HL-60 indukovanou mléčnou syrovátkou transgenní kozy.

Podrobný popis vynálezu

Konstrukt nukleové kyseliny použitý při získání transgenní kozí zygoty předloženého vynálezu obsahuje nukleotidovou sekvenci promotoru kozího β-kaseinu a nukleotidovou sekvenci genu hG-CSF. Exprese hG-CSF je kontrolována promotorem kozího β-kaseinu, který je specificky aktivován ve tkáni mléčné žlázy. Gen hG-CSF a promotor kozího β-kaseinu jsou v uvedeném pořadí popsány v bance GenBank jako přírůstky č. X03656 a M90559 a lze je v uvedeném pořadí získat z lidských a kozích tkání neboje lze syntetizovat pomocí běžného způsobu syntézy DNA. Konstrukt nukleové kyseliny lze vyrobit běžným způsobem (Sambrook J. et al., Molekulární klonování: laboratorní příručka (Molecular cloning: a laboratory manual), 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press,

New York (1989)). Navíc k promotoru kozího β-kaseinu a genu hG-CSF může • · ·

• · ·· ·· konstrukt nukleové kyseliny dále obsahovat transkripční terminační oblast.

Příkladem konstruktu nukleové kyseliny je úsek DNA pro genovou expresi pGbc-hGCSF se SEQ ID NO:1, kde promotor kozího β-kaseinu má nukleotidovou sekvenci od promotoru kozího β-kaseinu k nukleotidu těsně před translačním iniciačním kodonem exonu I genu kozího β-kaseinu a kontroluje expresi genu hG-CSF umístěného za ním.

Transgenní kozí zygotu tohoto vynálezu lze získat mikroinjikováním konstruktu nukleové kyseliny do neporušené kozí zygoty ve stádiu 1 buňky. Mikroinjikování lze provést běžným způsobem pod reverzním mikroskopem vybaveným mikromanipulátorem (Manipulace s myším embryem: laboratorní příručka (Mampulating the mouše embryo: A laboratory manual), 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1994)). Příkladem zygoty vynálezu je embryo Capra hircus aegagrus/pGbc-bGCSF, které se získá od Capra hircus aegagrus, druhu pocházejícího z Koreje a toto embryo obsahuje úsek DNA pro expresi genu pGbc-bGCSF. Tato transgenní zygota byla uložena 28. prosince 1999 do Korejské sbírky typových kultur (Korean Collection for Type Cultures) (KCTC) (adresa: Korejský výzkumný ústav biologických věd a biotechnologie (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB)), č. 52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejon, 305-333, Korejská republika) pod přírůstkovým číslem KCTC 0718BP, v souladu s podmínkami Budapešťské úmluvy o mezinárodním uznávání uložených mikroorganismů pro účel patentového řízení (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganism for the Purpose of Patent Proceduře). Avšak transgenní kozí zygota předloženého vynálezu není omezena na tuto zygotu..

Zygota ve stádiu 1 buňky pro použití v mikroinjekčním postupu se získá pomocí synchronizace estm kozy, superovulace kozy, připuštění superovulující kozy kozlem a odebrání zygot od připuštěné kozy.

· • · ·· · · · · · ··· ·· · · · · · · ·· · · · ·

Synchronizační a superovulační kroky se s výhodou provedou podle rozvrhu znázorněného na obrázku 1. Synchronizační krok se provede nitrosvalovou injekcí vhodného množství norgestometu a estradiolu, stejně jako zavedením implantátu obsahujícího vhodné množství norgestometu do ucha a odstraněním implantátu ve 13. nebo 14. dni po zavedení implantátu a superovulační krok se provede injektáží PMSG, FSH a hCG, a to osmkrát každých 12 hodin s počátkem od 60 hodin před odstraněním implantátu. Injekční rozpis zahrnuje podání PMSG a FSH v prvé injekci, FSH ve druhé až sedmé injekci a FSH a hCG v osmé injekci. hCG injektovaný společně s FSH v osmé injekci je účinný při indukci zvýšené superovulace, jakož i při regulaci doby ovulace. Tento způsob je zvláště vhodný při získávání neporušených zygot kozy Capra hircus aegagrus.

Krok připuštění a odebrání zygoty lze provést běžným postupem. Po spáření superovulující kozy s kozlem lze odebrání zygoty provést zanestetizováním připuštěné samice injekcí anestetického činidla, např. xylazinu nebo lidokainu, v čase 72 až 76 hodin po odstranění implantátu, držením připuštěné kozy bez jídla po 24 hodin před injekcí, položením kozy na hřbet, lokálním zanestetizováním abdominální středové linie, proříznutím abdominální středové linie za uvolnění vaječníku, vejcovodu a dělohy, zavedením katetru do nálevko vitého rozšíření vejcovodu, zavedením fyziologického roztoku pufrováného fosfátovým pufrem (PBS) obsahujícího hovězí fetální sérum do katetru, aby proudil od dělohy k vejcovodu a získáním neporušené zygoty.

