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Gebiet der Erfindung
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Das Gebiet der Erfindung betrifft
Verfahren zur Entwicklung transgener Ziegen.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die selektive Züchtung von domestizierten Tieren
basierend auf phänotypischen
Merkmalen hat zu einer signifikanten genetischen Verbesserung einer
Auswahl von Züchtungen
geführt.
Beispielsweise resultierten selektive Züchtungstechniken in der Erzeugung
von Milchkühen,
die mehr Milch produzieren und Milch mit verbesserten Fett- und
Protein-Profilen produzieren. Reproduktive Technologien, einschließlich künstlicher Befruchtung
und Embryonentransfer (d. h., Übertragen
eines Embryos in ein Tier, dass diesen nicht hervorgebracht hat)
haben zu dieser genetischen Verbesserung beigetragen. Verbesserte
reproduktive und molekulare Technologien, zum Beispiel Klonierung
von Embryonen und markerassistierte Auswahl (genetisches Screening),
erlauben eine noch größere Kontrolle über die
Auswahl der gewünschten
Merkmale. Allerdings erlauben diese Verfahren nur die Auswahl und
Vermehrung von Merkmalen, die bereits im Genpool der Spezies sind. Um
die existierenden Gene zu ersetzen oder zu modifizieren oder um
Gene für
Merkmale, die nicht in dem Genpool der Spezies vorliegen, zu inserieren,
muss ein Transgen in das Tier eingeführt werden. Transgene können verwendet
werden, um eine Krankheitsresistenz einzuführen, um die Zusammensetzung
der vom Tier stammenden Produkte (Milch, Serum, etc.) zu verändern, um
Arzneimittel oder Nahrungsmittel herzustellen oder für andere
Zwecke.
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Eine Anzahl von Techniken kann verwendet
werden, um transgene Tiere zu erzeugen. Unter den Techniken, die
erfolgreich verwendet wurden sind: Injektion des Transgens in den
Vorkern, Kerntransplantation und Injektion von genetisch veränderten
Stammzellen in Wirtsembryonen (Herstellung von Chimären).
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Vorkern-Injektion ist ein allgemein
verwendetes Verfahren für
Keimbahninsertion von Genen. Während diese
Technik attraktiv ist, da sie erfolgreich bei einer Reihe von Tieren
verwendet werden kann, machen die Unfähigkeit die Integration des
Transgens zu kontrollieren und die große Anzahl von Eizellen, die
injiziert werden müssen,
um wenigstens einen einzigen transgenen Nachkommen zu erhalten,
zusammen die Technik eher ineffizient, zumindest für andere
Tiere als Mäuse.
Außerdem
können
Tiere, die zum Beispiel durch Southern Analyse die als transgen
erachtet werden, Mosaike sein, das Transgen enthalten, es jedoch
nicht exprimieren, es in einer unerwünschten Weise exprimieren oder
es korrekt exprimieren, jedoch nicht an die Nachkommen weitergeben.
Ungeachtet dieser Schwierigkeiten wurden transgene Mäuse, Schafe,
Ziegen, Rinder und Schweine unter Verwendung der Vorkern-Injektion hergestellt.
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Transgene Mäuse wurden durch genetische
Manipulation von embryonalen Stammzellen (ESZ) der Maus erzeugt,
zum Beispiel durch injizieren eines Transgens in die ESZ, und dann
injizieren der veränderten embryonalen
Stammzellen in einen Wirtsembryo. Die resultierenden Mäuse sind
Mosaike, in denen die genetisch veränderten Zellen in einem größeren oder
geringeren Ausmaß zu
den somatischen Zellen oder Keimzellen beitragen.
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Kerntransfer ist ein dritter Ansatz,
um die Herstellung eines transgenen Tiers zu erreichen. Bei dieser Technik
wird der Kern einer Donorzelle in eine Rezipienten Eizelle eingebracht.
Von Nachkommen wurde auch bei Rindern und Schafen berichtet, jeweils
aus Zellen der inneren Zellmasse (ICM) und Keimscheibe, unter Verwendung
der Technik des Kerntransfers.
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Embryonen-Transfer ist eine Technik,
in der ein Embryo, der aus einem Donortier entnommen wurde in ein
Rezipiententier übertragen
wird, das den Embryo austrägt.
Durch Embryonen-Transfer wurden erfolgreich Nachkommen erzeugt,
wenn Embryonen von Zwergziegen in Standard- Ziegen übertragen
wurden, Sugie et al., 1970.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die Erfindung bietet ein Verfahren,
das die folgenden Schritte einschließt: (a) Einbringen eines Transgens
in eine Zygote einer Zwergziege, (b) Transplantieren der Zygote
in eine scheinschwangere Nicht-Zwergziege und (c) Ermöglichen
der Entwicklung Zygote bis zur Geburt.
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In einem weiteren Aspekt weist die
Erfindung ein Verfahren auf, das die folgenden Schritte einschließt: (a)
Einbringen eines Transgens in einen Embryo einer Zwergziege, (b) Transplantation
des Embryos in eine scheinschwangere Nicht-Zwergziege und (c) Ermöglichen
der Entwicklung des Embryos bis zur Geburt.
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In einem weiteren Aspekt bietet die
Erfindung ein Verfahren, das die folgenden Schritte einschließt (a) Einbringen
eines Transgens in die Zygote einer Zwergziege, (b) Transplantieren
der Zygote in eine scheinschwangere Zwergziege und (c) Ermöglichen
der Entwicklung der Zygote bis zur Geburt. In einem weiteren Aspekt
weist die Erfindung ein Verfahren auf, das die folgenden Schritte
einschließt:
(a) Einbringen eines Transgens in den Embryo einer Zwergziege, (b)
Transplantieren des Embryos in eine scheinschwangere Zwergziege
und (c) Ermöglichen
der Entwicklung des Embryos bis zur Geburt.
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In bevorzugten Ausführungsformen
schließt
das Verfahren auch ein: (d) Züchtung
der Nachkommen, um eine transgene Zwergziege herzustellen. In anderen
bevorzugten Ausführungsformen
erfolgt das Einbringen des Transgens in den Embryo durch Einbringen
einer embryonalen Stammzelle, die das Transgen enthält, in den
Embryo. Das Einbringen des Transgens erfolgt durch Infektion des
Embryos mit einem Retrovirus, das das Transgen enthält. Das
Einbringen des Transgens in die Zygote erfolgt durch Injektion des
Transgens in den Vorkern der Zygote.
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In anderen bevorzugten Ausführungsformen
werden wenigstens vier Zygoten in die scheinschwangere Zwergziege
transplantiert und wenigstens vier Embryonen werden in die scheinschwangere
Nicht-Zwergziege transplantiert.
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In einem weiteren Aspekt der Erfindung
weist die Erfindung embryonale Stammzellen der Zwergziege auf.
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Mit „transgen" ist eine DNA Sequenz
gemeint, die in die Keimbahn eines nicht-menschlichen Tiers eingebracht
wird, durch menschliches Eingreifen, wie zum Beispiel durch die
hier beschriebenen Verfahren.
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Mit „Zwergziege" ist eine Nigerianische
Zwergziege oder eine Pygmäen
Ziege oder jede andere Ziege geringer Größe, vergleichbar mit der einer
Nigerianischen Zwergziege oder der einer Pygmäen Ziege, gemeint. Geeignete
Ziegenzüchtungen
wiegen vollständig
ausgewachsen vorzugsweise etwa 36,3 kg (80 lbs) oder weniger und
wiegen 2,0 kg, bevorzugter 1,7 oder 1,5 kg bei der Geburt. Geeignete
Züchtungen
haben eine fötale
Größe und neugeborenen
Größe, die
es einer Nicht-Zwergziege (d.h. einer Standard-Ziege), in die das
Zwergziegenembryo oder die Zygote übertragen werden, erlaubt,
3 oder 4, bevorzugter 5 oder 6 Zwergziegen, in einer einzigen Schwangerschaft
zu gebären.
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Achondroplastische Zwergziegen sind
zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sowie
Zwergziegen, deren kleine Gestalt aus anderem Grund vorliegt.
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Da mehrere Zwergziegen Embryonen
in eine einzige scheinschwangere Standard-Ziege implantiert werden
können,
stellt das erfindungsgemäße Verfahren
ein Weg zur Verfügung,
durch den die Anzahl der Rezipiententiere, die für die Herstellung von transgenen
Ziegen benötigt
wird, verringert werden kann. Der Transfer von mehreren Zwergembryonen
in Standard- Ziegen als Rezipienten resultiert in einem Anstieg
(z.B. 2- bis 4 -fach) der Anzahl der Nachkommen pro Rezipient, verglichen
mit der Implantation von Standard-Ziegenembnonen in Standard- Ziegen Rezipienten.
Dies zeigt einen signifikanten Anstieg in der Produktionseffizienz
und eine signifikante Verringerung der Kosten der Rezipiententiere
verglichen mit anderen Systemen, wie den Transfer von Standard-Ziegenembryonen
in Standard-Rezipientenziegen. Darüber hinaus besitzen Zwergziegen
Eigenschaften, einschließend,
fehlende Saisonabhängigkeit,
frühes
Einsetzen der Geschlechtsreife und kleine fötale und neugeborenen Größe und guten
Milchertrag, der sehr wünschenswert
bei transgenen Tieren, die für
die Herstellung von Arzneimitteln öder Nutriceuticals in Milch
verwendet werden. Das Fehlen der Saisonabhängigkeit und das frühe Einsetzen
der Geschlechtsreife verringern die Generations-Intervalle verglichen
mit a mit anderen Milch-Wiederkäuern. Unter
Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
kann ein heterologes Genprodukt in der Milch eines transgenen Tiers
exprimiert werden in einem Zeitrahmen, der der kürzeste von allen Milch-Wiederkäuern ist
(z.B. ein Jahr vor dem von transgenen Milchvieh).
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Es ist die geringe fötale und
neugeborenen Größe von Zwergziegen,
die die Implantation von mehreren Embryonen in eine einzige Standard-Rezipientenziege
erlaubt. Zwergziegen sind ein wünschenswertes System
für die
Herstellung von transgenen Ziegen, auch wenn Zwerg-Ziegen eher als Standard-Ziegen
als Rezipienten für
Embnonen oder Zygoten verwendet werden. Dies ist so, da eine Zwergziege
natürlicherweise mehr
Nachkommen in einer einzigen Schwangerschaft erzeugt, als Standard-Ziegen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit jedem
Verfahren zur Herstellung transgener Zwergziegen verwendet werden,
einschließend:
Vorkern Injektion (oder jedes andere Mittel zur Einführung eines
Gens in eine Zelle), Kernaustausch (Embryo Klonierung) und Injektion
von genetisch manipulierten embryonalen Stammzellen in Embnonen
(Chimären
Herstellung). Das erfindungsgemäße Verfahren
kann auch verwendet werden, um andere fortgeschrittene reproduktive
und genetische Techniken zu entwickeln, wie homologe Rekombination.
Das erfindungsgemäße Verfahren
hat zahlreiche Vorteile gegenüber
den anderen Wiederkäuer-basierten
transgenen Systemen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren schließt vorzugsweise
die Erweiterung und Vermehrung der Zwergziegen Nachkommen ein, transgener
(oder ansonsten genetisch verändert,
so dass einige der Zellen ein Gen enthalten, das nicht natürlich in
der Spezies vorkommt) Transfer von Embryonen oder Eizellen oder
Zygoten an Standard-Ziegen. Generell können unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren
4 bis 6 oder mehr Zwergziegen Embryonen in einen Standard-Rezipienten übertragen
werden. Dies stelle eine signifikante Verbesserung gegenüber der
Verwendung von Standard- Ziegen dar, wo einer Standard-Rezipientenziege
nur 1 oder 2 Standard- Ziegen Nachkommen geboren werden.
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung
schließt
den Transfer von genetisch manipulierten Zwergziegen-Embryonen in
Zwergziegen ein.
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Andere Eigenschaften und Vorteile
der Erfindung sind aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsformen
und den Ansprüche
ersichtlich.
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Beschreibung
der bevorzugen Ausführungsformen
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A. Zwergziegen
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Zwergziegen sind einheimisch in Indien,
Arabien, China, auf den Westindischen Inseln und in Afrika (besonders
Nigeria, Ghana und Kamerun). Zwergziegen herrschen in Westafrika
vor, aufgrund ihrer natürlichen
Resistenz gegenüber
der Tse-tse Fliege, die andere Ziegenarten zerstören. Diese westafrikanische
Ziege wird auch Fouta Djallon, Kamerun-, Nigerianische Ziege oder
Baumziege genannt.
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Züchter,
die in Nordamerika auf leicht unterschiedliche äußere Merkmale selektierten,
haben zwei Züchtungen
von Zwergziegen, die Pygmäen-Ziege
und die Nigerianische Zwergziege charakterisiert. Nigerianische
Zwerge habe leicht längere
Hälse und
Beine und ihre Fässer
(barrels) sind nicht so breit und tief wie die der Pygmäen. Züchter der
Pygmäen
Ziegen selektieren auch auf einen eingeschränkteren Bereich der Fellfarbe.
Diese Züchtungen
sind beide von westafrikanischen Zwergziegen abgeleitet und haben ähnliche
reproduktive- und milchherstellungs-Eigenschaften (Tabellen 2 und
3). Zwergziegen, die für
das erfindungsgemäße Verfahren
nützlich
sind schließen
Nigerianische Zwergziegen, Pygmäen Zwergziegen
und andere Zwergziegen, die eine Größe haben, die es einer Standard-
Ziege erlauben 3 oder mehr in einer Schwangerschaft auszutragen,
ein.
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Die Amerikanisch-Nigerianische Zwergziegen
Gesellschaft (Alvaro, TX) stellt Informationen bezüglich Nigerianischer
Zwergziegen einschließlich
Züchterlisten
zur Verfügung.
Gemäß der Amerikanisch-Nigerianischen
Zwergziegen Gesellschaft sind ideale Ziegen 43,2 cm bis 48,3 cm
(17'' bis 19'') maximal 53,3 cm (21'') groß, und ideale Böcke sind
48,3 cm bis 50,8 cm (19'' bis 20''), maximal 58,4 cm (23'') groß. Ihr Idealgewicht beträgt vollständig ausgewachsen
34 kg (75 lbs). Natürlich
müssen
Zwergziegen, die für
das erfindungsgemäßen Verfahren
nützlich
sind nicht diese strengen Kriterien erfüllen. Nigerianische Zwergziegenwiegen
durchschnittlich 0,9 kg (2 lbs) bei der Geburt. Böcke können die
Geschlechtsreife mit 7 Wochen erreichen. Ziegen können sich
mit 7-8 Monaten fortpflanzen, obwohl es auch früher möglich ist. Nigerianische Zwergziegen
sind registrierfähig
bei der Amerikanischen Ziegen Gesellschaft, im Internationalen Milchziegen
Register und bei der Kanadischen Ziegen Gesellschaft.
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Die Nationale Pygmäen Ziegen
Gesellschaft hat einen Standard für die Zucht gesetzt, der von
der Amerikanischen Ziegen Gesellschaft akzeptiert wurde. Gemäß diesen
Standards ist ein ausgewachsener Bock am Widerrist 40,6 cm bis 59,9
cm (16,0'' bis 23,6'') hoch und eine ausgewachsene Ziege ist am
Widerrist 40,6 bis 56,9 cm (16,0'' bis 22,4'') hoch.