Transgenní kozí zygota předloženého vynálezu se transplantuje do hostitelské kozy (příjemkyně) a ponechá se vyvinout do přirozeného termínu porodu.

Transplantaci lze provést po ponechání hostitelské kozy 24 hodin bez žrádla, proříznutím abdominální středové linie hostitelské kozy za uvolnění vaječníku, vejcovodu a dělohy, zavedením katetru s transgenními zygotami do nálevkovitého rozšíření vejcovodu, aby bylo možno převést zygoty do vejcovodu.

• · • · • · • ·

Hostitelská koza, kterou lze použít v předloženém vynálezu, se vybere z těch koz, které jsou v estru, spontánním nebo indukovaném hormonem, např. PMSG. Zvýhodněná je příjemkyně ve stavu spontánního estru. Počet transgenní ch zygot, které lze transplantovat, je v rozmezí 2 až 4 na hostitelskou kozu. Zabřeznutí hostitelské kozy lze poznat ultrazvukovým diagnostickým vybavením asi ve 40. dni po transplantaci. Transplantované zygoty se ponechají vyvíjet k normálnímu termínu porodu za zisku transgenní ch koz, jejichž somatické a zárodečné buňky obsahují konstrukt nukleové kyseliny a poté se tyto transgenní kozy dále chovají.

Přítomnost konstruktu nukleové kyseliny vynálezu v transgenní koze lze identifikovat běžným způsobem, např. polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) nebo analýzou metodou Southern blotting. Expresi hG-CSF v transgenní koze lze dále identifikovat běžnou metodou, např. analýzou metodou western blotting nebo enzymovou imunoanalýzou (ELISA), a to použitím jejích mléčných proteinů.

Po dosažení dospělosti produkuje transgenní koza specificky ve tkáni mléčné žlázy hG-CSF a uvolňuje hG-CSF do mléka. Takto získaný hG-CSF si udržuje dobrou biologickou aktivitu in vivo a stimuluje růst a diferenciaci granulocytů a makrofágů. V oboru je dobře známo, že hG-CSF je účinný v prevenci a léčení různých nemocí, např. leukopenie způsobené transplantací kostní dřeně, maligního lymfomu, akutní leukemie, rakoviny plic, rakoviny vaječníku, nádoru varlat, myelodysplazie, aplastické anemie a kongenitální neutropenie. hG-CSF předloženého vynálezu lze proto výhodně použít ve farmaceutickém přípravku.

Farmaceutický přípravek lze vyrobit podle jakéhokoliv z běžných postupů. Při výrobě přípravku se aktivní složka s výhodou vmíchává do nosiče nebo ředí nosičem nebo se uzavře do nosiče, který může být ve formě kapsle, váčku nebo jiné obalové formy. Když nosič slouží jako řeďící látka, může to být tuhý, polotuhý nebo kapalný materiál, který se chová jako vehikulum, excipient nebo prostředí pro aktivní složku. Přípravek tak může být ve formě tablety, pilulky, prášku, váčku,

9 9999 999

99 99 99 9 · 9 9 tinktury, suspenze, emulze, roztoku, sirupu, aerosolu, měkké nebo tvrdé želatinové kapsle, sterilního injektovatelného roztoku, sterilně zabaleného prášku a podobně.

Příklady vhodných nosičů, excipientů a ředících látek jsou laktosa, dextrosa, sacharosa, sorbitol, mannitol, škroby, arabská guma, algináty, želatina, fosforečnan vápenatý, křemičitan vápenatý, celulosa, methylcelulosa, mikrokrystalická celulosa, polyvinylpyrrolidon, voda, methylhydroxybenzoáty, propylhydroxybenzoáty, talek, stearát hořečnatý a minerální olej. Přípravky mohou dále obsahovat plnidla, protiaglutinační činidla, lubrikační činidla, smáčecí činidla, přichucovací činidla, emulgátory, konzervační činidla a podobně. Přípravky vynálezu lze sestavit tak, aby se získalo rychlé, trvalé nebo zpožděné uvolňování aktivní složky po jejich podání savci prostřednictvím kteréhokoliv z postupů, které jsou v oboru známy.

Farmaceutický přípravek předloženého vynálezu lze podávat různými cestami zahrnujícími vnesení orální, transdermální, podkožní, nitrožilní a nitrosvalové. V případě člověka je typická denní dávka hG-CSF v rozmezí 75 až 600 mg/kg tělesné hmotnosti, s výhodou 100 až 400 mg/kg tělesné hmotnosti a lze podávat v jednotlivé dávce nebo v rozdělených dávkách.

Mělo by však být jasné, že množství aktivní složky skutečně podávané by mělo být určeno se zřetelem k různým závažným faktorům zahrnujícím léčený stav, vybranou cestu podávání, věk, pohlaví a tělesnou hmotnost jednotlivého pacienta a závažnost pacientova symptomu, a proto by výše uvedená dávka neměla být chápana jako jakkoliv limitující rámec vynálezu.

Následující příklady jsou uvedeny se záměrem další ilustrace předloženého vynálezu a neomezují jeho rámec.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 • · •« ·· ·· ·· • · · · · · · • ·· · · · · · • fc····· ·· • · · · · · ·· ·· ·· ··

Konstrukce vektoru pGbc-hGCSF

Z korejské kozy domácí (Capra hircus aegagrus) získaný plazmid pGbc_S (Korejská zveřejněná patentová přihláška č. 99-73 991), obsahující část β-kaseinového genu od promotoru k exonu I, byl rozštěpen s Hind III a výsledná směs byla extrahována směsí fenolu a chloroformu =1:1 (V/V), vysrážena v 95% ethanolu a rozpuštěna v destilované vodě za zisku fragmentu DNA obsahujícího ěást genu kozího β-kaseinu od promotoru k exonu I. Fragment DNA byl štěpen Dra I a výsledná směs byla podrobena elektroforéze na 1% agarosovém gelu. Pás fragmentu 1239 bp byl vyříznut z agarosového gelu a přečištěn pomocí soupravy Geneclean II (Biol01, USA) za zisku DNA fragmentu 1.

DNA genom kozy (Capra hircus aegagrus) byl podroben PCR, při použití primerů CAS-F l(SEQ ID NO: 2) a CAS-R1(SEQ ID NO: 3) a produkt PCR byl štěpen s Dra 1 a Hind III a elektronicky extrahován za zisku DNA fragmentu 2.

DNA fragmenty 1 a 2 byly navázány otevřeným pBluescript II (Stratagene, USA), čehož se dosáhlo působením Sal I, Hind III a telecí alkalické fosfatázy. K získání vektoru pGbc-hGCSF se do poloh Hind III a Eco Rl výsledného plazmidu vnesl fragment DNA pRC/RSV obsahující gen hG-CSF následovaný transkripční terminační oblastí hovězího růstového hormonu (Invitrogen, Nizozemí).

Vektor pGbc-hGCSF byl rozštěpen s Bss HII a Κρη I a výsledná směs byla podrobena elektroforéze na agarosovém gelu, poté přečištěna soupravou Geneclean II (BIO101) a následně Elutip-d (Schleicher a Schuell, Německo), dialyzována proti dialyzačnímu roztoku (10 mM Tris-Cl (pH 7,2) a 0,1 mM EDTA) a poté zfiltrována pomocí 0,22μιη filtru (Nalnene, USA) za zisku úseku DNA pro genovou expresi pGbc-hGCSF. Takto získaný úsek DNA pro genovou expresi byl zředěn dialyzačním roztokem na výslednou koncentraci 4 pg/ml.

• · · · ···· ·· • ······ · · ΦΦΦ φ · • · φ φ φ φ φ ΦΦΦ φφ φφ φφ φφ φφφφφ

Příklad 2

Odebrání kozí zygoty

Podle rozvrhu znázorněného na obrázku 1 byly jednoletým až tříletým samicím korejské kozy domácí (Capra hircus aegagrus), které byly získány ze stáda farmy Konju Sabisung, nitrosvalově injikovány 2 ml sezamového oleje obsahujícího 3,0 mg norgestometu a 5,0 mg estradiolu. Po odstranění srsti z ucha a dezinfikování ucha byl za účelem synchronizace estru do dezinfikovaného ucha nastřelen pistolí Syncromate-B (PETS, USA) implantát Syncromate-B (Sanofi Animal Health, USA) a poté byl chirurgicky odstraněn ve 13. nebo 14. dni po jeho nastřelení.

5,6 mg FSH (Ovagen, Immuno-Chemical Products, New Zealand) bylo rozděleno do osmi dávek a nitrosvalově injikováno koze každých 12 hodin od 60 hodin, jak je znázorněno na obrázku 1. Nejprve bylo injikováno 0,7 mg FSH a 0,7 mg PMSG (Pregnecol, Horizon Technology, Austrálie), poté vždy 0,7 mg FSH až do sedmé injekce a 0,7 mg FSH společně se 100 IU hCG jako osmá injekce.

Ovulující koza byla na 12 hodin připuštěna kozlem (Capra hircus aegagrus).

Mezi 72. až 76. hodinou po odstranění implantátu se koze nitrosvalově injikoval 2% roztok xylazinu (Rompun, Bayer, Korea), přičemž koza byla 24 hodin před injekcí bez jídla a koza byla položena na hřbet. Pro lokální zanestetizování se do abdominální středové linie injikovalo 10 ml 2% lidokainu a abdominální středová linie byla proříznuta v délce 4 až 6 cm, aby se uvolnil vaječník, vejcovod a děloha. Do nálevkovitého rozšíření vejcovodu se zavedl a upevnil katetr, jímž byla polyethylenová trubička s vnitřním průměrem 1,0 mm a do katetru se přivedl fosforečnanem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) obsahující fetální hovězí sérum, který proudil v opačném směni, z dělohy do vejcovodu, aby se získaly neporušené zygoty. Neporušené zygoty byly udržovány až do následujícího mikroinjektážního postupu v modifikované syntetické vejcovodové tekutině • · • · • * · ···· · · ♦ ·· ·· ·· ·· ·· ···· (m-SOF: Takahashi Y. et al., Theriogenology 37, 963 až 978 (1991)).