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Informationen bezüglich sowohl der Pygmäen Ziegen
und der Nigerianischen Zwergziegen kann in „The Pygmy Goat in America
with the Nigerian Dwarf" (Alice Hall, Hall Press, San Bemardino,
CA, 1992; ISBN: 0-932218-13-X; Bücherei
des Kongress, Katalog Karten Nummer: 82-90126).
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Die Zwergziegen sind homozygot für geringe
Größe. Zwergeswuchs
scheint durch drei Gene reguliert zu werden (Blanks, A Morphological,
Physiological and Genetic Investigation of the African Pygmy Goat,
Doktorarbeit, Oregon State University, 1971). Bei der Geburt ist
ein typisches Zwergzicklein weniger als halb so groß wie ein
Standard-Zicklein bei der Geburt. Das Gewicht von Zwergziegen ist
durchschnittlich bei 1,4 kg für Weibchen
und 1,6 kg für
Männchen,
wohingegen bei Standard-Saanen das Geburtsgewicht 3,6 kg für Weibchen
und 3,8 kg für
Männchen
ist. Hybride Zwerg-Standard-Zicklein liegen zwischen den parentalen
Phänotypen.
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Tabelle
2. Vergleich zwischen Zwerg- und Standard-Ziegenarten
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Kürzere Generationszeiten
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Zwergziegen haben dank ihrer sexuellen
Frühreife
eine kürzere
Generationszeit, als andere Milch-Wiederkäuer (Standard- Ziegen, Schafe,
Kühe).
Zwergziegen beiderlei Geschlechts sind schnell vollentwickelt. Der
Zyklus beginnt bei den Weibchen in allgemeinen in einem Alter von
zwei bis sechs Monaten, verglichen mit neun Monaten bei Standard-Ziegen,
und sie sind in der Lage eine Schwangerschaft bis zum Ende auszutragen,
wenn sie zu dieser Zeit befruchtet werden. Ebenso produzieren männliche
Zwergziegen nach zwei bis drei Monaten lebensfähiges Sperma, verglichen mit
fünf Monaten
bei Standard-Ziegen. Die Standard-Handhabungs-Praxis mit Zwergziegen
erfordert es, dass die Männchen
von ihren Wurfgefährten
im Alter von zwei Monaten entfernt werden, um junge Böcke von
der Paarung mit ihren Schwestern vor der Entwöhnung abzuhalten.
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Die frühe Geschlechtsreife ist wichtig,
da sie es einem transgenen Weibchen ermöglicht drei oder vier Monate
nach der Geburt befruchtet zu werden, was die frühe Milchproduktion als junge
Ziege erlaubt. Der gesamte Vorgang, beginnend als mikroinjiziertes
Ei bis zum milchgebenden Weibchen dauert 14 Monate (fünf Monate
für Fötus Gestation,
vier Monate für
Ziegen Wachstum und fünf
Monate für
Ziegen Gestation. Außerdem
kann das Milchgeben hormonell induziert werden, was somit die Zeit,
die benötigt
wird, um transgene Milch zu erhalten, weiter verkürzt (fünf Monate
für Fötus Gestation
und zwei bis vier Monate für
Ziegen Wachstum).
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Fehlen von Saisonabhängigkeit
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Die Zwergziege ist über das
ganze Jahr sexuell aktiv, eine Tatsache, die weiter zu ihren kürzeren Generationsintervallen
beiträgt.
Standard-Ziegen in gemäßigtem Klima
haben bestimmte Perioden der sexuellen Aktivität. In der nördlichen Hemisphäre haben
Standard-Ziegen
bestimmte Brunstzeiten von September bis März mit auftretender Brunst
etwa 18-21 Tage auseinander. Im Gegensatz dazu sind Zwergziegen
polystrous, (das heißt
sie zeigen keine Periode der sexuellen Inaktivität), wahrscheinlich weil sie
sich in den Tropen entwickelt haben in denen die saisonalen Wirkungen
auf die Reproduktion gering sind. Diese fehlende Saisonabhängigkeit
ist ein wichtiger Gesichtspunkt der Zwergziegenphysiologie, da geschlechtsreife
Tiere über
das ganze Jahr vermehrt werden können,
entweder durch natürliche
Befruchtung, Superovulation, Embryonentransfer oder durch Lagerung
eingefrorener Embryonen mit nachfolgendem Transfer. Dies ist besonders
vorteilhaft für
die Steigerung der Anzahl transgener Tiere. Einige Standard- Züchtungen
von Ziegen sind weniger saisonabhängig als andere und können als
Rezipient über
den größten Teil
des Jahres verwendet werden.
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Laktationsleistung
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Die Laktationsleistung von transgenen
Zwergziegen ist ausreichend um sie zu einem brauchbaren Modell für die heterologe
Proteinproduktion zu machen. Typische Laktation produziert durchschnittlich
1,0-1,5 L pro Tag für
10 Monate, eine bemerkenswerte Menge, wenn man die geringe Körpergröße der Zwergziegen bedenkt.
Diese Laktationsleistung ist somit ausreichend um das Erfordernis
für Gramm-Mengen
an Protein zu erfüllen.
Die Amerikanische Ziegengesellschaft hat Produktionsaufzeichnungen
für Pygmäen-Ziegen
angesetzt, die 1/3 der größeren Milchziegen
Züchtungen
produzieren. Die internationale Milchziegenregistrierung hat ähnliche
Produktionsstandards für
Pygmäen
und Nigerianische Zwergziegen angesetzt. Obwohl die Produktionsstandards
bei 460 bis 550 lbs (209 bis 250 kg) für Jährlinge liegen, können ältere Ziegen
mehr produzieren. Ziegen, die über
1000 lbs (454 kg) mit hohem Butterfett (5,5%) und Protein (4,2%)
produzieren sind nicht ungewöhnlich
(Diary Goat Journal, 1993 und Nigerianische Zwergziegen Gesellschaft).
Kürzlich
erbrachte eine Beurteilung der Milch einer Nigerianischen Zwergziege
aus unserer Herde durchschnittlich 5,6% Fett, 4,3% Protein und 4,9%
Laktose (8 Proben). Dies Übertrifft
den durchschnittlichen Proteingehalt für Standard- Ziegen von 3,0%,
für eine Molkerei
aus Quebec, die Laktationserträge
von 34 milchgebenden Molkerei Ziegen berichtet hat (Kanadische Ziegen
Gesellschaft, Quarterly, Nov. 1994).
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Tabelle
3. Produktionsstandards für
Zwergziegen Jährlinge
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Geringe Körpergröße
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Zusätzlich zu den Voreiten in der
Produktion bedeutet die geringe Körpergröße von Zwergziegen, dass weniger
Raum benötigt
wird, um milchgebende Zwergziegen unter zu bringen. Zusätzlich macht
ihre geringe Größe und ansehnliche
Natur auch die Handhabung der Tiere leichter.
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B. Ziegen Mehrfach-Geburtssystem
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Das Ziegen Mehrfach-Geburtssystem
basiert auf der Verwendung von Zwergziegen. Da Zwergziegen Föten und
Neugeborene klein sind, kann eine Standard-Rezipientenziege erfolgreich
mehrere Zwergziegen Nachkommen austragen und gebären. Sogar Zwergziegen können erfolgreich
3 bis 4 Zwergziegen-Nachkommen tragen. Jeder Ansatz resultiert in
einer gesteigerten Vervielfältigung
der Nachkommen und kürzeren
Generationsintervallen, im Vergleich zu der Herstellung von Standard-Ziegen
in Standard-Ziegen.
Das Verfahren schließt
die Sammlung von Zwergziegen Embryonen und ihren Transfer in synchronisierte
Standard-Rezipientenziegen oder in synchronisierte Zwergziegen Rezipienten
ein. In einer Studie waren wir in der Lage insgesamt 67 Zwergziegen
Embryonen aus sechs Zwergziegen Donoren zu gewinnen (durchschnittliche
Anzahl der Embryonen aus jedem Donor = 11,2). In einer anderen Studie
wurden insgesamt 16 Zwergziegen Embnonen in drei Standard- Rezipientenziegen übertragen
(durchschnittliche Anzahl der Embnonen in jeden Rezipienten = 5,3),
von denen zwei schwanger blieben.