Testový příklad 1

Účinek FSH a hCG na ovulaci a dobu odebrání zygoty 1) Vliv kombinace hCG s FSH na ovulaci

Ke zjištění vlivu kombinace hCG s FSH na ovulaci korejské kozy domácí byl opakován postup z příkladu 2 společně s kontrolním pokusem, který byl proveden přesně stejným způsobem, vyjma toho, že jako osmá injekce bylo podáno samotných 0,7 mg FSH, bez hCG. Mezi 70. až 76. hodinou po odstranění implantátu byl určen stupeň ovulace (číselný poměr ovulujících koz k celkovému počtu koz), míra ovulace (průměrný počet ovulujících folikulů na ovulující kozu), výtěžek (číselný poměr získaných oocytů na ovulační folikul) a stupeň oplodnění (číselný poměr zygot majících pronukleus na odebraný oocyt).

Výsledky jsou znázorněny v tabulce I.

Tabulka I

Vliv kombinace hCG s FSH na ovulaci

	Celkem koz	Ovulující kozy (stupeň ovulace)	Míra ovulace (míra ovulace)	Odebrané oocyty	Zygoty (stupeň oplodnění)
Skupina s FSH	44	16 (36,4 %)^a	127 (7,9 %)	70 (55,1 %)	31 (44,3 %)
Skupina s FSH + hCG	36	36 (100 %)^b	309 (8,6 %)	267 (86,4 %)	126 (47,2 %)

^a,b statisticky významný (P < 0,05)

Jak lze vidět z tabulky I, stupeň ovulace u skupiny s FSH + hCG (100 %) je vyšší, než u skupiny s FSH (36,4 %), což naznačuje, že kombinace FSH a hCG je ·

• · · · ·· ·♦ ·· • · · · · · · · · • · · · · · ·· ·· * • · ··· · 9 99 999 9 9 • · 9 9 9 9 9 9 9 9 ·· ♦♦ ·· 99 99 9999 pro indukci ovulace účinná. Na druhé straně podobný stupeň oplodnění pozorovaný jak pro skupinu s FSH + hCG, tak pro skupinu s FSH naznačuje, že hCG oplodnění nevadí. hCG lze proto s výhodou použít ke zvýšení stupně ovulace, bez zabraňování oplodnění.

Oproti zprávě, že samotný FSH je účinný v indukci ovulace u jiných druhů koz (Selgrath J.P. et al., Theriogenology 34, 1195 až 1205 (1990), Ebert K.M. et al., Bio/Technology 12, 699 až 702 (1994) a Gootwine E. et al., Theriogenology 48,

485 až 499), byl stupeň ovulace korejské kozy domácí, který byl indukován FSH, pouze 36,4 %. Zvýšení ovulace kombinací hCG s FSH, které bylo pozorováno pro korejskou kozu domácí, lze přičíst inherentní fyziologické charakteristice korejské kozy domácí.

2) Určení optimální doby pro odebrání zygoty při podávání hCG společně s

FSH

K určení optimální doby pro odebrání zygoty ve stadiu jedné buňky mající pronukleus, která je vhodná k mikroinjikování, byl opakován postup příkladu 2 kromě toho, že čas odebrání zygoty po odstranění implantátu se různil od 62 až 68 hodin, přes 70 až 76 hodin, do 78 až 84 hodin. Vývojové stadium zygoty bylo pozorováno pod pitevním mikroskopem.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce II.

Tabulka II

Vývojové stadium zygoty v různých dobách odebírání při podávání kombinace FSH ahCG

Doba odebrání⁰	Odebrané oocyty	Zygoty (stupeň oplodnění)	Vývojové stadium zygot (%)
Stadium 1 buňky	Stadium 2 buněk	Stadium 4 buněk	Stadium > 8 buněk

99

9 9 9

9 99

99

9 9 9

9 9

9999 • · 9

99

9 9 9

99

62 až 68	10	3 (30,0)	3(100) -	-	-
70 až 76	183	126 (68,9)	106 (84,1)	17 (13,5)	3 (2,4)
78 až 84	17	14 (82,4)	8(57,1)	4 (28,6)	2 (14,3)	-

^cdoba uplynulá od odstranění implantátu

Jak lze vidět z tabulky II, zygoty odebrané v čase 62 až 68 hodin jsou ve stadiu 1 buňky a stupeň oplodnění je 30 %. V případě zygot odebraných v čase 70 až 76 hodin byl stupeň oplodnění mnohem vyšší (70 %), i když i několik zygot bylo ve stadiu dvou buněk a čtyř buněk. Zygoty odebrané v čase 70 až 76 hodin měly značně snížený obsah zygot ve stadiu jedné buňky.