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Mehrere Schritte sind in das erfindungemäße Verfahren
einbezogen. Diese Schritte schließen ein: Synchronisation und
Superovulation, Embryonengewinnung und Embryonentransfer. Nicht
alle diese Schritte sind notwendiger Weise in jede Ausführungsform
des Ziegen Mehrfach-Geburtssystems einbezogen. Die genauen Schritte
und Techniken, die einbezogen sind hängen von der Verwendung in
dem System, das angewandt wird, ab. In vielen Fällen werden Zwergziegen Embryonen
von dem Transfer in die Rezipientenziege (die eine Standard- oder
Zwergziege sein kann) manipuliert (kloniert, mikroinjiziert, usw.).
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Synchronisation
und Superovulation
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Die Ziegen (Standard und Zwerge)
können
durch jegliches System, das dem Fachmann bekannt ist synchronisiert
und superovuliert werden. Das folgende hormonelle System ist nur
ein Beispiel der Verfahren, die verwendet werden können. Schwämme, die
60 mg Methoxyprogeseteron-Azetat enthalten wurden in die Vagina
von Standard- und Zwergziegen gebracht und dort für 17 Tage
belassen. Für
drei Tage, beginnend an Tag 15 der Schwammbehandlung, erhielten
die Zwergziegen (Embryonendonoren) zwei Injektionen Follikelstimulierendes
Hormon (FSH) pro Tag in absteigender Dosierung (5 mg, 4 mg, 3 mg,
2 mg, 2 mg, 2 mg mit 200 I.U. PMSG an Tag 2). Die Befruchtung wurde
erreicht, indem der Bock an Tag 18 und 19 bei den Ziegen war. Alternativ
kann die Ziege künstlich
befruchtet werden. Standard-Rezipientenziegen wurden nicht befruchtet, aber
wurden unter Verwendung der Schwämme
synchronisiert. Geringere Dosen FSH und Permanent Mare Serum Gonadotropin
(PMSG; 400 I.U.) können
für die
Synchronisation der Rezipienten auch verwendet werden, um die Eierstock-Antwort
zu sichern. Die Embryonen werden gesammelt und fünf Tage nach Befruchtung übertragen.
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Gewinnung der
Embryonen
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Embryonen wurden gewonnen und chirurgisch
unter Verwendung von Standardverfahren übertragen. Die Ziegen haben
24 h vor der Operation gefastet und dann wurde ihnen 0,66 mg Atropinsulfat
gegeben. Betäubung
wurde durch intravenöse
Verabreichung von Diazepam (1 mg/kg Körpergewicht) und Ketamin (5 mg/kg)
induziert. Die Betäubung
wurde mit Halothan durch endotrachiale Intubation aufrechterhalten.
Für Embryonen
im Morula- und Blastozystenstadium
(Tag 4-6 nach Befruchtung) wurde der Uterus exponiert und der proximate
Gebärmutterzipfel
wurde mit einem Foley Katheter verschlossen (Fr. 10 oder 12 für Standard-Ziegen
und Fr. 10 für
Zwergziegen). Ein Fr. 3 ½ Tom
Cat Katheter wurde an der Uterus-Tuben Verbindung inseriert und
10 bis 20 ml Medium wurde in den Uterus eingeführt. Beide Gebärmutterzipfel
wurden gleich behandelt. Embryonen in früheren Stadien können auf
die gleiche Weise durch spülen
der Eileiter (Tag 1-3 nach Befruchtung) gewonnen werden. Andere
Verfahren zur Embryonen Gewinnung können auch in den Verfahren
der Erfindung verwendet werden.
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Embryonen Transfer
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Die Zwergziegen Embryonen wurden
in die synchronisierten Standard-Rezipientenziegen entweder durch
ein chirurgisches Verfahren ähnlich
der Embryonen Gewinnung, oder durch Laparoskopie oder Nicht-Chirurgische
Verfahren (Pendleton et al., Luisiana Agriculture, 29 : 6-7, 1986, beschreibt
solche Verfahren) übertragen.
In dem chirurgischen Verfahren wurde der exponierte Uterus mit einer
Nadel (18 g) durchbohrt und ein Tom Cat Katheter der die Embryonen
in einer minimalen Menge Medium trug wurde durch das Punktionsloch
eingeführt
und vorsichtig in den Gebärmutterzipfel
eingezogen. Die Embryonen wurden in den Gebärmutterzipfel ausgestoßen und
der Katheter vorsichtig entfernt.
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Verschiedene Embryonen Transfertechniken
die anwendbar auf Milchziegen sind wurden von Youngs et al. beschrieben
(Youngs et al., Embryo Transfer in Dain Goats, in The. Proceedings
of the Intl. Goat Production Symposium, Florida A & M, Univ., Tallahassee,
FL, 1990). Diese Referenz beschreibt auch verwandte Techniken, einschließlich: Embryonen
Kryopreservation, Embryonen Teilung (Splitting), in vitro Embryonen Kultur,
Gentransfer, Kerntransplantation, in vitro Fertilisation und Embryonen
Sexing. Verschiedene Embnonen Transfer Techniken, die anwendbar
auf Milchziegen sind, sind beschrieben von Youngs et. al., (oben).
Brau et al., beschreibt nützliche
Verfahren für
nicht-chirurgische Sammlung von Ziegen Embryonen (Braun et al., Non-surgical
Embryo Collection in the Dairy Goat, The Proceedings of the Intl:
Goat Production Symposium, Florida A & M Univ., Tallahassee, FL, 1990).
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C. Embryonen Manipulation
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Die Embryonen, die aus dem Zwerg-Embryonendonor
gewonnen wurden, können
vor dem Embryonentransfer unter Verwendung der folgenden Techniken
oder anderen Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, manipuliert
werden. Generell kann jedes Verfahren zur Produktion von transgenen
Ziegen in den erfindungsgemäßen Verfahren
angewandt werden.
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Mikroinjektion
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Mikroinjektion des Transgens in den
Vorkern von Zygoten (entweder in vivo oder in vitro hergestellt) ist
ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von transgenen Tieren.
Die Pronuklei können
durch differentiellen Interferenzkontrast sichtbar gemacht werden,
was durch kurzes Zentrifugieren der Zygoten unterstützt werden
kann. DNA Lösung,
zum Beispiel ein Expressionsvektor mit dem Kasein-Kontrollelement,
das die Expression des gewünschten
Transgens antreibt, wird in einen der Pronuklei injiziert. Injizierte
Zygoten können
entweder chirurgisch in die Ovidukte der Rezipienten übertragen
werden oder bis zum Morula- oder Blastozystenstadium in vitro kultiviert
werden zur chirurgischen oder nicht-chirurgischen Übertragung, möglicherweise
nach einer Embryo-Biopsie. Der Guide to techniques in Mouse Developement
(oben) stellt eine detaillierte Beschreibung einer Vielzahl von
Verfahren, die verwendet werden können, um transgene Tiere herzustellen
und Embryonen zu manipulieren, zur Verfügung. Simons et al. beschreiben
Beispiele für
die Verwendung der Mikroinjektion von Schaf-Pronuklei und die Herstellung
von transgenen Schafen, die die humanen Blutgerinnungsfaktoren IX
und α1-Antitrypsin
produzieren (Bio/technology, 6: 179, 1989). Maede at al. (
US-PS 4,873,316 ) beschreiben
Mikroinjektions-Techniken
und Expressionssysteme, die geeignet sind, um rekombinante Proteine in
der Milch eines Säugers
zu exprimieren.
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Ebert et al. (Bio/technologie 12:
699, 1994) beschreiben die Induktionsmilch, die humanen Gewebeplasminogen
Aktivator enthält,
aus der Brustdrüse
von transgenen Ziegen aus einer ersten Generation transgener Männchen.
Ebert et al. (oben) beschreiben auch ein nützliches Verfahren- zur Induktion
der Laktation in Männchen
unter Verwendung eines hormonellen Systems. Dieses Verfahren ermöglicht die
frühe Beurteilung eines
Transgens, das in den Brustdrüsen
exprimiert wird, sogar in Männchen.
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Embryo Biopsie
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Unter manchen Umständen ist
es wünschenswert
einige Zellen von einem Embryo zu erhalten. Die Zellen können verwendet
werden, um das Geschlecht des Embryos zu bestimmen, um zu bestimmen,
ob das Transgen vorliegt und um die Struktur des Transgens einzuschätzen (z.B.,
ob es reorganisiert wurde). Eine bis ein paar Zellen können vorzugsweise
im 16-Zellstadium oder in einem größeren Stadium unter Verwendung von
Mikroinstrumenten entnommen werden. Genotypisierte Embryonen können in
Rezipienten übertragen werden
oder gefroren gelagert werden zur späteren Übertragung.
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In vitro Entwicklung
von Oozyten
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Keskintepe et al. beschreiben ein
Verfahren zur Entwicklung von Morula in vitro aus unreifen Ziegenoozyten
(Zygote 2: 97, 1994). Dieses Verfahren kann verwendet werden, um
Zygoten und Embryonen zur Genmanipulation, Wirtsembryonen zur Chimärenherstellung,
unbefruachtete Rezipienten-Oozyten zur Verwendung im Kerntransfer
und Embryonen und Oozyten zur Verwendung in anderen Techniken zur
Verfügung zu
stellen.
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Expandieren
von transgenen Embryonen durch Herstellung von Chimären
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Transgene Zwergziegen Embryonen,
einschließlich
jener, die durch Vorkern-Injektion oder Kerntransfer hergestellt
wurden oder von einem transgene Tier gewonnen wurden, können in
kleine Sätze
von Zellen geteilt werden, vorzugsweise 3 bis 6 Zellen, aber auch
genauso . wenige wie eine und genauso viele wie die Hälfte der
Zellen des Embryos. Jeder kleine Satz von Zellen (oder jede Zelle)
kann in einen intakten Wirtsziegen Embryo injiziert werden oder
zwischen den getrennten Zellen eines Wirtsziegen Embryos geschoben
werden, zur Herstellung von chimären
Ziegen. Der Wirtsembryo kann in vivo und in vitro hergestellt werden. Zwergziegen
Embryonen sind bevorzugte Wirte, obwohl auch Standard-Ziegen Embryonen
verwendet werden können,
insbesondere wenn die Wirtszellen auf die Plazentabildung gerichtet
sind. Sie können
diploid oder tetraploid sein. Durch Kontrolle des Verhältnisses
von injiziertem Embryo zu Wirtsembryo-Zellen, des Stadium des Wirts
(jünger),
der Ploidie des Wirts (tetraploid) oder Differenzierung des Wirts
(Trophektoderm) und Embryo (innere Zellmasse), kann der Wirtsembryo
auf die Plazentabildung gerichtet sein, während der transgene (injizierte)
Embryo auf den fötalen
Anteil gerichtet sein kann.
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Isolierung embryonaler
Stammzellen und Kultur
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Embryonale Stammzellen (ESZ) sind
zur Herstellung von transgenen Tieren sehr nützlich. Sie können genetisch
transformiert werden und dann verwendet werden um chimäre Embryonen
durch Blastozysten-Injektion, Morula-Injektion, Morula-Aggregation
oder andere Techniken (vgl. Guide to Techniques in Mouse Development,
oben) zu bilden. Wenn ESZ, die das Transgen beherbergen in die Keimbahn
aufgenommen. werden und an der Herstellung von reproduktiven Zellen
teilhaben, wird der Nachwuchs, der von den chimären Tieren hergestellt wird,
transgen sein. ESZ haben verschiedene Vorteile: 1) sie ermöglichen
eine gesteigerte Effizienz der Herstellung transgener Tiere; 2)
sie können
in vitro transformiert werden; 3) sie könne auf die Anwesenheit des
Transgen überprüft werden
(Robertson, Biology of Reproduction 44: 238, 1991); und 4) sie können vermehrt
werden, so dass man viele identische transgene Tiere erzeugen kann.
Die Verwendung von ESZ ermöglicht
es, ein existierendes Gen durch ein genetisch verändertes
Gen durch homologe Rekombination zu ersetzen (Thomas et al., Cell
51: 501, 1987). Pieper et al. (Nucleic Acids Res. 20: 1259, 1992)
beschreibt Verfahren zur Einbringung eines Transgens in eine Mauszygote
durch homologe Rekombination.
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Die folgenden Referenzen stellen
Informationen zur Verfügung,
bezüglich
der Herstellung von ESZ und deren Verwendung in der Herstellung
transgener Tiere: Wheeler et al., (Reprod. Fertlil. Dev. 6: 563,
1994); Reed et al. (PCT Anmeldungs-Nr. PCT/US93/08878); Wheeler
(PCT Anmeldungs-Nr. PCT/US94/05529); lannoccone (PCT Anmeldungs-Nr.
PCT/US94/09787); und Evans et al. (PCT Anmeldungs-Nr. PCT/GB89/01103).
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Zwergziegen ESZ können wie folgt hergestellt
werden. Zwergziegen-Embryonen, vorzugsweise im Blastozystenstadium
oder in jüngeren
Stadien, werden nach Entfernen der Zona pellucida, entweder durch
das natürliche
Ausbrütverfahren
oder durch mechanische Entfernung, auf geeigneten Feeder-Zelllinien
wie embryonische Fibroblasten Feeder-Schichten (Maus, STO, Ziege usw.) kultiviert.
Die Embryonen haften auf der Einzelschicht und vermehren sich als
eine undifferenzierter Zelllinie (Embryonale Stammzellen). Diese
Zellen können
als eine Zelllinie propagiert werden, gefroren gelagert werden oder
mit einem DNA Konstrukt durch jegliche bekannte DNA Transfer Technik
transfiziert werden (d.h., diese Zellen sind allen somatischen Zellmanipulationen,
die dem Fachmann bekannt sind zugänglich). ESZ können von
Morula abgeleitet werden (Eistetter, Dev. Growth and Diff. 31: 276,
1989). ESZ können
auch aus primordialen Keimzellen isoliert werden (Natsui et al.,
Cell 70: 841, 1992).
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Putative Zwergziegen ESZ werden wie
folgt abgeleitet. Embryonen im Morula-Stadium und/oder Blastozysten-Stadium
von superovulierten Zwergziegen wurden an Tag 6 (esterus = Tag 0)
gesammelt. Die Embryonen wurden in Medium für embryonale Stammzellen (ESCM;
MEM (GIBCO) platziert, angereichert mit nicht-essentiellen Aminosäuren, 0,1
mM β-Merkaptoethanol,
und 15% Rinder fötales
Kälberserum
(FCS) auf einer Feeder-Zellschicht. In diesem Fall bestand die Feeder-Zellschicht
aus mitomyzin-blockierten STO Zellen (erhältlich von der American Type
Culture Collection, Rockville, MD). Alternativ könnten embryonale Fibroblastenzellen
der Maus oder embryonale Fibroblastenzellen der Ziege als Feeder-Schicht
verwendet werden.