Proto pro získání zygot ve stadiu jedné buňky, které je vhodné pro mikroinjekci, je žádoucí odebrat zygoty v čase 70 až 76 hodin po odstranění implantátu.

Příklad 3

Mikroinjekce úseku DNA pro genovou expresi do kozí zygoty

Zygoty získané v příkladu 2 byly centriíugovány při 12 000 otáčkách za minutu po 7 minut, aby se zviditelnil pronukleus každé jednobuněčné zygoty. Pod DIC reverzním mikroskopem (Leitz, Německo) vybaveným mikromanipulátorem (Leitz, Německo) bylo do samčího pronukleu stadia jednobuněčných zygot mikroinjikováno 1 až 2 pl roztoku DNA obsahujícího 4 pg/ml úseku DNA pro genovou expresi pGbc-hGCSF získaného v příkladu 1. K minimalizaci změny pH v průběhu mikroinjekce bylo použito prostředí TL-HEPES (Hagen D.R., J. Anirn Sci. 69, 1147 až 1150 (1991)). Mikroinjikované zygoty byly do transplantace • 4 4

4 4

4 9 ·· ·

94 44 49

4 4 4 4 4 9 9

4 49 9 9 4

9 4 4 4 4 4 · · · · · · · «« 44 44 9494 kultivovány v prostředí m-SOF při 37 °C v 5% CO2. Pro další práci byly vybrány ty zygoty ve stadiu jedné buňky, které přežily výše uvedené působení.

Tato zygota byla označena jako embryo Capra hircus aegagrus/pGbc-bGCSF a byla uložena 28. prosince 1999 v Korejské sbírce typových kultur (Korean Collection for Type Cultures) (KCTC) (Adresa: Korejský výzkumný ústav biologických věd a biotechnologie (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) (KRIBB), 52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejon, 305-333, Korejská republika) pod přírůstkovým číslem KCTC 0718BP.

Příklad 4

Chirurgická transplantace mikroinjikovaných zygot do hostitelské kozy

Jednoleté až tříleté hostitelské kozy (Capra hircus aegagrus) ve spontánní fázi estru byly 24 hodin drženy bez potravy a poté byla abdominální středová linie každé hostitelské kozy lokálně zanestetizována a proříznuta za uvolnění vaječníků, vejcovodu a dělohy. V příkladu 3 získané zygoty ve stádiu jedné až čtyř buněk byly transplantovány nálevko vitým rozšířením vejcovodu, a to použitím sterilizovaného katetm, polyethylenové trubičky s vnitřním průměrem 0,5 mm, vnějším průměrem 0,8 mm a délkou 20 cm. Počet zygot na hostitelskou kozu byl v rozmezí dvou až čtyř. Ve třicátém dni po transplantaci bylo identifikováno zabřeznutí hostitelských koz ultrazvukovým diagnostickým zařízením (Sonorex, Medison, Korea), a to v třicátém dni po transplantaci. Zygoty byly ponechány se vyvíjet do normálního termínu porodu za získání 25 kůzlat.

Testový příklad 2

Srovnání spontánního estru a hormonem indukovaného estru prostřednictvím stupně zabřeznutí a stupně produkce kůzlat • *

9 9

999 • 9 ·

99

9 9 ·

9 99

9 9 9 9

9 9 9

9 9

99 • 9 9 · • 9 <

9 9 9

9 9

9999

Mikroinjikované zygoty získané v příkladu 3 byly opakováním postupu z příkladu 4 transplantovány do hostitelských koz ve spontánním estru a hormonem indukovaném estru. Hormonem indukované hostitelské kozy byly připraveny synchronizačním postupem příkladu 2 následovaným nitrožilní injekcí dávky 400 až 600 IU PMSF, a to podle stupně odezvy kozy na hormon ve 48 hodinách po odstranění implantátu. Byly studovány jejich stupeň zabřeznutí a stupeň produkce kůzlat. Výsledky jsou uvedeny v tabulce III.

Tabulka III

Stupeň zabřeznutí a stupeň produkce kůzlat z mikroinjiko váných zygot po transplantaci

	Hostitelské kozy	Průměrná míra ovulace	Průměrně transplanto- vaných zygot	Zabřeznutá hostitelská koza (stupeň zabřeznutí)	Kůzlata
Skupina s hormonem indukovaným estrem	35	5,3	2,7	9 (25,7)	10
Skupina se spontánním estrem	36	1,8	2,6	14 (38,9)	15

Jak lze vidět z tabulky III, je průměrná míra ovulace u skupiny se spontánním estrem nižší než u skupiny, na níž se působí hormonem, zatímco stupeň zabřeznutí u skupiny se spontánním estrem je vyšší než u skupiny, na níž se působilo hormonem.