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Über
einen Zeitraum von 7 Tagen wurden die Embryonen von ihren Zona pellucidae
ausgebrütet
und and die Feeder-Schicht geheftet. Nach einigen Tagen (bis zu
und über
2 Wochen) wurden die angehefteten Zellen durch Schneiden in Stücke mit
scharfer Schneide, Glas- oder Metall- Nadel oder Klinge und Abheben der
Oberfläche
mechanisch entfernt. Diese Stücke
wurden dann enzymatisch in kleine Zellklumpen verteilt (unter Verwendung
von Trypsin oder Protease) und wieder auf Platten mit frischen Feederzellen
plattiert. Die enzymatische Behandlung kann weggelassen werden und
die kleinen Stücke
können
direkt auf die neue Feederschicht übertragen werden.
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Nach 7 bis 14 Tagen wurden die Kolonien
der embryonalen Stammzellen wieder wie oben beschrieben übertragen.
Dieser Übertragungsschritt
wird wiederholt, wie benötigt.
Die Kolonien können übertagen
werden, während
sie klein und undifferenziert sind oder es kann ihnen ermöglicht werden
annähernd
Konfluenz zu erreichen. Große
Kolonien können
Bereiche mit differenzierten und undifferenzierten Zellen haben.
Undifferenzierte Zellen können
vorzugsweise für
kontinuierliche Passage enffernt werden.
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ESZ können in 10% Glyzerin und 90%
ESCM gefroren werden. ESZ Linien können aus gefrorenen Zellen
neu. gestartet werden. Gefrorene Zellen werden schnell aufgetaut,
von Kühlschutzmittel
freigewaschen und auf frische Feederschichten plattiert.
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Als ein alternatives Kultivierungsverfahren
könne etablierte
ESZ (nach einer Passage) auf Gelatine beschichtete Gewebekulturplatten
anstelle von Feeder-Zellschichten plattiert werden. Das ESZ Medium
ist angereichert mit BRL Zell aufbereitetem Medium (60% BRL aufbereitetes
MEM angereichert mit 40% ESCM und 0,1 mM β-Merkaptoethanol).
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Die ESZ, die wie oben beschrieben
hergestellt wurden, besitzen eine großes Kern zu Zytoplasma Verhältnis. Bei
großer
Zellzahl wachsen die ESZ in einer flachen Einzelschicht mit ungenauen
zellulären
Grenzen. Die Koloniegrenze ist ausgeprägt und glatt. Die Zellgröße ist weniger
als oder gleich 21 μm.
Wenn die Zellen einzeln oder in kleinen Klumpen plattiert werden,
bilden sie kleine Hügel,
die sich später
mit steigender Anzahl zu großen
flachen Kolonien ausdehnen. Undifferenzierte Zellen sind positiv
auf alkalischen Phosphatase und bilden spontan einfache embryonale
Körperchen
(embroid bodies) mit steigender Zellzahl (Koloniegröße). Einige
Kolonien können
spontan in große
flache (Trophoektoderm- ähnliche)
Zellen differenzieren und/oder in Zellen, die morphologische Eigenschaften
von Nervenzellen und/oder Muskelzellen haben.
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Herstellung
von embryonalen Stammzell-Chimären
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Embryonale Stammzellen, die vorzugsweise
ausgewählt
sind nach der geeigneten Aufnahme eines Transgens, werden in einen
Wirtsembryo injiziert, vorzugsweise, wenn der Embryo im Morula-
oder Blastozystenstadium ist, obwohl die Injektion auch erfolgen
kann, wenn der Embryo sogar noch jünger ist. Die verwendeten ESZ
sind vorzugsweise aus den Kolonien ausgewählt, die in kleine Klumpen
von Zellen getrennt sind (vorzugsweise fünf bis fünfzehn Zellen), entweder durch
mechanische oder enzymatische (Pronase oder Trypsin) Behandlung.
Diese Zellen würden
in das Blastocoel des Embryos im Blastozystenstadium oder unter
die Zona in die Masse der Morula oder Embryonen in jüngeren Stadien
injiziert. Wechselweise können
Zona-freie Morula- (oder jüngere)
Embryonen mit ESZ, die durch enzymatische Behandlung getrennt wurden,
kultiviert werden, was es den ESZ ermöglicht in den Embryo aufgenommen
zu werden. Wirtsembryonen können
in vivo und in vitro hergestellt werden, diploid oder tetraploid.
Der Guide to Techniques in Mouse Development (oben) beschreibt Techniken,
die ESZ in der Herstellung von transgenen Tieren einsetzen.
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Kerntransfer
zur Vermehrung von Embryonen
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Kerntransfer ist ein alternatives
Verfahren zur Vermehrung von transgenen Tieren. Die Kern Donorquelle
kann entweder eine Zelle sein, die einem transgenen Embryo entnommen
wurde (auf eine Vorkern Injektion folgend oder abgeleitet von einem
transgenen Muttertier/ Vatertier) oder eine transgene embryonale Stammzelle.
Die Zytoplasten-/Wirtsquelle kann jede Ziegenoozyte, in vitro oder
in vivo gereift.
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Die Wirtsoozyte wird entkernt (Metaphase
II Chromosomen werden entfernt), entweder durch Mikrochirurgie oder
durch Zentrifugationsverfahren. Der resultierende Wirts-Zytoplast
wird durch beliebig viele Mittel aktiviert (Kälteschock, elektrischer Puls,
Kalzium Ionophore, DMAP Behandlung, Ethanol, usw.), vor oder nach dem
Kerntransfer, in Abhängigkeit
von dem Zellzyklusstadium des Donorkerns. Generell werden embryonale Zellen
in einen voraktivierten Zytoplasten übertragen, während der
ES-Zell Zytopläst
nach Transfer und Fusion aktiviert wird. Donorkerne werden entweder
durch mechanische oder enzymatische (zum Beispiel Trypsin, Protease)
Trennung des Donor-Embryos oder Zelllinie erhalten. Die individuellen
Zellen (Karyoplasten) werden in die entkernte Oozyte (Zytoplast)
unter die umgebende Zona pellucida übertragen, so dass Kontakt
zwischen den Plasmamembranen des Karyoplasten und des Zytoplasten
besteht. Der Karyoplast und der Zytoplast werden durch eine der
verschiedenen Verfahren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf
Elektrofusion, PEG, fusogene Proteine oder Vieren, etc. fusioniert.
Die neue Zygote wird bis zu einem für den Transfer in ein Rezipiententier
geeigneten Stadium kultiviert oder gefroren gelagert. Ein anderes
Verfahren zur Kanoplasten/Zytoplasten Fusion ist, dass der Donorkern
direkt in das Ooplasma der entkernten Oozyte injiziert werden kann
(Collas et al., Molecular Reproduction and Development 38: 264,
1994). Die neuen Zygoten, die durch diese Kerntransfer-Techniken
hergestellt wurden können
auch mit einem Wirtsembryo kombiniert werden (in der Weise, wie
oben beschrieben), um Chimären
herzustellen. Prather et al. (
US-PS
4,994,384 ) und Massey (
US-PS
5,057,420 ) beschreiben kerntransfer Verfahren. Tatharn
et al. (Biology of Reproduction 53 ; 1088, 1995) beschreibt zusätzliche
Kerntransplantations-Verfahren.
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D. Verwendung transgener
Ziegen
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Die transgenen Ziegen, die nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellt wurden, können
verwendet werden, um nützliche
human-therapeutische Proteine (z.B. humanes Wachstumshormon) und
veterinär-therapeutische
Proteine (z.B. IL-6) in der Milch der Zwergziegen herzustellen.
Die Herstellung des heterologen Proteins in einem Säuger erleichtert
die post-translationale Modifikation des Proteins und umgeht teure Zellkultur-Medien, die in in
vitro Verfahren der Proteinherstellung vewendet werden. Die Erfindung
bietet weiterhin den Vorteil, dass das heterologe Protein in großen Mengen
hergestellt werden kann. Transgene Ziegen können auch verwendet werden,
um die Eigenschaften von Milch zu verändern.
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Transgene Ziegen können für viele
Zwecke, für
die andere transgene Tiere verwendet wurden, verwendet werden. Die
folgenden Referenzen beschreiben eine Vielzahl von Verwendungen
für transgene
Tiere: Sarvetnick et al. (PCT Anmeldung Nr. PCT/US94/04708); Bjursell
et al. (PCT Anmedung Nr. PCT/SE93/00515); Lonberg (PCT Anmeldung
Nr. PCT/US94/04580); and Abraham et al. (PCT Anmeldung Nr. PCT/GB94/00569).
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Beispielsweise kann die Expression
eines geeigneten Transgens Veränderungen
in dem Protein-, Lipid- oder Kohlehydratgehalt der Milch verursachen.
Nützliche
Milchprodukte, wie die, die einen reduzierten Laktosegehalt haben,
können
leicht produziert werden. Darüber
hinaus, wenn das Transgen (β-Galaktosidase, die
aus Aspergillus niger abgeleitet ist, exprimiert, ist das Enzym
besonders geeignet zur Hydrolyse von Laktose bei einem sauren pH
(bei pH 3-4). Dementsprechend ist eine Probe der Milch, die dieses
Enzym enthält, besonders
geeignet zur Reduktion des Laktosegehaltes einer zweiten Milchprobe
durch einfaches Zusammenmischen der beiden Milchproben.
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Wenn das heterologe Enzym eine Asparagin-Protease
ist, ist die Milch besonders geeignet zur Käseherstellung. Diese Proteasen
verringern die Zeit, die benötigt
wird, um durch Lab zu verklumpen. Asparagin-Proteasen können auch
die Ausbeute an Käse
steigern. Die Expression eines Rinder-β-Kaseins in Milch kann auch
die Käse-Ausbeute
verbessern. Zusätzlich
kann die Herstellung von Rinder-β-Kasein
oder anderen heterologen Proteinen (z. B. Laktoferrin oder Lysozym)
in Milch den Nährwert
von Milch steigern.
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Da heterologe Enzyme an die epitheliale
Zellmembran der Brust gebunden werden können, ermöglicht die vorliegende Erfindung
die Herstellung modifizierter Milch, während die Sorge, dass solche
Milch heterologe Enzyme enthält
verringert wird. Das Binden von Enzymen an die epitheliale Zellmembran
verringert auch die Anforderungen, die an die Synthese-Maschinerie der Zelle
gestellt werden, da das Enzym auf die Komponenten der Milch wirken
kann, ohne in die Milch sekretiert zu werden.
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E. Transgene
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Brauchbare Promotoren zur Expression
von Transgenen in dem Brustgewebe schließen Promotoren ein, die natürlich die
Expression von brustspezifischen Genen betreiben. Beispielsweise
können α-S1-Kasein Promotoren, αS2-Kasein
Promotoren, β-Kasein
Promotoren, κ-Kasein
Promotoren, β-Laktoglobulin
Promotoren, Molke saures Protein Promotoren und α-Laktoalbumin Promotoren verwendet
werden. Falls gewünscht, kann
der Promotor funktionell mit einem oder mehreren Verstärkerelementen
verbunden werden, so dass das (die) Verstärkerelement(e) die Transkription
des Gens, das die das heterologe Genprodukt kodiert, steigert.
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Die folgenden Referenzen beschreiben
Gene und Expressionskontrollregionen, die zur Konstruktion von Transgenen
in einer Vielzahl von Tieren nützlich
sind: Groenen et al. (Livestock Produktion Science 38: 61, 1994);
Wilmut et al. (Experientia 47: 905, 1991); Pursel et al. (J. Animal.
Sci. 71 (Anhang 3): 10, 1993); Clark et al. (
US-PS 5,322,775 ) ; und Bleck et al.
PCT Anmeldung Nr. PCT/US92/06549). Expressionskonstnakte und Gene,
die in anderen Tieren als Ziegen verwendet werden, können, falls
gewünscht,
zur Verwendung in Ziegen angepasst werden. Hurwitz et al. (PCT Anmeldung
Nr. PCT/US/06300) beschreibt Expressionskonstrukte, die zur Expression
von einem heterologen Protein in der Milch einer Ziege geeignet
sind.
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Vorzugsweise schließt das genetische
Konstrukt (d.h. ein Plasmid) auch eine Transkriptions- Terminations-Region
ein. Nützliche
Terminations-Regionen schließen
ein Polyadenylierungssignal und das 3'-Ende des Gens, von dem die
Promotorregion des genetischen Konstrukts abgeleitet wurde, ein.
Andere nützliche Transkriptions-Terminations-Regionen schließen Terminations-Regionen,
von denen bekannt ist, dass sie mRNA - Stabilität beeinflussen, wie die, die
abgeleitet sind von Rinderwachstumshormon-Gen, Globingenen, der
frühen
SV40 Region oder von Milchprotein-Genen, ein.
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Optional schließt das lineare oder zirkuläre genetische
Konstrukt ein Intron ein, das den Expressionsspiegel des heterologen
Gens steigern kann. Generell sollte das Intron zwischen der Transkriptions-Initiations-Stelle
und dem Translations-Start-Kodon platziert werden; 3' vom Translations-Stop-Kodon;
oder in der kodierenden Region des Gens, die das heterologe Protein
kodiert. Das Intron sollte eine 5' Spleiß-Stelle (d.h., eine Donor-Stelle),
eine 3' Spleiß-Stelle
(d.h. eine Akzeptor-Stelle) und vorzugsweise wenigstens 100 Nukleotide
zwischen den beiden Stellen einschließen. Besonders nützliche
Introns sind diejenigen, die natürlich
in Genen von Wiederkäuern
vorkommen (z. B. Gene die Kasein kodieren).
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Heterologe Genprodukte
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Es kann praktisch jedes heterologe
Protein in transgenen Zwergziegen hergestellt werden. Besonders nützliche
heterologe Proteine schließen
diejenigen, die von therapeutischem Wert für Menschen oder Tiere sind
ein (z. B. htPA, hGH und IL-6). Andere besonders nützliche
Proteine schließen
diejenigen ein, die den Nährwert
der Milch steigern (z. B. β-Kasein und Laktoferrin).
Viele Gene, die diese oder andere nützliche Proteine kodieren wurden
identifiziert und kloniert, was es ermöglicht, sie leicht für die Verwendung
in der Herstellung von transgenen Zwergziegen zu subklonieren.
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Andere besonders nützliche
heterologe Proteine schließen
die ein, die wertvoll in der Nahrungswissenschaft sind. Unter Anderen
sind nützliche
Proteine diejenigen, die eine enzymatische Aktivität besitzen,
die auf einen Bestandteil der Milch gerichtet ist; solche Enzyme
können
verwendet werden um ein Lipid, Protein oder den Kohlenhydratgehalt
der Milch zu verändern.
Beispielsweise kann β-Galaktosidase
mit der Erfindung hergestellt werden, um Milch mit einem reduzierten
Laktose-Spiegel herzustellen. Gene, die β-Galaktosidase kodieren können abgeleitet
werden von jedem einer Anzahl von Organismen, einschließlich Aspergillus
niger, (Kumar et al., 1992, Bio/technologie 10: 82); Homo sapiens
(Oshima et al., 1988, Biochem. Biophys. Res. Comm. 157: 238) ; Kluyveromyces
lactis (US-PS 5,047,340
; Sreekrishna und Dickson, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7909;
und Poch et al., 1992, Gene 118: 55); Lactobacillus bulgaricus (Schmidt
et al., 1989, J. Bacteriology 171: 625).
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Nützliche
Proteine schließen
ein: Cytokine, Asparagin-Proteasen, Lysozym, Steanl-CoA-Desaturase Lipase,
Glaktosyltransferase, Blutgertnnungsfaktor-Proteine, Protein C, α1-Antitrypsin, Urokinase
Plasminogen Aktivator, humanes Serumalbumin, zystische Fibrose Transmembran
Leitfähigkeits-Regulator
(conductance), gamma-Interferon, humanes CD4, Wachstumsfaktoren,
Peptidhonnone, Oncoproteine, Tumorsuppressor- Proteine, Milchproteine,
Hormonrezeptoren, Translationsfaktoren und Transkriptionsfaktoren.