Příklad 5 ·· ·· 04 0«

0000 «000

4 0 4 0 0 00

4 000 0 0 4 0 4

4 0 0 0 0 0

00 00 44

00 • · 4

4

0

4« 0004

Identifikace transgenní kozy

1) Izolace DNA genomu

Od 10 až 30 dnů starých kůzlat získaných v příkladu 4 byla od každého zvířete vyříznuta část ušní tkáně o velikosti 0,5 cm a poté byla přenesena do 15ml testové zkumavky a přidaly se 4 ml roztoku pro lýzi (10 mM Tris-Cl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA a 0,5% SDS). Výsledná směs byla udržována při 55 °C po 16 hodin, aby došlo k rozkladu tkáně.

Rozložené buňky tkáně byly podrobeny extrakci fenolem a vysrážení ethanolem podle Sambrook J. et al. (Molekulární klonování: laboratorní příručka (Molecular cloning: a laboratory manual), 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)), aby se získal čistý DNA genom. Přečištěná DNA byla rozpuštěna v destilované vodě na výslednou koncentraci 0,5 pg/pl.

2) PCR μΐ DNA genomu získaného v bodu 1 od každého kůzlete byl podroben PCR použitím primerů GB2 (SEQ ID NO: 4) a GCSF2 (SEQ ID NO: 5) nebo primerů GB2 (SEQ ID NO 4) a GCSF3 (SEQ ID NO: 6). PCR byla provedena inkubací při 94 °C po 4 minuty, aby se denaturovala DNA a opakováním tepelného cyklu třicetkrát, přičemž každý cyklus sestával z 1 minuty při 94 °C, 1 minuty při 55 °C a 1 minuty při 72 °C. Takto získaný produkt PCR byl podroben elektroforéze v 6% polyakrylamidovém sekvenujícím gelu s následnou autoradiografíí. Primer GB2 (SEQ ID NO: 4) má nukleotidovou sekvenci 5'-části rozpoznaného vlákna β-kaseinového genu (oblast v rozmezí od 1621. do 1640. nukleotidu) a primery GCSF2 (SEQ ID NO: 5) a GSF3 (SEQ ID NO: 6) mají v uvedeném pořadí nukleotidové sekvence komplementární k 3 '-částem rozpoznaného vlákna hG-CSF (oblasti v rozmezí od 511. do 530. nukleotidu a od 681. do 698. nukleotidu).

Produkty PCR byly podrobeny elektroforéze na agarosovém gelu a výsledek je znázorněn na obrázku 2, kde linie 1 až 7 jsou produkty PCR od jednotlivých φφ ·φ • 9 9 · kůzlat, linie (-) je od rodičovské kozy přírodního typu a linie (+) je ze směsi DNA genomu rodičovské kozy přírodního typu a plazmidu pGbc-hGCSF. Na linii 6 v obrázku 2 lze pozorovat pás 480 bp získaný pomocí PCR při užití primerů GB2 (SEQ ID NO: 4) a GCSF2 (SEQ ID NO: 5) a pás 540 bp získaný pomocí PCR při užití primerů GB2 (SEQ ID NO: 4) a GCSF3 (SEQ ID NO: 6). To potvrzuje, že kůzle z linie 6 je transgenní koza s vneseným úsekem DNA pro genovou expresi pGbc-hGCSF.

3) Analýza metodou Southern blotting μΐ kůzlečího genomu DNA získaného v bodu 1) bylo rozštěpeno Hind III a výsledné fragmenty byly podrobeny elektroforéze na 0,8% agarosovém gelu a přeneseny na nylonovou membránu podle Sambrook J. et al. (viz výše). Na nylonové membráně adsorbovaná DNA byla prehybridizována prehybridizačním roztokem (óxSSC, 5xDenhardtovo činidlo a 0,5% SDS) při 68 °C po 2 hodiny a poté hybridizována s ³²P značenou sondou hG-CSF připravenou náhodným značením fragmentu Hind III/Nae I genu hG-CSF pomocí [ot-³²P] dCTP.

Po ukončení reakce byla nylonová membrána postupně promyta roztokem 2xSSC/0,l% SDS při laboratorní teplotě, identickým roztokem při 65 °C po 10 minut a roztokem lxSSC/0,1% SDS při 65 °C po 10 minut. Na nylonovou membránu byl položen rentgenový film, exponovalo se při -70 °C po tři dny a poté se film vyvolal.

Výsledky jsou znázorněny na obrázku 3, kde linie 1 až 7 představují DNA genomy jednotlivých kůzlat, linie (-) DNA genom rodičovské kozy přírodního typu a linie (+) je směsí DNA genomu rodičovské kozy přírodního typu a plazmidu pGbc-hGCSF. Výsledky na obrázku 3 naznačují, že kůzle z linie 6 je transgenní kozou s vneseným úsekem DNA pro genovou expresi pGbc-hGCSF.

Opakováním výše uvedeného postupu byly mezi 25 kůzlaty identifikovány dvě transgenní kozy.