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Falls gewünscht, kann das Gen, das das
heterologe Protein kodiert mutiert werden. Besonders nützliche
Mutationen schließen
Mutationen in dem 5'- oder 3' untranslatierten Bereichen des Gens
ein, da solche Mutationen die Expression des Gens, das das heterologe
Protein kodiert, verbessern können.
Andere nützliche
Mutationen oder Deletionen sind diejenigen, die die Sekretion des
Proteins aus der Zelle steigern oder die Retention des Proteins
in der Zelle inhibieren. Beispielsweise werden vorzugsweise Sequenzen,
die Retentionssignale des Endoplasmatischen Retikulums oder andere
Sortierungs-Inhibitionssignale
aus dem genetischen Konstrukt deletiert oder mutiert um nicht-funktionell
zu sein. Zusätzlich
können
trunkierte Varianten von natürlich-vorkommenden
Proteinen in der Erfindung verwendet werden, vorausgesetzt, dass
das trunkierte Protein eine nützliche
biologische Aktivität
besitzt.
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Jedes heterologe Protein, das erfindungsgemäß hergestellt
wird, sollte an ein Signalpeptid gebunden sein, wenn das Protein
aus der Epithelialzelle der Brust sekretiert werden soll. Das Signalpeptid
kann eine natürlich-vorkommende
Komponente des heterologen Proteins sein (z.B. das Signalpeptid
der humanen Plazenta β-Galaktosidase).
Wenn das heterologe Protein kein natürlich sekretiertes Protein
ist und Sekretion gewünscht
wird, sollte das genetische Konstrukt so zusammengesetzt werden,
dass ein Signalpeptid an das heterologe Protein gebunden ist, so
dass das Signalpeptid die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuert.
Nützliche
Signalpeptide können
von Genen wie Kasein- Genen, dem Gen für humane Alkalische Phosphatase
oder dem Gen für
Melittin abgeleitet werden.
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Gebundene Enzyme
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Wenn das genetische Konstrukt ein
Enzym kodiert, das an die epitheliale Zellmembran gebunden werden
soll, kann das genetische Konstrukt eine Sequenz enthalten, die
ein Membran-assoziiertes Polypeptid kodiert. Beispielsweise kann
das genetische Konstrukt eine Sequenz abgeleitet von β-1,4-Galaktosyltransferase (vgl.
z.B. Masri et al., 1988, Biochem. Biophys. Res. Comm. 175: 657-663),
Laktase-Phlorizin-Hydrolase (vgl. z.B. Mantei et al., 1988, EMBO
J. 7: 2705-2713), dem thy-1 Protein (vgl. z.B. Brown et al., 1989,.
Science, 245: 1499-1501) oder dem Natrium/Glukose-Transproter (sieh
z.B. Kong et al., 1992, FEBS Letters 333: 1-4) enthalten.
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Das Anbinden des Enzyms an die Zellmembran
ermöglicht
es dem Enzym auf . einen Bestandteil der Milch zu wirken, während die
Sekretion des Enzyms in die Milch, die von dem Säuger gewonnen wird inhibiert wird.
Während
sekretierte Enzyme im Rinder Duktus für etwa 12 Stunden in Kontakt
mit der Milch bleiben, bevor sie mit der Milch entfernt werden,
wird der Zeitraum für
gebundene Enzyme nur durch den natürlichen Durchsatz der epithelialen
Zellmembran begrenzt. Da das Enzym im Duktus bleibt, wo es auf die
Milch, die über
einen langen Zeitraum produziert wird, wirken kann, muss die Zelle
nicht so viel heterologen Enzyms herstellen, wie benötigt würde, wenn
das heterologe Enzym sekretiert würde. Zusätzlich kann die Milch, die
von solchen Säugern
gewonnen wird wie gewünscht.
modifiziert werden (z. B. um einen reduzierten Laktosegehalt zu
haben), anbinden des Enzyms an die Zellmembran verringert die Sorge,
dass modifizierte Milch unerwünschte
heterologe Enzyme enthält.
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Antisense Oligonukleotide
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Wenn das genetische Konstrukt ein
antisense Oligonukleotid zur Inhibiening der Genexpression kodiert,
ist das Konstrukt zur Herstellung eines Oligonukleotides, das an
DNA oder mRNA des Gens hybridisiert, konstruiert. Generell kann
dieser Aspekt der Erfindung unter Verwendung von fachbekannten Antisense-Strategien
ausgeführt
werden. Die DNA Sequenzen einer Anzahl von epithelialen Zellgenen
der Brust sind bekannt. Geeignete Ziele schließen ohne Einschränkung ein,
Gene, die β-Laktoglobulin
(vgl. z.B. Ivanov et al., 1988; J. Biol. Chem. 369: 425-429, und
Silva et al., 1990, Nucleic Acid Res. 18: 3015), eine Acetyl-CoA
Carboxylase, eine Glaktosyltransferase (Shaper et al., 1986, Proc.
Natl. Acad. Sci. 83: 1573-1577; Masibay et al., 1989, Proc. Natl.
Acad. Sci 86: 5733-5737:
Masri et al., 1988, Biochem. Biophys. Res. Comm. 175: 657-663) und
ein α-Lactalbumin (Vilotte
et al., 1987, Biochemie 69: 609-620) kodieren. Somit ist der Fachmann
in der molekularen Biologie in der Lage ein genetisches Konstrukt
zu entwerfen, das ein antisense Oligonukleotid geeigneter Sequenz
und Länge
kodjert. Vorzugsweise ist das antisense Oligonukleotid zwischen
5 und 1000 Nukleotiden lang (stärker
bevorzugt 10 bis 500 Nukleotide).
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Ribozyme
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Die Gentransfer Verfahren der Erfindung
können
auch verwendet werden, um genetische Konstrukte, die Ribozyme kodieren,
an die epithelialen Zellen der Brust zu liefern. Es können konventionelle
Strategien beim Entwurf der genetischen Konstrukte, die Ribozyme
kodieren, verwendet werden. Geeignete Ziel-Nukleinsäuren schließen ohne
Einschränkung
die ein, die. für β-Laktoglobulin,
Acetyl-CoA Carboxylase, Galaktosyltransferase und α-Lactalbumin
kodieren.
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Genetische Knockouts
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Unter Verwendung embryonaler Stammzelltechnologie
kann man ein ausgewähltes
Gen ausschalten.
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Isolierung und Charakterisierung
von genetischen Konstrukten
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Die genetischen Konstrukte, die in
der Erfindung nützlich
sind, können
unter Verwendung konventioneller Techniken zur DNA Isolierung hergestellt
werden. Falls gewünscht,
kann die DNA Qualität
durch Standard-Verfahren bestimmt werden, wie Messen der optischen
Dichte oder Analysieren der DNA durch Elektrophorese. Vorzugsweise
ist die DNA frei von Endotoxinen und geeignete Verfahren schließen diejenigen
ein, die für
die Reinigung von DNA zur Verwendung im Menschen anerkannt sind
(z.B. die Verwendung eines Qiagen DNA Extraktions-Kits, gefolgt
von der Verwendung eines Endotoxin-Eleminierungs Kits). Falls gewünscht, können die
genetischen Konstrukte weiter Charakterisiert werden durch Sequenzieren
der DNA Moleküle,
besonders an Verbindungen, die durch die Ligation von zwei DNA Molekülen gebildet
werden. Die Erstellung von partiellen Restriktionskarten der genetischen
Konstrukte kann Information bezüglich
der Orientierung des Gens, das das heterologe Protein kodiert, im
Verhältnis
zu anderen Bestandteilen des Konstrukts, zur Verfügung stellen.