9« ·* «9 »9 »* ·· «999 9 9 · 9 ··· • 999 9 9 99 9 9 • 9 999 9 · 9 9 9 9 9 < ·

9 · 9 9 · 9 999 • 9 99 99 99 *· 999

Příklad 6

Analýza hG-CSF obsaženého v mléce transgenní kozy pomocí metody western blotting

Po přivedení transgenních koz získaných v příkladu 5 k vrhnutí potomků bylo od nich ve druhém dni odebráno mléko (kolostrum) a dále v pátém dni. K mléku se přidal stejný objem lx PBS a výsledná směs byla udržována při 4 °C po 1 hodinu a poté zcentrifugována při 13 000 otáčkách za minutu po 15 minut za zisku supematantu (mléčné syrovátky). 2 μΐ supematantu byly vystaveny působení 15% SDS-PAGE. Postup byl opakován pomocí komerčního rHuG-CSF získaného z E. coli (Kirin, Japonsko) a rHuG-CSF získaného z buněk CHO (Jugai, Japonsko) v uvedeném pořadí, jako srovnávacích skupin a mléčné syrovátky rodičovské kozy přírodního typu. Na gelu odseparované proteiny byly převedeny na nitrocelulosovou membránu (Amersham pharmacia biotech, USA), a to v oboru dobře známým způsobem (Proteinové metody (Protein Methods), Daniel M. Bollag a Stuart J. Edelstein, Wiley-Liss, 1991). Na membránu se působilo v třepačce blokačním roztokem (lxPBS obsahující 3 % odstředěného mléka) po 1 hodinu. Na membránu se působilo 1 hodinu roztokem připraveným tisícinásobným zředěním anti-hG-CSF myšího IgG (R&D systems, USA) 10 ml blokačního roztoku a dále trojnásobným zředěním 300 ml lxPBS po 5 minut ve třepačce. Na membránu se působilo 1 hodinu 10 ml roztoku připraveného blokačním roztokem tisícinásobně zředěné myší anti-IgG protilátky konjugované s křenovou peroxidázou. Na membránu se třikrát působilo lxPBS po 5 minut a poté se vyvolala pomocí soupravy ECL (Amersham pharmacia biotech, USA).

Výsledky jsou znázorněny na obrázku 4, kde linie 1 je 50 ng rHuG-CSF, linie 2 je 100 ng rHuG-CSF z E. coli, linie 3 je 50 ng rHuG-CSF z CHO, linie 4 je 100 • · · ···· · · · ·· ·· ·· ·· ·· ···· ng rHuG-CSF z CHO, linie 5 je 1 μΐ mléčné syrovátky transgenní kozy z druhého dne, linie 6 je 1 μΐ mléčné syrovátky transgenní kozy z pátého dne, v linii S jsou markéry molekulové hmotnosti proteinů a v linii (-) je mléčná syrovátka rodičovské kozy přírodního typu. Jak lze vidět z obrázku 4, v mléce transgenní kozy je přítomen pás proteinu s 18 kDa, který je identický s komerčními hG-CSF. Navíc intenzita tohoto pásu v mléčné syrovátce v pátém dnu je větší, než v mléčné syrovátce ve druhém dnu. Toto znamená, že koncentrace hG-CSF v mléčné syrovátce je v rozmezí 50 až 100 pg/ml. Transgenní koza tedy v mléce vylučuje velké množství hG-CSF.

Příklad 7

Koncentrace hG-CSF v mléce transgenní kozy

Ke stanovení koncentrace hG-CSF v mléce transgenní kozy bylo mléko transgenní kozy získané v příkladu 6 čtyřikrát zředěno roztokem pufru (20 mM Trizma base o pH 7,4 a 1 mM EDTA) a třikrát centrifrigováno při 27 OOOxg při 4 °C po 20 minut, aby se odstranily lipidy a cukry. Koncentrace hG-CSF v supematantu (mléčné syrovátce) byla stanovena pomocí komerční soupravy ELISA na faktor stimulující kolonie granulocytů (G-CSF) (katalogové číslo DCS50, R&D Systems, USA).

Příklad 8

Aktivita hG-CSF obsaženého v mléce transgenní kozy

Buňky HL-60 pocházející z lidské kostní dřeně (ATCC CCL-240) byly kultivovány v médiu RPMI 1640 obsahujícím 10 % fetálního hovězího séra při 37 °C v atmosféře 5% CO₂. Počet buněk byl upraven na 2,2.10⁵ buněk/ml a přidal se • · ·

DMSO na výslednou koncentraci 1,25 % (V/V). 90 μΐ buněčné kultury (asi 2.10⁴buněk) bylo přidáno do každé jamky destičky s 96 jamkami s nízkým odparem (NUNC, Dánsko) a kultivovovalo se při 37 °C v atmosféře 5% CO2 po 48 hodin.

Každá mléčná syrovátka od transgenní kozy získaná v příkladu 6, mléčná syrovátka rodičovské kozy přírodního typu a komerční hG-CSF (Choongwae Pharma Corporation) se zředily médiem RPMI 1640 na výslednou koncentraci 500 ng/ml hG-CSF a podrobily se následnému dvojnásobnému zředění médiem RPMI 1640.

pg komerčního hG-CSF (Choongwae Pharma Corporation) se přidaly k 10 ml mléčné syrovátky rodičovské kozy přírodního typu za zisku směsi a 10 μΐ této směsi se přidalo do jamky obsahující buňky HL-60 a kultivovalo se při 37 °C po 48 hodin.

Pro zjištění stupně proliferace buněk v kultuře se na každou kulturu působilo přípravkem CellTiter™ (katalogové číslo G4100, Promega, USA) a jejich optická hustota byla měřena při vlnové délce 670 nm.

Výsledky jsou znázorněny na obrázku 5, kde symbol -·- představuje komerční hG-CSF, symbol směs komerčního hG-CSF a mléčné syrovátky rodičovské kozy přírodního typu, symbol -A- mléčnou syrovátku transgenní kozy a -▼-mléčnou syrovátku transgenní kozy. Jak lze vidět z obrázku 5, mléčná syrovátka transgenní kozy má identickou buněčnou proliferační aktivitu s komerčním hG-CSF, zatímco mléčná syrovátka rodičovské kozy přírodního typu neovlivňuje proliferaci buněk. Navíc je proliferace buněk HL-60 indukována hG-CSF obsaženým v mléčné syrovátce transgenní kozy, přičemž je ekvivalentní s proliferaci známého hG-CSF.

I když byl předmět vynálezu popsán a ilustrován pouze odkazy na zvýhodněná provedení, odborníkům v oboru je zřejmé, že zde lze provést různé změny a • ·

modifikace bez odklonění se od duchu a rámce předloženého vynálezu, který je definován v připojených nárocích.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Kozí zygota, vyznačující se tím, že obsahuje konstrukt nukleové kyseliny s nukleotidovou sekvencí promotoru kozího β-kaseinu a sekvenci nukleové kyseliny kódující faktor stimulující kolonie lidských granulocytů, hG-CSF.
2. Kozí zygotapodle nároku 1, vyznačuj ící se t i m, že kozou je Capra hircus aegagrus.
3. Kozí zygota podle nároku 1, vyznačuj ící se t i m, že konstruktem nukleové kyseliny je expresní vektor pGb-hGCSF, SEQ ID NO: 1.
4. Kozí zygotapodle nároku 3, vy zn a č uj i c i se t i m, že je to embryo Capra hircus aegagrus/pGbc-bGCSF, s číslem KCTC 0718BP.
5. Způsob přípravy kozí zygoty podle nároku 1,vyznačující se tím, že zahrnuje mikroinjektáž konstruktu nukleové kyseliny obsahujícího nukleotidovou sekvenci promotoru kozího β-kaseinu a nukleotidovou sekvenci kódující hG-CSF do neporušené kozí zygoty.
6. Způsob přípravy neporušené kozí zygoty, vy zn a č uj i c i se tím, že zahrnuje synchronizaci estru kozy, superovulaci kozy, připuštění superovulující kozy kozlem a odebrání zygoty z připuštěné kozy, přičemž synchronizační krok se provede podáním norgestometu a estradiolu koze, vnesením implantátu obsahujícího norgestomet do kozy a odstraněním implantátu a superovulační krok se provede postupným podáváním koze v předem určených časových intervalech ·· *· • * · · • · · · • · · ·· ·*

94 99

9 9 4 4

4 4 49

9 9 9 4 «»· ·« • fc 44 4 4 4 4

4 9 ·

4 4 9

4 9 9 ·· ··** kombinované dávky sérového gonadotropinu březích klisen, PMSG, a folikulostimulačního hormonu, FSH, rozdělené dávky FSH a kombinované dávky FSH a lidského choriového gonadotropinu, hCG.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že kozou je Capra hircus aegagrus a že v synchronizačním kroku se podání PMSG a FSH provede 60 hodin před odstraněním implantátu, podání FSH se provede šestkrát každých 12 hodin po podání PMSG a FSH a podání FSH a hCG se provede 12 hodin poté.
8. Transgenní koza, vyznačuj ící se t i m, že produkuje mléko obsahující hG-CSF a která se vyvinula z kozí zygoty podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.
9. Způsob získání transgenní kozy podle nároku 8, vyznačující se tím, že zahrnuje přenos kozí zygoty podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 do kozy a ponechání kozí zygoty se vyvinout do normálního termínu porodu.
10. Způsob výroby hG-CSF, vy znač uj íc í se t í m, že se od transgenní kozy podle nároku 8 získává mléko a z mléka se získává hG-CSF.
11. Složení mléka, vyznačující se tím, že obsahuje hG-CSF, který je produkován transgenní kozou podle nároku 8.
12. hG-CSF, který je produkován způsobem nároku 10.
13. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje hG-CSF podle nároku 12 a farmaceuticky přijatelný nosič.